Metodika molekulární detekce viru žluté zakrslosti ječmene v jeho vektorech pomocí RT-PCR

VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I.

Metodika molekulární detekce viru žluté zakrslosti ječmene v jeho vektorech pomocí RT-PCR

foto: J. Jarošová, J. Ripl, E. Vlašánková

Metodika pro Státní rostlinolékařskou správu

Praha, 2009

Metodika molekulární detekce viru žluté zakrslosti ječmene v jeho vektorech pomocí RT-PCR

Ing. Jana Jarošová Ing. Blanka Jaňourová Ing. Jiban Kumar, Ph.D* Výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i. odbor rostlinolékařství, oddělení virologie Drnovská 507, 161 06 Praha-Ruzyně

*korespondujicí autor: e-mail: [email protected] Tato práce byla financována z projektu NAZV QH81269

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2009

ISBN: 978-80-7427-026-0

2

Anotace (česky): Žlutá zakrslost ječmene (Barley yellow dwarf - BYD) je jednou z nejdůležitějších virových onemocnění obilí jak v ČR, tak i celosvětově. Dokáže způsobit závažné ztráty na výnosech u většiny obilných druhů, jako pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, oves a žito. Virus žluté zakrslosti ječmene (Barley yellow dwarf virus - BYDV) je přenášeno výlučně několika druhy mšic žijících na obilninách. V této metodice uvádíme metody reverzní transkripce polymerázové řetězové reakci (RT-PCR) pro citlivou detekci BYDV v mšicích přenášejících tento virus včetně detailního popisu sběru a manipulace se vzorky. Anotace (anglicky): Barley yellow dwarf - BYD is one of the most important cereal diseases in the Czech republic and worldwide. It can cause significant economic losses in most cereal species such as wheat, barley, rice, corn, rye and oat. Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV) is transmitted solely by aphid species living on cereals and grasses. This methodology describes a reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for sensitive detection of BYDV in aphids including detailed description of samples’ collecting and handling.

Oponenti: Ing. Tomáš Růžička Státní rostlinolékařská správa Ztracená, 161 00 Praha 6 RNDr. Zdeno Šubr, CSc. Virologický ústav SAV Dúbravská 9, 84505 Bratislava, SR

3

Obsah 1

Cíl ....................................................................................................................................... 1

2

Vlastní popis metodiky ..................................................................................................... 1 2.1

Úvod ........................................................................................................................... 1

2.2

Současná klasifikace BYDV ...................................................................................... 2

2.3

Symptomatika ........................................................................................................... 3

2.4

Přenos BYDV ............................................................................................................. 5

2.5

Vektoři BYDV............................................................................................................. 7

2.5.1 Druhy mšic přenášející virus ............................................................................... 8 2.5.2 Způsob přenosu viru .......................................................................................... 10 2.6

Ekologie choroby .................................................................................................... 10

2.7

Diagnostika BYDV ................................................................................................... 11

2.7.1 RT-PCR ................................................................................................................. 12 2.7.2 Odběr vzorků ...................................................................................................... 12 2.7.3 Homogenizace ..................................................................................................... 13 2.7.4 Izolace RNA ......................................................................................................... 15 2.7.5 Vhodné primery pro RT-PCR ............................................................................. 19 2.7.6 RT-PCR ................................................................................................................. 19 2.7.7 Hodnocení diagnostické citlivosti a specifity ................................................... 21 2.8

Závěr ........................................................................................................................ 22

3

Srovnání „novosti“ postupů ........................................................................................... 23

4

Popis uplatnění metodiky .............................................................................................. 23

5

Seznam související literatury ......................................................................................... 23

6

Seznam publikací, které předcházely metodice ........................................................... 26

4

1 Cíl Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu pro spolehlivou detekci viru žluté zakrslosti ječmene v jeho vektorech. Pomocí včasné diagnostiky BYDV v jeho přenašečích mšicích je možno určit přibližný procentuální podíl infekčních jedinců přenašeče viru v porostu a tak předpovědět míru potenciální nákazy rostlin na daném území ještě před samotným nakažením rostlin nebo v jeho iniciálním stádiu.

2 Vlastní popis metodiky 2.1 Úvod

Žlutá zakrslost ječmene (Barley yellow dwarf - BYD) je jednou z nejdůležitějších virových onemocnění obilnin celosvětového významu. Dokáže způsobit závažné ztráty na výnosech u většiny obilných druhů, jako pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, oves a žito (Rastgou et al., 2005). Virus žluté zakrslost ječmene (Barley yellow dwarf virus-BYDV) jako původce choroby prokázali poprvé v roce 1951 Oswald a Houston. Téměř všechny rostliny z čeledi Poaceae (Gramineae) mohou být infikovány, tudíž přes 150 druhů slouží jako potencionální zdroje infekce (Bisnieks et al., 2004). BYDV se v ČR v poslední dekádě vyskytuje epidemicky u všech druhů obilnin. Z hlediska epidemiologie je velmi významná u ozimů, kde dochází k vysokým hospodářským ztrátám, intenzita napadení obvykle bývá tak vysoká, že takto napadené porosty jsou často zaorávány. Spolehlivá a časná detekce BYDV je velmi důležité pro účinná ochranná opatření vůči této viróze. Schopnost detekovat virus již ve vektorech - tj. v obilných mšicích umožňuje nejen infekci zjistit velmi brzy, ale i infekci částečně předcházet. Zjištěním počtu viruliferních mšic v porostech umožňuje použití insekticidní ochrany pouze v případě, v nichž je to ekonomicky nezbytné, což má za následek i příznivý dopad na životní prostředí. V této metodice uvádíme metody jedno krokové reverzní transkripce polymerázové řetězové reakci (one-step-RT-PCR) pro citlivou detekci viru žluté zakrslosti ječmene ve vektorech - mšicích Sitobion avenae (kyjatka osenní), Rhopalosiphum padi (mšice střemchová), Rhopalosiphum maidis (mšice kukuřičná) a Metopolophium dirhodum (mšice zhoubná), které jsou nejčastěji se vyskytující vektory

BYDV v ČR. Tyto metody byly vyvinuty v posledních letech výzkumu obilnin v našem oddělení.

Obrázek č. 1: Zaorávky pole ozimého ječmene totálně napadeného žlutou zakrslostí ječmene. (Foto, J. Kumar, VÚRV v.v.i.)

2.2 Současná klasifikace BYDV Choroba je způsobem osmi druhy virů (Chain et al., 2005) náležícími do rodu Luteovirus (BYDV-PAV, BYDV-PAS, BYDV-MAV a BYDV-GAV), Polerovirus (CYDV-RPV), nebo momentálně nezařazené druhy (BYDV-RMV, BYDV-SGV, BYDV-GPV) čeledi Luteoviridae (D`Arcy a Domier, 2005). Taxonomie virů žlutých zakrslostí ječmene prošla několika fázemi v souvislosti s rozvojem technologií schopných virus charakterizovat. Zpočátku byla taxonomie založena na specifičnosti přenosu mšicemi, hostitelích a křížové ochraně jednotlivých kmenů BYDVs. V současnosti, s ohledem na sérologické vlastnosti viru, cytopatologii a sekvence nukleových kyselin jsou viry žluté zakrslosti rozděleny do dvou hlavních rodů - Luteovirus - BYDV; přičemž existují minimálně dva sérotypy viru: BYDV-PAV a BYDV-MAV. Dřívější BYDV-RPV byl na základě novějších poznatků přeřazen do rodu Polerovirus jako Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV) (Miller et al., 2002). Kmen PAV byl později rozdělen na dva odlišné kmeny BYDV-PAV a BYDV-PAS, podle svých nukleotidových sekvencí genu pro obalový protein (Rastgou et al., 2005). Isoláty BYDV-PAS se liší ve více než 10% v nukleové sekvenci genu pro 2

obalový protein a výrazné odlišnosti se nachází i v jiných částech genomu (Bisnieks et al., 2004). BYDV-PAV je považován za nejrozšířenější virus v obilninách ve světě (D´Arcy, 1995). Vyšší výskyt PAV je dán větším poměrem přenosu a širokým spektrem preference přenašečů (Power, 2000). Kromě efektivity přenosu se jednotlivé kmeny liší i příznaky, preferencí hostitele a především sérologickými a molekulárními vlastnostmi. PAV se obvykle projevuje silnými příznaky onemocnění na obilninách (kroužkování listů). Některé odrůdy ječmene tolerantní k PAV mohou být vysoce náchylné k viru žluté zakrslosti obilnin kmenu RPV. Tento virus se často vyskytuje i na planých obilninách a travách (Lapierre et al., 2004), které jsou přirozeným rezervoárem i pro další kmeny BYDV. V ČR byly identifikovány pouze tři kmeny BYD – PAV, PAS a MAV (Kundu et al., 2009). Výskyt ostatních kmenů BYDV je v ČR aktuálně zkoumán.

2.3 Symptomatika Typickými symptomy napadení je zlatožluté až oranžové zbarvení listů a retardace růstu (obr.č. 6). Žloutnutí postupuje od špiček a okrajů listů a zachvacuje postupně celou listovou čepel. Žloutnutí většinou začíná 7 - 20 dnů po infekci a může být předcházeno tvorbou vodovatých skvrn na listech (D’Arcy, 1995). Zakrslost doprovází deformace listů a listových čepelí (u ovsa se listy stáčí do ruliček), redukce nadzemní i podzemní biomasy, poruchy v metání, sterilita kvítků, redukce počtu klásků a tvorba zadinového zrna. V dalším stádiu choroby se může objevovat nekróza cévních svazků a redukce kořenového systému. Napadené rostliny nemetají nebo nevytvářejí semena. Symptomy jsou v některých případech těžko odlišitelné od příčin neparazitického původu (Čača et al., 1981). Intenzita příznaků závisí především na době infekce. Čím dříve je rostlina infikována, tím bouřlivější je symptomatický projev a tím větší jsou ztráty na výnosu zrna. Ztráty na výnosech se pohybují v závislosti na lokalitě a ročníku mezi 11 až 47% (Zaharieva et al., 2001). U ječmene se setkáváme se žloutnutím, u pšenice, žita a tritikale obvykle se žloutnutím, občas červenáním, u ovsa s oranžověním až červenáním listů (obr.č. 5). Žloutnutí a červenání může přecházet v nekrózy, objevuje se zasychání listů a rostliny mohou odumírat. Na špičkách a okrajích starších listů kukuřice infikované BYDV se vytváří žluté, červené až nafialovělé skvrny (D’Arcy, 1995). Rostliny napadené viry jsou

3

rovněž náchylnější k biotickým (škůdci, houby) a abiotickým (mráz, sucho) stresům (Perry et al., 2000).

Obrázek č. 2. Příznaky BYDV na obilninách - zleva doprava pšenice, ječmen, oves. Vpravo zdravá rostlina. (Foto, J. Vacke, VÚRV Praha)

Obrázek č. 3. Žlutavě červená ohniska infekce. (Foto, J. Kumar, VÚRV v.v.i.)

4

2.4 Přenos BYDV Viry jsou všechny přenášeny mšicemi žijícími na Poaceae s různým stupněm specifičnosti přenosu (Dedryver et al., 2005). Přes 25 druhů mšic je známo jako přenašečů virů; viry se přenáší persistentně nepropagativně (cirkulativně) a jsou omezeny na floém infikovaných rostlin (Rastgou et al., 2005). Efektivnost přenosu Luteovirů je regulována mnohými faktory: hostitelskými rostlinami, environmentálními podmínkami, abundancí vektorů a povrchovou strukturou virionu. Přenos viru mšicemi je především závislý na molekulárních interakcích virionů s vektory (Gray & Gildow, 2003). Virus se nepřenáší vajíčky. Nymfy a dospělé mšice se stávají vironosnými při akvizičním sání na zdroji infekce již po 15 - 30 minutách. Cirkulační proces perzistentního viru přes zažívací trakt trvá cca 12 - 16 hodin, v přenašečích je virus stálý minimálně 120 hodin. Je přenášen při teplotách nad 12°C z důvodu vyšší letové aktivity mšic (Muška a Procházka, 2008). Obilniny jsou infikovány jednak na podzim (primární infekce), kdy jejich přenašeči migrují na vzcházející ozimy. Druhým obdobím je jaro až léto (sekundární infekce) od fáze sloupkování a později. Nejnebezpečnější jsou podzimní infekce, způsobené migrujícími infikovanými mšicemi z porostů trav a infikovaného výdrolu obilnin (Köhler, 2008). Každý serotyp je efektivně přenášen pouze omezeným počtem druhů mšic. Specificita vektoru u BYDV ovšem ne vždy koreluje se serotypem (Miller a Rasochová, 1997). Mezi nejefektivnější vektory jednotlivých kmenů BYDV patří: PAV Rhopalosiphum

padi

(mšice

střemchová),

Sitobion

avenae

(kyjatka

osenní),

Metopolophium dirhodum (kyjatka travní) a další, MAV - S. avenae a M. dirhodum, PAS - R. padi a S. avenae, RPV - R. padi, GPV - Schizaphis graminum (mšice obilná) a R. padi, RMV R. maidis (mšice kukuřičná), SGV - S. graminum (Rochow a Muller, 1971; Halbert et al., 1992; Power a Gary, 1995) (obr. č. 5&6). V Evropě je za jednoho z nejzávažnějších přenašečů považována mšice střemchová a kyjatka osenní, obzvláště pak kmenu PAV na jaře, kdy šíří virus z ozimých hostitelů (pšenice a ječmen) na jarní ječmen a kukuřici (Dedryver et al., 2005). Kromě R. padi, S. avenae a M. dirhodum (Honěk et al., 2006) se v ČR obvykle vyskytují i další přenašeči jako jsou S. graminum, R. maidis, Myzus persica (mšice broskvoňová), atd. V teplejších oblastech ČR se na obilních porostech hojně vyskytuje hlavně S. avennae, R. padi a R. maidis (Starý, 1996). V posledních letech se vzhledem k 5

dlouhodobému oteplování v ČR rovněž vyskytuje Diuraphis noxia (mšice zhoubná) (Starý, osobní sdělení). D. noxia může přenášet s velkou účinností kmen SGV (Halbert et al., 1992). Z hlediska životního cyklu mšic (Honěk et al., 2006) a epidemiologie BYDV v Evropě (Plumb, 1990) se dá předpokládat výskyt i ostatních kmenů BYDV v ČR.

Obrázek č. 4: Diagram přenosu viru mšicemi (zdroj: James et al. 2004)

6

Obrázek č. 5. Rhopalosiphum padi (nalevo) a Sitobion avenue (napravo). (Foto: P. Herrmann)

Obrázek č. 6. Schizaphis graminum - bezkřídlá forma (vlevo) a Rhopalosiphum maidis bezkřídlá forma (vpravo). (zdroj: College of Applied Science & Technology, ISU, USA)

2.5 Vektoři BYDV Všechny mšice sající na obilninách jsou potencionálními přenašeči BYDV stejně jako mšice sající na jiných Poaceae a Cyperaceae (Burnett, 1987). Mšice jsou sami o sobě závažnými škůdci obilných plodin, neboť ovlivňují produkci vysáváním živin z rostlin a tím působí zakrslost, malou velikost zrna, předčasný úhyn listů a také šíření BYDV(Stufkens a Teulon, 1998). BYDV se přenáší perzistentně cirkulativně nepropagativně (Burnett, 1987). Existuje vysoká variabilita specificity přenosu (Dedryver et al., 2005). Tato vysoká

7

specificita Luteoviridae poukazuje na specifické interakce mezi partikulami viru a buněčnými komponenty mšic, které tyto biologické mechanismy kontrolují (Papura et al., 2002). 2.5.1 Druhy mšic přenášející BYDV Virus je přenášen nejméně 25 druhy mšic perzistentním nepropagativním způsobem (Rastgou et al., 2005). Hlavními přenašeči jsou však rody Metopolophium, Rhopalosiphum, Schizaphis a Sitobion (Halbert a Voegtlin, 1995), proto se o nich zmíníme detailněji. Rhopalosiphum padi - mšice střemchová je holocyklická, jejím zimním hostitelem je Prunus nebo Pomeae (Halbert a Voegtlin, 1995). Má ovšem silný sklon k anholocyklii, tzn., že nevytváří sexuální formy a přezimuje jako živorodá samička na sekundárních hostitelích - trávy, výdrol, ozimy. Další populace mohou být androcyklické, přezimující jako živorodé samičky na sekundárních hostitelích a na jaře se mimo jiné tvoří okřídlení samci (Annonymous, 2009). Je to nejčastější a nejrozšířenější vektor BYDV celosvětově (McPherson et al., 1986), snadno rozpoznatelná svou trávově zelenou až olivově hnědou barvou, kulatým kapičkovitým tvarem a především červenou skvrnou na zadní části těla. Na jaře se obvykle drží níž na stoncích a listech, zatímco na podzim ji lze nalézt na úrovni půdy. Krutou zimou jsou její populace obvykle decimovány (Stufkens a Teulon, 1998). V Evropě je důležitým vektorem BYDV rovněž kyjatka osenní - Sitobion avenae, především na jaře, kdy přenáší BYDV ze zimních hostitelů (ozimy) na jarní obilniny a kukuřici (Dedryver et al., 2005). Existují klony anholocyklické i klony, které přezimují na šípcích a zahradních růžích. Kmeny anholocyklické jsou ovšem častější v oblastech s mírnějším klimatem, neboť jsou tvrdými zimami decimovány (Hoeller, 1990). Tělo je úzce vřetenovité, zelené nebo červenohnědé s tmavší pigmentací na hřbetu. Sifunkuly jsou černé, kónické, až 1,5× delší než světlý chvostek, tykadla téměř tak dlouhá jako tělo. Lze ji nalézt na obilninách, kukuřici i planých travách. Kolonie se formují na listech, stoncích i klasech a na rozdíl od ostatních druhů není neběžné nalézt kolonie i v pozdějších období růstu, od konce metání až téměř do sklizně (Stufkens a Teulon, 1998). Neboť kyjatky osenní sají přímo v klasech, pokud se namnoží, jsou schopny způsobit závažné ztráty i v tomto období, kdy již pro daný porost přenos BYDV není významnou hrozbou. Pokud se kolonie objeví před metáním, snižují počet zrn na klas,

8

pokud jsou klasy kolonizovány v období mléčné zralosti, zrno je následkem sání malé a svraštělé (Johnston a Bishop, 1987; Kolbe a Linke, 1974). Kyjatka travní - Metopolophium dirhodum měří cca 2–3 mm, je úzce vřetenovitá, světlezelená s tmavozeleným pruhem na hřbetu, sifunkuly má světlé, kónické, dvakrát tak dlouhé jako chvostek, tykadla dlouhá téměř jako tělo. Lze ji nalézt na všech částech rostliny (Stufkens a Teulon, 1998), ovšem nejběžnější je na vrchní straně horních listů (Halbert a Pike, 1985). Přezimuje jako vajíčko na Rosa spp., avšak za mírných zim je nyní běžně anholocyklické (Burnett, 1987). Je to velice aktivní mšice, tvořící malé kolonie, které s vysokou frekvencí dávají vzniku okřídleným jedincům (Cannon, 1985) a tudíž mohou hrát důležitou roli při šíření viru mezi jednotlivými plodinami/oblastmi. Mezi vektory BYDV je nejvariabilnějším druhem mšice obilná, Schizaphis graminum. Mezi jednotlivými biotypy existují veliké rozdíly - některé biotypy nejsou schopny BYDV vůbec přenášet, jiné jsou velmi spolehlivými vektory. Další proměnnou, kterou lze zaznamenat u mšice obilné je věk, v němž je schopna virus načerpat a začít přenášet, avšak obvykle jsou dospělci méně úspěšní vektoři než mladší vývojová stádia (Zhou a Rochov, 1984). Sání na rostlinách způsobuje žloutnutí a další fytotoxické efekty, při vyšších populací žloutne celá rostlina. Některé hostitelské rostliny tvoří v místech napadení červené až hnědavé skvrnky. Tělo mšice obilné je světlezelené s podlouhlými pruhy na dorzální straně, cca 2,7-2,9 mm dlouhé, tykadla jsou asi poloviční délky těla. Sifunkuly jsou téměř dvakrát tak dlouhé jako tělo, cylindrické. Vajíčka jsou černé barvy. Přezimují ve formě vajíček na ozimech nebo travnatých plevelech (Afonin et al., 2008). Důležitost jednotlivých druhů mšic, co se týče škodlivosti přenosem BYDV, je násobkem dvou vlastností - četnosti a efektivity přenosu viru. Z této jednoduché rovnice vychází R. padi jako jeden z nejdůležitějších vektorů, neboť je velmi hojná v podmínkách ČR, zvláště v podzimním období, a úspěšnost přenosu u ní dosahuje téměř 100% (Tanguy a Dedryver, 2008). M. dirhodum je více zimovzdorná a stejně dobrý vektor jako R. padi, nicméně zdaleka nedosahuje, krom výjimečných období, takové četnosti. S. avenae je jedním z nejrozšířenějších druhů mšic v obilninách, obzvláště v období pozdního jara a léta, čímž je schopna vykompenzovat svou nižší efektivitu přenosu. R. maidis je mnohem méně efektivní vektor BYDV než předchozí druhy a navíc, krom pozdního podzimu vzácně dosahuje vysokých populačních hodnot (Halbert a Pike, 1985).

9

2.5.2 Způsob přenosu viru BYDV je přenášen perzistentním způsobem, což znamená, že virus zůstává infekční v hemolymfě a tím pádem se tělo mšice stává rezervoárem viru, který může být přenášen celé dny i týdny, v podstatě po zbytek života mšice (Gray a Gildow, 2003). Perzistentní přenos vyžaduje dlouhé akviziční sání. Některé mšice jsou schopny virus přenášet již po 15-30 minutách sání (Watson a Mulligan, 1960), nicméně pro dosažení alespoň 50% úspěšnosti přenosu BYDV je nutné ponechat mšice na rostlinách minimálně 24 hodin (Rochow, 1963). Virus projde celým zažívacím ústrojím vektora, přes hemolymfu do slinných žláz, odkud může být opět sacím (kousacím) ústrojím vylučován. Virion musí úspěšně projít přes tři bariéry, aby byl proces přenosu úspěšný (Gildow, 1993; Gildow a Gray, 1993). Inkubační doba, během níž virus prochází tělem vektora a která končí infekčností vektora, trvá u BYDV asi 12 hodin (Miller a Rasochová, 1997).

2.6 Ekologie choroby Nejdůležitějšími vektory na podzim jsou obvykle mšice střemchová a mšice kukuřičná; zatímco na jaře to bývá kyjatka osenní a mšice střemchová (Li et al., 2001). Okřídlení dospělci migrují do obilných porostů z blízkých i větších vzdáleností a dávají vzniku novým, obvykle neokřídleným generacím. Migrační chování okřídlených jedinců je důvodem, proč prvotní BYDV symptomy jsou často viděny na okrajích pozemků a na náhodně se vyskytujících úsecích (Li et al., 2001). Mšice nejsou schopny přenést virus na své potomstvo. Z tohoto důvodu je procento viruliferních okřídlených dospělců nalétávajících do pole důležitým údajem, bez nějž je velmi těžké predikovat situaci na daném pozemku. Toto procento je velmi proměnlivé pozemek od pozemku, rok od roku (DeBarro et al., 1995). Počet mšic při podzimním náletu závisí na dvou hlavních faktorech: klimatických podmínkách toho léta a doba prvních mrazů ve vztahu k období vycházení obilí z půdy. Průměrné až lehce nadprůměrné srážky během léta obvykle populaci mšic svědčí (Kulemeka et al., 2001). Za sušších lét se díky snížené kvalitě obilnin jakožto zdroje potravy vyskytuje mšic méně. Obilniny, které vzejdou před prvními mrazíky se vystavují většímu riziku infestace mšicemi (a tudíž nákazy BYDV) než ty, které vzejdou až po prvních mrazech. Mšice zůstávají v porostech aktivní, dokud teplota neklesne pod cca 910

12°C (Gray et al., 1991). Na zimních hostitelích přezimují v různých stadiích. Mšice střemchová přezimuje ve formě vajíček na střemše. Při mírné zimě mohou přezimovat nymfy i dospělci na ozimech. Kyjatka osenní přezimuje na obilninách a travách ve formě vajíček, nymf i dospělců. Zimními hostiteli kyjatky travní jsou růže. Na zimní hostitelské rostliny se mšice stěhují v průběhu října. Teplotní průběh zimy spolu s přítomností nebo absencí sněhové přikrývky pak rozhodují o mortalitě během zimy - čím tvrdší zima, tím vyšší mortalita (Tanguy a Dedryver, 2008). Při chladném vlhkém počasí se rodí převážně bezkřídlí jedinci, takže na zimním hostiteli jsou mšice k zastižení často ještě v červnu. Naproti tomu při teplém a suchém počasí může být už v první generaci 90 % okřídlených potomků. Mšice střemchová je zprvu k nalezení na spodních listech, neboť ke svému dalšímu vývoji potřebuje stín a vlhko. Později se stěhuje do horní části stébla, méně často do klasu nebo laty. Na letním hostiteli se vyvíjí několik generací bezkřídlých mšic. Vzhledem k tomu, že při 21 °C procházejí nymfy čtyřmi stádii během 9 dnů a každá mšice má asi 70 potomků, umožňuje vysoká schopnost množení rychlý nárůst populace. Při přemnožení a nedostatku potravy se ve zvýšené míře rodí okřídlené formy, které přelétávají na výdrol a trávy, rozmnožují se dále a v pozdním létě tam dávají vznik gynoparám (matkám samiček). Ty přelétávají zpět na zimního hostitele - střemchu - (podzimní přelet), kde se rodí nymfy dospívající v bezkřídlé samičky, které se páří s později přilétajícími samečky a od poloviny října kladou vajíčka na kůru a pupeny (Annonymous, 2009).

2.7 Diagnostika BYDV Pro diagnostikování virového onemocnění je možné aplikovat několik metod. Mezi metody s významem pro rostlinolékařskou diagnostiku patří:  Polní diagnostika  ELISA test  Testování pomocí RT-PCR Polní diagnostika je založena na symptomatice. Je zde nutná určitá zkušenost hodnotitele, neumožňuje nám bezpečně zjistit příčinný vir. Její aplikovatelnost přichází až v době, kdy se na rostlinách projevují příznaky, což je u ozimů někdy koncem března a v průběhu dubna. Projev příznaků umožňuje zhodnotit závažnost poškození porostu v celé jeho ploše i se snadným vyhledáváním případných ohnisek napadení. Velká

11

vypovídací hodnota je však snížena obdobím, kdy je možné polní diagnostiku provádět, pro likvidaci silně zasaženého porostu a jeho řádné nahrazení jinou plodinou je příliš pozdě (Ripl et al., 2008). ELISA test je laboratorní sérologická metoda využívající protilátek, kdy je vzorek testován na přítomnost virového proteinu. K diagnostice virů v rostlinném materiálu se používá jeho modifikace DAS-ELISA test (Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Kromě příslušného přístrojového vybavení je nutné mít k dispozici specifické protilátky na protein viru. Je možné zpracovat velké množství vzorků, je nutné však pečlivě přistupovat k jejich odběru, aby byl získán dostatečně reprezentativní vzorek. Odběr reprezentativního vzorku je vůbec nejzodpovědnější částí diagnostiky ELISA testem. ELISA test je spolehlivým nástrojem pro rozlišení příčinného viru příznakových rostlin. Citlivost testu je určitým rizikem v latentní fázi choroby (Ripl et al., 2008).. Testování vzorků pomocí RT-PCR (Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction) představuje při diagnostice viru BYDV laboratorní detekci výskytu virové RNA v odebraném vzorku s mimořádnou citlivostí zaručenou mnohonásobným namnožením vhodné části RNA, jejíž přítomnost se poté stanoví gelovou elektroforézou. Pro pozitivní výsledek stačí teoreticky zachytit i jedinou molekulu RNA – jedinou částici viru v testovaném vzorku. Nevýhodou je vysoká cena a pracnost při testování většího množství vzorků (Ripl et al., 2008). 2.7.1 RT-PCR V této metodice je uveden protokol pro RT-PCR detekci viru žluté zakrslosti ječmene v jeho vektorech - mšicích. V reakci jsou použity primery pro univerzální detekci tří kmenů BYDV běžně se vyskytujících v ČR – PAV, PAS a MAV. Amplifikovaný produkt délky 290 bp nás informuje o přítomnosti resp. nepřítomnosti viru BYDV ve vzorku mšice. 2.7.2 Odběr vzorků Odběr mšic lze provádět kdykoli během vegetačního období, ideálně za suchého a teplého počasí, nicméně je možno mšice odebírat i za deště. K odběru používáme jemný malířský štěteček, kterým mšici smeteme z listu – stonku – klasu do připravené 1,5 ml

12

mikrozkumavky (diagram č. 1). Je také možno mšice odebírat i s částí rostliny, na které sají. Aktivita mšic klesá za chladných teplot, za deště a za větrného počasí, kdy je nutno mšice hledat na stoncích a listech blízko u země. Mšice lze odebírat z porostů obilnin a kukuřice, z výdrolů, z travních porostů v okolí polí. Lze odebírat dospělce, ať již okřídlené nebo neokřídlené, nebo nymfy. Při podzimních náletu do ozimů a jarním náletu do jařin je vhodné odebírat okřídlené právě doletěvší dospělce, neboť jejich potenciální infekčnost může být rozhodující pro míru infekce virem v porostu. Mšice dále usmrtíme zalitím kapkou etanolu nebo ponořením do tekutého dusíku, nebo je pouze po krátkou dobu uchováváme při nízkých teplotách – 4-8 °C (viz. kapitola 8.2) a z takto připravených vzorků izolujeme RNA.

Diagram č.1. Způsob odběru a přípravy vzorků mšic. 2.7.3 Homogenizace Prvním důležitým bodem je počet jedinců potřebný na izolaci RNA. Zde záleží na účelu odběru a detekce. Pokud je cílem vyjádřit procentuelně infekčnost mšic, je nutno homogenizovat každou mšici zvlášť. Při našich laboratorních testech byla citlivost 13

detekce viru v jednotlivých mšicích cca 95%, zatímco při homogenizaci 5 mšic v jedné zkumavce byla citlivost detekce 100%. Proto doporučujeme při stanovování procentuelní infekčnosti vektorů připočíst 5% navíc jako chybu citlivosti detekce a pro rutinní detekce odebírat z porostu – rostliny minimálně 5 ks mšic a homogenizovat jako celek. Pokud máme mšice naložené v etanolu, před homogenizací etanol vylijeme, popř. mšice přemístíme do nové 1,5 ml mikrozkumavky. Etanol je vhodný způsob konzervace, pokud je mezi odběrem mšic a samotnou izolací delší časová prodleva, neboť nukleové kyseliny jsou méně rozpustné v alkoholu než v polárnější vodě a tudíž jsou v etanolu vysráženy, zatímco celý vzorek je konzervován. Schopnost etanolu srážet nukleové kyseliny je ještě vyšší za snížených teplot, proto doporučujeme vzorky v lihu uchovávat v chladícím, popř. mrazícím zařízení. Nevýhodou je ztráta zabarvení povrchu těla mšic (pro případné určování druhu apod.). Pokud je homogenizace a izolace provedena do 2 dnů od odběru, je možno mšice zachovávat pouze za nižších teplot v chladícím zařízení či mšice usmrtit ponořením do tekutého dusíku nebo zamrazením. Po zamrazení je již nutno až do homogenizace mšice nerozmrazovat a ponechat v mrazicím boxu. Takto připravené vzorky můžeme uchovávat při teplotách pod mínus 20° C až po několik let. Před samotnou homogenizací vložíme mšice do 1,5 ml zkumavky, pokud tam již nejsou nachystány. Umístěním mikrozkumavky do tekutého dusíku nebo do mrazicího boxu provedeme usmrcení mšic, pokud tak již nebylo učiněno. Vlastní homogenizaci nelze provádět běžným způsobem třením vzorku v třecí misce v tekutém dusíku. Vzorek je příliš malý pro tento způsob zpracování a rozhodně by nebylo možné přenést tento vzorek kvantitativně z třecí misky do mikrozkumavky k následné izolaci DNA. Proto se k homogenizaci používá minishaker (Pellet pestles a Cordless motor, Sigma – Obr 7, 8), kterým se mšice rozdrtí přímo ve zkumavce. Homogenizaci provádíme těsně před samotnou izolací RNA. K homogenizaci použijeme chemikálie z komerčního extrakčního kitu MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit firmy Epicentre podle protokolu pro rostlinné a živočišné tkáně. Nejdříve si tedy do zkumavky o objemu řádově několik ml (velikost zkumavky zvolíme podle odpovídajícího množství vzorků, které se chystáme homogenizovat) připravíme lyzační roztok smícháním 300 l Tissue and Cell Lysis Solution a 1 µl Proteinase K na jeden vzorek (roztok připravujeme vždy čerstvý a pro takový počet vzorků, z něhož budeme následně izolovat RNA). Do 1,5 ml zkumavky se mšicemi přidáme 10 µl připraveného lyzačního roztoku a pomocí minishakeru mšice 14

rozdrtíme tak, aby v roztoku nebyly viditelné větší části (cca 30 – 60 s, popřípadě i déle). Poté doplníme objem na 300 µl z připraveného roztoku (tj. přidáme 290 µl lyzačního roztoku). Důsledná homogenizace (rozdrcení mšic ve zkumavce) je velice důležitým krokem pro získání požadovaného množství RNA. Ponechání větších částic mšic v homogenátu může vést k citelnému snížení extrahované RNA ve vzorku, což by mohlo zapříčinit falešné negativní výsledky při následné RT-PCR. Také je důležité vždy měnit homogenizační tyčinku (Obr 8 B) pro každý vzorek. Tyčinky musí být vždy před použitím sterilizovány v autoklávu.

Obr 7 Minishaker – bezdrátový motor (Sigma) s homogenizační tyčinkou

A

B

Obr 8 Motor (A) a výměnná homogenizační tyčinka (B) (Sigma)

2.7.4 Izolace RNA Pro izolaci celkové RNA z mšic doporučujeme použít komerční extrakční kit MasterPure™ DNA and RNA Purification Kit firmy Epicentre Biotechnologies. Kromě tohoto kitu jsme testovali i komerční extrakční soupravy SpectrumTM Plant Total RNA Kit (Sigma) a RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Ovšem námi vyizolovaná RNA těmito kity 15

nedosahovala požadovaných parametrů. Naměřená koncentrace RNA získaná pomocí kitu firmy Qiagen byla velice nízká (řádově 10 x nižší než u kitu firmy Epicentre) a koncentrace RNA extrahovaná kitem firmy Sigma byla dokonce spektrofotometrem nedetekovatelná a na gelu neviditelná (obrázek č 9). Komerční kit MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit firmy Epicentre Biotechnologies nepoužívá kolonkový systém izolace RNA jako kity výrobců Qiagen a Sigma, ale nukleové kyseliny se získávají precipitací a následným vytvořením pelety RNA (Shanke a Watson, 2009). Tento kit dále umožňuje izolaci jak DNA, tak i RNA (nebo obojí). Pro získání čisté RNA je možno přidat krok digesce DNasou, kdy je veškerá izolovaná DNA rozložena a zbude pouze RNA. Pro účely detekce RNA viru je nicméně tento krok zbytečný a proto ho nedoporučujeme. Provádíme tedy izolaci celkových nukleových kyselin (total nucleic acids – celkové nukleové kyseliny - TNA) podle návodu výrobce. Na obr 10 je znázorněno přehledné schéma izolace TNA tímto kitem.

Obr. 9. Kvalita RNA izolované z jednotlivých mšic různých velikostí a životních stádií konzervovaných v etanolu po dobu dvou měsíců. Byl použit 2,5 % agarózový gel, barven SYBR Green (Fermentas), byly použity RNA loading dye a RNA High Range ladder (Promega). Vzorky 1-6 jsou vzorky mšic izolovaných kitem Qiagen RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen); vzorky 7-11 are 6 jsou vzorky mšic izolovaných kitem Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma). M je RNA High Range žebřík (Promega). Protokol izolace TNA komerční soupravou MasterPure™ DNA and RNA Purification Kit (Epicentre) A.

Lýza buněk

1.

Lýzu buněk jsme částečně provedli v průběhu homogenizace vzorku pomocí minishakeru v lyzačním roztoku

2.

dále inkubujeme homogenizované vzorky ve vodní lázni při 65 ° C 15 minut (vortexujeme každých 5 minut)

16

B.

Přečištění

3.

ochladíme vzorek na ledu po dobu 3-5 minut

4.

přidáme 150 µl MPC Protein Precipitation Reagent k lyzovanému vzorku a důkladně vortexujeme po dobu 10 sekund

5.

centrifugujeme vzorek 10 min. při 14 000 rpm (tímto vznikne peleta nečistot pokud je výsledná peleta čistá, malá nebo není, přidáme dalších 25 µl MPC Protein Precipitation Reagent, promícháme a centrifugací znovu vytvoříme peletu nečistot).

6.

přeneseme supernatant do čisté mikrocentrifugační zkumavky a vyhodíme peletu

C.

Precipitace TNA

7.

pridáme 500 µl isopropanolu* do odebraného supernatantu a několikrát (asi 30-40

x)

převrátíme

zkumavky,

aby

došlo

k řádnému

promíchání

(nevortexujeme) 8.

centrifugací při 4 ° C po dobu 10 minut v centrifuze při 14 000 rpm vytvoříme peletu obsahující TNA

9.

opatrně odlijeme isopropanol bez porušení pelety (isopropanol je možno i velmi opatrně odpipetovat)

D.

Promytí TNA

12.

přidáme 500 µl 75 % ethanolu* - opatrně, aby se neporušila peleta a krátce centrifugujeme pokud není peleta usazená.

13.

opatrně odlijeme ethanol bez porušení pelety

14.

následuje druhé promytí (tj. opakujeme krok 12 a 13)

15.

pipetou opatrně odstraníme všechen reziduální ethanol a vysušíme peletu v exikatoru nebo otevřené zkumavky obrátíme dnem vzhůru a vysušíme na čisté buničině při pokojové teplotě. Je nutno zachovat sterilní podmínky aby RNázy, které se běžně vyskytují na povrchu našeho těla a v prostoru každodenních podmínek nezpůsobily rozklad RNA.

*

není součástí extrakční soupravy

17

E.

Rozpuštění TNA

16.

vysušenou peletu TNA rozpustíme v 35 μl TE pufru (TE Buffer) pomocí pipety nebo na třepačce při nižších otáčkách Kvalitu izolovaných nukleových kyselin měříme spektrofotometricky. Vzorek

nejdříve naředíme v TE pufru, obvykle 1 : 9 (TNA:TE pufr). Absorbanci měříme při 260 nm a při této vlnové délce absorbance (A260) o hodnotě 1,0 odpovídá pro směs jednovlákné, dvouvlákné DNA a jednovlákné RNA cca 25 g na ml. Čistotu vzorku lze posoudit z poměru absorbancí při 260 nm a 280 nm. Čistota vzorku nukleových kyselin, vyjádřená poměrem A260/A280 by se měla pohybovat mezi 1,8 a 2,0. Dále je možno zjistit kvalitu izolované RNA elektroforeticky, kdy na 2,5% agarózový gel nanášíme 3 µl TNA obarvené 2X RNA Loading Dye (Promega) společně s RNA High Range Ladder (Promega) podle návodu výrobce a podstoupíme 3-9 V/cm po dobu 60 - 90 min dle velikosti gelu. Při správné izolaci uvidíme dva bandy ribozomální RNA (obrázek 9).

Obr 10 Schema izolace TNA pomocí sady MasterPure™ DNA and RNA Purification Kit. zdroj:Epicentre Biotechnologies

18

2.7.5 Vhodné primery pro RT-PCR Na základě analýzy sekvence BYDV z genové banky NCBI byl vybrán reverzní a navržen forwardový primer v konzervativním úseku genomu BYDV. Tyto primery amplifikují PCR fragment o velikosti 290 bp společný pro všechny tři běžně se vyskytující kmeny BYDV, neboť mají homologii sekvence v daném úseku, ve kterém je primer navržen. Tab. 1 Primery použité k amplifikaci RT-PCR. Primer

Sequence (5’-3’)

NCBI position

Yan-Ra

TGTTGAGGAGTCTACCTATTTG

PAV AF235167: 3475; MAV D11028: 3436; PAS AF218798: 3475

PVinterF

GTTGAGTTTAAGTCACACGC

PAV EF521849: 3201; PAS EU863653: 284; MAV EF408184: 515

Product size

Tm 58°C

With Yan-Ra ∼290-bp

55°C

2.7.6 RT-PCR

2.7.6.1 Protokol One Step RT-PCR Z hlediska rychlosti a spolehlivosti je vhodnější používat one-step-RT-PCR, neboť redukcí kroků je sníženo riziko chyby a kontaminace. Při použití kitu QIAGEN OneStep RT-PCR je protokol následující: 1) 5 µl 5x pufr (konečná koncentrace 2.5 mM MgCl2), 1 µl dNTPs (konečná koncentrace 200 µM každý nukleotid), 1 µl Q solution, 0.6 µl každého primeru (viz tabulka č. 1) o koncentraci 10 µM, doplnit RNase a DNase free sterilní H 2O do 24 µl a přidat 1 µl RNA. 2) Podmínky reakce jsou: i) 50°C po dobu 30 min (reverzní transkripce); ii) 95°C po dobu 10 min (aktivace HotStarTaq polymerázy); iii) 35 cyklů ve třech krocích: 94°C po 20 s (denaturace), 55°C po 30 s (dosedání) a 72°C po dobu 1 min (polymerizace); iv) 72°C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a v) 10°C uchovávání.

19

2.7.6.2 Protokol Two Step RT-PCR Při two-step-RT-PCR v jedné reakci nejprve dojde reverzní transkripcí k tvorbě cDNA a v druhé reakci (PCR) k amplifikaci daných cílových úseků nukleové kyseliny. Protokol je následující: 1) Pro reverzní transkripci použijeme i) 10 µl H2O, 0.6 µl reverzního primeru BYDVcpR (viz tabulka č. 1) o koncentraci 10 µM a 2 µl RNA a necháme po dobu 5 minut při 70°C RNA zbavit se sekundárních struktur. ii) Okamžitě zchladíme - dojde k nasednutí primeru a iii) podle návodu výrobce používané reverzní transkriptázy pokračujeme. Zde je pro ukázku příklad s použitím AMV reverzní transkriptázy od firmy Promega. iv) V mastermixu smícháme 5μl AMV Reverse Transcriptase 5X Reaction pufru, 2 μl dNTP mix (konečná koncentrace 200 µM každého nukleotidu), 40 jednotek (40mM) RNasin® Ribonuclease Inhibitor sodium pyrofosfát (předehřátý na 42°C), 2.5μl AMV RT (30 jednotek) a doplníme vodou bez nukleáz tak aby celkové množství i s již předtím namíchanou směsí „RNA-primer-voda“ bylo 25 µl, tedy v tomto mastermixu do 12.4 µl. v) Rozpipetujeme do směsi „RNA-primer-voda“ - při pipetování „jednou špičkou“ pozor na možnost kontaminace! 2) Při PCR použijeme v mastermixu i) 0.6 µl každého primeru (viz tabulka č. 1) o koncentraci 10 µM (při konečném obsahu jedné reakce 25 µl) a 1 µl cDNA. ii) PCR podmínky se mohou lišit podle používané polymerázy, proto zde jen pro ilustraci uvedeme protokol za použití Go Taq polymerázy s 5X Green GoTaq™ reakčním pufrem (Promega). Mastermix se v tomto případě skládá z (1) 5 µl green Go TAQ pufru (1.5mM MgCl2), 2 µl dNTPs (200 µM každého nukleotidu), 0.6 µl každého primeru (viz tabulka č.1) o koncentraci 10 µM, 0.2 µl GO Taq polymerázy a doplníme RNase-free H2O do celkového množství 24 µl. (2) Rozpipetujeme a přidáme 1 µl cDNA. iii) Podmínky reakce jsou 95°C po dobu 2 min (iniciální denaturace); iv) 35 cyklů po třech krocích - 95°C po dobu 20s (denaturace), 55°C po dobu 30s (dosedání), 72°C po dobu 1 min (polymerizace); 20

v) 72°C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a vi) 10°C uchovávání. 2.7.6.3 Vizualizace PCR produktů Je doporučeno použití 1-2% agarózového gelu. 5 µl produktu je nanášeno na gel a podstoupeno 3-9 V/cm po dobu 60 - 90 min dle velikosti gelu. Produkt primerů BYcpR a BYcpF je dlouhý 290 bp (viz. Obrázek č.11).

Obrázek č. 11. Vizualizace RT-PCR produktů na 1,5% agarózovém gelu. Vzorek 1 je vzorek ze zdravé mšice, vzorky 2-5 jsou vzorky infekčních Sitobion avenae a vzorky 6-70 jsou vzorky infekčních Rhopalosiphum padi. M je 100 bp DNA ladder (Fermentas). 2.7.7 Hodnocení diagnostické citlivosti a specifity Specifita a citlivost této eseje byla porovnána s metodou DAS – ELISA (Double antibody sandwich - enzyme linked immunosorbent assay), běžně používanou variantou ELISA testu v rostlinné virologii, kde antigen nejdříve reaguje se specifickými protilátkami navázanými na povrch pevného nosiče a je pak detekován specifickými protilátkami značenými enzymem, který v případě pozitivního vzorku zviditelní reakci rozkladem vhodného chromogenního substrátu (Albertson, 2006). Jelikož bylo ke zjištění přítomnosti viru v mšicích spotřebováno vždy celé tělo tohoto hmyzu, a to v případě provádění obou metod, tedy PCR a ELISA, nebylo možné provést porovnání těchto metod v totožných vzorcích. K porovnání byly tedy použity vzorky jedinců mšic odebrané ze stejných infekčních rostlin. Metodou RT-PCR bylo zpracováno 20 vzorků mšic, přičemž virus BYDV byl detekován v 19 vzorcích (tj. 95 %

21

vzorků bylo pozitivních). Testem ELISA byl zpracován stejný počet vzorků a 11, tzn. 55 % vzorků bylo pozitivních. Při zpracování pěti mšic různých vývojových stádií v jednom vzorku bylo dosaženo 100% citlivosti u RT-PCR a 85 % citlivosti u ELISA testu. Dále byla citlivost PCR ověřena pomocí ředění templátové RNA. RNA viru byla detekována ještě při 10 000 násobném ředění (Obr 12). ELISA testem bylo možné virus spolehlivě detekovat jen do dvounásobného ředění, v některých případech ani v neředěné formě nebylo spolehlivých výsledků dosaženo. Z těchto výsledků vyplývá, že metoda PCR je pro detekci WDV daleko citlivější než ELISA test, a to řádově 5 000krát.

Obr 12 Citlivost RT-PCR - Detekce ředěné templátové RNA v RT-PCR. Vzorky 1-5 jsou vzorky Sitobion avenae; vzorky 6-10 Rhopalosiphum padi. Vzorek 1 a6 je vzorek neinfekční mšice, vzorek 5 a 10 je ředěn 10x, vzorek 4 a 9 - 100x, vzorek 3 a 8 - 1000x, vzorek 2 a 7 10000x. M je DNA marker – rozlišení 100 bp (Fermentas).

2.8 Závěr Žlutá zakrslost ječmene patří spolu se zakrslostí pšenice mezi nejdůležitější virové choroby v ČR. Systém ochranných opatření by měl zahrnovat regulaci viru zakrslosti pšenice a jeho vektora. Mšice jsou jedinými známými vektorem BYDV. Výskyt epidemie BYDV z velké míry závisí na počtu, fenologii a chování vektorů na poli. Procento infekčních jedinců se v různých období a na různých lokalitách liší.

22

Cílem této metodiky bylo vyvinutí rutinní diagnostické metody, která umožní spolehlivě detekovat virus v přenašeči mšicích. Včasná detekce viru v tomto vektoru může přispět k rozhodnutí o oprávněnosti zásahu proti infekčnímu přenašeči.

3 Srovnání „novosti“ postupů V České republice nebylo doposud sledováno procentuální zastoupení jedinců mšic přenášející BYDV. Zjišťování přítomnosti viru v přenašeči umožní předpovědět potenciální epidemii BYDV a v případě vyššího počtu neinfekčních mšic, který jinak porost výrazně nepoškozují, omezit zbytečné náklady na regulaci tohoto vektora.

4 Popis uplatnění metodiky Metodika je určena pro diagnostickou laboratoř statní rostlinolékařské správy. Metodika umožňuje detekci viru žluté zakrslosti ječmene (Barley yellow dwarf virus-BYDV) v jeho vektorech mšicích. Je zde uvedena metoda detekce BYDV pomoci RT-PCR. Metodiku je možné uplatnit při monitoringu výskytu viruliferních obilných mšic v dané populaci tohoto vektoru a signalizaci virózy žluté zakrslosti ječmene, což umožní aplikaci včasných ochranných opatření vůči výskytu a šíření této hospodářsky významné choroby obilnin.

5 Seznam související literatury Afonin A.N., Greene S.L., Dzyubenko N.I., a Frolov A.N. (eds.). 2008. Interactive Agricultural Ecological Atlas of Russia and Neighboring Countries. Economic Plants and their Diseases, Pests and Weeds[Online]. Available at: http://www.agroatlas.ru. Announymous. 2009. Agromanual. Available at: http://www.agromanual.cz/cz/atlas/skudci/skudce/msice-stremchova.html Burnett P.A. 1987. World Perspectives on Barley Yellow Dwarf f: proceedings of the international workshop, July 6-11, 1987, Udine International Maize and Wheat Improvement Center, Italy. Ministero degli affari esteri. Dipartimento per la cooperazione allo sviluppo, pp. 511. Cannon R.J.C. 1985. Colony development and alate production in Metopolophium dirhodum (Walker) (Hemiptera: Aphididae) on winter wheat. Bull. Entomol. Res. 75, 353-365. Čača a kol. 1981. Zemědělská fytopatologie, SZN, Praha, 1981, s. 344. D`Arcy C.J., Domier L.L. 2005. Luteoviridae. In: C. M. Fauquet et al.(eds) Virus TaxonomyEighth Report of the ICTV, Springer-Verlag, NewYork, pp. 891–900. 23

D’Arcy C.J. 1995. Symptomology and host range of barley yellow dwarf. Pp. 9-28. In C. J. D’Arcy and P. A. Burnett (eds.), Barley Yellow Dwarf: 40 Years of Progress. The American Phytopathological Society, St. Paul, MN. DeBarro P.J., Sheratt T.N., Brookes C.P., David O., Maclean N. 1995. Spatial and temporal genetic variation in British field populations of the grain aphid Sitobion avenae (F.) (Hemiptera: Aphididae) studied using RAPD-PCR. Proceedings of the Royal Society, London. Series B, 262, 321-327. Dedryver C.-A., Riault G., Tanguy S., Le Gallic J.F., Trottet M., Jacquot E.2005. Intraspecific variation and inheritance of BYDV-PAV transmission in the aphid Sitobion avenae. Eur. J. Plant Pathol. 111, 341–354. Gildow F.E., Gray S.M. 1993. The aphid salivary gland basal lamina as a selective barrier associated with vector-specific transmission of barley yellow dwarf luteoviruses. Phytopathology 83, 1293–1302. Gildow F.E. 1993. Evidence for receptormediated endocytosis regulating luteovirus acquisition by aphids. Phytopathology 83, 270–77. Gray S.M., Gildow F.E. 2003. Luteovirus-Aphid Interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 41, 539–66. Gray S.M., Power A.G., Smith D.M., Seaman A.J., Altman N.S. 1991. Aphid transmission of Barley Yellow Dwarf Virus: Acquisition Access Period and Virus Concentration Requirements. Phytopathology 81, 539-545. Halbert S.E., Pike K.S. 1985. Spread of barley yellow dwarf virus and relative importance of local aphid vectors in central Washington. Ann. Appl. Biol. 107, 387 - 395. Halbert S.E., Cornelly J., Lister R.M., Klein R.E., Bishop G.W. 1992. Vector specificity of barley yellow dwarf virus serotypes and variants in southwestern Idaho. Ann. Appl. Biol. 121, 123-132. Halbert S.E., Voegtlin D. 1995. Biology and taxonomy of vectors of barley yellow dwarf viruses. C.J. D’Arcy P.A. Burnett (eds) Barley yellow dwarf 40 years of progress 1995. 217-258. American Phytopathological Society St. Paul, MN. Hoeller C. 1990. Overwintering and hymenopterous parasitism in autumn of the cereal aphid Sitobion avenae (F.) in northern FR Germany. J. Appl. Entomol. 109, 21-28. Honěk A., Jarošík V., Dixon A. 2006. Comparing growth patterns among field populations of cereal aphids reveals factors limiting their maximum abundance. Bull. Entomol. Res. 96, 269-277. Chain F, Riault G, Trottet M, Jacquot E. 2005. Analysis of accumulation patterns of Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV) in two resistant wheat lines. Eur. J. Plant Pathol. 113, 343-355. Johnston R.L., Bishop G.W. 1987. Economic injury levels and economic thresholds for cereal aphids (Homoptera: Aphididae) on spring planted wheat. J. Econ. Entomol. 80, 478-482. Köhler A., 2008. Prognóza výskytu virových zakrslostí obilnin a obilních mšic v jarním období roku 2008. http://www.srs.cz/portal/ Kolbe W., Linke W. 1974. Studies of cereal aphids, their occurrence, effect on yield in relation to density levels and their control. Ann. Appl. Biol. 77, 85-87. 24

Kulemeka B., Bliss W., Harness A., Sutula C., Bandla M. Gray S.M. 2002. Diagnosis of Barley yellow dwarf virus and Cereal yellow dwarf virus Isolates in Infected Plants and Vectors by Group PCR and ELISA. In: Barley Yellow Dwarf Disease: Recent Advances and Future Strategies. Proceedings of an International Symposium, El Batán, Texcoco, Mexico, p. 897. Lapierre H., Signoret P.-A, 2004. Viruses and virus diseases of Poaceae (Gramineae). Institut national de la recherche agronomique. Paris, p. 853. Li C., Cox-Foster D., Gray S.M. Gildow F. 2001. Vector Specificity of Barley yellow dwarf virus (BYDV) Transmission: Identification of potential cellular receptors binding BYDV-MAV in the aphid, Sitobion avenae. Virology 286, 125-133. McPherson R.M., Starling T.M., Camper H.M. 1986. Fall and early spring aphid (Homoptera: Aphididae) populations affecting wheat and barley production in Virginia. J. Econ. Entomol. 79, 827–832. Miller W.A., Liu S., Beckett R. 2002. Barley yellow dwarf virus: Luteoviridae or Tombusviridae? Mol. Plant Pathol. 3, 177–183. Miller WA, Rasochová L. 1997 Barley yellow dwarf viruses. Annu. Rev. Phytopathol. 35, 167-190. Muška F., Procházka P. 2008. Problematika viróz ozimých obilovin. http://www.asz.cz/cs/ochrana-rostlin/problematika-viroz-ozimychobilovin.html Oswald J.W., Houston B.R. 1951. A new virus disease of cereals, transmissible by aphids. Plant Dis. Rep. 15, 471-475. Papura D., Jacquot E., Dedryver C.A., Luche S., Riault G., Bossis M., Rabilloud T. 2002. Two-dimensional electrophoresis of proteins discriminates aphid clones of Sitobion avenae differing in BYDV-PAV transmission. Arch. Virol. 147: 1881-1898. Perry K.L., Kolb F.L., Sammons B., Lawson C., Cisar G., Ohm H. 2000. Yield Effects of Barley yellow dwarf virus in Soft Red Winter Wheat. Virology 90, 1043-1048. Plumb, R.T. 1990. The epidemiology of barley yellow dwarf in Europe. In: Barley Yellow Dwarf: A Proceedings of the Workshop. P.A. Burnett 8ed.). Mexico, D.F.:CIMMYT. pp. 215-227. Power A.G., Gary S.M. 1995. Aphid transmission of barley yellow dwarf viruses: interactions between viruses, vectors, and host plants. In: D´Arcy CJ, Burnett PA (Eds.), Barley Yellow Dwarf; 40 Years of Progress. American Phytopathological Society, St. Paul, MN, pp. 259- 289. Rastgou M., Khatabi B., Kvarnheden A., Izadpanah K. 2005. Relationships of Barley yellow dwarf virus-PAV and Cereal yellow dwarf virus-RPV from Iran with viruses of the family Luteoviridae. Eur. J. Plant Pathol. 113, 321–326. Ripl J., Holý K., Kocourek F., Kumar J. 2008. Metodika ochrany obilnin proti viru zakrslosti pšenice a jeho vektoru křísku polnímu. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha 2008, pp. 27. Rochow W.F., Muller I. 1971. A fifth variant of barley yellow dwarf in New York. Plant Dis. 55, 874-877.

25

Rochow W.F. 1963. Latent periods in the aphid transmission of Barley yellow dwarf virus. Phytopathology 53, 355-356. Starý P. 1996. Occurrence of anholocylic strains of pest aphids on winter barley and wheat in South Moravia, Czech republic. Anz. Schadlingskde., Pflanzenshutz, Umweltschutz 69, 149-152. Stufkens M.A.W., Teulon, D.A.J. 1998. Aphids on cereal crops. Crop & Food Research, Lincoln. Available at www.aphidwatch.com. Tanguy S., Dedryver C.A. 2008. Reduced BYDV–PAV transmission by the grain aphid in a Triticum monococcum line. Eur. J. Plant Pathol. 123, 281–289. Watson M.A., Mulligan T.E. 1960. Comparison of two barley yellow dwarf viruses in glasshouse and field experiment. Ann. Appl. Biol. 48, 559-574. Zaharieva M., Monneveux P., Henra M., Rivoal R., Valkoun J., Nachnit M.M. 2001. Evaluation of a collection of wild wheat relative Aegilops geniculata Roth and identification of potential sources for useful traits. Euphytica 119, 33-38. Zhou G., Rochow W.F. 1984. Differences among five stages of Schizaphis graminum in transmission of Barley yellow dwarf Luteovirus. Phytopathology 74, 1450-1453.

6 Seznam publikací, které předcházely metodice Kundu J.K., Jarošová J., Gadiou S., Červená G., 2009 Discrimination of three BYDV species by one-step RT-PCR-RFLP and sequence based methods in cereal plants from the Czech Republic. Cereal Research Communications 37, 541-550. Kumar Kundu J., 2009 First Report of Barley yellow dwarf virus-MAV in oat, wheat, and barley grown in the Czech Republic. Plant Disease 93, 964. Kumar J., Jarošová J., 2008. Metodika molekulární determinace kmenů viru žluté zakrslosti ječmene. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha 2008. p.27. Kumar Kundu J., 2008. First report of Barley yellow dwarf virus-PAS in wheat and barley

grown in the Czech Republic , Plant Disease 92, 1587.

Kumar Kundu J., Vacke J., Červená Z., Chrpová J., Šíp V., 2007. Cereal viruses in the Czech Republic: distribution, detection, genetic diversities and resistence. In: Program and Abstracts of the "10th International Plant Virus Epidemiology Symposium Controlling Epidemics of Emering and Established Plant Virus Diseases - The Way Forward", 15-19 October 2007, ICRISAT, India, p. 38.

26

Foto P. Herrmann

Název:

Metodika molekulární detekce viru žluté zakrslosti ječmene v jeho vektorech pomocí RT-PCR

Autoři:

Jarošová J., Jaňourová B., Kumar J.

Vydal:

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.

Tisk:

CD

Počet stran:

26

Vydání:

první

Rok vydání:

2009

ISBN:

978-80-7427-026-0 © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2009

27