Detekce včelích virů (Picornaviridae), jejich variabilita, přenos a patogeneze

Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy Katedra zoologie

Detekce včelích virů (Picornaviridae), jejich variabilita, přenos a patogeneze

Bakalářská práce

David Šesták

Školitel: Mgr. Štěpán Ryba

Praha 2010

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma „Detekce včelích virů čeledi (Picornaviridae), jejich variabilita, přenos a patogeneze“ vypracoval samostatně. Materiály k této práci jsem čerpal především z internetu. Většinu článků jsem vyhledal na serverech „Web of Science“, „Pubmed“ a „Google Scholar“. Mnoho cenných rad a pomocných materiálů mi poskytl můj školitel Mgr. Štěpán Ryba, kterému tímto děkuji. Důležité informace poskytli i vážený pan Philippe Blanchard a vážená paní Petra Forgách. Veškerou použitou literaturu a podkladové materiály uvádím v přiloženém seznamu literatury.

V Praze dne 10.8.2010

…………………………… Podpis

Obsah Abstrakt ...................................................................................................................................... 5 Abstract ...................................................................................................................................... 5 Klíčová slova .............................................................................................................................. 5 Seznam zkratek .......................................................................................................................... 6 1. Úvod ....................................................................................................................................... 8 2 Apis mellifera .......................................................................................................................... 9 3. Včelí viry ................................................................................................................................ 9 3.1. Picornaviridae ............................................................................................................... 10 3.1.1. Iflavirus .................................................................................................................. 10 3.2. Dicistroviridae............................................................................................................... 10 3.2.1. Cripavirus............................................................................................................... 11 4. Metody detekce včelích virů ................................................................................................ 11 4.1. Reverzní PCR ................................................................................................................ 12 4.1.1 Příprava ................................................................................................................... 12 4.1.2. Izolace RNA ze vzorku........................................................................................... 13 4.1.3. cDNA ..................................................................................................................... 13 4.1.4. PCR ........................................................................................................................ 13 4.1.5. Elektroforéza a focení ............................................................................................ 14 5. Interakce včelích virů a jiných činitelů, CCD ...................................................................... 14 6. Varroa destructor.................................................................................................................. 14 7. ABPV – Acute Bee Paralysis Virus ...................................................................................... 15 7.1. Popis a výskyt ................................................................................................................ 15 7.2. Taxonomie, genom a partikule ...................................................................................... 16 7.3. Transmise ...................................................................................................................... 16 7.4. Patogeneze ..................................................................................................................... 17 8. BQCV – Black Queen Cell Virus ......................................................................................... 17 8.1. Popis a výskyt ................................................................................................................ 17 8.2. Taxonomie, genom a partikule ...................................................................................... 18 8.3. Transmise ...................................................................................................................... 18 8.4. Patogeneze ..................................................................................................................... 18 9. CBPV – Chronic Bee Paralysis Virus .................................................................................. 19 9.1. Popis a výskyt ................................................................................................................ 19 9.2. Taxonomie, genom a partikule ...................................................................................... 19 9.3. Transmise ...................................................................................................................... 20 9.4. Patogeneze ..................................................................................................................... 21 10. DWV – Deformed Wing Virus ........................................................................................... 22 10.1. Popis a výskyt .............................................................................................................. 22 10.2. Taxonomie, genom a partikule .................................................................................... 22 10.3. Transmise .................................................................................................................... 22 10.4. Patogeneze ................................................................................................................... 23 11. IAPV - Israeli Acute Paralysis Virus .................................................................................. 24 11.1. Popis a výskyt .............................................................................................................. 24 11.2. Taxonomie, genom a partikule .................................................................................... 24 11.3. Patogeneze ................................................................................................................... 25 13. KBV – Kashmir Bee Virus ................................................................................................. 25 12.1. Popis a výskyt .............................................................................................................. 25 12.2. Taxonomie, genom a partikule .................................................................................... 25 12.3. Transmise .................................................................................................................... 26 3

12.4. Patogeneze ................................................................................................................... 26 13. KV - Kakugo Virus ............................................................................................................. 26 13.1. Popis a výskyt .............................................................................................................. 26 13.2. Taxonomie, genom a partikule .................................................................................... 26 13.3. Transmise .................................................................................................................... 27 13.4. Patogeneze ................................................................................................................... 27 14. SBV – Sacbrood Virus........................................................................................................ 27 14.1. Popis a výskyt .............................................................................................................. 27 14.2. Taxonomie, genom a partikule .................................................................................... 27 14.3. Transmise .................................................................................................................... 28 14.4. Patogeneze ................................................................................................................... 28 15. Ostatní včelí viry ................................................................................................................ 29 16. Podobnost a společný výskyt virů ...................................................................................... 30 17. Závěr................................................................................................................................... 32 18. Seznam použité literatury ................................................................................................... 33

4

Abstrakt Včela medonosná (Apis mellifera) je hostitelem devatenácti DNA a RNA virů. Včelí viry z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae patří mezi neobalené RNA viry s jedním pozitivním vláknem (+ss RNA viry). Současný výzkum se soustřeďuje především na osm virů. Jedná se o ABPV, BQCV, CBPV, DWV, IAPV, KBV, KV a SBV. Všechny tyto patogeny se stávají extrémně nebezpečnými především v kombinaci s dalšími stresovými faktory, jako např. špatné počasí. Hlavním problémem posledních třiceti let je společný výskyt virů a jiných parazitů včel. Především se jedná o roztoče Varroa destructor, Tropilaelaps mercedesae a hmyzomorku Nosema apis. Společným působením včelích virů a výše zmíněných eukaryotických parazitů může dojít k vyhubení celých kolonií včel.

Abstract Honeybee (Apis mellifera) is a host of nineteen DNA and RNA viruses. Honeybee viruses from Picornaviridae and Dicistroviridae family belong to the uncoated positive-strand RNA viruses (+ss RNA viruses). Current research is focused in eight viruses. These are ABPV, BQCV, CBPV, DWV, IAPV, KBV, KV and SBV. All these pathogens become extremely dangerous mainly in combination with another stress factors, such as bad weather. Main problem of the last thirthy years is the coincidence between bee viruses and other honeybee parasites. These are Varroa destructor, Tropilaelaps mercedesae and Nosema apis. By the joint influence of bee viruses and eucaryotic parasites mentioned above, whole bee colonies may become eradicated.

Klíčová slova: ABPV, Apis mellifera, BQCV, CBV, DWV, IAPV, KBV, KV, SBV, Varroa destructor, včelí viry 5

Seznam zkratek aa ............................................................. amino acid ABPV ...................................................... acute bee paralysis virus AGID ....................................................... agarose gel immunodiffusion AHBs ....................................................... americké včely pocházející ze tří podruhů AIV .......................................................... apis iridescent virus ABV ........................................................ arkansas bee virus BBPV ...................................................... berkeley bee picornavirus BLAST .................................................... basic local alignment search tool BPMS ...................................................... bee parasitic mite syndrome BQCV ...................................................... black queen cell virus BVX ........................................................ bee virus X BVY ........................................................ bee virus Y CBPV ...................................................... chronic bee paralysis virus CCD ......................................................... colony collapse disorder CPVA ....................................................... chronic paralysis virus associate CtRLVaRNA ............................................ Carrot red leaf luteovirus associated RNA CWV........................................................ cloudy wing virus DWV ....................................................... deformed wing virus EBV ......................................................... egypt bee virus eIF............................................................ eukaryotic translation initiation factor ELISA...................................................... enzyme-linked immunosorbent assay Et al ......................................................... et alli FV ............................................................ filamentous virus HEX ......................................................... random hexamer primer IAPV........................................................ izraeli acute paralysis virus IRES ........................................................ internal ribosome entry site KBV ........................................................ kashmir bee virus MW.......................................................... molecular weight nt .............................................................. nucleotid NVC ........................................................ nucleospin viral columns ORF ......................................................... open reading frame RdRP ....................................................... RNA-dependent RNA polymerase 6

RPM ........................................................ rotations per minute RT-PCR.................................................... reverse transcription polymerase chain reaction SBV ......................................................... sacbrood virus SmV A ..................................................... sclerophthora macrospora virus A SPV.......................................................... slow paralysis virus TSBV ....................................................... thai sacbrood virus UTR ......................................................... untranslated region VDV-1 ..................................................... varroa destructor virus 1 Vpg .......................................................... viral protein genome-linked VPS.......................................................... virus particles size

7

1. Úvod Tato práce se zabývá včelími viry z čeledi Picornaviridae a jejich vlivem na život včel. První studie zabývající se touto problematikou pochází již z počátku dvacátého století (White, 1917 in Ghosh et al., 1999). Intenzivnější výzkum včelích virů začal probíhat od druhé poloviny minulého století (Bailey, 1963, 1968). Včelí viry, zmiňované v této studii, patří do čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae. Obě tyto čeledě obsahují viry s genomem tvořeným RNA o kladné polaritě a sdílí celou řadu společných znaků. Mezi rozdílné vlastnosti patří počet cistronů genomu, poloha strukturálních a nestrukturálních genů a struktura a počet IRES (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). Do čeledě Dicistroviridae patří ABPV, BQCV, IAPV a KBV (Mayo, 2002; Christian et al., 2005 in Blanchard et al., 2008). DWV, KV a SBV patří do rodu Iflavirus řazeného do čeledi Picornaviridae (Ghosh et al., 1999; Mayo, 2002; Fujiyuki et al., 2004). CBPV zůstává prozatím nezařazen (Olivier et al., 2007). Tyto viry se stávají extrémně nebezpečnými především v kombinaci s dalšími stresovými faktory, jako jsou např. nepříznivé klimatické podmínky, pesticidy nebo únava kolonie způsobená zvýšenou aktivitou včelstva během letních měsíců (Allen and Ball, 1996). Hlavním problémem je společný výskyt virů a jiných parazitů včel. Především se jedná o roztoče Varroa destructor (BowenWalker, 1998), Tropilaelaps mercedesae (Dainat et al., 2008; Forsgren et al., 2009) a mikrosporidie Nosema ceranea a Nosema apis (Allen and Ball, 1996; Higes et al., 2006). Společným působením včelích virů a výše zmíněných parazitů může dojít k oslabení včelího společenstva nebo k jeho kolapsu (Hung et al., 1996). Práce je rozdělena do několika kapitol. V první kapitole se zabývám popisem včely medonosné

(Apis

mellifera)

a

obecnou

charakteristikou

čeledí

Picornaviridae

a Dicistroviridae. Další kapitoly jsou věnovány popisu nejčastějších detekčních metod, s důrazem na reverzní PCR, a ektoparazitickému roztoči Varroa destructor. Největší část práce je věnována charakteristice osmi nejvýznamnějších virů včely medonosné. U každého je zmíněn jak popis viru, tak i výskyt, popis genomu, proces přenosu a patogeneze. Poslední kapitoly jsou věnována ostatním včelím virům a vzájemné podobnosti virů, z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae, a jejich společnému výskytu. Cílem této práce je přehledně utřídit veškeré relevantní informace jak o včelích virech nezařazených, tak o virech z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae a nastínit oblasti, kterými by se mohl ubírat budoucí výzkum.

8

2 Apis mellifera Včela medonosná patří mezi blanokřídlý sociální hmyz a jedná se o nejvýznamnějšího opylovače živočišné říše. Samičky se dělí na královny a dělnice. Každá kolonie má jen jednu královnu, která je jediná z celé kolonie schopná produkovat vajíčka. Dělnice mají nevyvinuté pohlavní orgány a jejich úkolem je vyhledávání a sběr potravy, tvorba plástů, ochrana kolonie a krmení královny, trubců i plodu. Samci, trubci, mají za úkol oplodnit královnu. (www zdroje 1;2) Včely jsou hostiteli několika více či méně nebezpečných parazitů. Kromě virů jsou včely běžně napadány bakteriemi, houbami, prvoky, roztoči a brouky (Ellis and Munn, 2005).

3. Včelí viry Včela medonosná (Apis mellifera) je hostitelem devatenácti dosud znamých virů: ABPV, ABV, AIV, BBPV, BQCV, BVY, BVX, CBPV, CPVA, CWV, DWV, EBV, FV, IAPV, KBV, KV, SBV, SPV, TSBV (Allen and Ball, 1996; Fujiyuki, 2004; Maori et al., 2007). Kromě dvou výjimek v podobě AIV a FV se jedná o plus RNA viry z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae a jeden virus nezařazený (Yue, 2006). Čeledě Picornaviridae a Dicistroviridae sdílejí celou řadu společných znaků. Předně se jedná o neobalené viry, jejichž genom je tvořen jednořetězcovou lineární RNA v kladném smyslu translace. To znamená, že virová RNA slouží stejně jako mRNA přímo k tvorbě proteinů. Nejprve vzniká polyprotein. Ten je dále dělen autoproteolyticky, tedy bez účasti proteáz hostitelské buňky, již během translace, na jednotlivé virové proteiny. Všechny důležité proteázy si viry z těchto čeledí kódují sami. Replikace virů probíhá v cytoplazmě hostitelské buňky. Nejprve je vytvořen (-) RNA řetězec a podle něj jsou pak vytvářeny (+) RNA genomy. (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). Délka genomu včelích virů z těchto čeledí se pohybuje mezi 8550 – 10152 nt. K 5´-konci je kovalentně připojen VPg o relativní molekulové hmotnosti menší než 5 kDa. 3´-konec je polyadenylován (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). U eukaryotických mRNA, které mají na svém 5´-konci methylguanosinovou čepičku, prohlíží ribozom vlákno od 5´-konce dokud nenarazí na AUG kodon, který iniciuje translaci. U čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae je iniciace translace odlišná. Zástupci těchto čeledí obsahují IRES, což je 450-500 nt dlouhý úsek vysoce strukturované RNA umístěné v 5´ UTR. Tento element umožňuje provádět translaci nezávisle jak na čepičce, tak na skenování od 5´-konce (Borman et al., 1997). 9

Viriony virů z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae jsou neobalené, velké v průměru kolem 30 nm a mají ikosahedrální symetrii. Kapsida je složená ze tří strukturálních proteinů o molekulové váze přibližně 25 kDa (VP1, VP2, VP3 resp. CP1. CP2, CP3). Čtvrtý protein VP4 se nachází uvnitř kapsidy a od předchozích tří se liší strukturou i sekvencí aminokyselin. Triangulační číslo je rovno třem, ale jedná se spíše o pseudo-T. Kapsida je tvořena šedesáti kapsomerami, z nichž každá je složená ze tří přibližně stejně velkých, ale nestejných domén. Jednotlivé domény jsou od sebe většinou proteolyticky odděleny. Zástupci obou čeledí mají v genomu jednotku složenou ze tří domén, obsahující helikázu typu III (Hel), cysteinovou proteázu (Pro) a RNA-dependentní RNA polymerázu (Pol) (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). 3.1. Picornaviridae Genom je monocistroní a virová RNA je infekční sama o sobě. Hned po vstupu do buňky je genom překládán a jsou tvořeny virové proteiny (Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). Pro navázání 40S podjednotky ribozomu je nutná speciální sekvence – IRES. V buňkách, ve kterých se viry z čeledi Picornaviridae množí, dochází k rozštípání eIF4G, pomocí proteázy 2Apro. To vede k zastavení translace téměř všech buněčných proteinů. Translace virových proteinů běží dál, protože C-terminální část eIF4G stimuluje translaci zprostředkovanou přes IRES. Tato C-terminální část obsahuje vazebná místa pro eIF3 a eIF4A. Zdá se tedy, že 40S podjednotka ribozomu interaguje s eIF3 na C-terminální části, která se váže na IRES. (Knipe et al., 2007). 3.1.1. Iflavirus Rod Iflavirus patří do čeledi Picornaviridae. Na 5´-konci genomu se nachází geny strukturální (strukturální proteiny) a na 3´-konci geny nestrukturální (helikáza, proteáza, polymeráza) (Chen et al., 2004). Do rodu Iflavirus jsou řazeny Deformed wing virus (Fujiyuki et al., 2004), Kakugo virus (Mayo, 2002) a Sacbrood virus (Christian et al., 2002). 3.2. Dicistroviridae Genom je bicistroní nesegmentovaný a obsahuje dvě ORF. Translace upstream ORF začíná na IRES podobnému IRES virů z čeledi Picornaviridae. Downstream ORF je translatováno z jiného IRES zcela nezávisle na translaci upstream ORF (Flint et al., 2004). Dicistroviridae má tedy dva ORF pro dva polyproteiny oddělené mezerou. ORF2 nezačíná běžným AUG kodónem, ale tripletem CCU. IRES uvnitř UTR váže 80S ribozom 10

za nepřítomnosti iniciační Met-tRNAi a iniciačních faktorů. Syntéza proteinů začíná od druhého kodónu GCU ležícího v A-místě ribozomu. Této specifické translace se účastní speciální struktura, která nahrazuje interakci mezi Met-tRNAi a P-místem iniciačního kodónu (Knipe et al., 2007). Prekurzorové proteiny jsou zpracovány proteázami kódovanými samotnými viry. Tyto proteázy jsou homologní 3C proteáze picorna virů. Nestrukturální geny se nachází na 5´-konci a strukturální geny na 3´-konci (Chen et al., 2004; Flint, 2004; Knipe et al., 2007; Le Gall et al., 2008). 3.2.1. Cripavirus Čeleď Dicistroviridae obsahuje jediný rod Cripavirus (Mayo, 2002), do kterého patří Acute bee paralysis virus (Mayo, 2002), Black queen cell virus (Mayo, 2002). Kashmir bee virus (Mayo, 2002) a na základě homologického genomu i Izraeli acute paralysis virus (Christian et al., 2005 in Blanchard et al., 2008). Tabulka včelích virů z čeledí Dicistroviridae a Picornaviridae

Virus

Čeleď

Rod

Délka genomu

GenBank

ABPV

Dicistroviridae

Cripavirus

9491 nt

AF150629

BQCV

Dicistroviridae

Cripavirus

8550 nt

AF183905

DWV

Picornaviridae

Iflavirus

10140 nt

AJ489744

IAPV

Dicistroviridae

Cripavirus

9499 nt

EF219380

KBV

Dicistroviridae

Cripavirus

9524 nt

AY275710

KV

Picornaviridae

Iflavirus

10152 nt

AB070959

SBV

Picornaviridae

Iflavirus

8832 nt

AF092924

4. Metody detekce včelích virů Jedinci infikovaní včelími viry z čeledí Picornaviridae a Dicistroviridae často nejeví žádné příznaky. Proto se před samotnou detekcí může použít metoda sloužící k namnožení virů uvnitř hostitele. Aby se virus mohl dostatečně rozmnožit, využívá se zcentrifugovaný supernatant z rozmělněných patologicky podezřelých nebo asymptomatických jedinců rozpuštěný ve fyziologickém roztoku. Tento extrakt je poté injekčně vpraven do larev nebo do 11

hrudní oblasti dospělých včel, kde se virus množí (Bailey and Woods, 1977; Ribiére, 2000). Obecným pravidlem je fakt, že včelí viry se množí rychleji v larvách než v dospělých jedincích (Bailey and Woods, 1974). K detekci virů byly dlouho používány serologické metody, ELISA a elektronová mikroskopie (Bowen-Walker et al., 1999; Kukielka et al., 2007). Tyto techniky ale nebyly schopny zachytit viry, které se vyskytovaly ve formě asymptomatické infekce. Citlivost a specifita byly také nedostačující (Chen et al., 2004). Dnes už se proto používá téměř výhradně vysoce účinná, rychlá a cílená RT-PCR, která je i ekonomicky výhodnější (Benjeddou et al., 2001; Grabensteiner et al., 2001; Bakonyi et al., 2002, Ribiére et al. 2002; Fujiyuki et al., 2004; Yue and Genersch, 2005; Chen and Siede, 2007) a AGID test (Ball 1999; Ribiére et al. 2000; Benjeddou et al., 2001). Celá PCR může být ještě více zefektivněna vytvořením speciálních primerů, které mohou společně pracovat jako multiplex (Grabensteiner et al., 2007). Pro detekci ABPV, BQCV, DWV, SBV je možno použít i velmi přesnou SYBR Green RT-PCR spolu se speciálními primery. V některých případech může být Syber Green RT-PCR, přesnější až o 90 % oproti klasické RT-PCR. Kromě toho je metoda méně časově i finančně náročná (Kukielka et al., 2007, Kukielka et al., 2009). Další velmi sensitivní metodou je „Western blotting“ užitá např. k identifikaci dalších CBPV asociovaných proteinů (Ribiére et al, 2000). K samotné extrakci RNA z infikovaných jedinců lze použít například Nucleospin RNAII total RNA isolation kit od Macherey-Nagel (Benjeddou et al., 2001). Nutné je zmínit i RP49 mRNA, což je standardně užívaný kontrolní gen včely medonosné. Užívá se jako ověřovací sonda při použití TagMan RT-PCR (Ward, 2007). 4.1. Reverzní PCR Reverzní PCR a následný AGID test patří mezi nejrozšířenější a nejspolehlivější metody detekce RNA. Níže uvedené parametry a množství jsou variabilní a mohou být různými autory uváděny jinak. 4.1.1 Příprava Při reverzní PCR používáme k detekci hlavu, hruď bez křídel a zadeček. Vzorky uchováváme při -80°C až -20ºC. Vybrané tkáně homogenizujeme 10 minut při frekvenci 30 a následně centrifugujeme (8000 RPM/1 min).

12

4.1.2. Izolace RNA ze vzorku Používáme NucleoSpin RNA Virus. 1) Smícháme 150 µl vzorku + 5 µl Proteinase K Solution a na 10 minut dáme do 40°C lázně. 2) Přimícháme 600 µl RAV 1 a na 5 minut vložíme do lázně 70°C. 3) Přidáme 600 µl 96-100% etanolu a 10-15 sekund mícháme. 4) Šest NVC vložimé do 2ml sběrných tub a do každé NVC napipetujeme 700 µl zlyzovaného roztoku a centrifugujeme (8000 RPM/1 min). 5)Vyměníme sběrné tuby za čisté. NVC naplníme 500 µl bufferu RAW a centrifugujeme (8000 RPM/1 min). 6) Sběrné tuby vyměníme a do NVC napipetujeme 600 µl bufferu RAV3 (k RAV3 je nutné před použitím přidat 50 µl etanolu) a centrifugujeme (8000 RPM/1 min). 7) Sběrné tuby vyměníme za nové a do NVC přidáme 200 µl bufferu RAV3 a centrifugujeme (11000 RPM/4 min). 8) NVC umístíme do 1,5 ml centrifugačních tub a přidáme 50 µl RNAse-free vody předehřáté na 70ºC a dvě minuty inkubujeme. 9) Centrifugujeme (11000 RPM/1 min). Vzorky uchováváme v mrazáku při -20ºC (Macherey-Nagel, 2008). 4.1.3. cDNA 1) Smícháme 2 µl RNA (vzorek), 6 µl destilované vody, 1 µl HEXu a zahřejeme na 70ºC. 2) Do 1,5 ml ependorfky napipetujeme 6 µl destilované vody, 4 µl RT-bufferu, 1 µl Rnasinu (Ribolock RNAse), 2 µl 10 mM dNTPs, 1 µl RT (RevertAid TM). Po každém kroku důkladně propipetujeme. 3) Do ependorfky z kroku 1 přidáme 14 µl roztoku připraveného v kroku 2. 4) Cycler – 48°C/60 min a 80°C/10 min. 4.1.4. PCR 1) Master mix: smícháme 13 µl destilované H2O + 2 µl bufferu (Brito A.S. 10 x Buffer) + 0,4 µl dNTPs (10 mM). Poté dáme na led a přidáme 0,1 µl Polymerázy Biotol. 2) Do zkumavky přidáme 0,155 µl (10 µM) forward primeru pro příslušný virus a 0,155 µl (10 µM) reverse primeru pro příslušný virus. 3) Do zkumavek z kroku 2 přidáme 1 µl vzroku a 15,9 µl Master mixu.

13

4) Cycler - reversní transkripce 50°C/30 min, následuje iniciace denaturace 94°C/2 min. Poté 35 amplifikačních cyklů 94°C/30 s, 60°C/30 s, a následně 72°C/30 s. Konečné nastavení 72°C/7 min. 4.1.5. Elektroforéza a focení Gel pro elektroforézu: smícháme 100 ml TBE 0,5 M + 0,7 agarózy + 2-3 µl ethidiumbromidu (přidává se až po ochlazení na 50°C). Přidáme 2,5 – 4 µl ORANGE G do každé zkumavky. Do levého výřezu přidáme standard a poté do každé zdířky napipetujeme 20 µl vzorku. Elektroforéza: 130 V/20 min. Focení: Používáme např. program AlphaDigiDoc.

5. Interakce včelích virů a jiných činitelů, CCD Většina virů se u včel nijak neprojevuje a jedná se tedy o asymptomatické přetrvávájící infekce, které propuknou většinou, až v přítomnosti dalšího faktoru, jakým může být nepříznivé počasí, bakteriální onemocnění, jednobuněční i mnohobuněční parazité či chemické látky vypouštěné do přírody člověkem. Hlavní roli samozřejmě hrají insekticidy a pesticidy, kterým jsou včely vystaveny při konzumaci nektaru (Bromenshenk, 1991). Problémem mohou být i látky používané proti včelím parazitům, jako např. akaricid používaný k hubení roztočů V. destructor, které oslabují imunitní systém včel (Broedsgaard,1996). CCD je soubor několika spolupůsobících faktorů charakteristický významným úbytkem dospělých včel. Tento úbytek zatím nebyl uspokojivě vysvětlen, protože v kolonii ani jejím okolí nebývají nalezeni žádní mrtví dospělci. V takto postižených společenstvech se o královnu stará jen několik málo mladých dospělců. (Cox-Foster et al., 2007).

6. Varroa destructor V. destructor ektoparazitický roztoč živící se hemolymfou včel (Rosenkranz et al., 2010). Původně napadal pouze východní včelu Apis cerana (Oudemans, 1904 in Rosenkranz et al., 2010). Do Evropy se virus dostal nejspíše v první polovině minulého století přes Rusko. Během posledních čtyřiceti let se roztoč rozšířil po celém světě. Až do roku 2000 byl V. destructor označován V. jacobsoni (Rosenkranz et al., 2010).

14

V. destructor je svým životním cyklem plně vázán na včely. Samičky prochází během životního cyklu dvěma fázemi. Foretickou fázi prožívají samičky na dospělých včelách, které je dopraví do larválních komůrek dělnic a trubců. V těchto komůrkách se odehrává fáze rozmnožovací. Samečci a nymfální stádia nežijí příliš dlouho a vyskytuji se pouze v larválních komůrkách (Kuenen and Calderone, 1997). Symptomy jednotlivých kolonií postižených V. destructor se lišily dle ročního období, ačkoli zastoupení virů zůstávalo stejné. V březnu bylo pozorováno rapidní snížení počtu jedinců v kolonii. Během července a srpna byl nejvyšší výskyt dezorientovaných a černých včel. Na podzim a v zimě byly zaznamenány náhlá zhroucení celých kolonií. Typickými příznaky jsou plazící se zmrzačené včely, poruchy sociálního chování, nedostatečná péče o larvy a především prudké vymření velké části kolonie (Berényi et al., 2006, Rosenkranz et al., 2010). V. destructor je hlavní příčinnou prudkého poklesu počtu včelstev v Evropě (Rosenkranz et al., 2010). Jinak téměř neškodné viry jako ABPV a KBV se v přítomnosti tohoto roztoče stávají extrémně nebezpečnými (Allen and Ball, 1996). V. destructor působí na včely několika způsoby. Intenzivní odsávání lymfy oslabuje infkované jedince. Způsobenými rankami se včely mohou infikovat viry a jinými patogeny a samozřejmě viry mohou být při sání přenášeny z roztoče přímo do hemolymfy včel. V těle V. destructor byly prozatím detekovány viry ABPV, DWV, IAPV, KBV a SBV. (Shen et al., 2005; Tentcheva et al., 2004; Boecking and Genersch, 2008).

7. ABPV – Acute Bee Paralysis Virus 7.1. Popis a výskyt První zmínka o ABPV pochází z roku 1963, kdy byl popsán ve Velké Británii jako přetrvávající infekce bez znatelných symptomů. Jeho objev souvisí se studií přenosu KBV. Při tomto pokusu byl ABPV objeven jako znečišťující látka (Bailey et al., 1963). Hlášen byl prozatím z Itálie, Francie, Polska, Jugoslávie, Německa, Skandinávie, Maďarska, Rakouska, USA, Kanady, Brazílie, Uruguaje a Thajska (Bailey, 1965; Ritter et al., 1984 in Martin 2001; Kulnicevic et al., 1990 in Bákonyi et al., 2002; Carpana et al., 1991; Faucon et al., 1992; Topolska et al., 1995 in Bákonyi et al., 2002; Bákonyi et al., 2002; Antúnez et al., 2006; Sanpa a Chantawannakul, 2008; Teixeira et al., 2008). Tímto patogenem je nejspíše infikováno přes padesát procent evropské populace včel. Ve Francii se jedná o 67 % (Tentcheva et al., 2004) a v Maďarsku o 57 % testovaných včelstev (Bákonyi et al., 2002). 15

7.2. Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Dicistroviridae Rod: Cripavirus (Mayo, 2002) Genom ABPV je dlouhý 9 491 nukleotidů a je tvořen jednovláknovou pozitivní RNA s polyadenylovaným 3´-koncem (Govan et al., 2000). Nestrukturální proteiny jako RNAdependentní RNA-polymeráza, helikáza a proteáza jsou kódovány ORF1. ORF2 kóduje jeden vedlejší a tři základní proteiny kapsidy, které jsou dohromady přepisovány jako jeden polyprotein. Kompletní kapsidový polyprotein se nachází v pozici 6509 až 9253 a kóduje 914 aminokyselin dlouhý polypeptid (Bákonyi et al., 2002). Partikule jsou velké kolem 30 nm v průměru (Govan et al., 2000). Nukleotidová sekvence Rakouského izolátu se nachází v GenBank pod přístupovým kódem AY053366 až AY053385 (Bákonyi et al., 2002). Krátké sekvence pocházející z USA jsou pod kódy AF263724; AF263733; AF263736 a AF264688 až AF264692 (Evans et al., 2001). Izolát z UK lze nalézt pod označením AF126050 (Ghosh et al., 1999). Brazilské vzorky mají přiděleno přístupové číslo EU292210. Kompletní genom má kód AF150629 (Govan et al., 2000). Molekulární váhy tří hlavních proteinů jsou 24, 33 a 35 kDA, vedlejší protein má mw 9,4 kDa (Govan et al., 2000). Sedimentační koeficient částic ABPV je 163 S a vznášivá hustota má hodnotu 1380 g/ml při pH 7 a při pH 9 se zvětšuje až na 1430 g/ml (Bailey, 1968; Govan et al., 2000). V roce 2002 byla zpracována fylogenetická studie založená na 401 nukleotidů dlouhém

úseku

(8121-8521)

náležejícímu

do

regionu

kapsidového

proteinu

(GenBank AF150629 - Govan and Davidson, 2000). Strom se skládal z celkem 32 izolátů pocházejících z Polska, Maďarska, Rakouska, Německa, USA a Velké Británie. Vyšly dvě hlavní větve, které odpovídaly regionálnímu rozdělení. První větev obsahovala izoláty z USA a UK, ve druhé se nacházely vzorky ze střední Evropy. V rámci střední Evropy se strom dělil na polskou, maďarskou a rakousko-německo-polskou větev. (Bákonyi et al., 2002). 7.3. Transmise ABPV byl u včel detekován v mozku, ve slinných a podhltanových žlázách mozku, ve hrudi i v zadečku (Bailey and Milne, 1968; Ball, 1985 in Benjeddou et al., 2001) a ve spermatu trubců (Yue et al. 2006). V Austrálii byl ABPV izolován i z mrtvé larvy královny (Allen and Ball, 1996). U dospělých královen virus detekován nebyl (Chen, 2005). Při krmení se virus horizontálně šíří skrze slinné žlázy. ABPV je uchováván i v zásobách potravy, do kterých jsou přidávány výměšky slinných žláz (Ball, 1985 in Benjeddou et al., 2001). Včelí královna se běžně páří až s 28 trubci (Kraus et al. 2005). 16

Virus by se tedy mohl poměrně snadno šířit i vertikální cestou. Nicméně v kolonii, v níž byly všechny vzorky spermatu pozitivní, nebyli nalezeni infikovaní dospělci a ani při umělé inseminaci infikovaným spermatem nebylo potomstvo pozitivní (Yue et al., 2006). Přenos z roztoče V. destructor na dospělce, larvy i kukly byl potvrzen v laboratorních podmínkách (Allen and Ball, 1996). ABPV se, stejně jako např. DWV vyskytuje i u několika čmeláků rodu Bombus a v některých případech se tedy může jednat i o mezidruhový přenos (Bailey and Gibbs, 1964). V. destructor působí jako vektor, protože skrze jeho kousnutí se virové partikule dostávají do hemolymfy (Scott-Dupree and McCarthy, 1995 in Govan et al., 2000). Účinnost přenosu ABPV z V. destructor na kukly a dospělce je v závislosti na použité detekční metodě 50-80% (Wiegers, 1988). 7.4. Patogeneze Jedinci napadení virem ABPV většinou nejeví žádné příznaky nákazy. Přesto může být tento virus pro včely neslučitelný se životem. (Bailey, 1965). Opravdu nebezpečným se virus stává především při spojení s V. destructor. V tomto případě je virus smrtelný pro dospělce i larvy a způsobuje kolapsy celých kolonií. Dokud nebyl do Evropy zavlečen V. destructor, nebyl ABPV izolován (Bailey et al., 1963; Allen and Ball, 1996). Při podání vyšších dávek infikované potravy nebo při umělém vpravení pomocí injekce je ABPV téměř vždy smrtelný. Známky ochrnutí jsou patrné do dvou dnů a po třech dnech včely umírají (Bailey et al., 1963; Nordström, 2000). Koncentrace ABPV v různých tělních částech dospělých včel se nemění, jsou-li včely virem krmeny (Bailey and Milne, 1968). Dávka ABPV v infikovaných koloniích je přibližně dvacetkrát vyšší než v koloniích zdravých (Berényi et al., 2006).

8. BQCV – Black Queen Cell Virus 8.1. Popis a výskyt Virus byl původně popsán u mrtvých jedinců Apis mellifera získaných z volné přírody. Poprvé byl BQCV, i přes své jméno, získán nejen z larev královen, ale i z larev dělnic. Virus se vyskytuje na starém i novém kontinentu (Bailey and Woods, 1977). Izolován byl v Brazílii, Španělsku,

Uruguaji,

USA,

Velké

Británii,

na

Novém

Zélandu

i

Asii

(Hornitzky and Anderson, 1993; Allen and Ball, 1996; Antúnez et al., 2006, Kukielka et al.,

17

2008; Teixeira et al., 2008). V Maďarsku byl tento patogen detekován u přibližně u 53 % testovaných kolonií (Forgách et al., 2007). 8.2. Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Dicistroviridae Rod: Cripavirus (Mayo, 2002) Až do roku 2002 byl řazen do skupiny „picorna-like“ virů, které napadají včely (Leat et al., 2000). Genom je nečleněný a obsahuje dva cistrony (Berényi et al., 2006). Vzorek BQCV pocházející z Jižní Afriky má genom, bez poly(A), dlouhý 8550 nukleotidů a obsahuje dva otevřené čtecí rámce (ORF). 5´-proximální ORF kóduje nejspíše replikázový protein a další nestrukturální geny. 3´-proximální ORF kóduje kapsidový polyprotein a další strukturální geny (Leat et al., 2000; Berényi et al., 2006). Prozatím byly identifikovány čtyři proteiny kapsidy o molekulové hmotnosti 6, 29, 32 a 34 kDa (Leat, 2000). Genovou sekvenci izolátu pocházejícího z Brazílie lze najít v GenBank pod kódem EU292211 (Teixeira et al., 2008), vzorek pocházející z Jižní Afriky má přiděleno přístupové číslo AF183905 a původní isolát (Rothamsted) je k nahlédnutí po zadání kombinace AF125252 (Leat et al., 2000). 8.3. Transmise U včelích královen byl BQCV detekován ve střevě, vaječnících a výkalech (Chen, 2005). Na rozdíl od CBPV či SBV se BQCV nemnoží v mozku (Bailey, 1977). V rámci přenosu BQCV se nejspíše uplatňují především paraziti V. destructor (Shimanuki et al., 1994) a Nosema apis (Allen and Ball, 1996). Larvy dělnic nebývají nakaženy tak často jako larvy královen, které se nejspíše infikují virovými partikulemi obsaženými v potravě (Allen and Ball, 1996). 8.4. Patogeneze Ačkoli se BQCV běžně vyskytuje u dospělých včel, příznaky jsou nejlépe pozorovatelné na kuklách královen či ještě nezakuklených královnách (Laidlaw, 1979 in Chen and Siede, 2007). Stejně jako u SBV jsou jedinci po smrti tmaví (Berényi et al., 2006). Název viru je ale odvozen od černě zbarvených skvrn na stěnách komůrek, ve kterých se nachází napadení jedinci, nikoli od černých mrtvých individuí (Bailey et al., 1983). Při umělé infikaci larev dochází k zastavení vývinu během několika málo dní (Bailey and Woods, 1977). Příznaky infekce virem BQCV jsou nejlépe patrné během jara a také na počátku léta (Laidlaw, 1979 in Chen and Siede, 2007). Virus se často vyskytuje v koloniích zamořených

18

hmyzomorkou Nosema apis a může být hlavní příčinnou úmrtnosti včel v těchto koloniích (Bailey et al., 1983; Allen and Ball, 1996). V Británii se oba parazité objevují v koloniích v pravidelných cyklech, přičemž největší výskyt lze pozorovat na jaře a začátkem léta (Allen and Ball, 1996). V Rakousku byl výskyt Nosemy v BQCV infikovaných koloniích 75 % (Berényi et al., 2006). BQCV je nejběžnější především na jaře a začátkem léta, kdy napadá larvy, larvy královen i dospělé včely (Berényi et al., 2006). Při uměle vyvolané infekci se BQCV množí pouze u larev včel. U dospělců dochází k množení až v případě, že jsou jim v potravě podány spory druhu Nosema apis (Bailey et al., 1983). Stejně jako u ABPV i u tohoto viru je virová dávka postižených kolonií asi dvacetkrát vyšší oproti koloniím neinfikovaným (Berényi et al., 2006).

9. CBPV – Chronic Bee Paralysis Virus 9.1. Popis a výskyt CBPV byl popsán již v šedesátých letech minuého století (Bailey, 1968 in Blanchard et al., 2007). Tento virus se dá označit za kosmopolitní patogen napadající dospělé včely (Blanchard et al., 2007), protože jeho výskyt byl potvrzen na všech kontinentech (Dall, 1985, Antúnez et al., 2006; Teixeira et al., 2008). V některých zemích může být postižena více než pětina včelstev (Blanchard et al., 2007), naopak v Maďarsku nebyl pozitivní ani jeden z padesáti dvou včelích vzorků (Forgách et al., 2007). Ve studii zaměřené na včelí královny bylo pozitivních 40 % testovaných vzorků (Chen et al., 2005). 9.2. Taxonomie, genom a partikule CBPV nebyl prozatím zařazen do žádné čeledi. Dle fylogenetické studie založené na porovnání RdRp by byl CBPV, spolu s RNA satelitem CtRLVaRNA a SmV A, členem monofyletické skupiny mezi čeleděmi Tombusviridae a Nodaviridae. Při srovnání aminokyselinových sekvencí CBPV se sekvencemi dostupnými na NCBI nebyla nalezena žádná podobnost. Stejně tak porovnání osmi sekvencí kolem konzervovaných domén RdRp členů čeledě Dicistroviridae a CBPV prokázalo celkovou podobnost mezi 5,4% u BQCV až 12,5% u CrPV (Cricket paralysis virus). Zdá se tedy, že CBPV by mohl být prozatím jediným členem nové čeledi virů s RNA genomem o kladné polaritě (Olivier et al., 2007). CBPV se řadí mezi plus RNA viry s jednovláknovým článkovaným genomem. Sekvence RNA1 a RNA2 jsou dostupné na stránkách NCBI pod kódy EU122229 a EU12230. 19

Tyto dvě hlavní nukleové kyseliny se liší délkou. RNA1 je dlouhá přibližně 3674 nukleotidů a obsahuje tři ORF. RNA2 obsahuje asi 2305 nukleotidů a má ORF čtyři (Olivier et al, 2007). Částice tohoto viru mohou nabývat celé škály tvaru, od elipsoidů velikosti 35-65 nm na 20 nm až po větveně struktury s délkou dosahující 640 nm (Bailey et al., 1963; Ball and Bailey, 1991 in Olivier et al., 2007). Ačkoli byl původně znám jen jeden protein virální kapsidy o 23,5 kDa, byly před devíti lety Ribiérem za použití metody „Western botting“, objeveny další čtyři polypeptidy spojené s CBPV . Jejich molekulové hmotnosti činí 20, 30, 50 a 75 kDa (Ribiére et al., 2000). 9.3. Transmise Virus byl ve včelách identifikován v několika tělesných oddílech. V hlavové části byl výskyt potvrzen v mozkové tkáni a v čelistních a podhltanových gangliích. V hlavě včel se nachází několik milionů virových částic, což je asi polovina celkového množství (Blanchard et al, 2007; 2008). Postižená mohou být i zadečková a hrudní ganglia (Giauffret, 1966b, 1970 in Ribiére et al., 2002) a epitel střeva (Giauffret et al., 1966a in Ribiére et al., 2002). Naopak svalová a tuková tkáň se jeví bez výskytu virových partikulí (Lee and Furgala, 1965). U královen byl výskyt viru potvrzen pouze v hemolymfě a zbytcích těla, z něhož byly odstraněny spermatéka, střevo, vaječníky a hlava, které byly negativní (Chen et al, 2005). Včelí stráže obsahují obecně vyšší dávky viru než dělnice (Blanchard et al., 2007). Přenos je nejspíše uskutečňován buď příjmem virových partikulí spolu s potravou nebo průnikem skrze různá zranění (Berényi et al., 2006). Pomocí TagMan RT-PCR byly měřeny i hladiny CBPV u kukel, larev a vajec. Výsledky napovídaly, že vertikální přenos mezi královnou a potomstvem se nejspíše neuskutečňuje (Blanchard et al., 2006). Naopak mladší Chenova studie ukazuje, že jak vejce (50%), tak larvy (17%) postižených královen jsou pozitivní. Nepřítomnost CBPV v královniných vaječnících se dá vysvětlit nízkou nedetekovatelnou hladinou viru (Chen et al., 2004). Téměř dvojnásobné množství kopií CBPV, oproti dělnicím, bylo zjištěno u včelích stráží. Vzhledem k úloze stráží v úlu je pravděpodobné, že se mohou snáze infikovat díky častějšímu kontaktu s ostatními včelami. Až do roku 2007 byl CBPV zjištěn pouze u Apis mellifera (Allen and Ball, 1996). Výskyt u předpokládaného hlavního vektora, tedy V. destruktor potvrzen nebyl (Tentcheva et al., 2004; Yue and Genersch, 2005), ačkoli byl tento roztoč přítomen v úlech včel s jasnými příznaky nákazy (Blanchard et al., 2007). Blanchard a jeho kolektiv se začali zabývat otázkou, zda nemohou být za přenos zodpovědní i jiní vektoři. Do styku s pozorovanými včelami 20

přicházeli především mravenci. Sledovanými druhy byly Componotus vagus a Formica rufa, kteří se živí masem a kteří byli pozorování, jak odnášejí do mraveniště mrtvé včely. Provedená studia potvrdila výskyt CBPV u obou druhů mravenců a především i u roztoče V. destruktor. Tyto testy byly provedeny za pomoci TagMan PCR (F. Rufus) a detekce mínus RNA vlákna (C. vagus a V. destruktor). Při porovnávání dílčích sekvencí mravenců, včel i roztočů docházelo až k 100 % shodě. Tyto výsledky naznačují, že jak mravenci, tak V. destrucor hrají v procesech přenosu CBPV významnou roli (Blanchard et al., 2008). 9.4. Patogeneze Virus CBPV je označován za velmi nebezpečný infekční činitel. Chronické ochrnutí způsobované následky tohoto viru může mít za následek vymření značné části populace kolonie (Allen and Ball, 1996). Úl postižený tímto patogenem lze poznat podle shluků postižených včel nebo jednotlivců, většinou v blízkosti česna nebo jeho nejbližším okolí (Faucon, 1992, Faucon 1996 in Ribiére et al., 2002). Tyto včely nejsou schopné letu a jejich křídla nebo celé tělo jsou postiženy charakteristickým třesem. Plazící se jedinci mohou být napadáni zdravými včelami z vlastní kolonie, což může vést až ke kompletní ztrátě chloupků a následné smrti. Postižení jedinci jsou často černě zbarveni. (Ball, 1999) a proto nemohou být strážemi rozeznány a nejsou vpuštěny dovnitř. Z tohoto důvodu je častý výskyt infikovaných včel před vstupem do úlu. Smrt nejspíše nastává v důsledku dehydratace, protože častým příznakem je „průjem“ (Berényi et al., 2006). Při detekci je nutné brát v potaz i fakt, že podobné příznaky se mohou vyskytovat i při otravě určitými pesticidy a stejně tak při extrémní práci kolonie během léta (Ribiére et al, 2000). Byly popsnány dva typy CBPV infekce. „Maladie noire“ (Ribiére et al, 2002), neboli typ jedna se vyskytuje celoročně (Ball and Bailey, 1997 in Ribiére et al., 2002) a jedná se o plazící se jedince bez výraznější přítomnosti černých individuí s bez chlupů. Typ dva může být pozorován na jaře a případně i počátkem léta (Giauffret et al., 1967 in Ribiére et al., 2002) a charakteristickým znakem jsou skupiny třesoucích se včel a černých „okousaných“ jedinců u vchodu (Ball and Bailey, 1997 in Ribiére et al., 2002). Délka onemocnění od uměle vyvolaného propuknutí infekce až po smrt trvá šest až sedm dní (Bailey and Woods, 1977; Ribiére, 2000). V případě přirozeného výskytu infekce se ve většině případů podaří celé kolonii nákazu bez vážných následků přežít (Berényi et al., 2006).

21

10. DWV – Deformed Wing Virus 10.1. Popis a výskyt DWV se nejčastěji vyskytuje v koloniích včel napadených parazitickým roztočem V. destructor (Bowen-Walker et al., 1999) a je zároveň nejčastějším virem včel v Evropě. Objeven byl poprvé v Japonsku v kolonii napadené výše zmíněným roztočem (Bailey and Ball, 1991 in Bowen-Walker et al., 1999). Při monitoringu rakouských úlu byl detekován v 91 % vzorků (Bérenyi et al., 2006) a v případě Francie se jednalo dokonce o 97 % (Tentcheva et al., 2004). I v Maďarsku, kde byl detekován ve třech čtvrtinách kolonií, je DWV nejrozšířenějším virem, (Forgách et al., 2007). Kromě Evropy byl tento patogen spolehlivě detekován i v Africe, ve Spojených státech amerických, v západní Kanadě, Brazílii, Uruguaji, Thajsku, Španělsku, Čině (u A. cerana), Nepálu a Pákistánu (Allen and Ball, 1996; Chen et al., 2004; Berenyi et. al. 2007; Kukielka et al., 2008; Teixeira et al., 2008, Antúnez et al., 2006, Sanpa a Chantawannakul, 2008). 10.2. Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Picornaviridae Rod: Iflavirus (Mayo, 2002) DWV patří mezi viry s jednodílným genomem tvořeným positivním RNA vláknem s jedním cistronem. Strukturální geny se nachází na 5´-konci a geny nestrukturální na 3´-konci (Bowen-Walker et al., 1999, Lanzi et al., 2006) Průměrná velikost genomu DWV je přibližně 10 131 nukleotidů Genersch, 2004) včetně poly-A ocásku (Fujiyuki et al., 2004; Lanzi et al., 2006) a kompletní nukleotidová sekvence genomu tohoto viru je přístupná v GenBank pod kódy NC_004830 a AY292384 (Lanzi et al., 2006). Gen pro kapsidový protein vzorku pocházejícího z Brazílie je zaevidován pod kombinací EU292212 (Teixeira, 2008). Partikule jsou velké 30 nm (Allen and Ball, 1996). Primery amplifikují sedm fragmentů dlouhých 400 – 600 bp. Amplifikovana oblast je dlouhá přibližně 6500 bp a nachází se poblíž 3´-konce. Při zpracovávání dat a tvorbě primerů je třeba brát v úvahu i mírné odlišnosti mezi DWV dle regionu výskytu (Genersch, 2004). 10.3. Transmise U dospělých jedinců byl virus detekován ve spermatu (Fievet et al., 2006; Yue et al., 2006), ve výměšcích žláz určených ke krmení larev (Chen et al., 2005; Yue and Genersch, 2005), v epiteliálních buňkách středního a zadního střeva, ze kterých jsou virové partikuly uvolňovány do lumen střeva, i v reprodukčních orgánech trubců i královny a v mozkové tkáni 22

(Chen et al., 2005, Fievet et al., 2006). V roce 2009 byla v Kanadě nalezena první evidovaná královna se zmrzačenými křídly. Až do této doby byl virus detekován pouze v asymptomatických královnách. Tato královna pocházela z kolonie napadené roztočem V. destructor (Williams et al., 2009). DWV je přenášen jak z královny na potomstvo, tak mezi včelami při krmení a naneštěstí i přes vektora V. destructor (Yue et al., 2006). Partikule DWV byly převědčivě detekovány ve vajíčkách (Chen et al., 2005) i ve spermatu trubců (Yue et al., 2006), krmení určeném pro larvy i ve výše zmíněném roztoči (Yue and Genersch, 2005). Při inseminaci zdravých královen infikovaným spermatem bylo u dvou ze tří zkoumaných královen virem infikováno 70% jedinců ve všech stádiích jejich potomstva před zakuklením. To poměrně jasně ukazuje, že trubci jsou schopni touto cestou infikovat většinu budoucího potomstva. Na druhou stranu trubci vybraní pro výše zmíněný pokus by nemuseli obstát ve velmi vyčerpávajícím letu a páření, tedy by takto mohla vzniknout bariéra pro přenos DWV. Postižení trubci by nebyli schopni absolvovat tento náročný proces a pářily by se tak jen zdraví jedinci (de Miranda and Fries, 2008). Přenos z roztočů na vajíčka a mladé larvy, je vyloučen, protože tyto živoní stádia V. destructor neparazituje (Chen et al., 2005). U včelích královen byly virové partikule zjištěny ve všech částech těla kromě hlavy a ve výkalech (Chen et al., 2005). Při horizontálním přenosu se virus nejspíše šíří nejen orálně – fekální cestou, ale i cestou kanibalismu (Chen et al., 2005; Yue and Genersch, 2005). Včely nejsou jedinými hostitely tohoto viru. Deformovaná a zmrzačená křídla byla pozorována i u čmeláků Bombus terrestris a Bombus pascuorum. Oba tyto druhy měli úzkou vazbu na nedaleko se vyskytující kolonie včel, postižené DWV. U prvního druhu byly postiženy královny, zatímco u druhého to byly dělníce, které byly pozorovány, jak kradou med ze sousední kolonie včel. Na rozdíl od včel nebyl v koloniích čmeláků, s postiženými jedinci, detekován V. destructor . U čmeláků byl patogen detekován pouze v abdomenu, což může souviset s nepřítomností výše zmíněného roztoče. Tato fakta potvrzují hypotézu, že DWV je silně virulentní a může se šířit i mezi druhy. Navíc při absenci V. destructor a nemožném vertikálním přenosu z včelí královny na čméláčí dělnice se jako jediná cesta přenosu infekce nabízí orální přenos. (Genersch et al., 2005) 10.4. Patogeneze Stejně jako u většiny ostatních virových onemocnění, ani u DWV není většina jedinců nijak postižena. I u symptomatických jedinců pracuje virus pomalu. DWV musí projít replikací, aby byl plně životaschopný (Yue and Genersch, 2005). Infikované kukly mohou mít 23

degenerovaná či poškozená křídla (Berényi et al., 2006), menší velikost během vývinu nebo mohou zemřít během zakuklení (Bowen-Walker et al., 1999). U dospělých jedinců se virus může projevovat ztrátou zbarvení, zakrnělými nebo zmrzačenými křídly a zkrácenými nateklými zadečky. Vyskytuje se i paralýza a následná smrt, a to i u královen (Allen and Ball, 1996; Martin, 2001). DWV je řazen mezi hlavní patogeny, které způsobují za součinnosti s V. destructor colony collapse disorder (Martin, 2001). Častý výskyt DWV je možná zčásti dán i tím, že se tento patogen vyskytuje ve všech životních stádiích včel a je tedy větší pravděpodobnost jeho detekce (Chen et al., 2005; Yue and Genersch, 2005). Rozdíl mezi virovými dávkami u kolonií zdravých a postižených je u DWV velmi markantní, dávky jsou vyšší přibližně stodvacetšestkrát (Berényi et al., 2006). Včely, u nichž se objeví symptomy, nežijí většinou déle než 67 hodin (Yang and Cox-Foster, 2007).

11. IAPV - Israeli Acute Paralysis Virus 11.1. Popis a výskyt IAPV byl poprvé izolován v roce 2004 v Izraeli (Maori et al., 2007), ačkoli je možné, že první nález je již o dva roky mladší a pochází z Francie. IAPV mohl být totiž chybně identifikován jako KBV, protože použité primery mohou nejspíše amplifikovat oba viry (Blanchard, 2008). Výskyt byl prozatím potvrzen v USA, kde byl spolu s KBV spojován se syndromem CCD (Cox-Foster, et al., 2007), Austrálii, Francii, Číně a samozřejmě Israeli (Chen and Evans, 2007; Maori et al., 2007; Stokstad, 2007; Blanchard et al., 2008). 11.2. Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Dicistroviridae Rod: Cripavirus (Christian et al., 2005 in Blanchard et al., 2008) Genom viru je složen ze dvou poměrně dlouhých ORF. ORF na 5´-konci kóduje strukturální polyproteiny, tedy minimálně dva proteiny kapsidy. Druhé ORF na 3´-konci kóduje polyproteiny nestrukturální a jedná se o některé sekvence pro RdRP, proteázy a helikázy (Maori et al., 2007). Délka genomu je 9499 nt (EF319380). Z Francie pocházející IAPV sekvence jsou k dispozici v GenBank pod kódy EU604006 až EU604010 (Blanchard et al., 2008), izraelská forma má kód NC_009025 a zbývající izoláty jsou uvedeny pod kódy EU122346 až EU122366 (Cox-Foster et al., 2007). IAPV se dělí na dvě hlavní linie, které odpovídají víceméně geografickému původu izolátů. Všechny vzorky pocházející z Francie patří spolu se dvěma australskými a dvěma 24

americkými vzorky do linie A. Ostatní izoláty patří do linie B (Cox-Foster et al., 2007; Maori et al., 2007). 11.3. Patogeneze IAPV je jedním z faktorů působícím při CCD, jeho úloha však zatím nebyla uspokojivě vysvětlena. IAPV byl detekován v 83% kolonií postižených výše zmíněným syndromem, ale jen v 5% zdravých kolonií. Mezi příznaky patří třesoucí se nebo zcela ochrnutá křídla. Takto postižení jedinci pak umírají mimo kolonii (Cox-Foster et al., 2007).

13. KBV – Kashmir Bee Virus 12.1. Popis a výskyt KBV byl poprvé izolován z jedinců Apis mellifera, kteří nebyli infikováni přirozenou cestou. Virus jim byl vpraven uměle z Apis cerana Fabricius pocházející ze severní a západní Indie (Bailey and Woods, 1977). KBV byl hlášen z Fidži, Spojených států amerických, Indie, Austrálie, Nového Zélandu Kanady, Španělska, Anglie a Thajska (Hornitzky, 1981 in Ward et al., 2007; Anderson, 1983 in Ward et al., 2007; Hornitzky, 1987 in Ward et al., 2007; Anderson, 1988 in Ward et al., 2007, Anderson, 1990; Allen and Ball 1996; Hung et al., 1996; Todd and Ball, 2007; Ward, 2007; Sanpa a Chantawannakul, 2008). Dřívější hypotézy o omezeném výskytu KBV ve středozápadní Evropě se bohužel neukázaly jako pravdivé, protože v nedávné době byl virus potvrzen i v Německu (Siede et al., 2004) a ve Francii (Tentcheva et al., 2004). Přesto se dá řící, že KBV nepatří mezi viry s extrémním výskytem, jako třeba DWV, a jeho výskyt ve střední Evropě je stále naštěstí raritou. Například při rakouské studii nebyl nalezen ani v jednom vzorku z Rakouska, Německa, Maďarska a Slovinska (Berényi et al., 2006). Naopak ve Francii byl již evidován (Tentcheva et al., 2004). V Anglii byli ze 458 zkoumaných kolonií pozitivní pouze tři (Ward et al., 2007). 12.2. Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Dicistroviridae Rod: Cripavirus (Mayo, 2002) Kompletní genom tohoto patogenu o délce 9 524 bp je od roku 2003 k dispozici na GenBank pod kódem NC_004807. (de Miranda, 2004). Partikule KBV mají různé rozměry s průměrnou velikostí 30 nm. Vznášiva hustota částic v CsCl je 1371 g/ml při pH 7 a hodnota sedimentace nabývá hodnot okolo 172 svedbergů (Bailey and Woods, 1977).

25

12.3. Transmise Virus se vyskytuje ve výstelce střeva a na rozdíl od jiných virů se KBV nenachází v nervové tkáni (Anderson and Gibbs, 1989 in Ward et al., 2007; Ribiére et al., 2002). Vzhledem k prokázané přítomnosti KBV partikulí jak v královnách, tak v jejich vajíčkách se u tohoto viru nejspíše uplaťnuje vertikální přenos mezi královnou a jejím potomstvem (Shen, 2005). Partikule KBV byly detekovány i ve výkalech královny a dělnic (Hung et al., 2000), což by umožňovalo horizontální fekálně – orální přenos (Chen et al., 2005). Prokázán byl přenos mezi roztoči navzájem a zroztočů na včelí potomstvo (Chen et al., 2004). Stejně jako ABPV je i KBV přenášen výměšky slinných žláz dospělců (Allen and Ball, 1996). Kromě včely medonosné byl tento patogen detekován i u německé vosy Vespa (Vespula) germanica (Anderson, 1991 in Genersch et al., 2005). 12.4. Patogeneze KBV je považován za virus s velmi vysokou virulencí (Allen and Ball, 1996). Infikované včely nejeví žádné zřetelné příznaky (Shen et al., 2005). Jedná se nejspíše o jedince nakažené KBV ve stádiu larvy, kteří infekci přežili a v dospělosti se u nich virus neprojevuje (Siede et al., 2004, Berényi et al., 2006). Při uměle vyvolané infekci umírají laboratorně chované larvy i dospělci během tří až šesti dnů (Bailey and Woods, 1977; Allen and Ball, 1996), stejná doba je předpokládána i u nově nakažených dospělců v přírodě (Berényi et al., 2006). K vyvolání smrtlné infekci stačí jen několik málo partikulí vpravených do hemolymfy (Allen and Ball, 1996).

13. KV - Kakugo Virus 13.1. Popis a výskyt Kakugo virus byl poprvé detekován pomocí metody RT-PCR u včelstev pocházejících z Itálie. Jedinými napadenými včelami byli včelí stráže a agresivní dělnice, u nichž byla zjištěna přítomnost viru v mozku. Zdá se tedy, že stejně jako SBV i KV má vliv na chování včel. Kromě mozku se virus vyskytuje i v hrudi a zadečku. Slovo kakugo znamená v japonštině „připravený k útoku“ Výskyt byl potvrzen i v Japonsku (Fujiyuki et al., 2004, 2006). 13.2. Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Picornaviridae Rod: Iflavirus (Fujiyuki et al., 2004) 26

Genom Kakugo viru je lineární, dlouhý 10 152 nukleotidů a kóduje protein o velikosti 2893 aa, který je podobný polyproteinům picornavirů. Virus se v těle včel vyskytuje ve formě virionů i ve formě volné RNA. Genom je dostupný na GenBank pod kódem AB070959. Virus je velmi podobný DWV (shoda 97-98%). Rozdíl je především ve 201 nukleotidech, z nichž 21 způsobuje substituci aa v polyproteinu (Fujiyuki et al., 2004). 13.3. Transmise Přenos viru se nejspíše odehrává stejně jako u ostatních virů skrze ranky, oděrky či vpichy způsobené jedinci kolonie nebo parazity typu V. destructor a Nosema apis. Kromě toho se virus přenáší i orálně (Fujiyuki et al., 2004, 2006). 13.4. Patogeneze Dodnes není jasné, zda má Kakugo virus vliv na zdraví včel. Možné je, že agresivní chování dělnic je spojeno s kraším životním cyklem (Fujiyuki et al., 2004, 2006).

14. SBV – Sacbrood Virus 14.1. Popis a výskyt Nemoc označovaná jako „Sacbrood“ je známa již od počátku 20. Století (White, 1917 in Ghosh et al., 1999). Už tehdy se vědci domnívali, že infekci způsobuje virus, ale samotný původce byl určen až o půl století později (Bailey et al. 1964). Na konci 20. Století se stal SBV prvním virem s kompletně osekvenovaným genomem (Ghosh et al., 1999). SBV se vyskytuje na všech kontinentech (Nixon, 1982 in Shen, 2005; Dall, 1985; Antúnez et al., 2006; Teixeira et al., 2008; Sanpa a Chantawannakul, 2008) a je tedy spolu s DWV nejspíše nejrozšířenějším včelím virem na světě (Shen et al., 2005), ačkoli například v Maďarsku byl přítomen jen v necelých 2 % případů (Forgách et al., 2007). SBV se dělí na tři typy. Typ jedna je reprezentován liniemi z kontinentální Evropy a jedná se jmenovitě o Španělsko, Francii a Rakousko. Typ dvě je složen ze vzorků z Uruguaje a Velké Británie. Typ tři je zastoupen pouze izolátem pocházejícím z Číny (Kukielka et al., 2009). 14.2. Taxonomie, genom a partikule Čeleď: Picornaviridae Rod: Iflavirus (Ghosh et al., 1999) Virové částice SBV mají průměr 28 nm a postrádají obal i charakteristický tvar (Bailey, 1968). Zatímco picornaviry známé u savců mají genom velký okolo 7500 nt, genom 27

SBV je přibližně o 1332 nt větší a jediné ORF (179 – 8752) kóduje až 2858 aminokyselin (Ghosh et al. 1999, Grabensteiner et al, 2000). UTR na 3´-konci kóduje replikázové proteiny a je dlouhý 80 nukleotidů, což odpovídá picorna virům savců. Naproti tomu na 5´-konci se nachází pouze 178 nt dlouhý UTR, což je úsek třikrát až šestkrát kratší než stejný region u savčích virů čeledi picornaviridae a jsou zde kódovány bílkoviny pro stavbu kapsidy (Ghosh et al, 1999; Leat et al. 2000). Stejně jako u DWV, i u tohoto patogenu je třeba brát v úvahu určité odchylky v genomu, odvozené většinou od rozdílného geografického původu studovaných vzorků (Grabensteiner et al, 2001). Vznášivá hustota částic v CsCl je 1360 g/ml a sedimentační koeficient je při pH 7 roven 159 S (Bailey and Woods, 1977). V kyselém pH je virus značně nestabilní. V SBV byly prozatím identifikovány tři strukturní proteiny o hmotnostech 25, 28 a 31,5 kDa (Bailey, 1976). Sekvence SBV z Velké Británie, jsou v GenBank evidovány pod kódem AF092924 (Ghosh, 1999). Nucleotidové sekvence vložené do databáze o rok později lze nalézt pod kódy AF284616 až AF284644 a AF284648 až AF284691 (Grabensteiner, 2000). 14.3. Transmise U SBV byl pozorován horizontální přenos na larvy při krmení, což asi souvisí s hromaděním virových partikulí v podhltanových žlázách (Bailey, 1969). Stejně jako u KBV, i u tohoto viru byly virové partikule nalezeny ve vajíčkách i v tělech královen a zřejmě se tedy uplatňuje i vertikální přenos (Shen et al., 2005). 14.4. Patogeneze Virus sacbrood napadá především včelí larvy, které ztrácí schopnost zakuklit se. Pod jejich kůží se navíc hromadí ekdysální tekutina, která standardně slouží k oddělení staré pokožky od nově vznikající. Larva tedy vytvoří jakýsi vak (sac - vak; brood – potomstvo) a zároveň mění barvu z bílé na bledě žlutou. Infekce končí smrtí a následným vysušením spojeným se změnou barvy na tmavě hnědou (Grabensteiner et al., 2000). Mrtvá larva pak vypadá jako šupina či strup (Bailey, 1975 in Ghosh et al., 1999). Procento nakažených larev není příliš vysoké, protože dělnice jsou schopny jich většinu odhalit a vynést již v raném stádiu (Allen and Ball, 1996). Potvrzen byl i výskyt viru u dospělých včel (Bailey, 1969). Kromě zkráceného životního cyklu některých jedinců nebyly pozorovány žádné příznaky další infekce (Bailey and Fernando, 1972 in Ghosh et al., 1999). SBV ovlivňuje chování včelích dělnic, napadených tímto virem. Bylo pozorováno, že tyto dělnice mají sklon začít se

28

krmit

dříve

než

jedinci

nenapadení.

Zároveň

ztrácejí

schopnost

sbírat

pyl

(Anderson and Giacon, 1992). Nejvyšší výskyt viru bývá na jaře, kdy se kolonie intenzivně množí a je zde tedy velké množství larev a také mladých včel (Bailey, 1969 in Ghosh et al., 1999) Virová dávka SBV u asymptomatických kolonií je asi desetkrát menší než u kolonií infikovaných (Berényi et al., 2006).

15. Ostatní včelí viry Apis iridescent virus AIV napadá asijskou včelu A. cerana. Dospělci ztrácejí schopnost létat a hromadí se před úly. V laboratorních podmínkách se virus množí i v A. meliifera, ale v přírodě u tohoto druhu zjištěn nebyl. Jedná se o DNA virus. VPS: 150 nm (Bailey et al., 1976; Allen and Ball, 1996). Arkansas bee virus Virus byl detekován pouze v USA. Laboratorně infikované včely umírají během tří týdnů. Virus může být zodpovědný za zkrácený životní cyklus. VPS: 30 nm (Bailey and Woods, 1974; Allen and Ball, 1996). Berkeley bee picornavirus Stejně jako ABV byl detekován pouze v Coloradu a Wyomingu (Allen and Ball, 1996). Bee virus X Virus byl izolován na všech kontinentech, kromě Asie. Napadá střevo a postižení jedinci mohou mít výrazně zkrácený životní cyklus. Ve spojení se SBV se stává smrtelným. VPS: 35 nm (Bailey and Woods, 1974; Allen and Ball, 1996). Bee virus Y BVY se stejně jako BQCV a FV vyskytuje v koloniích zamořených hmyzomorkou N. Apis, kde napadá střeva včel. VP: 35 nm (Bailey et al., 1980; Allen and Ball, 1996). Chronic paralysis virus associate Jedná se o satelitní virus, který je svým replikačním cyklem vázaný na CBPV. Geografický výskyt obou virů je tedy totožný. CPVA se replikuje v odlišných tkáních a v odlišném množství než CBPV. VPS: 17 nm (Bailey et al., 1980; Allen and Ball, 1996). Cloudy wing virus CWV se vyskytuje na všech kontinentech. V Británii byl detekován v 15% kolonií. Na krátké vzdálenosti se šíří vzduchem a napadá dospělce i larvy, Postižení jedinci přestávají 29

mít průhledná křídla a poměrně rychle umírají. Při zkrmování ani umělé infikaci se virus nemnoží. VPS: 17 nm (Bailey et al., 1980; Allen and Ball, 1996). Egypt bee virus EBV byl deteková z mrtvých jedinců pocházejících z Egypta a je vzdáleně příbuzný s DWV. Virové částice obsahují tři proteiny. Uměle infikované kukly černají a umírají během 3-4 dnů. VPS: 30-35 nm (Bailey et al., 1979; Allen and Ball, 1996). Filamentous virus Virus byl poprvé izolován v USA. Dle britské studie se jedná o nejrozšířenější, ale zároveň nejméně nebezpečný virus včel. Virus se vyskutuje v Evropě, Asii a Austrálii. Jedná se o DNA virus. VPS: 450x150 nm (Bailey et al., 1981; Allen and Ball, 1996). Slow paralysis virus Virus objeven během laboratorních studií BVX. V Británii je spojován s úmrtím dospělců i larev v koloniích zamořených V. destructor. Detekován byl pouze ve třech zemích. Uměle infikované včely umírají během 12ti dní. VPS: 30 nm (Bailey and Woods, 1974; Allen and Ball, 1996). Thai sacbrood TSBV se vyskytuje v Asii, kde napadá A. cerana. U druhu A. mellifera detekován nebyl, ačkoli v laboratorních podmínkách se v jedincích tohoto druhu úspěšně množí. Na počátku osmdesátých let zničil tento virus 95% kolonií včel v část Himalájí zvané Hindu Kush.VPS: 30 nm (Allen and Ball, 1996).

16. Podobnost a společný výskyt virů Viry zmíněné v této práci jsou si více či méně podobné. ABPV a KBV sdílejí některé antigenní vlastnosti. Jejich nukleotidové sekvence se shodují v 73 %. Ještě vyšší shoda, 79 %, je na úrovni aminokyselin (Bákonyi et al., 2002). Velmi blízké jsou si i DWV a KV, jejichž homologie na úrovni nukleotidů je 98% a je možné, že právě tento dvouprocentní rozdíl je důvodem, proč Kakugo virus napadá právě mozek. Odlišné aminokyseliny mohou být zodpovědné za změny v chování včel napadených Kakugo virem (Rortais et al., 2006). KV je homologní i s VDV-1, izolovaným z roztoče V.destructor. Genom a polyprotein se shodují z 95% (Fujiyuki et al., 2006). Viry ze skupiny Dicistroviridae tvoří podobně proteiny. Proteiny IAPV a ABPV se shodují z 80,2%, proteiny ABPV a KBV jsou shodné ze 79,3%. IAPV a KBV mají proteiny odpovídající si ze 77,4%. (Sabath et al., 2009). Společný výskyt více virů v jedné kolonii je běžným jevem. Dle Thajské studie se vyskytují DWV a ABPV 17% případů. Tři viry (ABPV, DWV, KBV nebo ABPV, DWV, 30

SBV) se vyskytují 13% případů a 4% kolonií bylo napadeno čtyřmi (ABPV, DWV, KBV, SBV) viry najednou (Sanpa a Chantawannakul, 2008). V Brazílii byla koinfekce mezi ABPV, BQCV a DWV zjištěna ve 22,4% zkoumaných vzorků (Teixeira et al., 2008). Koinfekce je možná i mezi ABPV a KBV (Evans, 2001). Společný výskyt KBV a SBV v kuklách potvrzen nebyl (Dall, 1985). Viry na sebe ve včelím organismu mohou působit a někdy nejspíše dochází ke kompetičnímu boji, protože např. ABPV se při uměle vyvolané infekci nemnoží v přítomnosti BQCV a SBV (Kukielka et al., 2007). Naopak KBV zastavuje replikaci BQCV a SBV (Anderson and Gibbs, 1988). Ke kompetici může docházet i při koinfekci KBV a ABPV (Anderson, 1991 in Evans, 2001).

31

17. Závěr Včelí viry se stávají vážným ekonomickým, zemědělským i ekologickým problémem. Díky tomu se na ně zaměřuje čím dál tím více prací, téměř ze všech kontinentů. I přes veškerou snahu není zatím jasné, zda jsou smrtelným faktorem opravdu viry. Pokud ano, je to určitě možné jen v součinnosti s dalším stresovým faktorem. Hlavním problémem je společné působení bezobratlých parazitů, především V. destructor, a výše zmíněných včelích virů. Jelikož včely žily s viry dlouhodobě v určité rovnováze, zaměřil bych další studium právě na ektoparazitického roztoče V. destructor. V. destructor se do západní Evropy dostal z Asie před čtyřiceti lety. I dnes jsou u asijských druhů včel evidováni bezobratlí paraziti a viry, které zatím v přírodních podmínkách A.mellifera nenapadají. Nicméně ze strany parazitů je zde stále riziko, že může dojít k přizpůsobení se na nového hostitele (A. mellifera). Proto by měl být co nejdříve omezen nebo zakázán mezinárodní obchod s včelami a jejich produkty. Viry přicházející např. z Asie bývají pro druhy západní Evropy mnohem nebezpečnější, protože včely neměly čas se jim přizpůsobit. V dnešní době rozvinutých technologií by teoreticky bylo možné včely imunizovat pomocí atenuovaných, neškodných nebo artificiálních virů. Evidence kovýskytu výše zmíněných virů je sice rozsáhlá, ale nikdy se zatím nevyskytovaly všechny najednou a některé práce ukazují, že při uméle vyvolané infekci se některé viry šíří lépe na úkor jiných. Tedy, obsadit „niku“ včela atenuovanými viry. Řešením mohou být AHBs. Jedná se o včely, které se nyní vyskytují v tropických nebo subtropických oblastech obou amerických kontinentů. Tento typ vznikl přenosem genů mezi africkým poddruhem včely medonosné dvěma podruhy evropské formy téhož druhu. Souhrnně jsou nazývány termínem „poafričtěné včely“ a jejich specifičnost tkví v jejich zvýšené odolnosti vůči roztočům a jiným parazitům (Rosenkranz, 1999; Moretto and Mello, 1999; Aumeier, 2001; Mondragón et al., 2005; Texeira et al., 2008).

32

18. Seznam použité literatury [1] dostupné k 20.6.2010 na http://www.priroda.cz/lexikon.php?detail=45 [2] dostupné k 20.6.2010 na http://cs.wikipedia.org/wiki/V%C4%8Dela_medonosn%C3%A1 [3] Allen, M., Ball, B., 1996. The incidence and world distribution of honey bee viruses. Bee world 77, 141-162. [4] Anderson, D. L., Gibbs, A. J., 1988. Transpuparial transmission of Kashmir bee virus and sacbrood virus in the honey bee (Apis mellifera). Annals of Applied Biology 114, 1-7. [5] Anderson D L. 1990. Pests and pathogens of the honeybee (Apis mellifera L.) in Fiji. Journal of Apicultural Research. [6] Anderson, D, L., Giacon, H., 1992. Reduced Pollen Collection by Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) Colonies Infested with Nosema Apis and Sacbrood Virus. Journal of Economic Entomology 85, 47-51. [7] Antúnez, K; D´Alessandro, B., Corbella, E., Ramallo, G., Zunino, P., 2006. Honeybee viruses in Uruguay. Journal of Invertebrate Pathology 93, 67-70. [8] Aumeier, P., 2001. Bioassay for grooming efectiveness towards Varroa destructor mites in Africanized and Carniolan honey bees. Apidologie 32, 81-90. [9] Bailey, L., 1963. The pathogenicity for honey-bee larvae of microorganisms associated with European foulbrood. Journal of Insect Pathology 5, 198-205. [10] Bailey, L., Gibbs, A. J., Woods, R. D., 1964. Sacbrood virus of the larval honey bee (Apis mellifera linnaeus). [11] Bailey, L., 1965. Paralysis of the honey bee, Apis mellifera Linnaeus. Journal of Invertebrate Pathology 7, 132-140. [12] Bailey, L., 1968. Honey bee pathology. Annual Review of Entomology 13, 191-212. [13] Bailey, L., 1968. The multiplication and spread of sacbrood virus of bees. Rothamsted Experimental Station, Harpenden, Herts., England. [14] Bailey, L., Milne, R. G., 1969. The Multiplication Regions and Interaction of Acute and Chronic Bee-paralysis Viruses in Adult Honey Bees. Rothamsted Experimental Station, Harpenden, Herts., England. [15] Bailey, L., 1969. The multiplication and spread of sacbrood virus bees. Annals of Applied Biology 63, 483-491. [16] Bailey, L., Woods, R. D., 1974. Three Previously Undescribed Viruses from the Honey Bee. Journal of General Virology 25, 175-186.

33

[17]

Bailey,

L.,

1976.

Viruses

attacking

the

honey

bee.

http://books.google.com/books?hl=cs&lr=&id=0HVnV0CX95EC&oi=fnd&pg=PA271&dq= bee+autor:bailey&ots=oQjFukIUHt&sig=3ZoWxUbzjHkNo_yevnRoPt3Gx6M#v=onepage& q&f=false [18] Bailey, L., Ball, B. V., Woods, R. D., 1976. An Iridovirus from Bees. Journal of General Virology 31, 549/461. [19] Bailey, L., Woods, R. D., 1977. Two More Small RNA Viruses from Honey Bees and Further Observations on Sacbrood and Acute Bee- Paralysis Viruses. Journal of General Virlogy 37, 175-182. [20] Bailey, L., Carpenter, J. M., Woods, R. D., 1979. Egypt Bee Virus and Australian Isolate of Kashmir Bee Virus. Journal of General Virology 43, 641-647. [21] Bailey, L., Ball, B. V., Carpenter J. M., Woods, R. D., 1980. Small Virus-like Particles in Honey Bees associated with Chronic Paralysis Virus and with a Previously Undescribed Disease. Journal of General Virology 46, 149-155. [22] Bailey, L., Carpenter, J. M., Govier, D. A., Woods, R. D., 1980. Journal of General Virology 51, 405-407. [23] Bailey, L., Carpenter, J. M., Woods, R. D., 1981. Properties of a filamentous virus of the honey bee (Apis mellifera). Viroogy 114, 1-7. [24] Bailey, L., Ball, B. V., Perry, J. N., 1983. Association of viruses with two protozoal pathogens of the honey bee. Annals of Applied Biology 103, 13-20. [25] Ball, B. V., 1999. An introduction to viruses and techniques for their identification and characterisation. Options Méditerranéennes. Série B : Etudes et Recherches (CIHEAM) 25. [26] Bákonyi, T., Grabensteiner, E., Kolodziejek, J., Rusvai, M., Topolska, G., Ritter, W., Nowotny, N., 2002. Phylogenetic Analysis of Acute Bee Paralysis Virus Strains. Applied and Environmental Microbiology, 6446-6450. [27] Bákonyi, T., Farkas, R., Szendröi, A., Dobos-Kovácz, M., Rusvai, M., 2002. Detection of acute bee paralysis virus by RT-PCR,in honey bee and Varroa destructor field samples:,rapid screening of representative Hungarian apiaries. Apidologie 33, 63-74. [28] Benjeddou, M., Leat, N., Davison, S., 2002. Black queen-cell virus RNA is infectious in honey bee pupae. Journal of Invertebrate Pathology 81, 205-206. [29] Berényi, O., Bakonyi, T., Derakhshifar, I., Köglberger, H., Nowotny, N., 2006. Occurrence of Six Honeybee Viruses in Diseased Austrian Apiaries. Applied and

34

[30] Blanchard, P., Ribiére, M., Celle, O., Lallemand, P., Schurr, F., Olivier, V., Iscache, A., L.,Faucon, J., P., 2006. Evaluation of a real-time two-step RT-PCR assay for quantitation of Chronic bee paralysis virus (CBPV) genome in experimentally-infected bee tissues and in life stages of a symptomatic colony. Journal of Virological Methods 141, 7-13. [31] Blanchard, P., Olivier, V., Iscache, A., L., Celle, O., Schurr, F., Lallemand, P., Ribiére, M., 2007. Improvement of RT-PCR detection of chronic bee paralysis virus (CBPV) required by the description of genomic variability in French CBPV isolates. Journal of Invertebrate Pathology 97, 182-185. [32] Blanchard, P., Schurr, F., Celle, O., Cougoule, N., Drajnudel, P., Thiéry, R., Faucon, JP., Ribiére, M., 2008. First detection of Israeli acute paralysis virus (IAPV) in France, a dicistrovirus affecting honeybees (Apis mellifera). Journal of Invertebrate Pathology 99, 348-350. [33] Boecking, O., Genersch, E., 2008. Varroosis – the Ongoing Crisis in Bee Keeping. Journal of Consumer Protection and Food Safety. [34] Borman, A. M., Le Mercier, P., Girard, M., Kean, K. M., 1997. Comparison of picornaviral IRES-driven internal initiation of translation in cultured cells of different origins. Nucleic Acids Research 25, 925-932. [35] Bowen-Walker, P. L., Martin, S. J., Gunn, A., 1999. The Transmission of Deformed Wing Virus between Honeybees (Apis mellifera L.) by the Ectoparasitic Mite Varroa jacobsoni Oud. Journal of Invertebrate Pathology 73, 101-106. [36] Broedsgaard, C. J., Hansen, H., 1996. Virus and varroa - a deadly combination. Gron Viden Landburg 162. [37] Carpana, E., Vecchi, M. A., Lavazza, A., Bassi, S., Dottori, M., 1991. Prevalence of acute paralysis virus (APV) and other viral infections in honeybees in Italy. Proceedings of the International symposium on recent research on bee pathology, 155-165. [38] Chen Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, Hei-ti., Evans, J., Feldlaufer, M., 2004. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology 87, 84-93. [39] Chen, Y. P., Higgins, J. A., Feldlaufer, M. F., 2005. Quantitative Real-Time Reverse Transcription-PCR Analysis of Deformed Wing Virus Infection in the Honeybee (Apis mellifera L.). Applied Environmental Microbiology 71, 436-441. [40] Chen, Y. P., Pettis, J. S., Collins, A., Feldlaufer, 2005. Prevalence and Transmission of Honeybee Viruses. Applied and Environmental Microbiology, 606-611. [41] Chen, Y. P., Siede, R., 2007. Honey bee viruses. Advances in Virus Research 70, 33-80. 35

[42] Chen, Y., Evans, J. D., 2007. Historical presence of Israeli acute paralysis virus in the United States. USDA-ARS, Bee Research Laboratory, Beltsville, MD 20705. [43] Christian, P., Carstens, E., Domier, L., Johnson, K., Nakashima, N., Scotti, P., van de Wilk, F., 2002. Dicistroviridae ICTVdbIndex of Viruses. Dostupné k 20.6.2010 na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/fs dicis.htm. [44] Christian P, Carstens E, Domier L, Johnson J, Johnson K, Nakashima N, Scotti P, van der Wilk F (2005) Dicistroviridae. In: Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA (eds) Virus taxonomy, VIIIth Report of the ICTV. Elsevier/Academic Press, London, pp 783–788 [45] Cox-Foster, D. L., Conlan, S., Holmes, E. C., Palacios, G., Evans, J. D., Moran, N. A., Quan, P-L., Briese, T., Hornig, M., Geiser, D. M., Martinson, V., van Engelsdorp, D., Kalkstein, A. L., Drysdale, A., Hui, J., Zhai, J., Cui, L., Hutchinson, S. K., Somins, J. F., Egholm, M., Pettis, J. S., Lipkin, W. I., 2007. A Metagenomic Survey of Microbes in Honey Bee Colony Collapse Disorder. Science 318. [46] Dainat, B., Ken, T., Berthoud, H., Neumann, P., 2008. The ectoparasitic mite Tropilaelaps mercedesae (Acari, Laelapidae) as a vector of honeybee viruses. Insectes Sociaux 56, 40-43. [47] Dall, D. J., 1985. A study of sacbrood and Kashmir virus infection in pupae of the honey bee, Apis mellifera. Department of Entomology, Waite research Institute. [48] de Miranda, J. R., Fries, I., 2008. Venereal and vertical transmission of deformed wing virus in honeybees (Apis mellifera L.). Journal of Invertebrate Pathology 98, 184-189. [49] Evans, J. D., 2001. Genetic Evidence for Coinfection of Honey Bees by Acute Bee Paralysis and Kashmir Bee Viruses. Journal of Invertebrate Pathology 78, 189-193. [50] Ellis, J. D., Munn, P. A., 2005. The worldwide health status of honey bees. Bee World 86, 88-101. [51] Faucon, J. P., Vitu, C., Russo, P., Vignoni, M., 1992. Diagnosis of acute paralysis: application to epidemic honeybee diseases in France during 1990. Apidologie 23. 139-146. [52] Fievet, J., Tentcheva, D., Gauthier, L., de Miranda, J., Cousserans, F., Colin, M. E., Bergoin, M., 2006. Localization of deformed wing virus infection in queen and drone Apis mellifera L. Virology Journal 3:16. [53] Flint, S. J., Enquist, L. W., Ranciello, V. R., Skalka, A., 2004. Principles of virology : molecular biology, pathogenesis, & control of animal viruses, (2nd Ed.). ASM Press, Washington DC, USA.

36

[54] Forgách, P., Bakonyi, T., Tapaszti, Z., Nowotny, N., Rusvai, M, 2007. Prevalence of pathogenic bee viruses in Hungarian apiaries: Situation before joining the European Union. Journal of Invertebrate Pathology 95, 235-238. [55] Forsgren, E., de Miranda, J. R., Isaksson, M., Wei, S., Fries, I., 2009. Defromed wing virus associated with Tropilaelaps mercedesae infesting European honey bees (Apis mellifera). Experimental and Applied Acarology 47, 87-97. [56] Fujiyuki, T., Takeuchi, H., Ono, M., Ohka, S., Sasaki, T., Nomoto, A., Kubo, T., 2004. Novel Insect Picorna-Like Virus Identified in the Brains of Aggressive Worker Honeybees. The Journal of Virology 78, 1093-1100. [57] Fujiyuki, T., Ohka, S., Takeuchi, H., Ono, M., Nomoto, A., Kubo, T., 2006. Prevalence and Phylogeny of Kakugo Virus, a Novel Picorna-Like Virus That Infects the Honeybee (Apis mellifera L.), under Various Colony Conditions. Journal of Virology, 11528-11538. [58] Genersch, E., 2004. Development of a rapid and sensitive RT-PCR method for the detection of deformed wing virus, a pathogen of the honeybee (Apis mellifera). The Veterinary Journal 169, 121 – 123. [59] Genersch, E., Yue, C., Fries, I., de Mirande, J. R., 2005. Detection of Deformed wing virus, a honey bee viral pathogen, in bumble bees (Bombus terrestris and Bombus pascuorum) with wing deformities. Journal of Invertebrate Pathology 91, 61-63. [60] Ghosh, R. C., Ball, B. V., Willcocoks, M. M, Carter, M. J., 1999. The nucleotide sequence of sacbrood virus of the honey bee: an insect picorna-like virus. Journal of General Virology 80, 1541-1549. [61] Govan, V.A., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S., 2000. Analysis of the Complete Genome Sequence of Acute Bee Paralysis Virus Shows That It Belongs to the Novel Group of Insect-Infecting RNA Viruses. Virology 277, 457-463. [62] Grabensteiner, E., Ritter, W., Carter, M. J., Davison, S., Pechhacker, H., Kolodziejek, J., Boecking, O., Derakhshifar, I., Moosbeckhofer, R., Licek, E., Nowotny, N., 2001. Sacbrood Virus of the Honeybee (Apis mellifera): Rapid Identification and Phylogenetic Analysis Using Reverse Transcription-PCR. Clinical and Diagnostic Laboratory Imunology, 93-104. [63] Grabensteiner, E., Bákonyi, T., Ritter, W., Pechhacker, H., Nowotny, N., 2007. Development of a multiplex RT-PCR for the simultaneous detection of three viruses of the honeybee (Apis mellifera L.,): Acute bee paralysis virus, Black queen cell virus and Sacbrood virus. Journal of Invertebrate Pathology 94, 222-225. [64] Higes, M., Martin, R., Meana, A., 2006. Nosema ceranae, a new microsporidian parasite in honeybees in Europe. Journal of Invertebrate Pathology 92, 93-95. 37

[65] Hornitzky, M. A. Z., Anderson, D. L., 1993. Honey bee diseases. Australian and New Zealand Standard Diagnostic Procedures. [66] Hung, A. C. F., Shimanuki, H., Knox, D. A., 1996. The role of viruses in bee parasitic mite syndrome. American Bee Journal 136. [67] Hung, A. C. F., Ball, B. V., Adams, J. R., Shimanuki, H., Knox, D. A., 1995. A scientific note on detection of American strains of acute paralysis virus and Kashmir bee virus in dead bees in one US honey bee (Apis mellifera L) colony. Apidologie 27, 55-56. [68] Hung, A. C. F., Peng, Ch. Y. S., Shimanuki, H., 2000. Nucleotide sequence variations in Kashmir bee virus isolated from Apis mellifera L. and Varroa jacobsoni Oud. Apidologie 31, 17-23. [69] Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E., 2007. Fields Virology 5th Edition. Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer Business. [70] Kraus, F. B., Neumann, P., Moritz R. F. A., 2005. Genetic variance of mating frequency in the honeybee (Apis mellifera L.). Biomedical and Life Sciences 52, 1-5. [71] Kuenen, L. P. S., Calderone, N. W., 1997. Transfers of Varroa mites from newly emerged bees: Preferences for age- and function-specific adult bees (Hymenoptera: Apidae). Journal of Insect Behavior, 213-228. [72] Kukielka, D., Esperón, F., Higes, M., Sánchez-Viscaíno, J. M., 2007. A sensitive onestep real-time RT-PCR method for detection of deformed wing virus and black queen cell virus in honeybee Apis mellifera. Journal of Virological Methods 147, 275-281. [73] Kukielka, D., Sánchez-Vizcaíno, J. M., 2009. One-step real-time quantitative PCR assays for the detection and field study of Sacbrood honeybee and Acute bee paralysis virus. Journal of Virological Methods 161, 240-246. [74] Lanzi, G., de Miranda, J. R., Boniotii, M. B., Cameron, C. E., Lavazza, A., Capucci, L., Camazine, S. M., Rossi, C., 2006. Molecular and Biological Characterization of Deformed Wing Virus of Honeybees (Apis mellifera L.). The Journal of Virology 80, 4998-5009. [75] Le Gall, O, Christian, P., Fauquet, C. M., King, A. M. Q., Knowles, N. J., Nakashima, N., Stanway, G., Gorbalenya, E., 2008. Picornavirales, a proposed order of positive-sense single-stranded RNA viruses with a pseudo-T = 3 virion architecture. Arch Virol 153, 715727. [76] Lee, P. E., Furgala, B., 1965. Chronic bee paralysis virus in the nerve ganglia of the adult honey bee. Journal of Invertebrate Pathology 7, 170-174.

38

[77] Leat, N., Ball., B., Govan, V., Davison, S., 2000. Analysis of the complete genome sequence of black queen-cell virus, picorna-like virus of honey bees. Journal of General Virology 81, 2111-2119. [78] Maori, E., Lavi, S., Mozes-Koch, R., Gantman, Y., Peretz, Y., Edelbaum, O., Tanne, E., Sela, I., 2007. Isolation and characterization of Israeli acute paralysis virus, a dicistrovirus affecting honeybees in Israel: evidence of diversity due to intra- and inter-species recombination. Journal of General Virology 88, 3428-3438. [79] Martin S. J., 2001. The role of Varroa and viral pathogens in the collapse of honeybee colonies: a modelling approach. Journal of Applied Ecology 38, 1082-1093. [80] Martin, C., Salvy, M., Provost, E., Bagnéres, A-G., Roux, M., Crauser, D., Clement, J-L., Le Conte, Y., 2001. Variations in chemical mimicry by the ectoparasitic mite Varroa jacobsoni according to the developmental stage of the host honey-bee Apis mellifera. Insect Biochemistry and Molecular Biology 31, 365-379. [81] Mayo, M. A., 2002. Virus taxonomy. Archives of Virology 147, 1071-1076. [82] Mondragón,, L., Spivak M., Vandame, R., 2005. A multifactorial study of the resistance of honeybees Apis mellifera to the mite Varroa destructor over one year in Mexico. Apidologie 36, 345-358. [83] Moore, N. F., Reavy, B., King, L. A., 1985. General Characteristics, Gene Organization and Expression of Small RNA Viruses of Insects. Journal of General Virology 66, 647-659. [84] Moretto, G., de Mello, J. L., 1999. Varroa jacobsoni infestation of adult Africanized and Italian honey bees (Apis mellifera) in mixed colonies in Brazil. Genetics and Molecular Biology 22. [85] Nixon, M., 1982. Preliminary world maps of honey bee diseases and parasites. Bee World 63, 23–42. [86] Nordström, S., Fries, I., Aarhus, A., Hansen, H., Korpela, S., 1999. Virus infections in Nordic honey bee colonies with no, lower or severe Varroa jacobsoni infestations. Apidologie 30, 475-484. [87] Nordström, S, 2000. Virus infections and varroa mite infestations in honey bee colonies. Acta Universitatis Agriculturae Sueciae. Agaria (Sweden) 209, 26-31. [88] Olivier, V., Blanchard, P., Chaouch S., Lallemand, P., Schurr, F., Celle, O., Dubois, E., Tordo, N., Thiéry, R., Houlgatte, R., Ribiére, M., 2007. Molecular characterization and phylogenetic analysis of Chronic bee paralysis virus, a honey bee virus. Virus Research 132, 59-68.

39

[89] Ribiére, M., Faucon, J-P., Pépin, M., 2000. Detection of chronic honey bee (Apis mellifera L.) paralysis virus infection: application to a field survey. Apidologie 31, 567-577. [90] Ribiére, M., Triboulot, C., Mathieu, L., Auriéres, C., Faucon, J. P., Pépin, M., 2002. Moleular diagnosis of chronic bee paralysis virus infection. Apidologie 33, 339-351. [91] Rortais, A., Tentcheva, D., Papachristoforou, A., Gauthier, L., Arnold, G., Colin, M. E., Bergoin, M., 2006. Deformed wing virus is not related to honey bees´ aggressiveness. Virology Journal 3:61. [92] Rosenkranz, P., 1999. Honey bee (Apis mellifera L.) tolerance to Varroa jacobsoni Oud. in South America. Apidologie 30, 159-172. [93] Rosenkranz P., Aumeier, P., Ziegelmann, B., 2010. Biology and control of Varroa destructor. Journal of Invertebrate Pathology 103, [94] Sabath, N., Price, N., Graur, D., 2009. A potentially novel overlapping gene in the genomes of Israeli acute paralysis virus and its relatives. Virology Journal 6, 144-150. [95] Sanpa, S., Chantawannakul, P., 2008. Survey of six bee viruses using RT-PCR in Northern Thailand. Journal of Invertebrate Pathology 100, 116-119. [96] Shen, M., Yang, X., Cox-Foster, D., Cui, L., 2005. The role of varroa mites in infections of Kashmir bee virus (KBV) and deformed wing virus (DWV) in honey bees. Virology 342, 141-149. [97] Shimanuki, H., Calderone, N. W., Knox, D. A., 1994. Parasitic mite syndrome: the symptoms. American bee journal 134, 827-828. [98] Siede, R., Büchler, R., 2004. First detection of Kashmir bee virus in Hesse, Germany. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 117, 12-15. [99] Stockstad, E., 2007. GENOMICS: Puzzling Decline of U.S. Bees Linked to Virus From Australia. Science 317, 1304-1305. [100] Teixeira, E. W., Chen, Y., Message, D., Pettis, J., Evans, J. D., 2008. Virus infections in Brazilian honey bees. Journal of Invertebrate Pathology 99, 117-119. [101] Tentcheva, D., Gauthier, L., Zappulla, N., Dainat, B., Cousserans, F., Colin, M., E., Bergoin, M., 2004. Prevalence and Seasonal Variations of Six Bee Viruses in Apis mellifera L., and Varroa destructor Mite Populations in France. Applied and Environmental Microbiology, 7185-7191. [102] Todd, J., Ball, B., 2007. Incidence and molecular characterization of viruses found in dying New Zealand honey bee (Apis mellifera) colonies infested with Varroa destructor. Apidologie 38, 354-367.

40

[103] Ward, L., Waite, R., Boonham, N., Fisher, T., Pescod, K., Thompson, H., Chantawannakul, P., Brown, M., 2007. First detection of Kashmir bee virus in the UK using real-time PCR. Apidologie 38, 181-190. [104] Wiegers, F. P., 1988. Transmission of honeybee viruses by Varroa jacobsoni Oud. European research on varroatosis control: proceedings of a meeting of the EC Experts' Group, Bad Homburg. [105] Williams, G. R., Rogers, R. E. L., Kalkstein, A. L., Taylor, B. A., Shutler, D., Ostiguy, N., 2009. Deformed wing virus in western honey bees (Apis mellifera) from Atlantic Canada and the first description of an overtly-infected emerging queen. Journal of Invertebrate Pathology 101, 77-79. [106] Yang, X., Cox-Foster, D., 2007. Effects of parazitation by Varroa destructor on survivorship and physiological traits of Apis mellifera in correlation with viral incidence and microbial challenge. Parasitology 134, 405-412. [107] Yue, C., Schröder, M., Bienefeld, K., Genersch, E., 2006. Detection of viral sequences in semen of honeybess (Apis mellifera): Evidence for vertical transmission of viruses through drones. Journal of Invertebrate Pathology 92, 93-96. [108] Yue, C., Genersch, E., 2005. RT-PCR analysis of Deformed wing virus in honeybees (Apis mellifera) and mites (Varroa destructor). Journal of General Virology 86, 3419-3424. [109] Macherey-Nagel, 2008. User Manual.

41