Beta-laktamázy se širokým spektrem účinku, jejich genetický základ a metody detekce

Masarykova univerzita v Brně

Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Beta-laktamázy se širokým spektrem účinku, jejich genetický základ a metody detekce (Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie – směr Mikrobiologie)

Eva Brhelová

Brno 2010

Poděkování Ráda bych poděkovala RNDr. Monice Dolejské PhD., vedoucí mé bakalářské práce, za vstřícnost a ochotu v průběhu jejího vypracovávání, cenné rady a připomínky.

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškeré pouţité literární zdroje jsou uvedeny v seznamu literatury.

V Brně dne 13.5.2010

...............................................

2

OBSAH SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK ............................................................................... 5 1 CÍL PRÁCE .............................................................................................................. 6 2 ÚVOD ....................................................................................................................... 7 3 ANTIBIOTIKA ........................................................................................................ 8 3.1 Definice a charakterizace ................................................................................... 8 3.2 Historie pouţití antibiotik .................................................................................. 8 3.3 Vyuţití antibiotik ............................................................................................... 9 3.4 Beta-laktamová antibiotika .............................................................................. 11 3.4.1 Chemická struktura ................................................................................... 11 3.4.2

Mechanizmus účinku ................................................................................ 12

3.4.3

Klinická účinnost a terapeutické pouţití ................................................... 12

3.4.4

Rozdělení .................................................................................................. 12

MECHANIZMY REZISTENCE K BETA-LAKTAMOVÝM ANTIBIOTIKŮM 18 4.1 PBP ................................................................................................................... 18 4.2 Multidrug transportéry ..................................................................................... 18 4.3 Poriny ............................................................................................................... 19 4.4 Beta-laktamázy ................................................................................................. 19 5 BETA-LAKTAMÁZY ........................................................................................... 20 5.1 Klasifikace beta-laktamáz ................................................................................ 20 5.2 Beta-laktamázy s úzkým spektrem účinku ....................................................... 22 5.3 Širokospektré beta-laktamázy (ESBL) ............................................................. 23 5.3.1 Enzymové rodiny širokospektrých beta-laktamáz .................................... 23 4

5.4 Beta-laktamázy AmpC ..................................................................................... 28 5.5 Metalo-beta-laktamázy (MBL) ........................................................................ 29 5.6 Karbapenemázy (KPC) a beta-laktamázy GES................................................ 30 6 MECHANIZMY PŘENOSU GENETICKÉ INFORMACE .................................. 31 6.1 Transformace.................................................................................................... 31 6.2 Konjugace ........................................................................................................ 31 6.3 Transdukce ....................................................................................................... 32 6.4 Genetické elementy odpovědné za šíření antibiotické rezistence .................... 32 6.4.1 Plazmidy ................................................................................................... 32

7

6.4.2

Integrony ................................................................................................... 33

6.4.3

Mobilní genetické elementy – IS a transpozony ....................................... 34

METODY DETEKCE ESBL ................................................................................. 36 7.1 Fenotypové metody .......................................................................................... 36 7.1.1 Konfirmační metoda CLSI........................................................................ 36 7.1.2

Metoda DDST (Double Disk Synergy Test) ............................................. 36

7.1.3

Metoda SDT (Synergy Disk Test) ............................................................ 38

7.1.4

E test ......................................................................................................... 40

7.1.5

3D test (3-dimensional test) ...................................................................... 42

7.2 Genotypové metody ......................................................................................... 43 7.2.1 PCR (Polymerázová řetězová reakce) ...................................................... 43

3

8 9 10 11

7.2.2

PCR-RFLP (Restrikční analýza) ............................................................... 44

7.2.3

LCR (Ligzová řetězová reakce) ................................................................ 44

DISKUZE ............................................................................................................... 46 ZÁVĚR ................................................................................................................... 48 SEZNAM LITERATURY ...................................................................................... 49 SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK .................................................................... 56

4

SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK Ala AMC Arg Asp ATP AZT CAZ CD CLSI CPD CS CTX DDST EARSS EDTA ESBL FEP Gln Glu Gly IMI IS IZ LCR Leu Lys MBL MEM MDR Met MIC MRSA ORF PBP PCR RFLP RTF SDR SDT Ser Thr 3D test

aminokyselina alanin kombinace antibiotik amoxicilin/kyselina klavulanová aminokyselina arginin aminokyselina kyselina asparagová adenosintrifosfát antibiotikum aztreonam antibiotikum ceftazidim kombinace antibiotik cefpodoxim/kyselina klavulanová Clinical and Laboratory Standards Institute antibiotikum cefpodoxim konzervovaný segment integronu antibiotikum cefotaxim double disk synergy test European Antimicrobial Resistance Surveillance System kyselina ethylendiamintetraoctová širokospektrá beta-laktamáza (extended-spectrum beta-lactamase) antibiotikum cefepim aminokyselina glutamin aminokyselina kyselina glutamová aminokyselina glycin antibiotikum imipenem inzerční sekvence inhibiční zóna ligázová řetězová reakce aminokyselina leucin aminokyselina lyzin metalo-beta-laktamáza antibiotikum meropenem multiple-drug-resistance aminokyselina methionin minimální inhibiční koncentrace methicilin rezistentní Staphylococcus aureus otevřený čtecí rámec (open reading frame) protein vázající penicilin (penicilin binding protein) polymerázová řetězová reakce restriction fragment length polymorphism resistance transfer factor specific-drug-resistance synergy disk test aminokyselina serin aminokyselina threonin 3-dimensional test

5

1 CÍL PRÁCE Cílem této práce je shromáţdit a sepsat základní informace o beta-laktamázách obecně s bliţším zaměřením na beta-laktamázy širokospektré. Toto téma je v posledních letech velmi diskutované, protoţe se širokospektré beta-laktamázy stávají stále větším problémem při antibiotické terapii. Proto se práce zaměří na jejich genetický základ a předeším na metody jejich detekce.

6

2 ÚVOD Lidé jiţ od dávných dob, ještě před objevem antibiotik, pouţívali k léčbě některé přírodní látky, aniţ by věděli, co vlastně vyuţívají. Například si na rány přikládali látku natřenou směsí bylin a hlíny, ve které zřejmě byly mikroorganizmy produkující antimikrobní látky. Prvním antibiotikem obsahujícím beta-laktamový kruh, zárověň i prvním objeveným antibiotikem, byl penicilin roku 1928 Alexandrem Flemingem. Od doby jeho objevení dala věda vzniknout dalším přirozeným i semisyntetickým antibiotikům. Bohuţel však ruku v ruce s vyvíjením nových antimikrobních látek, je i snaha mikroorganizmů vytvářet účinná opatření, jak se těmto látkám bránit. A tak nedlouho po zavedení prvních antibiotik do běţné praxe, začínají lékaři zaznamenávat známky rostoucí rezistence. Lidé často pod mylným dojmem antibiotik jako "zázračného léku“ či „všeléku na všechny neduhy“ antibiotika zneuţívají. Po svých lékařích vyţadují předepsání antibiotik i na nemoci způsobené viry, na něţ však tyto léky ani v nejmenším neúčinkují. Dalším neduhem společnosti bývá, ţe pokud jiţ antibiotika dostanou na léčbu bakteriálního onemocnění, často po odeznění příznaků nemoci, pod dojmem, ţe jsou jiţ vyléčeni, léčbu svévolně ukončí ještě před dobráním celé předepsané dávky (Levy 2002). Takto však vzniká ţivná půda pro mikroorganizmy. Můţe se stát a nezřídka se tak děje, ţe člověk, který sám po delší dobu nebral ţádná antibiotika, je kolonizován mikroorganizmem, a ten je rezistentní na běţně podávanou antibiotickou terapii. Jeho léčba se tak komplikuje a často musí být nasazena antibiotika vyšších generací (Levy 1998). Širokospektré beta-laktamázy (ESBL) se vyvinuly z beta-laktamáz úzkého spektra substitucemi jedné a více aminokyselin. Poprvé se objevily v osmdesátých letech, protoţe se v té době začaly ve zvýšené míře pouţívat oxyimino-cefalosporiny a cefalosporiny III. generace. První ESBL enzym byl popsán roku 1985 (Kliebe a kol. 1985).

7

3 ANTIBIOTIKA 3.1 Definice a charakterizace Antibiotikum je chemická látka produkovaná mikroorganizmy, schopná ve zředěném roztoku zabíjet nebo zastavovat růst jiných mikroorganizmů. V dnešní době se mezi antibiotika řadí také látky semisyntetické a syntetické (Votava 2005, Yao a Moellering 2003). Antibiotika rozdělujeme na bakteriostatická a bakteriocidní. Bakteriostatická jsou ta, která zastaví růst a rozmnoţování v sérových hladinách dosaţitelných u nemocného, tím limitují šíření infekce a dají šanci imunitnímu systému vypořádat se s patogenem přítomným v těle nemocného. Naproti tomu bakteriocidní jsou látky, které patogenní buňky zabíjejí. Ovšem platí, ţe co pro jeden mikroorganizmus je bakteriocidní pro druhý můţe být jen bakteriostatické nebo nepůsobit vůbec, v závislosti na citlivosti daného mikroorganizmu na určitou látku (Příborský 2004, Votava 2005, Yao a Moellering 2003).

3.2 Historie pouţití antibiotik Kdyţ se Alexandr Fleming roku 1928 vrátil po víkendu do laboratoře, našel na zapomenuté misce z minulého týdne zajímavý úkaz. Všiml si, ţe na Petriho misce s bakterií Staphylococcus aureus, jsou kolonie lyzovány. Tento stav byl zřejmě způsobený účinky plísně, která vyrostla v těsné blízkosti kolonií stafylokoků. Pokud by si tohoto jevu Fleming nevšiml, nebo tomu nevěnoval pozornost, jako se tomu stalo v případech jiných vědců, vůbec nemuselo dojít k převratnému objevu penicilinu, nebo by k němu došlo aţ mnohem později (Maurois 1959). Fleming dokázal, ţe plíseň produkuje látku o malé molekulové velikosti, která je schopna difundovat agarovou vrstvou a lyzovat bakteriální kolonie. Tuto látku nazval penicilin, protoţe byla produkována plísní Penicillium notatum. Penicilin byl tak účinný, ţe i jeho velmi malé mnoţství bylo schopné ničit kolonie bakterií, dokonce velmi rozšířenou bakteriii Staphylococcus aureus, původce do té doby neléčitelných infekcí (Levy 2002).

8

Fleming několik roků zkoumal vlastnosti a vyuţití penicilinu, ovšem nikdy se mu ho nepodařilo ze substrátu extrahovat. To se povedlo aţ skupině vedené anglickým patologem Floreyem a němcem Chainem, bezmála 15 let po jeho objevení (Maurois 1959). První podání penicilinu člověku bylo uskutečněno 12. února 1941 (Příborský 2004). Podávání penicilinu pacientům nebylo příliš časté, protoţe to byl nepříliš známý lék se sloţitou výrobní procedurou. Větší klinická zkouška se uskutečnila v roce 1942, aţ v důsledku neštěstí v Bostonském klubu Cocoanut Grove. Stovky lidí zde uhořely a další byli s váţnými popáleninami převezeni do okolních nemocnic. Penicilin byl podáván, aby zabránil vzniku a šíření infekcí v důsledku popálenin. Farmaceutické společnosti začaly penicilin vyrábět a lidé věřili, ţe je to univerzální lék, který jim pomůţe od všech nemocí. Jiţ Fleming na základě svých laboratorních pokusů krátce po velkém nástupu pouţívání penicilinu varoval před jeho naduţíváním a moţným vznikem rezistence. Ovšem ani on nepředpokládal, ţe proces vzniku rezistence bude tak rychlý a stane se celosvětovým problémem.

3.3 Vyuţití antibiotik Antibiotika se pouţívají pro antimikrobní terapii bakteriálních infekcí jak u lidí, tak i u domácích a chovných zvířat. Slouţí téţ jako profylaxe při chirurgických zákrocích. U potravinových zvířat se antibiotika pouţívají také jako růstový stimulátor. Subterapeutické dávky beta-laktamů totiţ u zvířat vyvolávají nárůst svalové hmoty. Pouţití antibiotických růstových stimulátorů je v současné době v zemích Evropské unie zakázáno (Smet a kol. 2010). Vesměs platí pravidlo, ţe se pro léčbu zvířat nepouţívají stejné antibiotické přípravky jako v medicíně humánní. Důvodem je vznik moţné rezistence a následná absence účinných antibiotik pro léčbu lidí. Srovnání pouţívaných beta-laktamů u lidí a zvířat uvádí Tab. 1 (Smet a kol. 2010).

9

Tab. 1: Beta-laktamová antibiotika aplikovaná v humánní a veterinární medicíně (Smet a kol. 2010)

Beta-laktamová antibiotika

Veterinární léčba

Humánní léčba

ampicilin, amoxicilin, benzylpenicilin, cloxacilin

penicilin, ampicilin, amoxacilin

amoxicilin + kys. klavulanová

amoxicilin + kys. klavulanová, piperacilin + tazobaktam

Cefalosporiny I. generace

cepadroxil, cefapirin, cefalexin

cefazolin

Cefalosporiny II. generace

cefaclor, cefamandol, cefonicid, ceforanid, cefuroxim

cefuroxim, cefoxitin

Cefalosporiny III. generace

cefovecin, cefpodoxin, ceftiofur

ceftriaxon, cefotaxim, ceftazidim

Cefalosporiny IV. generace

cefquinom

cefepim

Monobaktamy

-

aztreonam

Karbapenemy

imipenem, meropenem

imipenem, meropenem

Peniciliny

Peniciliny + inhibitory beta-laktamáz

10

3.4 Beta-laktamová antibiotika 3.4.1 Chemická struktura Beta-laktamová antibiotika obsahují tzv. beta-laktamový kruh, coţ je čtyřčlenná struktura sloţená ze tří atomů uhlíku a jednoho atomu dusíku. Další členění se děje na základě sloţení dalšího připojeného kruhu. V případě penicilinů se na něj váţe pětičlenný thiazolidinový kruh obsahující atom síry. Na aminoskupinu v 6. pozici se mohou vázat různé radikály. Všechny takto vzniklé látky jsou pak deriváty kyseliny 6aminopenicilánové, tedy penamy (Obr. 1). U cefalosporinů se váţe na čtyřčlenný betalaktamový kruh šestičlenný heterocyklický dihydrothisazinový kruh a vzniká tak derivát kyseliny 7-aminocefalosporinové, nebo téţ cefem (Obr. 2) (Přiborský 2004).

Obr. 1: Struktura penicilinů (Příborský 2004)

Obr. 2: Struktura cefalosporinů (Příborský 2004)

11

3.4.2 Mechanizmus účinku V bakteriální buňce se beta-laktamy váţou na transpeptidázy a karboxylázy, tedy enzymy účastnící se tvorby peptidoglykanu, který tvoří buněčnou stěnu. Tyto enzymy katalyzují tvorbu peptidových a glycinových můstků spojujících řetězce střídajících se molekul kyseliny N-acetylmuramové a N-acetylglukosaminu. Jsou označovány jako PBP neboli proteiny vázající penicilin (z angl. penicillin-binding proteins). Vazba betalaktamu na PBP zastaví tvorbu peptidoglykanu rostoucí bakterie a zároveň spustí autolytické enzymy rozvolňující jiţ vytvořenou buněčnou stěnu, které způsobí lyzi bakteriální buňky. Beta-laktamy tedy na buňky působí bakteriocidně (Votava 2005).

3.4.3 Klinická účinnost a terapeutické pouţití Klinická účinnost beta-laktamů je dána dobou, po kterou je hladina antibiotika v těle nad hodnotou MIC. Většina beta-laktamových antibiotik se poměrně rychle vylučuje z těla močí, mají tedy relativně krátký postantibiotický efekt. Kvůli tomu je účinná hladina antibiotika jen krátce po podání, a proto se jednotlivé dávky musí podávat poměrně často, většinou kaţdých 6 aţ 8 hodin. Toxicita beta-laktamových antibiotik je zanedbatelná. Častý je však výskyt vedlejších účinků, jako jsou alergické reakce po podání ampicilinu projevující se jako kopřivka. V nejtěţších případech můţe dojít aţ k anafylaktickému šoku v důsledku aplikace penicilinu (Votava 2005, Yao a Moellering 2003). Spektrum jednotlivých beta-laktamů je poměrně odlišné. Lze říci, ţe beta laktamová antibiotika nemohou ovlivnit mykobakterie, protoţe pro ně mají nepropustnou buněčnou stěnu. Podobně mykoplazmata, která buněčnou stěnu nemají vůbec a intracelulární bakterie, u kterých je špatný průnik antibiotika do fagocytů jsou vůči těmto antibiotikům rezistentní (Votava 2005). Bliţší pouţití je popsáno u jednotlivých antibiotik.

3.4.4 Rozdělení Beta-laktamy se dělí na peniciliny, cefalosporiny, monobaktamy a karbapenemy. Pro lepší účinnost beta-laktamů se k nim přidávají inhibitory beta-laktamáz. 12

3.4.4.1 Peniciliny Peniciliny jsou vysoce účinná antibiotika, ktará mají velmi nízkou toxicitu. Jsou získávány z kultur plísně Penicillium spp. Biochemickými substitucemi na bočním řetězci se mění vlastnosti penicilinů, jako jsou šířka antimikrobního spektra, stabilita vůči pH a beta-laktamázám. Všechny peniciliny dobře pronikají do tkání a tělních tekutin (Votava 2005, Yao a Moellering 2003).

3.4.4.1.1 Acidolabilní peniciliny Jak jiţ naznačuje jejich název, tyto peniciliny jsou nestabilní v kyselém prostředí ţaludku, a proto se podávají pouze parenterálně (Votava 2005, Yao a Moellering 2003).  Benzylpenicilin (syntetický penicilin G) je pouţíván při léčbě grampozitivních koků i tyčinek, gramnegativních koků a bakterií spirálovitého tvaru. Některé gramnegativní tyčinky jsou téţ citlivé, například pasteurely nebo některé bakteroidy.  Draselná sůl (krystalický penicilin G) je podávána intravenózně při závaţných

infekcích

pneumokokové

způsobených

pneumonie,

streptokoky,

aktinomykózy,

klostridii,

gonokokové

u

sepse,

meningokokové meningitidy, třetího stadia lymeské boreliózy či leptospirózy a mnohých dalších.  Prokain benzylpenicilin (prokain penicilin G) je špatně rozpustnou solí, která se podává intramuskulárně jednou za 24 hodin a benzylpenicilin je postupně uvolňován do těla. Je podáván na infekce způsobené Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi a citlivých kmenů pneumokoků, aktinomycet a korynebakterií.

3.4.4.1.2 Acidostabilní peniciliny Těmto penicilinům nevadí kyselé prostředí ţaludku, a proto mohou být podávány v tabletové formě (Votava 2005, Yao a Moellering 2003).  Phenoxymethylpenicilin (syntetický penicilin V) je jedním z nejčastěji předepisovaných antibiotik, převáţně kvůli dobrému vstřebávání a perorálnímu podávání. 13

3.4.4.1.3 Peniciliny odolné vůči stafylokokové penicilináze Tyto peniciliny mají stejné spektrum účinnosti na mikroorganizmy, avšak jejich účinky jsou niţší neţ je tomu u benzylpenicilinu. Jejich výhodou je, ţe odolávají stafylokokové beta-laktamáze (Votava 2005, Yao a Moellering 2003).  Oxacilin je lékem první volby u stafylokokových infekcí a smíšených infekcí stafylokokových a streptokokových.  Kloxacilin je kombinací oxacilinu s ampicilinem.  Methicilin se pouţívá pouze v zahraničí, odtud je převzatý název MRSA (methicilin rezistentní Staphylococcus aureus), na který samozřejmě u nás pouţívaný oxacilin neúčinkuje.

3.4.4.1.4 Aminopeniciliny Aminopeniciliny mají širší spektrum účinnosti na mikroorganizmy neţ předchozí peniciliny. Z grampozitivních bakterií je účinnost rozšířena i na Enterococcus faecalis a také listerie. Aminopeniciliny však působí hlavně na gramnegativní tyčinky jako jsou E. coli, Proteus mirabilis, bordetely, salmonely, shigely, helikobaktery, hemofily, ovšem jen pokud netvoří beta-laktamázy. Aminopeniciliny je moţné podávat jak perorálně tak i parenterálně (Votava 2005, Yao a Moellering 2003).  Amoxicilin je velmi dobře vyuţitelný, a proto se podává výhradně perorálně. Vyuţívá se pro léčbu horních a dolních cest dýchacích, zánětů středního ucha, močových infekcí, nekomplikované kapavky, k eradikaci Helicobacter pylori a profylaxi endokarditidy při operačních zákrocích.  Ko-amoxicilin je kombinací amoxicilinu a kyseliny klavulanové. Je vyuţíván u sepsí, při nitrobřišních a gynekologických infekcí, infekcích měkkých tkání, kostí a kloubů.  Ampicilin

je

podáván

parenterálně

při

infekcích

způsobených

Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Listeria monocytogenes. Dále také u salmonelových a shigelových infekcí.

14

3.4.4.1.5 Ureidopeniciliny Jsou pouze parenterálně podávané peniciliny působící na široké spektrum bakterií včetně Pseudomonas aeruginosa (Votava 2005, Yao a Moellering 2003). 

Ko-piperacilin je kombinace piperacilinu s tazobaktamem, který lze pouţít i na septické stavy u pacientů s leukémií.

3.4.4.1.6 Karboxypeniciliny Karboxypeniciliny jsou dobře účinné na gramnegativní bakterie. Jsou odolné vůči stafylokokové penicilináze. Pouţívají se na léčbu infekcí vyvolanými enterobakteriemi, Pseudomonas aeruginosa, streptokoky, hemofily, neiseriemi a anaeroby. Není účinný na klebsiely a enterokoky (Votava 2005, Yao a Moellering 2003).

3.4.4.2 Cefalosporiny Základem všech cefalosporinů je kyselina 7-aminocefalosporanová, která byla poprvé vyizolována z plísně rodu Cephalosporium (Yao a Moellering 2003). Mají široké spektrum působnosti, s vyjímkou enterokoků, a malou toxicitu pro makroorganizmus. Cefalosporiny lze u závaţných infekcí kombinovat s dalšími typy antibiotik, jako jsou aminoglykozidy, nitroimidazoly či polypeptidické antibiotika. Cefalosporiny se rozdělují do čtyř skupin podle spektra účinnosti a schopnosti průniku buněčnou stěnou. Účinnost na gramnegativní bakterie stoupá od první do čtvrté generace. Některé cefalosporiny III. generace jsou účinné i na pseudomonády. Ovšem od I. do III. generace klesá účinnost na grampozitivní koky (Stürenburg a Mack 2003).

3.4.4.2.1 Cefalosporiny I. generace Cefalosporiny I. generace mají stejné spektrum působnosti na bakterie jako ampicilin. Dobrá působnost je na rody Escherichia, Klebsiella a Proteus. Pro perorální podání je moţné pouţít cefalexin, cefadroxil a cefaclor. Injekčně můţe být podáván hospitalizovaným pacientům cefalotin nebo cefazolin (Votava 2005, Yao a Moellering 2003).

15

3.4.4.2.2 Cefalosporiny II. generace Tato beta-laktamová antibiotika jsou stabilnější vůči beta-laktamázám. Jejich spektrum je rozšířeno o další gramnegativní bakterie, a to Haemophilus influenzae, Bacteroides fragilis a některé kmeny seracií. Mezi perorální antibiotika této skupiny patří cefuroxim axetil a cefprozil, injekčně bývá podáván cefuroxim. Cefoxitin, dříve podávaný na nitrobřišní a gynekologické infekce způsobené anaeroby, se přestává pouţívat, protoţe je silným induktorem beta-laktamáz (Votava 2005, Yao a Moellering 2003).

3.4.4.2.3 Cefalosporiny III. generace Tyto cefalosporiny jsou velmi účinné na gramnegativní bakterie. Ovšem cefixim nepůsobí na pseudomonády a stafylokoky. Dále se pouţívají parenterálně dávkované cefotaxim a ceftriaxon, který má dlouhý biologický poločas a můţe být podávaný jen jednou denně. Na Pseudomonas aeruginosa jsou účinné ceftazidim a cefoperazon. Cefoperazon je méně odolný vůči beta-laktamázám, a proto bývá v kombinaci se sulbaktamem pod názvem ko-cefoperazon. Tato antibiotika jsou však silnými induktory beta-laktamáz, je proto nutné při jejich podávání zváţit moţná rizika (Stürenburg a Mack 2003, Votava 2005, Yao a Moellering 2003).

3.4.4.2.4 Cefalosporiny IV. generace Cefalosporiny IV. generace jsou podávány jenom parenterálně v nemocnicích. Velmi rychle pronikají zevní membránou bakterií, jsou stabilní vůči beta-laktamázám a vysoce afinitní k PBP. V porovnání s ostatními generacemi cefalosporinů dobře účinkují na grampozitivní bakterie, především stafylokoky. Pouţívají se na ţivot ohroţující gramnegativní nebo smíšené infekce. V České republice se pouţívá cefepim (Stürenburg a Mack 2003, Votava 2005, Yao a Moellering 2003).

16

3.4.4.3 Monobaktamy Aztreonam je jediným monobaktamem. Je účinný na gramnegativní bakterie, včetně Pseudomonas aeruginosa, Neisseria spp. a Haemophilus spp. Aztreonam je vhodný na léčení meningitid, protoţe dokáţe prostoupit zanícenými meningy (Yao a Moellering 2003).

3.4.4.4 Karbapenemy Karbapenemy jsou účinné na nejširší spektrum bakterií, včetně těch, které produkují

beta-laktamázy.

Imipenem

je

semisyntetický derivát

thienamycinu

produkovaného Streptomyces spp., dalšími karbapenemy jsou meropenem a ertapenem. Karbapenemy dobře reagují na infekci způsobenou stafylokoky, streptokoky, Bacillus spp. a Listeria monocytogenes. Více neţ 90 % enterobakterií je ke karbapenemům citlivých, výjimkou jsou bakterie tvořící karbapenemázy, například Enterococcus spp (Stürenburg a Mack 2003, Yao a Moellering 2003).

3.4.4.5 Inhibitory beta-laktamáz Inhibitory

beta-laktamáz

mají

podobnou

strukturu

jako

peniciliny

či

cefalosporiny. Mají však slabý antimikrobní účinek. Ve společnosti beta-laktamového antibitika zesilují jeho účinek a působí jako návnady pro beta-laktamázy. Ty se na ně irreverzibilně naváţou a beta-laktamové antibiotikum pak můţe proniknout do buňky.  Kyselina klavulanová je produktem Streptomyces clavuligerus (Neu a Fu 1978).

Kyselina

klavulanová

působí

společně

s peniciliny

a

cefalosporiny na beta-laktamázu produkující stafylokoky, klebsiely, Haemophilus influenzae, Moraxela catarrhalis, Neisseria gonorhoeae a další bakterie z čeledi Enterobacteriaceae (Yao a Moellering 2003).  Sulbactam je semisyntetický derivát penicilinu se slabou antimikrobní aktivitou (Aswapokéé a Neu 1978).  Tazobaktam je derivát kyseliny penicilanové strukturně podobný sulbaktamu. Samostatně má velmi nízkou antimikrobní aktivitu. (Yao a Moellering 2003).

17

4 MECHANIZMY REZISTENCE K BETA-LAKTAMOVÝM ANTIBIOTIKŮM 4.1 PBP Přirozená rezistence bakterie k beta-laktamovému antibiotiku můţe být spojena s absencí vazebných míst těchto antibakteriálních látek – proteinů vázajících penicilin (PBP). Dalším mechanizmem rezistence spojeným s PBP je změna cílového místa, která můţe být způsobena metylací nebo mutací nukleotidové sekvence kódující daný protein (Guardabassi a Courvalin 2006). Jiţ v roce 1977 byly popsány první PBP u druhu Escherichia coli, která má celkem sedm různých typů PBP (Spratt 1977).

4.2 Multidrug transportéry Aktivní effux je proces vypuzování metabolitů a toxických látek ven z buňky za spotřeby energie. Aktivní efflux zprostředkovávají transmembránové proteiny, které mají široké spektrum specifity. Effluxní pumpy se rozdělují podle substrátové specifity, zdroje energie a fylogenetického vývoje. Variabilita effluxních pump je velmi vysoká. Přesto můţeme effluxní pumpy rozdělit na substrátově specifické (SDR z angl. specificdrug-resistance) a nespecifické, tzv. multidrug transportéry (MDR z angl. multipledrug-resistance) (Butaye a kol. 2003). Multidrug transportéry udělují buňce nízký stupeň rezistence. Bývají kódovány geny na chromozomu. Podle zdroje energie jsou MDR děleny na dvě skupiny: ABC transportéty (z angl. ATP-binding cassette) a sekundární transportéry (Putman a kol. 2000). ABC transportéry vyuţívají jako zdroj energie hydrolýzu ATP, zatímco sekundární transportéry vyuţívají transmembránový elektrochemický gradient protonů nebo sodíkových iontů pro vypuzení antibiotika z buňky (Guardabassi a Courvalin 2006).

18

4.3 Poriny Vnější membrána gramnegativních bakterií má kompaktní strukturu díky interakci nenasycených mastných kyselin lipopolysacharidových molekul, takţe je pro hydrofilní molekuly méně prostupná. Tato vlastnost chrání buňku před potenciálně toxickým vnějším prostředím (Nikaido 2003). Hydrofilní sloučeniny potřebné pro buňku pronikají do jejího nitra prostřednictvím pórů proteinové povahy. Ty je moţno rozdělit na specifické kanály s vazebným místem a nespecifické poriny (Nikaido 1993). Poriny nemají ţádné specifické místo, přesto do buňky některé látky difundují snáze neţ jiné. Toto závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech jako je molekulová hmotnost, náboj či lipofilita (Nikaido 1993). Nejvíce prostudované poriny jsou u bakterie Escherichia coli. U této bakterie byly popsány dva hlavní poriny, OmpF s větším kanálkem a OmpC, který má kanálek uţší. U druhu Klebsiella pneumoniae byly popsány také dva poriny. OmpK35 je analogický s porinem OmpF u E. coli a OmpK36 analogický s OmpC (MartínézMartínéz 2008).

4.4 Beta-laktamázy Inaktivace antibiotik beta-laktamázami patří mezi nejčastější a zároveň nejnebezpečnější mechanizmy rezistence k beta-laktamovým antibiotikům. Geny pro rezistenci jsou přenášeny mobilními genetickými elementy, coţ usnadňije jejich šíření i v rámci různých druhů bakterií (Guardabassi a Courvalin 2006).

19

5 BETA-LAKTAMÁZY Beta-laktamázy jsou enzymy schopné hydrolyzovat beta-laktamový kruh, který obsahují peniciliny, cefalosporiny a další příbuzné antibakteriální látky (Bush a Bradford 2007). Beta-laktamázy se po objevení začaly klasifikovat následovně: 1.

podle spektra antibiotik, která dokáţou hydrolyzovat

2.

dle citlivosti na inhibitory beta-laktamáz, které je dokáţou inhibovat

3.

podle toho, zda jsou přenášeny plazmidem či jsou lokalizovány na

chromozomu.

5.1 Klasifikace beta-laktamáz První klasifikace byla vytvořena jiţ v roce 1968, kdy byly tyto enzymy rozčleněny na penicilinázy a cefalosporinázy (Sawai a kol. 1968). V následujících letech se přidalo řazení podle základního substrátu a izoelektrického bodu (Sykes a Matthew 1976). V roce 1981 se začlenila mezi beta-laktamázy skupina enzymů hydrolyzujících cefuroxim (Mitsuhashi a Inoue 1981). Bushová v roce 1989 provedla reorganizaci třídění beta-laktamáz (Bush a Singer 1989). S následnou revizí kolegiem Bushová, Jacoby, Medeiros jsou od roku 1995 beta-laktamázy tříděny podle preferovaného substrátu a jejich citlivosti k antibiotikům (Bush a kol. 1995). Toto členění je však zaloţeno na fenotypové vlastnosti, v důsledku bodové mutace můţe dojít ke změně substrátové specifity a citlivosti k inhibitorům, coţ způsobí změnu začlenění enzymu do skupiny. Z tohoto důvodu vypracoval Ambler členění na základě sekvencí aminokyselin a beta-laktamázy tak rozdělil do čtyř skupin značených A-D (Ambler 1980). Třída A: Enzymy této třídy velmi rychle hydrolyzují beta-laktamová antibiotika. Většinou jsou kódovány plazmidem kromě chromozomálních genů Klebsiella spp., Proteus vulgaris a Bacteroides spp. Jsou produkovány bakteriemi jak gramnegativními, tak i grampozitivními. Nejčastějšími betalaktamázami této třídy u čeledi Enterobacteriaceae jsou enzymy TEM-1 a 20

SHV-1. Aminokyselinovými substitucemi v těchto dvou původních, pak vznikají enzymy s rozšířeným polem působnosti, tzv. širokospektré betalaktamázy, které v posledních letech způsobují velké problémy s léčbou bakteriálních nákaz (Kolář a kol. 2002). Třída B: Tato třída enzymů je důleţitá svojí schopností rozkládat karbapenemy. Rezistence bývá rozšířena o některá další beta-laktamová antibiotika s výjimkou monobaktamů a není reverzibilní účinkem inhibitorů betalaktamáz. Patří sem například plazmidy přenášený enzym IMP-1 izolovaný z Pseudomonas aeruginosa. Produkce enzymů třídy B je popisována i u Stenotrophomonas maltophilia, v tomto případě se však jedná o chromozomální enzymy (Kolář a kol. 2002). Třída C: Enzymy této třídy bývají produkovány pouze gramnegativními tyčinkami. Patří sem chromozomální beta-laktamázy typu AmpC, které způsobují rezistenci na cefalosporiny I. a II. generace a na širokospektré peniciliny. Spontánní mutací genu ampR dochází k inhibici represorových molekul, které tlumí gen ampC. Následně dojde k derepresi, čímţ vznikne kontinuální nadprodukce molekul AmpC, která zapříčiní vznik rezistence na cefalosporiny III. generace. Účinkem inhibitorů není tato rezistence reverzibilní. Obvykle těmto enzymům odolávají karbapenemy (imipenem, meropenem) a také cefalosporiny IV. generace (cefepim, cefpirom) (Kolář a kol. 2002). Třída D: Do této třídy jsou řazeny OXA enzymy, které jsou kódovány plazmidy některých enterobakterií. Karbapenemázy z této skupiny jsou řazeny do devíti různých podskupin (Queenan a Bush 2007). Většina z nich se vyskytuje u acinetobakterů a pseudomonád (Livermore a Woodford 2006). Klasifikace podle Bushové, Jacobyho a Medeirose má dobrou návaznost na členění dle Amblera. Enzymy jsou začleňovány do 4 skupin podle substrátu a profilu inhibice. Toto členění bývá spíše v dříve datovaných publikacích.

21

Skupina 1: Obsahuje cefalosporinázy, jeţ nejsou inhibovány inhibitory beta-laktamáz. Většina enzymů je kódována chromozomálně. Některé odpovídají betalaktamázám molekulární třídy C Amblerova členění, tedy AmpC. Skupina 2: Je zastoupena nejpočetněji ze všech skupin. Obsahuje penicilinázy a cefalosporinázy, které bývají obvykle dobře inhibovatelné kyselinou klavulanovou. Jedná se o plazmidem kódované enzymy. Skupina odpovídá třídám A a D z Amblerova členění. Skupina je rozdělena do 8 podskupin podle substrátové specifity. A to na: 2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e a 2f. Skupina 3: Této skupině odpovídá podle Amblera molekulární třída B, tudíţ obsahuje metalo-beta-laktamázy, mající ve své struktuře iont zinku, které hydrolyzují široké spektrum substrátů včetně karbapenemů (s vyjímkou aztreonamu). Skupina 4: Nepříliš početná skupina penicilináz, které nejsou inhibovány kyselinou klavulanovou a zatím nemají zařazení do molekulární třídy, jsou produkovány kmeny Burkholderia cepacia.

5.2 Beta-laktamázy s úzkým spektrem účinku První na plazmidu nesená beta-laktamáza izolovaná z gramnegativní bakterie byla popsána v šedesátých letech dvacátého století (Datta a Kontomichalou 1965). Tato betalaktamáza označená jako TEM-1 byla nalezená u kmene E. coli izolovaného z krve řecké pacientky jménem Temoniera, proto označení TEM (Medeiros 1984). Pár let po první izolaci TEM-1 jiţ byla tato beta-laktamáza rozšířena po celém světě. Tato betalaktamáza dokáţe hydrolyzovat peniciliny a základní cefalosporiny (cefalotin a cefaloridin) (Bradford 2001). Beta-laktamáza TEM-2 vznikla substitucí jedné aminokyseliny, přesněji Gln39Lys, která však nezměnila substrátovou specifitu a tudíţ TEM-2 nepatří mezi ESBL (Barthélémy a kol. 1985). Další plazmidem přenášenou beta-laktamázou s úzkým spektrem účinku je SHV-1 (z angl. sulphydryl variable) nalezená u kmene Klebsiella pneumoniae a E. coli (Tzouvelekis a Bonomo 1999). Tato beta-laktamáza je kódována geny na chromozomu u klebsiel, ale přenášena plazmidy u E. coli (Bradford 2001).

22

5.3 Širokospektré beta-laktamázy (ESBL) Širokospektré beta-laktamázy – ESBL (z angl. extended-spectrum betalactamases) jsou enzymy, které jsou produkovány některými bakteriemi, především gramnegativními tyčinkami. Tyto enzymy hydrolyzují peniciliny, cefalosporiny všech generací a monobaktamy. Naopak samy jsou inhibovány inhibitory beta-laktamáz, kyselinou klavulanovou, tazobaktamem a sulbaktamem (Hrabák a kol. 2007a). Většina ESBL jsou enzymy obsahující serin v aktivním místě, tudíţ patří do třídy A podle Amblera. Molekulární hmotnost těchto enzymů je 29000 Da (Bradford 2001). ESBL vznikají substitucemi jedné nebo více aminokyselin v základních enzymech TEM-1, TEM-2 a SHV-1. Prvním popsaným enzymem schopným hydrolyzovat betalaktamy s rozšířeným spektrem, především oxyimino-cefalosporiny, byl SHV-2 izolovaný v Německu z kmene Klebsiella ozaenae (Kliebe a kol. 1985). V dnešní době je charakterizováno přes čtyři stovky ESBL (Smet a kol. 2010). Protoţe je výskyt ESBL celosvětově rozšířený problém, věnují se mu vědci v mnoha zemích. Jelikoţ nová širokospektrá beta-laktamáza můţe vzniknout jen jedinou mutací v nukleotidové sekvenci genů kódující jiţ známé enzymy, je potřeba udrţovat aktualizovanou databázi. Pro tyto potřeby je pod záštitou Karen Bushové a George Jacobyho zřízená webová stránka www.lahey.org/studies/, kde jsou zveřejňovány nejnovější poznatky o počtu a struktuře beta-laktamáz.

5.3.1 Enzymové rodiny širokospektrých beta-laktamáz 5.3.1.1 TEM beta-laktamázy Všechny širokospektré enzymy skupiny TEM jsou odvozeny od enzymů TEM-1. Vznikají substitucemi v jedné nebo více aminokyselinách. Prvním širokospektrým enzymem v této skupině je TEM-12 se substitucí Arg164Ser, popsaný poprvé v Londýně roku 1982 (Du Bois a kol. 1995). Dalším popsaným enzymem se stal TEM-3, který byl izolován roku 1987 (Sougakoff a kol. 1988). Beta-laktamáza TEM-3 dříve značená také jako CTX-1 se liší od TEM-1 ve třech aminokyselinách Gln39Lys/Glu104Lys/Gly238Ser.

23

Ve skupině TEM bývají časté substituce v pozicích Leu21, Gln39, Glu104, Arg164, Asp179, Met182, Ala237, Gly238, Glu240 a Thr265 (Obr. 3) (Bradford 2001, Gniadkowski 2008). Izoelektrický bod se u derivátů TEM pohybuje v rozmezí 5,2 aţ 6,5 (Bradford 2001). Ke dni 30. 4. je na adrese www.lahey.org/studies/ beta-laktamáza s nejvyšším pořadovým číslem TEM-181.

Obr. 3: Aminokyselinové substituce ESBL derivátů skupiny TEM (Bradford 2001)

5.3.1.2 SHV beta-laktamázy Beta-laktamázy typu SHV jsou po typu TEM druhé nejpočetnější. Ke dni 30. 4. jsou na stránce www.lahey.org/studies/ beta-laktamázy typu SHV s nejvyšším pořadovým číslem SHV-133. Jsou kódovány genem blaSHV. Zodpovídají aţ za 20 % plazmidem nesené rezistence na ampicilin u kmene Klebsiella pneumoniae (Tzouvelekis a Bonomo 1999). Izoelektrický bod se ve skupině SHV pohybuje

24

v rozmezí hodnot pI 7,0 aţ 8,2 (Bradford 2001). Nejčastější substituce se u SHV vyskytují v pozicích: Ala146, Gly156, Leu169, Asp179, Arg205, Gly238 a Glu240 (Obr. 4) (Gniadkowski 2008). Obr. 4: Aminokyselinová substituce ESBL enzymů skupiny SHV (Bradford 2001)

5.3.1.3 CTX-M beta-laktamázy Tato skupina je poměrně novou skupinou plazmidem přenášených širokospekrých beta-laktamáz hydrolyzujících cefotaxim. CTX-M beta-laktamázy se v osmdesátých letech vyskytovaly spíše sporadicky v Japonsku, Evropě a Argentině (Bonnet 2004). Ale jiţ v devadesátých letech bylo rozšíření enzymu CTX-M v Argentině a okolních státech masivní (Rossolini a kol. 2008). V současné době studie hovoří o tom, ţe osm z deseti případů bakteriálních infekcí s produkcí ESBL jsou způsobeny enzymy CTX-M (Ben-Ami a kol. 2006). Enzymy CTX-M bývají nalézány především u druhu Salmonella enterica serovar Typhimurium a Escherichia coli, ale byly zaznamenány i u dalších bakterií z čeledi Enterobacteriaceae (Bradford 2001). Většinou jsou tyto enzymy izolovány z močových infekcí v běţné populaci, nejedná se o nozokomiální nákazu (Cantón a kol. 2008).

25

Existuje předpoklad, ţe tyto beta-laktamázy mají původ v rodu Kluyvera (Poirel a kol. 2002). Izoelektrický bod se ve skupině CTX-M pohybuje v rozmezí pI 7,6 aţ 8,9 (Bradford 2001). Skupina enzymů CTX-M se dá rozdělit do šesti podskupin: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-25, CTX-M-8, Toho-2 a CTX-M-9 (Obr. 5) (Rossolini a kol. 2008). Enzymy skupiny CTX-M se vyskytují především v Jiţní Americe, východní Evropě a na Blízkém Východě (De Champs a kol. 2000). Ovšem v poslední době se rozšířily i do Indie a Číny (Paterson a Bonomo 2005). Některé enzymové typy jsou pouze místně specifické, ale jiné jsou jiţ celosvětově rozšířené (Cantón a kol. 2008). Jediným beta-laktamovým antibiotikem pouţitelným na léčbu infekce způsobené ESBL typu CTX-M zůstávají karbapenemy (Paterson a Bonomo 2005). Enzym CTX-M-15 se můţe stát rezistentním vůči karbapenemáze ztrátou porinu ve vnější membráně (Elliott a kol. 2006), toto můţe být závaţný problém, protoţe enzym CTX-M-15 je jedním z nejrozšířenějších enzymů u humánních kmenů enterobakterií. U izolátů ze zvířat je nejrozšířenější enzym CTX-M-1 (Meunier a kol. 2006).

26

Obr. 5: Celosvětové rozložení enzymů CTX-M (Rossolini a kol. 2008)

27

5.3.1.4 OXA beta-laktamázy Tato rychle se rozrůstající skupina beta-laktamáz je řazena podle Amblera do třídy D. OXA enzymy hydrolyzují oxacilin a kloxacilin. Jsou pouze slabě inhibovatelné kyselinou klavulanovou (Bush a kol. 1995). OXA enzymy jsou velmi rozmanité, podobnost je ve skupině jen 20-30 %. Také kvůli tomu se pohybuje izoelektrický bod v rozmezí od pI 5,5 do 8,9. OXA beta-laktamázy se vyskytují převáţně u druhu Pseudomonas aeruginosa (Livermore 1995). OXA-10 hydrolyzuje cefotaxim, ceftriaxon a aztreonam. Dalšími enzymy v této skupině jsou OXA-11, -14, -16, -17, -19, -15, -18, -28, -31, -32, -35 a -45 (Toleman a kol. 2003). Současná produkce karbapenem hydrolyzujících metalo-beta-laktamáz a aztreonam hydrolyzujících enzymů můţe vést k rezistenci na všechna beta-laktamová antibiotika (Toleman a kol 2003).

5.4 Beta-laktamázy AmpC Βeta-laktamázy gramnegativními

typu

AmpC

bakteriemi.

jsou

Geny pro

enzymy AmpC

produkované

beta-laktamázu

některými

se

nacházejí

v chromozomu celé řady bakterií, zejména čeledi Enterobacteriaceae (Hrabák a kol. 2007a). Původně byly geny pro tyto beta-laktamázy identifikovány pouze na chromozomu, později však byly nalezeny geny pro AmpC beta-laktamázy nesené plazmidem (Hanson 2003, Thomson 2001). Beta-laktamázy AmpC hydrolyzují peniciliny, cefamyciny, většinu cefalosporinů a monobaktamy, nehydrolizují karbapenemy. Jsou inhibovány kyselinou boritou či oxacilinem,

nikoli

však

kyselinou

klavulanovou.

Mohou

být

produkovány

konstitutivně či inducibilně. Inducibilní enzymy AmpC nejsou exprimovány bez přítomnosti induktoru, kterým jsou inhibitory beta-laktamáz. Dalšími induktory jsou imipenem či cefoxitin. Mutací v regulačním systému AmpC dochází ke konstitutivní nadprodukci beta-laktamáz, přičemţ tato změna je nevratná (Černohorská a Andrysík 2008). Plazmidem přenášené geny enzymů AmpC jsou známy od roku 1989 (Philippon a kol. 2002). Bývají izolovány z nozokomiálních infekcí i běţně v populaci. Malé změny v sekvencích

aminokyselin

umoţnily

vznik

několika

enzymových

rodin.

28

Rozpoznáváme 43 typů CMY, 7 variant enzymu FOX, 4 varianty enzymů ACC, LAT a MIR. Dále to jsou 3 varianty typu ACT a MOX a konečně dvě varianty DHA. Některé z těchto variant můţou být kódovány téţ na chromozomu (Jacoby 2009).

5.5 Metalo-beta-laktamázy (MBL) Metalo-beta-laktamázy jsou enzymy inherentně přítomné v genomu některých bakterií, jako jsou například Bacillus cereus (Queenan a Bush 2007), Bacillus anthracis (Queenan a Bush 2007), Stenotrophomonas maltophilia (Nicodemo a Garcia Paez 2007) či Aeromonas hydrophila (Massidda a kol. 1991). U zmíněných bakterií se často vykytují další serinové beta-laktamázy, které způsobují vysoký stupeň rezistence k beta-laktamům. Produkce obou typů enzymů můţe být inducibilní, se stejným mechanizmem indukce jako je tomu u AmpC betalaktamáz (Nicodemo a Garcia Paez 2007). MBL jsou enzymy hydrolyzující peniciliny, cefalosporiny a karbapenemy (Hrabák a Chudáčková 2008). Nejsou inhibovány inhibitory beta-laktamáz. Tyto enzymy jsou inhibovatelné chelátory kovových iontů, jako jsou EDTA, kyselina 2-merkaptopropionová nebo p-chloromerkuribenzoát (Hrabák a kol. 2007b). Na základě molekulárního členění se dělí do tří základních skupin, B1, B2 a B3, které se liší především strukturou aktivního místa (Garau a kol. 2005, Walsh a kol. 2005). Ke skupině B1 se řadí MBL enzymy detekované u bakterií Bacillus cereus, Bacteroides fragilis, Elizabethkingia meningoseptica a také získané MBL (IMP, VIM, GIM, SPM, SIM). Do skupiny B2 jsou řazeny MBL nalezené u Aeromonas spp. a Serratia fonticola. Enzymy ze skupin B1 a B3 většinou hydrolyzují všechny betalaktamy, včetně karbapenemů. Monobaktamy však nehydrolyzují. Substrátová specifita ve skupině B2 je omezená striktně na karbapenemy (Queenan a Bush 2007, Walsh a kol. 2005). Geny v současnosti nejvíce rozšířených izolátů spadají do skupin VIM, IMP, GIM, a SIM. Ty jsou obvykle lokalizovány na integronech, převáţně třídy 1. Po transpozici integronu na konjugativní plazmid, dochází k horizontálnímu přenosu. Tímto mechanizmem došlo k přijmutí genů MBL u pseudomonád, acinetobakterů a enterobakterií (Queenan a Bush 2007, Walsh a kol. 2005). První získaná MBL byla

29

izolována v Japonsku v roce 1990 u Pseudomonas aeruginosa (Osano a kol. 1994). I kdyţ je výskyt získaných MBL nejčastější u pseudomonád a acinetobakterů, jejich častý záchyt v poslední době u enterobakterií je alarmující (Hrabák a Chudáčková 2008).

5.6 Karbapenemázy (KPC) a beta-laktamázy GES První enzym ze skupiny karbapenemáz označený jako SME-1 byl poprvé identifikován v roce 1982 ve Velké Británii u druhu Serratia marcescens (Naas a kol. 1994). Dalšími pak byly IMI-1 a NMC-A nalezené u druhu Enterobacter cloacae především v USA, Francii a Argentině (Queenan a Bush 2007, Radice a kol. 2004, Rasmussen a kol. 1996). Získané karbapenemázy byly poté nalezené u kmenů Klebsiella pneumoniae a podle této bakterie byly také pojmenované jako KPC – z angl. Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (Jacoby 2006). KPC velmi silně hydrolyzují všechny peniciliny, cefalosporiny a aztreonam (Hrabák a Chudáčková 2008). Enzymy typu GES byly vyizolovány v Řecku roku 2000 u bakterie Enterobacter cloacae (Giakkoupi a kol. 2000) a poté také ve Francouzské Guianě u Klebsiella pneumoniae (Poirel a kol. 2000). Podle druhého zmiňovaného místa nálezu také dostaly jméno – „ Guiana Extended Spectrum“ (Jacoby 2006).

30

6 MECHANIZMY PŘENOSU GENETICKÉ INFORMACE 6.1 Transformace Transformací se u bakteriálních buněk myslí přenos genetického materiálu z donorové buňky do recipientní, bez jejich přímého kontaktu. Jde tedy o přenos volných izolovaných molekul DNA do určité molekulární velikosti, které se přichytí na buněčnou stěnu recipientních buněk, a poté aktivním transportem pronikají přes buněčnou stěnu do cytoplazmy, kde mohou procesem crossing-overu rekombinovat s recipientní DNA (Pikálek 2003). Protoţe touto cestou se do buňky dostanou jen molekuly o poměrně malé molekulové velikosti, bývají často rekombinantně zabudovány jen jeden nebo dva donorové geny. Zvýšení účinnosti bakteriální transformace lze dosáhnout záměrnou úpravou stavebního uspořádání buněčných stěn recipientních buněk, například elektroporací (Pikálek 2003).

6.2 Konjugace Konjugace patří mezi tzv. parasexuální rekombinace. Podstatou bakteriální konjugace je přiblíţení dvou bakteriálních buněk do těsné blízkosti. Po těsném kontaktu jejich buněčných stěn se z donorové buňky přenese pilusem do buňky recipientní molekula DNA. V recipientní buňce pak za příznivých podmínek dojde k procesu rekombinace mezi molekulami recipientní a donorové DNA. Přenos z donorové buňky do recipientní je výhradně jednosměrný (Willetts 1984). Donorová buňka je taková, která ve své cytoplazmě obsahuje specifický konjugativní F-plazmid (fertilitní). Recipientní buňka takový plazmid neobsahuje. F-plazmid zprostředkuje přenos genetického materiálu jen tehdy, pokud se zabuduje do donorové DNA. V takovém případě je konjugace řízena F-plazmidem, který přechází do recipientní buňky a za sebou táhne navázanou DNA z chromozomu buňky donorové. Jelikoţ je však toto spojení buněk velmi křehké a nestabilní, často se stává, ţe se vlákno přenášené genetické informace přeruší a do recipientní buňky se dostane jen pár genů, které jsou nejblíţe počátku přenosu. Takto přenesené geny z donorové buňky rekombinují s homologní oblastí buňky recipientní (Pikálek 2003). 31

6.3 Transdukce Transdukcí se rozumí horizontální přenos mezi buňkami jednoho aţ dvou genů prostřednictvím bakteriofága. Bakteriofág přisedne na donorovou buňku, virová nukleová kyselina je vstříknuta dovnitř hostitelské buňky. Během zmnoţování virionů se ke genetické informaci viru připojí část genetické informace hostitelské bakterie. Při plnění hlavičky bakteriofága je takto navázaná DNA hostitele vnesena do hlavičky spolu, nebo místo části virové DNA. Po lyzi hostitelské buňky se viriony dostávají do prostředí, kde mohou infikovat další buňky. Pokud virion se začleněnou DNA z hostitelské buňky infikuje další bakteriální buňku a injikuje tuto kombinovanou genetickou informaci do recipientní buňky, můţe v ní dojít k rekombinaci recipientní DNA s úsekem DNA z donorové buňky přenesené virovou částicí procesem crossing-overu (Pikálek 2003, Stanisich 1984).

6.4 Genetické elementy odpovědné za šíření antibiotické rezistence 6.4.1 Plazmidy Plazmidy jsou malé kruţnicové nebo lineární jednotky extrachromozomální dsDNA o velikosti 2 aţ 100 kilobází. Velké plazmidy se nachází u gramnegativních bakterií a malé plazmidy bývají především u bakterií grampozitivních. Plazmidová genetická informace se replikuje nezávisle na replikaci chromozomu. V buňce můţe být několik kopií téhoţ plazmidu. Plazmidy nejsou na rozdíl od chromozomu nezbytné pro ţivot a správnou činnost buňky. Plazmidy však často nesou geny, které jsou pro bakterie výhodné a v kompetičních bojích uţitečné. Mohou to být například geny pro lepší vyuţití substrátu, metabolické reakce, rezistence vůči antimikrobním a desinfekčním látkám, těţkým kovům, bakteriocinům nebo také mohou nést faktory virulence (Stanisich 1984). Jako R-plazmidy bývají označovány velké konjugativní plazmidy, které nesou geny pro rezistenci na více antibiotik. Obsahují dvě základní stavební jednotky, RTF faktor (Resistance Transfer Factor) a R-determinanty. RTF faktor nese geny pro

32

replikaci plazmidu, produkci pilů a konjugativní přenos. R-determinanty jsou sloţeny z transpozonů, které nesou geny pro rezistenci na různá antibiotika. Díky transpozonům, které se mohou různě kombinovat je struktura a sloţení R-plazmidů hodně variabilní. Můţou na nich proto vznikat nové kombinace genů, potaţmo rezistence k novým či dalším antibiotikům (Hradecká 2007).

6.4.2 Integrony Integrony jsou skupinou genetických elementů, které nesou ve své struktuře jednu nebo více genových kazet a gen int, který kóduje integrázu, coţ je místně specifická rekombináza umoţňující jejich inzerci. Dalšími sloţkami jsou promotor a specifické místo začlenění attI (Stokes a Hall 1989). Genové kazety jsou nejjednodušší mobilní elementy, které obsahují pouze jeden gen. Většinou kódující rezistenci k nějakému antibiotiku. Tento gen se váţe na rekombinační místo označované attC nebo tzv. 59-bp element (Joss a kol. 2009). Genové kazety se vyskytují ve dvou formách, jako volné, kovalentně uzavřené kruţnice, nebo začleněné do integronu. Většinou neobsahují promotor, tudíţ ve formě kovalentně uzavřené kruţnice nemůţe dojít k jejich expresi. Ta je umoţněna aţ po začlenění do integronu, který poskytuje společný promotor. Začlenění genových kazet probíhá homologní rekombinací mezi attI místem integronu a attC místem genové kazety (Obr. 6). Jejich začlenění je katalyzované integrázou, která je zodpovědná i za excizi. Nezačleněné genové kazety jsou schopné přeţít i lyzi buňky. Transformací se dostanou do nové, a v ní, pokud obsahuje integron, se můţe genová kazeta homologní rekombinací opět začlenit (Hradecká 2007, Joss a kol. 2009). Integrony se rozdělují do čtyř tříd, podle odlišností v int genech. Integron třídy 1, nazývaný sul1 integron, je popsán nejvíce ze všech. V jeho struktuře lze identifikovat dvě základní oblasti, tzv. konzervované segmenty (CS) na 5´- a 3´- konci integronu. V oblasti 5´- konce se vyskytuje gen intI, promotor a attI místo. Na 3´ CS je gen qacE1 kódující membránový protein, který zodpovídá za rezistenci ke kvartérním amoniovým solím. Dále gen sul1 kódující rezistenci k sulfonamidům a také ORF5. Do vnitřní variabilní oblasti se můţou v místě attI začlenit genové kazety, nebo můţe zůstat prázdná (Bissonnette a Roy 1992).

33

Obr. 6.: Schéma začlenění genové kazety do integronu (Joss a kol. 2009)

6.4.3 Mobilní genetické elementy – IS a transpozony Mezi mobilní genetické elementy patří IS elementy a transpozony. Mají schopnost přemisťovat se v rámci genomu vyštěpením z donorového místa a začleněním do místa cílového. Transpozice je katalyzována enzymem transponázou, kterou si sami kódují. Transpozice rozlišujeme na intermolekulární a intramolekulární, podle toho, jestli transpozice probíhá na stejné molekule DNA, nebo mezi dvěma molekulamim (Rosypal 2006). Cílová místa transpozonů nejsou homologní s transpozony. V místě inzerce transpozonu dochází ke zdvojení ve stejném směru krátkých sekvencí DNA, takţe transpozon je ohraničen na obou koncích přímými repeticemi. Rozlišujeme transpozice konzervativní a replikativní. Při konzervativní transpozici se z donorového místa vystřihne transpozon a poté dojde k inzerci v místě cílovém. Základem replikativní transpozice je zreplikování transpozonu v donorovém místě s následnou inzercí jeho kopie do místa cílového (Rosypal 2006). Mobilní elementy se rozdělují do čtyř tříd (Hradecká 2007, Rosypal 2006). 1. IS elementy a transpozony. IS elementy neboli inzerční sekvence, jsou nejjednodušším typem mobilních elementů. Dosahují délky 650 aţ 1600 párů bazí. Na koncích jsou přímé nebo obrácené repetice a ve vnitřní části kódují 34

genem tnp transponázu. To je enzym, který katalyzuje transpozici. Transponáza rozeznává koncové obrácené repetice transpozonu. Štěpí cílové sekvence, do kterých se vkládá transpozon, a po transpozici spojují cílové sekvence s vloţeným transpozonem. Transpozony dosahují velikosti několika tisíc párů bazí. Jejich konce jsou ohraničeny IS elementy, které nemusí být stejné. Stačí, kdyţ je aktivní pouze jeden, který zprostředkuje transpozici. Transpozony ve své vnitřní struktuře obsahují jeden či více genů, které nejčastěji kódují rezistenci k antibiotikům. 2. Transpozony Tn3. Tento transpozon obsahuje dva geny, jejichţ produkty jsou vyuţívány v procesu transpozice. Jsou to geny tnpA kódující transponáz a tnpR kódující rezolvázu. Dále obsahuje specifické místo res, kam se váţe rezolváza. Zbytek transpozonu je obsazen genem bla, který kóduje beta-laktamázu. 3. Bakteriofágové transpozony typu Mu 4. Transpozony typu Tn7.

35

7 METODY DETEKCE ESBL Pro klinickou praxi je nezbytné dokázat určit, zdali je bakterie rezistentní či citlivá na daná antibiotika. Pro základní vyhledání podezřelých kultur se dá vyuţít průměrů inhibičních zón (IZ) nebo hodnot minimální inhibiční koncentrace (MIC). K detekci ESBL se vyuţívá jejich vlastnosti inhibice kyselinou klavulanovou či jinými inhibitory. V případě prokázání producenta ESBL je kultura povaţována za rezistentní ke všem penicilinovým antibiotikům, monobaktamům (aztreonamu) a cefalosporinům všech generací, nehledě na výsledky minimální inhibiční koncentrace nebo zdánlivé citlivosti v testování inhibičních zón diskových metod (Hrabák a kol. 2007a).

7.1 Fenotypové metody 7.1.1 Konfirmační metoda CLSI Tato metoda vyuţívá srovnání vytvořených inhibičních zón kolem antibiotických disků. Na Mueller-Hinton agar se naočkuje testovaná kultura. Na ni se pak pokládají papírové disky, jeden napuštěný určitým cefalosporinem a druhý napuštěný kombinací téhoţ cefalosporinu a inhibitoru beta-laktamáz, např. kyselinou klavulanovou. Pokud se průměr inhibičních zón kolem disků liší o více neţ 5 mm, s tím, ţe zóna kolem disku s kombinací cefalosporinu a inhibitoru musí být větší, kultura je hodnocena jako producent ESBL (Hrabák a kol. 2007a, NCCLS 2002).

7.1.2 Metoda DDST (Double Disk Synergy Test) Tato metoda je opět zaloţena na výsevu kultury na Mueler-Hinton agar, na který se posléze pokládají disky s antibiotiky. V tomto testu se hodnotí deformace inhibičních zón mezi diskem s amoxicilinem/klavulanovou kyselinou, aztreonamem a disky s cefalosporiny (Obr. 7). Pokud se vytvoří inhibiční zóna ve tvaru „zátky od šampaňského“ směrem od disku s amoxicilinem/kyselinou klavulanovou směrem k některému disku s antibiotikem, pak je tato kultura označena za producenta ESBL (Obr. 8) (Jarlier a kol 1988, Thomson a Sanders 1992).

36

Metoda se také pouţívá pro zjišťování producentů inducibilní AmpC. Antibiotika i rozloţení disků zůstává stejné jako u testování producenta ESBL. Avšak vzdálenost středů disků je 20-30 mm. Testování se provádí na dvou souběţných miskách, jedné s Mueler-Hinton agarem a druhé s inhibitorem AmpC - Mueler-Hinton agar s oxacilinem. Producent inducibilní AmpC vytváří inhibiční zónu ve tvaru písmene D u disku s cefalosporiny nebo aztreonamu ve směru k disku amoxicilin/klavulanová kyselina. (Hrabák a kol. 2007a) Pro detekci hyperprodukce AmpC nebo současnou produkci AmpC a ESBL se vyuţívá schopnosti kyseliny borité a oxacilinu inhibovat AmpC enzymy (Černohorská a Andrysík 2008).

Obr. 7 Doporučené uspořádání disků při metodě DDST kombinované s metodou CLSI (Hrabák a kol. 2007a)

Kódové označení diskù (obsah disku): AMC: kombinace amoxicilin/klavulanovákyselina. (20/10 µg); AZT: aztreonam (30 µg); CAZ: ceftazidim (30 µg); CPD:cefpodoxim (10 µg); CD: kombinace cefpodoxim/klavulanová kyselina (10/1 µg); CTX: cefotaxim (30 µg); FEP: cefepim (30 µg).

37

Obr. 8: Pozitivní výsledek testu na produkci ESBL (Hrabák a kol. 2007a)

7.1.3 Metoda SDT (Synergy Disk Test) SDT je metoda pro detekci matalo-beta-laktamáz zaloţená na principu detekce deformace inhibičních zón na Mueller-Hinton agaru mezi disky s karbapenemy a diskem s chelátory kovových iontů (EDTA, 2-merkaptopropionová kyselina). Po naočkování kmene na agar se disky rozmístí tak, aby jejich středy byly ve vzdálenosti 20 mm (Obr. 9). Na sterilní disk filtračního papíru umístěného ve středu misky se napipetuje 10 µl roztoku EDTA, nebo 1 µl kyseliny 2-merkaptopropionové a nechá se zaschnout. Producenti MBL vytváří charakteristickou inhibiční zónu (Obr. 10) u disku s některým beta-laktamem ve tvaru „zátky od šampaňského“ nebo „vějíře“ ve směru ke středovému disku s EDTA, v případě středového disku napuštěného kyselinou 2-merkaptopropionovou má inhibiční zóna tvar vajíčka, tzv. „egg-like“. (Hrabák a kol. 2007b).

38

Obr. 9 Doporučené uspořádání disků pro metodu SDT (Hrabák a kol. 2007b)

Kódové oznaèení diskù (obsah disku): CAZ: ceftazidim (30 µg); MEM: meropenem (10 µg); IMI: imipenem (10 µg); D: disk s chelátorem (10 µl zásobního roztoku EDTA, resp. 1 µl 2-merkaptopropionové kyseliny).

Obr. 10: Pozitivní výsledek testu na produkci MBL (Hrabák a Chudáčková 2008)

Označení: 1- EDTA, 2- imipenem, 3- meropenem, 4- ceftazidim

39

7.1.4 E test E-test je metoda pro zjišťování minimální inhibiční koncentrace za pomoci prouţku papíru napuštěného antibiotikem. Na papírku je vyznačen gradient antibiotika. E-test pro detekci betalaktamáz bývá rozdělen na dvě poloviny, jedna je napuštěna antibiotikem např. ceftazidim a druhá polovina je napuštěna kombinací antibiotika a inhibitoru beta-laktamáz např. ceftazidim a kyselina klavulanová. Kmen je povaţován za producenta beta-laktamáz: 1. pokud je vytvořená zóna v oblasti cefalosporinu nejméně třikrát větší neţ zóna v okolí kombinace cefalosporin/kyselina klavulanová (Obr. 11), 2. vytvoří se kruhovitá zóna okolo části papírku s cefalosporinem u hodnoty niţší neţ je nejniţší hodnota gradientu (Obr. 12), 3. pokud je oválná zóna okolo části s cefalosporinem jakkoli zdeformovaná v zuţující se části (Obr. 13) (Drieux a kol. 2008). E-test se také vyuţívá pro testování karbapenemáz. Pokud při srovnání MIC imipenemu a MIC imipenemu s konstantní koncentrací EDTA, je MIC bez inhibitoru nejméně třikrát větší, je kmen vyhodnocen jako producent MBL (Hrabák a kol. 2007b).

Obr. 11: Pozitivní test ESBL (http://www.abbiodisk.com/)

40

Obr. 12: Pozitivní test ESBL – kruhová zóna (http://www.abbiodisk.com/)

Obr. 13: Pozitivní test ESBL – deformace zúžené části zóny (http://www.abbiodisk.com/)

41

7.1.5 3D test (3-dimensional test) 3D test doporučují někteří autoři k průkazu především karbapenemáz. Do MuelerHintonova agaru se vyříznou dráţky. Povrch plotny je inokulován dobře citlivým kmenem Escherichia coli. Do středu mezi dráţky se vloţí disk s testovaným antibiotikem. Do dráţek se napipetuje celobuněčný extrakt testovaného bakteriálního kmene. Celobuněčný extrakt se získá sonikací nebo opakovaným zamrazováním a rozmrazováním 24 hodinové kultury. Citlivý kmen E. coli vytvoří okolo disku s antibiotikem inhibiční zónu. Pokud testované kmeny produkují karbapenemázu, dojde k deformaci takto utvořené zóny směrem k disku (Obr. 14) (Thompson a Sanders 1992). Dosud však nenašla 3D metoda širší uplatnění v klinické praxi. Důvodem můţe být, ţe fenotypový projev enzymů ESBL je maskován enzymy AmpC, které nejsou citlivé k inhibitorům beta-laktamáz, např. kyselině klavulanové, tazobaktamu a sulbaktamu. V takovém případě se musí vyuţít inhibice enzymu AmpC jinými inhibitory (kyselinou boritou či oxacilinem) (Černohorská a Andrysík 2008, Hrabák 2007). Metoda je také náročná na přípravu a obtíţně reprodukovatelná v případě sníţené produkce enzymu (Hrabák a Chudáčková 2008).

Obr. 14: Průkaz karbapenemáz 3D metodou (Hrabák a Chudáčková 2008)

42

7.2 Genotypové metody Jednotlivé enzymové rodiny mají rozdílné izoelektrické body a této vlastnosti se dá vyuţít při měření izoelektrické fokusace. Tato metoda však jiţ nedokáţe rozlišit jednotlivé enzymy ve skupině. Nezastupitelnou metodou je PCR amplifikace genu bla nebo jeho části s následnou sekvenací získaného PCR produktu. Takto získaná sekvence se pak porovná s databázemi beta-laktamáz. Dalšími metodami jsou restrikční analýza (RFLP) a ligázová řetězová reakce (LCR). Pouţívání těchto metod má řadu důleţitých výhod. Usnadňuje vyhodnocování výsledků MIC, kdyţ je hodnota na hranici účinnosti, nebo těsně okolo ní. Rychlé zjištění genů rezistence v porovnání s fenotypovými metodami umoţňuje včasné nasazení terapeutické léčby v případech akutní infekce. Genetické testy jsou mnohem přesnější při monitorování epidemiologického rozšíření v nemocnicích a mezi populací. Jsou také pouţívány jako „zlatý standard“ pro ověřování přesnosti nových metod testování citlivosti, při kterých je MIC hraniční (Rasheed a Tenover 2003).

7.2.1 PCR (Polymerázová řetězová reakce) Principem PCR je replikace nukleových kyselin, coţ je základním molekulárním procesem všech ţivých organizmů. Základním mechanizmem PCR je cyklické opakování enzymové syntézy nových řetězců z vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5´→3´ prostřednictvím DNA-polymerázy. Vybraný úsek nukleotidové sekvence je vymezen připojením dvou primerů (Obr. 15), které se naváţou na protilehlé řetězce DNA tak, ţe jejich 3´-konce směřují proti sobě. Syntéza nových vláken probíhá po přidání DNA-polymerázy a nukleotidů na obou matricových řetězcích protisměrně. K syntéze DNA se pouţívají termostabilní polymerázy, které jsou izolovány z termofilních mikroorganizmů. Například z rodu Thermus aquaticus je to Taq DNApolymeráza, která dokáţe odolat teplotám, při nichţ jiţ DNA denaturuje. Tato vlastnost dovoluje, aby syntéza DNA probíhala opakovaně ve formě cyklů. PCR je tedy proces, při němţ se pravidelně opakují tři zcela odlišné cykly závisející na teplotě a reakční směsi. Prvním krokem je denaturace dvouřetězcových molekul DNA při teplotě 94 °C. Druhým krokem je připojení primerů k odděleným řetězcům DNA, které se děje při teplotách od 30 °C do 65 °C. A posledním, třetím krokem je syntéza nových řetězců

43

DNA prostřednictvím DNA-polymerázy v rozmezí teplot 65 – 75 °C v závislosti na pouţité polymeráze (Šmarda a kol. 2005).

7.2.2 PCR-RFLP (Restrikční analýza) Stanovení polymorfizmu délky restrikčních fragmentů u produktů PCR je modifikací standardní PCR pro typizaci cílové sekvence, obvykle určitého genu, obsahujícího sekvenční polymorfizmus. Můţe být provedena analýza jakéhokoliv genu v závislosti na volbě pouţitých primerů. Tato sekvence o délce aţ 5 kbp se amplifikuje za přísných podmínek pomocí primerů, které se připojují ke koncovým konzervovaným oblastem. Výsledné produkty PCR amplifikace stejné délky, jsou štěpeny restrikční endonukleázou a elektroforeticky analyzovány. Typizace je prováděna restrikčními spektry fragmentů amplifikované DNA (Šmarda a kol. 2005).

7.2.3 LCR (Ligzová řetězová reakce) LCR je alternativní metodou amplifikace sondy, jejímţ základem je ligace oligonukleotidových sond v závislosti na jejich vazbě na cílovou DNA. Metoda opět probíhá v opakujících se cyklech. Tyto cykly zahrnují denaturaci DNA, hybridizaci sond a ligaci. Pro LCR jsou potřeba čtyři oligonukleotidy neboli LCR-primery. Metoda vyuţívá termostabilní DNA-ligázu z Thermus aquaticus, která si i po mnoha cyklech udrţuje aktivitu k ligaci párů komplementárních oligonukleotidových sond po jejich připojení na cílovou sekvenci. Aby DNA-ligáza mohla připojit 3´-OH skupinu sousedního primeru, musí oligonukleotidy obsahovat 5´-koncovou fosfátovou skupinu. Ligace je úspěšná jen tehdy, pokud dojde k dokonalému spárování 3´- a 5´konců obou sousedících oligonukleotidových sond k cílové molekule DNA. LCR je vhodná především pro určování jednonukleotidových polymorfizmů, protoţe vadné spárování byť i jediné báze na 3´-konci sondy vázající se po směru transkripce způsobí neúspěšnou ligaci a amplifikaci a umoţní tak odlišení nesprávně navázané báze (Šmarda a kol. 2005).

44

Obr. 15: PCR analýza genů rezistence (Rasheed a Tenover 2003)

45

8 DISKUZE Antibiotika jsou pouţívána k léčbě lidí a zvířat, a to jak domácích, tak zvířat hospodářských v průmyslových velkochovech. Antibiotika jsou vylučována močí popřípadě stolicí, mohou se tak dostávat v nerozloţené formě spolu se splašky do přírody. Proběhlo velké mnoţství studií, které si vzaly za cíl odebírat vodu v řekách a potocích blízko nemocničních zařízení (Kim a kol. 2008, Schwartz a kol. 2003). K velkému úţasu všech se opravdu ukázalo, ţe v takto odebraných vzorcích vody je poměrně velké mnoţství různých antibiotik. To má samozřejmě vliv na ekosystém, protoţe se vytváří rezistence bakterií přítomných ve vodě. Ale tato antibiotika se také dostávají do těl mnoha dalších ţivočichů ţijících v takto zamořené oblasti. Jsou jimi ryby, vodní ptactvo a divoká lesní zvěř (Corvaglia a kol. 2008). Bakterie střevní mikroflóry makroorganizmu si pod vlivem selekčního tlaku vytvoří rezistenci a migrováním makroorganizmu na menší či větší vzdálenosti se rezistentní bakterie mohou roznést do okolí, jak bylo několikrát dokumentováno (Smet a kol. 2010). Na novém stanovišti makroorganizmu se tak objeví kmeny bakterií rezistentní na antibiotika, která se v dané lokalitě nikdy nevyskytovala. Bakterie se s výkaly mohou dostat do vodního systému dané oblasti a pak uţ je jen krok k horizontálnímu šíření genů rezistence mezi další bakterie na stanovišti, a následné nákaze dalších zvířat a lidí (Smet a kol. 2010). Další moţností je, ţe se antibiotika uloţí v těle těchto zvířat, které pak lidé zkonzumují, a tím do svého těla dostávají nízkou hladinu antibiotik, která však mohou selektovat patogenní bakterie (Smet a kol. 2010). Ty pak mohou způsobit infekci, která nebude léčitelná běţně podávanými antibiotiky. Dalším nebezpečným faktorem, který hraje významnou roli v tvorbě rezistence je pouţívání subterapeutických dávek antibiotik pro zvýšení přírůstku na váze u chovných zvířat. Tato praxe je sice v zemích Evropské unie zakázána, ale jinde ve světě je naprosto běţná. Opět tak v potravě člověk do těla dostává nízké dávky antibiotik. Do odpadů z nemocničních zařízení nebo farem neodchází jenom antibiotika, ale také vyselektované rezistentní bakterie, které se dostávají do vodního ekosystému a půdy, kde šíří geny rezistence mezi původní bakteriální mikroflórou. Například pole jsou stále hnojena zvířecími exkrementy, ve kterých se dá předpokládat výskyt rezistentních bakterií. Ty se dostanou do půdy, vody a mohou také infikovat volně ţijící

46

zvířata. Tyto bakterie se však mohou na rostlinách dostat zpět do chovu jako píce pro dobytek, popřípadě zelenina na stůl lidí. Pouţívání

antibiotik

je

v celosvětovém

měřítku

alarmující,

z důvodu

kaţdoročního nárůstu spotřebovaných antibiotik. V Evropě a uţ i v Americe funguje systém snaţící se omezit podávání antibiotik a kontroluje rozšíření rezistence. V Evropě je tento systém označen jako EARSS (The European Antimicrobial Resistance Surveillance System) (http://www.rivm.nl/earss/). Česká republika je v tomto programu zapojena od roku 2000. Bohuţel převáţně v rozvojových zemích jsou antibiotika běţně k dostání bez lékařského předpisu, zakoupit si je tak můţe kdokoli, kdo na ně má peníze. Jelikoţ jsou novější a účinější antibiotika hodně drahá, jsou v těchto zemích pouţívány pouze základní řady antibiotik. Ta jsou však kvůli politice volného prodeje léčiv neúčinná (Levy 2002). Beta-laktamázy, zejména ESBL, jsou poměrně aktuálním problémem současného zdravotnictví, protoţe si bakterie na současná antibiotika vytváří velmi rychle rezistenci. ESBL jsou velmi rozšířené kvůli velké oblibě cefalosporinů III. generace v humánní i veterinární medicíně. Je to hlavně z toho důvodu, ţe jsou účinné na široké spektrum bakterií, grampozitivních i gramnegativních. Nová antibiotika se nehledají, popřípadě nevyrábí. Pouze se rozšiřuje spektrum účinnosti jiţ stávajících látek změnami na bočních řetězcích beta-laktamového kruhu. Takto upravená antibiotika však mají podobnou strukturu jako starší verze a bakterie si na ně velmi snadno znovu utvoří rezistenci. Z tohoto důvodu si myslím, ţe by se farmaceutické firmy měly zaměřit na hledání nebo výrobu strukturně úplně nových typů antibiotických léčiv. Také by se měly vyvinout mechanizmy dokonalejšího odbourávání antimikrobních látek z prostředí, aby se tyto preparáty nehromadily v přírodě a potravním řetězcem se k nám znovu nevracely.

47

9 ZÁVĚR Ve své práci jsem stručně shrnula základní poznatky o beta-laktamových antibioticích, jejich struktuře a moţnostech pouţití. Dále jsem se věnovala přenosu genů rezistence a vzniku rezistence jako takové. Značná část mé práce je věnována klasifikaci beta-laktamáz a metodám jejich průkazu. Toto je poměrně náročné a obtíţné téma, protoţe beta-laktamázy byly při svém objevování pojmenovávány velmi rozmanitě. Například podle substrátu, který rozkládají, nebo místa objevení, popřípadě jména pacienta, u kterého byly poprvé izolovány, či jména vědce, který je poprvé vyizoloval, atd. Velké mnoţství takto pojmenovaných beta-laktamáz muselo být přejmenováno po otestování molekulárněbiologickými metodami. Kvůli moţnosti změny substrátové specifity po pouhé jediné mutaci v genu kódujícím beta-laktamázu, je vznik nových rezistencí velmi častý. Proto je potřeba stále udrţovat aktuální databázi jiţ objevených mutací genu bla. S tím je také spojena nutnost zdokonalování a vyvíjení nových metod detekce beta-laktamáz. ESBL je nemoţné detekovat fenotypovými metodami, pokud je bakterie současně producentem AmpC beta-laktamázy. V této oblasti je ještě široké pole působnosti pro vývojová pracoviště zkoumající antibiotika, jejich vliv na prostředí a na člověka.

48

10 SEZNAM LITERATURY Ambler R.P. (1980): The structure of β-lactamases. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 289: 321-331. Aswapokéé N., Neu H.C. (1978): A sulfone beta-lactam compound which acts as a beta-lactamase inhibitor. J. Antibiot. 31: 1238-1244. Barthélémy M., Labia R., Péduzzi J. (1985): Distinction entre les structures primaires des β-lactamases TEM-1 et TEM-2. Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 136: 311-321. Ben-Ami R., Navon-Venezia S., Schwaber M.J. (2006): Influx of extended-spectrum βlactamase-producing Enterobacteriaceae into the hospital. Clin.Infect. Dis. 42: 925-934. Bissonnette L., Roy P.H. (1992): Characterization of In0 of Pseudomonas aeruginosa plasmid pVS1, an ancestor of integrons of multiresistance plasmids and transposons of gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 174: 1248-1257. Bonnet R. (2004): Growing group of extended-spectrum β-lactamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 1-14. Bradford P.A. (2001): Extended-spectrum β-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistence threat. Clin. Microbiol. Rev. 14: 933-951. Bush K., Bradford P.A. (2007): β-lactamases: historical perspectives. In: Bonomo R.A., Tolmasky M.E. (eds.), Enzyme-mediated resistance to antibiotics: mechanisms, dissemination, and prospects for inhibition, s. 67-80. ASM Press, Washington, DC. Bush K., Jacoby G.A., Medeiros A.A. (1995): A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1211-1233. Bush K., Singer S.B. (1989): Biochemical characteristics of extended broad spectrum βlactamases. Infection. 17: 429-433. Butaye P., Cloeckaert A., Schwarz S. (2003): Mobile genes coding for efflux-mediated antimicrobial resistance in Gram-positive and Gram-negative bacteria. Int. J. Antimicrob. Agents. 22: 205-210. Cantón R., Baquero F., Coque T.M., Machado E., Novais A., Peixe L., Valverde A. (2008): Prevalence and spread of extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in Europe. Clin. Microbiol. Infect. 14: 144-153. 49

Corvaglia A.R., Demarta A., Gaia V., Peduzzi R. (2008): Role of residual antibiotics in aquatic environment on the selection and diffusion of bacterial resistances of Aeromonas, Acinetobacter and Legionella. Archives des Sciences. 61: 89-99. Černohorská L., Andrysík T. (2008): Detekce β-laktamáz typu AmpC u gramnegativních bakterií izolovaných z moče. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 57: 141146. Datta N., Kontomichalou P. (1965): Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in Enterobacteriaceae. Nature. 208: 239-244. De Champs C., Bonnet R., Chanal C., Sirot D., Sirot J. (2000): A 1998 survey of extended-spectrum beta-lactamases in Enterobacteriaceae in France. The French study group. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 3177-3179. Drieux L., Brossier F., Jarlier V., Sougakoff W. (2008): Phenotypic detection of extended-spectrum β-lactamase production in Enterobacteriaceae: review and bench guide. Clin. Microbiol. Infect. 14: 90-103. Du Bois S.K., Marriott M.S., Amyes S.G. (1995): TEM- and SHV- derived extendedspectrum beta-lactamases: relationship between selection, structure and function. J. Antimicrob. Chemother. 35: 7-22. Elliott E., Brink A.J., Van Greune J. (2006): In vivo development of ertapenem resistance in a patient with pneumonia caused by Klebsiella pneumoniae with an extended-spectrum β-lactamase. Clin. Infect. Dis. 42: 95-98. Garau G., Di Guilmi A.M., Hall B.G. (2005): Structure-based phylogeny of the metalloβ-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 2778-2784. Giakkoupi P., Loukova V., Sofianou D., Tsakris A., Tzelepi E., Tzouvelekis L.S. (2000): IBC-1, a novel integron-associated class A β-lactamase with extended-spectrum properties produced by an Enterobacter cloacae clinical strain. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 2247-2253. Gniadkowski M. (2008): Evolution of extended-spectrum β-lactamases by mutation. Cli. Microbiol. Infect. 14: 11-32. Guardabassi L., Courvalin P. (2006): Modes of antimicrobial action and bacterial resistance. In: Aarestrup F.M. (ed.), Antimicrobial resistance in bacteria of animal origin, s. 1-18. ASM Press, Washington, DC.

50

Hanson N.D. (2003): AmpC β-lactamases: what do we need to know for the future? J. Antimicrob. Chemother. 52: 2-4. Hrabák J. (2007): Klinicky významné β-laktamázy gramnegativních bakterií: širokospektré β-laktamázy (ESBL). Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 56: 103-111. Hrabák J., Bergerová T., Urbášková P., Vaniš V (2007a): Průkaz β-laktamáz širokého spektra (ESBL) a typu AmpC u enterobakterií. Zprávy CEM. 16: 31-36. Hrabák J., Bergerová T., Chudáčková E., Jindrák V., Urbášková P., Vaniš V. (2007b): Průkaz metalo-β-laktamáz (BML) u gramnegativních bakterií. Zprávy CEM. 16: 417422. Hrabák J., Chudáčková E. (2008): Rezistence enterobakterií ke karbapenemům. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 57: 125-136. Hradecká H. (2007): Mechanizmy a způsoby šíření rezistencí k antibiotikům u salmonel. Dizertační práce, Masarykova univerzita, 66 s. Jacoby G.A. (2006): β-lactamase nomenclature. Antimicrob. Agents Chemother. 50: 1123-1129. Jacoby G.A. (2009): AmpC β-lactamases. Clin. Microbiol. Rev. 22: 161-182. Jarlier V., Fournier G., Nicolas M., Philippon A. (1988): Extended broad-spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and suspectibility pattern. Rev. Infect. Dis. 10: 867-878. Joss M.J., Boucher Y., Doolittle W.F., Gillings M.R., Koenig J.E., Labbate M., Polz M.F., Stokes H.W. (2009): ACID: annotation of cassette and integron data. BMC Bioinformatics 10: 118. Kim J., Kang H.Y., Lee Y. (2008): The identification of CTX-M-14, TEM-52, and CMY-1 enzymes in Escherichia coli isolated from the Han River in Korea. J. Microbiol. 46: 478-481. Kliebe C., Nies B.A., Meyer J.F., Tolxdorff-Neutzling R.M., Wiedemann B. (1985): Evolution of plazmid-coded resistance to broad-spectrum cephalosporins. Antimicrob. Agents Chemother. 28: 302-307. Kolář M., Čermák P., Látal T. (2002): Klinicko-mikrobiologické podklady racionální antibiotické léčby. Trios, Praha, 110 s.

51

Levy S.B. (1998): Multidrug resistance: a sign of the times. New Eng. J. Med. 338: 1376-1378. Levy S.B. (2002): The antibiotic paradox: how the misuse of antibiotics destroys their curative powers. Perseus Publishing, United States, 312 s. Livermore D.M. (1995): β-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microbiol. Rev. 8: 557-584. Livermore D.M., Woodford N. (2006): The beta-lactamase threat in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter. Trends Microbiol. 14: 413-420. Martínéz-Martínéz L. (2008): Extended-spectrum beta-lactamases and the permeability barrier. Clin. Microbiol. Infect. 14: 82-89. Massidda O., Rossolini G.M., Satta G. (1991): The Aeromonas hydrophila cphA gene: molecular heterogenity among class B metallo-β-lactamases. J. Bacteriol. 173: 46114617. Maurois A. (1959): La vie de Sir Alexander Fleming. Librairie Hachette, Paris, 245 s. Medeiros A.A. (1984): β-lactamases. Br. Med. Bull. 40: 18-27. Meunier D., Jouy E., Kobisch M., Lazizzera C., Madec J.Y. (2006): CTX-M-1- and CTX-M-15-type beta-lactamases in clinical Escherichia coli isolates recovered from food-producing animals in France. Int. J. Antimicrob. Agents 28: 402-407. Mitsuhashi S., Inoue M. (1981): Mechanisms of resistance to betalactam antibiotics. In: Mitsuhashi S. (ed.), Beta-lactam antibiotics, s. 41-56. Springer-Verlag, New York Naas T., Livermore D.M., Nordmann P., Sougakoff W., Vandel L. (1994): Cloning and sequence analysis of the gene for a carbapenem-hydrolyzing class A β-lactamase SME-1, from Serratia marcescens S6. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1262-1270. NCCLS (2002): Performance standards for antimicrobial disk and dilution suspectibility tests for bacteria isolated from animals; approved standard – 2nd ed. NCCLS document M31-A2. Pensylvania, 86 s. Neu H.C., Fu K.P. (1978): Clavulanic acid, a novel inhibitor of beta-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 14: 650-655. Nicodemo A.C., Garcia Paez J.I. (2007): Antimicrobial therapy for Stenotrophomonas maltophilia infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 26: 229-237.

52

Nikaido H. (1993): Transport across the bacterial outer membrane. J. Bioenerg. Biomembr. 25: 581-589. Nikaido H. (2003): Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 593-656. Osano E., Arakawa Y., Wacharotayankum R., Ohta M. (1994): Molecular characterization of an enterobacterial metallo-beta-lactamase found in a clinical isolate of Serratia marcescens that shows imipenem resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 71-78. Paterson D.L., Bonomo R.A. (2005): Extended-spectrum β-lactamases: a clinical update. Clin. Microbiol. Rev. 18: 657-686. Philippon A., Arlet G., Jacoby G.A. (2002): Plasmid-determined AmpC-type βlactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1-11. Pikálek P. (2003): Dědičnost virů a bakterií. In: Rosypal S. (ed.), Nový přehled biologie, s. 631-632. Scientia, Praha. Poirel L., Kampfer P., Nordmann P. (2002): Chromosome-encoded Ambler class A βlactamase of Kluyvera georgiana, a probable progenitor of a soubgroup of CTX-M extended-spectrum β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 4038-4040. Poirel L., Karim A., Le Thomas I., Naas T., Nordmann P. (2000): Biochemical sequence analyses of GES-1, a novel class A extended-spectrum β-lactamase, and the class 1 integron In52 from Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 44: 622-632. Příborský J. (2004): Peniciliny, farmakologie a klinická farmakologie. Maxdorf, Praha, 105 s. Putman M., Konings W.N., van Veen H.W. (2000): Molecular properties of bacterial multidrug transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 672-693. Queenan A.M., Bush K. (2007): Carbapenemase: the versatile β-lactamases. Clin. Microb. Rev. 20: 440-458. Radice M., Ayala J., Famiglietti A., Fernandez K., Gutkind G., Power P., Ricover N., Vay C. (2004): First class A carbapenemase isolated from Enterobacteriaceae in Argentina. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 1068-1069

53

Rasheed J.K., Tenover F.C. (2003): Detection and characterization of antimicrobial resistance genes in bacteria. In: Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Pfaller M.A., Yolken R.H. (eds.), Manual of Clinical Microbiology, volume 1, 8th ed., s. 1196-1212. ASM Press, Washington, DC. Rasmussen B.A., Bush K., Hare R., Keeney D., Medeiros A.A., O´Gara C., Yang Y. (1996): Characterization of IMI-1 β-lactamase, a class A carbapenem-hydrolyzing enzyme from Enterobacter cloacae. Antimicrob.Agents Chemother. 40: 2080-2086. Rossolini G.M., D´Andrea M.M., Mugnaioli C. (2008): The spread of CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases. Clin. Microbiol. Infect. 14: 33-41. Rosypal S. (2006): Úvod do molekulární biologie. Tiskárna, Blansko, 289 s. Sawai T., Mitsuhashi S., Yamagishi S. (1968): Drug resistance of enteric bacteria. XIV. Comparison of β-lactamases in gram-negative rod bacteria resistant to αaminobenzylpenicillin. Jpn. J. Microbiol. 12: 423–434. Schwartz T., Jansen B., Kohnen W., Obst U. (2003): Detection of antibiotic-resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. FEMS Microbiol. Ecol. 43: 325-335. Smet A., Butaye P., Dewulf J., Haesebrouck F., Herman L., Heyndrickx M., Martel A., Persoons D. (2010): Broad-spectrum β-lactamases among Enterobacteriaceae of animal origin: molecular aspects, mobility and impact on public health. FEMS Microbiol. Rev. 34: 295-316. Sougakoff W., Goussard S., Courvalin P. (1988): TEM-3 β-lactamase, which hydrolyzes broad-spectrum cephalosporins, is derived from the TEM-2 penicillinase by two amino acid substitutions. FEMS Microbiol. Lett. 56: 343-348. Spratt B.G. (1977): Properties of the penicillin binding proteins of Escherichia coli K12. J. Biochem. 14: 342-352. Stanisich V.A. (1984): Identification of plasmids at the genetic level. In: Bennett P.M., Grinsted J. (eds.), Methods in microbiology, s. 5-32. Academic Press, London. Stokes H.W., Hall R.M. (1989): A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons. Mol. Microbiol. 3: 16691683. Stürenburg E., Mack D. (2003): Extended-spectrum β-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control. J. Infect. 47: 273-295.

54

Sykes R.B., Matthew M. (1976): The b-lactamases of gram-negative bacteria and their role in resistance to β-lactam antibiotics. J. Antimicrob. Chemother. 2: 115–157. Šmarda J., Doškař J., Koptíková J., Pantůček R., Růţičková V. (2005): Metody molekulární biologie. Vydavatelství MU, Brno, 188 s. Thomson K.S. (2001): Controversies about extended-spectrum and AmpC betalactamases. Emerg. Infect. Dis 7: 333-336. Thomson K.S., Sanders C.C. (1992): Detection of extended-spectrum beta-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the double-disk and threedimensional tests. Antimicrob. Agents Chemother. 36: 1877-1882. Toleman M.A., Jones R.N. Rolston K., Walsh T.R. (2003): Molecular and biochemical characterization of OXA-45, an extended-spectrum class 2d´ beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 2859-2863. Tzouvelekis L.S., Bonomo R.A. (1999): SHV-type β-lactamases. Curr. Pharm. Des. 5: 847-864. Votava M. (2005): Lékařská mikrobiologie obecná. Neptun, Brno, 351 s. Walsh T.R., Toleman M.A., Poirel L., Nordmann P. (2005): Metallo-β-lactamases: the quiet before the storm?. Clin. Microb. Rev. 18: 306-325. Willetts N. (1984): Conjugation. In: Bennett P.M., Grinsted J. (eds.), Methods in microbiology, s. 33-60. Academic Press, London. Yao J.D.C., Moellering R.C. (2003): Antibacterial agents. In: Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Pfaller M.A., Yolken R.H. (eds.), Manual of Clinical Microbiology, volume 1, 8th ed., s. 1039-1073. ASM Press, Washington, DC. URL: http://www.abbiodisk.com/, citováno ke dni 30. 4. 2010 URL: http://www.lahey.org/studies/, citováno ke dni 30. 4. 2010 URL: http://www.rivm.nl/earss/, citováno ke dni 30. 4. 2010

55

11 SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK Tab. 1: Pouţití beta-laktamových antibiotik v humánní a veterinární medicíně (Smet a kol. 2010) Obr. 1: Struktura penicilinů (Příborský 2004) Obr. 2: Struktura cefalosporinů (Příborský 2004) Obr. 3: Aminokyselinové substituce ESBL derivátů skupiny TEM (Bradford 2001) Obr. 4: Aminokyselinová substituce ESBL enzymů skupiny SHV (Bradford 2001) Obr. 5: Celosvětové rozloţení enzymů CTX-M (Rossolini a kol. 2008) Obr. 6.: Schéma začlenění genové kazety do integronu (Joss a kol. 2009) Obr. 7 Doporučené uspořádání disků při metodě DDST kombinované s metodou CLSI (Hrabák a kol. 2007a) Obr. 8: Pozitivní výsledek testu na produkci ESBL (Hrabák a kol. 2007a) Obr. 9 Doporučené uspořádání disků pro metodu SDT (Hrabák a kol. 2007b) Obr. 10: Pozitivní výsledek testu na produkci MBL (Hrabák a Chudáčková 2008) Obr. 11: Pozitivní test ESBL (http://www.abbiodisk.com/) Obr. 12: Pozitivní test ESBL – kruhová zóna (http://www.abbiodisk.com/) Obr. 13: Pozitivní test ESBL – deformace zúţené části zóny (http://www.abbiodisk.com/) Obr. 14: Průkaz karbapenemáz 3D metodou (Hrabák a Chudáčková 2008) Obr. 15: PCR analýza genů rezistence (Rasheed a Tenover 2003)

56