Název:
METODY IDENTIFIKACE VIRU HIV
Školitel:
Soňa KŘÍŽKOVÁ
Datum:
5.12.2013
Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023
Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
Virus HIV • • • • • • •
Human immunodefficiency virus Napadá primárně T-lymfocyty, především CD4+ buňky genom: ssRNA, lineární, 9749 nukleotidů, 2 kopie, 9 genů proteom: 18 proteinů Obalený virus retrovirus průměr 120 nm Proteiny kódované genomem HIV: Třída Virové strukturní proteiny
Esenciální regulační faktory
Doplňkové regulační proteiny
Primární proteinový produkt
Procesovaný proteinový produkt
gag
Gag polyprotein
MA, CA, SP1, NC, SP2, P6
pol
Pol polyprotein
RT, RNase H, IN, PR
env
gp160
gp120, gp41
tat
Tat
rev
Rev
nef
Nef
vpr
Vpr
vif
Vif
vpu
Vpu
Gen
Průběh infekce virem HIV •
Asymptomatické stadium – Akutní retrovirový syndrom • •
chřipkové příznaky ↑ virus ↓CD4+ (dočasně)
Asymptomatické stadium
– Asymptomatické stádium •
↑protilátky ↓virus
Akutní infekce
1000
– Chronická lymfadenopatie
•
↓ virus ↑protilátky ↓CD4+
Časné symptomatické stadium – sub-klinické poruchy imunity • • • •
•
chřipkové příznaky malé oportunní infekce kožní příznaky ↓ protilátky (ke konci)
Sub-klinické poruchy imunity
Kožní příznaky
Systémové selhání imunity
virus
900
Počet CD4+ lymfocytů/mm3
•
Chronická lymfadenopatie
Pozdní sympt. stadium
Časné symptomatické stadium
anti-HIV
800 700 600 500
CD4+
400 300 200 100
Pozdní symptomatické stadium, AIDS – systémové selhání imunity • • • • •
velké oportunní infekce nádory spojené s HIV infekcí wasting syndrom smrt v důsledku vyčerpání organismu ↓ protilátky ↓ CD4+ ↑ virus
0
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
Doba od infekce (měs.)
60
66
72
78
84
Co tedy můžeme detekovat? •
přímé metody – analyty virového původu: –
virová RNA •
–
virové proteiny • • •
•
raná asymptomatické období pozdní
Druh testu – – –
•
anti HIV protilátky (ne)specifické příznaky
Doba infekce – – –
•
18 proteinů (18 možností?) obalové proteiny – antigen p24, gp120 reversní transkriptasa
nepřímé metody – analyty hostitelského původu: – –
•
9 genů (9 možností?)
rychlé domácí testy screening (falešná pozitivita) potvrzení
Testovaný materiál: – – – – –
krev plasma sliny moč slzy
„Klasické“ metody laboratorní diagnostiky Protilátky proti HIV Virová RNA povinné testování v těhotenství, u dárců krve HIV testy
•
screening potvrzení
Používané metody: – – – – – –
• • •
900
ELISA - protilátky Imunostripy - protilátky Western-blot - core-proteiny (p17, p24, p55), polymerázy (p31, p51, p66), envelope-proteiny (gp41, gp120, gp160) RT-PCR Q-RT-PCR Plasma viral load Zjednodušený diagnostický algoritmus:
2 až 3 měsíce po rizikové události 0 – 2 měsíce – diagnostické okno výsledek –
do několika dnů standardně
800
CD4+
700 600 500 anti-HIV
400 virus
300
Klasické metody
– –
Akutní infekce
1000 Počet CD4+ lymfocytů/mm3
• • • •
200 100 0
Diagnostické okno
0
12 6 Doba od infekce (měs.)
HIV screening ELISA Nereaktivní
Reaktivní
Výsledek - negativní Doporučeno opakování testu po 1 až 2 měsících
Potvrzení ELISA Nereaktivní
Následné testy • opakování testu • molekulární metody (RT PCR, virová nálož)
Reaktivní
Výsledek - pozitivní
Nové metody detekce HIV • • •
Bez nutnosti práce s infekčním materiálem Použitelnost v tzv. „point of care“ Detekce v akutní fázi – virové proteiny – virová RNA Srovnání detekovatelnosti virových komponent a protilátek
Akutní infekce
1000
virus
900 800
CD4+ Koncentrace v plasmě
700 600 500 400 Klasické metody
300 200
100 0
0 Nové metody
Rychlost Senzitivita Jednoduchost Časnost
Počet CD4+ lymfocytů/mm3
• • • •
anti-HIV
3 Doba od infekce (měs.)
vRNA
p24 IgM celkové IgG
6
1
2
3
4
5
Doba od infekce (týdny)
6
12
16
• • • • •
Web of Science HIV detection V letech 2011-2013 Analytická chemie 34 relevantních publikací
Několik zajímavých článků:
1. Esseghaier, C., A. Ng, and M. Zourob, A novel and rapid assay for HIV-1 protease detection using magnetic bead mediation. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 41: p. 335-341. 2. Jangam, S.R., et al., A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 42: p. 69-75. 3. Lee, J.H., B.K. Oh, and J.W. Choi, Electrochemical sensor based on direct electron transfer of HIV-1 Virus at Au nanoparticle modified ITO electrode. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 49: p. 531-535. 4. Ruslinda, A.R., et al., Effects of diamond-FET-based RNA aptamer sensing for detection of real sample of HIV-1 Tat protein. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 40(1): p. 277-282. 5. Sassolas, A., L.J. Blum, and B.D. Leca-Bouvier, Optical detection systems using immobilized aptamers. Biosensors & Bioelectronics, 2011. 26(9): p. 3725-3736. 6. Wang, J.H., et al., An integrated chip capable of performing sample pretreatment and nucleic acid amplification for HIV-1 detection. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 41: p. 484-491.
7. Hu, J., et al., Sub-attomolar HIV-1 DNA detection using surface-enhanced Raman spectroscopy. Analyst, 2010. 135(5): p. 1084-1089. 8. Guo, Y.H., et al., A label-free biosensor for DNA detection based on ligand-responsive G-quadruplex formation. Talanta, 2013. 114: p. 138-142. 9. Martic, S., M. Labib, and H.B. Kraatz, On chip electrochemical detection of sarcoma protein kinase and HIV1 reverse transcriptase. Talanta, 2011. 85(5): p. 2430-2436. 10. Zheng, A.H., et al., A label-free signal amplification assay for DNA detection based on exonuclease III and nucleic acid dye SYBR Green I. Talanta, 2013. 114: p. 49-53.
Nové metody detekce HIV – současné směry •
Detekce – – –
• • • • • • • •
virových proteinů virových nukleových kyselin protilátek
(Bio)sensory Nanočástice Sekundární struktury nukleových kyselin Aptamery Paramagnetické částice Elektrochemická detekce Mikrofluidika PCR metody pro použití v point of care
Slovní mrak (word cloud, tag cloud) - množina slov zadaného textu, ve které jsou slova uspořádána podle četnosti (frekvence) v textu. Četnost slova v rámci zadaného textu je vyjádřena velikostí či barvou slov (čím větší slovo, tím vyšší četnost). Množina je uspořádána do podoby fiktivního mraku. http://www.jasondavies.com/wordcloud/#
Shrnutí • Detekce virových komponent • Časná fáze infekce • Diskrepance mezi klasickými metodami laboratorní diagnostiky a metodami pro časnou detekci HIV
Děkuji za pozornost!
Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023
Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
