PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

PENETAPAN KANDUNGAN SENYAWA FENOLIK TOTAL dan UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK HERBA SELADA AIR (Nasturtium officinale R.Br.) DENGAN MENGGUNAKAN METODE DPPH

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Diajukan oleh: Jap Yulius Billy Soegianto NIM : 098114069

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013


ii


iii

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Kupersembahkan karya ini untuk Tuhan Yesus, ibuku, dan semua pihak yang telah membantuku.

terima Kasih semuanya…….

iv


v


vi


PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkatNya sehingga penulis berhasil menyelesaikan karya tulis “Penetapan Kandungan Senyawa Fenolik Total dan Uji Aktvitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Herba Selada Air (Nastrurtium officinale R.Br.) Dengan Menggunakan Metode DPPH ”. Dalam penulisan skripsi ini penulis banyak mendapatkan bantuan dan semangat dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada: 1. Bapak Ipang Djunarko, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma 2. Bapak Prof.Dr.C.J.Soegihardjo, Apt selaku Dosen Pembimbing yang selalu

mendampingi

dan

mengarahkan

sehingga

penulis

dapat

menyelesaikan skripsi dengan baik. 3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen Penguji yang memberikan masukkan dan arahan sehingga dapat menyelesaikan skripsi dengan baik. 4. Bapak Jeffry Julianus, M.Si selaku Dosen Penguji yang memberikan pengarahan dalam penulisan skrpsi. 5. Semua dosen Fakultas Farmasi Sanata Dharma yang telah memberikan masukkan, ilmu dan dukungannya kepada penulis. 6. Teman-teman yang telah membantu selama penelitian, Filbert Hita Kumaro, dan Indah Kertawati yang memberikan bantuan sehingga penyelesian skripsi ini dapat selesai dengan baik.

vii


7. Laboran

Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia,

Biokimia–Anatomi

Manusia Universitas Sanata Dharma,yaitu Mas Kayat dan Mas Wagiran yang telah membantu dalam penyelesian skripsi ini . 8. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu-persatu Penulis mengetahui bahwa penulisan skripsi ini masih belum sempurna, oleh karena itu masukkan, saran dan kritikannya sangat diperlukan untuk memperbaiki penulisan skripsi ini. Terima kasih. Penulis

viii

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................................ i PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................................................... iii PENGESAHAN SKRIPSI .................................................................................... iii PERSEMBAHAN .................................................................................................. iv PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .....................v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................ vi PRAKATA ............................................................................................................ vii DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiii DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xivv DAFTRA LAMPIRAN.......................................................................................xv INTISARI............................................................................................................ xvii ABSTRACT .......................................................................................................... xvii BAB I. PENGANTAR .............................................................................................1 A. Latar Belakang ....................................................................................................1 1. Permasalahan................................................................................................... 5 2. Keaslian penelitian........................................................................................... 6 3. Manfaat penelitian........................................................................................... 6 B. Tujuan Penelitian .................................................................................................7 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA..................................................................... 8

ix


A. Selada Air ...........................................................................................................8 1. Nama lain selada air.......................................................................................8 2.

Morfologi tanaman selada air.......................................................................8

3.

Kandungan kimia.........................................................................................9

4.

Sistematika selada air.................................................................................10

B. Senyawa Fenolik ...............................................................................................10 1. Pengertian senyawa fenolik............................................................................10 2. Senyawa fenolik dan antioksidan.................................................................... 11 3. Senyawa fenolik pada tanaman....................................................................... 11 4. Kandungan Senyawa Fenolik Total Selada Air...............................................12 C. Metode Folin-Ciocalteu .....................................................................................13 D. Antioksidan.......................................................................................................14 1. Pengertian antioksidan................................................................................. 14 2. Sumber antioksidan.......................................................................................15 3. Penggolongan antioksidan.............................................................................17 4. Metode uji aktivitas atioksidan.....................................................................18 E. Radikal Bebas...................................................................................................20 1. Pengertian radikal bebas...............................................................................20 2. Kerusakan sel akibat radikal bebas...............................................................20 3. Pembentukan radikal bebas...........................................................................21 4. Radikal bebas dalam tubuh............................................................................22 F. Metode Ekstraksi...............................................................................................23 G. Landasan Teori.................................................................................................25

x


H. Hipotesis............................................................................................................26 BAB III. METODE PENELITIAN........................................................................27 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .......................................................................27 B. Variabel Penelitian ............................................................................................27 C. Definisi Operasional ..........................................................................................28 D. Bahan dan Alat Penelitian .................................................................................29 1. Alat................................................................................................................ 29 2. Bahan...............................................................................................................29 E. Tata Cara Penelitian ...........................................................................................29 1. Determinasi tanaman..................................................................................... 29 2. Pengumpulan bahan....................................................................................... 29 3. Preparasi sampel..............................................................................................30 4. Penetapan kandungan fenolik total..................................................................30 5.Pembuatan

larutan

DPPH,

pembanding

dan

uji

aktivitas

antioksidan......................................................................................................32 6.Penentuan

OT

dan

panjang

gelombang

maksimum

uji

aktivitas

antioksidan......................................................................................................33 7.Uji pendahuluan dan estimasi aktivitas antioksidan pada larutan uji dan pembanding.....................................................................................................33 F. Analisis Hasil.....................................................................................................34 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................................36 A. Determinasi Tanaman ......................................................................................36

xi

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI B. Pengumpulan Bahan .........................................................................................36 C. Hasil Preparasi Sampel .....................................................................................37 1. Pengeringan..................................................................................................37 2. Ekstraksi.......................................................................................................38 3. Fraksinasi.....................................................................................................41 D. Hasil Uji Pendahuluan .....................................................................................43 1. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total....................................43 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan.........................................................45 E. Hasil Optimasi Penetapan Knadungan Fenolik Total.......................................46 1. Penetapan Operating Time (OT)...................................................................46 2. Pengukuran panjang gelombang maksimum................................................47 F. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total.......................................................48 G. Hasil Optimasi Penentuan Aktivitas Antioksidan.............................................52 1. Penentuan Operating Time (OT)...................................................................52 2. Penentuan panjang gelombang maksimum...................................................54 H. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan.............................................................55 BAB V KESIMPULAN dan SARAN..................................................................63 A. Kesimpulan .......................................................................................................63 B. Saran ..................................................................................................................63 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................64 LAMPIRAN ...........................................................................................................68 BIOGRAFI PENULIS .........................................................................................103

xii

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Penentuan panjang gelombang maksimum asam galat ......................... 48 Tabel II. Persamaan regresi linier dari baku asam galat......................................50 Tabel III. Kandungan senyawa fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air ..................................................................................... 51 Tabel IV. Penentuan panjang gelombang maksimum DPPH .............................. 54 Tabel V. Persamaan regresi linier % IC dengan baku rutin..................................59 Tabel VI. Perhitungan persamaan regresi linier % IC dengan baku fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air...............................................59 Tabel VII. Nilai IC50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air........................................................................................................60 Tabel VIII. Tingkat kekuatan antioksidan............................................................61

xiii


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Mekanisme penghambatan radikal bebas oleh senyawa fenolik..........11 Gambar 2. Struktur rutin ....................................................................................... 13 Gambar 3. Reaksi DPPH dengan senyawa antioksidan........................................19 Gambar 4. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total............................. 44 Gambar 5. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan.................................................46 Gambar 6. Penentuan Operating Time (OT) asam galat replikasi 2 .................. ...47 Gambar 7. Struktur asam galat . ............................................................................ 50 Gambar 8. Operating Time (OT) rutin replikasi 1 ................................................53 Gambar 9. Operating Time (OT) fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air replikasi 3 .......................................................................................... 53 Gambar 10. Reaksi antara DPPH dengan antioksidan...........................................55 Gambar 11. Struktur kimia rutin.........................................................................56 Gambar 12. Mekanisme penghambatan DPPH oleh rutin..................................57 Gambar 13. Kurva aktivitas antioksidan rutin replikasi 3......................................58 Gambar 14. Kurva aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air replikasi 2 ......................................................................... 59

xiv

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Lampiran Surat Determinasi Tanaman..............................................68 Lampiran 2. Gambar Selada Air............................................................................69 Lampiran 3. Perhitungan Rendemen Uji Aktivitas Antioksidan...........................70 Lampiran 4. Data Penimbangan Uji Aktivitas Antioksidan..................................71 Lampiran 5. Data Konsentrasi Uji Aktivitas Antioksidan.....................................72 Lampiran 6. Penentuan Operating Time (OT) Rutin.............................................74 Lampiran 7. Penentuan Operating Time (OT) Fraksi Etil Asetat..........................76 Lampiran 8. Panjang Gelombang Maksimum DPPH............................................78 Lampiran 9. Scanning Penentuan Aktivitas Antioksidan......................................81 Lampiran 10. Perhitungan Nilai % IC Dari Rutin.................................................84 Lampiran 11. Perhitungan % IC Fraksi Etil Asetat..............................................86 Lampiran 12. Perhitungan Nilai IC50 Rutin..........................................................88 Lampiran 13. Perhitungan Nilai IC50 Fraksi Etil Asetat......................................90 Lampiran 14. Penimbangan Untuk Uji Kandungan Fenolik Total......................92 Lampiran 15. Optimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total.............................93 Lampiran 16. Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat...............................94 Lampiran 17. Scanning Penentuan Kandungan Fenolik Total............................97 Lampiran 18. Penentuan Kandungan Senyawa Fenolik Total.............................100 Lampiran 19. Uji Statistika Dengan Program R..................................................102

xv


INTISARI

Polusi udara saat ini sudah menjadi salah satu masalah yang serius yang diakibatkan oleh pencemaran udara yang berasal dari kegiatan industri. Pencemaran udara memunculkan radikal bebas yang berakibat buruk bagi kesehatan manusia. Radikal bebas merupakan senyawa yang bersifat sangat reaktif dan memiliki pasangan elektron bebas, oleh karena itu diperlukan antioksidan yang bertujuan untuk menangkal aktivitas radikal bebas.Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai antioksidan adalah selada air (Nasturtium officinale R.Br) yang telah lama dikonsumsi oleh masyarakat. Aktivitas antioksidan dari herba selada air berasal dari senyawa fenolik yang dapat menangkal radikal bebas, oleh karena itu dilakukan juga penetapan kandungan fenolik totalnya. Metode aktvitas antioksidan yang digunakan adalah dengan metode DPPH dengan prinsipnya adalah terjadi reduksi warna dari ungu menjadi kuning karena terbentuk senyawa DPPH tereduksi yang berasal dari reaksi radikal bebas dengan senyawa antioksidan. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan IC50 yaitu kemampuan senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan untuk menurunkan 50% aktivitas dari radikal bebas. Dari hasil penelitian diperoleh kandungan senyawa fenolik total adalah (6,463 ± 0,066) mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat dan IC50 dari herba selada air adalah ( 434,402 ± 5,945) µg/ml. Kata kunci : antioksidan, radikal bebas, Nasturtium officinale R.Br, senyawa fenolik total, DPPH.

xvi


ABSTRACT

It is well known that air polution can be a serious problem to human health because it will produce a free radical. Free radical is a molecule that has a free electron chain and is so reactive that we will need antioxidants to reduce it.Watercress (Nastrutrium officinale R.Br) is one kind of plant that can inhibit free radical because its polyphenolic contents.We must exact contents of polyphenolic compunds. DPPH methods are used to determine antioxidant activity by reducing a colour from purple to yellow. Antioxidant activity is presented by IC50. IC50 is the ability of antioxidant that can reduce 50% of free radical activity. According to this research we know that the total phenolic compounds is (6.463 ± 0.066) mg eqivalent gallic acid each gram fraction and IC50 is (434.402 ±5.945)µg/ml. Key words :antioxidant, free radical, Nasturtium officinale R.Br, total phenolic compunds, DPPH.

xvii


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Udara mempunyai arti yang sangat penting di dalam kehidupan makhluk hidup dan kelangsungan hidup makhluk lainnya,sehingga udara merupakan sumber daya alam yang harus dilindungi untuk hidup kehidupan manusia dan makhluk hidup lainnya. Pertumbuhan sektor industri pertahun masih merupakan sektor yang sangat potensial dalam memacu pertumbuhan ekonomi, namun disisi lain juga dapat memberikan dampak negatif berupa pencemaran udara baik yang di dalam ruangan maupun di luar ruangan yang dapat membahayakan manusia (Anonim, 2002). Kegiatan industri dapat menimbulkan pencemaran udara antara lain pabrik pengolahan minyak bumi, pabrik pengolahan logam, pabrik tekstil, pabrik gula, pabrik pengolahan karet dan pabrik plastik. Pabrik kimia tersebut menghasilkan semua pencemar ke udara lewat cerobong asap pabrik-pabrik kimia baik yang berbentuk gas ataupun partikel dan berpengaruh buruk bagi kesehatan ( Sumardjono,2006). Pencemaran udara merupakan masuknya komponen lain ke dalam lingkungan udara baik oleh kegiatan manusia secara langsung atau tidak langsung maupun proses alam sehingga kualitas udara turun sampai ke tingkat tertentu yang dapat menyebabkan lingkungan menjadi kurang baik. Adapun kriteria pencemaran udara antara lain bila nilai Pb adalah 0,06 ppm dan debu

1


2

0,26 ppm (Chandra,2006). Akibatnya adalah muncul radikal bebas di lingkungan yang tentunya berbahaya bagi kesehatan manusia. Radikal bebas adalah suatu atom atau molekul yang sangat reaktif dengan elektron yang tidak memiliki pasangan. Radikal bebas mencari reaksireaksi agar dapat memperoleh kembali elektron pasangannya. Serangkaian reaksi dapat terjadi, yang menghasilkan serangkaian radikal bebas. Setelah itu radikal bebas dapat mengalami tubrukan kaya energi dengan molekul lain yang merusak ikatan di dalam molekul, pada akhirnya radikal bebas dapat merusak membran sel, retikulum endoplasma, atau DNA sel yang rentan (Corwin, 2008). Radikal bebas merusak DNA yang dapat mengakibatkan sel kanker (Mazandarani et al, 2012). Pada dasarnya tubuh manusia memiliki antioksidan untuk membatasi kerusakan akibat terpapar radikal bebas. Salah satu antioksidan alami yang paling efektif adalah vitamin E. Vitamin ini larut dalam lemak dan sangat penting karena sebagian besar kerusakan oleh radikal bebas terjadi pada membran sel dan lipoprotein berkepadatan rendah. Antioksidan alami tubuh lainnya mencakup senyawa seperti cystein, glutathion dan D-penicillamin, serta isi darah misalnya molekul transferin yang mengandung zat besi dan seruloplasmin protein ( Youngson, 2003). Senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron. Secara biologis, antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitasnya senyawa


3

oksidan tersebut bisa dihambat. Keseimbangan oksidan dan antioksidan sangat penting karena berkaitan dengan berfungsinya sistem imunitas tubuh. Kondisi seperti ini terutama untuk menjaga integritas dan berfungsinya membran lipid, protein sel, dan asam nukleat, serta mengontrol transduksi sinyal dan ekspresi gen dalam sel imun (Winarsih,2007). Sumber antioksidan dapat dibagi menjadi dua kelompok,yaitu antioksidan sintetik, yaitu antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesis reaksi kimia dan antioksidan alami, yaitu antioksidan yang berasal dar alam (Prabantini, 2010). Tumbuhan mengandung berbagai jenis senyawa kimia yang berpotensi sebagai antioksidan, namun yang paling penting adalah vitamin C, vitamin E, senyawa fenol, dan thiol. Senyawa fenol meliputi flavonoid (turunan inti flavan), cincin kroman (tokoferol), dan lignan. Sayur-sayuran kaya akan zat gizi (vitamin, mineral, dan serat pangan) serta berbagai kelompok zat bioaktif lain yang disebut zat fitokimia. Zat bioaktif ini bekerja secara sinergis, meliputi mekanisme enzim detoksifikasi, peningkatan sistem kekebalan dan antioksidan (Silalahi, 2006). Negara Indonesia adalah suatu negara kepulauan yang memiliki hutan tropika terbesar kedua di dunia, kaya dengan keanekaragaman hayati dan dikenal sebagai salah satu dari negara megabiodiversity. Sebagai mana telah diketahui bersama, tumbuh-tumbuhan tersebut

memiliki

manfaat yang besar bagi

kehidupan manusia antara lain untuk kebutuhan sandang ,papan energi, dan sumber ekonomi (Ersam, 2004). Tanaman banyak mengandung senyawa aktif seperti senyawa fenolik yang dapat bertindak sebagai antioksidan. Penggunaan antioksidan tersebut tentunya dapat menghambat ataupun mencegah kerusakan


4

DNA pada manusia yang berujung pada timbulnya berbagai penyakit (Ozen., 2009). Salah satu tanaman tersebut adalah selada air ( Nasturtium officinale R.Br). Selada air (Nasturtium officinale R.Br) merupakan tanaman dengan batang menjalar. Batang ini yang diambil untuk dijadikan sayuran. Selada air dimanfaatkan sebagai mengobati TBC dan rasa panas di paru-paru, mengobati gangguan dan iritasi pada kulit. Kandungan zat gizi dan fitonutrien yang terkandung di dalamnya adalah provitamin A (karotenoid) dan vitamin C, minyak atsiri berupa rapanol dan serat (Wirakusumah, 2004). Adanya kandungan vitamin C pada selada air dimungkinkan terdapat aktifitas antioksidan karena vitamin C dapat bertindak sebagai peningkatan sistem kekebalan di dalam tubuh, oleh karena itu diperlukan suatu keseimbangan antara pembentukan radikal bebas dan proteksi antioksidan (Silalahi, 2006). Selada air diduga dapat bertindak sebagai antikanker berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh

Selain itu, tanaman selada air juga

banyak ditemui sehingga dapat dengan mudah untuk didapatkan dan diteliti aktivitas antioksidannya. Pemilihan pelarut ekstraksi dengan menggunakan etanol juga didasarkan pada penelitian yang telah dilakukan oleh (Ozen,2009 ) yang menyebutkan bahwa dengan menggunakan pelarut etanol menghasilkan aktifitas antioksidan yang lebih besar dibandingkan dengan menggunakan pelarut yang lain. Pada penelitian yang dilakukan oleh (Mazandarani, Momeji, Moghaddam, 2013), menyebutkan bahwa pada selada air (Nasturtium officinale R) terdapat kandungan senyawa flavonoid total, yaitu sebesar (26,57±1,16) mg ekivalen dari kuarsetin untuk sampel vegetatif dan senyawa fenolik sebesar (36,89±2,23) mg untuk sampel vegetatif


5

serta memiliki nilai aktifitas antioksidan yang dinyatakan sebagai IC50, Sebesar 1227,5 µg/ml dengan metode TAC . Pada penelitian ini digunakan metode DPPH untuk menentukan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik karena dengan digunakannya radikal bebas DPPH dapat digunakan untuk menangkap aktivitas antioksidan dari sampel yang ditandai dengan nilai IC50. Nilai IC50 adalah nilai yang dibutuhkan oleh suatu sampel untuk menangkap radikal bebas sebanyak 50%. Pada uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH telah dilakukan

untuk

mengukur aktivitas antioksidan telah digunakan untuk pengukuran antioksidan dari daun dewa

dan hasilnya dinyatakan sebagai IC50 (Widyaningsih,2010).

Penelitian ini juga menggunakan metode Folin-Ciocalteu dalam penetapan kadar senyawa fenolik total dengan prinsip adalah terjadinya reduksi ion fenolat oleh Folin-Ciocalteu yang kemudian dapat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan spekrtoskopi, metode ini telah digunakan untuk menetapkan senyawa fenolik total pada sampel kulit buah pinang ( Ismail, Runtuwene, Fatimah, 2010). Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan metode DPPH untuk

mengukur aktivitas

antioksidan dan metode Folin-Ciocalteu untuk pengukuran kandungan senyawa fenolik total. 1. Permasalahan a. Berapakah nilai aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air dan pembanding dinyatakan sebagai nilai IC50?

rutin dengan metode DPPH yang


6

b. Berapakah kandungan senyawa fenolik total dari fraski etil asetat ekstrak etanolik herba selada air tersebut yang dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per gram fraksi? 2. Keaslian penelitian Sejauh pengamatan yang diketahui oleh peneliti, penelitian ini belum pernah dilakukan, adapun untuk penelitian serupa yang pernah dilakukan oleh (Mazandari, et al,2013) dengan judul

Evaluation of Phytochemical and

Antioxidant Activities From Different Parts of (Nasturtium officinale R. Br). Pada penelitian ini sampel herba selada air diambil dari provinsi Mazandaran dan dilakukan juga penetapan kadar senyawa flavonoid total dengan menggunakan metode aluminium klorida, dan penentuan aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode TAC dengan pembanding BHA dan BHT ( Ozen, 2009) dengan judul Investigation Of Antioxidant Properties of (Nasturtium Officinale) (Watercress) Leaf Extract. Pada penelitian ini sampel herba selada air diperoleh dari daerah Arhavi-Artvin, Turki, pada periode Juni-Juli (2006). Metode aktivitas antioksidan pada penelitian ini adalah dengan menggunakan metode besi tiosianat. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya adalah tempat diambilnya sampel selada air yang diambil dari daerah Kaliurang, Indonesia dan metode uji aktivitas antioksidan yang berbeda yaitu dengan menggunakan metode DPPH dengan pembanding rutin. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoretis


7

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kandungan senyawa fenolik total dan mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik pada herba selada air (Nasturtium officinale R.Br ) menggunakan metode DPPH . b. Manfaat praktis Penelitian ini dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang penggunaan herba selada air sebagai sumber antioksidan alami yang dapat melawan radikal bebas. c. Manfaat metodologis Penelitian

ini

dapat

memberikan

informasi

mengenai

aplikasi

penggunaan metode DPPH sebagai salah satu uji aktivitas antioksidan yang terdapat pada bahan alam.

B. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini, yaitu untuk mengetahui kandungan senyawa fenolik total yang dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per gram fraksi dan menentukan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik dari herba selada air (Nasturtium officinale R.Br) dan pembanding rutin yang dinyatakan dengan IC50 menggunakan metode DPPH.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Selada Air 1. Nama lain selada air Tanaman selada air (Nasturtium officinale R. Br) termasuk dalam famili Brasicacea .Tanaman ini memiliki berbagai nama lain sebagai berikut : Pani (Hindi), selada air (Indonesia), nasturcio , agretto aquatico (Italia), berro de agua , berro de fuente ( Spanyol), wodjanoj kren, sherucha wodnaja, brunkress (Rusia), Echte

Brunnenkresse,

Bachkresse,

Waserkresse,

Wassersenf,

Wiesenkren

(Jerman), Xong (Vietnam).(Seidemann,2005). Nama sinonim dari tanaman ini adalah Caradaminum nasturtium Moench, Crucifera fontana E.H.L. Krause, Nasturtium aquaticum Wahlenb, Nasturtium nasturtium Cockerell, Rorippa nasturtium –aquaticum (L.) Hayek, Sisymbrium nasturtium Thunb (Seidemann, 2005). 2. Morfologi tanaman selada air Tanaman selada air merupakan tanaman air yang mendapatkan nutrisi dari langsung dari air dan dapat tumbuh di sungai kecil ataupun tumbuh di pinggir sungai yang memiliki air yang cukup tinggi. Tanaman selada air memiliki ciri-ciri batang yang tipis, merambat dan terkadang mengapung di atas air. Setiap daun terdiri dari 3 sampai 11 anak daun. Bunga berwarna kecil dan berukuran kecil dengan mahkota berbentuk silang. Bentuk buah siliques berukuran panjang 1,27 sampai 2,54 cm dengan 2 biji pada setiap lokus (Smith, 2007).

8


9

3. Kandungan kimia Senyawa yang terkandung dalam selada air (Nasturtium officinale) adalah adanya senyawa flavonoid yang terdapat di dalam selada air. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh (Mazandarani, et al, 2010) menyebutkan bahwa kandungan flavonoid totalnya sebesar 26,5 mg ekivalen quarsetin pada fase vegetatif dan 36,89 mg ekivalen kuarsetin pada fase generatif. Kandungan senyawa lain yang berpotensi sebagai antioksidan dalam spesies Brassica adalah lutein dan β karoten. Vitamin E dalam bentuk α tokoferol dapat bertindak sebagai senyawa antioksidan dengan memberikan atom hidrogennya ke senyawa radikal bebas dan juga terdapat kandungan vitamin C yang dapat bertindak sebagai antioksidan dengan mekanisme penangkapan radikal hidroksil dan superoksida. (Pilar, Tamara, Pablo, and Maria, 2011). 4. Sistematika selada air Tanaman selada air memiliki taksnomi sebagai berikut : Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Viridaeplantae

Infrakingdom

: Sterptophyta

Divisi

: Tracheophyta

Subdivisi

: Spermathophyta

Infradivisi

: Angiospermae

Class

: Magnoliopsida

Superordo

: Rosanae

Ordo

: Brassicales


Famili

: Brassicaceae

Genus

: Nasturtium

Spesies

: Nasturtium officinale R. Br.

10

( Anonim, 2013) B. Senyawa Fenolik 1. Pengertian senyawa fenolik Senyawa fenol mempunyai cincin aromatik yang mengandung bermacam gugus pengganti yang menempel, seperti gugus hidroksil , karboksil , metoksil (O-CH3), dan sering juga berstruktur cincin bukan aromatik. Senyawa fenol berbeda dengan lipid, yaitu lebih larut dalam air dan kurang larut dalam pelarut organik tak-polar. Beberapa agak larut dalam eter, khususnya jika jika pH cukup rendah untuk mencegah ionisasi gugus karboksil dan hidroksil yang ada ( Frank., 1995). Banyak senyawa fenol juga dihasilkan dari lintasan asam sikimat dan reaksi berikutnya diantaranya adalah asam sinamat, p-kumarat, kafeat, ferulat, dan gallat. Gallat akan diubah menjadi galotanin, polimer heterogen yang mengandung berbagai molekul asam galat yang saling terkait dengan asam galat lain serta dengan sukrosa dan gula lainnya. Banyak galotanin yang sangat menghambat pertumbuhan tanaman, dan ketahanan tumbuhan karena galotanin diangkut ke vakuola dan disitu mereka tidak dapat merombak enzim sitoplasma (Frank., 1995).


11

2. Senyawa fenolik dan antioksidan Dari sekian banyak senyawa fenolik di alam, flavonoid merupakan golongan terbesar, disusul fenolmonosiklik sederhana, fenilpropanoid, dan kuinon fenolik. Di alam, senyawa fenolik kerap dijumpai terikat pada protein, alkanoid, dan terdapat di antara terpenoid. Flavonoid berperan sebagai antioksidan karena dapat menangkap radikal bebas dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya. Pemberian atom hidrogen ini akan menyebabkan radikal bebas menjadi stabil dan berhenti melakukan perusakan terhadap lipida, protein dan DNA. Flavonoid dapat menghentikan tahap awal rekasi dengan melepaskan satu atom hidrogen kemudian berikatan dengan satu radikal bebas. Selanjutnya, dengan mekanisme seperti itu, radikal peroksi dapat dihancurkan atau distabilkan oleh resonansi dari gugus hidroksil yang membuat energi aktivasinya berkurang ( Ide., 2008).

OH

O

+R

RH +

O

O

H

H

(Silalahi, 2006). Gambar 1. Mekanisme penghambatan radikal bebas oleh senyawa fenolik

3.Senyawa fenolik pada tanaman Senyawa fenolik di dalam tanaman terdiri dari

satu atau lebih struktur

cincin aromatik dan terdapat gugus hidroksil. Senyawa ini tersebar secara luas di


12

tanaman dan merupakan hasil dari metabolit sekunder. Fungsi senyawa fenolik pada tanaman adalah sebagai pelindung terhadap sinar UV, parasit, atau terhadap agen patogen. Senyawa fenolik yang terdapat di dalam tanaman meliputi asam fenolat, flavonoid dan tanin. Senyawa flavonoid terbagi menjadi 6 sub bagian tersendiri, yaitu: flavons, flavonols, flavanols, flavanones, isoflavones dan antosianin ( Dai and Mumper, 2010). Senyawa fenolik terdapat secara luas di dalam tanaman salah satu tanaman yang memiliki senyawa polifenol adalah teh hijau (Camellia sinensis) adalah sebagai berikut epicatechin, epigallocatechin, epicatechin-3-gallate dan epigallo-catechin-3-gallate.Senyawa

fenolik ini terdapat pada daun teh yang

masih segar (Anesini, Ferarro,and Filip, 2008). Senyawa fenolik dapat ditemukan pada tanaman berkayu. Senyawa fenolik menyebabkan eksplan cepat berubah warna menjadi coklat dan mengering bahkan sesudah terbentuk kalus. Senyawa fenol tersebut akan teroksidasi membentuk quinon yang bersifat racun terhadap sel-sel tanaman ( Hendaryono, dan Wijayani,1994). 4.Kandungan senyawa fenolik pada tanaman selada air (Nasturtium officinale R.Br). Kandungan senyawa fenolik yang terdapat pada tanaman selada air (Nasturtium officinale) antara lain adalah terdapat senyawa flavonoid total pada tanaman ini yang telah dilakukan penelitian oleh (Mazandarani,et al, 2010). Senyawa flavonoid merupakan senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan yang kuat. Kuersetin merupakan salah satu senyawa fenolik yang poten sebagai antioksidan yand dapat menangkal radikal bebas dengan


13

mengoksidasi dari reaksi radikal bebas. Pada penelitian ini digunakan standard antiokisdan rutin karena efek penghambatan flavonoid rutin dan quersetin terhadap peroksidasi lipid bergantung pada ion Fe dalam lesitin liposom. Senyawa flavonoid tersebut bekerja dengan cara mengkelat logam, serta menangkap aktivitas radikal bebas. Dalam hal ini terjadi interaksi rutin dengan ion superoksida. Rutin secara signifikan lebih efektif menghambat sistem peroksidasi lipid yang tergantung ion Fe. Pengkelatan ion Fe menyebabkan kompleks ion inert dan tidak dapat mengawali terjadinya peroksidasi lipid,mekanisme pengkelatan rutin lebih kuat dibandingkan dengan vitamin C. (Winarsih., 2007).

OH OH

HO

O

O OH

Rhamoglikosida

O

Gambar 2. Struktur rutin

C. Metode Folin-Ciocalteu Senyawa fenolik dapat ditetapkan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip kerja dari metode ini adalah reaksi reduksi oksidasi. Ciocalteu merupakan

Reagen Folin–

reagen pengoksidasi berupa larutan berwarna kuning.

Senyawa fenolik dalam sampel akan dioksidasi oleh molybdotungstate yang merupakan komponen dari Folin–Ciocalteu membentuk senyawa berwarna biru.


14

Reaksi antara senyawa fenolik dengan Folin–Ciocalteu berjalan lambat pada suasana asam, sehingga perlu penambahan natrium bikarbonat agar terbentuk suasana basa dan reaksi dapat berjalan lebih cepat. Penggunaan metode ini telah digunakan oleh (Agustiningsih, Wildan, dan Mindaningsih, 2010) dalam menetapkan kandungan senyawa fenolik pada ekstrak daun pandan wangi ( Pandanus amaryllifous Roxb ). Pengukuran dengan Folin-Ciocalteu digunakan untuk pengukuran senyawa fenolik total. Prinsipnya berdasarkan pada rekasi oksidasi dari senyawa fenolik dan reduksi dari senyawa yang memiliki kromofor. Jika dalam sampel tersebut t terdapat agen pereduksi seperti asam askorbat, asam amino, xantin dan protein akan mengganggu pada pengukuran ini ( Makar., 2003).

Reagen ini

terdiri dari campuran polimer anionik yang akan tereduksi menjadi warna biru. Struktur dari bentuk kromofor ini tergantung dari sifat fenolik dan panjang gelombang maksimum pada 760 nm ( Hemingway and Laks,1992). D. Antioksidan 1. Pengertian antioksidan Senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron. Secara biologis pengertian antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam dampak dari oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan teresbut bisa dihambat ( Winarsih, 2007).


15

2. Sumber antioksidan a. Antioksidan alami Tumbuhan mengandung berbagai jenis antioksidan , namun yang paling penting adalah vitamin C, vitamin E, senyawa fenol (meliputi flavonoid, tokoferol dan lignin). Khasiat antioksidan untuk mencegah bahaya radikal bebas terdapat pada tanaman dan buah-buahan yang kaya akan antioksidan. Mekanisme kerja dari zat tersebut sebagai antiokisdan adalah sebagai berikut. 1) Vitamin E Vitamin E atau tokoferol adalah inhibitor terhadap lipida peroksidasi. Terdapat delapan jenis tokoferol alam yang mempunyai aktivitas sebagai vitamin E, tetapi alfa tokoferol yang paling aktif secara biologis. Tokoferol suatu antiokisdan yang sangat efektif, yang dengan mudah menyumbangkan atom hidrogen pada gugus hidroksil (OH) dari struktur cincin ke radikal bebas sehingga radikal bebas menjadi tidak reaktif. Dengan menyumbangkan hidrogen, vitamin E sendiri menajdi suatu radikal , tetapi lebih stabil karena elektron yang tidak berpasangan pada atom oksigen mengalami delokalisasi ke dalam struktur cincin aromatik(Silalahi, 2006). 2) Vitamin C Vitamin C merupakan suatu antioksidan penting yang larut dalam air. Vitamin C secara efektif menagkap radikal-radikal O2-, OH, peroksil dan oksigen singlet, dan juga berperan dalam melindungi membrane biologis. Dengan mengikat radikal peroksil dalam fase berair dari plasma atau


16

sitosol, vitamin C dapat melindungi membran biologis dari kerusakan peroksidatif. Sifat penting dari vitamin C sebagai antioksidan pertama, karena mempunyai potensial reduksi yang rendah

sehingga radikal

askorbil mampu bereaksi dengan radikal biologis dan mereduksi oksidanoksidan. Stabilitas dan reaktivitas yang rendah dari radikal askorbil, yang terbentuk ketika askorbat yang menangkap SOR dan senyawa nitrogen yang reaktif (Silalahi, 2006). 3) β karoten Senyawa karotenoid bekerja sebagai antioksidan, yakni penangkap radikal bebas, terutama radikal peroksil dan hidroksil maupun oksigen singlet. Sebagai antioksidan, beta karoten memperlambat fase inisiasi. Senyawa ini lebih efektif sebagai antiokisdan biologis terutama pada bagian yang memiliki tekanan partial oksigen rendah ( Silalahi, 2006). b. Antioksidan sintetik Antioksidan sintetik merupakan antiokisdan yang dibuat di pabrik untuk tujuan tertentu misalnya untuk mengawetkan makanan.

Sebagai contoh dari

senyawa antiokisdan sintetik adalah BHA (Butil Hidroksi Anisol), BHT (Butil hidroksi toluena) dan TBHQ (Tersier Butil Hidro Quinon ). Namun saat ini penggunaan dari antiokisdan bautan mulai dibatasi penggunaannya karena dapat menimbulkan penyakit seperti kanker, asma, urtikaria, dsb ( Race, 2009).


17

3. Penggolongan antioksidan Berdasarkan mekanisme kerjanya , antioksidan digolongkan menjadi tiga kelompok, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier. a. Antioksidan primer Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase (SOD) , katalase, dan glutation peroksidase (GSH-Px). Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer, apabila dapat memberikan atom hydrogen secara tepat kepada senyawa radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah menjadi senyawa yang lebih stabil.sebagai antioksidan, enzim-enzim tersebut menghambat pembentukan radikal bebas, dengan cara memutus rekasi berantai polimerisasi), kemudian mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil (Winarsi, 2007). b. Antioksidan sekunder Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau non enzimatis. Antioksidan dalam kelompok ini juga disebut sistem pertahanan . Dalam sistem pertahanan ini, terbentuknya senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara pengkelatan metal atau dirusak pembentukannya. Pengkelatan metal terjadi dalam cairan ekstraseluler. Antioksidan non-enzimatis dapat berupa komponen-nutrisi dan komponen nutrisi dari sayuran dan buah-buahan. Kerja sistem antioksidan non enzimatik, yaitu dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai dan radikal bebas atau dengan cara menangkapnya. Akibatnya, radikal bebas tidak akan bereaksi dengan komponen seluler. Antioksidan sekunder meliputi vitamin E, vitamin C, flavonoid (Winarsi, 2007).


18

c. Antioksidan tersier Kelompok antioksidan tersier meliputi enzim DNA repair dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini berfungsi sebagai perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas. Kerusakan DNA yang terinduksi senyawa radikal bebas dicirikan dengan rusaknya single dan double strand, baik gugus non-basa maupun basa ( Winarsi, 2007). 4. Metode uji aktivitas antiokisdan a. Metode DPPH Salah satu metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan suatu bahan adalah dengan menggunakan radikal bebas DPPH. DPPH adalah radikal bebas yang bersifat stabil dan beraktivitas dengan cara mendelokasi elektron bebas pada suatu molekul, sehingga molekul tersebut tidak aktif sebagaimana radikal bebas yang lain. Proses delokalisasi ini ditunjukkan dengan adanya warna ungu (violet) pekat yang dapat dikaraterisasi pada absorbansi (Molyneux, 2004). Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH menggunakan prinsip spektrofotometer. Senyawa DPPH akan berwarna ungu pada panjang gelombang 517 nm. Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya untuk berikatan dengan DPPH membentuk DPPH tereduksi,ditandai dengan semakin hilangnya warna ungu menjadi kuning (Molyneux, 2004). Struktur DPPH dan DPPH tereduksi hasil reaksi dengan antioksidan adalah sebagai berikut:


NO2

19

NO2 H N

O2N

NO2

N

+ DH

N

O2N

N

+D

NO2

Gambar 3. Reaksi DPPH dengan senyawa antioksidan

b. Metode CUPPRAC Metode pengukuran aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode Cupprac menggunakan bahan bis (neurokoprin) tembaga (II) sebagai pewarna kromogenik. Pereaksi bis (neurokoprin) tembaga (II) yang berwarna biru akan mengalami reaksi reduksi setelah senyawa yang berpotensi sebagai antiokisdan ditambahkan ke dalamnya dan akan mengakibatkan terbentuknya warna kuning dari hasil reaksi reduksi menjadi bentuk bis (neurokoprin) tembaga (I). Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 453,4 nm (Widyastuti., 2010). c. Metode FRAP Metode pengujian antiokisdan dengan metode FRAP menggunakan kompleks besi ligan 2,4,6 –tripiridil –triazin sebagai pereaksi. Senyawa kompleks ini memiliki warna biru akan berfungsi sebagai zat yang melakukan pengoksidasi dengan adanya senyawa antioksidan dan akan mengalami reaksi reduksi yang menghasilkan produk yang berwarna kuning pada suasana asam .Pengukuran kemudian dilakukan pada panjang gelombang 598 nm. Metode pengujian ini harus dilakukan apabila senyawa antioksidan dapat mereduksi Fe (III) TPTZ pada


20

kondisi reaksi secara termodinamika dan memiliki laju reaksi yang cukup cepat ( Widyastuti, 2010). Dari ketiga metode pengujian antioksidan yang ada, peneliti memilih menggunakan pengujian dengan metode DPPH karena metode ini lebih praktis dibandingkan dengan menggunakan pengujian aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode yang lain. E. Radikal Bebas 1. Pengertian radikal bebas Radikal bebas merupakan suatu atom ataupun gugus yang memiliki satu ataupun lebih elektron yang tak berpasangan. Karena jumlah elektron ganjil, sehingga tidak semua elektron dapat berpasangan. Meskipun suatu radikal bebas tidak bermuatan positif atau negatif, spesi ini sangat reaktif karena adanya elektron tidak berpasangan. Suatu radikal bebas biasanya dijumpai sebagai zat antara yang tak dapat diisolasi usia pendek, sangat reaktif, dan berenergi tinggi ( Fessenden and Fessenden, 1992). 2. Kerusakan sel akibat radikal bebas Radikal oksigen dan turunannya dapat mematikan sel. Radikal hidroksil menyebabkan kerusakan oksidatif terhadap protein, DNA, lemak membran yang mengandung lebih dari satu ikatan rangkap pada rantai hidrokarbon, dan komponen sel lain. Protein, membran, karbohidrat dan asam nukleat dapat menjadi rusak karena akibat radikal bebas oksigen. Kerusakan radikal bebas ini diperkirakan berperan menimbulkan berbagai macam penyakit. Pada protein,


21

asam amino prolin, hisitidin, arginin, sistein, dan metionin rentan terhadap serangan radikal hidroksil dan kerusakan oksidatif. Oksidasi asam amino dalam protein menimbulkan fragmentasi protein, pembentukan ikatan silang dan agregrasi ( Marks, Momeji, and Moghaddam, 1996). 3. Pembentukan radikal bebas Proses oksidasi merupakan proses yang meyebabkan atom mengalami peningkatan jumlah ikatan dengan oksigen atau penurunan jumlah ikatan dengan hidrogen atau kehilangan elektron. Oksigen merupakan molekul unsur memiliki konfigurasi elektron dwiradikal. Reaksi terbentuknya radikal bebas terdiri dari 3 tahap yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi(Cairns, 2004). a. Inisiasi Pada tahap ini terjadi pembelahan (fisi) homolitik ikatan kovalen di dalam molekul obat dan menghasilkan radikal bebas. Sumber energi pada proses ini berasal dari cahaya, baik cahaya ultraviolet maupun cahaya tampak yang mengenai sampel. Cahaya dengan panjang gelombang ini cukup energetik untuk memecah pasangan elektron dalam suatu ikatan kovalen dan menghasilkan dua radikal (Cairns, 2004). b. Propagasi Propagasi meruapkan reaksi kimia

yang utama. Pada langkah ini

radikal bebas bereaksi bersama-sama dan menghasilkan lebih banyak lagi spesies yang berekasi. Pada oksidasi, tahap propagasi ini melibatkan pembentukan peroksida dan hidroperoksida. Hidroperoksida dapat mengalami dekomposisi


22

lebih lanjut dan menghasilkan aldehid serta keton yang memiliki berat molekul kecil (Cairns, 2004). c. Terminasi Radikal bebas reaktif bergabung bersama membentuk ikatan kovalen, dan secara efektif proses reaksi rantai dan mengahsilkan senyawa yang stabil (Cairns, 2004). 4. Radikal bebas dalam tubuh Radikal bebas juga mucul di dalam proses fungsi normal di dalam sel. Proses metabolisme memerlukan banyak reaksi kimia yang melibatkan aksi dari radikal bebas, sebagai contoh adalah penggabungan rantai-rantai asam amino (polimerisasi) untuk membentuk protein atau polimerisasi dari molekul glukosa menjadi polisakarida menjadi

glikogen,melibatkan aksi radikal bebas. Dalam

proses metabolisme juga diproduksi radikal bebas yang penting dan berpotensi bahaya seperti radikal peroksida dan hidroksil (Youngson,1998). Bahaya radikal bebas dalam tubuh telah penelitian yang menggunakan ikan kerapu yang diinduksi dengan radikal bebas. Radikal bebas juga dapat menyebabkan berbagai macam penyakit misalnya pada penyakit Parkinson, kerusakan disebabkan akibat pembentukan radikal bebas oksigen yang berlebihan atau berkurangnya kemampuan inaktivasi radikal bebas di dalam inti ganglion basal. Karena nukleus kaudatus striatum tersebut juga berperan dalam fungsi emosi dan kognitif, defisiensi sintesis neurotransmitter yang disebabkan oleh kerusakan sel yang dicetuskan oleh radikal oksigen pada nukleus ini (Mark, et al, 1996).


23

F. Metode Ekstraksi Ekstraksi merupakan proses pemisahan senyawa kimia yang terdapat pada tanaman atau hewan ataupun komponen lain dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Senyawa kimia yang didapatkan dari proses ekstraksi merupakan campuran dari hasil metabolit ataupun senyawa lain yang terdapat pada tanaman. Pada tanaman merupakan sumber senyawa fenolik yang cukup banyak, proses ekstraksi untuk mendapatkan senyawa fenolik ini tergantung dari berat molekul, polaritas konsentrasi, jumlah gugus hidroksil dan cincin aromatik. Di dalam sampel terdapat berbagai variasi struktur dari senyawa fenolik itu sendiri, misalnya terdapat flavonoid, asam fenolat, antosianin dan proantosianin, oleh karena itu diperlukan metode ekstraksi yang tepat (Khoddami, Wilkes,and Roberts,2013). Pemilihan pelarut pada proses ekstraksi sangat tergantung dari sifat fisika kimia bahan aktif yang terdapat dalam sampel tanaman. Pemilihan pelarut yang baik untuk proses ekstraksi meliputi tidak bersifat toksik, mudah diuapkan pada suhu yang rendah, dapat mengawetkan hasil ekstraksi, tidak mengakibatkan kerusakan pada senyawa yang terdapat dalam sampel. Faktor yang cukup penting untuk pemilihan pelarut adalah jumlah senyawa fitokimia yang dapat diekstrak, lama proses ekstraksi, keberagaman jumlah senyawa aktif yang dapat diekstraksi, meskipun dalam proses ekstrkasi terdapat pelarut yang masih sisa, pelarut tersebut harus tidak toksik dan tidak mengganggu dalam proses pengukuran selanjutnya, pemilihan pelarut tergantung dari senyawa yang akan diekstrak ( Tiwari, Kumar , Kaur, and Kaur, 2011).


24

Pada penelitian ini metode ekstraksi yang digunakan adalah dengan menggunakan metode maserasi karena tidak dilakukan pemanasan dengan maserasi sehingga dapat digunakan untuk mengestraksi senyawa yang bersifat termostabil. Metode maserasi dilakuakn dengan cara mencampurkan serbuk dengan pelarut yang sesuai sampai pada waktu beberapa hari dan kemudian sampai semua senyawa yang dituju dalam sampel dapat terekstraksi. Metode maserasi yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan pelarut etanol 70% karena dengan konsentrasi etanol 70% dapat mendapatkan senyawa aktif bioflavonoid yang tinggi dibandingkan dengan menggunakan etanol yang murni. Hal ini disebabkan karena etanol 70% terdiri dari 30% kandungan air sehingga mengakibatkan

kepolaran

dari

pelarut

akan

meningkat

sehingga

akan

mempermudah dalam proses ekstraksi, etanol 70% akan mengakibatkan penetrasi ke dalam membran seluler untuk mengekstraksi bahan material intraseluler. Alasan lain digunakan pelarut etanol adalah tidak toksik dan lebih aman dibandingkan dengan pelarut metanol ( Tiwari, et al, 2011) . Penelitian ini tidak menggunakan penyarian dengan alat Sokletasi karena teknik ini diperlukan dengan melakukan pemanasan untuk sampel sampai 900C meskipun untuk melakukannya hanya diperlukan beberapa jam saja dibandingkan dengan metode maserasi yang memerlukan hingga beberapa hari.

Senyawa

fenolik meruapakan senyawa yang bersifat termolabil sehingga bila dilakukan dengan penyarian dengan alat Sokletasi akan mengakibatkan rusaknya senyawa fenolik yang menjadi target utama dalam proses ekstraksi ( Khoddami, et al, 2013). Sedangkan bila digunakan dengan metode perkolasi membutuhkan lebih


25

banyak cairan pelarut yang digunakan dibandingkan dengan menggunakan metode maserasi karena pelarut tersebut terus-menerus akan dimasukkan ke dalam perkolator sampai semua bahan metabolit sekunder tersebut sudah tersari semua dan juga harus selalu diguankan pelarut yang baru sehingga dirasakan kurang efisien dibandingkan dengan metode maserasi ( Tiwari,et al, 2011). G. Landasan Teori Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan kandungan senyawa fenolik total dari herba selada air (Nasturtium officinale R. Br). Senyawa fenolik total merupakan senyawa golongan flavonoid yang berpotensi sebagai penangkap radikal bebas dengan melepaskan satu atom hidrogennya ke molekul radikal bebas sehingga akan mengalami reaksi reduksi. Radikal bebas merupakan senyawa yang bersifat tidak stabil dan akan berbahaya bagi kesehatan jika masuk ke dalam tubuh dalam kurun waktu yang cukup lama. Oleh karena itu, dilakukan penelitian tentang sumber antioksidan yang berasal dari alam. Metode pengujian aktivitas antioksidan yang dilakukan adalah dengan menggunakan radikal DPPH, di mana DPPH akan mengalami proses reduksi karena adanya senyawa antioksidan yang akan mengakibatkan senyawa radikal itu akan kehilangan sifat radikalnya. Pengukuran aktivitas antiokisdan dinyatakan dengan

IC50, yaitu besarnya konsentrasi senyawa antioksidan yang mampu

menurunkan aktivitas dari DPPH sebesar 50%. Pengujian senyawa fenolik dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu yang prinsipnya adalah melakukan reaksi reduksi ion fenolat oleh reagen Folin-Ciocalteu pada suasana basa,


26

kemudian untuk hasil senyawa fenolik total dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per gram fraksi. H. Hipotesis 1. Herba selada air (Nasturtium officinale R.Br) mengandung senyawa fenolik. 2. Nilai aktivitas rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air dapat dinyatakan dengan IC50 dengan menggunakan metode DPPH.


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena subjek uji diberi perlakuan selama proses penelitian . B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah konsentrasi dari rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air . 2. Variabel terikat Varibel terikat pada penelitian ini adalah nilai % IC. 3. Variabel pengacau terkendali Varibel pengacau terkendali pada penelitian ini adalah tempat tumbuh tanaman selada air. 4. Variabel pengacau tak terkendali Varibel pengacau tak terkendali pada penelitian ini adalah usia tanaman dan kondisi tanah.

27


28

C. Definsi Operasional 1. Herba selada air Herba selada air diperoleh dari perkebunan di Kaliurang, Yogyakarta. Sayuran didapatkan dari pemasok sayuran segar yaitu dari depo sayur segar. Herba selada air yang diguankan dalam penelitian ini adalah keseluruhan herba selada air yang meliputi daun dan batang kecuali akar. 2. Ekstrak etanolik herba selada air Ekstrak etanolik herba selada air adalah ekstrak kental yang diperoleh dari serbuk selada air dengan menggunakan pelarut etanol teknis 70% dengan metode maserasi. Ekstrak kental didapatkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator. 3. Fraksi etil asetat dari herba selada air. Fraksi etil asetat herba selada air adalah ekstrak kental yang diperoleh dari ekstrak kental etanolik yang sudah melalui proses farksinasi. Ekstrak kental dari fraksi etil asetat dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator . 4. Persen IC. Persen IC merupakan kemampuan penangkapan fraksi etil asetat untuk menangkap radikal bebas yang diperoleh dari nilai absorbansi. 5. IC50 IC50 merupakan besarnya konsentasi senyawa sampel yang mampu menurunkan absorbansi DPPH sebanyak 50%.


29

D. Alat dan Bahan Pada penelitian ini alat dan bahan yang digunakan adalah sebagai berikut: 1. Alat Alat

–alat

yang digunakan

adalah

spektrofotometer

UV-1240,

Seperangkat alat –alat gelas dari pyrex, kuvet, vaccum rotary evaporator ( Junke & Kunkle), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), waterbath ( labo- tech ,Heraeus), blender, oven, printer. 2. Bahan Bahan-bahan yang diguankan adalah serbuk herba selada air, etanol 70% kualitas farmasetis, wasbensin, etil asetat dari P.T Brataco, rutin, DPPH, reagen Folin-Ciocalteu diperoleh dari Sigma.Chem, metanol p.a. diperoleh dari E. Merck, natrium karbonat, aquadest yang didapat dari laboratorium Farmakognosi-Fitokimia. E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi tanaman pada penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. 2. Pengumpulan bahan Pengumpulan bahan dilakukan di Kaliurang pada pagi hari, kemudian sampel herba selada air segera dibawa ke laboratorium untuk dikeringkan karena


30

jika terlalu lama akan terjadi browning. Pemanenan dilakukan pada bulan Februari 2013. 3. Preparasi sampel Sampel segar berupa herba

selada air sebanyak 4,3 kg dikeringkan

dengan menggunakan oven pada suhu 400C selama 2 hari. Setelah itu herba yang sudah kering digiling dengan blender sampai terbentuk serbuk yang halus. Serbuk kemudian dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70% selama dua hari . Setelah itu memisahkan ampas dengan pelarut menggunakan corong Buchner. Ampas sisa kemudian diremaserasi selama dua hari. Setelah itu dipisahkan antara pelarut

dan

ampas

dengan

menggunakan

corong

Buchner,

kemudian

mencampurkan antara pelarut satu dan dua yang diperoleh dari hasil maserasi yang pertama dan hasil remasearsi dan dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental etanolik. Ekstrak kental etanolik yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan menggunakan aquades hangat sebanyak 300 ml, kemudian dipartisi dengan menggunakan wasbensin, fase wasbensin dibuang dan diambil fase air. Setelah itu fase air dipartisi lagi dengan menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental fraksi etil asetat. Fraksi inilah yang akan digunakan untuk penelitian lebih lanjut. 4. Penetapan kandungan fenolik total Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotomteri.


a.

31

Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat 50, 75, 100, 125 dan 150 µg/ml

ditambahkan dengan 5 ml larutan reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

menggunakan

aquadest

dengan

perbandingan

(1:10)

kemudian

ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na2CO3 1M. Setelah 30 menit, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 760 nm. b.

Optimasi penetapan kandungan fenolik total 1 ) Penentuan OT (Operating Time) Sebanyak 0,5 ml larutan induk asam galat 50, 100 dan 150 µg/ml ditambahkan dengan 5,0 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquadest (1:10) dan kemudian ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na2CO3 1M. Absorbansi diukur setiap 5 menit pada panjang gelombang 760 nm selama 40 menit. 2 ) Penentuan panjang gelombang maksimum Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat 50, 100 dan 150 µg/ml ditambahkan dengan 5,0 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquadest dengan perbandingan (1:10) kemudian ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na2CO3 1 M selanjutnya dilakukan scanning pada panjang gelombang 600- 800 nm.

c.

Estimasi penetapan kadar senyawa fenolik total sampel Sebanyak 0,5 ml larutan sampel dengan kosentrasi 500 µg/ml

ditambhakan dengan 5,0 ml reagen

Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan

dengan aquadest dengan perbandingan (1:10) dan kemudian ditambahkan dengan


32

4,0 ml larutan Na2CO3 1M , diamkan selama 30 menit dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 448,6 nm. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat ( mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). 5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji aktivitas antioksidan a. Pembuatan larutan DPPH Sejumlah tertentu DPPH dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a. pada labu ukur 10 ml sehingga didapatkan konsentrasi larutan DPPH sebesar 0,4 mM. b. Pembuatan larutan pembanding 1) Pembuatan larutan induk rutin Sebanyak 2,5 mg rutin ditimbang dan kemudian dilarutkan metanol p.a pada labu ukur 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk sebesar 250 µg/ml. 2) Pembuatan larutan stok Dari larutan induk diambil sebanyak 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml dan 1,0 ml dan kemudian dilarutkan dengan metanol p.a. sehingga diperoleh kadar sebesar 15 µg/ml, 17,5 µg/ml, 20 µg/ml, 22,5 µg/ml dan 25 µg/ml. c. Pembuatan larutan uji Ditimbang 20 mg sampel kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a. dalam labu ukur 10 ml sampai batas tanda. Dari larutan induk kemudian diambil sebanyak 1,75 ml, 1,875 ml, 2,0 ml, 2,125 ml dan 2,25 ml ,


33

sehingga didapatkan kadar seri larutan uji sebesar 350 µg/ml, 375 µg/ml , 400 µg/ml, 425 µg/ml, 450 µg/ml. 6. Penentuan Operating Time (OT) dan panjang gelombang maksimum uji aktivitas antioksidan a.

Penentuan Operating Time (OT) Penentuan OT

dilakukan untuk melihat waktu yang diperlukan oleh

larutin uji dengan DPPH untuk berekasi secara sempurna. Pada penentuan OT ini untuk larutan pembanding dilakukan pada konsentrasi 15 µg/ml, 20 µg/ml , dan 25 µg/ml. Dilakukan pengukuran absorbansi dari menit ke 5 sampai menit ke 60, pembacaan absorbansi dilakukan setiap 5 menit. OT ditandai dengan penurunan absorbansi yang relatif lebih stabil. Dilakukan juga untuk larutan uji sebesar 350 µg/ml, 400 µg/ml dan 450 µg/ml. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. b.

Pengukuran panjang gelombang maksimum Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada konsentrasi

DPPH sebesar 0,02 mM, 0,04 mM dan 0,08 mM. Dilakukan scanning pada panjang gelombang 400-600 nm, kemudian penentuan panjang gelombang maksimum didapatkan dari hasil ketiga rata-rata pengukuran DPPH dengan tiga konsentrasi yang berbeda. 7. Uji pendahuluan dan estimasi aktivitas antioksidan pada larutan uji dan pembanding a.

Uji pendahuluan Disiapkan 3 buah tabung reaksi. Pada tabung pertama diisi dengan

menggunakan 1 ml metanol p.a. dan 1 ml larutan DPPH 0,4 mM, tabung kedua dengan 1ml larutan uji rutin sebesar 20 µg/ml dan 1 ml larutan DPPH 0,4 mM,


34

tabung ketiga dengan 1 ml larutan uji sebesar 400 µg/ml dan 1 ml larutan DPPH , setelah itu diamkan selama 30 detik dan amati perubahan warna yang terjadi. b.

Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan larutan pembanding Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan dari senyawa pembanding

yaitu rutin dilakukan pada seri larutan baku 15 µg/ml, 17,5 µg/ml, 20 µg/ml, 22,5µg/ml dan 25 µg/ml. Setelah itu, direkasikan dengan larutan DPPH 0,4 mM dan diamkan selama OT, yaitu 30 menit dan pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum, yaitu 515,5 nm. Pengukuran dilakukan dengan replikasi sebayak 3 kali. c.

Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan larutan uji Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan pada seri larutan

baku sampel 350 µg/ml, 375 µg/ml, 400 µg/ml, 425 µg/ml dan 450 µg/ml. Setelah itu direaksikan dengan larutan DPPH 0,4 mM dan diamkan selama OT, yaitu 30 menit dan pengukuran dilakkukan pada panjang gelombang maksimum yaitu 515,5 nm. Pengukuran dilakukan dengan replikasi sebanyak 3 kali. F. Analisis Hasil Analsis hasil untuk pengukuran aktivitas antioksidan yang dinyatakan sebagai % IC dapat dilakukan dengan rumus : AbsorbansiDPPH – Absorbansi sampel

x 100%

Absorbansi DPPH Kemudian dari data itu dianalisis dan dihitung nilai IC50 yang didapatkan dari persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear diperoleh dengan memplotkan antara sumbu X sebagai konsentrasi larutan uji/pembanding dan


35

sumbu y adalah nilai % IC dan kemudian dibandingkan terdapat perbedaan yang bermakna antara nilai IC50 dari sampel dan pembanding. Penetapan kandungan senyawa fenolik total yang dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat diperoleh dengan memasukkan absorbansi dari larutan uji ke dalam persamaan regresi linear dari kurva baku asam galat.


BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Pada percobaan kali ini, peneliti menggunakan sumber acuan yang sesuai dan kemudian dicocokkan dan hasilnya menunjukkan bahwa tanaman yang dimaksud adalah selada air (Nasturtium officinale R. Br) yang digunakan pada penelitian ini. B. Pengumpulan Bahan Pengumpulan bahan dilakukan di Kaliurang, Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada pagi hari sebelum matahari terbit dan kemudian sesegera mungkin dibawa ke laboratorium untuk dicuci dan segera dilakukan pengeringan. Pada penelitian ini sampel tanaman herba selada air diperoleh dari pemasok sayuran segar di Yogyakarta yaitu Depo Sayur Segar

yang berada di Jalan Monjali.

Sampel segar yang diperoleh dipanen pada pagi hari sebelum matahari terbit, tujuannya adalah supaya tidak terjadinya peristiwa browning. Peristiwa Browning ini dapat terjadi karena proses adaptif dari tanaman karena adanya luka atau karena proses penuaan. Peristiwa browning dapat disebabkan karena adaanya pengaruh enzimatik dalam tanaman itu sendiri, yaitu senyawa fenolik yang terdapat dalam tanaman oleh pengaruh enzim polifenol oksidase dengan bantuan oksigen akan mengubah gugus monofenol menjadi gugus O- hidroksi fenol yang selanjutnya diubah lagi menjadi O-kuinon, gugus inilah yang akan memberikan warna coklat (Thipyapong, Stout, and Attajarusit, 2007).

36


37

Pemilihan sayur herba selada air yang digunakan tidak boleh ada yang berwarna kuning pada daun ataupun batangnya, karena jika sudah terjadi kekuningan terjadi peristiwa browning yang akan mengakibatkan rusaknya senyawa fenolik di dalam tanaman karena aktivitas enzim polifenol oksidase sehingga tidak dipilih sayuran yang sudah berwarna kekuningan, jadi dipilih sayuran segar yang berwarna hijau. Pemanenan tanaman selada air dilakukan 2 jam setelah matahari terbit karena senyawa polifenol merupakan senyawa yang bersifat termolabil sehingga bila dilakukan pemanenan pada siang hari akan mengakibatkan rusaknya senyawa fenolik yang terdapat di dalam tanaman yang akan dipanen. C. Hasil Preparasi Sampel 1. Pengeringan Sampel herba selada air segar sebanyak 4,5 kg kemudian dicuci dengan air bersih yang mengalir tujuannya adalah untuk menghilangkan partikel-partikel asing dan kotoran yang terdapat pada selada air dan dikhawatirkan akan mengganggu dalam proses penelitian ini. Setelah sampel segar dicuci bersih kemudian dilakukan pemotongan menjadi beberapa bagian yang lebih kecil adapun tujuannya adalah lebih cepat dalam proses pengeringan karena akan memperluas

luas kontak permukaan

dari sampel tersebut setelah dilakukan

pemotongan supaya proses pengeringan dapat berjalan lebih cepat karena air yang terdapat didalam sampel selada air dapat lebih cepat menguap karena adanya pemanasan.


38

Setelah itu sampel yang sudah dipotong-potong dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 400 C selama 2 hari. Penggunaan suhu 40 0C dilakukan supaya tidak merusak senyawa fenolik yang berpotensi sebagai antioksidan karena senyawa fenolik mudah rusak oleh adanya panas. Tujuan dilakukan pengeringan adalah supaya kandungan air yang terdapat di dalam sampel dapat diuapkan sehingga mengurangi resiko terjadinya kontaminasi dari pertumbuhan bakteri, jamur ataupun organisme lain karena air merupakan salah satu media yang baik untuk pertumbuhan bakteri ataupun organisme hidup lainnya

dan lebih mudah untuk dibuat dalam proses

penyerbukan. Setelah kering herba yang sudah kering kemudian digiling dan kemudian dijadikan serbuk dan hasil yang didapatkan setelah penyerbukan adalah 151,1 g serbuk kering, jadi rendemennya sebesar 3,513 %. 2. Ekstraksi Serbuk kemudian ditimbang dan dibagi menjadi tujuh sehingga berat masing- masing

serbuk yang terbagi adalah 21,58 gram. Serbuk kemudian

dilakukan maserasi dengan menggunakan pelarut etanol. Alasan diguanakannya pelarut etanol adalah sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh (Tevin, 2009) yang menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH dengan menggunakan pelarut etanol menunjukkan absorbansi yang lebih rendah dibandingkan dengan menggunakan pelarut air. Selain itu, penggunaan pelarut etanol bisa digunakan untuk mengambil senyawa polifenol yang terdapat pada tanaman karena dengan penggunaan cairan etanol pada proses maserasi dapat mengakibatkan enzim polifenil oksidase menjadi tidak aktif dan kemudian


39

senyawa polifenol akan keluar. Penggunaan pelarut etanol 70% yang digunakan dalam proses ekstraksi dengan menggunakan metode maserasi dikarenakan pelarut etanol 70% memiliki polaritas yang lebih tinggi dibandingkan dengan etanol murni yaitu 99- 100 % sehingga senyawa aktif bioflavonoid akan lebih banyak tertangkap pada konsetrasi etanol 70%. Etanol mudah memasuki ke dalam membran sel untuk mengekstraksi bahan-bahan intraseluler dari dalam sel seperti senyawa fenolik dan komponen organik lainnya ( Tiwari,et al, 2007). Pada penelitian ini metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi tidak menggunakan metode ekstraksi lain yang menggunakan proses pemanasan seperti yang dilakukan dengan penyarian dengan alat Sokletasi, karena senyawa polifenol merupakan senyawa yang bersifat termolabil sehingga bila digunakan dengan penyarian menggunakan alat Sokletasi akan mengakibatkan rusaknya senyawa polifenol yang akan didapatkan. Begitu juga dengan menggunakan metode ekstrkasi dengan cara refluks, dan infundasi karena metode ini juga menggunakan proses pemanasan. Metode perkolasi penelitian ini karena

tidak digunakan

dalam

metode ini memerlukan waktu yang cukup lama dan

digunakan cukup banyak pelarut yang akan digunakan, selain itu metode ini juga hanya mendapatkan komponen yang diinginkan tidak terlalu banyak sehingga dipilih dengan metode maserasi. Maserasi dilakukan selama dua hari dan dilakukan pada suhu kamar, tujuan dilakukannya ekstraksi dengan metode

maserasi adalah untuk

mendapatkan senyawa polfenol yang terdapat dalam sel tanaman, metode maserasi ini mengakibatkan dinding sel tumbuhan tersebut dapat pecah karena


40

terdapat gaya tekanan putar sehingga menyebabkan senyawa aktif bioflavonoid yang merupakan metabolit sekunder dapat keluar dari dalam sel menuju ke cairan pelarut. Pelarut etanol yang digunakan menyebabkan perbedaan tekanan osmotik di dalam dan diluar sel sehingga

air masuk ke dalam sel tumbuhan dan

menyebabkan zat aktif yang berada di dalam sel tumbuhan akan keluar, peristiwa tersebut akan terus berulang hingga terjadi keseimbangan antara larutan didalam sel dan didalam sel. Setelah dua hari perendaman kemudian untuk memisahkan antara ampas dengan pelarut dengan menggunakan corong Buchner dengan tujuan untuk memisahkan antara pelarut dengan serbuk, digunakan juga dengan bantuan pompa vakum untuk mempermudah proses ekstraksi Sampel diremaserasi kembali dengan menggunakan pelarut etanol 70% selama dua hari dengan tujuan supaya jika masih ada metabolit sekunder yang masih belum tersari saat dilakukan maserasi yang pertama diharapakan dapat tersari pada maserasi yang kedua, kemudian setelah dua hari dipisahkan kembali antara pelarut dan serbuk dan kemudian dicampur dengan hasil masearsi yang pertama, selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak etanolik yang kental digunakan vaccum rotary evaporator yang berdasarkan prinsip kerjanya adalah berdasarkan perbedaan dari titik didih sehingga dapat memisahkan secara baik antara etanol dan zat filtrat. Selanjutnya, untuk filtrat yang sudah kental dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas penangas uap sekitar suhu 40- 500 C digunakan suhu tidak terlalu tinggi dengan tujuan supaya tidak merusak senyawa fenolik yang bersifat termolabil. Ekstrak diuapkan dengan penangas air sampai didapatkan bobot tetap,


41

dari hasil itu didapatkan berat ekstrak etanolik kental sebesar 30,8629 g dengan rendemen sebesar 20,425% dihitung dari serbuk kering yang diperoleh. 3. Fraksinasi Setelah didapatkan ekstrak etanolik yang kental, dilanjutkan dengan fraksinasi adapun tujuan dilkukannya fraksinasi adalah untuk mendapatkan komponen senyawa spesifik yang akan dicari. Pada penelitian ini senyawa yang dicari adalah senyawa fenolik yang terkandung dalam sel tanaman. Pelarut etanol yang digunakan dalam proses maserasi selain melarutkan senyawa fenolik tetapi selain itu juga dapat melarutkan senyawa organik lainnya yang tidak dikehendaki seperti lipid, klorofil dan senyawa organik lainnya, oleh karena itu untuk mendapatkan senyawa fenolik yang dituju perlu dilakukan fraksinasi. Proses fraksinasi pada penelitian ini dilakukan dengan melarutkan sampel dari hasil ekstraksi yang menghasilkan ekstrak kental etanolik dengan menggunakan 300 ml air hangat dengan tujuan untuk melarutkan ekstrak etanolik yang sudah didapatkan supaya dapat dilakukan ekstraksi cair-cair. Pada ekstraksi cair-cair pada prinsipnya menggunakan dua macam pelarut yang berbeda yang nantinya akan digojog sehingga diharapkan senyawa yang dituju dapat terambil pada salah satu pelarut yang digunakan selama proses fraksinasi. Setelah dilarutkan dengan air hangat, kemudian dilakukan fraksinasi dengan menggunakan pelarut wasbensin yang bersifat non polar. Tujuan dilakukan partisi dengan wasbensin adalah untuk menghilangkan senyawa non polar seperti klorofil lipid, asam organik , karotenoid yang secara alami terdapat


42

dalam sel tanaman ( Dai, et al, 2010). Selanjutnya campuran antara air dan wasbensin tersebut digojog dengan menggunakan corong pisah dengan tujuan supaya senyawa nonpolar dapat tertarik dari ke dalam fase wasbensin. Fraksi wasbensin berada di atas air hal tersebut disebabkan

karena adanya perbedaan

dari berat jenis antara kedua pelarut yang digunakan dalam fraksinasi itu. Adapun berat jenis untuk air 0,996 sedangkan berat jenis untuk wasbnesin adalah 0,730 (Anonim,1995). Fraksi air yang didapatkan kemudian digunakan kembali untuk dilakukan fraksinasi lagi dengan menggunakan etil asetat sedangkan fase wasbenin dibuang. Proses fraksinasi pada penelitian dilakukan dengan 3 kali pemisahan yaitu masing-masing 100 ml untuk setiap kali melakukan fraksinasi, hal ini bertujuan supaya

didapatkan hasil fraksinasi

yang optimal karena menurut

hukum Nerst koefisen distribusi (KD) merupakan perbandingan antara zat terlarut di dalam kedua pelarut yang tidak saling campur yang nantinya akan berpindah karena terjadi kejenuhan dan berdistribusi ke salah satu pelarut karena perbedaan kepolarannya, sehingga untuk mendapatkan hasil yang baik diperlukan beberapa kali proses fraksinasi. Setelah didapatkan fraksi air selanjutnya dilakukan fraksinasi lagi dengan, menggunakan etil asetat, digunakan etil asetat karena penggunaan etil asetat dapat adalm proses fraksinasi akan mengakibatkan senyawa –senyawa aktif yang terdapat dalam sel tanaman dapat berpindah dari fase air menuju ke faseetil asetat, senyawa aktif yang dapat larut ke dalam fase etil asetat yang


43

memiliki sifat semi-polar. Salah satu senyawa fenolik yang dapat tertarik masuk ke dalam fraksi etil asetat adalah flavonoid. Fraksinasi dengan menggunakan fraksi etil asetat juga untuk memisahkan bentuk glikon (terikat dengan gula) dan aglikonnya (bentuk tidak terikat dengan gula), sedangkan senyawa lain yang masuk ke dalam fraksi air adalah senyawa fenolik yang bersifat polar dan dalam bentuk aglikon. Pada penelitian ini yang diambil adalah fraksi dari etil asetat, dalam corong pisah fraksi etil asetat akan berada di bagian bawah sedangkan fraksi air akan berada di bagian atas hal ini disebabkan karena perbedaan dari berat jenis. Berat jenis untuk air adalah 0,996 sedangkan berat jenis untuk etil asetat adalah 0,898 (Anonim, 1995). Setelah dilakukan pemisahan dengan menggunakan corong pisah didapatkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air kemudian dipekatkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator, setelah didapatkan ekstrak kental fraksi etil asetat ekstrak etanolik setelah bobot tetap adalah 1,3043 g, kemudian ekstrak kental disimpan di dalam desikator dengan ditutup aluminium foil dengan tujuan supaya terhindar dari cahaya matahari secara langsung yang dikhawatirkan dapat merusak senyawa fenolik yang berpotensi sebagai antioksidan sehingga mempengaruhi hasil dalam penelitian. D. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total Uji pendahuluan ini bertujuan untuk melihat ada atau tidaknya kandungan senyawa fenolik yang terdapat pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik


44

dari herba selada air. Uji pendahuluan yang digunakan pada penelitian ini menggunakan metode yang digunakan adalah dengan metode Folin-Ciocalteu. Metode ini

akan mengakibatkan terjadinya reduksi

dari ion

fenolat dan

senyawa lain yang bisa tereduksi, sehingga akan terjadi perubahan warna menjadi biru pada susana yang basa. Pada uji pendahuluan ini untuk melihat adanya kandungan senyawa fenolik yang terdapatr pada sampel, dilakukan tiga tabung yang berisi kontrol positif, kontrol negatif dan sampel. Kontrol positif yang berisi reagen FolinCiocalteu, larutan natrium karbonat

1M dan larutan pembanding asam galat

dengan konsentrasi 100 µg/ml, sedangkan kontrol negatif yang berisi reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat dan sampel yang berisi larutan sampel dengan konsentrasi 500 µg/ml, selanjutnya ditambahkan dengan reagen kontrol negatif yang berisi reagen Folin-Ciocalteu, larutan Na2CO3 dan larutan metanol p.a. : air (1:1). Kemudian didiamkan selama 30 detik dan diamati perubahan warna yang terjadi.

Gambar 4. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total Keterangan : tabung A ( fraksi etil asetat + Folin-Ciocalteu + Na2CO3), tabung B (asam galat + Folin-Ciocalteu + Na2CO3), tabung C ( Folin-Ciocalteu + Na2CO3)


45

Setelah dilakukan pengamatan dapat dilihat bahwa terjadi perubahan warna menjadi biru tua pada kontrol positif dan terjadi pula perubahan warna menajdi biru yang terdapat pada larutan uji, tetapi tidak terjadi perubahan warna pada kontrol negatif. Hal ini dapat disimpulkan bahwa sampel uji mengandung senyawa fenolik yang dibuktikan dengan terajdinya perubahan warna menjadi biru karena terjadi proses reduksi oleh reagen Folin-Ciocalteu pada suasana yang basa. 2.Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Uji pendahuluan ini bertujuan untuk melihat ada atau tidaknya aktivitas antioksidan yang terdapat pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik dari

herba

selada air . Metode uji pendahuluan yang dilakukan pada penelitian ini termasuk ke dalam metode kualitatif karena hanya dilakukan pengamatan. Uji pendahuluan antioksidan akan memberika hasil positif yang ditandai dengan berubahnya warna DPPH dari ungu tua menjadi kekuningan hal ini dapat disebabkan karena terjadi penguarangan aktivitas dari radikal DPPH karena ditangkap oleh senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan

sehingga terbentuk senyawa DPPH yang

tereduksi. Pada uji ini disiapkan 3 tabung reaksi yang berisi kontrol positif yang berisi larutan rutin dengan konsentrasi 20 µg/ml

dan larutan DPPH dengan

konsentrasi 0,4 mM, kontrol negatif yang kemudian hanya berisi larutan DPPH 0,4 mM tanpa diberi larutan rutin dan sampel dan hanya ditambah dengan pelarut metanol p.a. Kemudian untuk sampel yang berisi konsentrasi 0,4 mM dan

larutan DPPH

dengan

fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air

dengan konsentarsi 400 µg/ml.


46

Gambar 5. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Keterangan : tabung A ( DPPH + metanol p.a.), tabung B ( fraksi etil asetat ekstrak etanolik + DPPH + metanol p.a. dan tabung C ( rutin + DPPH + metanol p.a.)

Dari ketiga perlakuan tersebut dibandingkan warna ketiga larutan tersebut setelah didiamkan selama 30 detik. Dari hasil percobaan didapatkan bahwa terjadi perubahan warna

untuk kontrol positif yaitu dari warna ungu

menjadi kuning begitu juga dengan larutan uji yang berisi sampel dan DPPH akan tetapi tidak terjadi perubahan warna pada kontrol negatif yang berisi larutan DPPH dan metanol p.a. kemudian dapat disimpulkan bahwa terdapat aktivitas antioksidan yang terdapat dalam sampel yang ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi kuning seperti yang terjadi pula pada kontrol positif. E. Hasil Optimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total 1. Penetapan Operating Time (OT) Pada penelitian ini dilakukan Opertaing Time

dengan tujuan untuk

mengetahui waktu reaksi yang optimal antara asam galat dengan reagen FolinCiocalteu. Pengukuran OT dilakukan selama 40 menit dengan melakukan pengukuran absorbansi setiap lima menit sekali. Pada penelitian ini digunakan tiga konsentrasi dari asam galat yang berbeda, yaitu konsentrasi kecil, sedang dan


47

besar yang digunakan untuk menentukan OT. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum,yaitu 760 nm.

Gambar 6. Penentuan Operating Time (OT) asam galat replikasi 2

Dari gambar 6 dapat dilihat bahwa pada menit ke dua puluh lima , semua asam galat dengan konsentrasi yang berbeda yaitu 50, 75 , dan 100 µg/ml telah bereaksi sempurna dengan reagen Folin-Ciocalteu pada suasana basa , hal ini ditandai dengan absorbansi yang sudah mulai stabil pada menit ke 30, sehingga dari data diatas dapat disimpulkan bahwa operating time untuk penentuan kandungan asam galat dengan Folin-Ciocalteu adalah 30 menit. 2. Pengukuran panjang gelombang maksimum Pengukuran panjang gelombang maksimum pada penelitian ini dimaksudkan untuk menentukan panjang gelombang maksimum yang dapat digunakan untuk pengukuran. Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan dengan melakukan scanning pada panjang gelombang 600- 800 nm.


48

Dilakukan pada tiga konsentrasi dari asam galat yang berbeda yaitu konsentrasi kecil, sedang dan tinggi. Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan setelah Operating Time (OT) supaya didapatkan serapan yang maksimal. Tabel I. Penentuan panjang gelombang maksimum asam galat

Konsentrasi asam galat ( µg/ml)

50 100 150

Panjang Panjang gelombang gelombang maximum hasil maximum ratascanning rata 761 748,6 742 743

Dari tabel diatas setelah dilakukan penentuan

Panjang gelombang maximum secara teoritis 760 nm

panjang gelombang

maksimum dari ketiga konsentrasi dari asam galat, yaitu 50, 100, dan 150 µg/ml didapatkan rata-rata dari hasil panjang gelombang maksimum yaitu sebesar 748,6 nm. F. Hasil Penetapan Kandungan Senyawa Fenolik Total Penetapan kandungan senyawa fenolik total pada penelitian kali ini menggunakan metode Folin-Ciocalteu, dimana prinsipnya adalah dengan melakukan reaksi

oksidasi dan reduksi. Reagen Folin-Ciocalteu terdiri dari

campuran fosmolibdat dan fosfotungstat yang akan mengalami reaksi reduksi sehingga akan menghasilkan warna biru yang terbentuk sebagai hasil dari terbentuknya senyawa komples molybdenum blue. Senyawa fenolik akan mengalami reaksi oksidasi pada suasana basa yang berasal dari larutan natrium karbonat sehingga akan menghasilkan ion fenolat yang akan selanjutnya ion inilah


49

yang akan diukur sebagai senyawa fenol yang dapat diukur pada panjang gelombang maksimum yang telah didapatkan, yaitu 748,6 nm. Penelitian ini dilakukan penetapan kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik karena peneliti ingin mengetahui hubungan aktivitas antiokisdan dengan kandungan fenolik totalnya. Senyawa fenolik yang terdapat di dalam tumbuhan termasuk salah satu senyawa golongan flavonoid yang berpotensi sebagai antioksidan dengan mendonorkan ion hidrogennya pada gugus hidroksilnya ketika berekasi dengan senyawa radikal melalui mekanisme transfer elektron sehingga proses oksidasi dapat dihambat dan menyebabkan aktivitas radikal bebas menjadi menurun. Penentuan kandungan fenolik total pada sampel fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air dengan metode Folin-Ciocalteu ditujukkan untuk mengetahui kandungan kandungan fenolik total yang terdapat dalam sampel. Kandungan fenolik total memiliki korelasi dengan aktivitas antioksidan, semakin tinggi kandunagn fenolik total maka aktivitas antioksidannya akan semakin meningkat sedangkan bila kandungan fenolik total dalam sampel rendah maka aktivitas antiokisdannya akan semakin rendah pula ( Anesini, Ferarro, and Filip, 2008), Oleh karena itu dilakukan penelitian mengenai kandungan fenolik total dalam sampel fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air. Senyawa baku yang digunakan untuk menentukan kandungan fenolik total mg ekivalen asam galat dilakukan dengan cara membuat kurva baku dengan menggunakan asam galat, digunakan asam galat sebagai baku karena senyawa ini


50

merupakan senyawa fenolik yang biasa dipakai sebagai penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteu, selain itu asam galat mudah didapatkan dan memiliki harga yang cukup murah . COOH

HO

OH OH

Gambar 7. Struktur asam galat Tabel II. Tabel persamaan regresi linier dari baku asam galat

Replikasi

1

2

3

Konsentrasi asam galat ( µg/ml) 50 75 100 125 150 49 74 99 124 149 50 75 100 125 150

Absorbansi

Persamaan regresi linier

0,313 0,420 0,535 0,619 0,731 0,329 0,445 0,572 0,680 0,792 0,305 0,412 0,528 0,631 0,729

A = 0,1096 B = 4,14.10-3 r = 0,9990 y = 4,14.10-3x + 0,1906 A = 0,1038 B = 4,644.10-3 r = 0,9996 y = 4,644.10-3x +0,1038 A = 0,0942 B = 4,268. 10-3 r =0,9995 y = 4,268.10-3x +0,0942

Penetapan kandungan fenolik total didalam sampel diperoleh dengan memasukkan absorbansi dari sampel yang kemudian dihitung

menggunakan


51

regresi linier dengan nilai r yang tertinggi yaitu pada replikasi 2 dengan nilai r 0,9996 dan persamaan regresi linier yang didapatkan adalah y = 4,644.10-3x + 0,1038. Tabel III. Tabel kandungan senyawa fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air

Sampel (µg/ml)

Absorbansi

500 500 510

0,401 0,407 0,411

Kandungan Kandungan RataSD (%) fenolik fenolik rata ( mg (µg/ml) total (mg ( mg ekivalen ekivalen ekivalen asam asam galat asam galat per gram galat per fraksi) per gram gram fraksi) fraksi ) 63,996 6,390 6,463 0,066 65,288 6,520 66,149 6,480

Berdasarkan tabel

dapat dilihat bahwa kandungan fenolik total (mg

ekivalen asam galat per gram fraksi) yang didapatkan dengan memasukkan nilai absorbansi dari masing-masing sampel ke dalam persamaan regresi linier didapatkan hasil perhitungan kandungan fenolik total

untuk sampel 1 sebesar

6,390, sampel 2 sebesar 6,520 dan sampel 3 sebesar 6,480 dengan rata-rata dari ketiga sampel tersebut sebesar 6,463 dengan SD sebesar 0,066 sehingga dapat dapat diketahui bahwa nilai rata-rata untuk kandungan senyawa fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air adalah 6,463 ± 0,066 mg ekivalen asam galat per gram fraksi .


52

G. Hasil Optimasi Penentuan Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan Operating Time (OT). Penentuan Operating Time (OT) bertujuan untuk mengetahui waktu dimana sudah terjadi reaksi yang optimal antara DPPH dengan rutin ataupun dengan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air sehingga dapat mengurangi kesalahan bias dalam penelitian ini pada saat pembuatan kurva baku . Penentuan Operating Time (OT) pada penelitian ini ditandai dengan penurunan absorbansi setiap satuan waktu yang menandakan jumlah DPPH yang tertangkap oleh senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan, jika penurunan dari absorbansi sudah menunjukkan absorbansi yang cukup stabil menunjukkan bahwa waktu itu sudah menunjukkan Operating Time (OT). Penentuan Operating Time (OT) rutin mengukur

larutan rutin

dilakukan dengan cara

yang sudah direaksikan dengan DPPH dengan

konsentrasi larutan rutin sebesar 15 µg/ml, 20 µg/ml dan 25 µg/ml, begitu juga dengan larutan uji yang sudah direaksikan dengan

DPPH yaitu dengan

konsentarsi larutan farksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air sebesar 350 µg/ml , 400 µg/ml dan 450 µg/ml . Pengukuran Operating Time (OT) dilakukan selama 60 menit dengan mengukur absorbansi baik dari baku rutin dan dari sampel setiap 5 menit sekali. Pengukuran Operating Time (OT) menggunakan panjang gelombang maksimum dari DPPH ,yaitu sebesar 517 nm.


53

Gambar 8. Operating Time (OT) rutin replikasi 1

Gambar 9. Operating Time fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air replikasi 3

Dari hasil penentuan Operating Time (OT) dapat ditentukan bahwa pada menit ke -30 semua reaksi antara fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air

dan

larutan pembanding (rutin) dengan DPPH sudah berjalan dengan

sempurna

pada konsentrasi kecil, sedang dan tinggi yang ditandai dengan

abosorbansi yang sudah mulai stabil. Hal ini dapat dilihat pada gambar 9 dan 10 ,


54

sehingga dapat disimpulkan bahwa pada menit ke 30 merupakan Operating Time untuk penentuan aktivitas antioksidan rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air. 2.Penentuan panjang gelombang maksimum Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk melihat panjang gelombang

dari

larutan DPPH yang

dapat memberikan hasil

pengukuran yang maksimal. Hasil dari penentuan panjang gelombang maksimum digunakan untuk melakukan pengukuran terhadap kurva baku rutin dan sampel dalam penentuan aktivitas antioksidan . Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan terhadap tiga konsentrasi larutan DPPH yang berbeda, kemudian untuk menentukan panjang gelombang maksimum dimabil rata-rata dari ketiga konsentrasi larutan DPPH teresebut. Pengkuran dilakukan dengan melakukan scanning

dari panjang

gelombang 400- 600 nm, adapun panjang gelombang maksimum DPPH secara teoritis adalah 517 nm. Tabel IV. Penentuan panjang gelombang maksimum DPPH

Konsentrasi larutan DPPH

0,02 Mm 0,04 Mm 0,08 Mm

Hasil scannning pengukuran panjang gelombang max larutan DPPH 515,5 nm 515,5 nm 515,5 nm

Rata –rata panjang gelombang

Panjang gelombang secara teoritis

515,5 nm

517 nm


55

Dari hasil pengkuran ketiga konsentarsi larutan DPPH diperoleh bahwa rata-rata panjang gelombang maksimum yang diperoleh adalah 515,5 nm. H. Hasil Penenetuan Aktivitas Antioksidan Pada penelitian ini uji aktivitas antioksidan dari senyawa baku rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air menggunakan metode DPPH. Metode DPPH mengukur kemampuan penangkapan radikal bebas sehubungan dengan kemampuan komponen senyawa yang menyumbangkan elektron atau hidrogen. Setiap molekul yang dapat menyumbangkan elektron atau hidrogen akan bereaksi dan memudarkan warna DPPH. Intensitas warna dari DPPH akan berubah dari ungu menjadi kuning karena terbentuknya DPPH yang tereduksi oleh elektron yang berasal dari senyawa yang bertindak sebagai antioksidan. Metode DPPH dipilih karena metode ini lebih cepat, mudah dan praktis dibandingkan dengan metode lain sehingga dipilih dengan menggunakan metode DPPH. Reaksi antara DPPH dengan antioksidan

NO2

NO2 H N

O2N

NO2

N

+ DH

N

O2N

N

+D

NO2

Gambar 10. Reaksi antara DPPH dengan antioksidan

Dari reaksi yang terjadi antara DPPH dengan senyawa antioksidan yang dapat melepaskan atom hidrogennya terlihat bahwa bentuk DPPH yang tereduksi


56

menjadi bentuk yang tidak bersifat radikal, karena elektron bebas yang terikat pada atom nitrgen telah diambil oleh atom hidrogen yang dilepaskan sehingga senyawa DPPH menjadi stabil. Senyawa DPPH merupakan senyawa organik sintesis yang bersifat sangat tidak stabil. Senyawa DPPH telah digunakan sebagai uji aktivitas antioksidan telah lama digunakan selama lebih dari lima puluh tahun terakhir. Senyawa DPPH dapat digunakan untuk menangkap berbagai macam senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan yang terdapat di alam sebagai contoh asam askorbat, asam amino sistein yang mengandung gugus tiol , senyawa gugus amin aromatik ( p- fenil diamin), dan senyawa polihidroksi aromatik. (Molyneux, 2004). Penelitian ini menggunakan senyawa baku pembanding rutin untuk uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik dari herba selada air. Digunakan pembanding rutin karena senyawa ini merupakan salah satu senyawa golongan flavonoid yang dapat bertindak sebagai penanangkap radikal bebas . Rutin dapat memberikan satu atom hidrogennya ke molekul DPPH yang bersifat sangat tidak stabil sehingga akan terjadi reduksi dari senyawa DPPH yang akan berakibat turunnya aktivitas dari senyawa radikal bebas itu sendiri. OH OH

HO

O

O OH

Rhamoglikosida

O

Gambar 11. Struktur kimia rutin


57

Mekanisme penghambatan radikal bebas oleh senyawa rutin : O

R

H

O OH

OH

HO

HO

O

O

+ RH O OH

O

Rhamoglikosida OH

O

Rhamoglikosida

O

O

O

OH

OH

HO

HO

O

O OH

O

O

Rhamoglikosida OH

O

Rhamoglikosida

O

O

O

OH

OH

HO

HO

O

O OH

O

O

O

Rhamoglikosida OH

Rhamoglikosida

O

(Rollando, 2012). Gambar 12. Mekanisme penghambatan DPPH oleh rutin

Dari mekanisme reaksi yang terjadi antara rutin dengan DPPH dapat dilihat bahwa senyawa rutin dengan gugus hidroksinya memberikan atom


58

hidrogennya kepada radikal bebas DPPH yang mempunyai satu pasang elektron bebas, kemudian senyawa rutin akan menerima elektron bebas yang berasal dari senyawa DPPH yang selanjutnya akan terjadi resonansi elektron pada cincin benzena rutin, sehingga aktivitas radikal dari DPPH akan menurun yang ditandai dengan berubahnya warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Aktivitas antioksidan diperoleh dari nilai absorbansi yang selanjutnya akan digunakan untuk menghitung persentase inhibisi 50% (IC50) yang menyatakan konsentrasi dari senyawa DPPH akan mengalami

yang mampu menyebabkan 50% dari

proses reduksi dilihat dari terjadinya penurunan

absorbansi . Semakin kuat suatu senyawa berpotensi sebagai antioksidan, maka akan semakin kecil nilai dari IC50 yang akan didapatkan karena semakin kecil pula konsentarsi yang dibutuhkan untuk menurunkan aktivitas dari DPPH.

Gambar 13. Kurva aktivitas antioksidan rutin replikasi 3


59

Gambar 14. Kurva aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air replikasi 2 Tabel V. Perhitungan persamaan regresi linier %IC dengan baku rutin

Replikasi

1

2

3

Konsentrasi Absorbansi Rutin ( µg/ml) 14,4 0,552 16,9 0,504 19,4 0,456 21,9 0,409 24,4 0,360 15 0,548 17,5 0,505 20 0,460 22,5 0,420 25 0,384 15 0,536 17,5 0,501 20 0,466 22,5 0,436 25 0,399

Aktivitas antioksidan ( %IC) 33,413 39,203 44,993 50,066 56,574 33,975 39,156 44,578 49,397 53,734 35,421 39,638 43,855 47,469 51,927

Persamaan Regresi Linier A = 0,4742 B = 2,2874 r = 0,9994 y = 2,2874x +0,4742 A = 4,3608 B = 1,9903 r = 0,9991 y = 1,9903x+ 4,3608 A = 10,9876 B = 1,6337 r = 0,9996 y = 1,6337x+ 10,9876

Tabel VI. Perhitungan persamaan regresi linier %IC dengan baku fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air

Replikasi

Konsentrasi Fraksi etil Asetat (µg/ml)

Absorbansi

Aktivitas antioksidan (% IC)



1

344,75 369,75 394,75 419,75 444,75 350 375 400 425 450 350 375 400 425 450

2

3

0,551 0,511 0,476 0,437 0,376 0,554 0,513 0,469 0,435 0,391 0,553 0,517 0,481 0,432 0,392

33,614 38,433 42,650 47,349 54,698 33,172 38,118 43,425 47,527 52,834 33,453 37,785 42,117 48,014 52,827

60

A = - 37,312 B = 0,2043 r = 0,9937 y = 0,2043x- 37,312 A = - 34,9576 B = 0,1949 r = 0,9993 y = 0,1949x – 34,9576 A = - 35,524 B = 0,1959 r = 0,9982 y = 0,1959x- 35,524

Tabel VII. Tabel nilai IC50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air

Bahan uji

Rutin Fraksi etil asetat

IC50 ( µg/ml) Rep 1 Rep 2 Rep 3 21,651 22,930 427,371 435,903

23,879 438,809

RataRata (µg/ml) 22,820 434,402

SD (%)

% CV (%)

1,118 5,945

4,899 1,368

Berdasarkan persamaan regresi linier kemudian memasukkan fungsi y dengan angka 50 kemudian didapatkan nilai IC50 dari aktivitas antioksidan kurva baku dari rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air dengan metode DPPH, diperoleh nilai IC50 rutin adalah 22,820 ± 1,118 µg/ml sedangkan untuk fraksi etil asetat diperoleh nilai IC50 sebesar 434,402 ±5,945 µg/ml. Berdasarkan nilai IC50 yang didapatkan bahwa aktivitas antiokisdan rutin lebih kuat dibandingkan dengan rutin, kemudian kekuatan aktivitas antioksidan dilihat nilai IC50 yang diperoleh dapat diketahui bahwa aktivitas antioksidan dari rutin sangat kuat karena nilai IC50 berada di bawah 50 µg/ml, sedangkan aktivitas


61

antioksidan dari fraksi etil asetat adalah kuat karena nilai IC50 berada diantara kisaran 50- 100 µg/ml. Tabel VIII. Tingkat kekuatan antioksidan

Sampel Rutin Fraksi etil asetat

IC50 ( µg/ml) 22,820 434,402

Tingkat aktivitas antioksidan Sangat Kuat (50Sedang Lemah (> kuat ( < 50 100 (101- 150 150 µg/ml) µg/ml) µg/ml) µg/ml) V V

(Ariyanto, 2006). Setelah itu dilakukan pengujian statistika dengan Program R untuk uji normalitas data dari IC50 rutin dengan fraksi etil asetat dengan menggunakan metode uji Shapiro -Wilk. Pengujian normalitas data diperlukan untuk menentukan parameterik uji yang akan digunakan selanjutnya, jika hasil statistik yang diperoleh berdistribusi normal maka uji yang akan dilakukan adalah parametrik, bila hasil yang diperoleh tidak berdistribusi normal maka dilakukan uji parametrik. Dari hasil pengujian didapatkan nilai p-value untuk uji normalitas data IC50 rutin adalah 0,4175 dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air adalah 0,8371, karena nilai p-value IC50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air diatas 0,05 maka HO diterima sehingga dapat disimpulkan bahwa data IC50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air terdistribusi normal. Uji selanjutnya adalah dilakukan uji T tidak berpasangan yang merupakan salah satu uji parametrik. Uji ini dilakukan untuk melihat apakah terdapat perbedaan antara IC50 rutin dengan fraksi etil asetat, dari hasil pengujian


62

Didapatkan nilai p- value lebih kecil dari 0,05. Dengan demikian, kesimpulan statistika yang dapat diambil adalah Ho ditolak dan H1 diterima sehingga IC50 antara rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air adalah berbeda.


BAB V KESIMPULAN dan SARAN A. Kesimpulan 1. Kandungan senyawa fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air adalah (6,463±0,066 ) mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat. 2. Hasil aktivitas antioksidan dari rutin yang dinyatakan dengan IC50 adalah (22,820±1,118)µg/ml dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air adalah (434,402±5,945) µg/ml. B. Saran Perlu dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan dan penentuan kandungan senyawa fenolik total dengan menggunakan fraksi air ekstrak etanolik herba selada air.

63


DAFTAR PUSTAKA Anesini, C., Ferarro ,G.E., and Filip, R, 2008, Total Polyphenol Content and Antioxidant Capacity of Commercially Available Tea (Camellia sinensis) in Argentina, J. Agric. Food Chem, 56, 9225–9229. Anonim,2002 ,http://www.hukor.depkes.go.id/up_prod_kepmenkes/KMK%20 No.%201407%20ttg%20Pedoman%20Pengendalian%20Dampak%20Pen cemaran%20Udara.pdf,hal3,diakses tanggal 11 April 2013. Anonim, 2013, http://www.itis.gov/ servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_ topic=TSN&search_value=23255 , diakses tanggal 4 Agustus 2013. Agustiningsih., Wildan, A., dan Mindaningsih, 2010, Optimasi Cairan Penyari Pada Pembuatan Ekstrak Daun Pandan Wangi ( Pandanus amaryllifous Roxb) Secara Maserasi Terhadap Kadar Fenolik dan Flavonoid Total, Momentum,6, 36-41. Ariyanto., 2006, Uji Aktivitas Antioksidan , Penentuan Kandungan Fenolik dan Fraksi Air Ekstrak Metanolik Pegagan (Centella asiatica L. Urban) , Skripsi, 68, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Cairns, D., 2004, Intisari Kimia Farmasi, 2th ed, , EGC, Jakarta, pp. 175-176. Chandra, B., 2006, Ilmu Kedoteran Pencegahan dan Komunitas ,Penerbit buku kedokteran EGC, Jakarta, pp.78,79 . Corwin, E. J., 2008, Buku Saku Patofisiologi, 3th, Penerbit buku kedokteran EGC, Jakarta, pp. 33. Dai, J., and Mumper,R.J, 2010, Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties, Molecules,15, 7314-7335. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Ersam, T., 2004, Keunggulan Biodiversitas Hutan Tropika Indonesia Dalam Merekayasa Model Molekul Alami, Seminar Nasional Kimia VI, Jurusan Kimia Institut Teknologi Surabaya, Surabaya. Frank, B,. S dan Cleon W., R., 1995, Fisiologi Tumbuhan , ITB, Bandung, pp. 145.

64


65

Fessenden, R. J., and Fessenden,J.S, 1992, Kimia Organik, 3th ed., Erlangga, Jakarta , pp. 223- 224. Harmita., 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, 1, 117-135. Hendaryono, D., dan Wijayani, A, 1994, Teknik Kultur Jaringan, Kanisius, Yogyakarta, pp. 135. Hemingway, R.W., and Laks, P.E, 1992, Plant Polyphenols Synthesis, Properties, Significance, Plenum Press, New York, pp. 264. Ide, P., 2008, Dark Chocolate Healing, PT Elex Media Komputindo , Jakarta, pp. 105. Ismail , J., Runtuwene, M.R.J., and Fatimah , F, 2010, Penentuan Total Fenolik dan Uji Aktivitas Antioksidan Pada Biji dan Kulit Buah Pinang Yaki ( Areca vestiara Giseke),Jurnal Ilmiah Sains ,12 ,84-87. Khoddami, A., Wilkes, M.A.,and Roberts, T.H, 2013,Technique for Analysis of PlantPhenolicCompound,Molecules,18, 2328-2375. Makkar, H. P.S, 2003, Quantification of Tannins in Tree and Shrub Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, pp. 4.

Foliage,

Marks, D.B., Marks, A.D., and Smith,C.M,1996, Biokimia Kedokteran Dasar:Sebuah Pendekatan Klinis, EGC, Jakarta, pp. 325-326. Mazandarani,M., Momeji, A., and Moghaddam, P.Z, 2012, Evaluation of phytochemical and antioxidant activities from different parts of Nasturtium officinale R. Br. in Mazandaran, Iranian Journal of Plant Physiology , 3 , 659-664. Molyneux. P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol, 2006, 211-219. Ozen, T., 2009, Investigation of Antioxidant Properties of Nasturtium officinale (Watercress) Leaf Extracts, Acta Poloniae Pharmaceutica-Drug Research , 66, 187-193. Pilar, S., Tamara,S., Pablo,S., and Maria,E.S, 2011, Antioxidant Properties of Brassica Vegetables, Functional Plant Science and Biotechnology,5, 4355.


Prabantini, D., 2010, A to Z Makanan Pendamping ASI, 1 Yogyakarta, pp. 68.

th

66

ed., Andi,

Race, S., 2009, Antioxidants, Tigmor Books, United Kingdom, pp. 7-10. Rollando., 2012, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1 –Difenil 2-Pikril Hidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak Metanol Daun Sirih ( Piper betle L.), Skripsi,68, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Seidemann, J ., 2005, World Spice Plants Economic Usage, Botany,Taxonomy, European Union, Berlin, pp. 250 Silalahi, J., 2006, Makanan Fungsional ,1th ed.,48-53, Kanisius, Yogyakarta. pp. 48-53. Smith, E.C., 2007, Watercress (Nasturtium officinale) Production Utilizing Brook Trout (Salvelinus fontinalis) Flow-through Aquaculture Effluent,Tesis, 14-20, Department of Agriculture Morgantown, West Virginia. Sumardjono, D., 2006, Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata 1 Fakultas Bioeksakta, Penerbit buku kedoteran EGC, Jakarta , pp.614. Tiwari, P.,Kumar, B., Kaur, M., Kaur,G., and Kaur, H, 2011, Phytochemical screening and Extraction: A Review, International Pharmaceutica Sciencia, 1, 98-104. Thipyapong, P., Stout, M .J., and Attajarusit, J, 2007, Functional Analysis of Polyphenol Oxidases by Antisense/Sense Technology, Molecules, 12, 1569- 1595. Widyaningsih,W., 2010, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak etanol Daun Dewa ( Gynura procumbens) Dengan Menggunakan Metode DPPH ( 1,1 – difenil-2-pikrilhidrazil), Skripsi, 109-104, Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta. Widyastuti, Niken., 2010, Pengukuran Aktivitas Antioksidan Dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP Serta Korelasinya Dengan Fenol dan Flavonoid Pada Enam Tanaman, Skripsi, Departemen Kimia IPB, 5-6, Bogor. Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas,1 Yogyakarta, pp. 77, 79-81,190, 191.

th

, Kanisius,


67

Wirakusumah, E.R., 2007, Jus Buah dan Sayuran, 1th ed., Penebar Swadaya, Depok, pp.60. Youngson, R., 2003, Antioksidan: Manfaat Vitamin C dan E Bagi Kesehatan, 1th, Penerbit Arcan , Jakarta, pp. 19.


LAMPIRAN Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman

68


Lampiran 2. Gambar Selada Air (Nasturtium officinale R.Br)

69


70

Lampiran 3. Perhitungan Rendemen Uji Aktivitas Antioksidan a. Rendemen ekstrak etanolik Penimbangan

Bobot cawan Bobot cawan + ekstrak Bobot ekstrak Total bobot ekstrak

Cawan 1 (g) 48,8154

Cawan 2 (g) 57,3122

Cawan 3 (g) 59,4113

Cawan 4 (g) 58,6043

Cawan 5 (g) 29,7053

Cawan 6 (g) 40,059

52,5199

62,7035

65,3319

64,4294

32,9566

44,8291

5,7045

5,3913

5,9206

5,8251

3,2513

4,7701

30,8629 g

Bobot herba selada air segar yang digunakan = 4300 g Rendemen ekstrak etanol = ( Total berat ekstrak etanolik/Berat herba selada air segar) x 100% = (30,8629 g /4300 g) x 100% = 0,7177 % b. Rendemen fraksi etil asetat Penimbangan Bobot cawan

= 59,4113 g

Bobot cawan + fraksi = 60,7156 g Bobot fraksi

= 1,3043

g

Rendemen fraksi etil asetat = (Berat fraksi etil asetat/berat herba) = (13043 g/4300 g) x 100% = 0,0303%

x 100%


71

Lampiran 4. Data Penimbangan Uji Aktivitas Antioksidan a. Penimbangan DPPH

Berat kertas Berat kertas + DPPH Berat kertas + sisa Berat DPPH

Replikasi 1 (g) 0,3113 0,3130 0,3115 0,0015

Replikasi 2 (g) 0,3044 0,3061 0,3045 0,0016

Replikasi 3 (g) 0,3768 0,3785 0,3629 0,0156

b. Penimbangan rutin

Berat kertas Berat kertas + rutin Berat kertas + sisa Berat rutin

Replikasi 1 (g) 0,3250 0,3279 0,3274 0,0024

Replikasi 2 (g) 0,3458 0,3487 0,3483 0,0025

Replikasi 3 (g) 0,3358 0,3387 0,3383 0,0025

c. Penimbangan fraksi etil asetat

Berat cawan

Replikasi 1 (g) 48,8155



Berat cawan + fraksi Berat cawan + sisa

48,8358

57,3339

40,0773

48,8352

57,3336

40,077

Berat fraksi

0,0197

0,02

0,02


Lampiran 5. Data Konsentrasi Uji Aktivitas Antioksidan a. Konsentrasi larutan DPPH Rep 1 BM = 394,32 Mol = (massa/BM) = (15,0 mg/394,33)

= 0,0380 mmol

M = ( mol/volume) = (0,0380 mmol/0,1 L) = 0,380 mM Rep 2 BM = 394,32 Mol = (massa/BM) = (16,0 mg/394,32)

= 0,0405 mM

M = ( mol/volume) = (0,0405 mmol/0,1L) = 0,405 mM Rep 3 BM = ( massa/BM) = (15,6 mg/394,32)

= 0,0395 mM

M = (mol/volume) = (0,0395 mM/0,1 L) = 0,395 mM Konsentrasi larutan induk rutin Replikasi 1

Replikasi 2

(2,4 mg/10 ml) = 240 µg/ml

( 2,5 mg/10 ml) = 250 g/ml

Replikasi 3 ( 2,5 mg/10 ml)

= 250 µg/ml

72


73

b. Konsentrasi seri baku rutin Replikasi

1 2 3

Seri baku 1 14,4 15 15

Konsentrasi (µg/ml) Seri baku Seri baku Seri baku 2 3 4 16,9 19,4 21,9 17,5 20 22,5 17,5 20 22,5

Seri baku 5 24,4 25 25

c. Konsentrasi larutan induk fraksi etil asetat Replikasi 1

Replikasi 2

19,7 mg/10 ml = 1970 µg/ml

20 mg/10 ml = 2000 µg/ml

Replikasi 3 20 mg/10 ml = 2000 µg/ml Konsentrasi seri baku fraksi etil asetat Replikasi

1 2 3

Seri baku 1 344,75 350 350

Konsentrasi (µg/ml) Seri baku Seri baku Seri baku 2 3 3 369.75 394,75 419,75 375 400 425 375 400 425

Seri baku 4 444,75 450 450


Lampiran 6. Penentuan Operating Time (OT) Rutin a. Penentuan OT rutin rep 1 Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

15 µg/ml 0,626 0,601 0,580 0,565 0,554 0,545 0,540 0,535 0,530 0,525 0,523 0,519

Absorbansi 20 µg/ml 0,558 0,478 0,61 0,456 0,451 0,450 0,446 0,446 0,447 0,447 0,446 0,446

25 µg/ml 0452 0,387 0,374 0,365 0,363 0,360 0,359 0,360 0,360 0,360 0,360 0,360

Absorbansi 20 µg/ml 0,495 0,435 0,423 0,417 0,415 0,414 0,414 0,414 0,414 0,413 0,412 0,414

25 µg/ml 0,461 0,402 0,383 0,375 0,370 0,365 0,359 0,359 0,359 0,358 0,359 0,358

OT yang diperoleh adalah 30 menit b. Penentuan OT rutin rep 2 Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

15 µg/ml 0,653 0,623 0,607 0,599 0,591 0,587 0,583 0,582 0,581 0,579 0,578 0,576

OT yang diperoleh adalah 30 menit

74


c. Penentuan OT rutin rep 3 Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

15 µg/ml 0,618 0,552 0,538 0,531 0,528 0,524 0,521 0,521 0,522 0,522 0,522 0,520

Absorbansi 20 µg/ml 0,380 0,366 0,359 0,355 0,353 0,351 0,353 0,353 0,353 0,354 0,353 0,354

25 µg/ml 0,365 0,342 0,329 0,322 0,317 0,314 0,312 0,310 0,310 0,308 0,308 0,308

OT yang diperoleh adalah 30 menit Jadi dari ke 3 replikasi penentuan OT rutin didapatkan hasil 30 menit.

75


Lampiran 7. Penentuan Operating Time (OT) Fraksi Etil Asetat a. Penentuan OT fraksi etil asetat rep 1 Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

350 µg/ml 0655 0,600 0,592 0,583 0,577 0,571 0,568 0,565 0,562 0,561 0,559 0,557

Absorbansi 400 µg/ml 0,569 0,521 0,501 0,490 0,480 0,474 0,468 0,464 0,459 0,455 0,452 0,451

450 µg/ml 0,472 0,412 0,386 0,370 0,357 0,347 0,339 0,331 0,325 0,319 0,313 0,308

Absorbansi 400 µg/ml 0,583 0,522 0,504 0,493 0,485 0,479 0,479 0,473 0,469 0,465 0,463 0,460

450 µg/ml 0,487 0,407 0,378 0,359 0,345 0,333 0,332 0,331 0,331 0,331 0,330 0,330

OT yang diperoleh adalah 30 menit b. Penentuan OT fraksi etil asetat rep 2 Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

350 µg/ml 0,668 0,616 0,599 0,589 0,582 0,575 0,571 0,568 0,566 0,564 0,562 0,561

OT yang diperoleh adalah 30 menit

c. Penentuan OT fraksi etil asetat rep 3

76


Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

350 µg/ml 0,622 0,579 0,562 0,551 0,541 0,534 0,528 0,524 0,517 0,514 0,512 0,509

Absorbansi 400 µg/ml 0,535 0,499 0,487 0,482 0,477 0,472 0,471 0,472 0,473 0,471 0,471 0,471

OT yang didapat adalah 30 menit Dari ke-3 replikasi didapatkan OT fraksi etil asetat adalah 30 menit.

450 µg/ml 0,524 0,416 0,388 0,368 0,353 0,340 0,339 0,339 0,338 0,337 0,337 0,336

77


Lampiran 8. Panjang Gelombang Maksimum DPPH a. DPPH 0,02 mM

78


b. DPPH 0,04 mM

79


c. DPPH 0,08 mM

80


Lampiran 9. Scanning Penentuan Aktivitas Antioksidan a. Scanning rutin

81


b. Scanning fraksi etil asetat ekstrak etanolik selada air

82


c. Scanning metanol

83


84

Lampiran 10. Perhitungan Nilai % IC Dari Rutin Replikasi 1 Konsentra Absorbans si Rutin i ( µg/ml)

Replikasi 2 Konsentra Absorbans si Rutin i (µg/ml)

Replikasi 3 Konsentra Abosrbans si Rutin i ( µg/ml)

14,4 0,552 16,9 0,504 19,4 0,456 21,9 0,409 24,4 0,360 Persamaan regresi linier A = 0,8279 B = -0,01916 r = 0,999984 y = -0,01916x +0,8279 Absorbansi kontrol : 0,829

15 0.548 15 0,536 17,5 0.505 17,5 0,501 20 0.460 20 0,466 22,5 0.420 22,5 0,436 25 0.384 25 0,399 Persamaan regresi linier Persamaan regresi linier A = 0,7938 A = 0,7388 B = -0,01652 B = -0,01356 r = 0,9991 r = 0,99960 y = -0,01652x +0,7938 y = -0,01356x +0,7388 Absorbansi kontrol :

Absorbansi kontrol :

0,830

0,830

% IC = (Absorbansi DPPH- Absorbansi sampel)/Absorbansi DPPH x 100% Perhitungan IC rutin rep 1 Persamaan regresi linier y = 2,2874x +0,4742 konsentrasi 14,4 µg/ml % IC = ( 0,829 – 0,552)/0,829

x 100%

= 33,413 % konsentrasi 16,9 µg/ml % IC = ( 0,829 – 0,504)/0,829 = 39,203 % konsentrasi 19,4 µg/ml

x 100%


% IC = (0,829 – 0,456)/0,829

x 100%

= 44,993 % konsentrasi 21,9 µg/ml % IC = (0,829 – 0,409)/0,829

x 100%

= 50,663 % konsentrasi 24,4 µg/ml % IC = (0,829 – 0,360)/0,829 = 56,574 %

x 100%

85


86

Lampiran 11. Perhitungan % IC Fraksi Etil Asetat Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi Konsentrasi Absorbansi fraksi etil fraksi etil fraksi etil asetat asetat asetat ( µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) 344,75 0,551 369,75 0,511 394,75 0,476 419,75 0,437 444,75 0,376 Persamaan regresi linier A = 1,1396 B = 0,001696 r = 0,9937 y = 0,001696x +1,1369

350 0,554 375 0,513 400 0,469 425 0,435 450 0,391 Persamaan regresi linier A = 0,9236 B = 0,001128 r = 0,9993 y = 0,001128x +0,9236

350 0,553 375 0,517 400 0,481 425 0,432 450 0,392 Persamaan regresi linier A = 1,1262 B = 0,001628 r = 0,9982 y = 0,001628x + 1,1262

% IC = (Absorbansi DPPH- Absorbansi sampel)/Absorbansi DPPH x 100% Perhitungan IC fraksi etil asetat Persamaan regresi linier y = 0,1949x – 34,9576 konsentrasi 350 µg/ml % IC = (0,829 – 0,554)/0,829 x 100% = 33,172 % konsentrasi 375 µg/ml % IC = (0,829 –0,513)/0,829

x 100%

= 38,118 % konsentrasi 400 µg/ml % IC = (0,829 –0,469)/0,829

x 100%


= 43,425 % konsentrasi 425 µg/ml % IC = (0,829 – 0,435)/0,829 x 100% = 47,527 % konsentrasi 450 µg/ml % IC = (0,829 – 0,391) /0,829 x 100% = 52,834 %

87


88

Lampiran 12. Perhitungan Nilai IC50 Rutin Aktivitas antioksidan rutin Replikasi

1

2

3

Konsentrasi rutin ( µg/ml) 14,4 16,9 19,4 21,9 24,4 15 17,5 20 22,5 25 15 17,5 20 22,5 25

Absorbansi

0,552 0,504 0,456 0,409 0,360 0,548 0,505 0,460 0,420 0,384 0,536 0,501 0,466 0,436 0,399

Aktivitas antioksidan ( % IC) 33,413 39,203 44,993 50,066 56,574 33,975 39,156 44,578 49,397 53,734 35,421 39,638 43,855 47,469 51,927

Persamaan regresi linier A = 0,4742 B = 2,2874 r = 0,9994 y = 2.2874x -0.4742 A = 4,3608 B = 1,9903 r = 0,9991 y = 1,9903x+ 4,3608 A = 10,9876 B = 1,6337 r = 0,.9996 y = 1,6337x+ 10,9876

Pada replikasi 1 didapatkan persamaan regresi linier y

= 2,2874x + 0,4742

50

= 2,2874x + 0,4742

49,5258 = 2,2874x x

= 21,651, sehingga didapatkan IC 50 sebesar 21,651 µg/ml


= 1,9903x + 4,3608

50

= 1,9903x + 4,3608

45,6392 = 1,9903x x

= 22,930, sehingga didapatkan IC50 sebesar 22,930 µg/ml

Pada replikasi 3 didapatkan persamaan regresi linier


y

= 1,6337x + 10,9876

50

= 1,6337x + 10,9876

89

39,0124 = 1,6337x x

= 23,449, sehingga didapatkan nilai IC50 sebesar 23,879 µg/ml

Dari perhitungan ketiga IC50 rutin didapatkan rata-rata sebesar 22,820 µg/ml


90

Lampiran 13. Perhitungan Nilai IC50 Fraksi Etil Asetat Replikasi

1

2

3

Konsentrasi Fraksi etil Asetat (µg/ml)

Absorbansi

Aktivitas antioksidan (% IC)

344,75 369,75 394,75 419,75 444,75 350 375 400 425 450 350 375 400 425 450

0,551 0,511 0,476 0,437 0,376 0,554 0,513 0,469 0,435 0,391 0,553 0,517 0,481 0,432 0,392

33,614 38,433 42,650 47,349 54,698 33,172 38,118 43,425 47,527 52,834 33,453 37,785 42,117 48,014 52,827


A = - 37,312 B = 0,2043 r = 0,9937 y = 0,2043x- 37,312 A = - 34,9576 B = 0,1949 r = 0,9993 y = 0,1949x – 34,9576 A = - 35,524 B = 0,1959 r = 0,9982 y = 0,1959x- 35,524


= 0,2043x – 37,312

50

= 0,2043x – 37,312

87,312

= 0,2043x

x


Pada replikasi 2 didapatkan persmaan regresi linier y

= 0,1949x – 34,9576

50

= 0,1949x -34,9576

84,9576

= 0,1949x

x



= 0,1959x – 35,524


91

50

= 0,1949x – 35,524

85,524

= 0,1949x

x


Dari ketiga nilai IC50 yang didapatkan nilai rata-rata sebesar 434,402 µg/ml


92

Lampiran 14. Penimbangan Untuk Uji Kandungan Fenolik Total 1. Penimbangan asam galat Replikasi 1 (g) Berat kertas 0,3156 Berat kertas + 0,3258 asam galat Berat kertas + 0,3158 sisa Berat asam 0,0100 galat 2. Penimbangan fraksi etil asetat Replikasi 1 (g) Berat cawan 48,658 Berat cawan + 48,66310 fraksi Berat fraksi 0,0050

Replikasi 2 (g) 0,3345 0,3447

Replikasi 3 (g) 0,3479 0,3581

0,3349

0,3481

0,0098

0,0100

Replikasi 2 (g) 49,987 49,992

Replikasi 3 (g) 58,654 58,659

0,0050

0,0051


Lampiran 15. Optimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total a. Operating Time rep 1 Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40

50 µg/ml 0,302 0,316 0,326 0,331 0,335 0,335 0,336 0,337

Absorbansi 100 µg/ml 0,443 0,463 0,476 0,484 0,492 0,496 0,499 0,502

150 µg/ml 0,687 0,724 0,750 0,767 0,777 0,786 0,791 0,796

Operating time yang didapat adalah 30 menit b. Operating Time rep 2 Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40

50 µg/ml 0,261 0,282 0,295 0,305 0,312 0,317 0,321 0,324

Absorbansi 100 µg/ml 0,461 0,487 0,502 0,512 0,520 0,526 0,530 0,533

150 µg/ml 0,674 0,712 0,737 0,754 0,766 0,775 0,781 0,785

Operating time yang didapat adalah 30 menit c. Operating Time rep 3 Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40

50 µg/ml 0,284 0,300 0,307 0,313 0,319 0,322 0,324 0,326

Absorbansi 100 µg/ml 0,470 0,497 0,512 0,523 0,531 0,537 0,541 0,545

150 µg/ml 0,693 0,731 0,756 0,772 0,786 0,797 0,807 0,814

93


Lampiran 16. Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat a. Asam galat 50 µg/ml

94


b. Asam galat 100 µg/ml

95


c. Asam Galat 150 µg/ml

96


Lampiran 17. Scanning Penentuan Kandungan Fenolik Total a.Scanning metanol : air (1:1)

97


b.Scanning asam galat

98


c. Scanning fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air

99


100

Lampiran 18 . Penentuan Kandungan Senyawa Fenolik Total Persamaan regresi linier yang digunakan y = 4,644.10-3x +0,1038 Sampel 1 Berat sampel = 5,0 mg Absorbansi = 0,401 0,401 = 4,644.10-3x +0,1038 0,2972 = 4,644.10-3x X = 63,996 µg/ml Kandungan fenolik total X.( v /m) = 0,0639. (0,5 ml/0,0050 g) = 6,390 mg ekivalen asam galat per gram fraksi Sampel 2 Berat sampel = 5,0 mg Absorbansi = 0,407 0,407 = 4,644.10-3x +0.1038 0,3032 = 4,644.10-3x X = 65,288 µg/ml Kandungan fenolik total X. (v/m) = 0,0652.(0,5 ml/0,0050g) = 6,520 mg ekivalen asam galat per gram fraksi Sampel 3 Berat sampel = 5,1 mg Absorbansi = 0,411 0,411 = 4,644.10-3x +0,1038 0,3072 = 4,644.10-3x


101

X = 66,149 µg/ml Kandungan fenolik total X.(v/m) = 0,0661.(0,5 ml/0,0051 g) = 6,480 mg ekivalen asam galat per gram fraksi


Lampiran 19. Uji Statistika Dengan Program R a. Uji normalitas data

b.Uji T tidak berpasangan

102


103

BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi berjudul “ Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Herba Selada Air (Nasturtium officinale R. Br) Dengan Menggunakan Metode DPPH” memiliki nama lengkap Jap Yulius Billy Soegianto ini merupakan anak dari pasangan Soegianto Karsono dan M.I Lily Budihardja dilahirkan di Semarang pada tanggal 27 Juli 1991. Pendidikan formal yang penulis jalani adalah di TK SD Kristen Debora Banjarnegara, pendidikan Sekolah Dasar di SD Kristen Debora Banjarnegara, pendidikan Sekolah Menengah Pertama di SMP N 1 Banjarnegara dan pendidikan Sekolah Menengah Atas SMA Santo Mikael Yogyakarta dan pada tahun 2009 penulis melanjutkan pendidikan Perguruan Tinggi di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakrta. Selama

mengikuti kuliah di fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma

pernah

mengikuti volunteer dalam pelaksanaan Kampanye Informasi Obat pada bulan November 2012.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents