Apoptóza: metody detekce
Karel Souček, Alena Vaculová Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail:
[email protected] tel.: 541 517 166
analýza
fragmentace DNA detekce asymetrie lipidové membrány analýza změny mitochondriálního potenciálu detekce kaspázové aktivity
Apoptóza
Nekróza vs. Apoptóza
nekróza
apoptóza
http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/cytotech/apopto/data/chap10.htm
Apoptóza vs. nekróza
Aktivace kaspáz Kondenzace buňky a organel Kondenzace chromatinu Ztráta asymetrie buněčné membrány Zachování integrity buněčné membrány Tvorba „bodies“ a jejich fagocytóza okolními buňkami
(From W. Wood et al., Development 127:5245–5252, 2000. © The Company of Biologists.)
Prozánětlivé stimuly, produkce cytokinů Nabobtnání buňky a organel Ztráta asymetrie buněčné membrány Rychlá ztráta integrity buněčné membrány Vylití cytosolu do mezibuněčného prostoru
http://www.imcworldwide.org/cbr/L1C-m2.html
Morfologie – nekróza vs. apoptóza
ztráta integrity plazmatické membrány bobtnání cytoplazmy a zvětšení buňky rozbití jádra desintegrace buněčných organel kompletní lyze buňky
bobtnání cytoplazmatické membrány, integrita membrány není porušena zmenšení velikosti buňky kondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinu udržení integrity intracelulárních organel formace tzv. apoptotických bodies
Biochemie – nekróza vs. apoptóza
Bez účasti specifických molekul Pasívní proces bez dodání energie z ATP Neregulovaná destrukce jaderné DNA Není specifická role mitochondrií Ztráta regulace iontových rovnováh
Aktivace specifických molekul Nutné dodání energie ve formě ATP Specifická fragmentace jaderné DNA Uvolnění specifických regulátorů z mitochondrií Změny symetrie membrán
Fyziologický význam – nekróza vs. apoptóza
Postihuje skupiny buněk Indukována nefyziologickými stimuly Poškození okolní tkáně – vylití toxických látek Spouští zánět
Týká se jednotlivých buněk Indukována fyziologickými stimuly Fagocytóza makrofágy Není zánět
Kritické body v detekci buněčné smrti
in vitro vs. in vivo normální vs. nádorové populace doba trvání „časového okna“ kdy je možné zachytit určitý znak se liší (!) – u jednotlivých buněčných populací – v závislosti na induktoru buněčné smrti – v závislosti na konkrétním znaku který detekujeme (zvolené metodě)
různé buňky ze stejné populace mohou umírat různým způsobem smrti
Detekce buněčné smrti Analýza
fragmentace DNA
– sub G0/G1 populace – TUNEL
Normal Cell Cycle G2
M
G0
DNA Analysis
G1
s
G0G1 C o u n t
- propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD
subG0G1
s 0
200
400
G2 M 600
4N 2N DNA content
800
1000
Purdue University Cytometry Laboratories
Analýza subG0/G1 populace
Analýza subG0/G1 populace
- extrakce nízkomolekulárních fragmentů pomocí citrátového pufru
Analýza subG0/G1 populace
výhody – rychlá a levná analýza – analýza možná zároveň s detekcí buněčného cyklu – lze použít jakoukoliv značku vázající se na DNA
limitace – omezená specificita – subG0 populace je detekovatelná i u mechanicky poškozených buněk – extrakce nízkomolekulárních fragmentů DNA závisí na protokolu zpracování buněk – buňky umírající apoptózou z G2 fáze je obtížné detekovat
Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling - TUNEL
detekce zlomů DNA 3´-OH konec jedno- nebou dvouřetězcových zlomů je označen modifikovaným analogem báze pomocí deoxynukleotidyl transferázy vizualizace – přímá (FITC-dUTP) – nepřímá (AP, POD, anti-BrdU Ab)
TUNEL
TUNEL
výhody – citlivost, specificita – možnost kombinace s detekcí buněčného cyklu http://www.ihcworld.com/imagegallery/albums/userpics/10003/tunel.jpg
limitace – finančně a časově náročný protokol – spotřeba velkého množství buněk – některé druhy fixace mohou u určitých buněk vést k artefaktům Pozn. Nutnost používat 0.2-1% BSA v oplachovacích pufrech
Detekce buněčné smrti detekce
asymetrie lipidové membrány
Detekce asymetrie lipidové membrány
fosfatidylseriny (PS) jsou translokovány na vnější stranu membrány během časné apoptózy
PS na vnější straně membrány slouží jako jeden ze signálů pro fagocyty
Detekce asymetrie lipidové membrány
Detekce asymetrie lipidové membrány
pro detekci translokace PS využíváme fluorescenčně značený protein Annexin V Annexin V vytváří Ca2+ závislou vazbu s PC v „normální“ buňce intracelulárně kotví cytoskeletární proteiny k lipidovým membránám translokace PS je jedním z důsledků změny morfologie a modulace cytoskeletu u apoptických buněk
Detekce pomocí annexinu V
File: K-ANX-FITC/PI
R1
R2
Quad % Total UL 0.21 UR 21.39 LL 70.17 LR 8.23
File: CHX_50/5h-ANX-FITC/PI Quad % Total UL 1.42 UR 29.11 LL 58.43 LR 11.04
Detekce translokace PS
výhody – časný a specifický znak apoptózy – možnost kombinace s detekcí povrchových CD antigenů
limitace – je nutné během analýzy odlišit mrtvé buňky – není možné analyzovat fixované vzorky
Detekce buněčné smrti analýza
změny mitochondriálního potenciálu
Mitochondrie, ΔΨm a apoptóza Mitochondrie hrají důležitou roli v regulaci apoptózy • klíčové regulátory jsou proteiny z Bcl-2 rodiny • permeabilita mitochondriální membrány může ovlivnit uvolnění cytochromu c a aktivaci kaspáz • některé proteiny z mezimebránového prostoru mitochondrií mohou indukovat apoptózu nezávislou na kaspázách (AIF, endonuclease G)
Death signal convergence onto mitochondria
Baliga B., Kumar S. (2003) Cell Death Differ. 10: 16-18 Desagher S., Martinou J. C. (2000) Trends Cell Biol. 10: 369-377 Van Loo G., et al. (2002) Cell Death Differ. 9: 1031-1042
Mitochondrie a ΔΨm
Δp = ΔΨm - 60 ΔpH Δp ~ elektrochemický protonový gradient (180mV) ΔΨm ~ mitochondriální membránový potenciál (150mV) ΔpH ~ pH gradient Δp pohání ATP-ADP výměnu, import mitochondriálních proteinů a transport metabolitů
-
+ + + + + +
Alberts, B., et. al. (2002), Molecular Biol. of the Cell
Mitochondrie, ΔΨm a apoptóza Depolarizace mitochondriální membrány a ztráta ΔΨ m je důsledek otevření „permeability transition pores“ (PTP) nebo narušení integrity vnější mitochondriální membrány Depolarizace mitochondrií je spojena s: • ischemií/reperfúzí • oxidativním stresem • buněčnou smrtí
Detekce ΔΨm •elektrody •radioaktivně značené próby •lipofilní fluorescenční kationty
Cossarizza, A. (1998), Purdue Cytometry CD-ROM Volume 3
Fluorescenční značky pro analýzu ΔΨm
Detekce ΔΨm
JC-1
5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide
ex./em. = 514/529 nm, monomer form; 585/590 nm J-aggregate form
TMRE ex./em. = 551/576 nm
tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate
NIH 3T3
AA
NaBt
CH-11
floating: 4.8% DAPI: 2.1%
floating: 12.7% DAPI: 2.6%
floating: 5.7% DAPI: 3.5%
floating: 16.3% DAPI: 6.0%
4.1%
47.5%
2.6%
42.4%
floating: 14.6% DAPI: 4.5%
floating: 29.6% DAPI: 16.0%
2.8%
50.3%
floating: 17.3% DAPI: 5.0%
floating: 39.3% DAPI: 20.0%
1.6%
53.7%
floating: 9.9% DAPI: 2.6%
3.8%
DHA
TNF-α
floating: 13.4% DAPI: 3.3%
5. 3%
control AA DHA
floating: 24.7% DAPI: 6.1%
25.7%
floating: 24.9% DAPI: 11.7%
26.3%
NaBt AA/NaBt DHA/NaBt
TNF-α AA/TNF-α DHA/TNF-α
CH-11 AA/CH-11 DHA/CH-11
control NaBt TNF-α CH-11 AA AA/NaBt AA/TNF-α AA/CH-11
DHA DHA/NaBt DHA/TNF-α DHA/CH-11
of
HL-60 & NDGA ΔΨm
2h
4h
6h
Control NDGA
Cytochrome c cytosol
Vondracek J., Štika J, Souček et. al., Eur. J. Pharmacol.
of
ΔΨm (TMRE) čas = -1 – 8.5 min NDGA (HBSS)
NDGA/NAC (HBSS)
of
ΔΨm (TMRE) 16 h NDGA (HBSS)
NDGA/NAC (HBSS) 1.1% 79.5% 4.6% 14.8%
4.2% 89.9% 1.3% 4.6%
1.6% 5.7% 88.6% 4.1%
Hoechst+PI
3.3% 54.4% 35.8% 6.5%
Hoechst+PI
ΔΨm (TMRE) 16 h
NDGA (10%BFS)
NDGA/NAC (10%BFS) 99.0% 0.5%
0.0% 0.0%
99.9% 0.1%
1.2% 83.5% 10.5% 4.8%
0.6% 4.7%
93.3% 1.4%
0.4% 0.1% R1
Hoechst+PI
Hoechst+PI
of
Možné důsledky poškození mitochondrií
Matthew G. Vander and Craig B. Thompson (1999) Nature Cell Biology. 1: E209-E216
Δψm Detekce pomocí TMRE
Soucek K. et al. Leuk. Res. 2006
Δψm sorting -> cell cycle re-analysis HL60/ATRA/96h
~intact population
~collapsed
Δψm sorting -> cell cycle re-analysis HL60/ATRA/TGF-β1/96h
HL60/ATRA/TGF/96h ΔΨm ~ intaktni populace (89.15%) ~intact population subG0G1: 0.67% G0G1: 76.06% S: 16.12% G2M: 7.82%
R1
0
40
80
Channels
120
160
200
HL60/ATRA/TGF/96h ΔΨm ~collapsed ~ kolaps (10.17%) subG0G1: 0.00% G0G1: 79.02% S: 16.43% G2M: 4.55% HL60/ATRA/TGF/96h subG0G1: 0.46% G0G1: 76.04% S: 13.38% G2M: 10.58%
0
40
80
Channels
120
160
200
0
40
80
Channels
120
160
200
„real-time” měření ΔΨm
Detekce ΔΨm Human Promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 nM / 1 h) NDGA (20 µM /1 h)
JC-1 (2.5 µg/ml)
R1
TMRE (100 nM)
DiOC6(3) (40 nM) MitoTracker (50 nM) Rh123 (1 ng/ml)
Detekce depolarizace mitochondriální membrány „real-time“ Human promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 nM)
JC-1
DiOC6(3)
TMRE
MitoTracker Red
Rh-123 Rh-123
Podmínky pro „real-time“ měření ΔΨm •homogenní označení buněk •standardizace teploty •standardizace experimentálního zásahu Burns, J. M. et.al. (1997). "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): 1022-4, 1026.
http://www.cytekdev.com
Možnosti kombinace detekce ΔΨm s dalšími parametry Vitální značení exprese CD antigenů (TMRE, CMXRos/anti-CD Ab-FITC) translokace fosfatidyl serinů (TMRE, CMXRos/Annexin V-FITC)
Produkce ROS (TMRE/DHR-123) Ca2+ (TMRE/Fluo-3 ) viabilita (propidium iodide, 7-AAD) fluorescenční proteiny (TMRE/GFP)
Detekce translokace fosfatidyl serinů, ΔΨm a viability
0.21
7.78
6.82
0.92
0.56
R1
23.26
23.2
46.24
39.7
R1
7.60
9.93
R2
2.61
7AAD negative
6.36
7AAD negative
1.54 6.46
22.6 1.37
7.63
44.95
1.02
17.33 18.97
Human promyelocytes HL-60 NDGA (20 µM /12 h)
1 2 3
Annexin V-FITC/TMRE/7-AAD
R2
TMRE
TMRE
2.61
1.61
Detekce [Ca2+]i a ΔΨm Fluo-3 AM/TMRE (HL-60/DMSO/120 h)
Detekce ROS a ΔΨm DHR-123/TMRE Human promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 µM) NDGA (20 µM)
Kritické parametry víceparametrové vitální analýzy •kvalita označení próbou •kompenzace TMRE+FLUO-3
TMRE
parameter - detector amp. •FL1 - 544 •FL2 - 434 compensation •FL1 - 1.1%FL2 •FL2 - 17.5%FL1
autofluorescence
FLUO-3
ΔΨm
výhody – rychlá a nenáročná metoda – snadné odlišení buněčných populací – možné kombinovat s detekcí řady dalších vitálních funkcí
limitace – specificitu nutno potvrdit další metodou – nemožnost fixace a permeabilizace
Kaspázy - Cysteinové proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové - Klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu - v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy) v cytoplazme, štěpení – aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. „death substráty“ a významně se tak podílet na šíření apoptotického signálu a exekuci apoptózy - struktura: - Prodoména - Katalytické podjednotky – velká a malá (heterotetramer)
Activace pro-kaspáz
www.rsc.org/ej/NP/2001/A909080K/
Substráty kaspáz
Strukturální proteiny – laminy (jádro), aktin, fodrin (cytoskelet), keratin 18 (intermediární filamenta) Signální a regulační proteiny – cPLA2, PKC, některé proteiny rodiny Bcl-2, MEKK-1 Transkripční faktory – MDM2, RB Proteiny v regulaci metabolismu DNA/RNA – PARP, CAD inhibitor (inaktivace DNázy závislá na kaspázách)
Metody detekce kaspázové aktivity detekce
aktivní formy kaspáz detekce aktivity pomocí syntetických selektivních substrátů analýza pomocí značených inhibitorů kaspáz (fluorochrome-labeled inhibitors of caspases (FLICA)) detekce štěpení substrátů kaspáz (PARP, CK18)
Detekce aktivní formy kaspáz
Detekce aktivní formy kaspáz
Intracelulární detekce pomocí protilátek specifických pouze pro aktivní formu enzymu fixace PFA + permeabilizace
Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů
krátké značené peptidy – nepermeabilní – detekce v bunečných extraktech pomocí fluorimetru (Alexis, Roche, BD, BioVision)
– permeabilní – detekce pomocí fluorescenční mikroskopie nebo průtokové cytometrie v intaktních buňkách (OncoImmunin, BioVision)
Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v intaktních buňkách BioVision
– specifické permeabilní substráty (CaspGLOW) – pan-specifický substrát (CASPScreen) (aspartyl)2-Rhodamine 110 (D2R)
Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v živých buňkách
PhiPhiLux (OncoImmunin) – Permeabilní pár fluorochromů kovalentně spojených linkerem (specifická substrátová sekvence) – Po stěpení dochází ke změně konformace a nárůstu fluorescence – buňky nelze dodatečne permeabilizovat !!! – lze snadno studovat dynamiku aktivace
http://www.phiphilux.com/princip1.htm
Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v intaktních buňkách výhody
– jednoduchý protokol – u některých substrátů možnost kombinace s detekcí povrchových antigenů limity
– specifita , nízká toxicita a prostupnost substrátu – nemožnost fixace a permeabilizace
Detekce kaspázových substrátů
Poly(ADP)ribose polymerase (PARP) – substrát kaspázy -3, -6 – rutinní detekce fragmentů pomocí Western blotu – analýza na průtokovém cytometru pomocí protilátek proti štěpeným fragmentům • PARP (p25; p89)
Detekce kaspázových substrátů
Cytokeratin 18 – intermembránová filamenta epitheliálních buněk – Substrát kaspázy-3, -6, -7, -9 – detekce specifického fragmentu pomocí M30 Cytodeath™ protilátky
http://www.peviva.se/prod/prod.php?key=M30%20CytoDEATH%20antibody
Protilátka M30 Cytodeath™
http://www.alexis-biochemicals.com/M30_CytoDEATH_Monoclonal_Antibody.5+M5f92729e270.0.html
Detekce kaspázových substrátů
výhody – jednoduchý protokol ~ standardní intracelulární imunodetekce na metanol fixovaných buňkách – možnost kombinace s detekcí dalších intracelulárních antigenů
limity – kvalita protilátky – buněčná specifita – obtížná kombinace analýzy s detekcí povrchových antigenů – nemožná kombinace s analýzou vitálních funkcí
Jakou metodu použít? více
než jednu; principielně odlišnou; v závislosti na buněčném typu; a experimentálním zásahu.
