Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie
Diplomová práce:
DNA detekce viru HSV1 a sledování průběhu léčby keratokonjunktivitid
Vypracovala: Jana Kachlíková Vedoucí práce: doc. RNDr. Omar Šerý, Ph.D. Konzultant: Mgr. Jan Lochman, Ph.D.
Brno, 2008
1
Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně, jen s použitím uvedené literatury.
Jana Kachlíková
2
Svému vedoucímu diplomové práce doc. RNDr. Omarovi Šerému, Ph.D. bych chtěla touto cestou poděkovat za odborné vedení, cenné rady a připomínky během vypracovávání zadaného úkolu. Rovněž bych chtěla poděkovat Mgr. Janu Lochmanovi Ph.D. za rady a ochotnou pomoc při práci. Dále také děkuji As. MUDr. Zuzaně Hlinomazové, Ph.D. za poskytnutí vzorků slz i klinických dat. Zároveň děkuji mé rodině a přátelům za trpělivost, pomoc a podporu.
3
Obsah: 1) Úvod……………………………………………….……………………..…….………..5 2) Teoretická část……………….…………………….…………………………..….....6-35 2.1. Infekce rohovky - keratitidy………….….…………………………….…….....6-22 2.1.1. Herpetické záněty rohovky…….……..……...…...…………….………10-13 2.1.2. Patogeneze HSV infekce ……………..….……………….…..…...…...13-14 2.1.3. Diagnostika HSV……..…………….………………………………..…14-22 2.1.3.1. Imunologické metody (ELISA, IF)……….….……….…..14-16 2.1.3.2. Detekce DNA (PCR techniky)…….……………………...16-22 2.2. Herpesviry……………………………………….………………...…….....…22-26 2.2.1. Virus herpes simplex………..….……..….…………..…….….….….....23-24 2.2.2. Životní cyklus……………...……...…….…………….…………..……24-26 2.3. Antivirová léčiva………………..………………...………..………………....26-35 2.3.1. Mechanismus působení..……..……………..……………..……………28-29 2.3.2. Rezistence HSV k antivirovým léčivům………………..…...….………29-31 2.3.2.1. Stanovení citlivosti HSV k antivirovým léčivům...…….....32-33 2.3.3. Metody stanovení antivirotik………………..……...…………………..33-35 2.3.3.1. Chromatografické metody (HPLC)………………..............34-35 3) Materiál a metody..………………….……...………………………………………35-44 3.1. DNA diagnostika HSV-1………………..……...………..…………………...36-43 3.1.1. Soubor osob………..………….……………………………………………36 3.1.2. Klinické vyšetření….…………………………………………………...36-37 3.1.3. Odběr vzorků……………………..…………………………………….37-38 3.1.4. Izolace DNA………….……...……………………………………………..38 3.1.5. Nested PCR………..…..………...…………….………………………..39-40 3.1.6. Real Time PCR ……….………………………….………...…………..40-43 3.2. Stanovení acykloviru a gancykloviru v slzách pomocí HPLC…………...………44 4) Výsledky a diskuse……………..……...…………………………………...………45-59 4.1. DNA detekce viru HSV-1…………..…….………..…………………………45-49 4.2. Stanovení koncentrace ACV a GCV v slzách pomocí HPLC………………..50-59 5) Závěr...……………………………………………………………………….…..…59-60 6) Seznam použitých zkratek…………………………………...……………...……...61-62
4
7) Seznam literatury………………...……………...…………………………….........62-67
1. Úvod: Herpes simplex viry (HSV) vyvolávají běžné infekce, které sahají od spontánně mizejících lokalizovaných nálezů po vážně rozšířené infekce, obzvláště u imunokomprimovaných pacientů (Cotarelo et al., 1999). Nejčastější klinickou manifestací infekce vyvolané HSV je herpes labialis (opar rtu), avšak mnohem větší nebezpečí představuje oční herpes. Keratokonjunktivitidy se stávají významnou příčinnou redukce zraku, která může vést až k oslepnutí, což se týká především rozvojových zemích. Zkoumání antivirové chemoterapie je tedy velmi důležité. Acyklovir byl objevený v roce 1974 a první zpráva popisující selektivní antivirovou aktivitu acykloviru proti herpesviru byla publikována v roce 1978 (Bacon et al., 2003). K dalším významným antivirovým léčivům patří především gancyklovir, pencyklovir, foskarnet i cidofovir. K docílení efektivního účinku antivirotik je nutnost provádět terapii již v raném stádiu onemocnění, což vyžaduje včasnou detekci herpesvirů z klinických vzorků pacientů (Madhavan et al., 1999). Všeobecně je diagnostika herpes simplex virů založena na standardních laboratorních metodách zahrnující izolaci viru na tkáňových kulturách a detekci HSV antigenů použitím enzymového imunostanovení. Postupy využívající tkáňové kultury jsou velmi citlivé i specifické, ale získání výsledků trvá až celý týden (Koenig et al., 2001). Přímá antigenová detekce pomocí imunofluorescence je sice rychlou metodou, avšak díky nízké prahové úrovni antigenu není příliš citlivá. Proto se tedy dává přednost molekulárně biologické technice, polymerasové řetězové reakci (PCR), která představuje rychlejší a citlivější metodu pro diagnózu herpes simplex viru (Madhavan et al., 1999). PCR umožňuje získat požadovanou a specifickou sekvenci genomové DNA, která se dále separuje elektroforézou v agarosovém gelu a vizualizuje obarvením ethidiumbromidem, který po ozáření ultrafialovým světlem fluoreskuje. Produkty polymerasové řetězové rekce se také mohou kvantitativně měřit v reálném čase (real-time PCR). Kvantifikace se provádí ve speciálním zařízení, které kromě cyklického střídání teplot umožňuje i detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase, tudíž odpadá nutnost elektroforetické detekce (Šmarda a spol., 2005).
Cílem práce bylo nejen provést literární rešerši týkající se detekce herpesvirů, léčby virových zánětů rohovky a metod stanovení antivirových preparátů, ale především vypracovat vhodné
5
metodiky DNA diagnostiky HSV 1 a stanovení koncentrace acykloviru a gancykloviru v slzách pomocí HPLC. Dále pak získané výsledky srovnat s klinickými nálezy.
2. Teoretická část 2.1. INFEKCE ROHOVKY-Keratitidy
Anatomie a fyziologie rohovky Rohovka (cornea) spolu s bělimou (sclera) tvoří tuhý obal oka. Zatím co bělima je bílá a neprůhledná, rohovka je ideálně průhledná a poněkud více vyklenutá než okolní sclera. Její průměr je v horizontále asi 11,7 mm, ve vertikále o 1 mm méně. Tloušťka je v centru kolem 0,5 mm, v periférii kolem 0,7 mm. Průměrný rádius zakřivení je 7,8 mm, má lomivost asi 43 D, tedy mnohem větší než čočka (Řehák, 1989). Rohovka je inervována z první větve V. hlavového nervu (n.trigeminus). Má největší počet nervových zakončení na mm2 ze všech tkání lidského těla. Rohovka je avaskulární tkáň s pomalým metabolismem, což znamená i pomalé hojení. Výživné metabolity (aminokyseliny a glukosu) získává difúzí z kapilár limbu, z prekorneálního slzného filmu a difúzí i aktivním transportem z komorové vody (Rozsíval et al., 2006). Rohovka se skládá z pěti vrstev. Povrchový epitel (Epithelium anterius) je vrstevnatý dlaždicový, bez rohovatění, asi s 5 vrstvami buněk (Čihák, 1997). Díky limbálním buňkám má epitel schopnost rychlé regenerace a migrace. Povrch epitelu tvoří mikroklky umožňující přilnutí mucinu, což je vnitřní vrstva slzného filmu (Rozsíval et al., 2006). Bowmanova membrána (Lamina limitans anteriol-externa) je bazální membrána, zesilující ze strany rohovkového vazivového stromatu bazální laminu epitelu (Čihák, 1997). Nemá schopnost regenerace, proto po jejím porušení vzniká rohovková jizva (Rozsíval et al., 2006). Vazivová vrstva rohovky - stroma (Substantia propria corneae) obsahuje vlákna, většinou kolagenní s malou příměsí vláken elastických. Descemetova membrána (Lamina limitans posteriorinterna) odděluje vazivo rohovky od jejího zadního epitelu. Je křehká, má však schopnost regenerace. Endotel zadní plochy rohovky a současně výstelka přední oční komory (Endothelium camerae anterioris) je jednovrstevný plochý epitel (Čihák, 1997), zodpovědný za průhlednost a konstantní hydrataci rohovky. Nemá schopnost regenerace a s věkem počet endotelií ubývá. Defekty endotelu jsou uzavírány migrací a zvětšováním velikosti zbylých buněk (Rozsíval et al., 2006).
6
Obr. 1 Schéma řezu rohovky (www.zelenyzakal.sk/images/Zeleny_zakal/cornea.jpg)
Infekční záněty rohovky jsou dnes jednou z hlavních příčin slepoty ve světě. V zemích rozvojového světa jsou příčinou zánětů rohovky vedle traumat především trachom a xeroftalmie, což úzce souvisí se životními podmínkami. V civilizovaných zemích, zejména v souvislosti s rostoucí popularitou nošení kontaktních čoček, se incidence keratitid také zvyšuje. Rohovka je za normálních okolností dobře chráněna před poškozením a infekcí řadou mechanismů. Víčka představují bariéru pro mikrobiální invazi, stejně jako reflexní mrkání s trvalým svlažováním a omýváním povrchu rohovky. Slzy obsahují řadu imunoaktivních látek (laktoferin, lysozym, betalysin, specifický albumin a imunoglobulin A), které představují nespecifickou ochranu oka. Faktory, které přispívají k rozvoji keratitidy, jsou vedle úrazu, chirurgického výkonu a jiného onemocnění rohovky, především porucha kvality slzného filmu, troficity a poruchy imunity (Rozsíval et al., 2003). Při keratitidách zánětlivý edém přímo poškozuje hraniční vrstvy rohovky, čím se mění její semipermeabilní charakter na zcela propustný. Zvýšení obsahu tekutiny v prostoru ložiska zapříčiní nejen zkalení, ale i nepravidelný povrch rohovky v daném místě (Oláh et al., 1998). Po prodělaných zánětech se rohovka většinou hojí jizvou, uspořádání již není tak ideální a rohovka zůstává v různém stupni neprůhledná (Řehák, 1989). Pro drobné jizvy způsobující zákal, který nesnižuje zrakovou ostrost, používáme název nubecula. Macula je sytější a výraznější zákal rohovky zasahující do hlubších vrstev stromatu. Velmi sytá jizva způsobující neprůhlednost rohovky a výrazně snižující ostrost zraku se označuje jako leukom. Patogeny způsobující rohovkovou infekci jsou obvykle viry, bakterie, akantaméby a plísně. 7
Virové keratitidy patří mezi nejčetnější rohovkové infekce. Vyskytují se jednostranně i oboustranně dle etiologického agens, samostatně nebo častěji ve spojení s folikulární konjunktivitidou. Hlavními původci virové keratitidy je herpes simplex virus, varicella zoster virus a adenovirus. Etiologickým agens Herpes simplex keratitidy je virus HSV-1, vzácně HSV-2. Patří k nejčastěji se vyskytujícím jednostranným keratitidám a je nejčastější příčinou jednostranné slepoty v civilizovaných zemích. Po primární infekci, která může probíhat subklinicky, přejde virus do stadia latence a usadí se v senzitivním gangliu. Provokačním momentem může být řada faktorů, jako například stres, trauma, UV záření, u žen menstruace. Charakteristickou známkou onemocnění jsou časté recidivy. Klinickým obrazem je nejprve subjektivní pocit bolesti doplněný slzením, v zápětí se na rohovce objeví puchýřky, které se rozpadají do podoby větviček – keratitis dendritica. V tomto období je patognomickou známkou onemocnění snížená citlivost až anestezie rohovky. Rekurentní infekce je charakterizována postižením stromatu rohovky - disciformní keratitida. Opakující záněty rohovky způsobují jizvení, případně patologickou vaskularizaci. Někdy dochází až ke vzniku descemetokélu a perforaci rohovky. Léčba se provádí lokálně virostatiky a u těžkých případů systémově. Podávají se mydriatika a u disciformí keratitidy při intaktním epitelu rohovky také kortikosteroidy (Rozsíval et al., 2006). Keratitida způsobená virem herpes zoster se projevuje ve dvou klinických formách: varicella a herpes zoster ophthalmicus. Varicella (plané neštovice) představuje primární infekci (Rozsíval et al., 2003). Po klidovém období vzniká aktivací latentního viru ze senzitivního trigeminálního ganglia obraz pásového oparu. Prodromy nemoci jsou charakterizovány bolestí hlavy, malátností, někdy horečkou a následným výsevem puchýřků v oblasti první větve trigeminu. Rohovkové onemocnění se vyskytuje u dvou třetin nemocných, často ve spojení s přední granulomatózní uveitidou nebo skleritidou. Akutní fáze se projevuje v podobě povrchové keratitis punctata a dendritica. Po třech týdnech se u 5% pacientů obvykle objevuje disciformní keratitidy. Onemocnění může přejít do chronického stádia v podobě neurotrofické keratopatie pro nekrotickou ganglionitidu (Rozsíval et al., 2006). Objevuje se permanentní anestezie (asi u 10-20% pacientů) a je provázena nepravidelnými epiteliálními defekty (Rozsíval et al., 2003). Postherpetická neuralgie v oblasti první větve trojklaného nervu může nemocné sužovat dlouhé měsíce bolestmi a vést k depresím, někdy až k sebevražedným sklonům. Terapie je obdobná jako u keratitis herpes simplex, ale vždy je doplněna systémově podávanými virostatiky v parenterální formě a analgetiky.
8
Adenovirová keratokonjunktivitida začíná v podobě oboustranné folikulární konjunktivitidy doprovázené epiteliálními defekty. Závažnou formou je epidemická keratokonjunktivitida (KCE) způsobená adenovirem sérotypu 8, 19 a 37. Probíhá ve třech stádiích. První z nich se projevuje akutní folikulární konjunktivitidou s otokem víček s serózní sekrecí. V druhém stádiu se po 3-4 dnech objevuje povrchová keratitida (keratitis epitelialis punctata). V těchto stádiích se virus replikuje a pacient je vysoce infekční. Třetí stádium je v podstatě imunitní odpovědí na virové antigeny, které probíhá pod obrazem subepiteliálních infiltrátů ve velikosti 1-2 mm vyskytující se v centru rohovky a jejich resorpce je velmi pomalá. Léčba probíhá výplachy borovou vodou a jopovidonem. Dále se používají lubrikancia a ve třetím stádiu při poklesu zrakové ostrosti jsou účinné lokální kortikosteroidy.
Dříve byl za nejčastější patogen bakteriální keratitidy považován Streptococcus pneumoniae.
Dnes
grampozitivních
je
většina
bakterií
bakteriální
Micrococcaceae
ulcerací
rohovky
(Staphylococcus
způsobena
aureus,
skupinou
Staphylococcus
epidermidis a Micrococcus), dále Streptococcaceae (Streptococcus pneumoniae) a skupinou gramnegativních
bakterií
Pseudomonadaceae
(Pseudomonas
aeruginosa)
a
Enterobacteriaceae (Enterobacter, Serratia a Proteus) (Kraus et al., 1997). Většina patogenů vniká do rohovky při porušeném epitelu s výjimkou gonokoků a diftérie, které pronikají intaktním epitelem. Klinický obraz se odvíjí od množství patogenů vniklých do rohovky (Rozsíval et al., 2006). Závisí na typu agens, jeho virulenci a době trvání infekce. Všeobecně je keratitida provázena překrvením, bolestí, světloplachostí, infiltrací rohovky až tvorbou vředu se zánětlivou reakcí v přední oční komoře. Může postihovat jednu nebo všechny vrstvy rohovky, může být ložisková i difúzní, často patognomická pro vyvolávající agens (Rozsíval et al., 2003). Určení etiologického agens má význam pro zavedení cílené léčby keratitidy. Využívá se kultivace z výtěru spojivkového vaku, kultivace z přímé skarifikace rohovkové léze, přímé určení DNA patogenu pomocí PCR nebo stanovení citlivosti na jednotlivá antibiotika. Léčba u bakteriálních keratitid je lokální a systémová. Lokální péče o okraje víček, výplachy jodpovidonem, širokospektrá antibiotika se v prvních dnech aplikují po hodině v podobě masti či kapek, mydriatika, nesteroidní antiflogistika, lubrikancia. Při zánětu postupujícím do nitra oka se indikují systémová antibiotika (pareneterálně) s dobrým průnikem do měkkých tkání. V takovém případě je nutná hospitalizace pacienta. Při vzniku descemetokély nebo perforaci rohovky je nutný chirurgický zákrok v podobě keratoplastiky.
9
Akantamébový zánět rohovky vyvolávají kosmopolitně se vyskytující protozoa-akantaméby. Vstupní branou infekce je nejčastěji mikrotrauma rohovky u nositelů kontaktních čoček. Časné stádium nemoci se projevuje v podobě povrchové keratitidy, která přechází v typickou prstencovitou formu provázenou velkou bolestí, slzením, edémem víček a blefarospazmem. Diagnostika vychází z anamnézy a klinického obrazu pacienta (Rozsíval et al., 2006). Laboratorně se může prokázat akantaméba mikroskopicky i kultivačně. Materiálem pro tyto vyšetření je nejlépe kontaktní čočka a roztok na její uchovávání, skarifikát nebo biopsie rohovky (Rozsíval et al., 2003). Přímý průkaz DNA umožňuje metoda PCR. Pomocí konfokální mikroskopie můžeme určit akantaméby přímo v rohovce. Terapie je dlouhodobá, trvá často měsíce až roky. Užívá se kombinace aromatických diaminů s aminoglykosidovými antibiotiky, případně imidazolovými antimykotiky v lokální aplikaci. U závažných stavů je doplněna systémovými imidazoly.
Plísňová keratitida je v našem podnebním pásmu vzácná. Můžeme se s ní setkat u pacientů s dlouhodobou léčbou kortikosteroidy, zvláště v lokálním užití u imunosuprimovaných pacientů. Méně vzácný je endogenní rozsev u systémové mykózy. Etiologickým agens jsou nejčastěji rody Candida a Cryptococcus. Plísňová keratitida projevuje šedobílými infiltráty na rohovce, s typickým nálezem satelitních ložisek v okolí původního ložiska, nereagující na antibiotikovou léčbu. Časně se vytváří výpotek v přední komoře hypoyon. Terapie je dlouhodobá lokálními a systémovými antimykotiky (amfotericin B) (Rozsíval et al., 2006).
2.1.1. Herpetické záněty rohovky Oční herpetické infekce existují v neonatální, primární a rekurentní formě. Neonatální infekce se získává in utero a může projevit jako konjuktivitida, keratitida, katarakta, iridocyklitida, atrofie duhovky, optická neuritida, retinitida a nebo encefalitida způsobující kortikální slepotu. Etiologickým agens je v 80% případů HSV-2 (Rozsíval et al., 2003). K primární infekci dochází většinou u dětí, během prvních pěti let života. Většinou se objevují drobné vezikuly na kůži v okolí oka, které mohou být doprovázeny keratokonjunktivitidou a adenopatií. Stroma rohovky nebývá postiženo. Více než 90% populace přichází v dětství do styku s HSV infekcí bez známek manifestního onemocnění (Kraus et al., 1997). Patognomickou známkou onemocnění je snížená citlivost rohovky. U
10
primární infekce se virus v 75% prokazuje kultivačně. Infekci může předcházet nebo i provázet herpes lapalis (Rozsíval et al., 2003). V souvislosti s reaktivací latentní formy viru dochází v gangliu trojklaného nervu k zpětnému transportu viru podél nervu (Rajčáni et al., 2006). Recidivující forma se dělí podle místa postižení rohovky na keratitis epithelialis, keratitis stromalis a endothelialis. Dále můžeme onemocnění klasifikovat dle etiopatogeneze jako infekční (s aktivní replikací viru), trofické (porucha senzitivity a výživy tkáně) a na imunitním podkladě (III a IV. typ přecitlivělosti). Mezi nejčastější formy epitelové keratitidy patří keratitis dendritica a keratitis geographica. Charakteristický je větvičkovitý vřed rohovky u keratitis denditica. Někdy mohou být větvičky vředu silnější, což nazýváme dendrogeografický vřed a nebo má vřed mapovitý charakter u keratitis geographica. Tyto ulcerace jsou provázené malou infiltrací a jsou způsobeny aktivní replikací viru v buňkách. Větvičky bývají zakončeny terminálním rozšířením. Dochází k dočasnému snížení citlivosti rohovky a nebo je úplně anestetická. Po infekční epitelové keratitidě mohou vzniknout vředy, které označujeme jako keratitis metaherpetica. Jedná se o vředy, při kterých nedochází k aktivní replikaci virů v tkáni. Mezi faktory přispívající ke vzniku keratitis metaherpetica patří změny inervace rohovky (trofický vředy) a slzného filmu, defekty bazální membrány epitelu (Kraus et al., 1997) a toxický efekt dlouhodobě podávaných antivirotik. Klinicky se metaherpetický vřed projevuje nehojícím se defektem se šedými „rolujícími se“ okraji (Rozsíval et al., 2003). Odlišit jej od vředu s aktivní infekcí je velmi obtížné. Usuzovat lze podle vývoje, protože většinou vzniká při a nebo po dlouho se nehojící herpesvirové keratitidě a nebo nám může pomoci charakter okrajů vředu. U metaherpetické léze bývají okraje šedé, navalité a nebarví se bengálskou červení. Kdežto okraje aktivního vředu bývají ploché, mohou měnit tvar a nekrotické buňky se intenzivně barví bengálskou červení a centrum fluoresceinem. Stromální keratitidy také většinou vznikají po epitelových HSV infekcí. Nejčastěji se vyskytuje keratitis disciformis je typická centrálním kruhovitým edémem stromatu, bez nekrózy, s minimální nebo žádnou buněčnou infiltrací, a nebývá provázena vaskularizací. Dále mohou být stromální keratitidy nekrotizující, keratitis stromalis necrotisans, charakterizované ložiskovou žlutobělavou infiltrací s postupnou nekrotizací tkáně. Proces je spojován s průnikem viru do stromatu rohovky a jeho replikaci. Keratitis interstitialis a HSVlimbitis vykazují různý stupeň infiltrace stromatu bez nekrózy, často s vaskularizací rohovky (Kraus et al., 1997). Představují imunitní reakci. Někdy můžeme pozorovat Wessleyův imunitní prstenec v podobě uloženin imunokomplexových depozit. Stromální keratitida vede k neovaskularizaci rohovky a sekundárně ke vzniku lipidových depozit. Opakující záněty 11
zanechávají ve stromatu jizvy. Recidiva v oblasti jizvy vede ke vzniku descemetokély a následně k rohovkové perforaci (Rozsíval et al., 2003). Někdy bývá převaha zánětlivých změn na endotelu rohovky s mírnou reakcí ve stromatu, poté se přiklání k diagnóze endotelitidy (Kraus et al., 1997). Lineární endotelitida se klinicky projevuje linií endoteliálních precipitátů šířících se z periferie centrálně. Zanechává edém stromatu a reaktivní striatu. Recidivy může provázet granulomatózní iridocyklitida s trabekulitidou. Opakující se onemocnění vede ke ztrátě senzitivity nervů v důsledku přímého poškození a ke vzniku anestezie rohovky.
Pomocí diferenciální diagnostiky se odlišují neonatální keratokonjunktivitidy způsobené HSV od mikrobiálních afekcí (bakteriálních a chlamydiových). Primární a rekurentní herpetické epiteliální léze se podobají akantamébové, zosterové či plísňové keratitidě. Stromální rohovkovou lézi musíme odlišit od Coganova syndromu a ostatních disciformních keratitid (zahrnující příušnice, pásový opar, plané neštovice, Epsteinovu-Barrovu keratitidu, syfilitickou, akantamébovou, plísňovou, ale i bakteriální keratitidu) (Rozsíval et al., 2003). Většinu případů herpetické infekce lze diagnostikovat klinicky, avšak vyskytnou-li se nějaké pochybnosti je třeba provádět laboratorní vyšetření (Diblík et al., 2004). Laboratorní diagnostika je u povrchových lézí založena na DNA diagnostice konkrétních herpetických virů pomocí metody PCR, jejíž největší výhodou je získání výsledku do několika hodin. Dále můžeme provádět tzv. Tzanckův test, tedy mikroskopické vyšetření obsahu puchýřků, elektronmikroskopické vyšetření s přímým průkazem virových partikulí (Rozsíval et al., 2003). Izolace viru na buněčné kultuře je úspěšná první 3-4 dny po primární infekci, tedy ještě před nástupem dostatečné hladiny protilátek. Zachycení viru na buněčné kultuře se musí potvrdit fluorescenčním vyšetření se specifickými monoklonálními protilátkami (Rajčáni et al., 2006). U stromálních lézí a uveitid provádíme sérologické metody (Rozsíval et al., 2003). K sérologickému důkazu protilátek se nejvíce využívá ELISA metoda, při které se dokazuje přítomnost specifických protilátek ve frakci IgG i třídě IgM (Rajčáni et al., 2006). Negativní výsledek však nevylučuje přítomnost herpes virů v rohovce.
Léčba u epiteliální herpes simplex keratitidy je lokální a systémová. Lokálně se aplikuje acyklovir (3% ung. 5x denně), jehož výhodou je dobrý průnik přes rohovkovou bariéru do stromatu a přední komory. 3-5x denně se vyplachuje spojivkový vak 10% betadinem (ředění 1:16). Alternativním léčivem je trifluridine (1% 5x denně), které je však k rohovce více 12
toxické než acyklovir a může způsobit epiteliální toxickou dysplazii. Při iritidě se podávají cykloplegika. Acyklovir systémově zvyšuje hladinu účinné látky v slzách. Je vhodným doplňkem u rozsáhlých epiteliálních lézí a nutností léčby u HIV pozitivních pacientů. Dávkování je 200-400 mg 5x denně po dobu 2-6 týdnů. Při recidivujících lézích se může přistoupit ke kauterizaci 2% betadinem nebo v klidové fázi nemoci k fotoablaci excimerovým laserem metodou PTK (fototerapeutická keratektomie). Léčba u disciformní keratitidy je stejná jako u povrchových keratitid, ale kombinujeme s nízkou dávkou lokálních kortikosteroidů (Rozsíval et al., 2003), které snižují riziko vzniku chronického a progresivního zánětu. Nejprve je vhodné použít silnější kortikosteroidy (dexymethazon, fluormetholon 4-8x denně) a postupně přejít na méně účinné preparáty (prednizolon, kortizon) a pomalu po dobu několika týdnů či měsíců dávku snižovat (Kraus et al., 1997). Léčba trofické keratopatie spočívá v podávání lubrikancií a bandáží terapeutickou kontaktní čočkou s vysokým obsahem vody, případně se provádí přešití amniovou membránou. Při ztenčování rohovky a progresi léze je nutná lamelární či perforující keratoplastika. Při častých recidivách, případně keratouveitid nebo po transplantaci rohovky kvůli herpetické keratitidě je vhodná profylaktická léčba acyklovirem (v dávce 400 mg 2x denně dlouhodobě). Vzhledem k jeho nefrotoxicitě je nutností provádět kontrolu ledvinných funkcí.
2.1.2. Patogeneze HSV infekce Herpesvirová infekce se šíří přímým kontaktem s infikovanou tkání nebo kontaminovanými nástroji. Virus přežívá 2 hodiny v suchém, 8 hodin ve vlhkém prostředí a inaktivují jej všechna běžná dezinficiencia (Rozsíval et al., 2003). HSV se primárně rozmnožuje v kůži, která je pokrytá rohovatějícím dlaždicovým epitelem a nebo na sliznicích krytých nerohovatějícím dlaždicovým epitelem (rohovka, rty, ústní dutina) (Želma et al., 1998). HSV je neurotropní virus (Bednář et al., 1996), dál proniká cestou nervových zakončení do příslušných senzorických ganglií, který se stává hlavním rezervoárem při přetrvávání viru v latentním stavu. Rozmnožování viru v dlaždicovém epitelu kůže má za následek vznik puchýřků, které v důsledku exsudace fibrinu mění na strupy, které mohou být druhotně infikované bakteriemi. Na sliznicích v důsledku nepřítomnosti rohové vrstvy vznikají drobné anebo víc vředovité defekty vyplněné fibrinem a nekrotickou tkání, která se po eliminaci viru opět pokrývá původním epitelem (Želma et al., 1998).
13
Základní poznatky o cestách šíření Herpes simplex viru vyplývají z experimentů na myších, králících a morčatech. Rozeznávají se dva odlišné způsoby testování virulence virových kmenů: 1. Šíření uvnitř nervového systému po intracerebrálním podání. 2 Šíření přirozenými cestami z brány vstupu po periferním podání (intraperitonálně, subkutánně, do skarifikované rohovky, intrakutánně, intranazálně). Cílem experimentální infekce bývá centrální nervový systém. Virus se v organismu šíří podél periferních nervů, ale i lymfatickou či krevní cestou. Šíření HSV podél nervů sice nastává intraaxonálně, ale v některých situacích dochází k replikaci viru v nervových svazcích, a to ve Schwannových buňkách obalující axony. Na šíření viru z periférie do CNS se uplatňují i produkty genů, které jsou nepostradatelné při rozmnožování viru v buněčné kultuře např. thymidinkinasa, gE a dálší glykoproteiny, proteiny brzké rané i pozdější fáze exprese (Rajčáni et al., 2006).
2.1.3. Diagnostika HSV
2.1.3.1. Imunologické metody (ELISA, IFA) ELISA metoda se může využívat na přímé určení virového antigenu nebo protilátky v odebraném vzorku. Princip spočívá v reakci antigenu s protilátkou značenou enzymem (Želma et al., 1995). Mnoho enzymů, včetně křenové peroxidasy a alkalické fosfatasy, které jsou nejpopulárnější, může být chemicky navázáno na antigen či protilátku. Většina antigenů se spontánně váží na plastové povrchy, jako jsou jamky na polystyrenové mikrotitrační destičce. Protilátky se také váží, přičemž si udržují svou antigenní vazebnou aktivitu. Tudíž antigenní nebo protilátkové destičky mohou být připraveny jako počáteční krok. Jakmile jsou antigeny nebo protilátky aplikovány na povrch jamek nebo jsou navázány na pevnou fázi, stávají se odolné vůči intenzivnímu promývání v detergenčním pufru, zatímco přebytek nenavázaných látek je tímto procesem jednoduše odstraněn. V dalších krocích se zachycuje na jednu nebo více vrstev pevné fáze vytvořený imunitní komplex, a nenavázané částice se opět efektivně vymyjí. Zachycený enzym pak reaguje se substrátem, což poskytuje základ pro vyhodnocení signálu (Catty et al., 1990). Přidání substrátu, většinou peroxidu vodíku, dochází k barevné reakci v závislosti na množství navázaných protilátek (Želma et al., 1995) či antigenů. Reakce může být zastavena ve vhodné fázi a barevný signál se stanoví vizuálním porovnáním se standardy nebo spektrofotometricky měřením absorbance (Catty et al., 1990). Pomocí ELISA metody s HSV 1 a HSV 2 monoklonálními protilátky (MAb) se provádí specifická HSV typizace a potvrzuje se cytopatický efekt u pozitivních tkáňových kultur 14
(Khodadoost et al., 2004). HSV specifické MAb rozpoznávají typově specifické epitopy, a proto se využívají k detekci antigenů (Liljeqvist et al., 1999). První používaná MAb (B1.E6) je protilátka proti gykoproteinu E, která je typově nespecifická, druhá MAb (B1.C1.) je HSV 1 specifická protilátka proti glykoproteinu C-1, a třetí MAb (O1.C5.B2) je HSV 2 specifická protilátka proti glykoproteinu G-2 (Khodadoost et al., 2004). Alkalická fosfatasa vytváří konjugát s F(ab´)2 myší protilátky, přidává se p-nitrofenyl, sloužící jako substrát, a po 30 minutovém intervalu se odečítá reakce při 405 nm. Liljeqvist et al. publikoval výsledky typizace 4800 klinických HSV izolátů, kde anti-HSV 1 MAb ukazuje 100% citlivost i specifitu a anti-HSV 2 MAb 99,46% citlivost a 100% specifitu (Liljeqvist et al., 1999). Pro diagnózu herpetických očních infekcí se ukazují sérologické techniky jako nevhodné (Khodadoost et al., 2004), avšak stanovení lokálních HSV protilátek pomocí modifikované micro-ELISA techniky je spolehlivým diagnostickým prostředkem pro rekurentní herpes keratitis. Robert et al. předpokládá, že u pacientů s historií rekurentních herpes, přítomnost HSV DNA v rohovkové tkáni může spustit produkci protilátek dokonce bez přítomnosti akutní manifestace onemocnění. Což je také důležité k identifikaci těchto pacientů a k jejich léčbě antivirotiky (Robert et al., 2006).
Imunoflourescence je další technikou pro detekci a lokalizaci antigenů po jejich reakci s protilátkami
označenými
fluorescenčními
látkami,
nejčastěji
fluoresceinem
nebo
fluoresneinizothiokyanátem (FITC). Podstata metody je v tom, že krátkovlnné UV záření excituje fluorochromy, které následně emitují světlo s delší vlnovou délkou, které se použitím správných filtrů mikroskopicky pozoruje jako fluorescence, tedy světélkování. Úspěch metody spočívá v kvalitě odebraného materiálu; správné fixaci preparátů, aby zůstala zachovaná antigenní aktivita; specifitě protilátek a na zkušeném mikroskopikovi (Želma et al., 1995). Na identifikaci či typizaci HSV se obvykle používá nepřímý imunofluorescenční důkaz antigenu (Rajčáni et al., 2006). Coyle ve své studii používal čtyři skupiny monoklonálních protilátek (A-D), skupina A byla HSV 1 specifická, B byla HSV 2 specifická zatímco C a D byly typově nespecifické. K buněčným peletům získaných z klinických vzorků se přidaly zmiňované skupiny protilátek a po fixaci v acetonu, inkubačním a promývacím kroku se provedlo značení s polyvalentním fluoresceinisothiokyanátem. Fluorescence se pozorovala pomocí Zeiss IV epifluorescenčního mikroskopu (Coyle et al., 1999). Chemicon International, Inc. (Temecula, Calif.) vyvinula Light Diagnostics Simul FluorTM imunofluorescenční stanovení pro paralelní přímou detekci HSV a VZV. Stanovení využívá UV ozáření a dva rozdílné filtry nastavené k identifikaci HSV a VZV. Použitím FITC filtru 15
antigen-protilátkový komplex u HSV fluoreskuje světle zeleně, zatímco u VZV žlutě. V případě TRITC (tetramethylrhodaminizokyanát) filtru je antigen-protilátkový komplex u HSV nerozpoznatelný, zatímco u VZV je jasně růžový. Simul FlurTM může být také využíván k potvrzení cytopatického efektu při identifikace VZV a HSV tkáňovými kultury. Pro laboratoře, které běžně provádí imunofluorescenční detekci HSV i VZV tato metoda nabízí úsporu v přípravě preparátů, barvení a vyhodnocování (Scicchitano et al., 1999).
2.1.3.2. Detekce DNA (PCR techniky) Polymerázová řetězová reakce (PCR) je výkonná metoda (Kleinschmidt-DeMasters et al., 2001), která umožňuje citlivou a specifickou detekci i nepatrného množství virové DNA v očních vzorcích od imunokompetentních i imunokoprimovaných pacientů (Tran et al., 2003). Proto se tedy PCR využívá jako významný prostředek v diagnostice herpesvirových infekcí (Weidmann et al., 2003). Princip polymerasové řetězové reakce (PCR) je založen na replikaci nukleových kyselin. Podstatou je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5' → 3' za katalytického působení termostabilní Taq DNA polymerasy. Vybraný úsek nukleotidové sekvence je vymezen připojením dvou primerů, které se vážou na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'- konce směřují proti sobě. Po přidání Taq DNA polymerasy a deoxynukleotid trifosfátů probíhá syntéza nových vláken na obou matricových řetězcích protisměrně. PCR je proces, při kterém se v závislosti na teplotě reakční směsi pravidelně střídají tři kroky. Nejprve probíhá denaturace dvouřetězcové DNA (při teplotě 94-96 °C), následuje připojení primerů k odděleným řetězcům DNA (tzv. annealing při teplotě 30-65 °C) a posledním krokem cyklu je syntéza nových řetězců DNA prostřednictvím Taq DNA polymerasy (při teplotě 65-75°C). Postupným opakováním celého procesu se eponenciálně (2počet
cyklů
) vytváří až miliarda kopií vybraného úseku cílové
molekuly (Šmarda et al., 2005). Tedy 30-40 cyklů vytvoří za 2-3 hodiny 106-109 kopií cílové DNA. Pro efektivní a přesnou PCR analýzu je rozhodujícím krokem návrh primeru. V minulosti byly sekvence primeru generovány ručně. V současné době jsou k dispozici počítačové programy, které umožňují návrh optimálního primeru, se zohledněním obsahu G+C, podobné teplotě Tm (melting temperature) obou primerů a absence komplementárních sekvencí v primerech, které by mohly vést k tvorbě duplexů (Kleinschmidt-DeMasters et al., 2001). Přesné hodnoty teploty a dobu trvání jednotlivých cyklů je třeba optimalizovat. Optimální počet cyklů je závislý na výchozí koncentraci templátové DNA. Příliš vysoký počet cyklů 16
významně zvyšuje množství vznikajících nespecifických produktů. Pro PCR je důležitá úplná počáteční denaturace templátu. V případě, že dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují, což vede k nespecifické vazbě primerů („self-priming“) a tudíž k falešně pozitivním výsledkům. Podmínky pro hybridizaci primerů závisí na zastoupení bází, délce oligonukleotidů a hodnotě Tm produktu. Teplota pro připojení (hybridizaci) primerů, označovaná jako Ta (annealing temperature), se vypočítá dle vztahu: Ta = 0,3 . TmPrimer + 0,7 . TmProdukt – 25 Kde TmPrimer je hodnota Tm nejméně stabilního páru primer-matrice, TmProdukt je hodnota Tm amplifikačního produktu. Avšak obecně užívaným pravidlem pro stanovení Ta je snížení teploty Tm o 5°C. Dále je také důležitá koncentrace jednotlivých složek reakční směsi. Kofaktorem enzymu jsou Mg2+ ionty, které tvoří rozpustný komplex s jednotlivými dNTP (2'-deoxyribonukleosid-5'trifosfát) rozpoznávaný Taq DNA polymerasou. Jelikož Mg2+ ionty interagují nejen s dNTP, ale i s primery, templátovou DNA, EDTA a dalšími chelatačními činidly, je třeba ve většině případů empiricky stanovit optimální koncentraci Mg2+ iontů. Příliš vysoká koncentrace některé ze složek reakce může vést k chybám a vzniku nespecifických produktů. Vysoká citlivost a specifita PCR způsobuje, že kontaminace i jedinou molekulou exogenní nebo neznámé DNA postačuje pro získání falešného signálu. Pro minimalizaci falešně pozitivních výsledků byly doporučeny určité standardní postupy zahrnující používání autoklávovaných roztoků, fyzikální separaci používaných PCR-reagencií od templátové DNA a produktů PCR, přípravu reagencií i vzorků do alikvótních částí, používání UV světla k odstranění exogenních nukleových kyselin, používání jednorázových ochranných pomůcek, přidávání DNA do reakce jako poslední složky a pečlivou volbu pozitivních a negativních vnitřních kontrol (Šmarda et al., 2005). Výsledné produkty PCR (amplikony) se následně prokazují elektroforetickou migrací v agarózovém gelu, který obsahuje ethidium bromid k vizualizaci produktu (KleinschmidtDeMasters et al., 2001). Rychlost pohybu molekul DNA v gelu je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Při posuzování elektroforetické pohyblivosti dané molekuly DNA není třeba brát v úvahu velikost náboje, protože nukleové kyseliny mají náboj rovnoměrně rozložen. Velikost molekuly DNA nebo jejího fragmentu o neznámé velikosti lze stanovit srovnáním s hmotnostními standardy. Těmi většinou bývají restrikční fragmenty plazmidů nebo genomu bakteriofágů, jejichž přesná velikost byla stanovena sekvencováním DNA. Po dokončení elektroforézy je třeba identifikovat polohy separovaných molekul, které nejsou pouhým okem viditelné. Ethidium bromid se vmezeřuje mezi sousední páry bazí v DNA a vytváří s ní 17
komplex, který po ozáření UV světlem fluoreskuje. Molekuly DNA o stejné velikosti jsou poté na gelu patrné jako proužky, jejichž intenzita je úměrná koncentraci DNA (Šmarda et al., 2005). Ke zjištění specifity vytvořených produktů PCR se obvykle provádí Southern blotting. Amplifikovaný fragment je přenesen z gelu na membránu a dále analyzován použitím radioaktivně nebo fluorescenčně značené sondy, která je komplementární k cílovému genu. Selhání navázání sondy na amplikon ukazuje falešně pozitivní PCR produkt nebo další technické problémy. Přímé sekvenování amplifikovaného produktu se také používá k potvrzení PCR produktu. Nicméně tento přístup se většinou provádí ve výzkumu, protože díky své manuální náročnosti je pro rutinní užívání nevhodný (Kleinschmidt-DeMasters et al., 2001). Polymerázová řetězová reakce se používá v široké škále variant, které jsou upraveny podle toho, zda se provádí molekulární identifikace nebo typizace organismů, amplifikace templátů s nízkým počtem kopií nebo detekce sekvenčních polymorfismů. Jednotlivé varianty se liší specifickými sekvencemi primerů, přísností reakčních podmínek a způsoby detekce produktů PCR (Šmarda et al., 2005).
Nested PCR je příkladem modifikace standardní PCR techniky, která se používá k zvýšení citlivosti detekce virů (Weidmann et al., 2003). Odstupňovaná PCR neboli nested PCR využívá vnějších a vnitřních primerů. Jedná se o vysoce citlivou metodu, která umožňuje detekovat i jedinou molekulu templátové DNA. Podle klasického protokolu se amplifikace provádí ve dvou krocích. První amplifikační krok zahrnuje 15-30 cyklů s jediným párem tzv. vnějších primerů a vzniká produkt, který se převádí do nové zkumavky. Následuje druhý amplifikační krok, ve kterém se pomocí vnitřních primerů amplifikují vnitřní části produktu z prvního kroku. Druhý amplifikační krok zahrnuje dalších 15-30 cyklů a po jeho dokončení se produkt detekuje elektroforézou. Přenos amplifikačních produktů z první reakce do druhé umožňuje naředění inhibitorů, které mohly být přítomny v původním vzorku, ale přináší s sebou i možnost kontaminace (Šmarda et al., 2005). Riziko kontaminace bylo snižováno představením tzv.“one-way“ pracovního schématu, při kterém se příprava vzorků a reagencií, první a druhý krok amplifikace uskutečňuje v místnostech různých budov s odděleným větracím systémem (Weidmann et al., 2003). Pro nested PCR byly popsány i protokoly zahrnující různé přístupy provedení reakce v jedné zkumavce. Obsah prvního amplifikačního kroku může být oddělen od obsahu druhého amplifikačního kroku silnou přepážkou z minerálního oleje. Po první amplifikaci jsou reakční 18
komponenty smíchány mikrocentrifugací a obsah je amplifikován znovu. Častěji se však navrhují páry vnějších a vnitřních primerů, které se podstatně liší teplotou pro připojení primeru. První amplifikace s párem vnějších primerů se provádí při nízké teplotě pro připojení primerů s 10-15 cykly. Jejím výsledkem je směs produktů jak vnitřních a vnějších primerů, tak jejich kombinace. Následuje druhotná amplifikace s vnitřními primery zahrnující 15-30 cyklů při podmínkách optimální teploty pro připojení primerů. Konce vnitřních primerů jsou často bohaté na báze G+C a tak upřednostňují amplifikaci vnitřního produktu, který je detekován elektroforézou (Šmarda et al., 2005). Díky vysoké citlivosti se nested PCR v laboratorní praxi používá jako srovnávací metoda k ostatním PCR technikám. Detekce HSV 1 se často provádí dle protokolu, který publikoval Aurelius et al. již v roce 1991, kde využívá specifických primerů BJ HSV 1, jejichž cílovým genem je glykoprotein D. K detekci HSV 2 infekce se aplikuje druhý Aureliův nested PCR protokol z roku 1993, kde primery BJ HSV 2 jsou specifické k sekvenci gG genu (Weidmann et al., 2003).
Multiplex (Mnohonásobná) PCR je variantou polymerasové řetězové reakce, kdy je do reakční směsi přidáno několik párů primerů rozpoznávajících více rozdílných cílových sekvencí, což umožňuje detekci několika genů současně. Primery použité při multiplex PCR nesmí být vzájemně komplementární, měly by mít podobnou teplotu hybridizace a délka produktů by měla být rozlišitelná při elektroforetické separaci. Reakční podmínky pro současnou amplifikaci všech produktů je nutno empiricky, krok za krokem optimalizovat. Hlavní výhodou této metody jsou nižší cenové náklady než při samostatných amplifikacích (Šmarda et al., 2005). Technika mnohonásobné PCR se v laboratorní diagnostice může využívat k paralelní detekci herpes simplex viru typu 1 i 2, cytomegaloviru a varicella-zoster viru z různých očních vzorků, zahrnující vzorky slz, výtěr ze spojivky, rohovky, vředů a kůže nebo měkkou kontaktní čočku. U některých pacientů byly výsledky multiplexové i standardní PCR negativní, avšak dle klinické diagnózy se pacienti řadili k některému z očních onemocnění, jako je např. alergická konjunktivitida, epidemická keratokonjunktivitida, rekurentní rohovkové poškození, rohovkový vřed nebo puchýřek, varicella-zoster virová keratitida nebo léčivem indukující keratitis či blepharitis. Díky nesrovnalostem mezi výsledky PCR a klinickou diagnózou by se další studie měly zaměřit na potvrzení citlivosti a specifity multiplex PCR metody (Zhang et al., 2003).
19
Kvantifikace množství molekul nukleových kyselin je důležitá při diagnostice mnoha patogenů. V současné době se používá varianta PCR umožňující přímou kvantifikaci PCR produktu v průběhu reakce, tedy metoda real-time PCR. K detekci vznikajícího produktu mohou být použity různé systémy, které jsou založeny na sledování změny intenzity fluorescenčního záření během amplifikace. Pro kvantifikaci DNA se obecně využívají interkalační barviva, fluorescenčně značené sondy nebo primery. Nejpoužívanější interkalační kyaninové barvivo nese název SYBER Green a váže do menšího žlábku dsDNA. Intenzita fluorescenčního signálu nenavázaného barviva je velmi nízká, avšak po vazbě na dsDNA se až tisíckrát zvýší a se vzrůstajícím množstvím PCR produktu dále roste. Hlavním omezením tohoto barviva je nemožnost odlišení nespecifických produktů. Dimery primerů, které by falešně zvyšovaly fluorescenční záření mohou být zhášeny použitím primerů značených specifickými fluorofory. Pro specifickou detekci se používá TaqMan sonda, kterou tvoří oligonukletidy komplementarní k vnitřní části amplifikované sekvence. Sonda má na 5'-konci fluorescenční značku (emituje světlo určité vlnové délky po předchozí absorbci světla odlišné vlnové délky) a na 3'-konci zhášeč (přijímá energii z fluoroforu ve formě světla a způsobuje její rozptýlení ve formě světla nebo tepla). Po navázání sondy ke komplementární sekvenci DNA se vytváří homoduplex a působením 5' exonukleasové aktivity Taq DNA polymerasy dochází k rozložení sondy, což způsobí ukončení efektu zhášení a nárůstu fluorescenčního signálu. Dvojice fluorescenčně značených sond využívající přenos energie fluorescenční rezonancí (FRET), což je excitovaný stav interakce dvou fluoroforů závislý na vzdálenosti, ve kterém je emise energie z donorového flouroforu (př. FAM, tedy 6-karboxyfluorescein) na 3'-konci první sondy spojená s excitací akceptorového fluoroforu (př. TAMRA, tedy 5kyrboxytetramethylrhodamin) na 5'-konci druhé sondy vázající se na sousedící sekvenci. Přenos energie mezi ligandy se může uskutečnit na vzdálenost 10-100 Å (1-5 nukleotidů), přičemž citlivost FRET může detekovat změny vzdálenosti 1-2 Å na základě změny intenzity fluorescence. Mezi vysoce specifické sondy patří molekulární majáky (Molecular Beacons), jejichž oligonukleotidy vytvářejí sekundární strukturu vlásenky určené pro detekci nukleové kyseliny v roztoku. Smyčka má komplementární sekvenci k cílové molekule a krátká vlásenka tvořená obrácenou repeticí udržuje v těsné blízkosti na koncích připojený fluorofor a zhášeč. Po připojení sondy ke komplementárnímu úseku DNA dochází k dostatečnému oddálení zhášeče od zářiče, který emituje fluorescenční záření (Šmarda et al., 2005).
20
LightCycler systém (Roche Diagnostics) je jedním z nejvýznamnějších diagnostických prostředků pro detekci DNA, který se v současné době vyskytuje na trhu. Velkou výhodou tohoto systému je možnost získání výsledků do jedné hodiny, po extrakci nukleové kyseliny ze vzorků. LightCycler technologie představuje kvantitativní real-time PCR, při níž dochází k velmi rychlé amplifikaci cílové nukleové kyseliny, a to díky teplotním změnám, které probíhají rychlostí 20°C za sekundu. Změny teplot v rámci amplifikace se dosahují mísením horkého vzduchu ohřátého tepelným zdrojem a vzduchu pokojové teploty přicházejícího zvenčí. Speciálně navržené skleněné amplifikační kapiláry o mikrolitrovém objemu se umisťují do karuselu, jehož krokový posun umožní přesun kapiláry z amplifikační komory na detekční pozici bezprostředně po ukončení každého amplifikačního kroku (Burrows et al., 2002). LightCycler je univerzální systém, který ke kvantifikaci DNA může využívat nespecifické barvivo SYBR Green (Koenig et al., 2001), TaqMan sondu (Weidmann et al., 2003) či FRET hybridizační próbu (Stöcher et al., 2003). Studie ukazují, že LightCycler PCR představuje vysoce citlivou metodu pro paralelní detekci a subtypizaci HSV v jedné reakční kapiláře. Real-time sledování amplifikovaného DNA produktu je možné užitím specifických primerů a dvojice fluorescenčně značených hybridizačních prób. Donorový fluorofor (fluorescein) je excitován světlem emitovaným z LightCycleru a část exitační energie je přenesena na akceptorový fluorofor (LC-Red 640 nebo LC Red 705). Výsledná energie emitovaná akceptorovým fluoroforem je měřená LightCyclerem a je úměrná množství specifického PCR produktu v reakčním mixu. Ke kalibraci LightCycler PCR se používají HSV 1 a HSV 2 pozitivní kontroly. Tyto referenční vzorky jsou plazmidové DNA, jejichž sekvence se získávají z databáze GenBank. Rozdíl mezi HSV 1 a HSV 2 se provádí stanovením teploty Tm jejich hybridizačních prób. „Melting“ pík s vrcholem při 58 °C se objevuje při připojení próby k HSV 1 DNA, a pro HSV 2 próbu je charakteristický pík s dvěma vrcholy při 71 °C a nižším při 66 °C (Burrows et al., 2002).
Před samotnou PCR analýzou se běžně provádí extrakce a purifikace nukleové kyseliny z klinických vzorků. Tyto procesy jsou docela časově i finančně náročné a hlavně představují kroky, při kterých se vzorky mohou kontaminovat ještě před vlastní analýzou. Proto Pandori et al. začal zkoumat nutnost extrakce nukleové kyseliny z klinických vzorků pro detekci HSV DNA použitím real-time PCR. Klinické vzorky odebrané z různých míst lidského těla analyzoval pomocí LightCycleru 2,0 (Roche Diagnostics, Indiapolis), jak bez, tak i po extrakci DNA. Získané data ukazují, že je možné opomenout extrakční krok před real-time PCR pro detekci herpes simplex viru. Je však nutné zdůraznit, že toto tvrzení platí pouze pro 21
vzorky sbírané vatovým tamponem, které se následně vpraví do běžně užívaného transportního pufru. Vzorky odebrané touto cestou pravděpodobně obsahují velmi malé množství fyziologických nečistot, které jsou dále ředěny. A navíc první krok PCR protokolu probíhá pří vysoké teplotě, při které disociuje většina biomolekul, čímž se minimalizuje obsah potenciálních inhibitorů (Pandori et al., 2006).
Řada studií se zabývá srovnáním metod detekce herpes simplex virů. Za „zlatý standard“ se stále považuje izolace HSV na tkáňových kulturách. Jedná se o velmi citlivou a specifickou metodu, avšak získání výsledků trvá až celý týden a málo laboratoří disponuje vhodným zařízením a kvalifikací k provádění těchto testů (Koenig et al., 2001). Tkáňové kultury však mají nízkou citlivost při izolaci virů z očních vzorků získaných od pacientů s herpetickou keratitis stromalis. V nedávných studiích byla publikována četnost virové izolace z očních vzorků pomocí tkáňových technik: Kaye et al. (1991) pouze 1 z 10 případů, Pramond et al., (1998) 14 z 70, Kaye et al.(2000) 1 z 51 a Khodadoost et al.(2004) 3 z 25 (Khodadoost et al., 2004). Detekce HSV antigenů pomocí enzymového imunostanovení (EIA) je rychlé a specifické (93%), ale málo citlivé (65%) v porovnání s metodami tkáňových kultur, a navíc enzymové imunostanovení nemůže být jediným prostředkem k detekci. LightCycler technologie je stejně specifická jako tkáňové kultury a EIA, ale víc citlivá než obě tyto metody. Koenig et al. publikoval pro detekci HSV pouze 78% citlivost tradičních kulturních testů a 56% citlivost EIA vůči LightCycler PCR. Polymerázová řetězová reakce představuje významnou detekční metodu pro HSV, která spojuje citlivost, specifitu a rychlost (Koenig et al., 2001), ale díky finanční a technické náročnosti zatím není rutinně využívaná (Coyle et al., 1999).
2.2. HERPESVIRY (čeleď Herpesviridae) Herpetické viry lidí patří do velké čeledi Herpesviridae, která zahrnuje okolo 120 druhů virů savců, ptáků i plazů (Rajčáni et al., 2006). Název čeledi pochází z řeckého slova herpes (plazivý). Tento výraz použil už Hippokrates při popisu plazivých kožních lézí u člověka. Až roku 1921 se však dokázal infekční virový původ onemocnění (Želma et al., 1998). Herpesviry
se
podle
genetické
a
biologické
podobnosti
řadí
do
tří
podčeledí
Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae a Gammaherpesvirinae (Bednář et al., 1996).
22
Do podčeledi Alphaherpesvirinae patří viry se širokým okruhem hostitelů, relativně krátkým reprodukčním cyklem, schopností rychlé rozšíření infekce v buněčných kulturách, značné destrukce infikovaných buněk a přechodu z produktivní do latentní infekce v senzorických gangliích. Betaherpesvinae se vyznačují úzkým okruhem hostitelů, relativně dlouhým reprodukčním cyklem a pomalým šířením infekce v buněčných kulturách. Charakteristickou změnou infikovaných buněk je zvětšení jejich objemu (cytomegalie) a vnitrojaderné inkluze (Želma et al., 1998). Viry podčeledi Gamaherpesvirinae mají dlouhý replikační cyklus, pomalu se uvolňují z hostitelských buněk a vykazují afinitu k lymfocytům. Produktivně se rozmnožují v epitelu sliznice nosohltanu. Důležitým znakem neproduktivní infekce lymfoidních buněk je jejich schopnost navodit proliferaci (imortalizaci) a indukovat expresi různých receptorů, v důsledku toho dochází k lymfoproliferativním procesům (Rajčáni et al., 2006).
2.2.1. Virus herpes simplex Rod Simplexvirus je zástupcem podčeledi Alphaherpesvirinae .Přirozeným hostitelem infekce je pouze člověk. Virus existuje ve dvou antigenně i biologicky odlišných typech HSV 1 a HSV 2. Infekce vyvolané prvním typem jsou většinou lokalizovány na obličeji nebo v ústech, a HSV 2 perigenitálně. Oba typy mají společné antigeny a zkříženě reagují v sérologických testech (Bednář et al., 1996).
Struktura virionu HSV 1 Virion HSV 1 má průměr 150-200 nm a skládá se z jádra, kapsidu, tegumentu a obalu. Zmíněné čtyři vrstvy jsou rozlišitelné pomocí elektronového mikroskopu. Proteinové jádro má prstencový tvar, na kterém je navinutá lineární dvouřetězcová DNA. Kapsid zaujímá ikozaedrickou symetrii a skládá se ze 162 subjednotek, nazvaných kapsomery. Tegument představuje amorfní proteinovou vrstvu, která vyplňuje prostor mezi kapsidem a obalem virionu. Vnější obal je tvořený třemi vrstvami, obsahuje glykoproteiny, lipidy a polyaminy (spermin a spermidin) a má charakteristické výběžky s délkou 8 nm (Želma et al., 1998).
23
Obr. 2. Schéma virionu HSV1 (www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/hsv1struc.jpg)
Genom herpesviru je tvořen lineární dsDNA (150 kpb). Sekvence DNA jsou převážně homologní, liší se pouze některými úseky, kódující antigenově odlišné glykoproteiny (gG1 a gG2). Lineární dsDNA je rozdělena na dvě jedinečné domény: UL (dlouhá) a US (krátká). Jedinečné sekvence jsou ohraničeny koncovými a vnitřními repeticemi uspořádané podle následujícího schématu: TRL – UL-IRLIRS-US-TRS (Rajčáni et al., 2006). Vzájemná orientace dlouhých a krátkých domén umožňuje vznik čtyř izomerů genomu HSV 1. Genom kóduje relativně velký počet enzymů, které se účastní při syntéze DNA a posttranslační úpravě proteinů. Příkladem je DNA polymerasa, proteiny vážící DNA a proteasy. Díky těmto enzymům jsou viry méně závislé na enzymové aktivitě hostitelské buňky a umožňují tak jeho množení i v buňkách, které se samy nerozmnožují (např. neurony).
2.2.2. Životní cyklus Infekce začíná adsorpcí viru na vnímavou (permisivní) buňku (Želma et al., 1998). Virion se přichytí svými výběžky na specifické receptory (obsahující glykozoaminoglykany, GAG (heparan sulfát)) na povrchu cytoplazmatické membrány buňky (Rajčáni et al., 2006). Na této interakci se podílí glykoproteiny gC a gB a v další fázi se na buněčné receptory váží viriony pomocí gD obalu. Konformační změnou gD dochází k vytvoření fúzních můstku mezi obalem částic a buněčnou membránou. Spřaženým jevem je kondenzace virového tegumentu a obalu, což umožní uvolnění nukleokapsidu a jeho proniknutí do cytosolu. Virový nukleokapsid
24
neznámým mechanismem ztrácí svůj obal a virová DNA se přes póry jaderné membrány dostává dovnitř jádra, kde cirkularizuje. V jádře dochází k replikaci a postupné expresi virového genomu. V první fázi (2-4 hodiny po infekci) probíhá exprese α-genů. Genomová dsDNA se přepisuje na α-mRNA. Transkripce je aktivována virovým tegumentovým proteinem α-TIF a buněčným proteinem OCT-1. α-mRNA se překládá na proteiny brzké rané fáze, které fungují jako transaktivační bílkoviny umožňující přepis β-mRNA z β-genů. V další fázi (5-7 hodin po infekci) dochází k expresi β-genů, které kódují proteiny pozdější rané fáze exprese. Tyto proteiny jsou enzymy, které jsou nezbytné pro syntézu prekurzorů DNA (thymidinkinasa, ribonukleotidreduktasa), replikaci DNA (DNA polymerasa, primáza, helikáza), regulaci virové genové exprese (aktivují expresi γ-genů a inhibují expresi α-genů). V této fázi tedy začíná v jádře hostitelské buňky i replikace virové dsDNA mechanismem otáčivé kružnice, přičemž vznikají intermediáty typu konkatemerů. V poslední fázi (9 hodin a později po infekci) probíhá exprese γ-genů a pokračuje syntéza virové DNA. Transkripce γ-genů je aktivovaná proteiny pozdější rané fáze exprese a replikací virové DNA. Přepisem γ-mRNA vznikají proteiny pozdní fáze exprese, které jsou většinou strukturní proteiny, ze kterých se skládá kapsid, tegument a částečně i obal virionu. V jádře hostitelské buňky se interakcí kapsidových proteinů nejprve vytváří prázdné kapsidy, do kterých se poté vkládá nukleoproteinové jádro obsahující molekulu genomové DNA. Virový nukleokapsid při přechodu z jádra do cytoplazmy získává z vniřní lameny jaderné membrány tegument a obal (Želma et al., 1998). Podle novější interpretace mnoho kapsidů při přechodu do cytoplamy ztrácí svůj obal a opět se obalí na vezikulách endoplazmatického retikula a z membrán Golgiho aparátu (Rajčáni et al., 2006). Obalené viriony se hromadí mezi vnitřní a vnější lamelu jaderné membrány a v endoplazmatickém retikulu a jsou transportované ve zvláštních vezikulích přes cytoplazmu k plazmatické membráně a skrz ni ven z hostitelské buňky (Želma et al., 1998). Celý cyklus rozmnožování herpes simplex viru trvá 16-18 hodin (Rajčáni et al., 2006).
Herpes simplex viry jsou schopné navozovat také neproduktivní (latentní) infekci (Želma et al., 1998). Viry pronikají do nervových zakončení z místa původního rozmnožování (kůže nebo sliznice) a šíří se axony do těla senzorického ganglia, kde přetrvává jejich dsDNA. (Rajčáni et al., 2006). Virová DNA je cirkulární a zůstává jako episom v jádře buňky a nebo je integrovaná do chromozomu. Mohou však existovat současně i obě formy. Při latentní infekci neprobíhá virová genová exprese, nedochází k produkci virových proteinů, dochází 25
pouze k tvorbě tří zvláštních LAT transkriptů (latency-associated transcipts). LAT transkripty jsou komplementární k sekvencím na genomu kódujících mRNA pro raný protein ICPO, který je důležitým transaktivátorem α-genů. LAT transkripty se tedy mohou k těmto sekvencím vázat a inhibovat tak tvorbu ICOP. Příčiny navození latence zatím nejsou známy (Želma et al., 1998). Reaktivace infekce může být vyvolána různými podněty, např. UV ozářením, horečkou, stresem či poruchou hormonální nerovnováhy. Při tom se virová DNA šíří retrográdně axonem a z nervového zakončení proniká do buňky sliznice či kůže, kde dochází k replikaci. Infekce se šíří přímo z buňky do buňky a vede k opakovanému vzniku ohraničených lézí v oblasti, která byla postižena v primoinfekci (Bednář et al., 1996).
2.3. ANTIVIROVÁ LÉČIVA Antivirová chemoterapeutika jsou obecně látky, které zasahují na různých úrovních virové infekce, tedy od vstupu virionu do buňky přes replikaci v jádře až k tvorbě nových virionů, které jsou z buňky vyplavovány (Lincova et al., 2002). Hlavním cílem antivirové terapie jsou aktivně se replikující viry. Proto tedy většina běžných antivirotik se uplatňuje při léčbě aktivních virových onemocnění. Avšak profylaktické a preventivní užití antivirových léčiv je stále více uznávané, zvláště u pacientů s vyšší náchylností k infekci, jako jsou imunokomprimovaní jedinci a příjemci transplantovaného orgánu (Abdel-Hag et al., 2006). Herpesvirové infekce se léčí virostatiky, které jsou strukturními analogy přirozeně se vyskytujících nukleosidů. Tyto nukleosidové analogy (antimetabolity) mají oproti běžným nukleosidům změněnou buď bázi a nebo cukernou složku. Příkladem antimetabolitu s pozměněnou bází je idoxuridin, který obsahuje thymin s methylovou skupinou v poloze 5. Jelikož se fosforyluje i v neinfikovaných buňkách, pak se zabudovává do DNA, čímž působí cytotoxicky, je vhodný pouze pro lokální terapii. K nejpoužívanějším virostatikům s pozměněnou cukernou složkou patří acyklovir, gancyklovir a pencyklovir, které představují deriváty guaninu (Lüllman et al., 2002). Acyklovir je velmi významné antivirové léčivo značně užívané proti herpetickým infekcím, zvláště u viru herpes simplex a varicella zoster. Podává se intravenózně, perorálně i místně (Fernández et al., 2003). Gancyklovir má vyšší aktivitu proti cytomegaloviru než acyklovir, a proto se volí při léčbě cytomegalovirové (CMV) infekce u imunokomprinovaných pacientů (Loregian et al., 2001). Nevýhodou gancykloviru je jeho nižší specifita než u acykloviru, a s tím související častější poruchy krvetvorby a neutropenie (Lüllman et al., 2002). 26
Pencyklovir inhibuje HSV podobně jako acyklovir, ale má výhodu v dlouhodobém působení v infikovaných buňkách. 1% pencyklovirovový krém je aplikován jako efektivní lokální léčivo na herpetickou vyrážku nezávisle na stupni rozvinutí léze (Abdel-Hag et al., 2006). Následkem omezené biologické dostupnosti acykloviru při orálním podání, byla navržena jeho prodrug forma s názvem valacyklovir. Jedná se o L-valyl ester acykloviru (Loregian et al., 2001), který vykazuje lepší resorpci po perorálním podání. Ve sliznici střeva a játrech je účinkem esteras přeměňován na acyklovir (Lüllman et al., 2002) a esenciální aminokyselinu L-valin (Loregian et al., 2001). Biologická dostupnost acykloviru z valacykloviru je přibližně 50%. Pencyklovir má také své orální proléčivo, famcyklovir, které má stejné indikace jako valacyklovir. Strukturně odlišným léčivem je foskarnet, který je indikován pouze při těžkých infekcích vyvolaných cytomegaloviry, většinou u pacientů s AIDS. Léčivo se eliminuje renálně, což vyvolává časté poruchy funkce ledvin (Lüllman et al., 2002). O
O N H2N
H2N
N
N H
N
N
N
N
N H
O
H2N HO
O
O
O H3C
CH3
Acyklovir
Valacyklovir
O N
N H2N
N H
N
N
N H2N
N H
N
O OH
OH
H3C
Pencyklovir
O O
O
Famcyklovir 27
CH3
O N
N H2N
N
N H
HO O
OH
Gancyklovir
Foskarnet
Obr.3: Chemická struktura antivirových léčiv: acyklovir [9-(2-hydroxyethoxymethyl)-9H-guanin], valacyklovir (L-valylester-acykloviru),
pencyklovir
(diacetylester–6-deoxypencykloviru),
[9-(4-hydroxy-3-hydroxymethyl-but-1yl)
gancyklovir
guanin],
[9-(1,3-dihydroxypropoxymethyl)guanin]
famcyklovir a
foskarnet
(trisodná sůl fosfoformátu).
2.3.1. Mechanismus působení antivirových léčiv Acyklovir představuje selektivní inhibitor replikace herpetických virů, s velmi nízkou toxicitou k okolním neinfikovaným buňkám. Tato selektivita je docílena specifickou a postupnou fosforylací acykloviru až na trifosfátovou formu, která probíhá pouze uvnitř virem infikované buňky (Loregian et al., 2001). Nejprve dochází k fosorylaci ayckloviru za katalytického působení virové thymidinkinasy (TK) (Bacon et al., 2003). Vzniklý acyklovirmonofosfát je následně konvertován na difosfát pomocí buněčné guanylátkinasy, a dále až na trifosfát prostřednictvím dalších buněčných enzymů. Acyklovirtrifosfát je aktivní metabolit fungující jednak jako substrát pro virovou DNA polymerasu, tak i jako její specifický inhibitor (Loregian et al., 2001), který kompetuje s přírodním nukleotidem deoxytrifosfátem (Bacon et al., 2003). Po navázání virové DNA polymerasy na aktivní trifosfátovou formu a její následné začlenění do DNA primeru matricového řetězce vede k zabránění elongace DNA řetězce, protože neobsahuje 3'-hydroxy skupinu deoxyribosy, nutnou pro připojení dalšího nukleotidu. Polarita fosfátových zbytků znemožňuje molekule acyklovirtrifosfátu proniknout membránou, a proto se hromadí v infikované buňce (Lüllman et al., 2002).
28
Pencyklovir má podobný mechanismus působení jako acyklovir, ale i přesto může být pozorováno několik rozdílů. Pencyklovir má vyšší afinitu k HSV thymidinkinase než acyklovir, ale nižší afinitu k HSV DNA polymerase a jeho trifosfátová forma je víc stabilní. Acyklovirtrifosfát představuje DNA řetězcový terminátor, zatímco pencyklovirtrifosfát pouze omezuje elongaci DNA řetězce, díky 3'-hydroxylové skupině na jeho acyklické straně řetězce (Bacon et al., 2003). Gancyklovir také podléhá fosforylaci cytomegalovirovým UL97 proteinem za vzniku aktivního nukleotidu. Gancyklovir-5'-monofosfát je dále fosforylován buněčnými kinasami na di- a tri-fosfátovou formu. Gancyklovirtrifosfát kompetitivně inhibuje začlenění dGTP do DNA, a tak se přímo inkorporuje do virové DNA, čímž omezuje a předčasně ukončuje její elongaci (Loregian et al., 2001). Foskarnet zasahuje do replikace virů tak, že blokuje vazebné místo pro pyrofosfát na virové polymerase a reverzní transkriptase (Lüllman et al., 2002). Foskarnet tedy nevyžaduje aktivaci v podobě fosforylace, ale působí přímo na virovou DNA polymerasu (Morfin et al., 2003).
2.3.2. Rezistence herpes simplex viru k antivirovým léčivům Od vzrůstajícího klinického použití acykloviru a pencykloviru může být očekáván vznik odolnosti, a proto je významné stanovení rozsahu použití těchto antivirotik. Acyklovir byl poprvé vyzkoušen v roce 1981, zatímco famcyklovir, valacyklovir a pencyklovir byli vyzkoušeny v polovině devadesátých let. Těmito antivirotiky bylo léčeno již mnoho milionů lidí (Bacon et al., 2003). Rezistence k acykloviru je spojována s mutacemi v jednom nebo druhém virovém enzymu, které jsou spojovány s acyklovirovým mechanismem působení, tedy thymindinkinasou a DNA polymerasou. Velmi časté jsou mutace vyskytující se ve virovém genu kódující TK a u 95% ACV-rezistentních izolátů se vyskytuje TK deficientní fenotyp (Morfin et al., 2003). Mohou být identifikovány tři rozdílné typy acyklovir rezistentních TK mutantů: TK-negativní (TKN), TK-parciální (TKP) a TK-alternativní (TKA). TKN mutanty postrádají TK aktivitu, zatím co TKP mutanty vykazují sníženou hladinu TK aktivity. TKA mutanty jsou substrátově specifické, které fosforylují thymidin, ale nikoliv acyklovir. Funkční DNA polymerasa je esenciální pro virovou replikaci, zatímco TK nikoliv. Proto tedy vyšší pravděpodobnost životaschopnosti ACV-rezistentního viru umožňují mutace v TK genu, spíše než mutace v DNA polymerase. 29
HSV TK je 376 aminokyselinový protein, který je kódovaný genem 1128 bp (UL23). Darby a kolektiv v roce 1986 zjistil, že ATP vazebné místo se nachází na aminokyselinách 51-63 a nukleosidové vazebné místo na aminokyselinách 168-176. Aminokyseliny 50-66, 79-91, 162178, 212-226 a 281-292 se nacházejí také v konzervovaných oblastech.
Obr.č.4: Krystalová struktura HSV 1 Thymidin kinasy (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=16201)
Genetické studie ACV rezistentních a ACV citlivých izolátů odhalily rozsáhlou míru polymorfismů v HSV genu kódujících TK. Mutace, které nesouvisejí s rezistencí, jsou všechny lokalizovány vně TK aktivního místa. U mutací, které mohou být spojovány s rezistencí, byla polovina z nich způsobena insercí nebo delecí nukleotidu a druhá polovina substitucí nukleotidu. Nukleotidové inserce nebo delece jsou zodpovědné za posunutí a syntézu zkrácené, nefunkční TK. Jsou často lokalizovány v homopolymerních repeticích guaninů nebo cytosinů. Mutace byly nalezeny několikrát v repeticích umístěných v kodónu 92 (5 guaninů) a v kodónu 146 (7 guaninů). Posunová mutace v 7G homopolymeru kodónu 146 je nejčastější mutace uváděná v ACV rezistentním HSV izolátu. Substituce argininu 176 HSV 1 a 177 HSV 2 byly nalezeny v klinických vzorcích, často také byla nalezena modifikace aminokyseliny 336. HSV DNA polymerasa je 1235 aminokyselinový protein, kódovaný 30705 bp genem (UL 30). Zahrnuje osm oblastí, které jsou označeny I-VII podle jejich stupně zachování ( oblast I je nejvíc zachována) +1 oblast je nazvána A.
30
Obr.č.5: Krystalová struktura HSV 1 DNA polymerasy (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=39467)
Mutace uvedené v DNA polymerase ACV rezistentní HSV jsou hlavně lokalizované v konzervovaných oblastech, speciálně v oblastech II a III, které zahrnují více než 40% mutací spojovaných s rezistencí (Morfin et al., 2003). Ačkoliv doposud všechny testované TKN mutanty jsou zkříženě rezistentní k pencykloviru a acykloviru, určité acyklovir rezistentní TKA řetězce a acyklovir rezistentní DNA polymerasové mutanty jsou citlivé nebo velmi citlivé k pencykloviru. Klinický význam těchto neobvyklých mutantů je nejistý. Klinické a laboratorní zkušenosti ukazují jen s velmi vzácnými výjimkami, že acyklovir rezistentní mutanti se zdají být neschopní iniciovat latentní infekci následnou reaktivací. Samozřejmě to může být způsobeno chybou v expresní funkci TK, což je vlastnost, typická u téměř všech rezistentních HSV mutantů, která je příčinou jejich neschopnosti se reaktivovat. Tisíce HSV vzorků sesbíraných z celosvětových pokusů a sledovacích programů za posledních 20 let bylo testováno na citlivost vůči acykloviru a pencykloviru. Objevily se dva shodné nálezy. Rozšíření acyklovir rezistentního HSV je vyšší u imunokomprimovaných pacientů než u imunokompetentních pacientů. Není záznam o jakémkoliv zvýšení rozšíření odolného HSV jak u imunokomprimované, tak i u imunokompetentní populace během tohoto období (Bacon et al., 2003).
31
2.3.2.1. Stanovení citlivosti herpes simplex viru k antivirovým léčivům In vitro hodnocení HSV citlivosti k antivirovým léčivům je založené na stanovení inhibice virové replikace za přítomnosti zvyšující se koncentrace antivirového léčiva. K určení virové replikace se využívají tři techniky: „plaque reduction assay“ (PRA), které je srovnávací technikou; DNA hybridizační test a barevná absorpční metoda. Poslední dvě metody jsou používané méně často, jelikož čtení cytopatických efektů je zautomatizováno. Tyto techniky poskytují stanovení koncentrace antivirových léčiv vedoucí k 50% inhibici virové replikace (IC50). Aby se mohlo rozlišit mezi citlivými a rezistentními řetězci, hranice IC50 je definována pro každý virus a antivirové léčivo. Hodnoty IC50 jsou obvykle stanovené podle spodní hodnoty získané pro citlivé viry. Ideální je detekce rezistence sledováním vývoje hodnot IC50 použitím sekvenčních izolátů (Morfin et al., 2003). Za prahovou hodnotu pro stanovení rezistence k acykloviru je obvykle považována koncentrace 2 mg.l-1 (Weinberg et al., 2007). HSV izolát je citlivý k acykloviru, jestliže IC50 je menší než 2 mg.l-1 a rezistentní, když IC50 je větší nebo rovna 2 mg.l-1 (Cotarelo et al., 1999). Při PRA se nejprve na mikrotitrační destičku adsorbuje buněčná monomolekulární vrstva, která se infikuje virovými izoláty, naředěnými tak, aby poskytovaly 50 plaků na jamku destičky. Následně se v duplikátu přidává 2% agaróza obsahující antivirové léčivo o určité koncentraci. Destička je po té inkubována až do vytvoření zřetelně viditelných plaků u kontrolních neléčených vzorků, a dále se fixují a obarvují krystalovou violetí. Po té se spočítá počet plaků a určí se IC50 (Weinberg et al., 2007). Tyto fenotypické metody vyžadují předcházející izolaci virových řetězců na buněčných kulturách, která je zdlouhavá a zdržuje adaptaci antivirové léčby podle citlivosti in vitro (Morfin et al., 2003). Proto se tedy vyvinula rychlejší metoda na stanovení citlivosti HSV k antivirovým léčivům. Jedná se o kvalitativní metodu, která je založená na PRA a využívající cytopatický efekt. Virové izoláty se postupně ředí a jsou očkovány na monomolekulární vrstvu Vero buněk rostoucí v 96-jamkové destičce, obsahující EMEM (Eagle´s minimum essential medium) s 2% rozpouštědlem FCS (fetal calf serum), 1% glutamin a antimikrobiální penicilin, streptomycin a amfotericin B. Pro každý HSV izolát se používají tři sady následného ředění (1:10), první bez antivirové částice, druhá s acyklovirem (2 mg . l-1) a třetí s foskarnetem (100 mg . l-1). Antivirotikum se vynechává v první jamce každé sady, která slouží jako růstová kontrola. Použitím kontrolních jamek se prokazuje, že růstové médium na Vero buňkách není toxické. Destičky se poté inkubují při 37°C s 5% CO2 na 72 hodin. Po inkubaci se pomocí inverzního světelného mikroskopu pozoruje tvorba cytopatického efektu. Titrem HSV izolátu 32
je nejvíc ředěný izolát, u kterého je detekován růst HSV. Izolát se považuje za citlivý k antivirovým částicím, pokud je titr obsažený v setu bez antivirotika nejméně o jeden log
10
větší než ten, který má v jamkách antivirovou částici. Pokud titry obsahující antivirové částice se rovnají s titry bez antivirových částic, jsou izoláty považovány za rezistentní k těmto částicím, protože nebyly inhibovány antivirotiky. Výsledky získané použitím rychlé metody se potvrdily i jinými metodami. Hlavními výhodami této metody je nejen rychlost, ale také jednodušší provedení i reprodukovatelnost než u PRA a navíc nevyžaduje titraci inokula (Cotarelo et al., 1999). Genotypické testy se nyní vyvíjejí k detekci rezistentních virů za krátký čas. Virové geny kódující dva cíle antivirových léčiv (TK a DNA polymerasa) jsou amplifikovány pomocí PCR a produkty jsou dále sekvenovány. Obtížnost spočívá v nalezení četné nukleotidové substituce a její následné označení za mutaci, která je a nebo není zodpovědná za rezistenci (Morfin et al., 2003).
2.3.3. Metody stanovení antivirotik Měření koncentrace acykloviru a podobných sloučenin představuje částečně závažný problém, protože tyto léčiva mají sklon být strukturně podobné endogenním substancím. Navíc se mohou metabolizovat na produkty, které by ztěžovaly stanovení společnou elucí s původními sloučeninami. Stanovení antivirových léčiv tedy vyžaduje užití vysoce selektivních analytických technik. První volbou pro stanovení obsahu acykloviru a podobných sloučenin v lidských tekutinách jsou chromatografické metody, mezi kterými dominuje reverzně fázová HPLC. K dalším navrhovaným technikám patří ELISA a radioimunoanalýza (RIA). Zmiňované imunologické metody mají nevýhodu především v dlouhém časovém intervalu, který je potřebný k získání konečných kvantitativních výsledů, dále v četnosti pipetovacích kroků a nutnosti vyvinutí antiséra a monoklonálních protilátek (Loregian et al., 2001). Navíc RIA vyžaduje manipulaci s radioaktivními izotopy (Fernández et al., 2003). Nejnovější trendy směřují k užití kapilární zónové elektroforézy a micelární elektrokinetické chromatografii. Kapilární elektroforéza s vyšším počtem teoretických pater, kratším separačním časem, adekvátním limitem detekce a nepotřebou organické mobilní fáze může být vhodným analytickým nástrojem pro rutinní užití a nahradit tak konvenční reverznífázovou HPLC.
33
2.3.3.1. Chromatografické metody (HPLC) Mezi chromatografickými techniky je pro stanovení antivirových léčiv široce používaná reverzně fázová vysokoúčinná kapalinová chromatografie, protože poskytuje rychlou, přesnou, citlivou a částečná či plně automatizovanou analýzu. Stacionární fází jsou nepolární C18 silikátové kolony dlouhé od 7,5 do 30 cm. Různí autoři navrhují rozdílné mobilní fáze a eluce nastává snižováním polarity mobilní fáze. Separace se převážně uskutečňuje při pokojové teplotě (Loregian et al., 2001) a nebo se mohou používat termostabilní kolony umožňující chromatografii při regulované teplotě (Fernández et al., 2003). Pro analýzu při rychlosti průtoku 1,0-1,5 ml za min postačuje časový interval menší než 10 minut. Detekce většinou probíhá pomocí UV (měření absorbance při 250-254 nm) nebo fluorescenčního (λex = 260-285 nm, λem = 375-380 nm) detektoru. Stanovení antivirových léčiv v plasmě nebo séru pomocí reverzně fázové HPLC vyžadují zpracování vzorků před samotnou analýzou (Loregian et al., 2001). Některé studie využívají pouze centrifugaci plasmy a supernatan přímo injektují do chromatografické kolony. Častěji se provádí deproteinizace pomocí kyseliny trichloroctové, trifluoracetové a nebo roztokem síranu hlinitého. Uvedené techniky neposkytují adekvátní purifikaci extraktů (Fernández et al., 2003) a injekce kyselého supernatanu vede k četným pozdě-eluujícím píkům. Je tedy nutný přechod z izokratické ke gradientové eluci. K překonání výše zmiňovaných problémů byly navrženy náplně pro extrakci na pevné fázi (Loregian et al., 2001). Příkladem je Waters Oasis HLB kolony, které obsahují polymerní náplň pro reverzní fázi s hydrofilními i lipofilními charakteristikami (Fernández et al., 2003). Acyklovir i gancyklovir jsou velmi polární a snadno ionizovatelné látky, a tak jsou mírně zachycovány apolární stacionární fází (s kapacitním faktorem nižším než 1), jako je C18 reverzně fázové kolony. V této souvislosti se navrhovalo užití iontově párových činidel, jako je dekanosulfát při kyselém pH. Tyto činidla snižují polaritu léčiv tím, že reagují s jejich polárními skupinami, a tak dochází ke zvýšení kapacitního faktoru. I když se zvyšuje selektivita a přesnost analýzy biologických vzorků, je obecně známa celá řada nevýhod iontově párové chromatografie: velmi silná interakce iontově párových sloučenin se stacionární fází, je tedy obtížné jejich následné uvolnění z kolony, poskytuje malou reprodukovatelnost retenčních časů a nízkou stabilitu (Merodio et al., 2000) (Huidobro et al., 2005). Byly popsány HPLC techniky stanovující acyklovir z plasmy pomocí fluorescenční detekce s velmi kyselou mobilní fází, která se užívá k zlepšení fluorescence. Ačkoliv tyto metody vykazují vyšší citlivost, kyselost mobilní fáze rychle ničí stacionární fázi, což má za následek 34
snížení životnosti kolony. HPLC s UV detekcí patří mezi velmi běžné techniky pro stanovení acykloviru, avšak některé z těchto metod mají limit detekce vyšší než 100 ng . ml-1, který není dostatečně citlivý pro farmakokinetické studie (Fernández et al., 2003). V dnešní
době,
vysokoúčinná
kapalinová chromatografie
ve
spojení
s hmotnostní
spektroskopií, se může stát populární analytickou technikou pro stanovení léčiv v biologických tekutinách, protože může poskytovat vyšší citlivost a selektivitu než tradiční metody (Heon-Woo et al., 2007). HPLC analýza acykloviru nebo gancykloviru v tělních tekutinách byla publikována četnými výzkumy, avšak není známo mnoho studií stanovující tyto antivirové částice souběžně (Teshima et al., 2003). Perrottet et al. při analýze acykloviru a gancykloviru v lidské plazmě metodou HLPC se spektrofluorimetrickou detekcí (exitace 260 nm a emise 380 nm) zvažoval vliv metabolitu acykloviru, 9-karboxymethoxymethylguaninu (CMMG), který může potenciálně zasahovat do eluce gancykloviru. Tento interferenční potenciál nevyžaduje velký zásah do metody, CMMG a gancyklovir mohou být efektivně separovány nepatrnou modifikací pH (Perrottet et al., 2007). Aycklovir a gancyklovir se také můžou souběžně stanovit reverzní fázovou chromatografií se spektrofotometrickou detekcí při 254 nm. Celková doba chodu byla přibližně 15 minut a limit detekce 10 ng . ml-1 pro obě sloučeniny. Proto tedy metoda může být účinně využívána pro rutinní sledování koncentrace acykloviru a gancykloviru v plasmě u imunokomprimovaných pacientů (Tehsima et al., 2003).
3. Materiál a metody Reagencie: Pro PCR techniky byly využity komerčně dostupné kity UltraClean Tissue DNA Kit (MoBio, USA), End-Point PCR HSV1/2 (Nanogen Advanced Diagnostics, Itálie), TaqManUniversal PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), dále primery HS11, HS12, BD1, BD2 a próby HS1S, SBDA (LMFR - Laboratoř speciálních technik molekulární biologie, ČR), vnitřní kontrola DECK (Nanogen Advanced Diagnostics, Itálie), agaróza (MoBio, USA), TBE pufr EliPhore (Elisabeth Pharmacon, ČR), ethidiumbromid (Top Bio, ČR). Acyklovir v nejvyšší dostupné čistotě byl získán od firmy PLIVA Lachema, a.s. a gancylovir z léčiva Cymevene, které vyrábí Roche, s.r.o. Ostatní chemikálie na přípravu roztoků byly od firmy Sigma-Aldrich (acetonitril), Penta (NaH2PO4 . 2H2O) a Serva (kyselina trichloroctová). Voda byla upravena systémem Milli-Q (Millipore).
35
Použité přístroje: Termocykleru TECHNE Gradient Real-Time PCR Systém ABI 7300 Centrifuga EPP 5417R (rotor 30 x 3,75 g) Třepačka IKA MS 1 MINISHAKER System chromatograf HPLC HP (hp series 1100) - kolona TSK gel ODS – 80 TM (15 cm × 4.6 mm, 5 µm) Předvážky KERN 440-33N Analytické váhy KERN ABJ 80-4M pH metr WTW inoLab Level 2 Míchadlo magnetické IKA RH basic 2 Centrifuga EPP MINISPIN (rotor 12 x 4 g)
3.1. DNA DIAGNOSTIKA HSV 1
3.1.1. Soubor osob Do studie, která probíhala od ledna 2005 do prosince 2007, v rámci studie podporované Interní grantovou agenturou Ministerstva zdravotnictví ČR (IGA MZČR), byli zařazeni pacienti z oční kliniky FN Brno Bohunice. Soubor tvořilo celkem 220 pacientů s podezřením na povrchové nebo hluboké keratitidy či keratouveitidy. Průměrný věk uvedených pacientů byl 42 ± 9,8 roku v rozmezí 4-82 let a jednalo se o 82 žen a 138 mužů.
3.1.2. Klinické vyšetření Klinické vyšetření pacientů bylo provedeno As. MUDr. Z. Hlinomazovou, Ph.D., MUDr. V. Loukotkovou, MUDr. E. Tokošovou, Ph.D. a zahrnovalo vyšetření zrakové ostrosti do dálky na Snellenových optotypech, klinické vyšetření na štěrbinové lampě a testování citlivosti rohovky. Dále následoval odběr slz pro DNA diagnostiku, poté byl změřen nitroočí tlak bezkontaktním tonometrem a bylo vyšetřeno oční pozadí. Konfokální mikroskopie se prováděla na přístroji Confoscan 4 firmy Nidek, a to u nejasných diagnóz, kdy klinický obraz ukazoval na infekci, ale výsledky PCR diagnostiky byly negativní. Dále u pacientů se suspektní metaherpetickou keratitidou k potvrzení či vyloučení
36
intracelulárních inkluzí aktivní keratitidy. Konfokální mikroskopií bylo vyšetřeno celkem 15 pacientů z celého souboru. U chronicky recidivujících pacientů byla pořizována fotodokumentace na fotoštěrbinové lampě Topcon 710, aby byly sledovány změny v závislosti na léčbě.
3.1.3. Odběr vzorků Každý pacient zařazený do studie předem podepsal informovaný souhlas s odběrem vzorků slz ze spojivkového vaku prováděný týmem lékařek viz. výše. Odběry byly prováděny pomocí sterilní mikropipety s filtrem a odběrového tampónu. Množství slz se pohybovalo v intervalu 30- 50 µl. Stěry z rohovky se získávaly speciálním odběrovým tamponem s nylonovými vlákny (kat.č. 516CS01, Copan). Odebrané vzorky slz a/nebo odběrové tampóny byly vloženy do transportního média izolačního kitu UltraClean Tissue DNA (MoBio, USA). Pro vyloučení kontaminace vzorků byly během celého odběru používány sterilní rukavice. Před odběrem vzorků nebylo použito žádné barvivo (fluorescein, Lyssajusova zeleň), aby nedocházelo ke zkreslení výsledků DNA diagnostiky. Dále nebylo použito žádné jiné diagnostické léčivo (mydriatika) ani lokální anestetikum. U každého pacienta byly pořízeny celkem tři vzorky, které byly odebírány s odstupem 1-2 minuty. Další odběry byly prováděny podle klinického stavu pacienta v časovém rozmezí 7-10 dnů.
Obr.6: Znázorňuje odběr vzorků slz
37
Obr.7: Detailní pohled odběrový tampon s nylonovými vlákny
3.1.4. Izolace DNA Vzorky slz byly uchovávány v lednici při 4ºC, a to maximálně 2 dny před izolací DNA. Izolace virové DNA z odebraného vzorku byla prováděna pomocí komerčně dostupného izolačního kitu UltraClean Tissue DNA Kit (MoBio, USA). Tyto izolační kity jsou založené na principu kolonek využívajících silika membrány. DNA se váže k silika membráně, zatímco ostatní látky přes ni procházejí při centrifugaci.
Postup: Vzorek byl nejprve 20 sekund silně vortexován a následně krátce centrifugován. Pufr s uvolněnou DNA byl přenesen na kolonku a vzorek se centrifugoval (10 000 rpm., 1 min). Kolonka se dala do čisté mikrozkumavky, připipetovalo se 400 µl roztoku TD2 a centrifugovalo se (10 000 rpm., 1 min). Kolonka se opět předělala do čisté mikrozkumavky a centrifugovalo se (10 000 rpm., 1 min). Tento krok slouží k dokonalému odstranění zbytků roztoku TD2. Následovalo předělání kolonky do nové mikrozkumavky, připipetovalo se 50 µl roztoku TD3 a centrifugovalo se (10 000 rpm., 1 min). Poté se odstranila kolonka a v 50 µl elučního pufru byla vyizolovaná DNA.
38
3.1.5. Nested PCR Nested PCR sloužila jako referenční technika k navrhované Real-Time PCR „in house“ metodě. K detekci HSV1/2 byly využity kity, End-Point PCR HSV1/2 (Nanogen Advanced Diagnostics, Itálie), pro nested multiplex PCR. Jedná se o komerčně dostupné kity, které patří mezi diagnostické zdravotnické prostředky in vitro a nesou značku CE. Amplifikační kit umožňuje detekovat 50 vzorků. Součástí kitu je Taq DNA polymerasa a barevně odlišené 0,2 ml zkumavky pro první a druhý amplifikační krok. Zkumavky pro první amplifikační krok obsahují 40µl (vnějších primerů, dNTP, pufru) a pro druhý amplifikační krok 44 µl (vnitřních primerů, dNTP, pufru) a jsou doplněny 50 µl minerálního oleje.
Postup: Do mikrozkumavky s mixem pro první amplifikaci bylo přidáno 5 µl 0,2 U . µl-1 termostabilní DNA polymerasy a dále 5 µl vyizolované DNA. Následoval první amplifikační krok použitím termocykleru Techne Gradient (Techne, UK) dle následujícího schématu: počáteční denaturace při 94 °C 2 minuty 35 cyklů při 94 °C 30 sekund při 55 °C 30 sekund při 72 °C 30 sekund konečná extense při 72 °C 5 minut Poté bylo do mikrozkumavky s mixem pro druhou amplifikaci přidáno 5 µl 0,2 U . µl-1 termostabilní DNA polymerasy a 5 µl produktu z prvního amplifikačního kroku. Následoval druhý amplifikační krok, který byl totožný s prvním, lišil se pouze nižším počtem cyklů (30). Finální amplifikační produkty představovaly sekvence HSV DNA, 160 bp HSV 1 a 81 bp HSV 2. Detekce zmiňovaných fragmentů probíhala elektroforeticky při 80V na 2% agarózovém gelu pro velmi krátké fragmenty EliPhore, který byl barven ethidiumbromidem. Výsledný gel byl osvícený UV zářením a fotografován digitálním fotoaparátem Camedia 3030. Amplifikované DNA fragmenty byly srovnávány s pozitivní kontrolou. Pro zamezení získání falešně negativních výsledků (zamezení vlivu inhibicí) byla při PCR použita univerzální vnitřní kontrola DECK (Nanogen Advanced Diagnostics, Itálie).
39
Obr. 8: Detekce HSV1 pomocí kitu End-Point PCR HSV1/2. První a třetí pozice představovala prázdný běh. V druhé pozici jsou vidět bandy délkového standardu. Čtvrtá pozice ukazuje HSV negativní výsledek, kde se amplifikovala pouze vnitřní kontrola. V páté pozici jsou vidět bandy HSV pozitivních kontrol, kde HSV 1 – horní proužek a HSV 2 – dolní proužek. Šestá pozice ukazuje HSV1 pozitivní výsledek, u kterého se zřejmě v důsledku nedostatku primerů neamplifikovala vnitřní kontrola.
3.1.6. Real-time PCR Real-time PCR„in house“ metoda byla zavedena k analýze HSV 1. Primery specifické k HSV 1 templátové DNA (gpD) byly navrženy pomocí softwaru Primer Express 2.0.0. ze sekvence NC_001806 uložené v databázi GenBank (National Center for Biotechnology Information). K detekci amplifikačních produktů byl používán přístroj ABI 7300 (Applied Biosystems, USA), který umožňoval sledovat PCR produkty v reálném čase.
Real-time PCR využívala k detekci HSV1 primery HS11 5’- CAC CGA ATG CTC CTA CAA CA - 3’, HS12 5’- TCG GTG CTC CAG GAT AAA CT - 3’a sondu HS1S 5’- CCC CGC TGG AAC TAC TAT GA - 3’. Sonda byla na svém 5’-konci značena fluorescenční
40
barvou FAM (absorpce při 494 nm, emise při 518 nm) a na 3’-konci zhášečem ECLIPSE. Také se používala inhibiční kontrola BDNF, k níž byly specifické primery BD1 5’-TCA AGA GGC TTG ACA TCA TTG - 3’, BD2 5’-TCA TTG GGC CGA ACT TTC - 3’ a sonda SBDA se sekvencí 5’- ACT TTC GAA CAC ATG ATA GAA GAG CTG T- 3’, značená na 5’-konci Yakima Yellow (absorpce při 525 nm, emise při 548 nm) a na 3’-konci zhášečem ECLIPSE. Reakční směs o celkovém objemu 25 µl obsahovala 20 µl amplifikačního mixu [12,5 µl TaqManUniversal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,5 µl každého z primerů o koncentraci 50µM (LMFR - Laboratoř speciálních technik molekulární biologie) 0,5 µl příslušné próby o koncentraci 6,25 µM (LMFR - Laboratoř speciálních technik molekulární biologie), 6 µl vody] a 5 µl izolované DNA.
Postup: Před izolací DNA se do každého vzorku napipetovalo 20 µl inhibiční kontroly. Izolace DNA se prováděla dle výše uvedeného postupu. Detekce HSV1: Do mikrozkumavky se nejprve nepipetovalo 20 µl amplifikačního mixu pro HSV 1 a přidalo se 5 µl vyizolované DNA. Detekce inhibiční kontroly (IC): Do mikrozkumavky se nejprve nepipetovalo 20 µl amplifikačního mixu pro IC a přidalo se 5 µl vyizolované DNA. Připravená destička s mikrozkumavkami se následně vložila do přístroje pro real-time PCR, který využíval program pro absolutní kvantifikaci. Po počáteční denaturaci trvající 2 minuty při 50°C a 10 minutách při 95°C byla DNA amplifikována v tříkrokových cyklech 40x denaturace 20 s při 95°C, annealing 20 s při 55°C a extenze 32 s při 72°C. Po ukončení amplifikace bylo provedeno automatické vyhodnocení výsledků. U pozitivních výsledů byla stanovena hodnota Ct (Cycle Treshold), která udávala počet cyklů, při němž došlo k prokazatelnému zvýšení fluorescence. Pozitivita vzorku byla ještě vizuálně posouzena s ohledem na charakteristický tvar amplifikační křivky. V případě, že byl výsledek negativní, nedocházelo k amplifikaci a tedy i k nárůstu fluorescence. Inhibiční kontrola se však amplifikovala pokaždé.
41
Obr.9: Obrázek ukazuje rozdíly pozitivního a negativního výsledku při detekci HSV 1 pomocí real-time PCR.
42
Kvantifikace HSV 1 DNA byla provedena metodou real-time PCR prostřednictvím kitu EliGene HSV 1 RT. Součástí kitu byly standardy o koncentraci 107, 106, 105, 104, 103, 102 virových částic . µl-1, které sloužily pro sestavení kalibrační křivky. Amplifikace a kvantifikace probíhala dle standardního postupu uvedeného v návodu k použití.
Obr.10: Na obrázku jsou znázorněny amplifikační křivky standardů o koncentraci 107, 106, 105, 104, 103, 102 virových částic . µl-1 kitu EliGene HSV 1 RT.
Pro vyloučení falešně pozitivních výsledků, které by mohly být způsobeny kontaminací v průběhu odběrů vzorků i DNA analýz, bylo prováděno slepé testování. Do laboratoře byly bez upozornění mezi vzorky náhodně přimíchávány čisté odběrové tampóny v transportním mediu izolačního kitu UltraClean Tissue DNA (MoBio, USA), opatřeny kódy smyšlených pacientů. V průběhu studie nebyl zaznamenaný falešně pozitivní výsledek.
43
3.2. STANOVENÍ ACYKLOVIRU A GANGYKLOVIRU V SLZÁCH POMOCÍ HPLC Při zavádění metodiky pro stanovení acykloviru a gancykloviru v slzách pomocí reverzně fázové HPLC se vycházelo ze studie s názvem, A simple and simultaneous determination of acyclovir and ganciclovir in human plasma by high-performance liquid chromatogramy, kterou publikoval D. Teshima et al. (2003). Ke kvantitativní analýze vzorků slz se využívala metoda extrerního standardu, kdy se proměřily jednotlivé koncentrace standardů acykloviru a gancykloviru. Z naměřených dat byly sestrojeny kalibrační křivky, které umožňují vypočítat koncentraci acykloviru a gancykloviru v slzách pacientů.
Příprava vzorku: Před samotným stanovením byly ze vzorku odstraněny proteiny, a to srážením s kyselinou trichloroctovou (TCA). Jelikož se jednalo o vzorky slz, tak jediným vysráženým proteinem byl zřejmě lysozym.
Postup: Nejprve se zmražené vzorky slz centrifugovaly 1 minutu při 12 000 rpm. K 10 µl slz se napipetovaly 2 µl 100 % TCA a následovala 30 minutová inkubace v lednici. Dále se vzorky centrifugovaly 5 minut při 15 000 rpm. Ze supernatantu se odebralo 10 µl, ke kterým se přidalo 20 µl Milli-Q vody.
Parametry HPLC: Do HPLC systému bylo pomocí autosampleru nastříknuto 20 µl upravenové vzorku slz. Mobilní fázi tvořila směs 20 mM fosfátového pufru o pH 3,0 a acetonitrilu v poměru 70:2 (1,56 g NaH2PO4 . 2H2O + 14 ml acetonitrilu do 500 ml Milli-Q vody) a byl nastavený průtok 1 ml za minutu. Celková doba analýzy pro jeden vzorek činila 17 minut. V průběhu analýzy bylo nutné promytí kolony, proto od 10 do 12 minuty byla mobilní fáze mísena s čistým acetonitrilem v poměru 1:1. Detekce byla provedena pomocí DAD detektoru (Diode Array Detektor), který je tvořen sadou fotodiod. DAD tedy detekuje i kvantifikuje látky při více vlnových délkách (v našem případě 254 -360 nm), což umožní získat chromatogram i optické spektrum jednotlivých frakcí. 44
4. Výsledky a diskuze 4.1. DNA DETEKCE VIRU HSV 1 Do DNA diagnostiky bylo zařazeno 212 pacientů. Celkem bylo provedeno 636 detekcí HSV 1 DNA metodou real-time PCR. Referenční metodou nested PCR bylo detekováno 50 vzorků. U obou zmiňovaných metod byla zaznamenána shoda výsledků ve 100%.
212
HSV 1 pozitivní pacienti počet % 85 40
HSV 1 negativní pacienti počet % 127 60
celkem HSV 1 DNA detekcí 636
pozitivní HSV 1 DNA detekce počet % 197 31
negativní HSV 1 DNA detekce počet % 439 69
celkem pacientů
Tab.č.1: Tabulka zobrazuje zastoupení pozitivních a negativních pacientů i HSV 1 DNA detekcí.
Jak ukazuje výše uvedená tab.č.1 bylo zaznamenáno 85 pacientů HSV 1 pozitivních, což odpovídá 40% z celého souboru. U zbylých 127 pacientů nebyla detekována HSV 1 DNA, avšak 39 pacientů bylo infikováno jinými viry, jako jsou adenoviry, VZV, EBV nebo HSV 2. 60% negativních výsledků naznačuje, že diagnóza herpesvirových zánětů rohovky stanovená na základě klinického vyšetření není zcela jednoznačná, což může způsobit primárně chybné určení diagnózy.
Absolutní kvantifikace HSV 1 DNA byla nejprve provedena u standardů kitu EliGene HSV 1 RT pomocí metody real-time PCR. koncentrace standardu 7 10 virových částic . µl-1 106 virových částic . µl-1 105 virových částic . µl-1 104 virových částic . µl-1 103 virových částic . µl-1 102 virových částic . µl-1
Ct 20,6 23,9 27,2 30,6 34,1 38,4
Tab.č.2: Tabulka ukazuje hodnoty Ct jednotlivých standardů kitu EliGene HSV 1 RT
45
Hodnoty uvedené v tab.č.2 jasně naznačují, že Ct je nepřímo úměrné koncentraci virových částic. Z naměřených hodnot Ct, které odpovídají příslušným koncentracím standardů, mohla být sestrojena kalibrační křivka pro kvantifikaci HSV 1 DNA vzorků slz.
Graf č.1: Zobrazuje kalibrační křivku standardů kitu EliGene HSV 1 RT, která ukazuje závislost hodnoty Ct na logaritmu koncentrace standardů HSV1 DNA.
U HSV 1 pozitivních pacientů byla absolutní kvantifikace virové DNA prováděna opakovaně, a to vždy s odstupem 7 – 10 dnů. Vzorky byly pro zjednodušení výsledků rozděleny vzhledem ke kvantitě na silně pozitivní, které představovaly koncentraci 107-104 virových částic . µl-1; středně pozitivní s koncentrací 104-102 virových částic . µl-1 a slabě pozitivní s koncentrací menší než 102 virových částic . µl-1.
46
pacienti
1. odběr
2. odběr
3. odběr
4. odběr
silně pozitivní 107- 104 virových částic . µl-1
18
-
-
-
48
33
16
16
19
40
27
-
-
12
42
69
středně pozitivní 104- 102 virových částic . µl-1 slabě pozitivní <102 virových částic . µl-1 negativní
Tab.č.3: Tabulka ukazuje výsledky kvantitativní analýzy HSV 1 DNA před léčbou (1.odběr) a v průběhu léčby (2.-4. odběr).
Kvantitativní analýza tedy umožnila u pacientů sledovat množství virových částic obsažených na µl vzorku slz před zahájením léčby a také po zavedení léčby virostatiky.
Graf č.2: Znázorňuje zastoupení pacientů jednotlivých stupňů pozitivity před léčbou, tedy v čase 0 a po zahájení léčby acyklovirem vždy v týdeních časových intervalech.
47
Z uvedeného grafu č.2 vyplývá, že po zavedení léčby acyklovirem dochází v průběhu 8,5 ± 1,5 dne k značnému poklesu koncentrace virových částic. Průměrně se jedná o 7,5 ± 3,1 cyklu. A po tří týdenní léčbě byla většina pacientů HSV 1 negativní. Výjimku tvořila skupina 16 středně pozitivních pacientů.
Pacienti byli léčeni v případě prvního ataku superficiální keratitidy pouze lokálním acyklovirem (3% Zovirax), a to 5x denně. Druhá a další ataka byla podpořena systémovou léčbou acyklovirem (Herpesin), který byl podáván 5 x denně v dávce 400 mg. Účinnost léčby bylo možné hodnotit z poklesu kvantifikované HSV DNA v průběhu léčby. U HSV 1 pozitivních pacientů byl pozorován nárůst hodnot Ct v čase. U 16 pacientů byly získávány stále pozitivní výsledky s hodnotou Ct v průměru 33,8 ± 0,3. Bylo zřejmé, že tito pacienti nereagovali na léčbu acyklovirem, a proto se označili jako acyklovir rezistentní.
čas [dny] 0 7 14 21 28
hodnota Ct ACV rezistentní HSV 1 pozitivní pacienti pacienti 33,8 25,1 34,2 32,6 33,6 34,6 33,7 50 33,5
Tab.č.4: Zobrazuje hodnoty Ct u souboru pacientů acyklovir rezistentních pacientů a u ostatních HSV 1 pozitivních pacientů v příslušných dnech.
48
Graf č.3: Ukazuje časovou závislost hodnoty Ct v průběhu léčby acyklovirem u HSV 1 pozitivních pacientů a u acyklovir rezistentních pacientů.
Z grafu č.3 je vidět, že v průběhu léčby acyklovirem docházelo u HSV 1 pozitivních pacientů k zvyšování hodnot Ct, a tím k poklesu kvantity HSV 1 DNA. Avšak u skupiny acyklovir rezistentních pacientů byly hodnoty Ct téměř konstantní.
Diagnostika acyklovir resistentních pacientů byla velmi zásadní pro jejich další léčbu. V souboru byly zaznamenány 3 primoinfekce bez reakce na acyklovir a 13 pacientů bylo již dříve léčeno různými druhy antivirotik bez výrazného efektu. Acyklovir rezistentní pacienti byli následně přeléčeni gancyklovirem v lokálním podání (0,15% Virgan gel) a v případě stále trvajících obtíží byl podáván gancyklovir systémově parenterálně (Cymevene inj.) s přechodem na tabletovou formu valgancyklovir (Valcyte tbl.) v dávkování 480 mg jednou denně po dobu max. dvou měsíců. Všichni pacienti, u kterých následkem léčby klesaly hodnoty virových částic, vykazovali i zlepšení klinického nálezu ve srovnání s původním stavem.
49
4.2. STANOVENÍ KONCENTRACE ACV A GCV V SLZÁCH POMOCÍ HPLC U pacientů s recidivujícími keratokonjunktivitidami byla sledována koncentrace acykloviru a gancykloviru v slzách, použitím reverzně fázové HPLC, jako odezva na podání různých lékových forem antivirotik.
Kalibrace ACV: koncentrace ACV [µg . ml-1] 0,01 0,10 1,00 10,00
plocha píku 1,7 16,2 169,5 1711,8
Tab.č.5: Ukazuje hodnoty ploch píků pro příslušné koncentrace standardu acykloviru.
Kalibrace GCV: koncentrace GCV [µg . ml-1] 0,01 0,10 1,00 10,00
plocha píku 5,4 21,0 218,2 2135,0
Tab.č.6: Ukazuje hodnoty ploch píků pro příslušné koncentrace standardu gancykloviru.
50
Obr.č.11: Obrázek ukazuje příklad chromatogramu standardu acykloviru o koncentraci 10 µg . ml-1.
Obr.č.12: Obrázek ukazuje příklad chromatogramu standardu gancykloviru o koncentraci 10 µg . ml-1.
51
Z výše uvedených chromatografů je zřejmé, že retenční časy acykloviru a gancykloviru se od sebe značně liší. Což umožňovalo v jednom vzorku slz provádět analýzu acykloviru a gancykloviru současně bez potřeby dalších úprav. Acyklovir měl v průměru retenční čas roven 6,6 minut a u gancykloviru průměrný retenční čas činil 5,5 minut.
Kromě retenčních časů bylo dalším kritériem pro identifikaci píků chromatogramu u jednotlivých vzorků slz charakteristické spektrum. Jelikož acyklovir a gancyklovir mají velmi podobnou chemickou strukturu, vykazují téměr identická optická spektra s absorbčním maximem při 254 nm.
Obr.č.13: Obrázek ukazuje optické spektrum gancykloviru s λmax při 254 nm.
Sledovaní pacienti byli léčeni paralelně systémově acyklovirem (Herpsin) a lokálně gancyklovirem (Virgan gel). Herpesin byl podávaný intravenózně 3x denně po osmihodinovém intervalu (v 6, 14 a 22 hod.). Infúze vždy obsahovala 250 mg acykloviru v 250 ml fyziologického roztoku. Virgan gel byl aplikován 3-4x denně a gram gelu obsahoval 1,5 mg gancykloviru. 52
Obr.č.14: Obrázek znázorňuje příklad chromatogramu vzorků slz.
Žádný vzorek slz boužel neposkytoval chromatogram, ve kterém by byl rozpoznatelný pík odpovídající acykloviru. U pacientů tedy nemohla být vypočítána koncentrace acykloviru. Důvodem zřejmě bylo malé množství slz, představující nedetekovatelnou koncentraci acykloviru. Kalibrační křivka se tedy sestrojila pouze pro gancyklovir.
53
Graf č.4: Na grafu je znázorněna kalibrační křivka gancykloviru.
Jednotlivé body grafu jsem proložila přímkou regrese, ze které jsem získala následující rovnici: y = 213,27x + 2,5559, která mi umožnila vypočítat koncentraci gancykloviru v jednotlivých vzorcích slz.
Pacient č.1: čas podání GCV [hod.] 6:45 11:05 13:55 Tab.č.6: Zobrazuje přesný čas lokální aplikace gancykloviru u pacienta č.1.
54
vzorek č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
čas odběru množství retenční čas vzorku vzorku [min.] [hod.] [µl] 6:00 10 7:00 10 5,56 8:00 10 5,45 9:00 10 10:00 10 11:00 5 12:00 10 5,56 13:00 10 5,57 14:00 5 5,57
plocha píku 2467,80 7,40 706,69 504,35 3700,48
vypočítaná koncentrace GCV [µg . ml-1] 11,56 0,02 3,30 2,35 17,34
Tab.č.7: Zobrazuje údaje vzorků slz od pacienta č.1.
V tab.č.7 i v níže uvedených tabulkách č.9 a 11 je vidět, že množství odebraných slz u všech vzorků nedosáhlo 10 µl. Tyto vzorky byly doplněny Milli-Q vodou na požadovaný objem a plochy píků se aproximovaly dle příslušného ředění. Retenční časy píků odpovídající gancykloviru se u jednotlivých vzorků v podstatě shodovaly.
Graf č.5: Ukazuje závislost koncentrace gancykloviru v µg . ml-1 na čase odběru vzorků slz u pacienta č.1, kterému byl podáván gancyklovir v 6:45, 11:05 a 13:55 hodin.
55
Z grafu č.5 je patrné, že koncentrace gancykloviru má strmější nárůst s klesajícím časovým intervalem mezi podáním léčiva a odběrem vzorku. Nejvyšší koncentrace gancykloviru 17,34 µg . ml-1 byla naměřena u vzorku č.9, který byl odebraný po 5 minutách aplikace Virgan gelu. U vzorku č.3, tedy 75 minut po podání léčiva byla koncentrace gancykloviru téměř nulová, avšak u vzorku č.8, který byl odebraný 115 minut po aplikaci léčiva činila koncentrace gancykloviru 2,35 µg . ml-1. Tyto rozdíly mohou být vysvětleny nestejnoměrným dávkováním Virgan gelu.
Pacient 2: čas podání GCV [hod.] 7:00 9:00 11:35 14:00 Tab.č.8: Zobrazuje přesný čas lokální aplikace gancykloviru u pacienta č.2.
vzorek č.
čas odběru vzorku [hod.]
množství vzorku [µl]
retenční čas [min.]
plocha píku
vypočítaná koncentrace GCV [µg . ml-1]
1 2 3 4 5 6
8:30 9:30 11:30 12:30 13:30 14:30
10 10 10 5 5 5
5,46 5,43 5,43 5,42 5,43
852,50 16,85 757,00 156,71 6154,6
3,99 0,07 3,54 0,72 28,85
Tab.č.9: Zobrazuje údaje vzorků slz od pacienta č.2.
56
Graf č.6: Ukazuje závislost koncentrace gancykloviru v µg . ml-1 na čase odběru vzorků slz u pacienta č.2, kterému byl podáván gancyklovir v 7:00, 9:00, 11:35 a 14:00 hodin.
I u pacienta č.2, jak ukazuje graf č.6, je vidět rostoucí koncentrace gancykloviru po podání léčiva. Nejvyšší koncentrace gancykloviru 28,85 µg . ml-1 byla naměřena u vzorku č.6, který byl odebraný po 30 minutách aplikace Virgan gelu. Stejný časový interval představoval i vzorek č.2, ale u něj koncentrace gancykloviru činila pouze 3,99 µg . ml-1. Rozdíl hodnot může být opět vysvětlen nestejnoměrným dávkováním Virgan gelu.
Pacient 3: čas podání GCV [hod.] 8:25 9:05 11:05 13:50 Tab.č.10: Zobrazuje přesný čas lokální aplikace gancykloviru u pacienta č.3.
57
vzorek č. 1 2 3 4
čas odběru množství vzorku vzorku [µl] [hod.] 9:00 10:00 11:00 14:00
5 5 10 10
retenční čas [min.]
plocha píku
vypočítaná koncentrace GCV [µg . ml-1]
5,42 5,43 5,42 5,43
3217,20 3683,40 1035,00 4386,20
15,07 17,26 4,84 20,55
Tab.č.11: Zobrazuje údaje vzorků slz od pacienta č.3.
Graf č.7: Ukazuje závislost koncentrace gancykloviru v µg . ml-1 na čase odběru vzorků slz u pacienta č.3, kterému byl podáván gancyklovir v 8:25, 9:05, 11:05 a 13:50 hodin.
U pacienta č.3 byly obecně naměřeny nejvyšší hodnoty koncentrací gancykloviru. U vzorku č. 2, který byl odebraný 55 minut po aplikaci Virgan gelu, koncentrace gancykloviru činila 17,26 µg . ml-1, což bylo asi 5 krát víc ve srovnání s pacienty č.1 a 2, kteří po hodinovém intervalu dosahovaly koncentrací gancykloviru 3,30 resp. 3,54 µg . ml-1.
58
Jelikož lidí trpících závažnou formou herpes virového zánětu rohovky s nutností hospitalizace není mnoho, byli analyzováni pouze tři pacienti. Odběr slz u těchto pacientů není zcela jednoduchý a objem 10 µl se ukázal jako nedostačující pro stanovení koncentrace systémově podávaných antivirotik. Z těchto důvodů nebylo možné sledovat hladinu acykloviru v slzách, která by ukazovala kolik léčiva se z infúze dostane přímo do oka, což mělo být prostředkem k následné optimalizaci dávkování finančně náročné antivirové léčby. Stanovení koncentrace gancykloviru v slzách bylo úspěšné, avšak jeho lokální aplikace ve formě gelu neumožnila přesně definovat obsah podaného léčiva. Díky tomu nebyl pozorovaný lineární pokles koncentrace gancykloviru s rostoucím časovým intervalem od podání Virgan gelu.
5. Závěr Virové záněty rohovky se stále řadí k obtížně léčitelným onemocněním a jejich diagnostika je pro oční lékaře problematická. Proto hlavním cílem mé diplomové práce bylo zavedení metodiky pro detekci HSV 1 DNA s využitím real-time PCR, která sloužila k potvrzení klinického nálezu u pacientů podezřelých na herpesvirovou infekci. Navrhnutá „in house“ metoda poskytovala velmi dobré výsledky, které se 100% shodovaly s referenční metodou nested PCR prováděnou pomocí komerčně dostupného kitu End-Point PCR HSV1/2 (Nanogen Advanced Diagnostics, Itálie). Během studie nebyl zaznamenán falešně pozitivní výsledek. Výhodou real-time PCR byla nejen rychlost a přesnost stanovení, ale také možnost absolutní kvantifikace HSV 1 DNA. Sledování kvantity viru v slzách a stěrech z rohovky se jevilo jako pomocný faktor při sledování účinnosti antivirové léčby. U pacientů bylo s poklesem kvantity HSV 1 DNA pozorováno zlepšení klinického nálezu. Důležitá byla také diagnostika acyklovir rezistentních pacientů, kteří se následně přeléčili gancyklovirem. Další část se pak zaměřila na vývoj metody pro stanovení antivirových léčiv, acykloviru a gancykloviru, v slzách pomocí HPLC. Systém využíval reverzně fázovou chromatografii, při které se uplatňovaly hydrofóbní interakce mezi relativně polární mobilní fází, polárním analytem a nepolární stacionární fází. Kvantitativní analýza standardů acykloviru a gancykloviru byla úspěšná, jejich eluce nastávala v rozdílných retenčních časech, což umožňovalo paralelní stanovení acykloviru a gancykloviru ve vzorcích slz. Studii však komplikoval nejen nízký počet pacientů, ale především nedostatečné množství odebraných
59
slz, ve kterém bylo možné detekovat pouze lokálně aplikovaný gancyklovir, ale bohužel ne systémově podávaný acyklovir.
Závěrem lze říct, že se podařilo zavést metodiku využívající real-time PCR pro detekci i kvantifikaci HSV 1 DNA. A reverzně fázová HPLC k stanovení koncentrace acykloviru a gancykloviru v slzách se ukazjuje jako principiálně schůdná, avšak dořešení problému množství vzorku by vyžadovalo delší výzkum.
60
6.Seznam použitých zkratek ACV
acyklovir
AIDS
acquired immunodeficiency syndrome
CMMG
9-karboxymethoxymethylguanin
CMV
cytomegalovirus
CNS
centrální nervový systém
Ct
Cycle Treshold
dGTP
deoxyguanosintrifosfát
dNTP
2'-deoxyribonukleosid-5'-trifosfát
EBV
Epstein-Barrové virus
EDTA
ethylendiamine-N,N,N´,N´- tetraaccetic acid
EIA
enzyme immunoaasay
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
EMEM
Eagle´s minimum essential medium
FCS
fetal calf serum
FITC
fluoresneinizothiokyanát
FRET
fluorescence resonance energy transfer
GAG
glykozoaminoglykany
GCV
gancyklovir
gG
glykoprotein G
G+C
guanin + cytosin
HIV
human immunodeficiency virus
HPLC
high pressure liquid chroatography
HSV
herpes simplex virus
IC50
50% inhibition of concentration
IFA
immunofluorescence assay
Ig
imunoglobulin
KCE
epidemická keratokonjunktivitida
LAT
latency-associated transcipts
MAb
monoclonals antibodies
Oct-1
octameric protein 1
PCR
polymerase chain reaction
61
PRA
plaque reduction assay
PTK
fototerapeutická keratektomie
Ta
annealing temperature
Taq
Thermus aquaticus
TCA
trichloraccetic acid
α-TIF
alpha transcription initiation factor
Tm
melting temperature
TRITC
tetramethylrhodaminizokyanát
VZV
varicella zoster virus
7. Seznam literatury Abdel-Haq, N., Al-Tatari, H., Asmar, B. (2006): New antiviral agents, Indian J Pediatr 73, 313-321.
Bacon, T. H., Levin, M. J., Leary, J. J., Sarisky, R. T., Sutton, D. (2003): Herpes Simplex Virus Resistance to Acyclovir and Penciclovir after Two Decades of Antiviral Therapy, Clinical Microbiology Reviews 16, 114-128.
Bednář, M., Fraňková, V., Schindler, J., Souček, A., Vávra, J. (1996): Lékařská mikrobiologie, Marvil, 558.
Burrows, J. Nitsche, A., Bayly, B., Walker, E., Higgins, G., Kok, T. (2002): Detection and subtyping of Herpes simplex virus in clinical samples by LightCycler PCR, enzyme immunoassay and cell culture, BMC Microbiology 2, 1-7.
Catty, D., Raykundali, C. (1990): Antibodies and practical approach, IRL, Oxford University, 2, 280.
Cotarelo, M., Catalán, P., Sánchez-Carrillo, C., Menasalvas, A., Cercenado, E., Tenorio, A., Bouza, E. (1999): Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility
62
of herpes simplex virus to antiviral agents, The Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44, 705
Coyle, P., V., Desai, A., Wyatt, D., McCaughey, C., O’Neill, H., J. (1999): A comparison of virus isolation, indirect immunofluorescence and nested multiplex polymerase chain reaction for diagnosis of primary and recurent herpes simplex type 1 and 2 infections, Journal of Virological Methods 83, 75-82.
Čihák, R. (1997): Anatomie 3, Grada Publishing, 655.
Diblík, P. et al. (2004): Diagnostika a léčba očních chorob v praxi, Triton, 618.
Fernández, M., Sepúlveda,. J., Aránguiz, T., von Plessing, C. (2003): Technique validation by liquid chromatography for the determination of acyclovir in plasma, Journal of Chromatography B, 791, 357-363.
Heon-Woo, L., Ji-Hyung, S., Kyung-Tae, L. (2007): Development and validation of highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of penciclovir in human plasma: Application to bioequivalence study, Journal of Chromatography B, 852, 382-388.
Huidobro, A., L., Rupérez, F., J., Barbas, C. (2005): LC methods for acyklovir and related impurities determination, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 37, 687-694.
Kleinschmidt-DeMasters, B., K., DeBiasi, R., L., Tyler, K.L. (2001): Polymerase Chain Reaction as a Diagnostic Adjunct in Herpesvirus Infections of the Nervous System, Brain Pathology 11, 452-464.
Khodadoost, M. A., Sabahi, F., Behroz, M., J., Roustai, M., H., Saderi, H., Amini-BavilOlyaee., S., Arzenani, M., K. (2004): Study of Polymerase Chain Reaction-based Method for Detection of Herpesw Simplex Virus Type 1 DNA among –iranian Patients with Ocular Herpetic Keratitis Infection, Jpn J Ophtalmol 48, 328-332.
63
Koenig, M., Reynolds, K.S., Aldous, W., Hickman, M. (2001): Comparison of Light-Cycler PCR, enzyme immunoassay, and tissue culture for detection of Herpes Simplex Virus, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 40, 107-110.
Kraus, H., Boguszaková, J., Diblík, P., Dotřelová, D., Filipec, M., Hycl, J., Karel, I., Kocur, I., Kraus, H., Křepelková, J., Kuchynka, P., Otradovec, J., Palečková, J., Peregrin, J., Řehůřek, J., Svěrák, J., Šedivý, A.3 (1997): Kompendium očního lékařství, Grada Publishing, 360.
Liljeqvist, J., A., Svennerholm, B., Bergström, T. (1999): Typing of Clinical Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 Isolates with Monoclonal Antibodies, Journal of Clinical Microbiology 37, 2717-2718.
Lincova, D., Farghali, H., et al. (2002): Základní a aplikovaná farmakologie, Galén, 672.
Loregian, A., Gatti, R., Palú, G., De Palo E. F. (2001): Separation methods for acyclovir and related antiviral compound, Journal of Chromatography 764, 289-311.
Lőllman, H., Mohr, K., Wehling, M. (2002): Farmakologie a toxikologie, Grada Publishing, 725.
Madhavan, H. N., Priya, K., Anand, A. R., Therese, K. L. (1999): Detection of Herpes simplex virus (HSV) genome using polymerase chain reakction (PCR) in clinical samples Comparsion of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV, Journal of Clinical Virology 14, 145-151.
Merodio, M., Campanero, M., A., Mirshahi, T., Mirshahi, M., Irache, J., M. (2000): Development of a sensitive method for the determination of ganciclovir by reversed-phase high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A 870, 159-167.
Morfin, F., Thouvenot, D. (2003): Herpes simplex virus resistance to antiviral drugs, Journal of Clinical Virology 26, 29-37.
64
Oláh, Z. et al. (1998): Očné lekárstvo: učebnica pre lekárske fakulty, Vydavatelstvo Osveta, Martin, 255.
Pandori, M., W., Lei, J., Wong, E., H., Klausner, J., Liska, S. (2006): Real-Time PCR for detection of herpes simplex virus without nucleic acid extraction, BMC –infectious Diseases 6, 1-9.
Perrottet, N., Beguin, A., Meylan, P., Pascual, M., Manuel, O., Buclin, T., Biollaz, J., Decosterd, L., A. (2007): Determination of aciclovir and ganciclovir in human plasma by liquid chromatogramy-spectrofluorimetric detection and stability studies in blood samples, Journal of Chromatography B, 852, 420-429.
Rajčáni, J., Čiampor, F. (2006): Lekárska virológia, VEDA, vydavateľstvo Slovenskej akadémie vied, Bratislava, 574.
Robert, P., Y., Liekfeld, A., Metzner, S., Ranger-Rogez, S., Adenis, J,. P., Denis, F., Hartmann, Ch., Pleyer, U. (2006): Specific antibody production in herpes keratitis: intraocular inflammation and corneal neovascularisation as predicting factors, Graef’s Arch Clin Exp Ophthalmol 244, 210-215.
Rozsíval, P., Hlinomazová, Z., Jirásková, N., Kocúr, I., Krásný, J., Otradovec, J., Říčařová, R., Vlková, E., Toušková-Zichová, M. (2003): Infekce oka, Grada Publishing, Praha, 228.
Rozsíval, P., Diblík, P., Dotřelová, D., Hejcmanová, D., Hlinomazová, Z., Horáčková, M., Jirásková, N., Kolář, P., Korda, V., Kuchynka, P., Mokrý, J., Odehnal, M., Pašta, J., Ředinová, M., Řehák, J., Řehořová, J., Říčařová, R., Synek, S., Továrek, L., Vlková, E., Výborný, P. (2006): Oční lékařství, Galén a Karolinum, Praha, 373.
Řehák, S. et al. (1989): Oční lékařství: učebnice pro lékařské fakulty, AVICENUM, zdravotnické nakladatelství, Praha, 254.
Scicchitano, L., M., Shetterly, B., Bourbeau, P., P. (1999): Evaluation of Light Diagnostics SimulFluor HSV/VZV Immunofluorescence Assay, DIAGN MICROBIOL INFECT DIS 35, 205-208. 65
Stöcher. M., Leb, V., Bozic, M., Kessler, H., H., Halwachs-Baumann, G., Landt, O., Stekel, H., Berg, J. (2003): Parallel detection of five human hepres virus DNAs by a set of real-time polymerase chain reactions in a single run, Journal of Clinical Virology 26, 85-93.
Šmarda, J., Doškař, J., Pantůček, R., Růžičková, V., Koptíková, J. (2005): Metody molekulární biologie, Masarykova univerzita v Brně, 188.
Teshima, D., Otsubo, K., Yoshida, T., Itoh, Y., Oishi, R. (2003): A simple and simultaneous determination of acyclovir and ganciclovir in human plasma by high-performance liquid chromatography, Biomed.Chomatogr. 17, 500-503.
Tran, T., H., C., Rozenberg, F., Cassoux, N., Rao, N., A., LeHoang, P., Bodaghi, B. (2003): Polymerase chain reaction analysis of aqueous humor samples in necrotising retinitis, British Journal of ophtalmology 87, 79-83.
Weidmann, M., Meyer-König, U., Hufert, F., T. (2003): Rapid Detection of Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster Virus Infections by Real-Time PCR, Journal of Clinical Microbiology 41, 1565-1568.
Weinberg, A., Leary, J. J., Sarisky, R. T., Levin, M. J. (2007): Factors that affect in vitro measurement of the susceptibility of herpes simplex virus to nucleoside analogues, Journal of Clinical Virology 38, 139-145.
www.bact.wisc.edu/themicrobialworld/hsv1struc.jpg
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=16201
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=39467
www.zelenyzakal.sk/images/Zeleny_zakal/cornea.jpg
Zhang, Y., Kimura, T., Fujuki, K., Sakuma, H., Murakami, A., Kanai, A. (2003): Multiplex Polymerase Chain Reaction for Detection of Herpes Simplex Virus Type 1, Type 2, 66
Cytomegalovirus, and Varicella-Zoster Virus in Ocular Viral Infections, Jpn J Ophthalmol 47, 260-264.
Želma, J., Čiampor, F., Labuda, M. (1998): Špeciálna virológia, SAP-Slovak Akademic Press, 226.
Želma, J., Čiampor, F., Leššo, J. (1995): Všeobecná virológia, SAP-SLOVAK ACADEMIC PRESS, 238.
67
