Metody detekce a identifikace MO se zaměřením na PCR a její variace. Kamila Zdeňková

Metody detekce a identifikace MO se zaměřením na PCR a její variace Kamila Zdeňková

Metody detekce a identifikace MO 

rozdělení metod pro mikrobiologické zkoušení potravin



přehled „rychlých“ metod detekce MO



metody založené na polymerásové řetězové reakci (PCR)



biočipy (microarrays nebo arrays)



real on time PCR



digitální PCR



normativní postupy zahrnující PCR

Metody pro mikrobiologické zkoušení potravin Klasické kultivační metody 

  



metody uvedené v Nařízení Komise (ES) č.2073/2005 v platném znění jsou metody referenční a jejich použití je nezbytné pro úřední kontrolu potravin téměř všechny vydány jako ČSN ISO, ČSN EN nebo ČSN EN ISO vydává a seznam platných norem udržuje ÚNMZ (Úřad pro normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví) alternativní metody mohou být použity pro ostatní účely a tehdy, pokud byly validovány postupem podle EN 16140 mezinárodně uznávanými organizacemi Rozdělení metod:



Kvalita 

Ano či ne



Kvantita 

Kolik

Česká technická norma ICS 07.100.01 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metody pro průkaz a stanovení počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae Část 2: Technika počítání kolonií

Únor 2006 ČSN ISO 21528-2 56 0096

ICS 07.100.01 Únor 2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae - Part 2: Colony count method Microbiologie des aliments - Méthodes horizontales pour la recherche et le dénombrement de Enterobacteriaceae Partie 2: Méthode par la comptage des colonies Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Horizontale Verfahren für den Nachweis und für die Zählung von Enterobacteriaceae - Teil 2: Koloniezahlverfahren Tato norma je českou verzí mezinárodní normy ISO 21528-2:2004. Mezinárodní norma ISO 215282:2004 má status české technické normy. This standard is the Czech version of the International Standard ISO 21528-2:2004. The International Standard ISO 21528-2:2004 has the status of a Czech Standard. Nahrazení předchozích norem Touto normou spolu s ČSN ISO 21528-1 z února 2006 se nahrazuje ČSN ISO 8523 (56 0096) z října 1995 a ČSN ISO 7402 (56 0108) z října 1995.

Klasické versus rychlé metody stanovení mikroorganismů v potravinách 

Klasické metody stanovení    



závazné normy (ČSN, ISO) či standardní operační postupy (SOP) dobře charakterizované, akceptované náročné na materiál a práci zdlouhavé 2-10 dní

Rychlé metody stanovení    

doba trvání do 24 h vhodné pro orientační rozbor většího množství vzorků náročné na přístrojové vybavení positivní nález musí být potvrzen normovanou metodou pro daný MO

Přehled metod používaných pro detekci MO Horizontální metody – ISO normy

Klasické kultivační metody, ISO normy PCR

Molekulárně-biologické metody (detekce DNA, případně RNA)

Polymerázová řetězová reakce (PCR) a její variace (multiplex, nested apod.), reversní transkripce PCR (RT – PCR), sekvenace

PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qPCR), digitální PCR (dPCR) Genotypizační metody (AFLP, RFLP, PCR-RFLP, PFGE atd.

Detekce proteinu založené na interakci antigenu s protilátkou

ELISA (Enzymová imunoanalýza na pevné fázi ) Imunochromatografická technika na membráně Imumomagnetická separace

Aglutinace Imunosenzory

Ostatní metody

MALDI-TOF-MS, VIDAS, impedanční metody, stanovení značeného substrátu (CO2), stanovení ATP luminiscenčně, Limulův test atd.

Centrální dogma molekulární biologie • popisuje cestu

přenosu informace v biologických systémech

I

II

DNA: nositelka dědičnosti RNA: realizace genetické informace (čili exprese genu)

III I

Replikace

II

Transkripce

III

Translace

Literature and sources used

Edited by http://en.wikipedia.org/wiki/File:Centraldogma_nodetails.GIF

Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction – PCR)

Navržena Kary B. Mullisem roku 1983 Nobelovou cenou udělena roku 1993

Literatura a použité zdroje

Obrázky: http://www.karymullis.com


  

in vitro reakce umožňující amplifikaci DNA katalyzována termostabilní DNA polymerasou k namnožení cílového úseku používá oligonukleotidových primerů

Vlastní PCR - cyklické opakování 3 kroků Fáze

Průůběěh

Teplota

1.

DENATURACE

tepelné odděělen í vláken dvojšroubovice DNA

94 - 96°C

2.

ANNEALING

přřipojen í primerůů k jejich komplementárn ím úsekůům v DNA

50 - 65°C

3.

ELONGACE

prodloužžen í primerůů polymerasou

72°C


Denaturace

Nasedání primerů

Prodlužování primerů


Obrázek: Andy Vierstraete (1999)

PCR

.

Literature and sources used

Andy Vierstraete (1999)

PCR

 

teoretická účinnost reakce - 100% teoreticky dochází v každém cyklu ke zdvojnásobení

N;

N=N0*2^n

No=1 n

2^n 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1024 15 32768 20 1048576 25 33554432 30 1073741824 35 34359738368 40 1,09951E+12

1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 32768 1048576 33554432 1073741824 34359738368 1,09951E+12

No=10 10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 327680 10485760 335544320 10737418240 3,43597E+11 1,09951E+13

N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N0 = počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce)

n = počet cyklů

Reakční směs (mastermix, MM) složka

funkce

deionizovaná voda

bez DNas, RNas

reakční pufr

vhodné prostředí pro polymerasu (iontová síla, pH)

Mg2+

vazba s nukleotidy – kofaktor polymerasy, (MgCl2, MgSO4)

dNTP (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)

nukleotidy - stavební kameny polymerace

primer A, primer B

synteticky připravené oligonukleotidy o délce 20-25 nukleotidů, ohraničení amplifikovaného úseku

DNA polymerasa

termostabilní DNA polymerasa, polymerace

templát DNA

DNA izolovaná z buněk, plazmidová DNA (genomové knihovny), buněčný extrakt podrobený lýzi

Reakční směs (koncentrace) složka

obvyklá koncentrace v reakční směsi

nízká koncentrace

vysoká koncentrace

templát DNA

0,01 ng-1000ng (plazmid-genomová DNA)

nízký výtěžek

nízká specifita nasedání primerů

přítomnost inhibitorů PCR reakce- EDTA, heparin, (PO4)3nízký výtěžek

nízká specifita nasedání primerů

0,01-0,05 U/µl

nízký výtěžek

nízká specifita

Mg2+

1-5mM (množství Mg2+ je přímo úměrné množství dNTP)

nízký výtěžek

nízká přesnost DNA polymerasy stabilizace ds DNA – neúplná renaturace – nižší výtěžek stabilizace nespecifické vazby primerů-nespecifické

Reakční pufr

10mM Tris-HCl, 50mM KCl

pH<7 poškození templátu

dNTP (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)

200µM pro každý nukleotid

vyšší přesnost

primer A

0,1-1µM

primer B

0,1-1µM

DNA polymerasa

chybné zařazení

Reakční cyklus (teplotní a časový profil) proces

T (°C)

t

Počáteční denaturace

94-95°C

2-5min

Denaturace

95°C

30s-1min

cykly přerušení vodíkových vazeb (hlavně genomová DNA), denaturovaná vlákna obsazena primery (nadbytek) N=25 -30, max. 40

teplota dle délky produktu, typu termocycleru, zkumavek nízká teplota = při ochlazení renaturace vysoká teplota = tepelné poškození templátu, hlavně u delších produktů (chyby)

Annealing

50-65°C

1min

optimální Ta (teplota annealingu) je blízká tzv. teplotě tání primerů = teplota 50% disociace duplexu primer/templát (různé vzorce, záleží na obsahu CG a TA) oba primery by měly mít podobnou Ta – stejná specifita nasedání vysoká teplota = primer nenasedá nízká teplota = primer nasedá nespecificky teplota dle množství templátu: dostatek - 20-40s, málo – déle (musí najít svůj úsek)

Elongace

72°C

45s-3min

teplota optimální pro DNA polymerasu , teplota podle délky fragmentu

Závěrečná elongace

72°C

5-15 min

dokončení nedosyntetizovaných řetězců hybridizace komplementárních vláken

DNA polymerasy • Taq DNA polymerasa • termofilní bakterie Thermus aquaticus (nyní rekombinantně) • aktivní při pokojové teplotě – nutnost pracovat na ledu • při teplotách nad 90°C je inaktivní, ale při ochlazení se znovu aktivuje • pouze 5éxonukleasová aktivita (degradace Okazakiho fr.), nikoliv 3éxonukleasová aktivita (proofreading) • 1 chyba na 10-20tisíc nukleotidů

• Další typy polymeras • Proofreading polymerasy (3éxonukleázová aktivita) = oprava • reverzní transkripce (Mn2+) nebo polymerázová aktivita (Mg2+) v závislosti na přítomných kofaktorech • Hot start polymerasy = ovlivnění začátku reakce • Platinum® Taq DNA Polymerasa Proofreading polymerasy Tth Tma Deep VentTM Tli Pfu Pwo

Thermus thermophilus HB-8 Thermotoga maritima Pyrococcus sp. Thermococcus litoralis Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei

„Hot-start PCR“  

technika, která snižuje nespecifické amplifikace při přípravě mastermixu při pokojové teplotě byly vyvinuty specializované enzymatické systémy, které inhibují polymerázovou aktivitu enzymu při pokojové teplotě   



vazbou protilátky v přítomnosti kovalentně vázaných inhibitorů odloučí až po zahřátí enzymu

Platinum® Taq DNA Polymerasa je rekombinantní Taq DNA polymerasa 



dodávána v komplexu s protilátkou, která inhibuje polymerázovou aktivitu při pokojové teplotě. DNA polymeráza se aktivuje vysokou teplotou (při 94° C) v průběhu počáteční denaturace PCR jakmile se polymeráza oddělí od inhibitoru znovu získá svou aktivitu v plném rozsahu

Primery  oligonukleotidy o délce 20-25 nukleotidů  bez intramolekulárních komplementárních sekvencí – tvorba sekundárních struktur  vyrovnaný poměr GC a AT  3´ konce primerů - probíhá od nich syntéza  neměly by být vzájemně komplementární– tvorba a amplifikace dimerů  na 3´konci by neměl být tymin (nízká specifita párování), degenerace kodonu  na 3´konci by neměly být více jak dva G či C-vysoká stabilita (3 vodíkové vazby)-nespecifické produkty (nasednutí i při nekomplementaritě zbytku)  často na 3´konci tzv. GC svorka (zakončení GC)-zvýšení účinnosti hybridizace k templátu  3´konec nutná komplementarita k templátu  5´ konce primerů – sekvence nemusí zcela odpovídat  vložení restrikčního místa, detekce mutace, různé značky

Primery 

amplifikace ne zcela známé sekvence či sekvence s variabilními pasážemi = degenerované primery  směs primerů lišící ve variabilním místě  zařazení inosinu (páruje se se všemi bazemi) či tyminu (nízká specifita k A)

GAYTST

GHGKAG



amplifikace genu 





Primer, kterým začíná 5‘-konci řetězce genu a v průběhu PCR se elonguje ve směru transkripce, se označuje jako kódující = forward primer (5´primer , upstream primer). Vznikající sekvence identická se sekvencí kodonového vlákna. 3´primer nasedá na 3´konec genu, nasedá na kodonové (+) vlákno. Vznikající sekvence identická se sekvencí antikodonového vlákna.

degenerované primery: amplifikace ne zcela známé sekvence – na místo neznámého nukleotidu zařazeno více možných variant = směs primerů lišící se v dosazené bázi  celkový počet variant – vynásobení počtu variant na jednotlivých pozicích  případně lze zařadit inosin (páruje se se všemi bazemi) či tymin (nízká specifita k A) 



nejdostupnější metodou detekce produktů PCR je elektroforesa v agarosovém gelu interkalační barvivo Ethidium bromid či SYBR Green I

Mr

1000bp

500bp

-

1

2

3

4

+

429bp

Detekovaný vzorek*

Směr DNA produktů



100bp

+

-

Nemodifikovaná plodina (negativní kontrola)

1

0,1% GM plodina

2

0,5% GM plodina

3

1% GM plodina

4

2% GM plodina

+

5% GM plodina (pozitivní kontrola) Negativní a pozitivní kontroly se zařazují z důvodu odhalení případné kontaminace či technické chyby, která by mohla za konečné zkreslení výsledků. Z důvodu jistoty u celého průběhu se obě kontroly řadí mezi vzorky již na počátku celého testu.

* Ústav pro referenční materiály a měření (Institute for Reference Materials and Measurements), organizace Evropské komise EC JRC, http://www.irmm.jrc.be.

Elektroforetická detekce  Analýza délky vzniklých fragmentů  princip molekulového síta  koncentrace agarosy: princip molekulového síta velikost produktu se srovnává se standardem obsahujícím fragmenty DNA známé délky Doporučená koncenrace agarosového gelu % agarose DNA size range (bp) 0.75 10.000 - 15.000 1.00 500 - 10.000 1.25 300 - 5000 1.5 200 - 4000 2.00 100 - 2500 2.5 50 - 1000  elektroforetická separace v polyakrylamidovém gelu na automatickém sekvenátoru  přesné zjištění délky fragmentů v genotypizační metodě AFLP  alespoň jeden primer musí být značen fluorescenční značkou

Analýza PCR produktů 

Analýza specifity fragmentu 

hybridizační analýza=hybridizace s fluorescenčně značenou



štěpení restrikčními enzymy

sondou DNA (shoda sekvencí)  Southern blot: přenos na membránu – hybridizace se značenou sondou DNA (část sekvence shodná s produktem)  přenos přímo (technika dot blot)=DNA čipy 



restrikční místo uprostřed sekvence

sekvenace PCR produktu 

přímo (vše se sekvenuje, v případě polymorfismu nejednoznačné)příprava jednovláknové DNA 



 

asymetrické PCR: různá koncentrace primerů (obvykle 50:1 až 100:1), po 15-20 cyklech dojde k vyčerpání - tvoří se pouze jednovláknový produkt z primeru o vyšší koncentraci sekvence na tuhé fázi: primer značený biotinem + tuhá fáze pokrytá streptavidinem = navázání

po zaklonování (jednoznačné) žádaný produkt lze též po elektroforéze „vyříznout“ a po přečištění sekvenovat

PCR produkt má svojí specifickou délku a sekvenci

Multiplex PCR 

PCR s násobným množstvím párů primerů

Výhoda: + možnost analýzy více parametrů Nevýhoda: - zvýšení tvorby nespecifických produktů - diskriminace delších DNA fragmentů

Příklad multiplex PCR Mr

Nt

1

500 bp

2

3 101 bp

4

5

6

151 bp

100 bp Detekční limit „duplex“ PCR s primery P35S 1-3´/ P35S 1-5´ a nosT 2-3´/ nosT 2-5´. Dráha 1: nemodifikovaná sója, dráha 2: 0,1% RR sója, dráha 3: 0,25% RR sója, dráha 4: 0,5% RR sója, dráha 5: 1% RR sója, dráha 6: 5% RR sója, Nt: beztemplátová kontrola. Mr: marker 100 bp DNA ladder, očekávaná velikost produktů: 101 a 151 bp.

Nested PCR    

dvě po sobě následující amplifikační reakce dva druhy oligonukleotidových primerů - vnitřní a vnější templát první reakce - DNA extrahovaná z vyšetřovaného vzorku templát druhé reakce - produkt získaný první amplifikací

+ zvýšení citlivosti a přesnosti

1. PCR

vnější primery DNA templát cílový produkt 1. PCR

2. PCR

vnitřní primery DNA templát (cílový produkt 1. PCR) Cílový produkt 2. PCR

Standardy a kontrola PCR procesu 

vhodné zařazení pozitivní, negativní či beztemplátové kontroly PCR procesu -

negativní kontrola - necílová DNA

Nt

beztemplátová kontrola - sterilní voda

+

pozitivní kontrola - ověřená cílová sekvence



negativní nebo beztemplátové kontrola: ověření kontaminace reagencií a používaných pomůcek

možné



pozitivní kontrola: ověření funkčnosti všech kroků



vhodné zařazení beztemplátové kontroly celého procesu analýzy vzorku, tzn. nejprve je podrobena izolačnímu procesu společně s analyzovaným vzorkem (beztemplátová kontrola izolačního procesu) a dále je podrobena všem PCR procesům jako analyzovaný vzorek

PCR pro detekci a identifikaci MO • pro sledovaný MO vznikl jedinečný produkt (komplementární primery), tzn. nevzniká stejný produkt pro jiné MO • detekce patogenních bakterií: nejčastěji identifikace genů zodpovědných za projevy virulence. • Listeria spp.: iap gen – při vhodně nastavené reakci tvoří produkt jen bakterie rodu Listeria, druhová specifita určena velikostí amplifikovaných produktů • E. coli O157: rfb gen - pro O157 somatický antigen stx1, stx2 - geny kódují produkci toxinů eaeA gen (virulenční faktor intimin), hlyA (enterohemolysin A)

„Analytická“ PCR 

Co hledám? Co chci zjistit? 

Přítomnost specifické sekvence, specifického genu  druhově specifická PCR (např. detekce patogenu – Campylobacter, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes apod.)  deteguji délku fragmentu, mohu ověřit restrikčním štěpením  více dvojic primerů – multiplex PCR

559bp

1000bp 500bp

Mr 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Nt

Detekce tet(O) – gen rezistence k tetracyklinu v bakterii Campylobacter A-100bp marker, 1-4-kmeny rezistentní k tetracyklinu 5-9 kmeny sensitivní k tetracyklinu 10-beztemplátová kontrola

Typizace MO 



1.

typizace a identifikace bakterií na úrovni kmenů: důležité parametry při diagnostice i léčbě onemocnění a zároveň při monitorování epidemiologie infekcí (např. zeměpisné rozšíření, zdroj nákazy, hostitelská specifita, patogenita, virulence) dva typizační systémy:

Fenotypizace 

Biochemické testy

2. Genotypizace: 1. metody založené na porovnávání získaných vzorů DNA fragmentů, které využívají rozdílnosti ve velikosti fragmentů DNA získaných buď amplifikací genomové části DNA nebo jejich štěpením specifickými restrikčními endonukleasami, či kombinací obojího (např. AFLP, RFLP, PFGE, Rep-PCR) 2. metody založené na sekvenci, kdy jsou bakteriální kmeny rozlišeny na základě polymorfismů v DNA (např. SLST, MLST) 3. metody založené na hybridizaci DNA s próbami o známé sekvenci

Typizace MO 



fenotypový typizační systém spočívá v určení bakteriálního fenotypu na základě koloniální morfologie na různých růstových médiích, biochemických testů, sérologie, citlivosti ke „killer“ toxinům, patogenitě a citlivosti k různým druhům antibiotik apod. V některých případech však není fenotypová typizace dostatečně účinná při určování blízce příbuzných bakteriálních kmenů genotypizace využívá rozlišení bakteriálních kmenů na základě zkoumání jejich genetického materiálu a získaný genetický profil je unikátní (můžeme jej přirovnat např. k otisku prstu, tzv. DNA fingerprint)



analyzovat rozdíly mezi různými DNA v rámci druhu = genotypizace (fingerprinting)  DNA fingerprinting náhodným primerem  štěpení DNA, připojení adaptérů, z kterých vedeno PCR

4000bp 3000bp 2000bp 1517bp

1500bp

1200bp 1000bp

1000bp

800bp

750bp

500bp

500bp

A 1 2 3

4 5

6

7 8

B 9 10 11 12 B

REP PCR 38bp dlouhý úsek s 6 degenerovanými pozicemi (sekvencemi) srovnání vzniklých profilů

PFGE (pulsed – field gel electrophoresis)  

 

 



elektroforetická technika používaná při dělení velkých molekul DNA (10 kbp – 10 Mbp) při klasické gelové elektroforese v konstantním elektrickém poli je možné účinně dělit fragmenty DNA do velikosti zhruba 20 kbp, protože nad touto hranicí fragmenty DNA vykazují stejnou pohyblivost a není možné je od sebe rozlišit aplikace střídavého elektrického pole ve třech různých směrech (posun vždy o 120 °), umožňuje účinné rozdělení i velkých fragmentů DNA principem této metody je opět štěpení genomové DNA restrikční endonukleasou (tentokrát však lyse buněk a štěpení DNA probíhá in situ v agarosových bločcích připravených smícháním bakteriální suspenze s rozpuštěnou agarosou) volena méně často štěpící RE, poskytující menší počet dlouhých fragmentů rozdělením fragmentů pomocí PFGE a obarvením gelu (např. v roztoku ethidiumbromidu) opět u jednotlivých kmenů získáme různé vzory bandů (profilů), jež mezi sebou velmi dobrá reprodukovatelnost a diskriminační schopnost = metoda považována za tzv. zlatý standard v oblasti genotypizačních metod

Pulsní gelová elektroforesa (Pulsed–field gel electrophoresis, PFGE) • •

mohou být rozděleny molekuly 10 Mb v agarosovém gelu gel je vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem (90-180°) v časových intervalech periodicky mění • DNA periodicky mění svůj směr migrace (nutná reorientace molekuly) díky změnám orientace elektrického pole

CHEF • contour-clamped homogenous electrical field • úhel 120° nebo 106°, také 90°pro 200-300 kb

http://www.currentprotocols.com/protocol/mb0205b

Výhody a nevýhody PCR Výhody + nízká mez detekce 0,001% až 0,5% GMO či jednotky cílového MO + možnost sériových analýz + možnost analýz několika parametrů v jedné reakci (multiplex PCR) + malé reakční objemy (nižší cena stanovení) + možnost analýz potravinářských surovin i technologicky opracovaných potravin

Nevýhody - nemožnost kvantifikace pomocí klasické metody PCR - některé sekvence podléhají patentovému zákonu (v běžné praxi jsou nedostupné pro návrh primerů) - poměrně vysoká cena základního vybavení - malé reakční objemy (náročné na zkušenost experimentátora a výběr vhodných podmínek reakce) - neschopnost odlišit živé a mrtvé buňky MO

RNA v buňce Ribosomes with ribosomal RNA

Messenger RNA (mRNA)

Chromosomal DNA

Bacterial cell

Small RNAs

multiple RNA copies for every one DNA copy, depending on the state of the cell

• Životnost mRNA v buňce je velmi nízká • u bakterií 1 až 6 minut, kvasinky okolo 20 minut • mRNA je v živé buňce neustále syntetizována a degradována

PCR kombinované s reverzní transkripcí (RT-PCR, Reverse transcription PCR) mRNA

cDNA

amplifikace genu (PCR)

Reverzní transkripce

Použitelné pro izolaci genu z mRNA – např. eukaryotní organismy, poté cDNA (nejsou v ní obsaženy introny)

RT-PCR  



reakce, která amplifikuje RNA namísto DNA zejména mRNA: kontrola exprese, rozlišení živých a mrtvých buněk počátečním krokem je izolace celkové RNA nebo mRNA z vzorku, pomocí nukleas jsou odstraněny zbytky DNA, následně je pomocí reverzní transkriptasy přepsána templátová mRNA do cDNA a ta je poté podrobena PCR


http://cmapspublic2.ihmc.us/rid=1KGLS64P4-151J1FG-16Y3/12.0-DNA%20RECOMBINANT%20TECHNOLOGY%20_suraya

Fluorescence - aplikace Odlišení živých/mrtvých buňky - kity LIVE BacLight™ Bacterial Gram Stain Kit

Cíl Výsledek

Fluorescenční látky Standardní filtry Ex/Em (nm)

LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit

LIVE/DEAD® Reduced Biohazard Cell LIVE/DEAD® Viability Kit Yeast Viability #1 Kit

Bakterie Živé G+ se barví zeleně a živé G- se barví červeně

Kvasinky

Odlišné zbarvení je založeno Aktivní na propustnosti membrán. buněčné Živé buňky se barví hlavně vakuoly se zeleně a mrvé buňky barví převážně červeně (proniknou oranžově, živé obě barviva) i mrvé buněčné stěny modře

SYTO® 9

SYTO® 9

SYTO® 10

FUN® 1

Hexidium iodid

Promidium iodid

Ethidium homodimer-2

Calcofluor White M2R

FITC

FITC

FITC

FITC

Texas Red®

Texas Red®

Texas Red®

DAPI

480/500

480/500

484/505

488/560–610

480/625

536/617

535/624

365/440

http://lib.jiangnan.edu.cn/asm/254Introduce.htm

Koncentrace a kvalita DNA 

Převážně spektrofotometricky   



[ng/ml] A260/A280 ratio: indicates pollution proteins, in pure DNA is 1.8 to 2.0 A260/A230 ratio: less than 1.8 indicates the presence of organic contaminants - (poly) phenols, thiocyanates, carbohydrates, urea, etc., in a clean DNA is in the range 1.8-2.0 (-2, 2)

Horizontální agarosová elektroforesa 

Lambda/HindIII marker

Detekce specifického genu

559bp

1000bp 500bp

Mr 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Nt

Detekce tet(O) – gen rezistence k tetracyklinu v bakterii Campylobacter A-100bp marker, 1-4-kmeny rezistentní k tetracyklinu 5-9 kmeny sensitivní k tetracyklinu 10-beztemplátová kontrola

PCR detekce - reálný vzorek   

účinnost izolace DNA z potravinové matrice účinnost PCR detekce=citlivost (závislost signálu na výchozím množství templátu) DETEKČNÍ LIMIT!!!! L. monocytogenes 1kb 103 104 105

106

Primery komplementární k Listeria spp. 1003 bp 593 bp

Primery komplementární k Listeria monocytogenes

BAX® system Q7  validovaný systém pro





 

detekci potravinových patogenů komerční kit pro izolaci DNA a PCR reakci validované schéma zkoušky (izolace DNA z malých objemů po pomnožení) detekce specifického produktu pomocí křivky tání (případně též Real-Time PCR aplikace)

BAX® system Q7        

Salmonella Listeria monocytogenes Genus Listeria Enterobacter sakazakii E. coli O157:H7 Staphylococcus aureus Real-time Campylobacter jejuni/coli/lariReal-time Vibrio cholerae/ parahaemolyticus/vulnificus Real-time  Yeast and molds

http://www2.dupont.com/DuPont_Home/ en_US/index.html

Provedení Vzorek

Příprava vzorku

PCR

Teplotní lyze

Detekce a analýza

Není nutné použít izolovanou DNA Lyofilizované reagencie (tableta)  DNA-Polymerase  Primery  Nukleotidy  Pufr  Barvička  Pozitivní kontrola: interní

Kmen

Výsledek

Izolát z masa

-

Analýza křivky tání

T [°C]

E. coli

(CCM 3954)

T [°C]

Avirulentní EC 4787 O157:H7 (pasážovaná)

-

T [°C]

Avirulentní EC 4787 O157:H7

+

T [°C]

Biočipy (microarrays nebo arrays) 

kolekce mikroskopických spotů DNA navázaných k pevnému povrchu (např. sklo, plast nebo křemíkový čip)



až tisíce krátkých DNA sond komplementárních k hledaným sekvencím



založeno na klasické technologii hybridizace DNA



imobilizované DNA fragmenty (sondy) mohou být kratší oligonukleotidy (20-30 bp), PCR produkty, genomová DNA, umělé bakteriální chromosomy (BAC), plazmidy nebo i dlouhé oligonukleotidy



DNA biočipy jsou nejčastěji využívány k měření exprese velkého množství genů současně



NK bývají izolovány z buněk, RNA je převedena na cDNA nebo cRNA, a jsou amplifikovány pomocí PCR technik



řetězec NK hybridizuje se sondou imobilizovanou na povrchu pevného nosiče, detekce je prováděna buď stříbrem, chemiluminiscenčně (pro DIG značku) nebo přímo fluorescenčně

Biočipy (microarrays nebo arrays)

Navázaný cílový fragment Imobilizovaný DNA fragment

Pevný povrch Literatura a použité zdroje

Počítačový model prost. uspořádání na DNA biočipu. Převzato z http://www.npaci.edu/online/v4.12/dnachip_nhor_clip.jpg.

Kvantifikace NK pomocí PCR 

PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qPCR, angl. Real on Time PCR)



monitorování vznikajícího produktu v průběhu celého amplifikačního procesu



qRT PCR je nejpřesnější a nejvýhodnější v současné době dostupná kvantitativní metoda



vysoká pořizovací cena nástrojů



interkalační barviva - (např. SYBR green I, Ethidium bromid) = levnější



fluorescenčně značené sondy - přesnější

CT

Prahový detekční cyklus CT (threshold cycle) – nejnižší cyklus ve kterém hodnota fluorescence měřeného vzorku vzroste nad hodnotu fluorescence pozadí

Fluorescence reportéru ( Rn)

Vzorek 1

2

3

4

5 beztemplátová kontrola

Ct

Amplifikační křivka Vzorek 1: 106 kopií cílového úseku vzorek 2: 105 kopií cílového úseku vzorek 3: 104 kopií cílového úseku vzorek 4: 103 kopií cílového úseku vzorek 5: 102 kopií cílového úseku zelená přímka znázorňuje mezní hodnotu pozadí

Počet cyklů

PCR

 

teoretická účinnost reakce - 100% teoreticky dochází v každém cyklu ke zdvojnásobení

n

2^n 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1024 15 32768 20 1048576 25 33554432 30 1073741824 35 34359738368 40 1,09951E+12

N; N=N0*2^n No=1 No=10 1 10 2 20 4 40 8 80 16 160 32 320 64 640 128 1280 256 2560 512 5120 1024 10240 32768 327680 1048576 10485760 33554432 335544320 1073741824 10737418240 34359738368 3,43597E+11 1,09951E+12 1,09951E+13

N = N0

n (2)

N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N0 = počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce)

n = počet cyklů

Skutečná amplifikační účinnost reakce

N = N0 (1+E)n N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N0= počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce)

E = amplifikační účinnost reakce <0,1> n = počet cyklů

SYBR Green I Systém  

    

SYBR Green I (SG I) interkaluje do malého žlábku dsDNA fluorescence SG I se po navázání do dsDNA zvýší až 1000-krát delší amplikony = vyšší fluorescenční signál detekce veškeré dsDNA = nižší specifičnost systému nutnost pečlivého výběru reakčních podmínek nutná analysa křivek tání cenově dostupnější než detekce pomocí fluorescenčně značených sond

SYBR Green I a)

b)

c)

a) prostředí reakce po teplotní denaturaci b) nasednutí primerů a vazba barviva c) prodlužování primerů upraveno dle www.biochem.roche.com/lightcycler

Křivka tání

Nahoře: Křivky tání. Dole: Záporná derivace fluorescence dělená derivací teploty

Kalibrační a disociační křivka

Fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET, angl. Fluorescence Resonance Energy Transfer) Zdroj 1

2 1< 2

 fluorofor je excitován pomocí vhodné vlnové délky  energie z „dárce“ (donoru) je přenesena na druhý fluorofor (akceptor)

 excitovaný akceptor emituje světlo s „vyšší“ vlnovou délkou

Real on Time PCR 

přesná, rychlá, univerzální metoda



vhodná pro sériové analýzy



vysoké pořizovací náklady

Digitální PCR (dPCR) 

Rozdělení analyzovaného vzorku do velkého počtu separátních reakčních „komor“


http://digital-pcr.gene-quantification.info/, 29.4.2013


dosažené pomocí 1) čipu (dynamické čipy (mikrofluidika), OpenArray®) 2) maličkých kapiček nanolitrové velikosti (ang. doplet)



teplotní protokol jako u klasického PCR



fluorescenční detekce umožněna použitím Taqman hydrolyzačních sond (endpoint PCR, nárůst fluorescence)



kvantifikace je provedena odečtem fluorescence velkého počtu individuálních reakcí (komor) na konci amplifikační reakce



počítají se jednotlivé „komůrky“ + positivní (detekce fluorescence, tzn. obsahuje cílový úsek) - negativní (nedetekuje se fluorescence, tzn. neobsahuje cílový úsek)



používá se statistické vyhodnocení pomocí Poissonovo rozdělení (zákon vzácných jevů)



počet cílových úseků průměrně připadající na jednu reakční komoru = - ln (1 – počet pozitivních komůrek/ celkový počet analyzovaných komůrek)


absolutní kvantifikace



přítomnost cílového úseku je měřena přímo (není potřeba porovnání se standardní křivkou)



jednoduché porovnání výsledků získaných z jednotlivých PCR běhů (dPCR počítá přímo cílové úseky, není ovlivněno různými použitými přístroji, standardní křivkou či zkušenostmi experimentátora).



relativní kvantifikace provedena poměrem absolutních kvantifikací dvou cílových úseků



vhodné i pro kvantifikaci nízké koncentrace cílového úseku ve vysokém množství doprovodné nukleové kyseliny



citlivější než real on time PCR


Rozdělení vzorku do komůrek zmenšuje (odstraňuje?) efekt přítomnosti inhibitorů amplifikační reakce. Vzorek, který by nemusel být vhodný pro kvantifikaci pomocí qPCR může být spolehlivě kvantifikován pomocí dPCR.

Sestavy (angl. Arrays) 1.

2.

• 1.

Dynamické čipy pro genotypování a genovou expresi (Fluidigm BioMarkTM) OpenArray® Real-Time PCR Systém (Life Technologie, Applied Biosystems) Droplet digital PCR (ddPCR) Biorad QX100


http://digital-pcr.gene-quantification.info/, 29.4.2013



Díly A-E představují sérii ředění analyzovaného vzorku cDNA (1:1)



Díl F je negativní kontrola



Každý díl obsahuje 765 komůrek (individuální PCR reakce)



Černá políčka – negativní signál



Červená políčka – pozitivní signál (detekce fluorescence)



Sloupec označený „Estimated“: odhad kopií cílového úseku určený pomocí qPCR



Sloupec označený „Biomark“: odhad kopií cílového úseku pomocí dPCR

OpenArray® Real-Time PCR Systém • Kombinace OpenArray® Real-Time PCR Instrument a OpenArray® AccuFill™ Systém (Applied Biosystems – life technologies)


http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/PCR/real-time-pcr/real-timepcr-applications/digital-pcr.html, 13.1.2013.

Kapkový digitální systém PCR (ddPCR) • Kapkový digitální systém PCR angl. Droplet digital PCR (ddPCR) • vzorek a olej vytvoří emulzi • až 20000 kapiček („komůrek“) v analyzovaném vzorku

1. Přístroj „emulgátor“


2. přístroj 3. přístroj PCR termální cycler angl. droplet reader

Ředění analyzovaného vzorku

http://www.gene-quantification.de/digital-1.html, 28.04.2013 a http://www.labdd.com/a/yixuejianyan/fenzishengwuxue/23106.html, 29.04.2013.

Využití PCR v potravinářské mikrobiologii  analytické PCR  kvalitativní detekce a identifikace

potravinových patogenů (rodově a druhově specifická PCR)  další studium jednotlivých kmenů  detekce specifických genů (např. genů pro rezistenci k antibiotikům)  detekce genových mutací  genotypizační metody  reverzní transkripce=studium exprese genů  kvantitativní PCR (Real on Time PCR a digfitální PCR  kvantitativní detekce potravinových patogenů

Normativní postupy zahrnující PCR ČSN P CEN/TS 15790

Krmiva- Typizace PCR probiotických druhů Saccharomyces cerevisiae (kvasinky)

ČSN EN ISO 22174

Mikrobiologie potravin a krmiv - Polymerázová řetězová reakce (PCR) k průkazu mikroorganismů působících onemocnění z potravin - Všeobecná ustanovení a definice

ČSN P CEN/TS 20836

Mikrobiologie potravin a krmiv - Polymerázová řetězová reakce (PCR) k průkazu mikroorganismů působících onemocnění z potravin - Zkoušení výkonnosti termocyklérů

ČSN EN ISO 20837

Mikrobiologie potravin a krmiv- PCR k průkazu a kvantifikaci mikroorganismů působících onemocnění z potravin – požadavky na přípravu vzorku ke kvalitativnímu průkazu

ČSN EN ISO 20838

Mikrobiologie potravin a krmiv - Polymerázová řetězová reakce (PCR) k průkazu mikroorganismů působících onemocnění z potravin - Požadavky k amplifikaci a průkazu pro kvalitativní metody

ČSN EN ISO 22118

Mikrobiologie potravin a krmiv- PCR k průkazu a kvantifikaci mikroorganismů působících onemocnění z potravin – Charakteristiky metody

ČSN EN ISO 22119

Mikrobiologie potravin a krmiv- PCR v reálném čase k průkazu mikroorganismů působících onemocnění z potravin – Všeobecné požadavky a definice

ČSN P CEN/TS 15634-2

Potraviny - Detekce potravinových alergenů molekulárně biologickými metodami - Část 2: Celer (Apium graveolens) - Kvalitativní stanovení specifické sekvence DNA pomocí PCR v reálném čase v tepelně opracovaných uzeninách

V případě vašeho zájmu, nebo jakýchkoli dotazů mě neváhejte kontaktovat

E- mail : [email protected]

Metody detekce a identifikace MO se zaměřením na PCR a její variace. Kamila Zdeňková

Recommend Documents