PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN BENALU (Dendrophthoe pentandra L. Miq.) DI POHON KEPEL (Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook. f.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Willigis Danu Patria NIM: 098114028

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013

i


UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN BENALU (Dendrophthoe pentandra L. Miq.) DI POHON KEPEL (Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook. f.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Willigis Danu Patria NIM: 098114028

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

“Pusat terbaik adalah prinsip tetapi pusat yang terbaik adalah

Yesus dan Keselamatan. Karena dalam penggambarannya semua pusat adalah kacamata-kacamata. Namun pusatnya adalah Yesus yaitu sebagai matanya. Kemungkinan kacamata prinsip adalah aplikatif yang berguna untuk di laksanakan”

Catatan seorang ayah (alm.)

Kupersembahkan Skripsi ini untuk : Tuhan Yesus Kristus, Sang Jalan, Pelindung, dan Keselamatan, yang telah menuntun jalanku sampai saat ini. Ibu dan Ayah (alm) yang telah merawat dan mendidik aku sampai saat ini, adik-adikku yang selalu ku sayangi. “ Cintaku pada kalian selamanya” Semua keluarga besar Eyang Suberta, Eyang Mangkuatmaja, Eyang Mujiran atas dukungan baik moril dan materil.

iv


v


vi


PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Daun Benalu (Dandrophtoe Petandra L. Miq.) di Pohon Kepel (Stelechocarpus Burahol (Bl.) Hook. F.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farnasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Prof. Dr. CJ. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah memberikan bimbingan, pengarahan serta ilmu dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini. 2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaannya menguji skripsi ini. 3. Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaannya menguji skripsi ini. 4. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 5. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

vii


6. Gissela Haryuningtiyas yang selalu memberikan dukungan dan semangat kepada penulis. 7. DPPH team (Aldo Kristian, Mikhael Gustandy, dan Anthony Felix) terimakasih atas kerjasama yang telah dilewati bersama dalam penelitian ini. 8. Teman-teman Farmasi kelas A angkatan 2009 dan FST 2009 khususnya Hera dan Wanda yang membantu dan memberi semangat disaat penulis merasa putus asa. 9. Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan jauh dari sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini. Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi. Yogyakarta, Januari 2013

Penulis

viii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL…………………………………………………….. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………….

ii

HALAMAN PENGESAHAN……………………………………………

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN………………………………………….

iv

PERYATAAN KEASLIAN PENULIS…………………………………..

v

LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA…….

vi

PRAKATA……………………………………………………………….

vii

DAFTAR ISI……………………………………………………………..

ix

DAFTAR TABEL………………………………………………………..

xiv

DAFTAR GAMBAR……………………………………………………..

xvi

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………...

xviii

INTISARI………………………………………………………………...

xix

ABSTRACT……………………………………………………………...

xx

BAB I PENGANTAR…………………………………………………….

1

A. Latar Belakang…………………………………………………………

1

1. Permasalahan……………………………………………………….

3

2. Keaslian penelitian…………………………………………………

3

3. Manfaat penelitian………………………………………………....

4

4. Tujuan umum dan khusus ............................................................

5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………..

6

A. Tanaman Benalu………………………………………………………...

6

1. Klasifikasi tanaman ..………………………………………………

ix

6


2. Morfologi tanaman…..……………………………………………..

6

3. Deskipsi tanaman……………………………………………………

7

4. Penyebaran tanaman………………………………………………...

7

5. Kandungan kimia benalu …………………………………………..

7

B. Senyawa Fenolik……………………………………………………...

8

C. Antioksidan…………………………………………………………..

10

D. Metode DPPH………………………………………………………...

11

E. Metode Senyawa Fenolik Total ...........................................................

12

E. Ekstraksi ………………………………………………………………

12

F. Validasi Metode Analisis ……………………………………………...

13

1. Akurasi ……………………………………………………………..

14

2. Presisi ………………………………………………………………

14

3. Linearitas …………………………………………………………..

15

4. Selektivitas …………………………………………………………

15

G. Spektrofotometri ……………………………………………………...

16

H. Landasan Teori ……………………………………………………….

17

I. Hipotesis ……………………………………………………………...

18

BAB III METODOLOGI PENELITIAN………………………………..

19

A. Jenis dan Rancangan Penelitian……………………………………….

19

B. Variabel………………………………………………………………..

19

1. Variabel bebas……………………………………………………...

19

2. Variabel tergantung…………………………………………………

19

3. Variabel pengacau terkendali……………………………………… .

19

x


4. Variabel pengacau tak terkendali………………………………….. .

20

C. Definisi Operasional.........................................................................

20

D. Bahan dan Alat Penelitian .................................................................

20

1. Bahan penelitian ............................................................................

20

2. Alat penelitian ...............................................................................

20

E. Tatacara Penelitian ............................................................................

21

1. Determinasi tanaman .....................................................................

21

2. Pembuatan dan penyiapan bahan (simplisia) ..................................

21

3. Ekstraski simplisia .......................................................................

22

4. Pembuatan fraksi etil asetat ...........................................................

23

5. Pembuatan larutan pembanding uji ................................................

23

6. Uji pendahuluan ...........................................................................

25

7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan .....................................

25

8. Uji aktivitas antioksidan ...............................................................

26

9. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ....................

27

10. Penetapan kandungan fenolik total .............................................

28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................

30

A. Hasil Determinasi Tanaman ..............................................................

30

B. Hasil Pengumpulan Bahan ................................................................

30

C. Hasil Preparasi Sampel .....................................................................

31

1. Hasil ekstraksi sampel ..................................................................

31

2. Hasil fraksinasi ekstrak..................................................................

34

D. Hasil Uji Pendahuluan ......................................................................

37

xi


1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ……………………………

37

2. Uji pendahuluan senyawaan fenolik ………………………………

38

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan…………………..

39

1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks) ……

39

2. Penentuan Operating Time (OT)……………………………………

40

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan……………..……...

42

1. Lineritas metode uji antioksidan…………………………………....

43

2. Presisi metode uji antioksidan……………………………………....

45

3. Spesifisitas metode uji antioksidan…………………………...…….

46

G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH….…….

47

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total…..……

48

1. Penentuan operating time (OT)……………………………...……...

58

2. Penentuan panjang gelombang maksimum…………………..…......

59

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolat Total………...

59

1. Linearitas metode penetapan kandungan fenolik total……………..

60

2. Presisi metode penetapan kandungan fenolik total…………………

60

3.Spesifisitas metode penetapan kandungan fenolik total…………….

61

J. Estimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total ..………………………

61

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………………………………….

64

A. Kesimpulan……………………………………………………………

64

B. Saran…………………………………………………………………..

64

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………

65

xii


LAMPIRAN………………………………………………………………

69

BIOGRAFI PENULIS……………………………………………………

102

xiii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I.

Kriteria nilai akurasi yang masih dapat diterima menurut APVMA (2004) .................................................

Tabel II.

Tebel III . Tabel IV.

Kriteria Nilai Presisi yang Masih dapat Diterima menurut APVMA (2004) ..................................................

15

Hasil Scanning panjang gelombang maksimum DPPH..…..

40

Hasil pengukuran absorbansi seri baku kuersetin yang direaksikan dengan DPPH ................................................

Tabel V.

Tabel VI.

etanolik daun benalu yang direaksikan dengan DPPH ......

44

Nilai presisi uji aktivitas antioksidan kuersetin ...………....

45

Nilai presisi uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ……

Tabel VIII

Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan menggunakan metode DPPH ..................................................................

46

51

Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekatrak etanolik daun benalu dengan metode DPPH……………………….

Tabel X.

44

Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi etil asetat ekstrak

Tabel VIII.

Tabel IX.

14

52

Hasil perhitungan IC50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu ........................................................

53

Tabel XI.

Perbandingan IC50 benalu dari berbagai inang...................

57

Tabel XII.

Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu .....................

Tabel XIII.

57

Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan folin ciocalteu ...........................

xiv

59


Tabel XIV.

Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan dengan folin ciocalteu ............................

Tabel XV.

Nilai presisi seri baku asam galat pada penetapan kandungan fenolik total ....................................................

Tabel XVI.

60

61

Nilai penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol ...................................................................

xv

63


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Struktur kimia dari beberapa tipe flavonoid (Shandar et al., 2011) …………………………………….

Gambar 2.

9

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (radikal bebas) dan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (non radikal) (Molyneux, 2003) …………………………………………

Gambar 3.

Persiapan ekstraksi (A= daun yang akan diserbukan, B= daun yang telah diserbukan) ………………………….

Gambar 4.

33

Pemakaian alat (A=Corong pisah, B= Integrasi vaccum dan corong Buchner, C= vaccum rotary evaporator) …….

Gambar 5.

12

37

Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif [blanko], B = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu], C =kontrol positif [kuersetin] ………………………………………………..

Gambar 6.

38

Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol negatif [blanko], B = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu], C =kontrol positif [asam galat]) …

39

Gambar 7.

Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)…………….

40

Gambar 8.

Grafik penentuan OT fraksi etil asetat (Replikasi 2)……..

41

Gambar 9.

Pendekatan skema reaksi yang mungkin terjadi antara radikal 2,2-difenil-1-pikril hidrazil (DPPH) dengan bentuk transformasi dengan DPPH ataupun dengan kuersetin ...…………………………………….....

xvi

49


Gambar 10.

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin …………………………………….

Gambar 11.

51

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat …………………...……………………………..

53

Gambar 12.

Diagram alur uji hipotesis variable numerik (Dahlan, 2012)…..

54

Gambar 13.

Histogram rerata IC50 dari kuersetin dan fraksi etil asetat dengan interval kepercayaan 95%…………………

56

Gambar 14.

Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)………………

58

Gambar 15.

Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total…

63

xvii


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Surat pengesahan determinasi tanaman benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) ......................... ........

Lampiran 2.

69

Gambar tanaman benalu yang diambil di kompleks Universitas Sanata Dharma ..............................................

70

Lampiran 3

Perhitungan rendemen ......................................................

71

Lampiran 4.

Data penimbangan untuk pengujian aktivitas Antioksidan .....................................................................

Lampiran 5.

72

Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji ................................................................

73

Lampiran 6.

Scanning pengkoreksi ......................................................

74

Lampiran 7.

Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ........................

79

Lampiran 8.

Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH ...............................................................................

Lampiran 9.

86

Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu124 ..........................................

81

Lampiran 10. Penimbangan uji kandungan fenolik total ........................

90

Lampiran 11. Scanning kontrol asam galat .............................................

91

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total ....................

91

Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total ....................................

95

Lampiran 14. Uji statistik ........................................................................

100

xviii


INTISARI

Antioksidan memiliki kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Radikal bebas ini dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid atau DNA sehingga menimbulkan penyakit degeneratif. Komponen antioksidan yang terdapat pada tanaman seperti asam fenolat, polifenol dan flavanoid akan menangkap radikal bebas seperti peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil dan juga menghambat mekanisme oksidatif yang menunjukan penyakit degeneratif. Benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) memiliki kandungan utama kuersetin dan kuersetin 3-o-rhamnosida, salah satu jenis flavonoid, yang mampu memberikan aktivitas antioksidan. Daun benalu yang telah dikeringkan diekstrak dengan etanol 70%, kemudian dilanjutkan dengan fraksinasi dengan etil asetat. Aktivitas antioksidan fraksi etil ekstrak etanolik dihitung menggunakan metode DPPH dan didapatkan nilai IC50. Dilakukan juga penentuan fenolik total yang menunjukkan jumlah senyawa fenolik yang memengaruhi aktifitas antioksidan yang dinyatakan dengan nilai massa ekuivalen asam galat per massa fraksi (mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat esktrak etanol). Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar (12,57 ± 0,7) μg/mL (taraf kepercayaan 95%). dan tergolong dalam aktivitas antioksidan sangat kuat. Kandungan fenolik total sebesar (13,76±0,9) mg (taraf kepercayaan 95%) ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu dan metode belum tervalidasi.

Kata kunci: Antioksidan, daun benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.), fraksi etil asetat, DPPH, kandungan fenolik total

xix


ABSTRACT Antioxidant have the ability to capture free radicals. These free radicals can oxidize nucleic acids, proteins, lipids or DNA, causing degenerative diseases. Antioxidants compound found in plants such as phenolic acids, polyphenols and flavanoids would capture free radicals such as peroxide, hydroperoxide or lipid peroxyl and also inhibit the oxidative mechanisms that show degenerative diseases. Chemical constituents from mistletoes (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) are quercetin and quercetin 3-o -rhamnosida, one type of flavonoids, which are able to provide antioxidant activity. Mistletoes dried and extracted with 70% ethanol, followed by fractionation with ethyl acetate. Antioxidant activity of ethyl acetate fraction from ethanol extract was calculated using DPPH method and obtained IC50 values. Do also the determination of total phenolic compounds that show the amount of phenolic antioxidant activity that otherwise affect the value of the mass of gallic acid equivalents per mass fraction (mg gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of ethanol extracts). The results showed that the ethyl acetate fraction from ethanolic mistletoes leaf extract has antioxidant activity with IC50 value of (12.57 ± 0.7) mg / mL (95% confidence interval), and belong to the very powerful antioxidant activity. The content of total phenolic (13.76±0.9) mg (95% confidence interval) gallic acid equivalents per gram of ethyl acetate fraction from ethanol extract of leaves of the mistletoes and the method not validated. Keywords: Antioxidant, leaf parasite (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.), Ethyl acetate fraction, DPPH, total phenolic content

xx


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Oksigen dibawa oleh darah untuk proses metabolime di dalam tubuh. Oksigen dapat membantu sel mengubah nutrisi menjadi energi, namun oksigen ini dapat teroksidasi sehingga terbentuk molekul yang tidak stabil karena metabolisme di dalam tubuh maupun faktor luar seperti merokok, polusi, dan lain sebagainya. Molekul tidak stabil tersebut lalu berubah menjadi sebuah radikal bebas. Radikal bebas ini sangat reaktif sehingga menimbulkan banyak penyakit pada manusia seperti kanker dan penyakit kardiovaskular serta dapat menyebabkan oksidatif yang menyerang protein, DNA, dan lipid (Jacobi and Burri, 1996). Karakteristik utama antioksidan adalah kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Radikal yang terkandung dalam sistem biologis dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid atau DNA dan menimbulkan penyakit degenaratif. Komponen antioksidan yang terdapat pada tanaman seperti asam fenolat, polifenol dan flavanoid akan menangkap radikal bebas seperti peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil, dan juga menghambat mekanisme oksidatif yang menimbulkan penyakit degeneratif (Prakash, 2001). Indonesia kaya akan berbagai keanekaragaman hayati yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai obat atau bahan baku obat. Survei tentang obat di Amerika Serikat yang diakui oleh Food and Drug Administration pada periode 1983-1994 menunjukkan bahwa 157 dari 520 (30%) jenis obat berasal dari bahan

1


2

alam atau turunannya, dimana 61% senyawa antikanker yang diakui juga berasal dari bahan alam atau turunannya. Survei ini menunjukkan terdapat 119 senyawa yang digunakan sebagai obat yang berasal dari 90 spesies tumbuhan di dunia, dimana 77% dari hasil penelitian, tumbuhan digunakan secara tradisional (ethnomedicine) (Cordell, 2000). Oleh karena itu, perlu adanya eksplorasi aktivitas tanaman obat sehingga memperkaya informasi tanaman obat. Benalu adalah tanaman yang kurang diperhatikan karena sifatnya sebagai tanaman parasit. Tanaman benalu secara empiris memiliki kasiat sebagai antikanker. Benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) juga memiliki aktivitas antioksidan, namun aktivitas antioksidannya dipengaruhi oleh tanaman inang yang ditumbuhinya. Benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) pada inang mangga teh, kenanga, dan belimbing memiliki nilai IC50 yang berbeda (Artanti, Widayati, dan Fajriah, 2009). Tanaman Kepel diketahui memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat dengan IC50 sebesar 6,43 µg/mL (Sunarni, Pramono, dan Asmah, 2007). Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dalam penelitian ini ingin mengetahui seberapa besar aktivitas antioksidan benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) pada tanaman kepel (Stelechocarpus burahol (Bl)Hook. f.). Untuk mendukung hasil aktivitas antioksidan yang didapatkan maka pada penelitian

ini

juga

dilakukan

penentuan

jumlah

fenolik

total

untuk

mempresentasikan jumlah fenolik yang menyebabkan aktivitas antioksidan. Menurut Huang, Boxin, and Prior (2005) fenolik total ini memiliki korelasi yang baik dengan aktivitas antioksidan sehingga dapat dilakukan penelitian terhadap keduanya.


3

1. Permasalahan a. Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu pada inang yang dinyatakan sebagai IC50 melalui pengujian menggunakan metode DPPH. b. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu pada inang kepel yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat. 2. Keaslian penelitian Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji aktivitas antioksidan daun benalu (Dendrophthoe pentandra) pernah dilakukan: a. Fajriah,

Darmawan,

Sundowo,

dan

Artanti(2007)

“Isolasi

Senyawa

Antioksidan dari Ekstrak Etil Asetat Daun Benalu Dendrophthoe pentandra L. Miq. yang Tumbuh pada Inang Lobi-Lobi.” Penelitian ini menggunakan benalu yang tumbuh pada pohon lobi-lobi yang di ekstrak dengan etil asetat kemudian dipisahkan dengan kromatografi cair menggunakan eluen bergradien n-heksana, etil asetat, dan metanol. Fraksi yang diperoleh dianalisis dengan kromatografi lapis tipis dan disemprot dengan DPPH untuk mengetahui aktivitas antioksidannya. Selanjutnya senyawa aktif diidentifikasi menggunakan FT-IR dan GC-MS. b. Widowati, Mozef, Risdian, Ratnawati, Tjahjani, and Sandra(2011) “The Comparison of Antioxsidative and Proliferation Inhibitor Properties of Piper betle L., Catharanthus roseus (L) G. Don., Dendrophthoe pentandra L., Curcuma mangga Val. Extracts on T47D Cancer Cell Line”.


4

Tanaman benalu diambil dari pohon mangga yang ditanam di daerah Bogor. Benalu dan beberapa tanaman lainnya kemudian di uji aktivitas antioksidannya menggunakan DPPH dan uji aktivitas antikanker dengan uji MTS. c. (Artanti, Widayati, dan Fajriah(2009) “Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Ekstrak Air dan Etanol daun Benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq yang Tumbuh pada Berbagai Inang.” Tanaman benalu diambil dari berbagai inang diekstrak dengan air dan etanol kemudian dibandingkan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dan toksisitasnya dengan menghitung LC50 dari larva Artemia salina. Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah dalam penelitian ini benalu diambil dari pohon kepel yang terdapat pada kompleks Universitas Sanata Dharma Maguwoharjo, Sleman, Yogakarta, dengan keadaan dikeringkan untuk mendapatkan fraksi etil asetat dari ekstrak etanol daun benalu kemudian diuji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH dan ditetapkan kandungan fenolik totalnya dengan menggunakan instrumen spektrofotometer UV-VIS. 3. Manfaat penelitan a. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi bagi penelitian lebih lanjut maupun masyarakat luas mengenai potensi ekstrak daun benalu pada pohon inang kepel. b. Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan pada perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi, khususnya tentang penggunaan metode DPPH dalam menguji aktivitas antioksidan bahan alam.


4.

5

Tujuan umum dan khusus a. Tujuan umum. Menguji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak

etanol daun benalu pada pohon inang kepel menggunakan metode penangkapan radikal bebas DPPH. b. Tujuan khusus. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu pada pohon inang kepel dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50 dan mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu pada pohon inang kepel yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanolik.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Benalu

1. Klasifikasi tanaman Klasifikasi tanaman benalu dalam sistematika tumbuhan adalah sebagai berikut. Kingdom

: Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi

: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas

: Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)

Sub Kelas

: Rosidae

Ordo

: Santales

Famili

: Loranthaceae

Genus

: Dendrophthoë Mart.

Spesies

: Dendrophthoe pentandra (L.) Miq. (Backer and Bakhuizen, 1965).

2. Morfologi tanaman Benalu ini memiliki karakteristik batang agak tegar, gundul kecuali pada pucuk-pucuk muda. Daun tumbuh tersebar atau sedikit berhadapan, menjorong, panjangnya 6-13 cm, dan lebar 1,5-8 cm, pangkal menirus-membaji, ujung tumpul runcing, panjang tangkai daun 5-20 mm. Bunga yang tumbuh pada ruas-ruas,

6


7

tandan dengan 6-12 bunga. Jumlah mahkota bunga 5 meruas, menyudut atau bersayap dibagian bawah dan menyempit dibagian leher, dibagaian ujung tumpul, berwarna hijau atau kuning-orange, panjang tabung bunga 6-12 mm. Kepala sari dengan panjang 2-5 mm dan tumpul (Samiran, 2005). 3. Deskripsi tanaman Benalu merupakan tanaman setengah parasit karena sifatnya yang dapat berfotosintesis. Pada benalu terdapat alat hisap yang disebut haustorium, yang sifatnya dapat mengambil nutrisi dari tanaman inangnya. Mekanisme tumbuhnya benalu diperantarai oleh burung. Burung akan memakan biji benalu,namun karena biji tersebut juga menghasilkan lendir yang lekat maka biji tersebut melekat pada paruh burung tersebut. Kemudian burung akan mengoleskan biji tersebut pada dahan pohon lain yang kemudian akan menjadi bibit tanaman benalu yang tumbuh pada pohon yang menjadi inangnya (Pracaya, 2007). 4.

Penyebaran tanaman Penyebarannya dari Indonesia sampai Cina; Semenanjung Malaya,

Sumatra, Jawa, Kalimantan, Nusa Tenggara, dan Fillipina. Habitat benalu ini pada umumnya di hutan hujan atau di hutan-hutan yang terbuka dan di perkebunan dataran rendah sampai ketinggian 500 m dpl (Valkenburg, 2003). 5.

Kandungan kimia benalu Jenis flavonoid yang merupakan kandungan utama benalu adalah

quercetin

3-rhamnoside

dan

kaempferol

3-rhamnoside

(Sukpondma,

Rukachaisirikul, and Jasakul, 2000). Kadar kuersetin dari tanaman benalu yang didapat dari inang teh masing-masing sebesar 2,7 mg/g dan 9,6 mg/g untuk benalu


8

Macrosolen avenis dan Scurrula oortiana. Kadar kuersetin pada tanaman benalu Scurrula oortiana dari Beunying yang tumbuh pada pohon kopi sebesar 6,1 mg/g ; Benalu Scurrula parasitica yang tumbuh di pohon Jure 5,1 mg/g; sedang pada benalu Dendrophthoe pentandra yang tumbuh pada puring sebesar 35,1 mg/g; dan pada tanaman randuuntuk benalu Dendrophthoe pentandra sebesar 39,8 mg/g (Rosidah, Yulinah, dan Gana,1999). Isolat yang diisolasi dari ekstrak air daun benalu D. pentandra adalah senyawa quercetin 3-o-ramnosida, yang merupakan salah satu senyawa aktif antioksidan dari golongan flavonoid dengan nilai IC 50 9,4 ppm (Darmawan dan Artanti, 2006).

B. Senyawa Fenolik Senyawa fenolik merupakan kelompok molekul yang besar dan beragam, seperti metabolit sekunder aromatik dari beberapa famili yang berbeda di suatu tanaman. Fenolik ini merupakan salah satu metabolit sekunder yang melimpah di suatu tanaman yang dapat diklasifikasikan menjadi senyawa yang tidak larut seperti tanin, lignin, asam hidroksisinamat, dan senyawa larut seperti asam fenolat, fenilpropanoid, favonoid dan kuinon (Harborne and Williams, 2000). Flavonoid berbeda dalam penyusunan gugus hidroksil, metoksi dan bagian gugus glikosida dan dalam konjugasi antara cincin A dan B. Variasi dalam cincin C merupakan pembagian dalam subkelas. Dilihat dari struktur molekular mereka, maka dapat dibagi dari delapan kelas (Shandar, Kumar, Prasher, Tiwari, Shalhan, and Sharma, 2011).


Flavone

Anthocyanidin

Flavononoes

Catechin

Flavonol

Dihydroflavonol

9

Isoflavone

Chalcone

Gambar 1. Struktur kimia dari beberapa tipe flavonoid (Shandar, et al., 2011).

Flavonoid (bagian glikosida) dapat terdegradasi oleh aksi enzim ketika diambil dari material tanaman yang masih segar atau tidak dikeringkan. Maka disarankan untuk dilakukan pengeringan ketika material akan digunakan, dan dibuat menjadi serbuk. Untuk ekstraksi, pelarut yang digunakan sesuai dengan tipe flavonoid yang terkandung. Polaritas sangat penting dibutuhkan disini. Flavanoid yang kurang polar (contoh: isoflavon, flavanon, metilasi flavon, dan flavonol) diekstraksi dengan kloroform, diklorometan, dietil eter, atau etil asetat, sedangkan flavonoids glikosida dan aglikon yang lebih polar diekstraksi dengan alkohol atau alkohol dengan campuran air. Glikosida yang mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam air dan larutan alkohol-air yang sesuai (Andersen and Markham, 2006).


10

C. Antioksidan

Antioksidan adalah senyawa yang dapat secara langsung menahan pembentukan radikal bebas dan terbagi atas 3 jenis, yaitu: antioksidatif, penangkap radikal bebas, dan pengkelat. Antioksidan dan penangkap radikal bebas secara umum dikatakan sama, namun tidak selalu. Sebagai contoh, etanol adalah penangkap radikal bebas hidroksil tetapi tidak pernah ditujukan sebagai antioksidan.

Pada

pengertian

awal,

antioksidan

dideskripsikan

sebagai

penghambat proses oksidatif, di mana dapat bereaksi dengan radikal peroksil (Desisov and Afanas’ev, 2005). Karakteristik

utama

antioksidan

adalah

kemampuannya

untuk

menangkap radikal bebas. Reaktif radikal bebas dan spesies oksigen yang terkandung dalam sistem biologis yang ada di sistem biologis. Radikal bebas ini dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid atau DNA dan dapat menimbulkan penyakit degenaratif. Komponen antioksidan yang terdapat pada tanaman seperti asam fenolat, polifenol dan flavanoid akan menangkap radikal bebas seperti peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil dan juga menghambat mekanisme oksdiatif yang menunjukan penyakit degeneratif (Prakash, 2001). Kapasitas antioksidan adalah menurunnya kecepatan dari antioksidan sehingga terjadi pemutuskan ikatan rantai. Aksi inhibitor dari antioksidan akan muncul setelah kita mengkonsumsi. Durasi efek inhibitor dalam mekanisme aksi antioksidan dan aktivitas di tempat reaksi akan hilang ketika antioksidan ini sangat sedikit dikonsumsi (Desisov and Afanas’ev, 2005).


11

D. Metode DPPH

Metode DPPH. merupakan cara yang cepat dan mudah untuk mengevaluasi aktivitas antiradikal pada antioksidan, tetapi juga menyajikan model kinetika

reaksi

DPPH

yang

stabil.

Modifikasi metode

pengukuran

telah dilakukan pada metode DPPH• untuk setiap kasus kinetika. Beberapa senyawa bereaksi sangat cepatdengan DPPH•, dan mengurangi sejumlah DPPH• dengan molekul yang sama dengan jumlah gugus hidroksil yang tersedia. Namun, untuk sebagian besar senyawa diuji, reaksi berjalan sangat lambat dan kompleks (Bondet, 1996). Molekul dari 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) dikarakteristikan sebagai radikal bebas yang stabil

yang

terlihat

dari

penggambaran delokalisasi dari pembagian elektron secara keseluruhan oleh karena itu, molekul tidak dimerisasi akan sama pada kebanyakan dari radikal bebas yang lain. Dekolisasi juga menunjukkan warna violet, yang diabsorbsi pada larutan etanol pada panjang gelombang 520 nm (Molyneux, 2003). Prinsip metode ini adalah melihat kemampuan antioksidan dengan mengukur pengurangan intensitas warna dari DPPH akibat penangkapan elektron radikal DPPH oleh antioksidan yang menjadi berikatan dengan hidrogennya DPPH-H. Hasil dari pengurangan warna ini merupakan stokiometri terhadap jumlah dari elektron yang ditangkap (Bondet, et al., 1997).


12

Gambar 2. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (radikal bebas) (kiri) dan 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (non radikal) (kanan) (Molyneux, 2003).

E. Metode Senyawa Fenolik Total

Metode kolorimetri yang biasa digunakan adalah Folin Ciocalteu, salah satu metode yang memiliki reaksi oksidasi yang cepat dengan fenol dengan menggunakan alkali (biasanya sodium karbonat), dimana nilai yang didapat signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011). Estimasi kandungan fenolik total dilakukan dengan cara memberikan reagen Folin Ciocalteu dan reaksi yang terjadi adalah oksidasi dari ion fenolat senyawa uji oleh pereaksi fenol Folin-Ciocalteu, dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat menghasilkan produk dengan warna biru sekitar panjang gelombang 745-750 nm (Ronald et al., 2005).

F. Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes RI a, 1995).


13

Maserasi merupakan proses yang tepat dimana obat yang sudah halus direndam dengan pelarut sampai meresap dan melunakkan susunan sel, sehingga zat-zat yang mudah larut akan melarut. Dalam proses maserasi, bahan biasanya ditempatkan dalam wadah atau bejana bermulut lebar. Bersama pelarut yang sudah ditetapkan, bejana ditutup rapat, dan isinya dikocokberulang-ulang selama 2-14 hari. Penggojokan memungkinkan pelarut mengalir berulang-ulang keseluruh permukaan dari bahan yang sudah halus (Ansel, 1989). Prinsip ekstraksi menggunakan prinsip like dissolve like. Komponen yang bersifat polar akan mudah larut dalam pelarut polar dan komponen yang bersifat non polar akan mudah larut dalam pelarut non polar. Kelarutan suatu komponen juga dipengaruhi oleh kemampuan zat pelarut untuk membentuk ikatan hidrogen dengan pelarut (Depkes RI, 1986) Substansi fenolik dapat diekstraksi dari material tanaman menggunakan sebagian tanaman dengan melihat kepolarannya. Secara umum, pelarut yang baik dengan penurunan nilai kepolaran seperti: air, metanol 80% atau etanol 70%, aseton 80%, dan etil asetat. Fenolik antioksidan secara keseluruhan, dibagi berdasarkan

kelas-kelasnya

seperi

asam

fenolik,

asam

hidroksisinamat,

flavonoids, dan keratenoid (Huang, Boxinand Prior, 2005). G. Validasi Metode Analisis

Pada penggunaan metode yang berbeda harus digunakan validasi untuk melihat potensi dari metode tersebut sehingga sangat penting memahami objektivitas validasi untuk membuktikan prosedur yang digunakan sesuai untuk tujuan yang diharapkan (Chan, Lam, Lee andZhang, 2004).


14

1. Akurasi Akurasi pada prosedur analisis menggambarkan kedekatan hasil yang kita dapatkan dengan nilai yang sebenarnya baik nilai yang kita dapatkan dan dari suatu referensi tertentu (Chan, et al., 2004). Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery).Untuk recovery dikatakan baik jika pada analit dengan konsentrasi kurang dari 0,1% (b/v) memiliki nilai sekitar 75-125% (Kingstone, 2004). Tabel I. Kriteria Nilai Akurasi yang Masih dapat Diterima Menurut APVMA (2004)

Kadar zat aktif (%) > 10 1-10 0,1-1 <0,1

Nilai Recovery yang masih dapat diterima (%) 98-102 90-110 80-120 75-125

2. Presisi Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility) (Harmita, 2004). Definisi ripitabilitas dari ICH adalah gambaran keterulangan dengan dibawah pengaruh dari operasi sistem yang sama setealah interval waktu yang singkat. Ripitabilitas metode dapat dideterminasi dari multiple replikasi preparasi dari sampel yang sama. Dilakukan dengan cara multiple preparasi sampel (n=6) pada eksperimen yang sama atau dengan menyiapkan tiga kali replikasi dengan tiga konsentrasi berbeda (Chan, et al., 2004).


15

Tabel II. Kriteria Nilai Presisi yang Masih dapat Diterima Menurut APVMA (2004)

Kadar zat aktif (%) > 10 1-10 0,1-1 <0,1

Nilai KVyang masih dapat diterima (%) <2 <5 < 10 < 20

3. Linearitas Linearitas menunjukan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi dalam garis lurus, terlihat dari respon yang sebanding dengan jumlah analit. Target konsentrasi dari analit dalam preparasi obat dengan lima larutan standar dalam kurva linearitas dengan jarak 0,5-1,5 kali konsentrasi analit. Setiap standar harus dipreparasi dan dianalisis sebanyak tiga kali (Harris, 2010). 4. Selektivitas (Spesifisitas) Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Spesifisitas dapat meliputi akurasi dan presisi, kemurnian reagen, toleransi alat, menggunakan bahan standar bersertifikat untuk analit dalam sampel yang akan dianalisis. Metode analisis harus menghasilkan jawaban yang dapat diterima mendekati nilai standar baku. Blanko yang terhitung akan menjadi pengganggu saat pengukuran analit pada saat penyiapan sampel dan saat analisis. Jumlah terhitung pada blanko yang terdeteksi ini mungkin merupakan sampel sebelumnya yang tertinggal pada alat kaca atau instrument (Harris, 2010).


16

H. Spektrofotometri Spektrum tampak terdapat pada rentang panjang gelombang 400 nm (ungu) sampai 750 nm (merah), sedangkan spektrum ultraviolet terdapat pada rentang panjang gelombang 100 nm sampai 400 nm. Absorbansi cahaya ultraviolet atau cahaya tampak mengakibatkan suatu transisi elektronik yaitu promosi elektron-elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi yang berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap selanjutnya terbuang sebagai kalor, sebagai cahaya, atau tersalurkan dalam reaksi kimia (Fessenden dan Fessenden, 1986). Absorbsi energi direkam sebagai absorban. Absorban pada sutau panjang gelombang tertentu didefinisikan sebagai : A= log Dengan:

𝐼° 𝐼

A

= absorbans

Iº

= Intensitas berkas cahaya rujukan

I

= Intensitas berkas cahaya sampel

Absorban suatu senyawa pada suatu panjang gelombang tertentu bertambah dengan molekul yang mengalami transisi. Oleh karena itu absorban bergantung pada struktur elektronik senyawanya dan juga pada kepekatan sampel (Fessenden dan Fessenden, 1986). Output dari spektrofotometri UV-Vis dapat berupa spekra UV-Vis yang dapat digunakan sebagai informasi kualitatif dan dapat digunakan untuk analisis kuantitatif Dari aspek kualitatif spektroskopi UV dan Vis menghasilkan data berupa panjang gelombang maksimal, intensitas, efek, pH, dan pelarut yang


17

kesemuanya dapat dibandingkan dengan data yang sudah dipublikasikan sebelumnya. Dari aspek kuantitatif suatu berkas radiasi dikenakan pada larutan sampel (cuplikan) yang akan diiukur dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan tersebut kemudian diukur besarnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton melalui satu satuan luas penampang per detik (Gandjar, dan Rohman, 2007).

I. Landasan Teori Antioksidan adalah senyawa yang dapat secara langsung menahan pembentukan

radikal

bebas.

Karakteristik

utama

antioksidan

adalah

kemampunnya untuk menangkap radikal bebas yang terkandung dalam sistem biologis. Radikal bebas ini dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid atau DNA dan dapat menimbulkan penyakit degenaratif seperti kanker. Komponen antioksidan yang terdapat pada tanaman benalu seperti kuersetin dan kamferol akan menangkap radikal bebas seperti peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil dan juga menghambat mekanisme oksdiatif yang menunjukan penyakit degeneratif. Benalu adalah tanaman setengah parasit dengam memiliki alat hisap yang disebut haustorium, yang digunakan untuk mengambil nutrisi dari tanaman inangnya namun juga dapat menghasilkan fotosintesis. Benalu memiliki aktivitas antioksidan, namun aktivitas antioksidannya dipengaruhi inang dari benalu. Tanaman kepel memiliki aktivitas antioksidan yang tergolong sangat kuat.


Kemampuan

antioksidan

dilihat

dengan

mengukur

18

pengurangan

intensitas warna dari DPPH akibat penangkapan elektron radikal DPPH oleh antioksidan yang menjadi berikatan dengan hidrogennya DPPH-H. Hasil dari pengurangan warna ini merupakan stokiometri terhadap jumlah dari elektron yang ditangkap. Estimasi kandungan fenolik total dilakukan dengan cara memberikan reagen Folin Ciocalteu dan reaksi yang terjadi adalah oksidasi dari ion fenolat senyawa uji oleh pereaksi Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat menghasilkan produk warna biru sekitar panjang gelombang 745-750 nm.

J. Hipotesis Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu memiliki aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai IC50 dan memiliki kandungan fenolik yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat.


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni.

B. Variabel 1.

Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanol benalu.

2.

Variabel tergantung berupa kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanol benalu untuk menangkap radikal DPPH (%IC).

3.

Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, variasi jenis benalu.

4.

Variabel pengacau tak terkendali berupa cahaya matahari, curah hujan, cuaca, kelembapan ruangan, umur daun, dan komposisi senyawa penyusun ekstrak.

C. Definisi Operasional 1. Ekstrak etanolik daun benalu adalah sari hasil proses maserasi daun benalu dengan penyari etanol 70%. 2. Fraksi etil asetat adalah fase non polar hasil fraksinasi ekstrak etanol daun benalu dengan menggunakan etil asetat. 3. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu untuk menangkap

19


20

radikal DPPH dilihat dari pengurangan absorbansi menggunakan spektroskopi visible. 4. Persen inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH dilihat dengan pengurangan absorbansi menggunan spektroskopi visible.

D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: daun benalu (Dendrophthoe pentandra L. Miq) yang diambil dari pohon kepel (Stelechocarpus burahol (Bl) Hook. f.) yang terdapat di taman Universitas Sanata Dharma, kampus III, Paingan (Yogyakarta); akuades(Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma); bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. SigmaChem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat, dan kuersetin;bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahankualitas teknis CV. General Laboratorium, yaitu: etanol 70%; dan aluminium foil. 2. Alat penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath (labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Lamda 20), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000μL; 1-10


21

mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tumbuhan daun benalu (Dendrophthoe pentandra L. Miq) Determinasi tanaman benalu dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma, Fakultas Biologi Universitas Sanata Dharma. Determinasi tanaman ini untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian benar-benar tanaman benalu (Dendrophthoe pentandra L. Miq). 2. Pembuatan dan penyiapan bahan (simplisia) a. Pengumpulan bahan.Tanaman benalu diperoleh dari taman Universitas Sanata Dharma (Yogyakarta). Pengumpulan pada musim kemarau bulan Juli tahun 2012. Pemanenan dilakukan pada tanaman yang menjelang berbunga saat pagi hari. b.Sortasi basah. Bahan baku dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, krikil, rumput, bagian tanaman yang tidak dibutuhkan (tangkai, biji, dan bunga), bagian dari tanaman lain (tangkai, daun, bunga dan biji inang), bahan yang rusak dan lain-lain. c.Pencucian. Pencucian herba benalu dilakukan dengan menggunakan air mengalir yang berasal dari air sumur. Sejumlah daun benalu dicuci dengan cara dialiri air sumur sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada daun. Pencucian ini dilakukan sebanyak tiga kali.


22

d. Pengeringan. Daun benalu yang masih basah dikeringkan pada sinar matahari secara tidak langsung. Cara pengeringan adalah bahan dihamparkan di atas nampan bambu dengan diatur agar tidak terlalu menumpuk dan diusahakan agar bahan (daun) tidak menggulung, kemudian ditutup kain hitam dan dilakukan penjemuran di bawah sinar matahari pada pukul 09.00 (pagi) sampai pukul 15.00 (sore). Posisi daun harus sering dibalik sehingga pemanasan dapat merata. Akhir pengeringan ditandai dengan mudah dipatahkannya bahan simplisia. e. Sortasi kering. Sejumlah simplisia yang sudah kering (ditandai dengan mudah hancur ketika diremas) dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, krikil, bahan yang rusak dan lain-lain (khususnya tanpa pencucian). f. Perajangan atau penyerbukan simplisia. Simplisia yang telah kering dan disortasi basah ditumbuk sampai halus, kemudian dilakukan pengayakan untuk memperoleh serbuk yang lebih halus dengan ayakan dengan nomor mesh 40. g. Pengepakan dan penyimpanan. Sejumlah simplisia yang telah halus kemudian dibungkus dengan menggunakan kantong plastik kedap udara dengan cara dibungkus rapat. Penyimpanan dilakukan di suhu ruangan 3. Ekstraksi simplisia Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 30 g dan dituang kedalam bejana maserasi, ditambah etanol 70% sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimasersi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol 70% secukupnya selama 2 hari kemudian


23

disaring. Lalu hasil penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstak etanol daun benalu. 4.Pembuatan fraksi etil asetat Ekstrak etanol daun benalu ditambahkan 300 mL air hangat dan di ekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada paling bawah, sedangkan fase washbensin berada pada bagian atas. Hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air-etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan dengan vacum rotary evaporator dan waterbath hingga didapakan ekstrak kental. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan analisis lebih lanjut. 5. Pembuatan larutan pembanding dan uji a. Pembuatan larutan DPPH. DPPH sebanyak 15,7 mg diambil dan dilarutkan metanol p.a ke dalam labu ukur 100 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru. b. Pembuatan larutan stok kuersetin. Kuersetin diambil 2,5 mg ke dalam labu takar 10,0 mL, kemudiandilarutkan dengan metanol p.a sampai batas tanda. c. Pembuatan larutan pembanding.Larutan stok kuersetin diambil sebanyak 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL,


24

sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; dan 15,0 μg/mL. d. Pembuatan larutan uji 1)

Larutan uji untuk aktivitas antioksidan. Fraksi etil asetat ditimbang

sebanyak 25,0 mg ke dalam labu takar 25,0 mL, kemudiandilarutkan dengan

metanol p.a sampai batas tandasebagai larutan stok. Larutan stok diambil sebanyak 2 mL ke dalam labu takar 10,0 mL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai batas tanda sebagai larutan intermediet. Larutan intermediet diambil sebanyak 0,6; 0,9; 1,2; 1,5; 1,8 mLke dalam labu takar 10,0 mL,kemudian ditambahkan metanol p.a sampai batas tanda. Konsentrasi larutan uji sebesar 6,05; 9,07; 12,10; 15,12; 18,14 μg/mL.

2)

Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total. Fraksi etil

asetat ditimbang sebanyak 10,1 mg ke dalam labu takar 10,0 mL, lalu ditambahkan metanol p.a sampai batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 141,7 μg/mL. e. Pembuatan larutan asam galat. Larutan asam galat dibuat dengan konsentrasi 500 μg/mL dalam akuades : metanol (1:1). Larutan asam galat diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL ke dalam labu takar 10,0 mL, kemudian ditambahkan akuades : metanol (1:1) sampai batas tanda, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL.


25

6. Uji pendahuluan a. Uji fenolik.Larutan uji dengan konsentrasi 750,0 μg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mLkemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi laludidiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat 1 M ditambahkan sebanyak 7,5 mL, kemudian amati warna larutan tersebut. b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan. Larutan DPPH diambil sebanyak 1 mL dimasukan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Larutan DPPH ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 μg/mL, dan larutan uji 200,0 μg/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut. 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum.Larutan DPPHdimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mLpada 3 labu ukur 10 mL,. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. b. Penentuan operating time (OT).Larutan DPPH sebanyak 2 mL dimasukan kedalam masing-masing tiga labu ukur 5 mL, ditambahkan masing-masing


26

dengan 1 mL larutan pembanding kuersetin 12,5; 37,5 dan 62,5 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya denga spektrofotometer

visibel pada panjang gelombang

scanninghasil dari serapan panjang gelombang selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 100; 200; 300 μg/mL. 8. Uji aktivitas antioksidan a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol).Larutan DPPHdimasukkan sebanyak 2 mLpada labu ukur 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji. b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji.Larutan DPPH sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi. c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan. Hasil dari prosedur 7 a dan b divalidasi presisi (%CV) spesipisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r). % CV

=

𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑆𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟

𝑥 100 %


27

9. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri sesuai dengan penelitian Rollando ( 2012). a. Penentuan OT. Larutan asam galat sebanyak 0,5 mL 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. b. Penentuan panjang gelombang maksimum. Larutan asam galat diambil sebanyak 0,5 mL 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm. 10. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat. Larutan asam galat diambil sebanyak 0,5 mL 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL ditambah dengan 5 mL reagen FolinCiocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M. Setelah OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.


28

b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total. Hasil dari prosedur 9 b, divalidasi presisi (%CV), spesipisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r). % CV

=

𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑆𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟

𝑥 100 %

c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji. Diambil 0,5 mL larutan uji 750 μg/mL, lalu masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). Lakukan 3 kali replikasi.

F. Analisis Hasil Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus : 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖(𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐴𝑏𝑠𝑟𝑜𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑚𝑏𝑎𝑛𝑑𝑖𝑛𝑔/𝑢𝑗𝑖) 𝑥100 % 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 mengunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC50 larutan pembanding dan larutan uji. Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku secara intrapolasi.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman Determinasi tanaman adalah langkah awal yang harus dilakukan dari suatu penelitian dengan menggunakan suatu sampel berupa tanaman. Determinasi tanaman bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang akan digunakan dalam penelitian untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel analisis fitokimia. Determinasi tanaman Benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) telah dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan acuan buku “Flora untuk Sekolah di Indonesia” karanganvan Steenis (1981). Pembuktian dikuatkan dengan surat determinasi (lampiran 1) tanaman yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

B. Hasil Pengumpulan Bahan Daun benalu diperoleh dari beberapa pohon kepel yang ditumbuhi tanaman parasit benalu di kompleks Kampus Sanata Dharma, Desa Paingan, Kecamatan Maguwoharjo, Kabupaten Sleman, Yogyakarta. Tanaman benalu yang dipilih adalah benalu dengan spesies Dendrophthoe pentandra dengan mencocokan gambar yang telah dipastikan kebenarannya. Hal ini dilakukan untuk memudahkan membantu pengambilan tanaman agar tidak terjadi kesalahan dalam

29


30

pengambilan tanaman yang dimaksud. Kemudian tanaman benalu dideterminasi dengan Flora untuk Sekolah di Indonesia untuk memastikan kebenarannya. Daun benalu dipanen dengan kriteria-kriteria berikut ini, yaitu pada musim kemarau pada bulan Juli, saat tanaman berbunga pada pagi hari. Tanaman benalu dikumpulkan dan diambil daunnya yang masih segar, tidak kuning tanpa ada klasifikasi umur tanaman. Pemanenan dilakukan pada pagi hari dengan tujuan agar daun dalam kondisi segar. Proses pemanenan tidak dilakukan pada siang hari karena akan mengakibatkan kandungan metabolit sekunder yang berfungsi sebagai antioksidan akan berkurang (Andayani, Lisawati dan Maimunah, 2008), senyawa-senyawa antioksidan seperti flavonoid yang terkandung dalam daun merupakan sistem pertahan pada infeksi jamur dan radiasi UV (Cusnie and Lamp, 2005). Daun yang diambil tidak terlalu muda karena kandungan metabolit sekunder yang belum sempurna. Tanman diambil yang belum terlalu tua (tidak berwarna kuning atau coklat), karena daun yang kuning atau coklat kandungan kimianya banyak yang sudah hilang (berkurang).

C. Hasil Preparasi Sampel 1. Hasil ekstraksi sampel Tujuan dilakukan ekstraksi sampel adalah mengumpulkan senyawa kimia yang terkandung dalam daun benalu yang kemungkinan mengandung senyawasenyawa sebagai antioksidan. Dalam proses penyarian digunakan tanaman yang telah dikeringkan dan diserbukan. Tanaman yang masih segar ataupun tanaman


31

yang telah dikeringkan dapat digunakan sebagai sumber untuk mengumpulkan senyawa pada tanaman (Tiwari et al., 2011). Penelitian ini digunakan tanaman yang telah dikeringkan dikarenakan senyawa dapat mengalami kerusakan bila senyawa segar dan tidak dikeringkan karena tanaman memiliki enzim yang dapat merusak senyawa antioksidan sehingga perlu dilakukan pengeringan terlebih dahulu untuk mengurangi kerusakan sanyawa yang terkandung (Andersen and Markham, 2006). Proses pengeringan dilakukan setelah penyortiran dan pencucian yang bertujuan untuk mengurangi kontaminasi dari benda asing yang mungkin akan menjadi pengacau dalam penelitian baik berupa debu, atau bagian tanaman lain. Proses pengeringan dengan cara diangin-anginkan dan ditutup dengan kain hitam. Tanaman ditutup kain hitam bertujuan untuk mengurangi UV yang mungkin dapat merusak senyawa antioksidan yang terdapat pada tanaman tersebut (Andayani, Lisawati dan Maimunah, 2008). Pengeringan dihentikan ketika daun sudah kering dengan tanda rapuh dan mudah dipatahkan. Daun yang telah kering tersebut kemudian diserbuk dengan menggunakan blender sampai halus. Kemudian serbuk diayak dengan nomor mess 40. Tujuan dari dilakukannya penyerbukan ini adalah untuk memperbesar luas permukaan simplisia yang akan kontak dengan cairan penyari. Luas permukaan yang besar ini akan mengoptimalkan pembasahan serbuk simplisia oleh cairan penyari sehingga hasil penyariannya juga akan optimal. Dan pengayakan dilakukan untuk penyeragaman partikel dengan ukuran yang telah ditentukan sehingga diharapkan didapatkan penyarian yang optimum.


A

32

B

Gambar 3 . Persiapan ekstraksi (A= daun yang akan diserbukan, B= daun yang telah diserbukan)

Kesuksesan dari hasil pengambilan komponen aktif dari tumbuhan didasarkan dari tipe pelarut yang digunakan dalam prosedur ekstraksi. Karakter dari pelarut yang baik adalah memiliki ketoksikan rendah, mudah diuapkan pada suhu rendah, mampu mengabsorbsi dengan baik, memiliki sifat pengawet, tidak memiliki kemampuan yang menyebabkan disosiasi atau kompleks dengan ekstrak (Ellof, 1998). Etanol dipilih sebagai pelarut dikarenakan etanol lebih mempresentasikan jumlah polifenol yang lebih baik dibandingkan dengan ekstrak air, lebih efisien dalam menembus dinding sel dan menarik polifenol untuk keluar dalam sel, dan bersifat preservative terhadap mikroorganisme (Lapornik et al., 2005). Etanol dengan konsentrasi 70% dengan 30 % air dipilih karena komponen bioaktif flavonoid memiliki konsentrasi lebih besar dibandingkan dengan etanol secara murni (Biomakr, 2010). Hal terpenting penting dalam pemilihan etanol sebagai pelarut adalah ketoksikannya yang rendah dibandingkan metanol walaupun metanol memiliki kepolaran yang lebih tinggi, namun pada metanol memiliki sifat sitotoksik yang tidak sesuai dengan tujuan penelitian mengingat akan hazard yang ditimbulkan (Tiwari et al., 2011).


33

Proses ekstraksi menggunakan metode maserasi yaitu dengan cara menjaga pelarut tetap kontak dengan pelarut dengan suatu putaran pada beberapa waktu tertentu sampai seluruh senyawa terlarut. Metode ini cocok untuk senyawa yang tidak tahan terhadap suhu yang tinggi (Ncube et al., 2008). Ekstraksi dengan maserasi dilakukan dengan merendam sampel daun benalu dalam cairan penyari, yaitu etanol 70% selama 5 hari pada temperatur kamar dengan perbandingan pelarut: serbuk (10:1) (Depkes RI, 1986). Maserasi dilakukan dengan menggunakan alat bantu berupa shaker yang digunakan untuk membantu proses maserasi, tujuannya adalah dengan bantuan energi mekanik yaitu penggojogan yaitu untuk mengoptimalkan pelarut yang kontak dengan serbuk sehingga tidak terjadi pengendapan atau settling. Pengendapan ini akan mengurangi daya untuk menyari senyawa pada serbuk, hal ini diakibatkan oleh luas kontak dengan solven semakin kecil karena partikel berikatan dengan kuat antar partikel tersebut. Selain itu penggojogan ini berfungsi untuk menjaga gradien konsentrasi supaya difusi cairan penyari dapat menyari secara optimal saat larutan mulai jenuh. Setelah 5 hari dilakukan maserasi kemudian penyari dicuci dengan sisa etanol sambil divakum dengan corong Buchner. Tujuannya adalah untuk mempercepat proses penyaringan dibandingkan dengan penyaringan biasa, dan mendapatkan hasil yang lebih banyak. Setelah itu, pelarut etanol diuapkan menggunakan alat vaccum rotary evaporator pada suhu 80oC dan tekanan rendah hingga diperoleh ekstrak pekat etanol. Kemudian cawan porselin yang kosong ditimbang untuk mengetahui bobot ekstrak nantinya setelah pemekatan. Ekstrak pekat selanjutnya diuapkan lagi dengan waterbath hingga


34

diperoleh ekstrak kental etanol 70%. Penguapan dengan tekanan rendah akan mempercepat proses penguapan karena pelarut akan menguap pada suhu di bawah titik didihnya dan rusaknya zat aktif akibat kontak dengan panas berlebihan dapat dihindari. Bobot ekstrak etanol yang didapat adalah 14,7 g dan rendemen yang didapat dari ekstrak etanol daun benalu adalah 16,34 %. Hasil ekstrak yang berupa ekstrak kental tersebut disimpan di lemari pendingin untuk menjaga agar estrak tetap baik selama penyimpanan sampai dilakukan tahap selanjutnya.

2. Hasil fraksinasi ekstrak Setelah

didapatkan

ekstrak

kental

etanol

tersebut,

kita

harus

mengekstraksi lagi senyawa tersebut dengan wasbensin. Hal ini dimaksudkan agar menghilangkan senyawa-senyawa yang tidak diinginkan pada tumbuhan seperti lipid dan klorofil. Menurut Snyder (1997) wasbensin memiliki indeks polaritas 3,8 yang berarti bersifat sangat non polar, sehingga dapat digunakan untuk mengekstraksi senyawa non polar seperti klorofil, vitamin, minyak, lemak dan aglikon flavonoid yang non polar misalnya aglikon isoflavon dan termetoksilasi (Harborne, 1987). Pemisahan

senyawa-senyawa

non

polar

menggunakan

wasbensin

menggunakan metode ekstraksi cair-cair. Prinsip pemisahan dengan ekstraksi caircair adalah pemisahan senyawa berdasarkan kepolaran suatu senyawa dengan 2 pelarut yang berbeda kepolarannya. Ekstrak etanol dilarutkan dengan air hangat dan diektraksi dengan corong pisah dengan perbandingan 1:1. Kemudian digojog dengan perlahan sebanyak lima kali yang bertujuan untuk memudahkan dalam pemisahan dengan pencampuran. Kemudian pada corong pisah terdapat 2 fase, yaitu fase nonpolar yaitu yang terlarut dalam wasbensin dan fase polarnya yaitu yang terlarut


35

dengan wasbensin. Fase air-nya akan berada di bawah karena air memiliki berat jenis yang lebih besar, yaitu 1 pada suhu kamar dan wasbensin akan berada di atas karena berat jenisnya yang lebih kecil yaitu 0,730 dan air memiliki bobot jenis 0,996 (Depkes RI a, 1995). Fase airnya ini diekstraksi lagi dengan wasbensin sebanyak tiga kali. Hal ini dimaksudkan agar senyawa-senyawa non polar ini dapat terpisah sempurna ke dalam pelarut wasbensin tersebut. Setelah dilakukan pemisahan senyawa yang tidak dinginkan tersebut kemudian dilakukan fraksinasi kembali dengan menggunakan etil asetat. Hal ini bertujuan untuk mengarahkan senyawa-senyawa yang lebih larut dengan etil asetat untuk kita uji aktivitas antioksidannya. Jenis flavonoid yang merupakan kandungan

utama

benalu

adalah

quercetin

3-rhamnoside

dan

kaempferol

3-

rhamnoside(Sukpondma,et al, 2000). Kadar kuersetin yang terkuantitatif dalam benalu yang didapat dari Dendrophthoe pentandra inang pohon purring 35,1 mg/g; dan pada tanaman randuuntuk benalu Dendrophthoe pentandra sebesar 39,8 mg/g (Rosidah, dkk.,1999). Darmawan dan Artanti, (2006), juga mengatakan “Isolat yang berhasil diisolasi dari ekstrak air daun benalu D. pentandra adalah senyawa quercetin 3-ramnosida, yang merupakan salah satu senyawa aktif antioksidan dari golongan flavonoid dengan nilai IC50 9,4 ppm”. Kuersetin adalah salah satu golongan flavones yang merupakan senyawa aglikon yang bersifat lebih non polar (Andersen and Markham, 2006), sehingga dengan adanya fraksinasi etilasetat tersebut lebih menspesifikan pada senyawa flavonoids dengan golongan isoflavones, flavanones, methylated flavones, and flavonols (Andersen and Markham, 2006). Selain itu, adanya gula yang mungkin terkandung pada ekstrak ini akan menjadi interferensi dalam uji fenolik total (Leamsomron et al, 2009).


36

Fraksi etil asetat juga dipisahkan dengan metode ekstraksi cair-cair. Sejumlah ekstrak air yang didapatkan setelah pemisahan dengan wasbensin ini dilarutkan dengan etil asetat (1:1). Dibuat perbandingan sama juga bertujuan untuk mengurangi resiko perpindahan solute karena adanya perbedaan jumlah pelarut. Jika zat padat ditambahkan ke dalam campuran dari dua cairan tidak bercampur, zat itu akan mendistribusi diri menjadi dua fase sehingga keduanya menjadi jenuh(Martin, Swarbick, dan Cammarata, 1990). Ekstrak air kemudian diekstraksi sebanyak

tiga

kali.

Ekstraksi

berulang-ulang

ini

bertujuan

memaksimalkan perpindahan zat sesuai kepolarannya. Karena untuk mendapatkan hasil yang efisien jumlah pengulangan harus besar (Martin, Swarbick, dan Cammarata, 1990). Fraksi etilasetat kemudian diuapkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak yang pekat. Digunakan vaccum rotary evaporator bertujuan untuk meminimalkan kerusakan senyawa fenolik karena pemanasan. Sisa fraksi etil asetat kemudian dipanaskan dengan waterbath untuk menguapkan sisa pelarut sehingga didapatkan ekstrak kental. Sebelumnya cawan ditimbang untuk mendapatkan bobot fraksi etil asetat. Fraksi kental etil asetat kemudian ditaruh dalam cawan petri yang dibungkus dengan plastik dan ditutup dengan alumunium foil supaya tidak terpapar udara dan sinar UV yang mungkin terpejankan dan dapat mendegradasi senyawa fenolik yang terkandung. Fraksi etil asetat yang sudah dibungkus dimasukkan didalam desikator agar tidak terpapar lembab dan ditumbuhi jamur atau mikroba. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,73 g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,81%.


A

B

37

C

Gambar 4. Pemakaian alat (A=Corong pisah, B= Integrasi vaccum dan corong Buchner, C= vaccum rotary evaporator)

D. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Tujuan dilakukan uji pendahuluan ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif aktivitas antioksidan dari fraksi air ekstrak etanolik daun benalu (Dendrophthoe pentandra (L). Miq.). Uji ini menggunakan reaksi antara senyawa uji dan DPPH. Prinsip dari metode DPPH dalam mengetahui aktivitas antioksidan adalah didasarkan dari reaksi reduksi dari DPPH. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu ruangan dan berwarna violet dalam metanol. Radikal bebas tersebut merusak rantai yang bertanggung jawab sebagai warna tersebut menjadi warna kuning ketika radikal bereaksi dengan antioksidan

(Badarinath et al.,

2010). Pengujian fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu ini menunjukan warna kuning saat direaksikan dengan DPPH yang menanjukan bahawa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu positif memiliki aktivitas antioksidan. Aktifitas dibuktikan dengan dibandingkan dengan kontrol positif yang digunakan adalah kuersetin.


B

A

38

C

Gambar 5. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif [blanko],B = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu]+DPPH, C =kontrol positif [kuersetin]

2. Uji pendahuluan fenolik Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif kandungan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu. Prinsip uji ini adalah reaksi oksidasi reduksi dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat menghasilkan suatu produk yang berwarna biru disekitar panjang gelombang 745-750 nm (Huanget al., 2005). Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan ion fenolik yang teroksidasi oleh kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat, juga semakin pekatnya warna biru yang terbentuk juga menandakan semakin banyak kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat yang tereduksi (Singleton and Rossi, 1985). Hasil yang diperoleh menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol benalu berwarna biru setelah direaksikan dengan Folin–Ciocalteu dan natrium karbonat, berbeda dengan kontrol negatif tanpa larutan uji yang berwarna bening dan memiliki warna yang mirip dengan kontrol positif yaitu asam galat.


B

A

39

C

Gambar 6. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol negatif [blanko], B = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu]+Folin Ciocalteu dan Na2CO3, C =kontrol positif [asam galat])

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks) Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan bertujuan untuk mendapatkan daerah serapan maksimum DPPH atau absorbsi maksimum untuk mendapatkan hasil lineritas dari pengukuran kurva baku. DPPH merupakan senyawa yang memiliki warna violet dengan panjang gelombang maksimum teoritis 517 nm. Namun dalam prakteknya, panjang gelombang yang dihasilkan tidak memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang teoritis, hal ini tergantung dari instrumen pengukuran yang digunakan. Warna yang ditimbulkan ini muncul karena DPPH memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Menurut Fessenden (1986) kromofor adalah struktur parsial yang berperan dalam warna (gugus tak jenuh yang dapat menjalani transisi π→π* dan n→π* dan auksokrom adalah gugus yang tidak dapat menjalani transisi π→π* tetapi dapat menjalani transisi elektron n).


40

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi, yaitu pada konsentrasi tinggi, tengah dan rendah yaitu 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Hal ini bertujuan agar dapat mempresentasikan panjang gelombang maksimum untuk kurva baku dari setiap konsentrasi. Absorbansi sampel dihitung dengan auto zero menggunakan pelarut yang digunakan yaitu metanol. Hal ini dilakukan supaya tidak adanya gangguan serapan dari metanol atau kontaminan yang mungkin tercemar dalam metanol. Rata-rata panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut adalah 515,5 nm. Seperti yang telah digunakan 515,5nm (Rollando, 2012), 515 nm (Bondet, et al., 1997). Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi Konsentrasi larutan DPPH

λ maksimum hasil scanning

λ maksimum rata-rata

λ maksimum teoritis

0,02 mM 0,04 mM 0,08 mM

515.5 515.5 515.5

515.5

517

2. Penentuan Operating Time Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan waktu optimum dimana reaksi antara baku pembanding (kuersetin) dan larutan uji (fraksi etil asetat ekstrak etanol) terhadap reagen (DPPH) yang diberikan. Penentuan Operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. Estimasi waktu yang dilihat adalah dalam waktu satu jam dengan selang waktu lima menit. Waktu dihitung setelah reagen dicampurkan dan absorbansi pertama dihitung setelah lima menit pertama.


41

Panjang gelombang maksimum yang dipakai adalah panjang gelombang yang telah didapatkan dalam penetapan λ maksimal yaitu 515,5 nm.

Gambar 7. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 2)

Gambar 8. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat (Replikasi 2)

Dari hasil yang diperoleh baik kuersetin dan fraksi etil asetat memiliki OT yang sama yaitu 30 menit. Penyimpulan waktu operating time 30 menit dikarenakan pada waktu ini reaksi mulai stabil atau bereaksi sempurna. Hal ini


42

diyakinkan dengan selisih waktu yang semakin kecil. Nilai OT 30 menit merupakan waktu yang sering dipergunakan dalam mereaksikan DPPH (Molyneux, 2004).

F. Validasi Metode Analisis Penetapan Aktivitas Antioksidan Tujuan dilakukan validasi metode analisis adalah untuk membuktikan bahwa metode penelitian yang digunakan memenuhi persyaratan sehingga didapatkan hasil yang sesuai dan dapat dipercaya. Dalam pengerjaan suatu penelitian mungkin peneliti akan dihadapkan hasil yang bias dengan hasil yang sebenarnya tanpa dilakukan validasi metode. Dalam suatu metode analisis setiap proses pengerjaannya harus tervalidasi atau terkontrol. Beberapa validasi yang dilakukan saat pengerjaan: a.

Pemilihan sampel harus representative, yaitu sampel yang diambil harus

mewakili sampel lainnya. Pada penelitian dilakukan dengan cara pengambilan daun diambil di setiap dahan dari beberapa pohon. Semua daun yang baik diserbukkan dan dihomogenkan. Sehingga dalam waktu sampling cukup mewakili sampel lainnya. b.

Error yang mungkin terjadi dalam penelitan seperti random error ataupun

systematic error. Random error mungkin terjadi seperti saat melarutkan dimana dalam melarutkan harus di bawah miniskus larutan. Systemic error mungkin terjadi saat suhu ruangan yang tidak terkontrol. Error tersebut dapat membuat hasil menjadi bias. Bias hasil adalah nilai yang berbeda dari nilai sebenarnya (Burgess,2000). Maka dalam metode analisis perlu dilakukan parameter-


43

parameter untuk menilai error yang mungkin terjadi. Karakteristik hasil biasanya rata-rata atau nilai yang representative dengan nilai analit dalam sampel, dan mengestimasi nilai ketidakpercayaan nilai. Random error bisa diekspresikan dari standar deviasi sampel. Dan biasanya nilai ini lebih bermakna bila dihubungkan dengan rerata yang merupakan koefisien variasi (%CV). Bias juga dapat dilihat dari nilai % recovery (Prichard, 2001).Parameter lain yang dibutuhkan untuk menilai menilai bias adalah linearitas dan spesifisitas. c.

Untuk mengurangi kesalahan pembacaan hasil maka digunakan uji

kebermaknaan. Uji kebermaknaan melibatkan suatu perbandingan antara faktor eksperimental terhitung dengan faktor yang sudah ada di dalam tabel statistika yang ditentukan dengan sejumlah nilai dari suatu serangkaian data percobaan dan tingkat probabibilitas yang terpilih, sehingga membuat keputusan yang diambil menjadi benar (Sudjadi, 2007). 1. Linearitas metode uji antioksidan Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita, 2004). Dalam penentuan yang baik konsentrasi kurva kalibrasi minimum terdiri dari lima konsentrasi dengan jarak antara 50-150%. Sedangkan untuk koefisien korelasi adalah 0,995 ataupun diharapkan lebih dari nilai tersebut (Chan et al., 2004). Linearitas ini didapat dengan membuat kurva kalibrasi antara konsentrasi kuersetin dan fraksi etil asetat yang telah direaksikan dengan DPPH pada OT vs


44

absorbansi yang diperoleh sebanyak tiga replikasi. Hasil pengukuran kuersetin danfraksi etil asetat ditunjukan pada tabel V dan VI. Tabel IV . Hasil pengukuran absorbansi kuersetin yang direaksikan dengan DPPH Replikasi 1 Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) terukur

5,2 7,8 10,4 13 15,8

0,653 0,563 0,475 0,377 0,288

y = -0,035x + 0,833 r= -0,9997

Kuersetin Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) terukur (µg/mL) terukur

5 7,5 10 12,5 15

0,663 0,572 0,473 0,385 0,292

y = -0,037x + 0,849 r = -0,9998

5 7,5 10 12,5 15

0,656 0,559 0,480 0,395 0,311

y = -0,028x + 0,82 r = -0,9995

Tabel V. Hasil pengukuran absorbansi fraksi etil asetat ekstrak etanolik yang direaksikan dengan DPPH

Replikasi 1 Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) terukur

6,05 9,07 12,10 15,12 18,14

0,589 0,521 0,422 0,357 0,275

y = -0,026x + 0,7496 r = -0,9983

Fraksi etil asetat ekstrak etanol Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) terukur (µg/mL) terukur

6,02 9,04 12,05 15,06 18,07

0,559 0,498 0,410 0,356 0,265

y = -0,024x + 0,7096 r = -0,9971

6,02 9,04 12,05 15,06 18,07

0,570 0,506 0,421 0,346 0,259

y = -0,026x + 0,733 r = -0,9988

Dari seri baku kuersetin menggunakan persamaan linear regresi dari replikasi 2 dengan persamaan y = -0,037x + 0,849 (tabel V ) karena nilai r yang dihasilkan merupakan yang paling baik dari tiga replikasi yang telah dilakukan yaitu 0,9998. Sedangkan untuk fraksi etil asetat ekstrak etanol didapatkan persamaan y = -0,026x + 0,733 dengan nilai r = 0,9988 (tabel VI). Persamaan ini yang akan digunakan untuk perhitungan presisi.


45

2. Presisi metode uji antioksidan Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004). Presisi ini diukur dari nilai SD dan CV. SD (Standar Deviasi) menunjukan seberapa dekat hasil dari serangkaian data dengan rata-ratanya (Harris, 2010). Coefficient of Variation (CV) atau sering disebut Relative Standard Deviation (RSD) merupakan nilai perbandingan Standar Deviasi dan rata-ratanya yang dinyatakan dalam bentuk persen yang menggambarkan relatif eror dari suatu penelitian analisis (Miller dan Miller, 2010).

Untuk

memperkirakan

keraguan

dapat

menggunakan

interval

kerpercayaan. Interval kepercayaan adalah jarak dari sebuah rata-rata sampel yang dipercaya masuk dalam populasi rata-rata dengan suatu probabilitas seperti 95% atau 99%. Interval kepercayaan 95% pada sebuah rata-rata dihitung dengan: 𝑥± df (σ/ 𝑛) (Hibbert and Gooding, 2006). Tabel VI. Nilai presisi uji aktivitas antioksidan kuersetin Kuersetin Rerata konsentrasi 5,07 7,60 10,13 12,67 15,27

Rerata abs 0,657 0,565 0,476 0,386 0,297

SD

CV

0,0051 0,0067 0,0037 0,0090 0,0123

0,78 0,18 0,76 2,34 4,14

Interval kepercayaan 95% 0,0127 0,0165 0,0090 0,0224 0,0305


46

Tabel VII. Nilai presisi uji aktivitas antioksidan etil asetat Fraksi etil asetat Rerata konsentrasi 6,03 9,05 12,06 15,08 18,10

Rerata abs 0,573 0,508 0,418 0,353 0,266

SD

CV

0,0152 0,0117 0,0067 0,0061 0,0081

2,65 2,30 1,59 1,72 3,03

Interval kepercayaan 95% 0,0377 0,0290 0,0165 0,0151 0,0201

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari pengukuran tiga replikasi dari kelompok tersebut didapatkan rerata SD kuersetin dari lima konsentrasi tersebut adalah 0,0073 dan CVsebesar 1,84%. Hal ini menunjukan bahwa hasil yang didapatkan memenuhi persyaratan. Menurut Kingstone (2004), CV yang baik adalah CV ≤ 20%. untuk konsentrasi analit <0,1%b/v. Hasil fraksi etil asetat yang diperoleh dari pengukuran tiga replikasi dari kelompok tersebut didapatkan rerata SD kuersetin dari lima konsentrasi tersebut adalah 0,0095 dan CV sebesar 2,26%. Hal ini menunjukan bahwa hasil yang didapatkan memenuhi persyaratan (CV ≤ 20%) (Kingstone, 2004). Dari perhitungan interval kepercayaan 95% didapatkan rata-rata absorbansi yang didapatkan dengan nilai yang tertera pada tabel VII dan VIII. 3. Spesifisitas metode uji antioksidan Hasil dari kromatogram merupakan representatif untuk spesifisitas dengan tidak adanya interferensi yang ditunjukan dari media atau eksipient (Chan et al., 2004). Hasil scanning pada larutan pembanding kuersetin (Lampiran 6c) dan larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6e) pada panjang gelombang 515,5 nm tidak terdapat serapan. Artinya tidak terdapat kontaminan atau senyawa lain yang


47

terukur pada panjang gelombang tersebut yang dapat mengganggu pembacaan DPPH karena adanya interferensi atau overlapping. Karena jika terdapat interferensi akan sulit membedakan antara serapan DPPH atau senyawa lain. Dapat disimpulkan metode uji aktivitas antioksidan untuk kuersetin dan fraksi etil asetat memiliki spesifisitas yang baik. Hasil dari validasi metode analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa metode penangkapan radikal bebas DPPH oleh kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu sebagai antioksidan terbukti sudah baik dalam linearitas, presisi dan spesifisitas sehingga hasil yang diperoleh dapat dipercaya.

G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH Uji aktivias antioksidan dilakukan dengan metode penangkapan radikal (radical scavenging) terhadap radikal 2,2-difenil-1-pikril hidrazil (DPPH). Prinsip metode ini adalah melihat

kemampuan antioksidan dengan mengukur

pengurangan intensitas warna dari DPPH akibat penangkapan elektron radikal DPPH oleh antioksidan yang menjadi berikatan dengan hidrogennya DPPH-H. Hasil dari pengurangan warna ini merupakan stokiometri terhadap jumlah dari elektron yang ditangkap (Bondet, et al., 1997). DPPH• + AH ↔DPPHH + A• Reversibilitas dari reaksi telah dievaluasi saat penambahan jumlah DPPH pada saat akhir dari reaksi. Jika terdapat peningkatan dalam persentase dari penurunan DPPH• pada saat plateu (reaksi mulai stabil) reaksi yang terjadi adalah


48

reversibel, meskipun reaksi ini telah (complete reaction) selesai (Bondet, et al.,1997). Keuntungan metode DPPH ini adalah teknik yang mudah, efektif, cepat dalam pengerjaan penelitian karakteristik ekstrak tanaman, tidak membutuhkan pemisahan sampel, dan potensi sampel dapat diketahui (Badarinath, 2010). Peneliti menduga bahwa daun benalu memiliki potensi sebagai antioksidan. Secara empiris tanaman benalu ini memiliki khasiat antikanker, dan dalam penelitian yang dikatakan Rusidah et al., 1999, mengatakan bahwa benalu ini memiliki kandungan utama berupa kuersetin dan quercetin 3-o-ramnosida (Darmawan dan Artanti, 2006). Kuersetin ini merupakan senyawa flavanoid yang cukup kuat sebagai senyawa antioksidan, sehingga tujuan penelitian ini untuk mengetahui seberapa besar senyawa antioksidan pada daun benalu tersebut. Pada penelitian ini digunakan kontrol positif berupa kuersetin, yang dimaksudkan untuk melihat potensi kekuatan fraksi etil asetat ekstrak etanol dari benalu dibandingkan senyawa kuersetin yang telah terbukti sebagai senyawa flavonoid yang kuat sebagai antioksidan. Sebagai blangko adalah pelarut yang digunakan dalam mengukur dengan spektrofotometri visibel. Pelarut yang digunakan adalah metanol. Digunakan metanol dikarenakan metanol terbukti tidak mengganggu (interferensi) dalam reaksi DPPH (Molyneux, 2004). Pengukuran dilakukan dalam panjang gelombang maksimum hasil scanning yaitu 515,5.


OH

49

O

OH

HO

OH

DPPH

O

DPPH-H

HO

O

OH

OH

OH

O

O

OH

quercetin

O

DPPH

O

DPPH-H HO

O

DPPH

Kuersetin

OH

OH

DPPH-H

OH

O

O OH

O O HO

HO

O O

O

HO

OH

O

O

O

O

HO

O

OH

O

OH

OH

O

O

O

OH

O

Reaksi polimerisasi

O

DPPH R

R

O

N O N

R1

H HO

O

OH

OH

O

Transformasi kuersetin dengan DPPH

Gambar 9 . Pendekatan skema reaksi yang mungkin terjadi antara radikal 2,2difenil-1-pikril hidrazil (DPPH) dengan bentuk transformasi dengan DPPH ataupun dengan kuersetin.


50

Reaksi penghambatan radikal bebas DPPH oleh karena adanya kuersetin ditunjukkan pada gambar 10, dimana radikal bebas DPPH yang bereaksi dengan antioksidan akan mengikatH yang berasal dari senyawa antioksidan, sehingga sifat radikal bebas yang dimiliki oleh DPPH akan hilang. Karena DPPH-H tidak lagi berbentuk radikal lagi maka delokalisasi elektron tidak terjadi yang menyebabkan intensitas warna mulai menghilang. Reaksi lain yang mungkin terjadi setelah kuersetin menjadi radikal adalah transformasi dari radikal dengan DPPH ataupun dimerisasi dengan sesama kuersetin dan menjadi polimerisasi. Berkurangnya intensitas warna DPPH berjalan dengan stokiometri yaitu sebanding dengan konsentrasi senyawa antioksidan. Parameter yang digunakan untuk aktivitas antioksidan dengan metode penangkapan radikal DPPH ini adalah IC50 yakni konsentrasi senyawa uji yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar 50 %. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi larutan uji dengan persen penangkapan radikal. Semakin kecil nilai IC50 senyawa uji, berarti semakin kuat senyawa uji tersebut sebagai antioksidan. Persamaan regresi linier dan hasil pengukuran % IC untuk kuersetin ditunjukan pada tabel IX dan gambar 10.


51

Tabel VIII. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) kontrol

Replikasi

5,2 7,8 10,4 13 15,8 5 7,5 10 12,5 15 5 7,5 10 12,5 15

I

II

III

0,862

0,859

0,865

Absorbansi kuersetin

% IC

0,653 0,563 0,475 0,377 0,288 0,663 0,572 0,473 0,385 0,292 24,1618 35,3757 44,5087 54,3353 64,0462

24,25 34,69 44,90 56,269 66,59 22,82 33,41 44,94 55,18 66,01 23,90 35,15 44,31 54,18 63,92

Persamaan regresi linier y = 4,024x + 3,323 r=0,9997

y = 4,326x + 1,210 r=0,9999

y = 3,949x + 4,994 r=0,9995

Kurva konsentrasi vs % IC kuersetin 80 70 absrobansi

60 50 40 30 20 10 0 0

5

10

konsentrasi (µg/mL)

15

20 y = 4.326x + 1.210 R² = 0.999

Gambar 10. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin

Hasil IC50 yang didapatkan dari kuersetin sebesar 11,40 µg/mL artinya untuk menangkap radikal bebas sebesar 50% diperlukan konsentrasi kuersetin sebesar 11,40 µg/mL. Hasil ini didapatkan dengan persamaan y = 4,326x + 1,210 regresi linear dan r= 0,9999. Nilai r yang mendeakati satu ini menandakan


52

kevalidan dalam kurva kalibrasi yang mendekati linear (perbandingan antara tiap konsentrasi dan aktivitas antioksidan hampir sama). Gambar berikut adalah kurva regresi linear antara konsentrasi kuersetin dengan rata-rata aktivitas antioksidan menggunakan metode penangkapan radikal DPPH. Persamaan regresi linier dan hasil pengukuran % IC untuk fraksi etil asetat ekstrak etanolik ditunjukan pada tabel X. Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etilasetat ekstrak etanol daun benalu dengan metode DPPH Konsentrasi Absorbansi Absorbansi Persamaan regresi Replikasi (µg/mL) kontrol larutan uji % IC linier

I

II

III

6,05 9,07 12,10 15,12 18,14 6,02 9,04 12,05 15,07 18,07 6,02 9,04 12,05 15,06 18,07

0,848

0,819

0,821

0,589 0,521 0,422 0,357 0,275 0,559 0,498 0,410 0,356 0,265 0,57 0,506 0,421 0,346 0,259

30,54 38,56 50,24 57,90 67,57 31,75 39,19 49,94 56,53 67,64 28,26 36,54 48,560 56,52 66,50

y = 3,088x + 11,60 r = 0,9983

y = 2,959x + 13,3576

r= 0,9971

y = 3,202x + 8,696 r = 0,9983

Hasil IC50 yang didapatkan dari kuersetin sebesar 12,78µg/mL. Hal ini menunjukan dalam menangkap radikal bebas sebesar 50% diperlukan konsentrasi kuersetin sebesar 12,57 µg/mL. Gambar 11 berikut adalah kurva regresi linear antara konsentrasi kuersetin dengan rata-rata aktivitas antioksidan menggunakan metode penangkapan radikal DPPH.

absrobansi


53

Kurva konsentrasi vs % IC fraksi etil asetat

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.000

5.000

10.000

15.000


y =20.000 3.162x + 10.69 R² = 0.997

Gambar 11. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat

Nilai r yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah 0,9999 untuk kuersetin dan 0,9989 untuk fraksi etil asetat, dimana nilai ini berada di atas nilai r yang dipersyaratkan 0,995 (Chan et al., 2004). sehingga uji antioksidan yang dilakukan dalam penelitian ini baik dalam linearitas. Tabel X. Hasil perhitungan IC50 dan kuersetin Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu Kuersetin Replikas i I II III

IC50 (µg/mL)

Rerata (µg/mL)

SD

CV

Interval kepercayaan (95%)

11,60 11,28 11,40

11,42

0,16

0,42

0,40

Fraksi etil asetat Replikas i I II III

IC50 (µg/mL)

Rerata (µg/mL)

SD

CV

Interval kepercayaan (95%)

12,43 12,38 12,90

12,57

0,28

2,26

0,70

Dari hasil IC50 antara kuersetin dan fraksi etil asetat tidak memiliki perbedaan yang besar yaitu 1,15 µg/mL. Nilai CV yang dihasilkan dari hasil


54

pengukuran kuersetin dan fraksi etilasetat ekstrak etanol yaitu sebesar 0,42 dan 2,26%, sehingga CV dikatakan memenuhi persyaratan analisis karena CV ≤20% (Kingstone, 2004), hal ini berarti bahwa uji antioksidan yang dilakukan mempunyai presisi yang bagus dan cukup reprodusibel. Hipotesis komparatif Variabel numerik Sebaran Normal ?

Tidak

Ya

Berpasangan

UJI NON PARAMETRIK

Tidak Berpasangan Jumlah kelompok?

2 kelompok Varian?

sama

>2 kelompok Varian?

berbeda

sama

berbeda

UJI PARAMETRIK YANG SESUAI

Gambar 12.Diagram alur uji hipotesis variable numerik (Dahlan, 2012).

Dalam

pembacaan

hasil

digunakan

uji

kebermaknaan

untuk

membandingan antara faktor eksperimental dengan statistik agar keputusan yang diambil benar. Software yang dipakai dalam pengujian dengan statistik adalah R 2.14.1. Uji yang pertama dilakukan adalah uji normalitas Shapiro-wilk. Menurut Dahlan (2012), uji normalitas Shapiro-wilk digunakan jika data berjumlah kurang


55

dari lima puluh. Pengujian distribusi normal tersebut digunakan untuk melihat distribusi data tersebut mengikuti distribusi normal atau distribusi tidak normal. Jika data mengikuti distribusi normal bisa memakai mean sedangkan jika tidak bisa menggunakan median dalam perhitungan. Uji normalitas ini menentukan jenis uji selanjutnya yang digunakan (parametrik dan nonparametrik). Jika data berdistribusi normal maka jenis uji selanjutnya adalah uji parametrik, tetapi jika data berdistribusi tidak normal maka jenis uji selanjutnya adalah uji nonparametrik. Hasil statistik menunjukkan nilai p sebesar 0,9488 dan 0,4029 masing-masing untuk IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat. Bila dilihat dari nilai p dari kuersetin dan fraksi etil asetat memiliki nilai p lebih dari 0,05 (taraf kepercayaan 95%) maka Hnull diterima karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih besar daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Dapat disimpulkan bahwa IC50 kuersetin maupun fraksi etil asetat mengikuti distribusi normal. Karena data mengikuti distribusi normal maka uji dapat dilanjutkan dengan uji parametrik. Sesuai dengan jenis penelitian uji parametrik yang digunakan adalah uji t tidak berpasangan. Uji t tidak berpasangan dilakukan untuk melihat adanya perbedaan antara rerata dari. Dari hasil perhitungan dengan program R tersebut didapatkan nilai p adalah 0,0079 Bila dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan, yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%) Hnull ditolak karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih kecil daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa nilai rerata IC50 kuersetin berbeda dengan IC50 fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu .


56

14.0000 13.5000 13.0000 12.5000 12.0000

IC 50 kuersetin

11.5000

IC 50 fraksi

11.0000 10.5000 10.0000 IC50

Gambar 13. Histogram rerata IC50 dari kuersetin dan fraksi etil asetat dengan interval kepercayaan 95%

Berdasarkan penggolongannya kuersetin dan fraksi etil asetat ini merupakan senyawa dengan intensitas kekuatan antioksidan yang besar karena memiliki nilai IC50 kurang dari 50 µg/mL (Tabel XIII). Fraksi etil asetat memiliki aktivitas yang mirip dengan kuersetin ini dikarenakan karena senyawa utama yang terkandung di dalamnya adalah kuersetin. Terdapat kemiripin nilai IC50 yang dihasilkan. Walaupun nilai yang dihasilkan lebih kecil karena dalam suatu fraksi etil asetat kita tidak dapat memastikan hanya satu senyawa yang terkandung dalam senyawa tersebut. Perlu dilakukan analisa lebih lanjut dalam skrining fitokimia untuk mengetahui apa saja senyawa yang mungkin terkandung dalam fraksi etilasetat ekstrak etanolik daun benalu tersebut.


57

1 2 3 4

Tabel XI. Perbandingan IC50 benalu dari berbagai inang Ekstrak EtOH Fraksi etil asetat ekstrak EtOH Sampel 80% IC50 (µg/mL) 70% (µg/mL) Benalu Belimbing* 21,0 Benalu Mangga* 6,4 Benalu Kenanga* 10,7 Benalu Duku* 9,6

5 6 7

Benalu Sirsak* Benalu Cemara** Benalu Mahkota Dewa*

38,7

8

Benalu Teh*

11,1

9

Benalu Kepel

No

9,4 25,2 12,57

*(Artanti, Darmawan, dan Fajriah, 2006) , ** (Darmawan dan Artanti, 2006)

Perbandingan IC50benalu dari berbagai inang ditunjukan pada tabel XIII. Aktivitas fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu masih dibawah benalu pada inang mangga, duku, kenanga, duku, teh. Perbedaan aktivitas antioksidan benalu ini dipengaruhi tanaman inang yang dihinggapinya, karena sifatnya yang semi parasit. Tabel XII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu

Intensitas

Nilai IC50

Kuersetin

Sangat kuat Kuat Sedang Lemah

<50 µg/mL 50-100 µg/mL 101-150 µg/mL >150 µg/mL

√ -

Fraksi etilasetat ekstrak etanolik √ -

Fraksi etilasetat ekstrak etanolik daun benalu memiliki aktivitas yang sangat kuat walaupun memiliki aktifitas antioksidan yang lebih kecil dengan kuersetin dan benalu diberbagai inang seperti mangga, dan teh dilihat dari nilai IC50.


58

H. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total 1. Penentuan Operating time (OT) Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan waktu optimum dimana reaksi antara baku pembanding (asam galat) dan larutan uji (fraksi etil asetat ekstrak etanol) terhadap reagen (DPPH) yang diberikan. Penentuan Operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. Estimasi waktu yang dilihat adalah dalam waktu tiga puluh menit dengan selang waktu lima menit. Waktu dihitung setelah reagen dicampurkan dan absorbansi pertama dihitung setelah lima menit pertama. Panjang gelombang maksimum yang dipakai adalah panjang gelombang yang telah didapatkan dalam penetapan lamda maks. teoritis yaitu 750 nm.

absorbansi

Penentuan Operating time Asam Galat 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL

0

10

20

30

40

waktu

Gambar 14. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)


59

Dari hasil yang ditunjukan dengan grafik (gambar 14)OT yang didapatkan dari asam galat adalah 15 menit. 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks) Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan bertujuan untuk mendapatkan daerah serapan maksimum DPPH atau absorbsi maksimum untuk mendapatkan hasil lineritas dari pengukuran kurva baku. Dalam penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi, yaitu pada konsentrasi tinggi, tengah dan rendah, yaitu 50; 100; dan 150 µg/mL. Hal ini bertujuan agar dapat mempresentasikan panjang gelombang maksimum dari setiap konsentrasi. Dalam pengerjaan, absorbansi sampel dihitung dengan auto zero menggunakan pelarut yang digunakan yaitu, metanol:air (1:1). Hal ini dilakukan supaya tidak adanya gangguan serapan dari pelarut atau kontaminan yang mungkin tercemar dalam metanol. Rata-rata panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut adalah 750 nm. Tabel XIII. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan folin ciocalteu Konsentrasi larutan Asam galat

λ maksimum hasil scanning

λ maksimum rata-rata

150 µg/mL 100 µg/mL 50 µg/mL

744 754 753

750,65

λ maksimum teoritis

750

I. Validasi Metode Analisis Penetapan Fenolik Total

Tujuan dilakukan validasi metode analisis adalah untuk membuktikan bahwa metode penelitian yang digunakan memenuhi persyaratan sehingga


60

didapatkan hasil yang sesuai dan dapat dipercaya. Dalam pengerjaan suatu penelitian mungkin peneliti akan dihadapkan hasil yang bias dengan hasil yang sebenarnya tanpa dilakukan validasi metode. Dalam suatu metode analisis setiap proses pengerjaannya harus tervalidasi atau terkontrol. Pada penetapan kandungan fenolik totat validasi yang digunakan adalah, presisi, linearitas, dan spesifisitas. 1. Linearitas metode uji fenolik total Berdasarkan hasil tiga persamaan regresi linier dalam tabel dipilih satu persamaan dengan nilai r yang paling mendekati 1 atau -1. Persamaan replikasi 3 dengan persamaan y = 0,004x + 0,1296 dengan nilai r = 0,9999. Tabel XIV. Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan dengan folin ciocalteu Asam galat Replikasi 1 Replikasi 2 Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) terukur (µg/mL) terukur 50 0,321 49,8 0,324 75 0,444 74,7 0,453 100 0,545 99,6 0,565 125 0,652 124,5 0,675 150 0,777 149,4 0,786 y = 0,004x + 0,0998 y = 0,004x + 0,1022 r= -0,9993 r = 0,9995

Replikasi 3 Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) terukur 51 0,339 76,5 0,441 102 0,551 127,5 0,653 153 0,756 y = 0,004x + 0,1296 r = 0,9999

2. Presisi metode uji fenolik total Berdasarkan hasil yang diperoleh dari pengukuran tiga replikasi dari kelompok tersebut didapatkan rerata SD asam galat dari lima konsentrasi tersebut adalah 0,0109 dan CV sebesar 2,0311%. Hal ini menunjukan bahwa hasil yang didapatkan memenuhi persyaratan. Menurut Kingstone (2004), CV yang baik adalah CV ≤ 20%. untuk konsentrasi analit <0,1%b/v.


61

Tabel XV. Nilai presisi seri baku asam galat pada penetapan kandungan fenolik total Rerata absorbansi

SD

CV

0.328 0.446 0.553 0.660 0.773

0,0096 0,0062 0,0103 0,0130 0,0154

2,94 1,40 1,85 1,97 1,99

Kepercayaan 95% 0,0239 0,0155 0,0255 0,0323 0,0382

3. Spesifisitas metode uji fenolik total Hasil scanning pada larutan pembanding asam galat (Lampiran 6e) dan larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6g) pada panjang gelombang 750 nm tidak terdapat serapan. Artinya tidak terdapat kontaminan atau senyawa lain yang terukur pada panjang gelombang tersebut yang dapat mengganggu pembacaan DPPH karena adanya interferensi atau overlapping. Karena jika terdapat interferensi akan sulit membedakan antara serapan DPPH atau senyawa lain. Dapat disimpulkan metode uji aktivitas antioksidan untuk kuersetin dan fraksi etil asetat memiliki spesifisitas yang baik.

F. Estimasi Kandungan Fenolik Total Senyawa yang berperan utama dalam aktivitas antioksidan adalah senyawa fenolik. Senyawa fenolik banyak terdistribusi dalam tanaman, maka perlu dilakukan perhitungan kandungan fenolik total yang mungkin tedapat pada fraksi etil asetat ekstrak etanol pada daun benalu tersebut. Prinsip metode kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan


62

menggunakan alkali (biasanya sodium karbonat), dimana nilai yang didapat signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011). Kompleks biru yang terbentuk terjadi dengan reaksi oksidasi reduksi dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat dengan produk warna biru sekitar panjang gelombang 745-750 nm (Ronald,et al., 2005). Reaksi yang mendasari pembentukan kompleks warna biru adalah sebagai berikut: O

H2(PMo12O12)

OH

H3PO4(MoO3)12

+

atau

+

+ H 3O

H7(PMo12O10) O

Senyawa fenol reagen Folin-Ciocalteu

kuinon

Kompleks molybdenum-blue

(Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965)

Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan jumlah ion fenolik yang teroksidasi oleh kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat, juga semakin pekatnya warna biru yang terbentuk juga menandakan semakin banyak kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat yang tereduksi (Singletonand Rossi, 1985).


63

Penetepan Kandungan Fenolik Total

0.8

absorbansi

0.7 0.6 0.5 0.4

0.3 0

50

100

150

200 y = 0.004x + 0.129 R² = 0.999


Gambar 15. Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total Tabel XVI. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu Replikasi

fenolik total (mg ekivalen)

I

13.89

II

14.05

III

13.34

rata-rata

13.76

SD

0.3724

CV (%)

2.7065

Rentang kepercayaan 95% 0,92

Dari ketiga persamaan yang telah didapatkan dari tiga replikasi dipilih persamaan yang paling linear yang ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi linear yang paling baik diperoleh dari replikasi III dengan y = 0,004x + 0,1296 dan r sebesar 0,999. Berdasarkan perhitungan intrapolasi persamaan regresi linear y = 0,004x + 0,1296; maka didapatkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu sebesar 13,76±0,92 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat dengan nilai CV sebesar 3,67 % yang termasuk baik karena kurang dari 20% (Kingstone, 2004).


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1.

Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan sebagai IC50 sebesar (12,57 ±0,7) μg/mL (taraf kepercayaan 95%).

2.

Kandungan fenol total pada fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat sebesar (13,76±0,9) mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu (taraf kepercayaan 95%). Metode kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu belum tervalidasi.

B. Saran 1.

Perlu dilakukan pengembangan formulasi yang tepat dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu Dendrophthoe pentandra.

2.

Perlu dilakukan pengujian antioksidan pada batang dan bunga benalu.

3.

Perlu dilakukan uji korelasi lebih lanjut melalui uji statistik antara kandungan fenolat total dengan aktivitas antioksidan.

4.

Perlu dilakukan uji akurasi sebagai validasi metode dalam kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu.

64


65

DAFTAR PUSTAKA Andayani, R., Lisawati Y., dan Maimunah, 2008, Penentuan Aktivitas Abtioksidan Kadar Fenolat Total dan Likopen Pada Buah Tomat (Solanum Lycopersicum L.), http://ffarmasi.unand.ac.id/pub/JSTFFeb2009% 20_regina_.pdf, diakses tanggal 20 Desember 2012 Andersen, Oyvind M., and Markham, Kenneth R., 2006, Flavonoids, Chemistry, Biochemistryand Applications, Taylor and Francis Group, United States of America, pp. 2, 3. Ansel, C. H., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, edisi IV, UIPress, Jakarta, pp.607-609. Artanti, N., Darmawan A., Hanafi M., 2006, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif Antioksidan dari Ekstrak Air Daun Benalu (Dendrophthoe pentandra L. Miq.) yang Tumbuh pada Cemara. jurnal.pdii.lipi.go.id, 43-51. Artanti, N., Widayati, R., dan Fajriah, S., 2009, Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Ekstrak Air dan Etanol Daun Benalu (Dendrophtoe petandra L. Miq) yang tumbuh pada berbagai inang, JKTI, vol 11 No 1, 38-40. APVMA, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical Methods for Active Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products, Kingston. Backer C.A., dan Bakhuizen van den Brink RC, 1965. Flora of Java, Vol. 2. Noordhoff, Groningen, The Netherland, pp. 67–76. Badarinath, A.V., Mallikarjuna RAo, K., , Chetty, C. Madhu Sudhana, Ramkanth, S., Rajan, T.V.S, Gnanaprakash, K., 2010, A Review on In-vitro Antioxidant Methods: Comparisions, Correlations and Considerations, Int. J. Pharm. Tech. Research, Vol.2, No.2, pp. 1276-1285. Bimakr, M., 2010, Comparison of different extraction methods for the extraction of major bioactive flavonoid compounds from spearmint (Mentha spicata L.) leaves. Food Bioprod Process; 1-6. Bondet, V., Brand-Williams, W. and Berset, C., 1996, Kinetics and Mechanisms of Antioxidant Activity using the DPPH• Free Radical Method, Lebensm.Wiss. U.-Technol., vol. 30, 609–615. Chan, C.C, Lam, H., Lee, Y.C., and Zhang, X.M., 2004, Analtytical Method Validation and Instrument Performance Verification, Jhon Wiley and Sons, Inc., New Jersey pp.70-85.


66

Cicco, N., and Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate Concentration on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination of Phenolics with Low Concentration in the Presence of Methanol: A Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, Am. J. Anal. Chem., pp.840-845. Cordell, G.A., 2000, Biodiversity and Drug Discovery–a Symbiotic Relationship. Phytochemistry, vol 55, 463–380 Dahlan, M. S., 2012, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta, p.17. Depkes RI, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.10- 12. Depkes RI a, 1995, Farmakope Indonesia, ed.IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, p.7. Desisov, Avgeny T., and Afanas’ev, I. B., 2005, Oxidation and Antioxidants in Organic Chemistry and Biology, Taylor & Francis Group, the academic division of T&F Informa plc., United States of America, p.492. Eloff, JN., 1998, Which Extractant Should be Used for The Screening and Isolation of Antimicrobial Components from Plants. J. Ethnopharmacol., 60: 1–8. Fajriah, S., Darmawan, A., Sundowo A., dan, Artanti N., 2007, Isolasi Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Etil Asetat Daun Benalu Dendrophthoe pentandra L. Miq. yang Tumbuh pada Inang Lobi-Lobi, Jurnal Kimia Ilmiah,vol. 2, 17-20. Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H., edisi ke 3, Erlangga, Jakarta, pp.436-440. Gandjar, I. G., dan Abdul Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp.240,465-472. Harborne, J.B., and Williams, CA., 2000, Advance in Flavanoid Research since 1992, Phytochemistry,pp.55, 481-504. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Ed. 2, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, pp.47-109.


67

Harmita, 2004, Majalah Ilmu Kefarmasian Vol.I, No.3: Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara, Departemen Farmasi FMIPA UI,Jakarta, pp.117-135. Harris, C. Daniel, 2010, Quantitative Chemical Analysis,W. H. Freeman and Company,New York, p.102. Hibbert, D. Brynn and Gooding, J. Justin, 2006, Data Analysis for Chemistry, Oxford University Press, Inc., Newyork, pp.2, 19, 34-37 Huang, D., Boxin Ou,, and Prior, R.L., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant Capacity Assays. J. Agr. Food Chem., pp.53, 1841-1856. Jacobi, R.A., and Burri, B.J. 1996, Oxidative damage and defense. Am. J. Clin. Nutr., 63, 985–990. Kingston, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical Methods for Active Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products, APVMA. Lapornik, B., Prosek, M., Wondra, A. G., 2005, Comparison of Extracts Prepared From Plant by-Products Using Different Solvents and Extraction Time. J. Food Eng., 214–222. Leamsomrong, K, Suttajit, M., chantiratikul, P., 2009, Flow injection system for the Determination of Total Phenolik Compound by Using Follin-Ciocalteu Assay, Asian.J. Appl. Sci., vol 2, 184-190. Martin, A., Swarbrick, J., dan Cammarata A., 1990, Farmasi Fisika, Jilid II, diterjemahkan oleh Yoshitha, UI-Press, Jakarta, pp.622-630. Miller, James N., and Miller, Jane C., 2010, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 6th ed, Pearson Education Limited, London, p.19. Molyneux, P., 2003,The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., Vol. 26, No. 2, Mar.-Apr. 2004, pp. 212-217 Ncube, N.S., Afolayan, A.J., Okoh, A.I., 2008, Assessment Techniques of Antimicrobial Properties of Natural Compounds of Plant Origin: Current Methods and Future Trends. Afr. J. Biotech., 1797-1806. Pracaya, 2007, Hama dan Penyakit tanaman, Penebar Swadaya, Jakarta, p.417. Prakash, Aruna, 2001, Antioxidant Activity, takes you into the Heart of a Giant Resource Volume 19 Number 2, 1,2.


68

Ronald, L. Prior, Wu, Xianli, and Schaich, K., 2005, Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements, J. Agr. Food Chem., 4290-4302. Rosidah, S. Yulinah ,Elin, S. Gana A., 1999, Uji Aktivitas Antiradang pada Tikus Galur Wistar dan Telaah Fitokimia Ekstrak Daun Babadotan dan Ekstrak Rimpang Jahe. http://bahan-alam.fa.itb.ac.id. Samiran, 2005, Keanekaragaman Jenis Benalu dan Tumbuhan Inangnya di Kebun Raya Purwodadi, Laporan Teknik Pusat Penelitian Biologi LIPI : Daftar Isian Pelaksanaan Anggaran (DIPA) tahun anggaran 2005, Buku I, pp.269-275. Sandhar, Harlen K., Kumar, B., Prasher, S., Tiwari P., Salhan M., and Sharma P., 2011, A Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids, I.P. S.,vol 1, 25-40. Singleton,V.L.& Rossi, J.A., 1965,Colorimetry of Total Phenolics withPhosphomolybdic-phosphotungstic Acid Reagents, Am. J. Enol. Vitic. 16:144-58. Snyder L.R., and Kirkland J.J,1997, Practical HPLC Method Development, 2nd Ed, John Wiley and Sons, pp. 273-290. Sukpondma Y., Rukachaisirikul V., and Jasakul Chaweewan, 2000,Chemical Constituents from Leaves of Dendrophthoe pentandra L.Congress on Science & Technology of Thailand. Sunarni T., Pramono S., dan Asmah R., 2007, Antioxidant-free Radical Scavenging of Flavonoid from The Leaves of Stelechocarpus burahol (BI.) Hook. F. and Th., Majalah Farmasi Indonesia, 18(3), 111-116. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur H., 2011, Phytochemical Screening and Extraction: A Review, Int. Pharm. Sci., Vol 1, 1-9. Valkenburg van JLCH, 2003. Dendrophthoe, Scurrula, In: RHMJ Lemmens and N. Bunyapraphatsara (eds.). Medicinal and poisonous plants 3. PROSEA. Backhuys Publisher, Leiden, pp.157–158, 370–372. Widowati, W., Mozef, T., Risdian, C., Ratnawati., H., Tjahjani S.,and, Sandra F., 2011, The Comparison of Antioksidative and Proliferation Inhibitor Properties of Piper betle L., Catharanthus roseus (L) G. Don., Dendrophthoe pentandra L., Curcuma mangga val. Extracts on T47D Cancer Cell Line, IRJBB, Vol. 1(2) 22-28.


69

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)


70

Lampiran 2. Gambar tanaman benalu yang diambil di kompleks Universitas Sanata Dharma


71

Lampiran 3 . Perhitungan Rendemen a. Rendemen ekstrak etanol Penimbangan Cawan 1 (g)

Cawan 2 (g)

Cawan 3 (g)

Bobot cawan

65,5471

56,2631

61,5411

Bobot cawan+ekstrak

70,5231

62,2023

65,3219

Bobot ekstrak

4,9760

5,9392

3,788

Bobot ekstrak total

14,7032

Bobot daun benalu yang digunakan

=90 g

Rendemen ekstrak metanol

=

Bobot ekstrak yang didapat

=

14,7032

bobot bahan yang digunakan 90

𝑥 100%

𝑥 100 %

= 16,3369%

b. Rendemen fraksi etil asetat Cawan (g)

Cawan 2 (g)

Cawan 3 (g)

Bobot cawan

65,5473

56,2632

61,5412

Bobot cawan+ekstrak

65,8039

56,5358

61,7449

Bobot ekstrak

0,2566

0,2726

0,2037

Bobot ekstrak total

0.7329

Bobot daun benalu yang digunakan

= 90 g

Rendemen ekstrak etanol

=

Bobot ekstrak yang didapat

=

0,7329

bobot bahan yang digunakan 90

𝑥 100

= 0.814 %

𝑥 100%


72

Lampiran 4 . Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan a. Data penimbangan DPPH Replikasi 1 (g)

Repilkasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Bobot kertas

0,2123

0,2129

0,2130

Bobot kertas + DPPH

0,2279

0,2286

0,2289

Bobot kertas + sisa

0,2123

0,2129

0,2130

Bobot DPPH

0,0156

0,0157

0,0159

b. Data penimbangan kuersetin Replikasi 1 (g)

Repilkasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Bobot kertas

0,2439

0,2326

0,2347

Bobot kertas + kuersetin

0,2465

0,2352

0,2373

Bobot kertas + sisa

0,2439

0,2327

0,2348

Bobot zat

0,0026

0,0025

0,0025

c. Penimbangan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu Replikasi 1 (g)

Repilkasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Bobot cawan

65,5473

56,2632

61,5412

Bobot cawan + kuersetin

65,5685

56,2883

61,5663

Bobot cawan + sisa

0,0252

0,0251

0,0251


73

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji a. Konsentrasi DPPH 1.

Replikasi 1 BM = 394,33 Mol = M=

2.

massa BM

mol volume

=

15,6 mg

=

0,0395 mmol

=

15,7 mg

=

0,0398 mmol

=

15,9 mg

=

0,0403 mmol

394,33 0,1 L

= 0,0395 mmol = 0,395 mM

Replikasi 2 BM = 394,33 Mol =

massa BM

mol

M= volume 3.

394,33 0,1 L

= 0,0398 mmol = 0,398 mM

Replikasi 3 BM = 394,33 Mol =

massa BM

mol

M= volume

394 ,33 0,1 L

= 0,0403 mmol = 0,403 mM

b. Konsentrasi Kuersetin 1.

Kosentrasi larutan induk Replikasi 1Replikasi 2Replikasi 3

2,6 mg 10 mL

2,5 mg

= 260 µg/mL 10 mL = 250 µg/mL

2,5 mg 10 mL

= 250 µg/mL


2.Konsentrasi seri larutan pembanding kuersetin Konsentrasi larutan pembanding

Seri larutan pembanding

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Seri 1

5,2 µg/ml

5 µg/ml

5 µg/ml

Seri 2

7,8 µg/ml

7,5 µg/ml

7,5 µg/ml

Seri 3

10,4 µg/ml

10 µg/ml

10 µg/ml

Seri 4

13 µg/ml

12,5 µg/ml

12,5 µg/ml

Seri 5

15,8 µg/ml

15 µg/ml

15 µg/ml

Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding (Replikasi 1) : Larutan induk

=

Konsentrasi larutan pembanding (seri 1)

=

C1 x V1 =

260 µg/mL

C2 x V2

260 µg/mL x 0,2 ml C2

=

C2 x 10 ml

=

5,2 µg/mL

c.Fraksi etil asetat (larutan uji) 1.Kosentrasi larutan induk Replikasi 1Replikasi 2Replikasi 3 25,2 mg 50 mL

= 504 µg/mL

25,1 mg 50 mL

25,1 mg

= 502 µg/mL 50 mL = 502 µg/mL

74


3.Konsentrasi seri larutan uji Konsentrasi larutan pembanding

Seri larutan pembanding

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Seri 1

6,05µg/ml

6,02 µg/ml

6,02 µg/ml

Seri 2

9,07 µg/ml

9,03 µg/ml

9,04 µg/ml

Seri 3

12,10 µg/ml

12,05 µg/ml

12,05 µg/ml

Seri 4

15,12 µg/ml

15,06 µg/ml

15,06 µg/ml

Seri 5

18,14 µg/ml

18,07 µg/ml

18,07 µg/ml

Contoh perhitungan konsentrasi larutan uji (Replikasi 1) : Larutan induk

=

504 µg/mL

=

V2 x C2

Intermediet (seri 1) V1 x C1 2 mlx 504 μg/ml C2 Konsentrasi larutan pembanding (seri 1)

=

10 x C2 =

100,8 μg/ml

=

C1 x V1

=

C2 x V2

100,8 µg/mL x 0,6 ml

=

C2 x 10 ml

=

6,05 µg/mL

C2

75


Lampiran 6. Scanning pengkoreksi a. Scanning metanol

b. Scanning metanol : air (1:1 v/v)

76


c. Scanning kuersetin

d. Scanning asam galat

77


e. Scanning fraksi etilasetat ekstrak etanol (400-600 nm)

f. fraksi etilasetat ekstrak etanol (600-800 nm)

78


Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a.

Penentuan λ maksimum, 1. Scanning DPPH 0,020 mM

79


2. Spektra DPPH 0,040 mM

80


3. Spektra DPPH 0,080 mM

81


82

4. Plot scanning λ maksimum

b. Penentuan Operating Time 1. Penetuan OT kuersetin Waktu (menit)

Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 517 nm 5,2 µg/mL

10 ,4µg/mL

15,6 µg/mL

5

0,665

0,551

0,371

10

0,653

0,536

0,35

15

0,645

0,523

0,333

20

0,638

0,510

0,317

25

0,634

0,499

0,308

30

0,633

0,494

0,303

35

0,632

0,494

0,303

40

0,632

0,494

0,303

45

0,632

0,494

0,303

50

0,631

0,494

0,302

55

0,631

0,494

0,302

60 0,631 OT yang didapat 30 menit

0,494

0,302


Waktu (menit)

83

Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 517 nm 5 µg/mL

10 µg/mL

15 µg/mL

5 10

0,623 0,612

0,492 0,476

0,306 0,284

15

0,602

0,465

0,272

20 25

0,597 0,594

0,455 0,448

0,26 0,251

30 35

0,592 0,592

0,441 0,441

0,243 0,243

40 45

0,592 0,592

0,441 0,441

0,243 0,243

50 55

0,592 0,592

0,440 0,440

0,243 0,242


0,440

0,242

Waktu (menit)

Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 517 nm 5 µg/mL

10 µg/mL

15 µg/mL

5

0,65

0,483

0,335

10

0,629

0,462

0,312

15

0,621

0,446

0,291

20

0,616

0,435

0,274

25

0,613

0,426

0,261

30

0,610

0,420

0,252

35

0,610

0,420

0,252

40

0,610

0,420

0,252

45

0,610

0,420

0,251

50

0,610

0,419

0,251

55

0,609

0,419

0,251


0,419

0,251


84

2. Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu Waktu (menit)

Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 517 nm 6,048 µg/mL

12,096 µg/mL

18,144 µg/mL

5

0,635

0,489

0,377

10

0,624

0,478

0,361

15

0,617

0,468

0,350

20

0,611

0,463

0,343

25

0,609

0,460

0,339

30

0,608

0,458

0,337

35

0,608

0,458

0,335

40

0,608

0,458

0,335

45

0,608

0,458

0,335

50

0,608

0,457

0,335

55

0,608

0,457

0,334


0,457

0,334


Waktu (menit)

85

Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 517 nm 6,024 µg/mL

15,048 µg/mL

18,072µg/mL

5 10 15

0,599 0,591 0,587

0,478 0,462 0,453

0,417 0,402 0,393

20 25

0,585 0,584

0,448 0,446

0,387 0,383

30 35

0,584 0,584

0,445 0,445

0,38 0,379

40 45 50

0,584 0,584 0,584

0,445 0,444 0,444

0,379 0,378 0,378

55 0,584 60 0,584 OT yang didapat 30 menit

0,443 0,443

0,378 0,377

Waktu (menit)

Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 517 nm 6,024 µg/mL

15,048 µg/mL

18,072µg/mL

5

0,615

0,477

0,397

10

0,607

0,467

0,384

15 20

0,598 0,594

0,458 0,455

0,376 0,371

25

0,591

0,453

0,368

30

0,590

0,453

0,366

35

0,590

0,452

0,366

40

0,589

0,452

0,365

45 50

0,589 0,589

0,452 0,452

0,365 0,365

55 0,589 60 0,589 OT yang didapat 30 menit

0,452 0,452

0,365 0,364


86

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH % IC = Absorbansi (larutan control)–Absorbansi sampel (larutan pembanding/uji)X100% Absorbansi larutan control 1. Kuersetin

Konsentrasi (µg/mL) 5,2

Replikasi

Absorbansi kontrol

7,8 10,4 13 15,8

I

Absorbansi larutan pembanding 0,653

% IC 24,25

0,563 0,475 0,377 0,288

34,69 44,90 56,26 66,59

0,862

Konsentrasi 5 ,2 µg/mL 0,862 −0.653

%IC =

0,862

𝑥 100 % = 24,25%

Konsentrasi 7,8 µg/mL %IC =

0,862 −0.563 0,862

𝑥 100 % =34,69%

Konsentrasi10,4 µg/mL %IC =

0,862 −0.475 0,862

𝑥 100 % = 44,90%

Konsentrasi 13µg/mL 0,862 −0.377

%IC =

0,862

𝑥 100 % = 56,26%

Konsentrasi 15,8µg/mL 0,862 −0.288

%IC =

0,862

𝑥 100 % = 66,59%

Persamaan regresi linier

y = 4,024x + 3,323 r=0,9997


Konsentrasi Absorbansi Replikasi (µg/mL) kontrol 5 7,5 0,859 II 10 12,5 15 Replikasi

III

Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) kontrol 5 7,5 0,862 10 12,5 15

Absorbansi larutan pembanding 0,663 0,572 0,473 0,385 0,292 Absorbansi larutan pembanding 0,656 0,559 0,480 0,395 0,311

% IC 22,81 33,41 44,94 55,18 66,01

% IC 23,90 35,15 44,31 54,18 63,92

87


y = 4,326x + 1,210 r=0,9999


y = 3,962x + 4,663 r=0,9995

2. Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu Replikasi

I

Konsentrasi Absorbansi (µg/mL) kontrol 6,05 9,07 0,848 12,10 15,12 18,14

Absorbansi larutan uji 0,589 0,521 0,422 0,357 0,275


%IC =

0,848

𝑥 100 % = 30,5425%

Konsentrasi 9,07µg/mL %IC =

0,848 −0.521 0,848

𝑥 100 % =38,5613%

Konsentrasi12,10 µg/mL %IC =

0,848 −0.422 0,848

𝑥 100 % = 50,2358%

% IC 30,54 38,56 50,24 57,90 67,57

Persamaan regresi linier y = 3,088x + 11,60 r = 0,9983


88


%IC =

0,848

𝑥 100 % = 57,9009%


%IC =

0,848

𝑥 100 % = 67,5708%

Konsentrasi Absorbansi Replikasi (µg/mL) kontrol 6,02 0,859 9,04 II 12,05 15,06 18,07 Konsentrasi Absorbansi Replikasi (µg/mL) kontrol

III

6,02 9,04 12,05 15,06 18,07

0,865

Absorbansi larutan uji 0,663 0,572 0,473 0,385 0,292 Absorbansi larutan uji 24,1618 35,3757 44,5087 54,3353 64,0462

% IC 22,8172 33,4109 44,9360 55,1804 66,0070 % IC 23,8979 35,1508 44,3155 54,1763 63,9211


y = 4,326x + 1,210 r=0,9999 Persamaan regresi linier

y = 3,949x + 4,994 r=0,9995


Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu a. Kuersetin Replikasi I Persamaan regresi linier :y = 4,024x + 3,323 ( y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL) IC50 adalah nilai x saat y = 50 50=4,024x + 3,323

x=

50−3,323

= 𝟏𝟏, 𝟔𝟎µg/mL

4,024

Replikasi

Persamaan

IC50 (µg/mL)

II

y = 4,326x + 1,210

11,28

III

y = 3,949x + 4,994

11,44

b.Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu Replikasi I Persamaan regresi linier :y = 3,088x + 11,60 ( y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL) IC50 adalah nilai x saat y = 50 50 = 3,088x +11,60 x=

50−11,60 3,088

= 𝟏𝟐, 𝟒𝟑 µ𝐠/𝐦𝐋

89


Replikasi

Persamaan

IC50 (µg/mL)

II

y = 2,959x + 13,3576

12,38

III

y = 3,202x + 8,696

12,90

90

Lampiran 10. Penimbangan uji kandungan fenolik total a. Data Penimbangan Asam Galat Replikasi 1 (g)

Replikasi 2 (g)

Replikasi 3 (g)

Bobot Kertas

0,2246

0,2268

0,2431

Bobot Kertas + zat

0,2496

0,2519

0,2689

Bobot sisa

0,2246

0,227

0,2434

Bobot zat

0,0250

0,0249

0,0255

b. Data Penimbangan Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu Replikasi 1 (g)

Repilkasi 2 (g)

Replikasi 3(g)

Bobot cawan

65,5473

56,2632

61,5412

Bobot cawan + kuersetin

65,5624

56,2782

61,5563

Bobot cawan + sisa

0,0051

0,0050

0,0050


Lampiran 11. Scanning kontrol asam galat

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total a. Penentuan Operating Time Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 750,0 nm 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,314 0,504 0,764 10 0,325 0,524 0,796 15 0,325 0,525 0,796 20 0,325 0,525 0,796 25 0,325 0,525 0,796 30 0,325 0,526 0,797 OT yang didapat 10 menit Waktu (menit)

Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 750,0 nm 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,296 0,522 0,727 10 0,303 0,548 0,758 15 0,306 0,548 0,759 20 0,306 0,548 0,759 25 0,306 0,548 0,76 30 0,306 0,548 0,76 OT yang didapat 10 menit Waktu (menit)

91


Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 750,0 nm 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,309 0,547 0,759 10 0,327 0,584 0,791 15 0,328 0,584 0,791 20 0,328 0,584 0,792 25 0,328 0,584 0,792 30 0,328 0,584 0,792 OT yang didapat 10 menit Waktu (menit)

b. Penentuan λ maksimum 1. Spektra asam galat 50 μg/mL

92


2. Spektra asam galat 100 μg/mL

93


3. Spektra asam galat 150 μg/mL

94


95

Lampiran 13.Penentuan kandungan fenolik total a. Asam Galat 1. Kosentrasi larutan induk Replikasi 1

Replikasi 2

25,0 mg

24,9 mg

10 mL

= 2500 µg/mL

10 mL

Replikasi 3 25,5 mg

= 2490 µg/mL 10 mL = 2550 µg/mL

2. Kosentrasi larutan intermediet Replikasi 1 C1.V1

Replikasi 2

= C2.V2

2500 µg/mL x 5 mL =C2 x 25 ml C2

C1.V1

= C2.V2

2490 µg/mL x 5 mL = C2 x 25 mL

= 500 µg/mL

C2

= 498 µg/mL

Replikasi 3 C1.V1

= C2.V2

2550 µg/mL x 5 mL = C2 x 25 mL C2

= 510 µg/mL

3. Konsentrasi seri larutan asam galat Replikasi 1 (500 µg/mL) Seri 1 C1.V1 500 µg/mL.1mL C2

= C2.V2 = C2. 10 = 50 µg/mL

Seri 2 C1.V1 = C2.V2 500 µg/mL.1,5mL C2

= C2. 10mL = 75 µg/mL


Seri 3 C1.V1

= C2.V2

500 µg/mL.2 mL C2

Seri 4

= C2. 10 mL

=100 µg/mL

C1.V1

= C2.V2

500 µg/mL.2,5mL C2

= C2. 10

=125 µg/mL

Seri 5 C1.V1

= C2.V2

500 µg/mL. 3mL C2

= C2. 10 mL

=150 µg/mL

Konsentrasi

Persamaan

Seri Larutan

(µg/mL)

Absorbansi

Seri 1

50

0,321

Seri 2

75

0,444

Seri 3

100

0,545

Seri 4

125

0,652

Seri 5

150

0,777

konsentrasi vs abs

y = 0.004x + 0.0998 r= -0,9993

Replikasi 2 (498 µg/mL) Seri 1 C1.V1 498 µg/mL.1mL C2

Seri 2 = C2.V2 = C2. 10

C1.V1 = C2.V2 498 µg/mL.1,5mL

= 49,8 µg/mL C2

= C2. 10mL

= 74,7 µg/mL

96


Seri 3 C1.V1

= C2.V2

498 µg/mL.2 mL C2

Seri 4

= C2. 10 mL

=99,6 µg/mL

C1.V1

= C2.V2

498 µg/mL.2,5mL C2

= C2. 10

=124,5 µg/mL

Seri 5 C1.V1

= C2.V2

498 µg/mL. 3mL C2

= C2. 10 mL

=149,5 µg/mL Konsentrasi

Persamaan

Seri Larutan

(µg/mL)

Absorbansi

Seri 1

49.8

0,324

Seri 2

74,7

0,453

Seri 3

99,6

0,565

Seri 4

12,5

0,675

Seri 5

149,4

0,786

konsentrasi vs abs

y = 0,004x + 0,1022 r = 0,9995

Replikasi 3 (510 µg/mL) Seri 1 C1.V1 510 µg/mL.1mL C2

Seri 2 = C2.V2 = C2. 10 = 51 µg/mL

C1.V1 = C2.V2 510 µg/mL.1,5mL C2

= C2. 10mL = 76,5 µg/mL

97


Seri 3 C1.V1

= C2.V2

510 µg/mL.2 mL C2

Seri 4 C1.V1

= C2. 10 mL

=102 µg/mL

= C2.V2

510 µg/mL.2,5mL C2

= C2. 10

=127,5 µg/mL

Seri 5 C1.V1

= C2.V2

510 µg/mL. 3mL C2

= C2. 10 mL

=153 µg/mL Konsentrasi

Persamaan

Seri Larutan

(µg/mL)

Absorbansi

Seri 1

51

0,339

Seri 2

76,5

0,441

Seri 3

102

0,551

Seri 4

127,5

0,653

Seri 5

153

0,756

Sampel replikasi 1 Bobot sampel

= 5,1 mg

Absorbansi sampel

= 0,666 y = 0,004x + 0,099

0,666 = 0,004x + 0,099 x=

0,666 − 0,099 0,004

= 141,75 µg/mL

konsentrasi vs abs y = 0,004x + 0,1296 r = 0,9999

98


Kandungan fenolik total = v

0,5 𝑚𝐿

x . m = 0,14175 mg/mL. 0,0051 𝑔 = 13,89 mg ekivalensi asam galat per g fraksi Sampel replikasi 2 Bobot sampel

= 5,0 mg

Absorbansi sampel

= 0,664 y = 0,004x + 0,102

0,664 = 0,004x + 0,102 x=

0,664 − 0,102 0,004

= 140,5 µg/mL Kandungan fenolik total = v

x . m = 0,1405 mg/mL.

0,5 mL 0,0050 g

= 14,05 mg ekivalensi asam galat per g

fraksi. Sampel replikasi 3 Bobot sampel

= 5,0 mg

Absorbansi sampel

= 0,667 y = 0.004x + 0.129

0,667 = 0.004x + 0.129 x=

0,664 − 0,129 0,004

= 133,75 µg/mL

99


Kandungan fenolik total = v

0,5 𝑚𝐿

x . m = 0,13375 mg/mL. 0,0050 𝑔 = 13,34 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

Lampiran 14. Uji Statistik Uji Statistikdalam mengolah data menggunakan program R 2.14.1 a. Uji Normalitas

100


b. Uji Varians Data Uji varians data menggunakan t-test tidak berpasangan dengan tingkat kepercayaan 95%

101


102

BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidarzil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Daun Benalu (Dendrophthoe pentandra L. Miq) di Pohon Kepel (Stelechocarpus burahol (Bl) Hook. f.” memiliki nama lengkap Willigis Danu Patria. Dilahirkan di kota Tanjung karang, 23 Juli 1991 dari pasangan Bapak Drs. F.X. Agus Edhi Santhosa dan Ibu Caecilia Widarti. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Sejahtera IV pada tahun 1995 hingga 1997 TK Sejahtera IV Bandar Lampung lalu melanjutkan pendidikan dasar di SD Sejahtera IV Bandar Lampung pada tahun 1997 hingga 1999 dan dilanjutkan di SD Fransiskus Asisi Bandar Lampung pada tahun 1999 hingga 2003.Penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMPN 8 Bandar Lampung pada tahun 2003 hingga 2006 dan SMAN 2 Bandar Lampung pada tahun 2006 hingga 2009. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2012. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain yang terdapat di dalam maupun di luar Universitas Sanata Dharma antara lain: dalam kegiatan UKF Veronica (seni) dan UKF Skuadra Viola (futsal); dalam kepanitiaan Titrasi (2010), panitia Pelantikan Apoteker (2011), panitia Peringatan Dies Natalis ke-16 (2012), dan panitia Temu Alumni (2012); dalam pelatihan Achievement Motivating Training (2009) dan Event Organaiser Training (2009); Dalam peserta Seminar Ilmiah Nasional (2009).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents