PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, ANTIBAKTERI, DAN UV PROTECTION EKSTRAK RIMPANG KUNYIT (Curcuma longa L.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh: Elyn Prameswari NIM: 118114110

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015


ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, ANTIBAKTERI, DAN UV PROTECTION EKSTRAK RIMPANG KUNYIT (Curcuma longa L.)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh: Elyn Prameswari NIM: 118114110

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

i


Persetujuan Pembimbing

ii


HALAMAN PENGESAHAN

iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

Aku percaya pada keberuntungan dan aku menyadari semakin aku bekerja keras semakin banyak keberuntungan yang aku miliki -Thomas Jefferson-

Kupersembahkan Skripsi ini untuk : Tuhan Yesus, sang Penyelamat yang selalu membimbingku Kedua orang tuaku Kedua kakakku Almamaterku

iv


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

v


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

vi


PRAKATA Puji syukur dan terima kasih kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala anugerah dan berkat – Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi berjudul “Isolasi dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection Ekstrak Rimpang Kunyit (Curcuma longa L.)”. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis mengalami banyak kesulitan dan masalah dalam menyelesaikan skripsi ini. Tetapi dengan adanya bantuan, dukungan, bimbingan, kritik, dan saran dari berbagai pihak, akhirnya penulis mampu menghadapi segala kesulitan dan masalah yang menghadang. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada: 1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Dr. rer. nat. Yosi Bayu Murti, Apt. selaku dosen pembimbing dan dosen penguji atas kesabaran, bimbingan, arahan, masukan, perhatian, semangat dan waktu yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. 3. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan waktu, kritik, dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini. 4. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku dosen penguji yang telah memberikan waktu, kritik, dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini. 5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang selalu mendukung, membantu, dan memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian skripsi ini. 6. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku DPA yang telah mendukung selama proses perkuliahan sampai proses pembuatan skripsi ini. 7. Papa, Mama, dan kakak Getty Rajasa atas kasih sayang dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis, baik secara moral maupun materil. 8. Vega Citrawati dan Leonardo Yoppy Eka Noviyanto selaku kakak dan sahabat atas kasih sayang, dukungan, kritik, saran, canda tawa, dan semangat yang diberikan kepada penulis. 9. Segenap Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 10. Segenap Laboran Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.

vii


11. Tim skripsi dan sahabat penulis (Setio Agustin, Agustine Kurniawaty, Surya Adhi Nugraha, Skolastika Feranda) atas kerjasama yang telah dilewati bersama selama penelitian ini. 12. Veve, Shiro, kak Reny, Marshella, dan Ratna selaku teman dan pemberi semangat bagi penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. 13. Teman – teman laskar intan: Nella, Iga, Yunika, Natry, mbak Wahyu, dan Deivi atas semangat, dukungan, kegilaan, canda tawa, kritik, dan sarannya. 14. Teman – teman Fakultas Farmasi angkatan 2011 atas kerjasama, canda tawa, dan memberi semangat. 15. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu atas bantuannya dalam pengadaan bahan baku simplisia rimpang kunyit. 16. Semua pihak yang telah memberikan dukungan dan bantuan yang tidak dapat disebutkan satu – persatu. Penulis menyadari bahwa dalam penyelesaian skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis memohon maaf apabila terdapat hal – hal yang kurang berkenan, tidak lupa penulis juga mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Akhir kata penulis berharap tugas akhir ini dapat bermanfaat untuk berbagai pihak yang membutuhkan dan menjadi sumbangan bagi ilmu pengetahuan.

Penulis Elyn Prameswari

viii


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL................................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................................v LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI KARYA .............................................. vi PRAKATA........... ................................................................................................. vii DAFTAR ISI...........................................................................................................ix DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiv INTISARI............. ..................................................................................................xv ABSTRACT ...........................................................................................................xvi BAB I PENGANTAR ..............................................................................................1 A. Latar Belakang .............................................................................................1 1. 2. 3.

Permasalahan .........................................................................................2 Keaslian penelitian ................................................................................3 Manfaat penelitian .................................................................................5

B. Tujuan Penelitian..........................................................................................5 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................7 A. Kunyit ...........................................................................................................7 1. 2. 3. 4.

Klasifikasi tanaman ...............................................................................7 Deskripsi tanaman .................................................................................8 Kandungan kimia kunyit .......................................................................8 Khasiat dan kegunaan kunyit ................................................................9

B. Ekstraksi .....................................................................................................10 1. 2.

Maserasi ..............................................................................................10 Triturasi ...............................................................................................11

C. Kromatografi ..............................................................................................12 1. 2.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT).........................................................12 Kromatografi kolom ............................................................................14

D. Antioksidan ................................................................................................15 1. 2. 3.

Reactive Oxygen Species (ROS) .........................................................15 Senyawa dan golongan senyawa antioksidan......................................16 Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ..................................18 ix


E. Antibakteri ..................................................................................................19 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Bakteri .................................................................................................19 Mekanisme antibakteri ........................................................................20 Resistensi bakteri.................................................................................20 Golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri .....................21 Uji kualitatif antibakteri dengan metode bioautografi kontak ............21 Uji daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer ............................23

F. UV Protection ............................................................................................24 1. 2. 3.

Radiasi ultraviolet pada kulit...............................................................24 Tabir surya...........................................................................................24 Uji aktivitas tabir surya dengan metode inhibition of bleaching of -carotene .......................................................................................25

G. Landasan Teori ...........................................................................................26 H. Hipotesis .....................................................................................................27 BAB III METODE PENELITIAN.........................................................................28 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................................28 B. Definisi Operasional ...................................................................................28 C. Bahan dan Alat Penelitian ..........................................................................28 1. 2.

Bahan penelitian ..................................................................................28 Alat penelitian .....................................................................................29

D. Tatacara Penelitian .....................................................................................29 1. 2. 3. 4.

Pengumpulan dan penyiapan bahan ....................................................29 Ekstraksi ..............................................................................................30 Optimasi fase gerak pada ekstrak kental rimpang kunyit ...................31 Identifikasi golongan senyawa pada ekstrak kental rimpang kunyit ...................................................................................................32 5. Uji kualitatif penangkap radikal bebas ekstrak rimpang kunyit ..........32 6. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak rimpang kunyit..................33 7. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak rimpang kunyit ...........36 8. Isolasi senyawa yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection .................................................37 9. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection pada isolat ..........................................................................42 10. Uji daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer ............................43 11. Identifikasi golongan senyawa pada isolat ..........................................44 12. Bagan alur penelitian ...........................................................................45

x


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................46 A. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan ..........................................................46 1. 2. 3.

Pengumpulan bahan ............................................................................46 Susut pengeringan simplisia ................................................................47 Penyiapan bahan ..................................................................................48

B. Ekstrak Kental Rimpang Kunyit ................................................................49 1. 2.

Ekstraksi ..............................................................................................49 Susut pengeringan ekstrak ...................................................................51

C. Optimasi Fase Gerak Ekstrak Kental Rimpang Kunyit .............................51 D. Identifikasi Golongan Senyawa dengan Reagen Semprot pada Ekstrak Kental Rimpang Kunyit ................................................................54 E. Uji Aktivitas Penangkap Radikal Bebas DPPH, Antibakteri, dan UV Protection pada Ekstrak Kental Rimpang Kunyit ......................................58 1. 2. 3.

Uji aktivitas penangkap radikal bebas .................................................58 Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak .............60 Uji aktivitas UV protection dengan metode inhibition of bleaching of - carotene .....................................................................67

F. Isolasi Senyawa yang Memiliki Aktivitas Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection .................................................................72 G. Aktivitas Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection pada Isolat ..................................................................................................76 1. 2. 3.

Aktivitas penangkap radikal bebas DPPH pada isolat ........................76 Aktivitas antibakteri pada isolat ..........................................................77 Aktivitas UV protection pada isolat ....................................................81

H. Identifikasi Isolat Aktif.................................................................................83 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................85 A. Kesimpulan.................................................................................................85 B. Saran ...........................................................................................................85 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................86 LAMPIRAN.......... .................................................................................................91 BIOGRAFI PENULIS .........................................................................................115

xi


DAFTAR TABEL Tabel I. Tabel II. Tabel III. Tabel IV. Tabel V. Tabel VI. Tabel VII.

Hasil identifikasi golongan senyawa pada ekstrak kental rimpang kunyit................................................................................55 Kisaran nilai Rf ekstrak kunyit dengan metode bioautografi kontak .............................................................................................62 Hasil uji aktivitas UV protection ekstrak rimpang kunyit..............71 Profil KLT isolasi senyawa dengan fase gerak kloroform .............74 Hasil aktivitas UV protection pada isolat .......................................81 Identifikasi golongan senyawa pada isolat .....................................83 Aktivitas Isolat................................................................................83

xii


DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4. Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7. Gambar 8. Gambar 9. Gambar 10. Gambar 11. Gambar 12. Gambar 13. Gambar 14. Gambar 15. Gambar 16. Gambar 17. Gambar 18. Gambar 19. Gambar 20. Gambar 21. Gambar 22.

Molekul DPPH (radikal).................................................................18 Struktur -carotene ........................................................................25 Hasil optimasi fase gerak pada deteksi UV 254 nm .......................52 Hasil optimasi fase gerak pada deteksi UV 254 nm .......................53 Ekstrak rimpang kunyit pada deteksi secara fisik ..........................54 Ekstrak rimpang kunyit dengan reagen semprot ............................55 Perbandingan nilai Rf antara standar kurkumin dan ekstrak rimpang kunyit................................................................................58 Hasil uji kualitatif penangkap radikal bebas DPPH .......................59 Hasil uji antibakteri dengan bioautografi kontak ...........................62 Kontrol media .................................................................................65 Hasil kontrol pertumbuhan bakteri .................................................66 Hasil kontrol positif amoksisilin ....................................................66 Kurva optimasi intensitas cahaya ...................................................69 Perbandingan profil KLT ekstrak rimpang kunyit dan hasil triturasi ............................................................................................72 Perbandingan profil KLT pada UV 254 nm ...................................73 Perbandingan profil KLT pada UV 366 nm ...................................73 Alur isolasi senyawa aktif ekstrak rimpang kunyit ........................75 Hasil uji kualitatif penangkap radikal bebas pada isolat setelah 2 jam penyemprotan ...........................................................76 Hasil uji antibakteri ........................................................................78 Kontrol media .................................................................................79 Kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus..........................................80 Kontrol positif amoksisilin .............................................................80

xiii


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9.

Surat determinasi rimpang kunyit ..................................................91 Sertifikat hasil uji bakteri E. coli dan S. aureus .............................93 Foto simplisia kering rimpang kunyit.............................................95 Perhitungan susut pengeringan simplisia rimpang kunyit ..............96 Perhitungan rendemen ekstrak rimpang kunyit ..............................98 Susut pengeringan ekstrak ..............................................................99 Optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis ................................101 Isolasi senyawa .............................................................................103 Identifikasi golongan senyawa dengan reagen semprot pada isolat .............................................................................................107 Lampiran 10. Uji kualitatif penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri .....................................................................................109

xiv


INTISARI Perawatan kecantikan menggunakan lulur secara tradisional telah digunakan sejak zaman nenek moyang dengan komponen utama rimpang kunyit (Curcuma longa L.). Beberapa penelitian pada rimpang kunyit sering menyebutkan kandungan pada kunyit adalah kurkuminoid yang memiliki aktivitas terapetik yang luas, sehingga penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui golongan senyawa selain kurkuminoid yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection pada ekstrak rimpang kunyit. Rimpang kunyit diekstraksi dengan pelarut etanol 90% v/v. Uji pendahuluan dilakukan secara kualitatif dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Uji aktivitas sebagai penangkap radikal bebas dilakukan dengan metode DPPH, antibakteri dengan metode bioautografi kontak, dan UV protection dengan metode inhibition of bleaching of -carotene. Senyawa aktif hasil uji kualitatif tersebut diisolasi dengan kromatografi kolom. Isolat yang diperoleh tersebut kemudian kembali diuji aktivitas penangkap radikal bebas dilakukan dengan metode DPPH, antibakteri dengan metode Kirby – Bauer, dan UV protection dengan metode inhibition of bleaching of -carotene. Hasil penelitian menunjukkan adanya senyawa yang memiliki aktvitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. Isolat pertama yang diperoleh memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection, sedangkan isolat kedua yang diperoleh memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. Kedua isolat tersebut berdasarkan hasil identifikasi merupakan golongan senyawa terpenoid. Kata kunci :ekstrak rimpang kunyit, bercak aktif, isolasi, identifikasi golongan senyawa.

xv


ABSTRACT Main component of lulur is turmeric rhizome (Curcuma longa L.). The major compounds in turmeric are curcuminoids which have been researched and it had large therapeutic activity. This research aimed to find out the other substances of turmeric extract besides curcuminoids which has activity as free radical scavenger, antibacterial, and UV protection. Turmeric was extracted with ethanol 90% v/v. Preliminary test completed qualitatively by Thin Layer Chromatography (TLC) method. Activity test as a free radical scavenger has been done by applying DPPH method, antibacterial activity with bioautography assay, and UV protection with inhibition of bleaching of carotene assay. The active substances isolated with column chromatography. Isolates were tested again as free radical scavenger with DPPH method, antibacterial activity with Kirby – Bauer method, and UV protection with inhibition of bleaching of -carotene assay. The result found active isolates with free radical scavenger activity, antibacterial, and UV protection. The first isolate has free radical scavenger and UV protection, whereas the second isolate has free radical scavenger, antibacterial, and UV protection. Both isolates identified as terpenoid. Keywords : turmeric extract, active zone, isolation, identification of active substance.

xvi


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Perawatan

kecantikan

secara

tradisional

merupakan

salah

satu

manifestasi kebudayaan yang diturunkan secara turun menurun dan telah menjadi satu bentuk seni kecantikan. Perawatan kulit merupakan bagian dari perawatan kecantikan yang telah dikenal sejak jaman dahulu kala dan telah menjadi bagian dari kebudayaan masyarakat. Oleh karena itu, trend yang popular saat ini adalah back to nature yaitu dengan menggunakan tumbuh – tumbuhan atau herbal sebagai bahan utama dalam perawatan kecantikan. Hal ini disebabkan karena bahan – bahan alami tersebut lebih dapat diterima oleh tubuh dibandingkan bahan sintetik (Tarigan, Zuhra, dan Sihotang, 2008). Salah satu perawatan tubuh yang sering dilakukan adalah dengan luluran. Lulur telah dikenal sejak nenek moyang terutama oleh keluarga keraton sebagai perawatan kecantikan kulit secara tradisional. Hal ini dilakukan karena ingin memiliki kulit yang halus dan mulus agar tetap terjaga kebersihan dan kesehatannya, lulur cocok digunakan untuk perawatan kulit tubuh bagi yang tinggal di daerah tropis karena berudara panas, yang menyebabkan kulit tubuh dengan mudah terkena sengatan matahari dan kotoran keringat. Bahan utama lulur yang digunakan oleh nenek moyang adalah dengan memanfaatkan rimpang kunyit yang dibuat dengan cara sederhana.

1


2

Kunyit yang telah dihaluskan menjadi bubuk akan menghasilkan minyak yang mengandung antioksidan, sehingga lulur dapat menghaluskan kulit dan membuat kulit lebih cerah. Kunyit juga bersifat mendinginkan, membersihkan, menghilangkan bau yang tidak sedap, dan bersifat antibakteri. Oleh karena itu sering digunakan sebagai kosmetik tradisional untuk perawatan kesehatan kulit wajah dan tubuh. Ekstrak etanolik rimpang kunyit (Curcuma longa L.) memiliki kandungan kurkumin dan flavonoid yang merupakan golongan senyawa fenolik, dan terpenoid (Chhetri, Yogol, Sherchan, Anupa, Mansoor, dan Thapa, 2008). Saat ini, kunyit juga digunakan dalam formulasi sebagai tabir surya (Ganpati, Bhaurao, Iranna, Dilip, dan Nilkanth, 2011). Oleh sebab itu, pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection pada kunyit. Penelitian ini diawali dengan pembuatan ekstrak rimpang kunyit kemudian dilakukan uji kualitatif dengan menggunakan lempeng KLT untuk mengetahui zona bercak yang memiliki aktivitas untuk selanjutnya diisolasi dengan kromatografi kolom dan dilanjutkan dengan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection secara kualitatif pada isolat yang didapatkan. 1.

Permasalahan Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, permasalahan yang

ditimbulkan adalah: a.

Apakah ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection?


b.

3

Golongan senyawa apa yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection selain kurkuminoid yang terkandung pada ekstrak rimpang kunyit?

2. Keaslian penelitian Sejauh pengamatan penulis, penelitian berjudul “Isolasi dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection

Ekstrak Rimpang Kunyit (Curcuma longa L.)” belum pernah

dilakukan. Penelitian mengenai rimpang kunyit yang terkait aktivitas antibakteri pernah dilakukan oleh Naz, Jabeen, Ilyas, Manzoor, Azlam, dan Ali (2010) yang menguji tentang aktivitas antibakteri pada kurkuminoid dan minyak atsiri dari rimpang kunyit terhadap bakteri Bacillus subtilis, Bacillus macerans, Bacillus licheniformis dan Azotobacter dengan menggunakan metode difusi sumuran. Pada penelitian ini, kurkuminoid diperoleh dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut etanol, sedangkan minyak atsiri diekstraksi dengan cara hidrodistilasi yang kemudian didilusi dengan menggunakan metanol. Penelitian lain terkait dengan aktivitas antibakteri juga pernah dilakukan oleh Helen, Prinitha, Sree, Abisha, dan Jacob (2012) yang menguji minyak atsiri, ekstrak metanol, ekstrak aseton, dan ekstrak n-heksan rimpang kunyit terhadap bakteri Gram positif, Gram negatif, serta fungi dengan metode Kirby – Bauer. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa berbagai macam ekstrak rimpang kunyit tersebut memiliki daya antibakteri. Aktivitas antioksidan rimpang kunyit pernah dilakukan oleh Choi (2009) dengan menggunakan ekstrak metanolik rimpang kunyit yang diuji secara in vitro


4

menggunakan metode DPPH, ABTS, dan FRAP menunjukkan bahwa ekstrak metanolik rimpang kunyit dapat digunakan sebagai sumber antioksidan. Penelitian terkait juga dilakukan oleh Nahak dan Sahu (2011) tentang evaluasi aktivitas antioksidan pada ekstrak etanolik dari lima spesies kurkuma dan kandungan fenolik total dengan menggunakan metode DPPH. Revathy, Elumalai, Benny, dan Antony (2011) melakukan penelitian mengenai isolasi, pemurnian, dan identifikasi kurkuminoid dari rimpang kunyit dengan kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi pada penelitian ini adalah n-heksan, kloroform, etil asetat, metanol, dan aseton yang selanjutnya pemisahan kurkuminoid diuji dengan KLT menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95:5 v/v). Pemisahan terbaik ditunjukkan oleh ekstrak aseton yang selanjutnya masing – masing kurkuminoid tersebut diisolasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan dilakukan pemurnian menggunakan HPLC. Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian – penelitian sebelumnya adalah simplisia kering rimpang kunyit diperoleh dari B2P2TOOT. Ekstraksi dilakukan dengan pelarut etanol 90% v/v yang kemudian dilakukan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection secara kualitatif dengan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui zona bercak yang memiliki aktivitas tersebut, yang selanjutnya diisolasi dengan kromatografi kolom. Hasil isolasi yang diperoleh tersebut kemudian dilakukan uji aktivitas kembali dengan metode DPPH semprot untuk uji penangkap radikal bebas, metode Kirby - Bauer untuk uji antibakteri¸ dan menggunakan metode inhibition of bleaching of

–


5

carotene untuk uji UV protection. Selain itu, pada penelitian ini tidak berfokus pada kurkuminoid seperti pada penelitian – penelitian sebelumnya melainkan pada senyawa lain yang terdapat pada rimpang kunyit yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. 3.

Manfaat penelitian Hasil penelitian ini diharapkan memiliki manfaat sebagai berikut: a.

Manfaat teoritis : Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection ekstrak rimpang kunyit dan golongan senyawa yang memiliki aktivitas tersebut.

b.

Manfaat praktis : Penelitian ini diharapkan mampu membuktikan khasiat rimpang kunyit terhadap penggunaannya sebagai kosmetik tradisional sehingga tidak hanya dimanfaaatkan pada lulur, tapi juga pada sediaan kosmetik tradisional yang lain. B. Tujuan Penelitian

1.

Tujuan umum Membuktikan bahwa ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas sebagai

penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. 2.

Tujuan khusus a.

Mengetahui ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection.


b.

6

Mengetahui golongan senyawa selain kurkuminoid yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection pada ekstrak rimpang kunyit.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Kunyit 1.

Klasifikasi tanaman Tanaman kunyit menurut United States Department of Agriculture

(USDA) diklasifikasikan sebagai berikut: Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Division

: Magnoliophyta

Class

: Liliopsida

Subclass

: Zingiberidae

Order

: Zingiberales

Family

: Zingiberaceae

Genus

: Curcuma

Species

: Curcuma longa L.

Nama lain dari C. longa menurut United States Department of Agriculture (USDA) adalah Curcuma domestica Valeton. Kunyit (C. longa) di berbagai daerah di Indonesia dikenal dengan nama kunir (Jawa), Hunik (Batak), kunyir (Lampung), temu kuning, kunir (Jawa), koneng (Sunda), konyet atau temu koneng (Madura), kunidi (Sulawesi Utara), kuminu (Ambon), rame (Irian) (Pangkalan Ide, 2011).

7


2.

8

Deskripsi tanaman Kunyit adalah tanaman tema tahunan. Kunyit merupakan tumbuhan

daerah subtropis sampai tropis dan tumbuh subur di dataran rendah lebih kurang 90 meter sampai ketinggian 2000 meter di atas permukaan laut. Kunyit memiliki batang pohon semu dan basah. Daunnya mirip dengan tumbuh – tumbuhan jenis pisang – pisangan. Pelepah – pelepah daun kunyit yang dominan berwarna hijau membentuk batang dengan helaian daun berbentuk bulat telur. Rimpangnya memiliki banyak cabang dengan kulit luarnya berwarna jingga kecoklatan. Buah daging rimpang kunyit berwarna merah jingga kekuning – kuningan. Tinggi tumbuhan kunyit mampu mencapai 1 meter dan bunganya muncul dari pucuk batang semu dengan panjang sekitar 10 – 15 cm dan berwarna putih (Thomas, 1989). 3.

Kandungan kimia kunyit Kunyit mengandung protein (6,3%), lemak (5,1%), mineral (3,5%),

karbohidrat (69,4%), dan air (23,1%). Minyak atsiri (5 – 8%) yang diperoleh dengan cara destilasi uap mengandung α – phellanderene (1%), sabiene (0,6%), cineol (1%), borneol (0,5%), zingiberene (25%), dan seskuiterpenes (53%). Kandungan kurkuminoid pada kunyit yaitu kurkumin (77%), desmetoksikurkumin (18%), dan bis – desmetoksikurkumin (5%). Kurkumin inilah yang memberi warna kuning pada kunyit dan diduga memiliki aktifitas terapetik terbesar pada kunyit. Kurkumin bersifat hidrofobik dan mudah larut dalam dismethylsulfoxide, aseton, etanol, dan minyak. Selain itu, kurkumin memiliki nilai absorbansi maksimum pada 425 nm. Warna kunyit/ kurkumin dapat berubah dari kuning


9

menjadi merah gelap apabila berada pada kondisi yang asam (Rathaur, Raja, Ramteke, dan John, 2012). 4.

Khasiat dan kegunaan kunyit Kunyit telah digunakan di India selama lebih dari 6000 tahun sebagai

obat, kosmetik, bumbu masak, pewarna, dan sebagainya (Rathaur, et al., 2012). Di Indonesia, rimpang kunyit digunakan sebagai bumbu masak, sementara di Eropa kunyit dipergunakan sebagai bahan baku kosmetika atau perwarna makanan (Thomas, 1989). Selain itu, pengobatan tradisional Cina juga telah menggunakan kunyit selama lebih dari 1000 tahun terutama untuk mengobati limpa, liver, dan sakit perut. Kunyit juga digunakan untuk menstimulasi dan menurunkan tekanan darah, mengurangi rasa sakit pada bagian abdominal, antibiotik, anti virus dan analgesik (Rathaur, et al., 2012). Kunyit juga dapat memiliki kemampuan sebagai bahan pengawet makanan melalui mekanisme antioksidannya. Tidak hanya digunakan sebagai bumbu dapur, kunyit juga dapat digunakan sebagai pengobatan tradisional untuk anoreksia, batuk, luka pada penderita diabetes, penyakit hepar, reumatik, sinusitis, dan lain – lain. Kunyit memiliki efek biologis yang luas, termasuk didalamnya yaitu sebagai anti – inflamasi, antioksidan, anti – karsinogenik, anti – mutagenik, anti – koagulan, anti – fertilitas, anti – diabetes, antibakteri, anti – fungal, anti – protozoa, anti fibrotik, anti – tukak lambung, dan hipokolesteremia (Rathaur, et al., 2012). Ekstrak rimpang kunyit menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan. Hasil studi ini menunjukkan bahwa kunyit memiliki kemampuan untuk


10

menangkap radikal bebas, mengurangi besi kompleks, dan menghambat peroksidasi (Tilak, Banerjee, Mohan, Devasagayam, 2004). B. Ekstraksi 1.

Maserasi Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair yang dibuat dengan

penyari simplisia menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya matahari langsung. Cairan penyari yang sering digunakan adalah air, eter, etanol, atau campuran etanol dan air (Deputi Bidang Pengawasan Obat Tradisional, Kosmetik, dan Produk Komplemen, 2010). Parameter – parameter dasar yang mempengaruhi kualitas sebuah ekstrak yaitu: bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal, cairan penyari yang digunakan untuk ekstraksi, dan prosedur ekstraksi. Bagian tanaman yang digunakan untuk ekstraksi dapat dari berbagai macam bagian tanaman seperti dahan, ranting, daun, bunga, akar, buah, biji, dan lain – lain (Tiwari, Kumar, Kaur, Kaur, dan Kaur, 2011). Cairan penyari yang digunakan untuk ekstraksi harus memenuhi kriteria murah, mudah diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, tidak toksik, netral, tidak mudah terbakar, selektif yang artinya dapat menarik zat berkhasiat yang dikehendaki (Depkes RI, 1986). Pemilihan prosedur ekstraksi didasarkan pada lamanya waktu ekstraksi, cairan penyari yang digunakan, pH cairan penyari, temperatur, ukuran partikel jaringan tanaman, dan perbandingan antara pelarut dan sampel (Tiwari, et al., 2011). Maserasi adalah salah satu bentuk ekstraksi yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dengan cairan penyari dalam suatu wadah selama


11

beberapa hari. Proses yang mendasari maserasi adalah cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel sehingga isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan tergantikan oleh cairan penyari yang konsentrasinya rendah. Peristiwa tersebut berulang hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Maserasi banyak digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari dan tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari (Depkes RI, 1986). 2.

Triturasi Triturasi merupakan salah satu bentuk teknik pemurnian suatu senyawa.

Pada umumnya pelarut yang bersifat non – polar seperti n – heksan, n – pentana, dietil eter, digunakan untuk menghilangkan senyawa – senyawa pengotor yang bersifat non – polar. Hal ini didasarkan pada prinsip “like dissolves like” yaitu senyawa yang bersifat non – polar pada umumnya akan larut pada senyawa non – polar dan tidak larut pada senyawa polar (Zala, Patel, Patel, Parmar, dan Sen, 2012). Pada kondisi tertentu untuk dapat memperoleh larutan senyawa yang diinginkan tidak hanya dapat diperoleh dengan pelarut tunggal saja, akan tetapi membutuhkan campuran pelarut. Hal tersebut dimungkinkan karena kelarutan senyawa tersebut lebih baik ketika dilarutkan dengan kombinasi pelarut dibandingkan hanya dengan pelarut tunggal (Tan, Reed, Gahm, King, Seran, Bostick, et al., 2008). Apabila menggunakan campuran dua macam pelarut, syarat


12

utamanya adalah kedua campuran pelarut tersebut harus mampu bercampur secara homogen (Zala, et al., 2012). C. Kromatografi 1.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan cara sederhana pada

identifikasi pendahuluan suatu senyawa. Metode ini juga bermanfaat pada pemisahan suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusi dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Data yang diperoleh dari metode ini berupa harga Retardation factor (Rf) dan warna bercak kromatogram yang diperoleh dari pengembangan bercak pada plat kromatografi lapis tipis (Rohyami, 2008). Nilai Rf digunakan untuk menunjukkan posisi hasil pemisahan suatu senyawa secara spesifik, yang dihitung dengan cara: Rf (retardation factor) = (Sherma dan Fried, 2003). Kromatografi lapis tipis merupakan teknik kromatografi yang paling sering digunakan untuk uji kualitatif senyawa – senyawa organik, isolasi senyawa tunggal dari senyawa campuran, uji kuantitatif, dan sebagai isolasi preparatif. Pada beberapa kasus tertentu, terkadang kromatografi lapis tipis digabungkan dengan teknik kromatografi lainnya. Tersedia berbagai macam fase diam yang dilapisi pada KLT maupun pada High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), yaitu: fase diam anorganik (silika atau silika gel dan alumina), fase diam organik (polyamide, selulosa), fase diam organik polar yang terikat secara kovalen dengan modifikasi pada matriks silika gel (diol, sianopropil, dan


13

aminopropil), dan fase diam organik bersifat nonpolar (RP2, RP8, RP18) yang memiliki kerapatan yang berbeda – beda. Selain itu, terdapat berbagai macam pilihan fase gerak yang dapat digunakan untuk memisahkan campuran senyawa yang bergantung pada selektivitas senyawa bedasarkan donor proton, penerima proton, dan gaya dipol. Penyerapan sinar UV pada KLT, fase gerak tidak memberikan pengaruh yang signifikan untuk deteksi senyawa dan untuk uji kuantitatif. Hal tersebut dikarenakan fase gerak pada KLT akan menguap terlebih dahulu sebelum dideteksi (Hajnos, Sherma, dan Kowalska, 2008). Kelebihan dari metode KLT ini adalah metode preparasi yang paling sederhana apabila dibandingkan dengan Gas Chromatography (GC) dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Selain itu, beberapa macam sampel dapat dianalisis pada satu – satuan waktu hanya dengan satu lempeng KLT atau lempeng HPTLC, sehingga dapat mempersingkat waktu dan juga meminimalisir volume pelarut yang digunakan untuk tiap sampel. Baik larutan standart maupun sampel juga dapat diletakkan pada satu lempeng yang sama sehingga dapat memberikan akurasi dan presisi pada uji kuantitatif dengan densitometer (Hajnos, et al., 2008). Pada teknik pemisahan dengan KLT, jumlah sampel yang dibutuhkan lebih sedikit, fleksibel dalam pemilihan deteksi sampel, memiliki jumlah kapasitas massa yang tinggi, mudah dilakukan, biaya yang dikeluarkan lebih murah, dan tidak membutuhkan fasilitas laboratorium yang modern (Sherma dan Fried, 2003). Kekurangan dari metode KLT ini adalah tidak dapat menggunakan pelarut yang memiliki viskositas yang tinggi (Hajnos, et al., 2008). Metode KLT


14

juga memiliki efisiensi pemisahan yang rendah dan reprodusibilitas nilai Rf dipengaruhi oleh kondisi lingkungan apabila dibandingkan dengan HPLC dan GC (Sherma dan Fried, 2003). Setelah melakukan optimasi pemisahan dengan fase gerak dan pengembangan teknik kombinasi, zona bercak perlu dilakukan deteksi lebih lanjut. Hal tersebut dilakukan apabila bercak tidak berwarna ataupun tidak berflorosensi, ataupun juga tidak menyerap lampu UV pada panjang gelombang 254 nm, maka bercak tersebut dapat dilihat melalui peredaman fluorosensi dengan F-plates khusus yang mengandung indikator fluorosensi, atau bisa juga melalui reagen deteksi dengan cara disemprot atau dicelup yang biasanya dapat diikuti dengan pemanasan. Identifikasi golongan senyawa dari analit dapat menggunakan reagen yang bersifat selektif. Salah satu contoh reagen yang digunakan adalah reagen Dragendorff (KbiI4) yang digunakan untuk identifikasi adanya basa heterosiklik (seperti alkaloid) (Hajnos, et al., 2008). 2.

Kromatografi kolom Kromatografi kolom merupakan salah satu teknik kromatografi yang

paling sering digunakan karena mudah dalam pengoperasiannya. Kolom pada kromatografi ini diisi dengan fase diam. Fase diam yang sering digunakan yaitu silika dan alumina. Sampel yang akan dipisahkan secara kromatografi, sebelumnya dicampur terlebih dahulu dengan fase diam dan kemudian dimasukkan pada kolom kromatografi tersebut. Prinsip pemisahan pada kromatografi kolom adalah fase gerak akan bergerak turun secara kapiler melewati kolom tersebut hingga mencapai dasar kolom membawa analit yang


15

terlarut. Kelebihan lain yang dimiliki kromatografi kolom ini adalah hanya membutuhkan pelarut dalam jumlah yang sedikit. Kromatografi kolom merupakan variasi dari preparasi sampel secara KLT karena fase diam yang digunakan dapat sama dengan fase diam yang digunakan pada KLT (Hostettmann, Marston, Hostettmann, 1997). Kromatografi kolom merupakan salah satu jenis kromatografi adsorpsi yang sering digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa organik. Hal tersebut dikarenakan senyawa organik memiliki kelarutan yang rendah dengan pelarut air atau campuran antara pelarut organik dan air sehingga hasil pemisahan senyawa akan lebih baik apabila dibandingkan dengan kromagrafi cair fase terbalik (Hurtubise, 2010). Metode step – gradient chromatography adalah suatu metode elusi pada kromatografi dengan perubahan fase gerak yang satu dengan fase gerak lainnya secara bertahap. Prinsip utama dengan adanya perubahan gradien pada fase gerak adalah untuk meningkatkan kekuatan elusi dari fase gerak, sehingga salah satu senyawa dari analit akan bercampur dengan fase gerak yang sesuai (Wu, Liang, dan Berthod, 2012). D. Antioksidan 1.

Reactive Oxygen Species (ROS) Oksigen yang dihirup dalam proses pernapasan berperan dalam reaksi

intermediet yang disebut sebagai reactive oxygen species (ROS). Reactive oxygen species (ROS) yang berlebih dalam tubuh ini dapat merusak protein, lemak, dan DNA, yang mengakibatkan stress oksidatif, yaitu ketidakseimbangan antara


16

oksidan dan antioksidan dalam proses oksidasi, hal ini diduga sebagai penyebab penuaan dini dan berbagai macam penyakit pada manusia (Choi, 2009). Reactive oxygen species pada kondisi fisiologis normal akan tersimpan pada organel sel spesifik, yang kemudian akan dimusnahkan oleh sel fagositosis. Reaksi reduksi dari molekul oksigen (O2) menjadi air (H2O) adalah dengan melalui transfer elektron tunggal, oleh karena itu, akan terjadi reaksi intermediet seperti superoksida anion (O2-), hidrogen peroksida (H2O2), dan hidroksiradikal (HO•) yang akan tersimpan dalam mitokondria. Beberapa enzim sitokrom P – 450 juga dapat mereduksi O2 menjadi O2- secara langsung. Sehingga diperlukannya suatu mekanisme perlindungan terhadap ROS (Tringali, 2001). 2.

Senyawa dan golongan senyawa antioksidan Antioksidan adalah suatu senyawa yang dapat menghambat proses

oksidasi dengan cara menghambat polimerisasi rantai yang diawali dengan adanya radikal bebas yang kemudian dilanjutkan dengan reaksi oksidasi (Cespedes, Morales, Avila, Hafidi, Alarcon, dan Lopez, 2009). Mekanisme perlindungan ROS enzimatik yaitu superoxide dismute (SOD) yang mengkatalisis O2- menjadi O2 dan H2O2. H2O2 ini kemudian dimetabolisme kembali menjadi O2 dan H2O. Selain itu, juga diperlukan antioksidan non – enzimatik seperti vitamin E untuk membantu meminimalisir konsentrasi HO• yang ada pada membran sel. Sebuah titik kritis terjadi ketika pengumpulan dan detoksifikasi ROS dalam sel, dimana dengan adanya penyakit, usia, senyawa – senyawa kimia seperti obat, pestisida, herbasida, serta berbagai macam polutan dapat merusak mekanisme perlindungan tubuh terhadap radikal bebas (Tringali, 2001).


17

Antioksidan sintetis yang telah lama digunakan yaitu butylated hydroxy toluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), propylgallate, dan tert – butyl hydroquinone, akan tetapi penggunaan BHA dan BHT ini diduga dapat menginduksi kerusakan hati dan bersifat karsinogenik, sehingga diperlukan sumber antioksidan lain yang dapat berasal dari bahan alam yang lebih aman untuk dikonsumsi (Choi, 2009). Antioksidan alami yang terdapat pada tumbuhan yaitu seperti α – tocopherol, asam askorbat, karotenoid, flavonoid, dan senyawa – senyawa fenolik. Vitamin E (α – tocopherol), merupakan antioksidan alami yang efektif akan tetapi penggunaannya terbatas. Sehingga, industri makanan dan pengobatan mengembangkan antioksidan alami yang berasal dari tumbuh – tumbuhan (Tringali, 2001). Curcuma longa memiliki pigmen kekuningan yang merupakan senyawa golongan fenolik yang memiliki peran sebagai penangkap radikal bebas, dimana senyawa golongan tersebut menurut Pundir dan Jain (2010) larut dalam etanol. Flavonoid dan tanin merupakan senyawa yang berfungsi sebagai penangkap radikal bebas karena ketiga senyawa tersebut adalah senyawa fenol yaitu senyawa dengan gugus –OH yang terikat pada cincin aromatik, sehingga juga terlarut dalam etanol (Kuntorini, Astuti, dan Miliana, 2011). Ekstrak etanolik rimpang kunyit mengandung golongan senyawa saponin, terpenoid, dan flavonoid (Chhetri, et al., 2008). Senyawa – senyawa golongan fenolik memiliki satu atau lebih cincin aromatis dengan satu atau lebih gugus hidroksil tersebut berpotensi menangkap senyawa – senyawa radikal bebas dengan membentuk resonansi radikal fenoksil stabil dan juga dengan reaksi reduksi oksidasi (Choi, 2009).


3.

18

Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Metode radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) merupakan

uji antioksidan yang stabil dalam suhu ruang dan dapat berkurang dengan adanya molekul antioksidan yang ditandai dengan perubahan warna dari violet menjadi tidak berwarna dalam larutan etanol (Garcia, Oldoni, Alencar, Reis, Loguercio, dan Grande, 2012). Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, dan mudah untuk skrining aktivitas penangkap radikal beberapa senyawa, selain itu metode ini terbukti akurat dan praktis (Rastuti, 2012). Hasil yang didapatkan dengan metode ini bersifat reprodusibel dan sebanding dengan metode penangkap radikal bebas lainnya (Kedare dan Singh, 2011). Kekurangan dari metode DPPH ini adalah DPPH memiliki halangan sterik yang cukup besar, sehingga molekul yang kecil lebih memungkinkan untuk bereaksi dengan DPPH dibandingkan dengan molekul yang besar (Bergeron, Carrier, dan Ramaswamy, 2012). Selain itu, DPPH hanya dapat larut pada pelarut organik dan tidak dapat mengukur aktivitas antioksidan dalam plasma karena protein dalam plasma akan terpresipitasi pada pelarut alkohol (Kedare dan Singh, 2011). Senyawa DPPH memiliki radikal bebas yang terdelokalisasi pada molekulnya, sehingga memberikan warna ungu (Kedare dan Singh, 2011).

Gambar 1. Molekul DPPH (radikal)


19

Metode DPPH juga dapat dikembangkan dengan KLT dimana lempeng KLT yang telah mengandung senyawa sampel tersebut dan telah dielusi, dicelup atau disemprot dengan larutan DPPH yang telah diketahui konsentrasinya. Metode ini bertujuan sebagai langkah awal untuk mengetahui adanya sampel yang mengandung antioksidan (Komsta, Hajnos, dan Sherma, 2014). Menurut Ngan (cit., Marliana, 2007) zona bercak yang berubah warna menjadi keputih – putihan, kekuning – kuningan, atau kuning pada sinar tampak setelah disemprot dengan DPPH diidentifikasi sebagai antioksidan. E. Antibakteri 1.

Bakteri Bakteri merupakan organisme (bentuk unsur terkecil yang sudah

memiliki kehidupan) bersel tunggal yang mudah ditemui di dalam tubuh ataupun di luar tubuh (kecuali cairan darah dan cairan tulang belakang) (Utami, 2012). Bakteri secara global dibagi dalam dua kelompok besar setelah diwarnai menurut metode sarjana Denmark dr. Gram, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Tjay dan Rahardja, 2007). Infeksi pada kulit, seringkali disebabkan oleh jamur, Staphylococcus aureus, dan Streptococcus sp (Kareru, et al.,2010). Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif yang dapat menyebabkan berbagai macam infeksi pada manusia seperti menyebabkan lesi pada kulit, sedangkan infeksi serius dari bakteri ini dapat menyebabkan pneumonia, meningitis, infeksi saluran kemih. Selain itu, bakteri ini juga dapat menyebabkan keracunan makanan karena melepaskan enterotoxin ke dalam makanan dan menyebabkan shock sindrom


20

dengan adanya pelepasan superantigens pada aliran darah. Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif yang umumnya ada pada saluran pencernaan manusia, tetapi kadang – kadang bakteri ini juga dapat menyebabkan infeksi pada manusia (Lodhia, Bhatt, dan Thaker, 2009). 2.

Mekanisme antibakteri Antibakteri berdasarkan mekanisme kerjanya dibagi menjadi dua macam,

yaitu: antibakteri bersifat bakterisidal dan bersifat bakteriostatik. Dikatakan bakterisidal karena antibakteri tersebut pada dosis biasa berkhasiat mematikan bakteri, sedangkan bersifat bakteriostatik karena antibakteri tersebut pada dosis biasa mampu menghambat pertumbuhan atau perkembangbiakan suatu bakteri dimana pemusnahannya dilanjutkan dengan sistem pertahanan tubuh sendiri dengan cara fagositosis (‘dimakan’ oleh limfosit) (Tjay dan Rahardja, 2007). Prinsip terapi secara umum dengan antibakteri yaitu: suatu antibakteri seharusnya membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri tanpa membahayakan tubuh manusia sebagai inangnya, dan obat terpenetrasi ke jaringan tubuh yang dituju, serta menuju ke bakteri target secara spesifik. Intinya, antibakteri bersifat efektif atau poten dengan efek samping yang rendah, atau memiliki toksisitas selektif terhadap bakteri patogen yang dituju (Nugroho, 2012). 3.

Resistensi bakteri Resistensi merupakan kemampuan alami bakteri untuk tidak terpengaruh

terhadap agen antibakteri (Nugroho, 2012). Salah satu penyebab terjadinya resistensi ini adalah penggunaan antibakteri yang tidak rasional. Oleh sebab itu, dikembangkan penemuan senyawa baru sebagai antibakteri yang salah satu


21

sumbernya berasal dari tanaman. Berbagai macam bagian tanaman telah digunakan untuk perawatan kulit sebagai antibakteri dan antifungi seperti daun, ranting, akar, kulit batang, ataupun buah yang diaplikasikan secara topikal. Sediaan dalam bentuk gel, krim, dan sabun yang mengandung berbagai macam ekstrak tanaman telah digunakan untuk mengobati berbagai macam penyakit pada kulit yang disebabkan oleh infeksi mikroba (Kareru, Keriko, Kenji, Thiong’o, Gachanja, dan Mukiira, 2010). 4.

Golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri Telah dilaporkan bahwa berbagai macam ekstrak rimpang kunyit dapat

menimbulkan efek antibakteri pada bakteri patogen baik pada bakteri Gram negatif maupun bakteri Gram positif. Efek yang diberikan kunyit pada bakteri Gram positif yaitu, S. aureus dan Staphylococcus epidermidis. Efek yang diberikan kunyit pada bakteri Gram negatif yaitu E. coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Salmonella typhimurium (Singh, Chandra, Bose, dan Luthra, 2002). Rimpang kunyit dapat menghambat pertumbuhan jamur, virus, dan bakteri karena mengandung berbagai senyawa diantaranya adalah kurkumin dan minyak atsiri. Senyawa sesquiterpen dalam minyak atsiri kunyit merupakan turunan dari senyawa terpen seperti alkohol yang bersifat bakterisida (Warnaini, 2013). 5.

Uji kualitatif antibakteri dengan metode bioautografi kontak Bioautografi merupakan metode skrinning mikrobiologi yang pada

umumnya digunakan sebagai uji pendahuluan dalam rangka untuk mengetahui


22

ada tidaknya aktivitas antibakteri pada analit. Kelebihan dari metode ini adalah sensitif, sederhana, murah, tidak membuang waktu, dan tidak membutuhkan peralatan dengan teknologi yang tinggi. Metode bioautografi yang akan digunakan adalah bioautografi yang dikombinasikan dengan teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT), sehingga sering juga disebut sebagai bioautografi kontak. Prosedur pada metode bioautografi sama seperti prosedur yang digunakan pada metode difusi agar. Perbedaannya adalah senyawa uji akan berdifusi ke media agar dari lempeng KLT. Hal tersebut dilakukan dengan cara lempeng KLT atau kromatografi kertas yang telah berisi senyawa uji diletakkan pada medium agar yang telah diinokulasikan bakteri atau jamur tersebut selama beberapa menit atau jam supaya mengalami difusi. Selanjutnya, lempeng tersebut diambil dan lapisan agar diinkubasi. Maka akan muncul zona hambat dimana senyawa antimikroba tersebut telah kontak dengan medium agar (Choma, dan Grzelak, 2010). Bioautografi merupakan metode yang efektif untuk mendeteksi adanya senyawa antibakteri pada senyawa – senyawa kompleks, hal tersebut dikarenakan metode ini memfasilitasi senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri terlokalisasi secara langsung dari lempeng KLT yang kontak dengan mikroorganisme. Sehingga metode ini cocok untuk penemuan senyawa antibakteri baru yang berasal dari tumbuh – tumbuhan ataupun dari senyawa alam lainnya. Bioautografi dapat digunakan sebagai awalan untuk tahap isolasi selanjutnya, sehingga tidak membuang waktu untuk mengisolasi senyawa yang tidak memiliki aktivitas antibakteri karena dapat mengetahui lokasi senyawa yang memiliki aktivitas (Suleiman, McGaw, Naidoo, dan Eloff, 2010).


6.

23

Uji daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer Metode Kirby – Bauer disc diffusion merupakan metode yang paling

sering digunakan untuk menguji daya antibakteri dengan menggunakan paper disc yang mengandung berbagai macam senyawa aktif dengan volume yang diketahui. Paper disc yang telah berisi senyawa aktif tersebut kemudian diinokulasikan pada media agar yang telah mengandung bakteri uji (Vasanthakumari, 2009). Media agar yang digunakan pada metode ini adalah Mueller – Hinton agar (Gillespie, 1994). Daya antibakteri ditentukan dengan adanya zona hambat yang terbentuk di sekitar disc yang mengandung senyawa aktif. Hal tersebut dapat terjadi karena senyawa aktif akan berdifusi dari disc ke medium untuk menghambat pertumbuhan bakteri uji di sekitar daerah paper disc (Vasanthakumari, 2009). Ukuran zona hambat dapat dipengaruhi oleh kepadatan atau viskositas media biakan, kecepatan difusi antibiotik, konsentrasi antibiotik pada paper disc, sensitivitas organisme terhadap antibiotik, dan interaksi antibiotik dengan media. Selain itu, suatu zat yang ditemukan mempunyai efek signifikan tidak boleh digunakan untuk terapi secara langsung karena dimungkinkan zat tersebut memiliki efek samping signifikan pada sistem yang diobati (Harmita, Radji, 2006). Kelebihan metode ini adalah metode ini relatif mudah dilakukan karena tidak memerlukan peralatan khusus, relatif murah, dan juga bersifat fleksibel dalam pemilihan disc yang akan digunakan untuk uji. Kelemahan dari metode ini adalah tidak dapat digunakan secara akurat untuk bakteri yang pertumbuhannya lambat (Jorgensen dan Ferraro, 2009).


24

F. UV Protection 1.

Radiasi ultraviolet pada kulit Kulit merupakan organ terluar dan terbesar yang paling rentan terhadap

bahaya sinar matahari karena kulit terpapar secara langsung oleh sinar matahari. Ketika kulit mamalia terpapar radiasi ultraviolet dalam waktu yang lama, akan menginduksi oksidatif stress dengan adanya spesies oksigen reaktif yang dapat menyebabkan kanker kulit pada seseorang. Selain itu, paparan sinar ultraviolet juga dapat mengakibatkan yaitu edema, eritema, pembentukan sel – sel yang terbakar, hiperplasia, immunosupresi, kerusakan DNA, penuaan dini, dan melanogenesis. Salah satu mekanisme tubuh untuk melindungi sel – sel kulit dari paparan sinar ultraviolet yaitu dengan adanya pigmen melanin yang dapat menyerap sinar ultraviolet. Jumlah melanin yang terbentuk tersebut pada kondisi tertentu terkadang tidak cukup untuk melindungi kulit dari paparan sinar ultraviolet, sehingga diperlukan sebuah strategi untuk melindungi kulit dari radiasi sinar ultraviolet dengan menggunakan tabir surya untuk menetralkan spesies oksigen reaktif dengan cara mengeblok paparan radiasi ultraviolet pada epidermis (Balakrishnan, et al., 2011). 2.

Tabir surya Tabir surya pada umumnya dikembangkan untuk meminimalisir eritema,

merupakan suatu senyawa kimia yang mampu menyerap dan mengurangi efek radiasi sinar ultraviolet terhadap sel - sel kulit (Sarkar, 2012). Tabir surya memiliki beranekaragam komposisi dan mekanisme aksi seperti mengeblok, memantulkan, maupun menghamburkan radiasi sinar ultraviolet (Latha, Martis,


25

Shobha, Shinde, Bangera, Krishnankutty, et al., 2013). Tabir surya secara garis besar dibedakan menjadi dua macam yaitu kimia dan fisika. Tabir surya secara kimia mengandung senyawa aromatis yang terkonjugasi dengan gugus karbonil. Senyawa utama yang berperan penting sebagai fotoprotektif yaitu asam fenolik, flavonoid, dan polifenol. Struktur ini akan menyerap energi tinggi dari sinar ultraviolet dan kemudian melepaskan energi tersebut sebagai energi yang rendah (Balakrishnan, et al., 2011). Tabir surya secara fisika seperti titanium dioksida dan zinc oxide, bekerja dengan cara membentuk lapisan pada kulit yang mampu memantulkan, menghamburkan sinar ataupun mengeblok paparan sinar ultraviolet (Zhai, Wilhelm, dan Maibach, 2008). 3.

Uji aktivitas tabir surya dengan metode inhibition of bleaching of

-

carotene Senyawa

-carotene merupakan salah satu bentuk sederhana dari

karotenoid, yang memiliki rumus molekul C40H56. Senyawa

-carotene sangat

tidak stabil dalam udara karena dapat teroksidasi dan juga tidak stabil terhadap cahaya dan panas sebab dapat mengalami isomerisasi menjadi bentuk cis

-

carotene yang lebih tidak stabil (Tungriani, Karim, dan Seniwati, 2012). Senyawa

-carotene larut dalam benzena, kloroform, karbon disulfida;

cukup larut dalam eter, petroleum eter, minyak; tidak larut pada air, asam, basa (O’Neil, 2001). Struktur -carotene, yaitu:

Gambar 2. Struktur -carotene


26

Prinsip metode inhibition of bleaching of -carotene adalah berdasarkan pemudaran warna larutan

-carotene dari warna kuning. Pemudaran warna ini

akan terjadi apabila tidak adanya senyawa antioksidan. Hal tersebut dikarenakan adanya senyawa antioksidan yang mampu membantu mempertahankan ikatan konjugasi µ dari

-carotene (Ueno, Yamakura, Arastoo, Oshima, dan Kokubo,

2014). G. Landasan Teori Manfaat antioksidan yaitu dapat menangkap radikal bebas yang dapat membahayakan tubuh, sedangkan tabir surya digunakan untuk melindungi tubuh dari radiasi sinar ultraviolet (UV). Antibakteri yang terdapat dalam kosmetik dapat berfungsi sebagai pencegah pertumbuhan bakteri baik untuk sediaan kosmetik itu sendiri maupun untuk mencegah timbulnya jerawat pada kulit yang disebabkan oleh bakteri. Rimpang kunyit mengandung kurkumin yang merupakan senyawa golongan fenolik yang dapat larut dalam etanol. Selain itu, ekstrak etanolik rimpang kunyit juga mengandung golongan senyawa saponin, terpenoid, dan flavonoid. Flavonoid merupakan senyawa antioksidan karena senyawa tersebut adalah senyawa fenol yang berpotensi menangkap senyawa – senyawa radikal bebas dengan membentuk resonansi radikal fenoksil stabil dan juga dengan reaksi reduksi oksidasi. Oleh sebab itu, rimpang kunyit tidak hanya berpotensi sebagai antioksidan tetapi juga sebagai tabir surya karena golongan senyawa utama yang berperan sebagai fotoprotektif yaitu fenolik karena adanya cincin aromatis yang terkonjugasi dengan gugus karbonil.


27

Rimpang kunyit dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena mengandung golongan senyawa fenolik dan senyawa sesquiterpen dalam minyak atsiri yang merupakan turunan senyawa terpen. Minyak atsiri ini juga terdapat dalam ekstrak etanolik kunyit. Oleh sebab itu, dilakukan uji aktivitas pendahuluan rimpang kunyit sebagai penangkap radikal bebas dengan metode DPPH, sebagai antibakteri dengan metode bioautografi kontak, dan sebagai UV ptotection dengan menggunakan metode inhibition of bleaching of

-carotene untuk mengetahui

zona bercak yang aktif. Setelah itu, dilanjutkan dengan isolasi senyawa dengan kromatografi kolom dan dilakukan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection pada isolat tersebut. H. Hipotesis Hasil isolasi yang didapatkan dari ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection.


BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksploratif. B. Definisi Operasional 1. Ekstrak kental rimpang kunyit merupakan ekstrak etanolik rimpang kunyit yang telah dipekatkan dengan menggunakan evaporator. 2. Isolat merupakan hasil isolasi dengan kromatografi kolom dari zona bercak ekstrak rimpang kunyit yang memiliki aktivitas. C. Bahan dan Alat Penelitian 1.

Bahan penelitian Rimpang kunyit dalam bentuk simplisia kering sebanyak 1 kg diperoleh

dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah.

Bahan

kimia kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi DPPH dan

-

carotene. Bahan kimia kualitas pro analitik Merck, Germany meliputi etanol, nheksan, kloroform, metanol, NaCl, lempeng KLT silika gel 60 F254 dan silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm). Akuades diperoleh dari Brataco Chemica. Mueller – Hinton agar, kultur murni S. aureus ATCC 25923 dan kultur murni E. coli ATCC 25922 diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta. Media Agar No. 1 diperoleh dari Oxoid dan Trypticasein Soy Broth (TSB) diperoleh dari Agarindo

28


29

Biological Company. Amoksisilin sebagai kontrol positif didapatkan dari Indofarma. 2.

Alat penelitian Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa blender,

seperangkat alat maserasi, vacuum rotary evaporator (Buchi), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), oven (WTB binder), penjepit, micro haematocrit tubes, light meter (Lutron), lampu UV 254 nm, lampu UV 366 nm, mikropipet 100 – 1000 µL; 5 – 50 µL; 0,5 – 10 µL (Acura 825, Socorex), sentrifuge, vortex (Junke & Kunkel), penangas air (labo – tech, Heraceus), autoclave (YX – 400Z), inkubator, ose, tabung reaksi bertutup, dan alat – alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex – Germany dan Iwaki). D. Tatacara Penelitian 1.

Pengumpulan dan penyiapan bahan a.

Determinasi tanaman Determinasi tanaman pada rimpang kunyit diperlukan untuk mengetahui kebenaran bahan rimpang kunyit yang digunakan pada penelitian.

b.

Pengumpulan bahan Satu kilogram rimpang kunyit kering diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah.


30

c. Penyiapan bahan Simplisia rimpang kunyit yang telah diperoleh tersebut diserbuk dengan menggunakan blender. d.

Susut pengeringan simplisia Cawan petri yang telah dikeringkan sebanyak 3 buah ditimbang dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105

hingga mencapai bobot

tetap. Setelah ketiga cawan petri tersebut mencapai bobot tetap, ditambahkan serbuk simplisia rimpang kunyit dan ditimbang cawan petri beserta serbuk simplisia tersebut hingga didapatkan serbuk simplisia ± 0,5 gram pada masing – masing cawan. Ketiga cawan petri tersebut kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 50

hingga mencapai

bobot tetap. 2.

Ekstraksi a.

Pembuatan ekstrak kental rimpang kunyit Satu kilogram simplisia kering dalam bentuk serbuk tersebut ditimbang dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi serta ditambahkan dengan etanol 90% v/v hingga dapat merendam seluruh serbuk simplisia tersebut. Campuran tersebut kemudian dimaserasi selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah 24 jam, campuran disaring sehingga didapatkan filtrat pertama dan residu yang tersisa dilakukan maserasi kembali dengan menggunakan pelarut etanol 90% v/v selama 24 jam pada suhu ruang. Filtrat kedua diperoleh melalui penyaringan dari hasil maserasi kedua. Filtrat pertama dan kedua kemudian dicampurkan hingga


31

homogen dan dilakukan evaporasi hingga menjadi ekstrak kental. Ekstrak kental ini kemudian disimpan dalam lemari pendingin. b.

Susut pengeringan ekstrak Cawan petri yang telah dikeringkan sebanyak 3 buah ditimbang dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105

hingga mencapai bobot

tetap. Setelah ketiga cawan petri tersebut mencapai bobot tetap, ditambahkan ekstrak kental dan ditimbang cawan petri beserta ekstrak kental tersebut hingga didapatkan ekstrak kental ± 0,5 gram pada masing – masing cawan. Masing – masing cawan tersebut ditambahkan silika ± 0,5 gram. Ketiga cawan petri tersebut kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 50 3.

hingga mencapai bobot tetap.

Optimasi fase gerak pada ekstrak kental rimpang kunyit a.

Preparasi sampel dari ekstrak kental Sebanyak 5 mg ekstrak kental yang telah diperoleh ditimbang dan dilarutkan ke dalam 1 mL etanol. Campuran tersebut kemudian diaduk hingga homogen.

b.

Optimasi fase gerak pada ekstrak kental Sampel yang telah didapatkan kemudian ditotolkan sebanyak 5 spot pada lempeng KLT dengan jarak elusi 5 cm, dimana masing – masing fase gerak mendapatkan 1 spot yang kemudian dibandingkan dan diamati kelima hasil elusi tersebut. Macam – macam fase gerak yang digunakan, yaitu: a) n-heksan : etil asetat (2:3 v/v)


32

b) Kloroform : metanol (7:3 v/v) c) Kloroform : metanol (9:1 v/v) d) Kloroform : metanol (95:5 v/v) e) Etil asetat: asam formiat: asam asetat glasial: air (100:11:11:20 v/v) 4.

Identifikasi golongan senyawa pada ekstrak kental rimpang kunyit a.

Deteksi secara fisik Ekstrak kental yang telah disiapkan tersebut ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 5 cm dan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Lempeng KLT hasil elusi kemudian dikeringkan pada suhu ruang. Setelah kering, lempeng KLT tersebut dideteksi pada lampu UV 254 nm dan 366 nm.

b.

Identifikasi golongan senyawa dengan reagen semprot Ekstrak kental tersebut diidentifikasi golongan senyawanya dengan menggunakan KLT dengan jarak elusi 5 cm. Hasil elusi yang telah dikeringkan tersebut kemudian divisualisasi dengan pereaksi AlCl3, FeCl3, sitroborat, Dragendorff, dan vanilin sulfat. Hasil KLT tersebut kemudian diamati dan dihitung nilai Rf yang timbul pada masing – masing pereaksi tersebut.

5.

Uji kualitatif penangkap radikal bebas ekstrak rimpang kunyit a.

Preparasi pereaksi semprot DPPH Pereaksi DPPH dibuat 0,2% b/v dalam pelarut metanol dan disimpan dalam wadah gelap dan tertutup rapat (Marston, 2011).


b.

33

Uji kualitatif penangkap radikal bebas DPPH Ekstrak kental 5 mg/ mL dalam etanol ditotolkan pada lempeng KLT dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan jarak elusi 5 cm. Lempeng KLT hasil elusi tersebut kemudian dikeringkan pada suhu ruang dan selanjutnya disemprot dengan pereaksi DPPH. Hasil positif ditandai dengan adanya bercak berwarna kuning – putih dengan latar ungu pada lempeng KLT.

6.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak rimpang kunyit a.

Pembuatan larutan Mac Farland 0,5 (1,5 x 108 CFU/mL) Larutan barium klorida 1,175% b/v diambil sebanyak 0,05 mL lalu ditambahkan 9,95 mL larutan asam sulfat 1% b/v, diaduk hingga homogen (Mahon, Lehman, Manuselis, 2011).

b.

Pembuatan media 1) Media TSB cair Tiga gram media TSB (30 g/ L) dilarutkan dalam 100 mL aquadest diaduk hingga homogen di atas penangas air. Media tersebut disterilkan dengan autoclave. Setelah itu, media TSB tersebut dituang ke dalam tabung dengan volume masing – masing tabung 20 mL secara aseptis. 2) Media agar Enam gram media TSB (30 g/L) ditambahkan 1,2% b/v agar dan dilarutkan dalam 200 mL aquadest. Campuran tersebut diaduk hingga homogen di atas penangas air dan disterilkan dengan


34

autoclave. Kemudian, campuran tersebut dituang ke dalam cawan petri dengan volume masing – masing cawan petri 15 mL secara aseptis dan dibiarkan hingga memadat. c.

Pembuatan saline water 0,9% b/v Natrium klorida ditimbang 0,9 gram yang kemudian dilarutkan dalam 100 mL aquadest hingga larut.

d.

Pembuatan suspensi bakteri uji Kultur murni bakteri uji E. coli dan S. aureus masing – masing diambil sebanyak 1 ose dan masing – masing diinokulasikan pada media TSB cair, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Pembuatan suspensi bakteri uji dilakukan dengan cara bakteri dari media TSB cair yang telah diinkubasi tersebut ditambahkan ke dalam 10 mL saline water hingga kekeruhannya sesuai dengan larutan standar Mac Farland 0,5 (1,6 x 108 CFU/mL).

e.

Penyimpanan kultur bakteri Sisa kultur bakteri yang belum diuji dari media TSB cair yang telah diinkubasi tersebut, masing – masing diambil 0,5 mL dan dicampur dengan 25 µL gliserol dalam wadah tabung eppendorf yang berbeda. Tabung eppendorf tersebut kemudian diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator dengan suhu 37

dan kemudian disimpan dalam freezer.


f.

35

Pembuatan kontrol 1) Kontrol kontaminasi media Kontrol kontaminasi media dibuat dengan cara menuang 15 mL media agar pada cawan petri secara aseptis yang kemudian diinkubasi selama 24 jam dan kemudian diamati. 2) Kontrol pertumbuhan bakteri uji Kontrol pertumbuhan bakteri uji dibuat dengan cara menginokulasikan 100 µL bakteri uji dan diratakan dengan cotton bud dalam media agar yang telah dibuat sebelumnya, diinkubasi selama 24 jam dan kemudian diamati. 3) Kontrol positif Kontrol positif dibuat dengan menggunakan amoksisilin dengan konsentrasi 5 mg/ mL dan diambil 15 µL, 20 µL, dan 30 µL yang kemudian masing – masing ditotolkan pada paper disc yang berbeda – beda. Paper disc tersebut kemudian diletakkan pada media agar yang telah diinokulasikan 100 µL bakteri uji, diinkubasi selama 24 jam dan diamati.

g.

Penyiapan sampel Ekstrak kental rimpang kunyit ditimbang 5 mg dan dilarutkan dalam 1 mL etanol yang kemudian ditotolkan pada lempeng KLT dengan volume 15 µL, 20 µL, dan 30 µL sehingga akan didapatkan mass loading 75 µg, 100 µg, dan 150 µg. Lempeng KLT tersebut kemudian dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol


36

(95 : 5 v/v). Setelah dielusi, lempeng KLT tersebut dibiarkan mengering secara aseptis. h.

Metode bioautografi kontak Lempeng KLT yang telah kering tersebut, dikontakkan pada media agar yang telah diinokulasikan 100 µL bakteri uji secara spreading. Setelah 40 menit, lempeng KLT tersebut diangkat dari media agar dan media agar tersebut diinkubasi selama 18 jam yang kemudian diamati lokasi bercak yang mengandung daya antibakteri. Daya antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona hambat pada media agar tersebut (Choma, dan Grzelak, 2010).

7.

Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak rimpang kunyit a.

Preparasi pereaksi -carotene Pereaksi

-carotene dibuat 0,05% b/v dalam pelarut kloroform

dan disimpan dalam wadah gelap dan tertutup rapat (Marston, 2011). b.

Optimasi intensitas cahaya Lempeng KLT kosong dicelupkan dalam pereaksi

-carotene

yang telah dibuat sebelumnya dan warna lempeng KLT tersebut diukur dengan menggunakan indikator warna. Lempeng KLT kemudian disinari dengan lampu UV dalam kotak fluoroscent, dimana posisi ketinggian lampu UV diatur yaitu 100 cm dari dasar, 50 cm dari dasar, dan 35 cm dari dasar serta intensitas cahaya pada tiap ketinggian diukur dengan alat light meter. Perubahan warna yang terjadi pada latar lempeng KLT tersebut diamati pada menit ke – 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15. Tiap posisi


37

lampu tersebut dilakukan dengan 5 kali replikasi dan dihitung standar deviasi serta rata – rata perubahan warnanya. c.

Uji kualitatif aktivitas -carotene Larutan ekstrak dengan konsentrasi 5 mg/ mL yang telah disiapkan ditotolkan pada lempeng KLT untuk dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Lempeng KLT yang telah dielusi kemudian dicelupkan dengan pereaksi -carotene dan warna pada lempeng KLT tersebut diukur dengan menggunakan indikator warna. Setelah itu, lempeng KLT tersebut disinari dengan sinar UV dalam kotak fluoroscent dengan ketinggian lampu dari dasar adalah 50 cm dan intensitas cahayanya telah terukur dengan alat light meter. Perubahan warna pada lempeng KLT diukur pada menit ke – 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15. Uji ini dilakukan dengan 5 kali replikasi dan dihitung standar deviasi serta rata – rata perubahan warna.

8.

Isolasi senyawa yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection a.

Triturasi 1) Penyiapan sampel Ekstrak kental ditimbang 5,0 gram dan dimasukkan ke dalam mortir yang telah ditimbang sebelumnya. Lima gram sea sand ditambahkan pada mortir tersebut dan diaduk hingga homogen sambil diteteskan metanol sebanyak 1 – 2 tetes untuk memudahkan


38

pengadukan. Campuran tersebut kemudian didiamkan selama semalam di dalam lemari pendingin. 2) Triturasi dengan n-heksan Campuran ekstrak kental rimpang kunyit dan sea sand tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge. Lima mL n-heksan ditambahkan pada tabung sentrifuge tersebut, dicampurkan hingga homogen dengan vortex, dan kemudian disentrifugasi. Bagian larutan hasil dari sentrifugasi tersebut kemudian diambil dan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatmann no. 42 yang akan ditampung di cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya. Langkah ini dilakukan hingga bagian larutan hasil sentrifugasi menjadi bening. Hasil filtrasi tersebut kemudian diuapkan di atas penangas air hingga seluruh pelarut teruapkan dan ditimbang kembali. Filtrat yang diperoleh disimpan di lemari pendingin dan disebut sebagai hasil triturasi n-heksan. 3) Triturasi dengan kloroform : metanol (95:5 v/v) Campuran ekstrak kental rimpang kunyit dan sea sand sisa dari triturasi n-heksan dikeringkan dan dipindahkan ke tabung sentrifuge baru. Kloroform : metanol (95:5 v/v) ditambahkan sebanyak 5 mL, dicampurkan hingga homogen dengan vortex, dan kemudian disentrifugasi. Bagian larutan hasil dari sentrifugasi tersebut kemudian diambil dan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatmann no. 42 yang akan ditampung di cawan porselen


39

yang telah ditimbang sebelumnya. Langkah ini dilakukan hingga bagian larutan hasil sentrifugasi menjadi bening. Hasil filtrasi tersebut kemudian diuapkan di atas penangas air hingga seluruh pelarut teruapkan dan ditimbang kembali. Filtrat yang diperoleh disimpan di lemari pendingin dan disebut sebagai hasil triturasi kloroform : metanol (95:5 v/v). 4) Pengujian KLT ekstrak kental dan hasil triturasi Masing – masing ekstrak kental rimpang kunyit, hasil triturasi n-heksan, dan hasil triturasi kloroform : metanol (95:5 v/v) ditimbang 2,5 mg yang kemudian diletakkan pada masing – masing tabung flakon. Masing – masing tabung flakon tersebut kemudian ditambahkan 500 µL etanol p.a dan diaduk hingga homogen. Setelah terlarut hingga homogen, masing – masing tabung flakon tersebut ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan mikrokapiler dengan jarak elusi 5 cm dan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Hasil elusi dibandingkan dan dihitung nilai Rf masing – masing bercak pada ekstak kental rimpang kunyit, hasil triturasi n-heksan, dan hasil triturasi kloroform : metanol (95:5 v/v). b.

Kromatografi kolom Kromatografi kolom pada penelitian ini menggunakan metode elusi step – gradient chromatography.


40

1) Optimasi pelarut yang akan digunakan Hasil triturasi n-heksan yang telah diperoleh tersebut ditimbang 2,5 mg dan dilarutkan dalam 0,5 mL n-heksan hingga tercampur homogen. Campuran tersebut kemudian ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 5 cm untuk masing – masing fase gerak. Fase gerak yang digunakan yaitu: n-heksan : kloroform (50:50 v/v), n-heksan : kloroform (25:75 v/v), kloroform, dan kloroform : metanol (98:2 v/v). Setelah dielusi, lempeng KLT tersebut kemudian diamati dan dibandingkan setiap fase gerak. 2) Preparasi sampel untuk kromatografi kolom Hasil

triturasi

n-heksan

ditimbang

300

mg

dan

dicampurkan dengan 300 mg silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) hingga homogen. 3) Penyiapan kolom kromatografi Bagian bawah kolom disumbat dengan kapas yang telah dibasahi dengan n-heksan. Kolom kemudian disusun dari bawah ke atas yaitu: silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) di atas kapas tersebut dengan ketinggian sekitar 2 cm, sampel yang telah tercampur dengan silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) dengan ketinggian sekitar 0,5 cm, silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) dengan ketinggian sekitar 1 cm, dan ditutup kembali dengan kapas yang telah terbasahi oleh nheksan.


41

4) Kromatografi kolom dengan teknik elusi step - gradient Kolom kromatografi yang telah siap digunakan dialirkan dengan 20 mL n-heksan : kloroform (75:25 v/v) dan dilanjutkan dengan 10 mL n-heksan : kloroform (50:50 v/v) yang ditampung dalam tabung flakon setiap 2 mL dari hasil kromatografi kolom tersebut. Setiap tabung flakon tersebut kemudian dicuplik untuk dilakukan KLT dengan menggunakan fase gerak kloroform dan profil KLT tersebut diamati. 5) Penggabungan isolat hasil kromatografi kolom Nilai Rf masing – masing plat KLT hasil cuplikan tiap tabung flakon dari kromatografi kolom dihitung. Bercak yang memiliki nilai Rf yang sama dan pada profil KLT hanya menunjukkan satu bercak digabungkan dalam wadah tabung flakon lain yang telah ditimbang sebelumnya. Setelah itu, diuapkan di atas penangas air dengan suhu 50

dan ditimbang kembali untuk

mengetahui bobot yang didapatkan serta dihitung pula rendemen yang diperoleh. Ketika hasil penggabungan isolasi tersebut telah pekat, maka langkah selanjutnya adalah memindahkannya ke tabung eppendorf dengan cara melarutkan isolat dengan pelarut yang sesuai sehingga diperoleh kadar 1 mg/ 100 µL dan kemudian diuapkan kembali, sehingga di dalam tabung eppendorf terdapat 1 mg isolat.


9.

42

Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection pada isolat a.

Preparasi sampel 1) Isolat pertama Tabung eppendorf yang telah mengandung 1 mg isolat pertama tersebut dilarutkan dalam 1 mL n-heksan : kloroform (75 : 25 v/v). 2) Isolat kedua Tabung eppendorf yang telah mengandung 1 mg isolat kedua tersebut dilarutkan dalam 1 mL n-heksan : kloroform (50 : 50 v/v).

b.

Uji aktivitas penangkap radikal bebas DPPH secara KLT Isolat pertama dan kedua tersebut ditotolkan pada lempeng KLT dengan volume penotolan 10 µL, 20 µL, dan 30 µL menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan jarak elusi 5 cm. Lempeng KLT hasil elusi tersebut kemudian dikeringkan pada suhu ruang dan selanjutnya disemprot dengan pereaksi DPPH. Hasil positif ditandai dengan adanya bercak berwarna kuning – putih dengan latar ungu pada lempeng KLT.

c.

Uji aktivitas UV protection dengan -carotene secara KLT Larutan isolat pertama dan larutan isolat kedua dengan konsentrasi masing – masing larutan 1 mg/ mL yang telah disiapkan ditotolkan pada lempeng KLT untuk dielusi dengan jarak elusi 5 cm


43

menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Lempeng KLT yang telah dielusi kemudian dicelupkan dengan pereaksi -carotene dan warna pada lempeng KLT tersebut diukur dengan menggunakan indikator warna. Setelah itu, lempeng KLT tersebut disinari dengan sinar UV dalam kotak fluoroscent dengan ketinggian lampu dari dasar adalah 50 cm dan intensitas cahaya telah terukur dengan light meter. Perubahan warna pada lempeng KLT diukur pada menit ke – 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15. 10. Uji daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer a.

Preparasi bahan Pembuatan suspensi bakteri, kontrol media, dan kontrol pertumbuhan dilakukan seperti pengujian daya antibakteri sebelumnya, hanya saja pada metode Kirby – Bauer media agar yang digunakan adalah Mueller – Hinton agar. Pembuatan kontrol positif menggunakan amoksisilin dengan konsentrasi 1 mg/ mL dan volume yang digunakan pada paper disc yaitu 5 µL; 7,5 µL; dan 10 µL yang kemudian diletakkan ke dalam media agar yang telah diinokulasikan 100 µL bakteri.

b.

Pengujian daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer Satu miligram isolat pertama dan isolat kedua dalam tabung eppendorf hasil dari kromatografi kolom masing – masing dilarutkan dengan 1 mL n-heksan : kloroform (75 : 25 v/v) untuk isolat pertama dan 1 mL n-heksan : kloroform (50 : 50 v/v) untuk isolat kedua. Masing – masing isolat tersebut kemudian ditotolkan pada paper disc dengan


44

volume 50 µL, 100 µL, dan 200 µL. Paper disc tersebut kemudian dibiarkan mengering untuk menghilangkan pelarut secara aseptis. Paper disc yang telah kering tersebut, diletakkan pada media agar yang telah diinokulasikan 100 µL bakteri uji secara spreading. Inkubasi dilakukan selama 24 jam dan diamati serta diukur zona hambat yang timbul pada media agar tersebut. 11. Identifikasi golongan senyawa pada isolat a.

Deteksi secara fisik Larutan isolat pertama dan kedua dengan konsentrasi 1 mg/ mL yang telah disiapkan tersebut ditotolkan pada lempeng KLT sebanyak 10 µL dengan jarak elusi 5 cm dan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Lempeng KLT hasil elusi kemudian dikeringkan pada suhu ruang. Setelah kering, lempeng KLT tersebut dideteksi pada lampu UV 254 nm dan 366 nm.

b.

Identifikasi golongan senyawa dengan reagen semprot Kedua isolat tersebut diidentifikasi golongan senyawanya dengan menggunakan KLT dengan jarak elusi 5 cm. Hasil elusi yang telah dikeringkan tersebut kemudian divisualisasi dengan pereaksi AlCl3, FeCl3, Dragendorff, dan vanilin sulfat. Hasil KLT tersebut kemudian diamati.


12. Bagan alur penelitian Serbuk simplisia rimpang kunyit 919,7 gram Maserasi dengan etanol 90% v/v

Evaporasi Ekstrak kental rimpang kunyit 135,4 gram

Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection dan identifikasi golongan senyawa Bercak aktif memiliki Rf 0,74 – 0,78

Triturasi heksan

Triturasi kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Hasil triturasi heksan 0,818 gram

Bercak Rf 0,74 – 0,78 pada ekstrak rimpang kunyit Kromatografi kolom Isolat 1 (0,1412 gram)

Isolat 2 (0,0173 gram)

Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, UV protection, dan identifikasi golongan senyawa

Hasil triturasi kloroform : metanol (95 : 5 v/v) 2,576 gram

45


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan 1.

Pengumpulan bahan Rimpang kunyit dalam bentuk simplisia kering sebanyak 1 kg diperoleh

dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu. Menurut peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia nomor 12 tahun 2014 tentang persyaratan mutu obat tradisional, yang dimaksud dengan simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat tradisional yang belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Penyimpanan dalam bentuk kering ini bertujuan supaya dapat disimpan dalam waktu yang lama, mengurangi kadar air, dan menghentikan reaksi enzimatik sehingga dapat mencegah terjadinya penurunan mutu atau kerusakan simplisia. Air yang masih tersisa dalam simplisia dengan kadar tertentu dapat menjadi media pertumbuhan kapang dan jasad renik lainnya. Enzim tertentu dalam sel masih dapat bekerja menguraikan senyawa aktif sesaat setelah sel mati selama simplisia tersebut mengandung sejumlah kadar air tertentu (Tini, Amri, 2003). Simplisia rimpang kunyit yang didapatkan pada penelitian ini dikemas dalam kantong plastik tertutup rapat. Tujuan pengemasan tersebut adalah untuk melindungi simplisia agar tidak rusak atau berubah mutunya karena berbagai faktor baik dari dalam maupun dari luar serta melindungi simplisia dari cemaran.

46


47

Syarat wadah yang digunakan untuk mengemas yaitu: tidak beracun, tidak menyebabkan perubahan bau, rasa, warna, dan reaksi dari simplisia, serta harus mampu melindungi simplisia baik dari pencemaran maupun pengaruh lingkungan yang dapat menurunkan kualitas. Dalam kemasan tersebut terdapat silika gel yang berfungsi untuk menyerap kelembapan udara selama penyimpanan untuk mencegah tumbuhnya jamur dan jasad renik lainnya. Setelah bahan simplisia rimpang kunyit diperoleh, determinasi tanaman diperlukan dengan tujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang akan digunakan dalam penelitian sehingga dapat menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel untuk analisis fitokimia. Hasil determinasi yang dikeluarkan oleh Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, menyatakan kebenaran bahwa simplisia kering yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia rimpang kunyit. Pembuktian determinasi tanaman tersebut dikuatkan dengan adanya surat determinasi tanaman (lampiran 1) dengan penanggung jawab Dyah Subositi, M.Sc. yang dikeluarkan oleh B2P2TOOT Tawangmangu. 2.

Susut pengeringan simplisia Penetapan susut pengeringan bertujuan untuk melihat persentase

kandungan senyawa yang mudah menguap. Hal ini merupakan parameter yang perlu diperhatikan karena apabila nilai susut pengeringan besar maka akan ada banyak senyawa yang terkandung dalam simplisia mudah menguap, sehingga tujuan akhir dari penetapan parameter ini adalah supaya tidak mengalami


48

kesalahan dalam proses penanganan dan penyimpanan simplisia agar senyawa – senyawa yang berpotensi memiliki aktivitas tidak menguap. Susut pengeringan simplisia dilakukan pada suhu penetapan 105

dan dilakukan hingga mencapai

bobot tetap. Menurut Materia Medika Indonesia jilid V tahun 1989, yang dimaksud dengan bobot tetap adalah dua kali penimbangan berturut – turut tidak berbeda lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang. Penimbangan dilakukan setelah zat dikeringkan lagi selama satu jam. Hasil susut pengeringan simplisia rimpang kunyit yaitu 10,49% pada replikasi pertama, 11,10% pada replikasi kedua, dan 10,71% pada replikasi ketiga sehingga rata – rata susut pengeringan yang diperoleh pada penelitian ini adalah 10,77%.

Nilai 10,77% yang didapatkan ini menyatakan jumlah maksimal

senyawa yang mudah menguap atau hilang pada proses pengeringan. Hasil susut pengeringan yang diperoleh pada penelitian ini juga sesuai dengan Farmakope Herbal Indonesia edisi I tahun 2008 bahwa susut pengeringan simplisia rimpang kunyit tidak lebih dari 12%. 3.

Penyiapan bahan Rimpang kunyit dalam bentuk simplisia kering tersebut kemudian

diserbuk dengan menggunakan blender. Tujuan dari penyerbukan simplisia kering tersebut adalah untuk memperkecil ukuran partikel sehingga dapat memperluas permukaan. Apabila permukaan partikel tersebut diperluas maka kesempatan untuk kontak antara bahan yang akan diekstraksi dengan cairan penyari akan semakin luas sehingga cairan penyari dapat lebih mudah masuk ke dalam bahan


49

yang akan diekstraksi saat dilakukan maserasi dan penarikan zat oleh cairan penyari dapat maksimal dan efektif. B. Ekstrak Kental Rimpang Kunyit 1.

Ekstraksi Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik zat yang diinginkan dari bahan

dengan menggunakan pelarut yang dapat melarutkan zat yang diinginkan dari komponen tersebut dan menghilangkan zat – zat yang tidak diinginkan. Pemilihan pelarut untuk ekstraksi merupakan dasar yang penting karena pelarut yang digunakan akan mempengaruhi apa yang terkandung dalam ekstrak. Cairan penyari yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 90% v/v. Etanol dipilih sebagai cairan penyari karena etanol dapat melarutkan senyawa – senyawa organik pada bahan alam. Etanol juga dapat menurunkan aktivitas enzim polifenol oksidase yaitu suatu enzim yang dapat mendegradasi senyawa – senyawa polifenol. Selain itu, etanol juga lebih mudah terpenetrasi pada membran seluler sehingga komponen yang terekstraksi akan semakin lebih besar. Metanol tidak dipilih karena metanol bersifat lebih polar dibandingkan dengan etanol, kurang aman, dan kurang ekonomis (Tiwari, et al., 2011). Penelitian ini menggunakan kadar etanol 90% v/v karena kandungan air dapat menjadi media pertumbuhan mikroorganisme akan tetapi air masih tetap dibutuhkan karena berfungsi untuk menarik senyawa – senyawa yang bersifat polar dalam bahan alam yang diduga memiliki aktvitas biologis. Selain itu, etanol 90% v/v juga bersifat mudah menguap sehingga proses pemekatan ekstrak dapat menggunakan suhu yang tidak terlalu panas dan proses pemekatan dapat berjalan lebih cepat.


50

Selain cairan penyari, diperlukan pula pemilihan metode ekstraksi karena apabila menggunakan metode ekstraksi yang kurang tepat dapat menyebabkan degradasi pada bahan alam dan hilangnya kandungan zat aktif pada bahan alam. Terdapat berbagai macam metode ekstraksi seperti sokhletasi, maserasi, infusi, perkolasi, dll. Pada penelitian ini, metode ekstraksi yang dipilih adalah maserasi. Menurut Badan Pengawas Obat dan Makananan Republik Indonesia tahun 2010, apabila penyarian dilakukan dengan campuran cairan penyari air dan etanol maka dilakukan dengan maserasi atau perkolasi. Maserasi lebih dipilih karena metode maserasi memiliki beberapa keuntungan seperti membutuhkan volume cairan penyari yang lebih sedikit, lebih mudah dilakukan, dan peralatan yang dibutuhkan lebih sederhana dibandingkan dengan metode perkolasi. Selain itu, perkolasi tidak dipilih karena bahan harus benar – benar terdistribusi secara homogen pada wadah dan dalam pengemasan bahan pada wadah tidak boleh terlalu padat karena apabila terlalu padat, cairan penyari tidak dapat mencapai seluruh bagian bahan dan proses ekstraksi tidak dapat berjalan sempurna (Sarker, Latif, Gray, 2006). Proses maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruang dan kemudian dilanjutkan dengan proses remaserasi dengan tujuan untuk memaksimalkan proses penyarian senyawa – senyawa yang mungkin belum tersari karena cairan penyari yang sudah mengalami penjenuhan. Tujuan penyaringan pada proses maserasi dan remaserasi untuk memisahkan antara bahan yang tidak terlarut dengan pelarut yang telah berisi zat – zat yang terlarut didalamnya untuk kemudian dilakukan pemekatan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator sehingga akan didapatkan ekstrak kental


51

rimpang kunyit. Bobot ekstrak kental rimpang kunyit yang didapat yaitu 135,4 gram dengan rendemen 14,72%. Pemerian ekstrak kental rimpang kunyit yaitu: warna kuning kecoklatan, bentuk ekstrak kental, bau khas, rasa pahit. 2.

Susut pengeringan ekstrak Hasil susut pengeringan ekstrak rimpang kunyit yaitu 8,81% pada

replikasi pertama, 10,77% pada replikasi kedua, dan 10,77% pada replikasi ketiga sehingga rata – rata susut pengeringan yang diperoleh pada penelitian ini adalah 10,12%.

Nilai 10,12% yang didapatkan ini menyatakan jumlah maksimal

senyawa yang mudah menguap atau hilang pada proses pengeringan. C. Optimasi Fase Gerak Ekstrak Kental Rimpang Kunyit Pemilihan fase gerak dalam analisis dengan metode kromatografi didasarkan pada kemampuannya dalam melarutkan senyawa yang diinginkan sehingga dapat memisahkannya dengan senyawa – senyawa lain. Penelitian ini menggunakan KLT dengan fase diam silika gel 60 F254 sehingga polaritas suatu campuran fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi suatu senyawa yang juga berarti akan menentukan nilai Rf. Pada umumnya, fase gerak berisi campuran satu atau lebih pelarut karena adanya kemungkinan pemisahan yang terjadi lebih baik dari fase gerak yang hanya berisikan satu macam pelarut. Selain itu, komposisi fase gerak yang berbeda dapat memberikan perbedaan interaksi antara senyawa campuran dengan fase gerak dan fase diam. Penelitian ini diawali dengan menggunakan 3 macam komposisi fase gerak yang dipilih berdasarkan perbedaan kepolarannya. Fase gerak pertama adalah fase gerak yang paling polar diantara ketiga fase gerak yang lain yaitu etil


52

asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100 : 11 : 11 : 20 v/v). Hal ini dikarenakan pada fase gerak pertama mengandung asam dan air dalam komposisinya sedangkan pada kedua fase gerak lainnya tidak mengandung asam ataupun air. Fase gerak kedua adalah kloroform : metanol (7 : 3 v/v) yang memiliki sifat semipolar. Fase gerak ketiga adalah n-heksan : etil asetat (2 : 3 v/v) yang bersifat non – polar dibandingkan dengan kedua fase gerak yang lain.

1

2

3

1

1

1

0,5

0,5

0,5

0

0

0

1

2

3

1

2

3

(A) (B) (C) Gambar 3. Hasil optimasi fase gerak pada deteksi UV 254 nm ( 1 = penotolan pertama, 2 = penotolan kedua, 3 = penotolan ketiga). (A) Fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100 : 11 : 11 : 20 v/v). (B ) Fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v). (C) Fase gerak n-heksan : etil asetat (2 : 3 v/v)

Gambar 3A dengan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100 : 11 : 11 : 20 v/v), tidak terjadi pemisahan senyawa karena seluruh sampel terbawa oleh fase gerak. Pada gambar 3B dengan fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v) mulai terlihat terjadinya pemisahan dua senyawa akan tetapi pemisahan yang terjadi tidak sempurna karena kedua senyawa tersebut terlalu berhimpitan. Pada gambar 3C dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (2 : 3 v/v) terlihat pemisahan yang baik tetapi hanya menunjukkan dua bercak.


53

Pemisahan pada ekstrak kunyit seharusnya mengandung lebih dari 2 bercak karena kandungan pada rimpang kunyit sebagian besar adalah kurkuminoid yang tersusun atas bisdemetoksi kurkumin, demetoksi kurkumin, dan kurkumin. Oleh sebab itu, peneliti menambahkan dua komposisi fase gerak yaitu kloroforom : metanol (9 : 1 v/v) dan kloroform : metanol (95 : 5 v/v) untuk melihat adanya kemungkinan bercak lain yang timbul. 1

1

4

3

0,5

0,5

2 1

0

(A)

0

(B)

Gambar 4. Hasil optimasi fase gerak pada deteksi UV 254 nm (A = fase gerak kloroform : metanol (9 : 1 v/v); B = fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v))

Gambar 4 menunjukkan mulai adanya pemisahan 4 senyawa yang belum sempurna pada fase gerak kloroform : metanol (9 : 1 v/v). Pemisahan mulai terlihat sempurna pada fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dimana terlihat 4 zona bercak pada lempeng KLT. Gambar 4B menunjukkan zona bercak pertama hingga ketiga terlihat berwarna kuning dan zona bercak keempat hanya terlihat pada UV 254 nm. Oleh sebab itu, fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) karena menunjukkan pemisahan yang terbaik diantara keempat fase gerak yang lain.


54

D. Identifikasi Golongan Senyawa dengan Reagen Semprot pada Ekstrak Kental Rimpang Kunyit Identifikasi golongan senyawa pada penelitian ini bertujuan untuk melihat adanya kemungkinan golongan senyawa lain selain bisdemetoksi kurkumin, demetoksi kurkumin, dan kurkumin pada kunyit yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, antibakteri, dan UV protection. Proses identifikasi ini menggunakan berbagai macam reagen semprot yang bersifat spesifik terhadap golongan senyawa tertentu. Reagen semprot yang digunakan pada penelitian ini adalah AlCl3 dan sitroborat yang berfungsi untuk mengidentifikasi golongan senyawa flavonoid, FeCl3 yang berfungsi untuk mengidentifikasi golongan senyawa fenolik, Dragendorff yang berfungsi untuk mengidentifikasi golongan senyawa alkaloid, dan vanilin sulfat yang berfungsi untuk mengidentifikasi golongan senyawa terpenoid.

A

1

1

0,5

0,5

0

0

B

1

0,5

0

C

Gambar 5. Ekstrak rimpang kunyit pada deteksi secara fisik (A = secara visual, B = deteksi pada UV 254 nm, C = deteksi pada UV 366 nm)

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 55

A

1

1

0,5

0

B

1

1

0,5

0,5

0,5

0

0

0

C

1

0,5

0

E

D

Gambar 6. Ekstrak rimpang kunyit dengan reagen semprot (A = AlCl3, B = FeCl3, C = Dragendorff, D = sitroborat, E = vanilin sulfat)

Tabel I. Hasil identifikasi golongan senyawa pada ekstrak kental rimpang kunyit

Deteksi dengan reagen Rf

Deteksi pada UV

0,24 – 0,28

254 nm Kuning

0,34 – 0,38

Kuning

0,48 – 0,54 0,74 – 0,78

Kuning Meredam

366 nm Berpendar kuning Berpendar kuning -

AlCl3

FeCl3

Dragendorff

Sitroborat

Vanilin Sulfat

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+ (ungu gelap)

Keterangan : - = tidak terjadi perubahan, + = adanya perubahan

Interpretasi Hasil

Terpenoid


56

Pada tabel I diketahui adanya 4 bercak pada ekstrak rimpang kunyit dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Deteksi pada bercak senyawa dengan Rf 0,74 – 0,78 diawali dengan deteksi secara fisik yaitu pada UV 254 nm dan 366 nm. Hasil yang diperoleh pada deteksi UV 254 nm adalah adanya peredaman pada Rf 0,74 – 0,78. Pada UV 366 nm tidak ada yang berpendar pada Rf 0,74 – 0,78. Ketika sampel ekstrak rimpang kunyit disemprot dengan vanilin sulfat dan dilakukan pemanasan pada suhu 105

terbentuk warna ungu pada Rf 0,74 –

0,78. Vanilin sulfat merupakan reagen yang berfungsi untuk mengidentifikasi golongan senyawa terpenoid. Hasil positif adanya golongan senyawa terpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu dengan menggunakan reagen vanilin sulfat setelah pemanasan (Taganna, Quanico, Perono, Amor, Rivera, 2011). Berdasarkan hal tersebut, maka bercak senyawa pada Rf 0,74 – 0,78 merupakan golongan senyawa terpenoid karena menunjukkan hasil positif. Menurut Wagner dan Bladt (1984) senyawa terpenoid dapat dideteksi dengan pereaksi vanilin asam sulfat dengan mekanisme abstraksi H+ sehingga terbentuk senyawa yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi. Ikatan rangkap dua pada struktur kimia terpenoid memiliki spektrum serapan pada sinar ultraviolet dan sinar visibel, sehingga ketika dideteksi pada daerah cahaya tampak terlihat berwarna violet. Senyawa disebut positif pada AlCl3 apabila terbentuk fluorosensi kuning ketika dideteksi pada sinar UV 366 nm. Terbentuknya fluorosensi kuning tersebut mengindikasikan bahwa senyawa tersebut merupakan golongan senyawa


57

flavonoid (Jork, Funk, Fischer, Himmer, 1990). Bercak senyawa pada Rf 0,74 – 0,78 tidak menunjukkan fluorosensi kuning pada UV 366 nm setelah disemprot dengan AlCl3 yang berarti bahwa bercak senyawa tersebut bukan golongan senyawa flavonoid. Golongan senyawa flavonoid juga ditunjukkan dengan reaksi positif pada reagen sitroborat dengan terbentuknya fluorosensi hijau kuning pada lampu UV 366 nm (Alam, Mufidah, Massi, Kurnia, Rahim, Usmar, 2012). Bercak senyawa pada Rf 0,74 – 0,78 tidak membentuk warna kuning setelah disemprot dengan sitroborat, sehingga menunjukkan hasil negatif pada reagen sitroborat. Hasil negatif tersebut semakin memperkuat bahwa bercak senyawa pada Rf 0,74 – 0,78 bukan golongan senyawa flavonoid. Senyawa disebut positif pada FeCl3 apabila terbentuk warna biru kehijauan. Terbentuknya warna tersebut mengindikasikan bahwa suatu senyawa merupakan golongan senyawa fenolik (Robinson, 1991). Bercak senyawa pada Rf 0,74 – 0,78 setelah disemprot reagen FeCl3 tidak terbentuk warna biru kehijauan. Hal ini menunjukkan bahwa bercak senyawa pada Rf 0,74 – 0,78 bukan golongan senyawa fenolik. Hasil positif pada reagen Dragendorff ditunjukkan dengan terbentuknya warna jingga apabila dilihat secara visual. Suatu senyawa yang menunjukkan hasil positif

terhadap

Dragendorff

mengindikasikan

bahwa

senyawa

tersebut

merupakan golongan senyawa alkaloid (Alam, et al.,2012). Bercak senyawa pada Rf 0,74 – 0,78 tidak membentuk warna jingga secara visual setelah disemprot dengan reagen Dragendorff. Hal tersebut mengindikasikan bahwa bercak senyawa


58

Rf 0,74 – 0,78 bukan golongan senyawa alkaloid karena menunjukkan hasil negatif. Berdasarkan

penelitian

Azizah

dan

Salamah

(2013)

dengan

menggunakan fase gerak yang sama, maka hasil bercak pada nilai Rf 0,24 – 0,28 tersebut diidentifikasi sebagai bisdemetoksi kurkumin, bercak pada nilai Rf 0,34 – 0,38 diidentifikasi sebagai demetoksi kurkumin, dan bercak pada nilai Rf 0,48 – 0,54 diidentifikasi sebagai kurkumin. Hal ini diperkuat dengan dilakukan perbandingan antara ekstrak rimpang kunyit yang didapat peneliti dengan standar kurkumin dalam penelitian ini. 1

0,5

0

A

B

Gambar 7. Perbandingan nilai Rf antara (A) standar kurkumin dan (B) ekstrak rimpang kunyit dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Hasil tersebut menunjukkan bahwa nilai Rf standar kurkumin juga berada pada rentang 0,48 – 0,54, sehingga dapat disimpulkan bahwa bercak pada Rf 0,48 – 0,54 yang didapatkan pada penelitian ini merupakan senyawa kurkumin. E. Uji Aktivitas Penangkap Radikal Bebas DPPH, Antibakteri, dan UV Protection pada Ekstrak Kental Rimpang Kunyit 1.

Uji aktivitas penangkap radikal bebas Uji aktivitas penangkap radikal bebas dilakukan secara kualitatif dengan

cara menyemprot radikal bebas DPPH pada lempeng KLT hasil elusi. Tujuan dari


59

uji ini adalah untuk mengetahui lokasi senyawa yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas. Hasil positif adanya daya penangkap radikal bebas DPPH ditunjukkan dengan terbentuknya bercak berwarna putih hingga kuning dengan latar belakang ungu. Senyawa DPPH merupakan radikal bebas yang stabil karena adanya delokalisasi elektron pada molekulnya. Adanya delokalisasi ini membuat DPPH berwarna ungu. Perubahan warna DPPH dari ungu tersebut dapat terjadi apabila adanya suatu senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen terhadap radikal bebas DPPH. Reaksi utama DPPH dimana DPPH adalah Z• dan donor molekul adalah AH, yaitu: Z• + AH = ZH + A• (Kedare dan Singh, 2011). 1

1

0,5

0,5

0

A

B (1)

C

0

A

B

C

(2)

Gambar 8. Hasil uji kualitatif penangkap radikal bebas DPPH (1 = setelah 1,5 jam penyemprotan DPPH, 2 = setelah 6 jam penyemprotan DPPH). (A) Standar kurkumin. (B) Ekstrak kunyit dengan 6 totolan. (C) Ekstrak kunyit dengan 8 totolan

Hasil pengujian yang didapatkan bahwa senyawa dengan Rf 0,74 – 0,78 pada ekstrak rimpang kunyit memiliki daya aktivitas sebagai penangkap radikal bebas. Bercak mulai terlihat putih setelah 1,5 jam penyemprotan dan warna putih


60

mulai terlihat jelas setelah 6 jam penyemprotan DPPH. Senyawa tersebut berdasarkan hasil identifikasi golongan senyawa merupakan golongan terpenoid. Adanya donor atom hidrogen pada golongan senyawa terpenoid bila direaksikan dengan radikal bebas DPPH akan menghilangkan delokalisasi elektron pada radikal bebas DPPH. 2.

Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak Tujuan dilakukan uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi

kontak adalah untuk mengetahui secara langsung lokasi senyawa antibakteri yang ditentukan berdasarkan nilai Rf pada kromatografi lapis tipis. Hasil positif adanya aktivitas antibakteri pada metode ini ditunjukkan dengan munculnya zona hambat pertumbuhan bakteri pada daerah bercak yang mengandung senyawa antibakteri. Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah S. aureus yang merupakan bakteri Gram positif dan E. coli yang merupakan bakteri Gram negatif. Staphylococcus aureus adalah flora normal pada mulut, saluran pernapasan atas, usus besar, dan kulit pada manusia. Bakteri ini sangat jarang menimbulkan penyakit apabila seseorang dalam keadaan sehat dan dalam jumlah normal. Apabila kekebalan tubuh melemah, maka keberadaan bakteri ini dapat menimbulkan beberapa kondisi yang tidak normal seperti munculnya jerawat, radang paru (pneumonia), radang selaput otak (meningitis), dan radang sendi (arthritis). Sebagian besar penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini akan memproduksi nanah sehingga sering disebut “piogenik” (Utami, 2012). Jerawat yang ditimbulkan tentu menjadi masalah bagi tiap orang terutama kaum wanita, karena dianggap mengganggu penampilan. Oleh sebab itu, kosmetik tradisional


61

juga mengindikasikan adanya kandungan yang bersifat antibakteri untuk dapat menghilangkan jerawat tersebut, salah satu komposisi tanaman yang terdapat pada kosmetik tradisional tersebut adalah kunyit. Escherichia coli merupakan flora normal dalam tubuh manusia. Akan tetapi apabila jumlahnya

melebihi normal, E. coli juga dapat menyebabkan

infeksi pada kulit seperti selulitis pada bagian atas maupun bawah tungkai, infeksi pada luka setelah operasi, infeksi pada luka bakar, dll (Petkovsek, Elersic, Gubina, Bertok, Erjavec, 2009). Kadar larutan ekstrak rimpang kunyit pada metode bioautografi kontak adalah 5 mg/ mL. Setelah dilakukan elusi dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v), lempeng KLT dibiarkan mengering secara aseptis karena pelarut kloroform dan metanol diketahui memiliki daya antibakteri sehingga dapat mengganggu hasil pengamatan. Kontak antara lempeng KLT dan media agar yang telah berisi bakteri dilakukan selama 40 menit dengan tujuan supaya terjadi pemindahan senyawa pada lapisan KLT secara difusi sehingga akan memunculkan zona hambat pada pertumbuhan bakteri uji pada zona bercak yang memiliki aktivitas antibakteri.


µg

µg

62

250 µg 200 µg Rf 0,74-0,78 Rf 0,48-0,54 Rf 0,34-0,38

(a) (b) Gambar 9. Hasil uji antibakteri dengan bioautografi kontak. (a) Ekstrak kunyit terhadap E. coli dengan mass loading 250 µg dan 200 µg. (b) Ekstrak kunyit terhadap S. aureus dengan mass loading 250 µg dan 200 µg

Tabel II. Kisaran nilai Rf ekstrak kunyit dengan metode bioautografi kontak

Mass loading

150 µg

200 µg

250 µg

Kisaran nilai Rf 0,24 – 0,28 0,34 – 0,38 0,48 – 0,54 0,74 – 0,78 0,24 – 0,28 0,34 – 0,38 0,48 – 0,54 0,74 – 0,78 0,24 – 0,28 0,34 – 0,38 0,48 – 0,54 0,74 – 0,78

Bakteri uji E. coli -

S. aureus + + + + + + +

Keterangan: - = tidak ada daya antibakteri, + = ada daya antibakteri

Pada awalnya mass loading ekstrak kunyit yang ditotolkan adalah 75 µg, 100 µg, dan 150 µg. Namun mass loading tersebut tidak memberikan bercak yang menimbulkan zona hambat pada pertumbuhan kedua bakteri uji. Oleh sebab itu, mass loading ekstrak kunyit ditingkatkan menjadi 200 µg dan 250 µg. Berdasarkan gambar 9, hasil kromatografi ekstrak rimpang kunyit dengan mass loading 200 µg dan 250 µg tidak menunjukkan adanya zona bercak yang


63

menghambat pertumbuhan bakteri E. coli. Hal ini berarti bahwa ekstrak rimpang kunyit tidak memiliki aktivitas antibakteri pada bakteri E. coli. Pada hasil kromatografi ekstrak rimpang kunyit terhadap bakteri S. aureus dengan mass loading 200 µg sudah mulai menunjukkan adanya zona bercak yang menghambat pertumbuhan bakteri tersebut seperti data yang ditunjukkan pada tabel 2. Oleh sebab itu, dapat disimpulkan bahwa senyawa Rf 0,74 – 0,78 memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. aureus yang pada tahap langkah selanjutnya merupakan target isolasi senyawa pada penelitian ini. Terbentuknya zona hambat pada S. aureus (Gram positif) sedangkan pada bakteri E. coli (Gram negatif) tidak, disebabkan karena terdapat perbedaan struktur dan komposisi dinding sel antara bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif. Struktur komposisi dinding sel bakteri Gram positif lebih sederhana dengan kandungan lipid yang rendah yaitu 1 – 4% sedangkan pada dinding sel bakteri Gram negatif tersusun dari tiga lapis sel yaitu lapisan luar lipoprotein, lapisan tengah lipopolisakarida, dan lapisan dalam berupa peptidoglikan dengan kandungan lipid lebih tinggi yaitu 11 – 22% sehingga hal ini memungkinkan penetrasi zat aktif ekstrak menjadi lebih sulit pada bakteri Gram negatif (Jawetz, Melnick, Adelberg, 2005). Berdasarkan penelitian Helen, Prinitha, Sree, Abisha, dan Jacob, 2012, rimpang kunyit mampu menghambat bakteri S. aureus dan E. coli, sedangkan pada penelitian ini tidak didapatkan aktivitas antibakteri pada bakteri E. coli. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya kemungkinan bahan rimpang kunyit yang diperoleh berbeda sehingga kandungan kimia pada rimpang kunyit juga dapat


64

berbeda, yaitu pada penelitian Helen, et al., 2012 bahan rimpang kunyit diperoleh dari hutan Bonacaud sedangkan pada penelitian ini bahan rimpang kunyit diperoleh dari B2P2TOOT Tawangmangu. Selain itu, pada penelitian Helen, et al., 2012, proses ekstraksi menggunakan pelarut metanol, aseton, dan n-heksan yang disentrifugasi yang kemudian diambil bagian supernatannya serta menggunakan minyak atsiri dari rimpang kunyit yang diperoleh dengan cara distilasi. Pada penelitian ini proses ekstraksi menggunakan pelarut etanol 90% v/v dengan cara maserasi. Perbedaan cairan penyari dan metode ekstraksi yang digunakan juga dapat mempengaruhi aktivitas antibakteri karena adanya perbedaan zat – zat yang tersari pada cairan penyari. Telah diketahui bahwa senyawa dengan Rf 0,74 – 0,78 tersebut merupakan golongan terpenoid. Target terpenoid adalah pada membran sel bakteri atau peptidoglikan sehingga dapat menghambat terjadinya proses transport elektron, translokasi protein, dll. Terpenoid dapat membentuk ikatan dengan membran sel atau peptidoglikan tersebut sehingga dapat merusak membran sel tersebut yang dapat mengurangi permeabilitas membran sel. Oleh sebab itu bakteri dapat kekurangan nutrisi, sehingga pertumbuhan bakteri akan terhambat atau mati (Zengin, Baysal, 2014). Kontrol yang digunakan pada penelitian ini ada 3, yaitu kontrol media, kontrol perumbuhan bakteri uji, dan kontrol positif dengan menggunakan amoksisilin. Kontrol media bertujuan untuk mengetahui bahwa media yang digunakan tidak terkontaminasi oleh apapun yang dapat mengacaukan pengamatan hasil dan keaseptisan dalam bekerja. Hasil kontrol media setelah


65

inkubasi yang didapatkan adalah media jernih yang berarti bahwa media yang dibuat tidak terkontaminasi dan proses penelitian berlangsung dengan aseptis (Gambar 10).

Gambar 10. Kontrol media

Kontrol pertumbuhan bakteri uji pada penelitian ini ada 2, yaitu kontrol pertumbuhan bakteri E. coli dan kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus. Tujuan pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji adalah untuk mengetahui bahwa bakteri uji dapat tumbuh pada media yang digunakan. Hal tersebut ditandai dengan penampakan media yang keruh. Hasil yang didapat baik pada kontrol pertumbuhan bakteri E. coli maupun pada kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus adalah media menjadi keruh apabila dibandingkan dengan kontrol media yang berarti bahwa bakteri uji dapat tumbuh pada media tersebut (Gambar 11).


(A)

66

(B)

Gambar 11. Hasil kontrol pertumbuhan bakteri (A) bakteri E. coli dan (B) bakteri S. aureus

Kontrol positif yang digunakan yaitu amoksisilin dengan konsentrasi 5 mg/ mL yang ditotolkan dengan mass loading 75 µg, 100 µg, dan 150 µg. Kontrol positif dilakukan untuk mengetahui bahwa dengan mass loading tersebut sudah mampu untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Hasil yang didapat, baik pada bakteri E. coli maupun S. aureus terbentuk zona jernih yang berarti dengan mass loading 75 µg, 100 µg, dan 150 µg tersebut sudah mampu untuk menghambat pertumbuhan kedua bakteri tersebut (Gambar 12).

2

3

1

3

1

2 (A) (B) Gambar 12. Hasil kontrol positif amoksisilin. (A) Pada bakteri S. aureus (1 = mass loading 75 µg, 2 = mass loading 100 µg, 3 = mass loading 150 µg). (B) Pada bakteri E. coli (1 = mass loading 75 µg, 2 = mass loading 100 µg, 3 = mass loading 150 µg)


67

Kontrol positif juga sebagai pembanding besarnya daya hambat yang ditimbulkan oleh bercak pada ekstrak rimpang kunyit. Berdasarkan hasil yang didapat, ekstrak rimpang kunyit dengan mass loading 75 µg, 100 µg, dan 150 µg belum menimbulkan zona hambat. Zona hambat baru ditimbulkan dengan mass loading 200 µg sehingga dapat disimpulkan bahwa daya antibakteri hasil elusi ekstrak rimpang kunyit lebih kecil dibandingkan dengan amoksilin sebagai kontrol positif. Tujuan menggunakan kadar amoksisilin 5 mg/ mL adalah untuk menyamakan kadar larutan ekstrak rimpang kunyit yang digunakan yaitu 5 mg/ mL. 3.

Uji aktivitas UV protection dengan metode inhibition of bleaching of

-

carotene Radiasi sinar ultraviolet utama pada manusia berasal dari matahari yang terdiri atas berbagai macam panjang gelombang yang secara keseluruhan radiasi tersebut berbahaya bagi kulit. Radiasi sinar ultraviolet pada matahari dibagi menjadi 3 macam berdasarkan panjang gelombangnya, yaitu UV A dengan panjang gelombang 320 – 400 nm, UV B dengan panjang gelombang 280 – 320 nm, dan UV C dengan panjang gelombang 200 – 280 nm. Sebagian besar radiasi ultraviolet yang sampai ke permukaan bumi adalah UV A. Sinar ultraviolet A dapat terpenetrasi lebih masuk ke dalam kulit dibandingkan dengan UV B, akan tetapi UV B bersifat lebih genotoksik dan membentuk radikal bebas pada kulit dibandingkan dengan UV A. Sinar ultraviolet C merupakan radiasi sinar ultraviolet dari matahari yang paling membahayakan dibandingkan yang lain,


68

akan tetapi dengan adanya lapisan ozon pada atmosfer bumi membuat UV C tidak terserap sampai pada permukaan bumi (Balakrishnan, et al., 2011). Berdasarkan hal tersebut, maka banyak produsen yang memproduksi kosmetik tabir surya bahkan kosmetik tradisional pun tidak luput dari indikasi mampu melindungi kulit dari radiasi sinar ultraviolet dengan mengandung komposisi tanaman yang diduga memiliki efek aktivitas tersebut. Komposisi tanaman yang digunakan tersebut belum diketahui secara pasti senyawa aktif yang memiliki daya sebagai UV protection sehingga pada penelitian ini, uji UV protection menggunakan metode inhibiton of bleaching of

-carotene dengan

tujuan dapat mengetahui lokasi senyawa yang memiliki daya sebagai UV protection. Suatu senyawa diidentifikasi memiliki kemampuan sebagai UV protection apabila mampu menghambat pemudaran warna kuning dari

-carotene

ketika terkena radiasi sinar ultraviolet. Lempeng KLT yang telah dielusi dicelup dengan

-carotene dengan

tujuan untuk mengetahui lokasi zona bercak yang dapat mempertahankan warna dari

-carotene. Radiasi sinar ultraviolet dilakukan pada lampu UV dengan

intensitas cahaya yang terukur. Sumber sinar radiasi ultraviolet tidak menggunakan cahaya matahari langsung karena intensitas cahaya yang dihasilkan matahari bersifat tidak konstan dan apabila

-carotene terpapar cahaya matahari

secara langsung maka pemudaran warna terjadi sangat cepat sehingga menyulitkan dalam pengamatan. Indikator warna pada penelitian ini dibutuhkan sebagai parameter pemudaran warna dari -carotene. Indikator warna dibuat dari skala 0 – 7 dengan


69

perubahan warna dari kuning hingga putih berdasarkan degradasi warna yang tersedia pada aplikasi Corel (lampiran 10). Pembuatan indikator warna tersebut dilakukan karena ketiadaan standar perubahan warna pada

-carotene sehingga

dengan adanya indikator warna tersebut memudahkan untuk mengamati adanya zona bercak yang mampu menahan warna

-carotene apabila dibandingkan

dengan latar lempeng KLT. Selain indikator warna juga diperlukan optimasi intensitas cahaya pada -carotene tidak berlangsung terlalu cepat

metode ini supaya pemudaran warna

sehingga pengamatan dapat lebih mudah dilakukan. Optimasi intensitas cahaya dilakukan dengan cara mengatur ketinggian lampu dari dasar. Hal yang diukur pada optimasi ini adalah pemudaran warna pada latar lempeng KLT kosong yang telah dicelup -carotene. Perubahan Warna terhadap Waktu 7

Indikator ke -

6 5

Intensitas cahaya rendah

4 3

Intensitas cahaya sedang

2

Intensitas cahaya tinggi

1 0 0

1

3

6

9

12

15

Waktu (menit)

Gambar 13. Kurva optimasi intensitas cahaya

Berdasarkan gambar 13, intensitas cahaya yang digunakan pada peneltian ini adalah intensitas cahaya sedang yaitu 15,01 lux dengan ketinggian lampu


70

ultraviolet dari dasar adalah 50 cm. Intensitas cahaya rendah yaitu 5,895 lux dengan ketinggian lampu ultraviolet dari dasar 100 cm tidak dipilih karena pada menit ke – 12 hingga ke – 15 warna

-carotene belum mencapai kestabilan

dengan standar variasi pada menit ke – 15 yang masih besar dibandingkan dengan dua intensitas yang lain yaitu 0,55. Apabila pemudaran warna -carotene belum mencapai stabil, maka akan ada kemungkinan bahwa reaksi yang terjadi belum berjalan sempurna. Oleh sebab itu, apabila intensitas cahaya yang dipilih adalah intensitas cahaya rendah, maka waktu pengamatan akan menjadi lebih lama. Intensitas tinggi yaitu 30,48 lux dengan ketinggian lampu ultraviolet dari dasar 35 cm juga tidak dipilih karena pemudaran warna -carotene berlangsung cepat yaitu pada menit ke – 6 warna -carotene sudah stabil. Hal ini akan menyulitkan ketika melakukan pengamatan. Oleh sebab itu, peneliti memilih intensitas cahaya yang dipilih adalah intensitas cahaya sedang dengan ketinggian lampu ultraviolet dari dasar adalah 50 cm dan intensitas cahaya yang diperoleh 15,01 lux karena perubahan warna -carotene cenderung lambat dengan ditandai kestabilan warna dimulai pada menit ke – 12. Uji aktivitas UV protection pada ekstrak rimpang kunyit dilakukan dengan ketinggian lampu 50 cm dari dasar dan intensitas cahaya 15,81 lux. Pada lempeng KLT hasil elusi, 3 zona bercak warna kuning telah muncul sebelum dicelup -carotene yaitu pada nilai Rf 0,24 – 0,28; Rf 0,34 – 0,38; dan pada Rf 0,48 – 0,54. Ketiga zona bercak ini telah diidentifikasi sebelumnya merupakan bisdemetoksi kurkumin, demetoksi kurkumin, dan kurkumin. Akan tetapi pada


71

penelitian ini, bertujuan untuk mencari adanya zona bercak lain selain ketiga Rf tersebut yang mampu mempertahankan warna -carotene. Tabel III. Hasil uji aktivitas UV protection ekstrak rimpang kunyit

Replikasi ke -

Rf bercak aktif

1 2 3 4 5

0,74 – 0,78 0,74 – 0,78 0,74 – 0,78 0,74 – 0,78 0,74 – 0,78

9 + + -

Menit ke 12 + + + + +

15 + + + + +

Keterangan : - = tidak memiliki aktivitas, + = memiliki aktivitas

Berdasarkan tabel III, zona bercak dengan warna lebih kuning dibandingkan warna latar pada lempeng KLT mulai terlihat pada menit ke – 9 pada replikasi 2 dan 3, sedangkan pada replikasi 1, 4, dan 5 zona bercak tersebut mulai terlihat pada menit ke – 12. Hal ini dapat terjadi karena metode -carotene bersifat subyektif, yang merupakan salah satu kekurangan dari metode ini. Walaupun bersifat subyektif tetapi metode ini tetap digunakan karena memiliki beberapa kelebihan yaitu alat yang digunakan sederhana, cepat, ekonomis, dan dapat diketahui lokasi bercak senyawa yang memiliki aktivitas secara langsung. Apabila diketahui lokasi bercak senyawa yang memiliki aktivitas, maka dapat lebih mudah dalam melakukan isolasi senyawa. Kisaran nilai Rf bercak yang memiliki aktivitas UV protection tersebut adalah 0,74 – 0,78 yang merupakan golongan terpenoid berdasarkan hasil identifikasi golongan senyawa yang telah dilakukan sebelumnya. Hal ini tidak berarti bahwa bisdemetoksi kurkumin, demetoksi kurkumin, dan kurkumin tidak memiliki aktivitas UV protection. Hanya saja pengamatan


72

perubahan warna pada ketiga senyawa tersebut tidak dilakukan pada penelitian ini. F. Isolasi Senyawa yang Memiliki Aktivitas Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection Berdasarkan hasil uji kualitatif secara KLT yang telah dilakukan sebelumnya, ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection pada kisaran nilai Rf 0,74 – 0,78. Oleh sebab itu, senyawa tersebut yang akan diisolasi pada penelitian ini. Proses isolasi senyawa diawali dengan melakukan triturasi yang bertujuan untuk meminimalkan kandungan kurkuminoid dari ekstrak rimpang kunyit sehingga diharapkan akan memperoleh senyawa dengan nilai Rf 0,74 – 0,78.

A

B

C

A

B

C

A

B

C

(1) (2) (3) Gambar 14. Perbandingan profil KLT (1) secara visual, (2) UV 254 nm, dan (3) UV 366 nm. (A) Ekstrak rimpang kunyit. (B) Hasil triturasi dengan pelarut nheksan. (C) Hasil triturasi dengan pelarut kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Gambar 14 menunjukkan bahwa triturasi dengan pelarut n-heksan hanya melarutkan senyawa yang memiliki Rf 0,74 – 0,78 dan mampu membersihkan kurkuminoid. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa dengan Rf 0,74 – 0,78 cenderung bersifar non – polar karena larut dengan pelarut n-heksan. Bobot hasil


73

triturasi n-heksan yang diperoleh yaitu 0,818 gram dengan perolehan rendemen 8,37%, sedangkan bobot hasil triturasi dengan kloroform : metanol (95 : 5 v/v) yaitu 2,576 gram dengan perolehan rendemen 26,35%. Tahap selanjutnya dilakukan kromatografi kolom dengan metode elusi step – gradient chromatography yang diawali dengan pemilihan fase gerak yang tepat supaya dapat melarutkan senyawa yang diinginkan. Pemilihan fase gerak dilakukan secara KLT berdasarkan perbedaan polaritasnya. 1

1

0

A

B

0

1

1

0

0

C

D

Gambar 15. Perbandingan profil KLT pada UV 254 nm (A = fase gerak nheksan : kloroform (50 : 50 v/v), B = fase gerak yang digunakan n-heksan : kloroform (25:75 v/v), C = fase gerak yang digunakan kloroform, D = fase gerak yang digunakan kloroform : metanol (98:2 v/v))

A

1

0

B

1

0

C

D

1

0

1

0

Gambar 16. Perbandingan profil KLT pada UV 366 nm (A = fase gerak nheksan : kloroform (50 : 50 v/v), B = fase gerak yang digunakan n-heksan : kloroform (25:75 v/v), C = fase gerak yang digunakan kloroform, D = fase gerak yang digunakan kloroform : metanol (98:2 v/v))


74

Berdasarkan gambar 15 dan gambar 16, apabila pelarut semakin bersifat non – polar, maka perbedaan nilai Rf antara kurkuminoid dengan senyawa yang memiliki Rf 0,74 – 0,78 semakin jauh tetapi apabila sifat kepolaran pelarut ditingkatkan maka kurkuminoid akan semakin mendekati senyawa yang akan diisolasi. Hal tersebut dapat dilihat pada profil KLT dengan deteksi UV 366 nm, dimana terjadi peningkatan nilai Rf pada kurkuminoid. Berdasarkan hasil dengan deteksi UV 366 nm tersebut juga dapat mengartikan bahwa kurkuminoid memiliki sifat lebih polar apabila dibandingkan dengan senyawa yang memiliki kisaran nilai Rf 0,74 – 0,78 sehingga kurkuminoid akan terbawa oleh fase gerak yang cenderung lebih polar. Oleh sebab itu, pada penelitian ini dipilih pelarut n-heksan : kloroform (75 : 25 v/v) dan n-heksan : kloroform (50 : 50 v/v) untuk kromatografi kolom karena mampu memisahkan antara senyawa yang diinginkan dari kurkuminoid dalam ekstrak rimpang kunyit yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, antibakteri, dan UV protection. Teknik memasukkan sampel pada kromatografi kolom ini adalah cara kering karena sampel dicampur dengan fase diam dan didiamkan hingga mengering sebelum dimasukkan pada kolom kromatografi. Teknik ini dipilih karena lebih mudah dilakukan apabila dibandingkan dengan cara basah yaitu sampel dilarutkan pada fase gerak terlebih dahulu dan kemudian dimasukkan pada kolom yang telah terbasahi oleh fase gerak hingga batas fase diam. Tabel IV. Profil KLT isolasi senyawa dengan fase gerak kloroform Isolat 1 2

Rf 0,67 0,57

Tabung ke 1 – 5 pada putaran pertama dan 1 -2 pada putaran kedua 7 – 8 pada putaran pertama dan 5 – 7 pada putaran kedua


75

Profil KLT hasil isolasi senyawa dengan kromatografi kolom tersebut diperlukan untuk mengetahui pola bercak yang sama pada tiap hasil tampungan yang diwadahi dalam tabung sehingga kandungan tabung – tabung tersebut dapat digabungkan. Hasil isolasi dengan pola bercak yang sama yang ditandai dengan nilai Rf yang sama. Kromatografi kolom hasil triturasi n-heksan menghasilkan 2 isolat yaitu pada isolat pertama diperoleh bobot isolat 0,1412 gram dengan rendemen 47,53%, sedangkan isolat kedua memiliki bobot 0,0173 gram dengan rendemen 5,82%. Ekstrak rimpang kunyit

Triturasi dengan pelarut n-heksan

Triturasi dengan kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Hasil triturasi n-heksan 0,818 gram

Hasil triturasi kloroform : metanol (95 : 5 v/v) 2,576 gram

Optimasi fase gerak Pencampuran dengan silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) Kromatografi kolom Fase gerak n-heksan : kloroform (75 : 25 v/v) Fase gerak n-heksan : kloroform (50 : 50 v/v) Isolat 1 0,1412 gram

Isolat 2 0,0173 gram

Gambar 17. Alur isolasi senyawa aktif ekstrak rimpang kunyit


76

G. Aktivitas Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection pada Isolat 1.

Aktivitas penangkap radikal bebas DPPH pada isolat Dua isolat hasil kromatografi kolom tersebut diuji untuk mengetahui

isolat yang berperan sebagai penangkap radikal bebas pada ekstrak rimpang kunyit. Isolat 1

K

Isolat 2

A

B

C

K

A

B

C

Gambar 18. Hasil uji kualitatif penangkap radikal bebas pada isolat setelah 2 jam penyemprotan. (K) Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 47 µg). (A) Isolat dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 10 µg). (B) Isolat dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 20 µg). (C) Isolat dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 30 µg)

Berdasarkan gambar 18, kedua isolat dan ekstrak baru menunjukkan aktivitas sebagai penangkap radikal bebas DPPH setelah 2 jam penyemprotan DPPH. Isolat kedua lebih memiliki daya aktivitas antioksidan dibanding isolat pertama karena pada mass loading 10 µg sudah menunjukkan aktivitas sebagai penangkap radikal bebas DPPH dan pada mass loading 30 µg isolat kedua menunjukkan ketebalan bercak yang hampir setara dengan ekstrak. Isolat pertama baru menunjukkan aktivitas sebagai penangkap radikal bebas DPPH pada mass loading 30 µg dan bercak yang ditimbulkan lebih tipis apabila dibandingkan isolat kedua pada mass loading 10 µg. Berdasarkan hasil tersebut maka dapat


77

disimpulkan bahwa isolat kedua lebih poten sebagai penangkap radikal bebas dibandingkan isolat pertama pada ekstrak rimpang kunyit. Aktivitas penangkap radikal bebas pada ekstrak baru terlihat setelah 2 jam sedangkan pada uji sebelumnya aktivitas terlihat setelah 1,5 jam. Hal ini dapat terjadi karena volume penotolan yang berbeda. Pada tahap sebelumnya volume penotolan lebih banyak karena penotolan dilakukan dengan mikrokapiler sedangkan pada uji ini volume penotolan terukur yaitu 10 µL. Volume penotolan yang berbeda tersebut mengakibatkan mass loading yang terkandung menjadi berbeda pula sehingga akan mempengaruhi waktu yang dibutuhkan ekstrak rimpang kunyit untuk menangkap radikal bebas DPPH. 2.

Aktivitas antibakteri pada isolat Pengujian aktivitas antibakteri dilanjutkan dengan metode Kirby – Bauer,

yaitu metode difusi paper disc. Pengujian aktivitas ini bertujuan untuk mengetahui isolat yang memiliki daya aktivitas antibakteri. Dua isolat yang didapatkan tersebut merupakan senyawa dengan Rf 0,74 – 0,78 yang menunjukkan adanya zona hambat pada pertumbuhan bakteri S. aureus dengan metode bioautografi kontak. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan kedua isolat tersebut merupakan campuran antara n-heksan : kloroform (75 : 25 v/v) untuk isolat pertama dan n-heksan : kloroform (50 : 50 v/v). Kloroform dan nheksan merupakan senyawa yang memiliki daya antibakteri, sehingga dapat membiaskan hasil. Oleh sebab itu, untuk mencegah terjadinya hal tersebut maka setelah dilakukan penotolan, paper disc yang berisi larutan isolat tersebut dikeringkan pada cawan petri steril secara aseptis dengan tujuan untuk


78

menghilangkan pelarut sehingga yang tersisa pada paper disc adalah mass loading. Pengujian ini hanya dilakukan pada bakteri S. aureus karena berdasarkan hasil dari metode bioautografi kontak bahwa bercak pada Rf 0,74 – 0,78 hanya memiliki aktivitas antibakteri pada bakteri S. aureus dan tidak memiliki aktivitas antibakteri pada bakteri E. coli.

(a) (b) Gambar 19. Hasil uji antibakteri. (a) Isolat pertama 200 µg. (b) Isolat kedua 200 µg

Isolat pertama pada mass loading 50 µg , 100 µg , dan 200 µg tidak menunjukkan adanya aktivitas antibakteri pada bakteri S. aureus. Hal tersebut ditunjukkan pada gambar 19 bahwa isolat pertama pada mass loading terbesar yaitu 200 µg tidak menimbulkan adanya zona hambat pertumbuhan bakteri S. aureus. Isolat kedua pada mass loading 50 µg dan 100 µg juga tidak menunjukkan adanya aktivitas antibakteri pada bakteri S. aureus. Adanya aktivitas antibakteri baru ditunjukkan oleh isolat kedua dengan mass loading 200 µg yaitu terlihat adanya zona hambat pertumbuhan bakteri S. aureus pada gambar 19. Rata – rata diameter zona hambat pada isolat kedua dengan mass loading 200 µg adalah 8,3 ± 0,58 mm.


79

Pada metode bioautografi kontak terlihat adanya aktivitas antibakteri, sedangkan setelah senyawa tersebut diisolasi menjadi dua isolat, aktivitas antibakteri hanya ditunjukkan oleh isolat kedua dengan mass loading 200 µg. Hal ini dimungkinkan bahwa aktivitas antibakteri baru dapat ditunjukkan apabila kedua isolat menjadi satu – kesatuan seperti yang dilakukan pada metode bioautografi kontak. Kemungkinan kedua adalah bahwa menurut Rosner dan Aviv (cit., Sudirman, 2005) metode bioautografi lebih sensitif dibandingkan metode paper disc sehingga pada metode bioautgrafi dihasilkan zona hambat pertumbuhan bakteri uji sedangkan pada metode paper disc hanya dihasilkan zona hambat yang kecil atau tidak sama sekali. Kontrol yang dilakukan pada metode ini juga ada 3 yaitu kontrol media, kontrol pertumbuhan bakteri uji, dan kontrol positif. Gambar 20 menunjukkan bahwa media yang digunakan tetap jernih setelah inkubasi yang berarti media yang digunakan tidak terkontaminasi dan proses penelitian berlangsung dengan aseptis.

Gambar 20. Kontrol media

Kontrol pertumbuhan bakteri uji pada metode ini hanya kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus karena bakteri yang digunakan pada metode ini


80

hanya S. aureus. Gambar 21 menunjukkan bahwa media menjadi keruh apabila dibandingkan dengan kontrol media yang berarti bahwa bakteri S. aureus dapat tumbuh pada media yang digunakan.

Gambar 21. Kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus

Kontrol positif menggunakan amoksisilin terhadap pertumbuhan S. aureus dengan konsentrasi 1 mg/ mL karena konsentrasi kedua isolat yang digunakan adalah 1 mg/ mL. Diameter zona hambat yang didapatkan yaitu 25,7 ± 0,58 mm dengan volume penotolan 5 µL; 29,7 ± 0,58 mm dengan volume penotolan 7,5 µL; dan 32 ± 1 mm dengan volume penotolan 10 µL.

(A)

(B)

(C)

Gambar 22. Kontrol positif amoksisilin. (A) Volume penotolan 5 µL; (B) volume penotolan 7,5 µL; (C) volume penotolan 10 µL


3.

81

Aktivitas UV protection pada isolat Hasil isolasi dari ekstrak rimpang kunyit dilakukan uji UV protection

dengan metode inhibiton of bleaching of

-carotene dalam rangka untuk

mengetahui isolat yang memiliki aktivitas UV protection. Masing – masing isolat ditotolkan dengan mass loading 10 µg, 20 µg, dan 30 µg dengan tujuan untuk mengetahui mass loading minimum yang memiliki aktivitas UV protection. Tabel V. Hasil aktivitas UV protection pada isolat

Keterangan

h = 50 cm max = 13,81 lux min =13,74 lux Rata – rata = 13,775 lux Rf = 0,74 - 0,78

+ ++

10 µg -

Isolat 1 20 µg +

30 µg +

10 µg -

++

-

+

+

+

t (mnt)

Ekstrak (47 µg)

9 12 15

Isolat 2 20 30 µg µg + + +

++

Keterangan : - = Tidak ada aktivitas, + = Aktivitas lemah, ++ = Aktivitas sedang.

Hasil kedua isolat berdasarkan tabel V menunjukkan bahwa isolat kedua lebih poten sebagai UV protector dibandingkan isolat pertama karena dengan mass loading 10 µg pada menit ke – 15 sudah mampu menghambat pemudaran warna -carotene. Isolat kedua dengan mass loading 30 µg juga sudah memiliki aktivitas sebagai UV protector setara dengan ekstrak (mass loading 47 µg) pada menit ke – 15. Isolat pertama menunjukkan aktivitas UV protection yang sangat lemah karena warna bercak yang timbul berbeda tipis dengan warna latar lempeng KLT. Akan tetapi aktivitas UV protection pada isolat kedua lebih lemah dibandingkan ekstrak karena ekstrak sudah mulai menunjukkan aktivitas UV protection pada menit ke – 9. Hal ini terjadi dikarenakan adanya kemungkinan bahwa kedua isolat baru dapat memiliki aktivitas UV protection apabila menjadi


82

satu – kesatuan seperti hasil uji aktivitas UV protection yang ditunjukkan pada ekstrak dengan mass loading 47 µg. Aktivitas UV protection yang dimiliki oleh ekstrak pada metode ini lebih lemah dibandingkan dengan metode inhibiton of bleaching of

-carotene yang

didapatkan sebelumnya. Hal ini dapat terjadi karena volume penotolan yang berbeda. Pada tahap sebelumnya volume penotolan lebih banyak karena penotolan dilakukan dengan mikrokapiler sedangkan pada uji ini volume penotolan terukur yaitu 10 µL. Volume penotolan yang berbeda tersebut mengakibatkan mass loading yang terkandung menjadi berbeda pula. Oleh sebab itu, daya UV protection dengan volume penotolan 10 µL hanya terlihat berbeda sedikit dibandingkan dengan warna latar lempeng KLT.

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 83

H. Identifikasi Isolat Aktif Tabel VI. Identifikasi golongan senyawa pada isolat

Deteksi dengan reagen Isolat

Deteksi pada UV 254 nm

1 Rf = 0,74 – 0,78 2 Rf = 0,74 – 0,78

Meredam Meredam

366 nm Berpendar biru -

AlCl3

FeCl3

Dragendorff

Sitroborat

-

-

-

-

-

-

-

-

Keterangan : - = tidak terjadi perubahan, + = adanya perubahan

Tabel VII. Aktivitas Isolat

Aktivitas Isolat 1 2

Penangkap radikal bebas + +++

UV protection

Antibakteri

+ ++

+

Keterangan : - = tidak memiliki aktivitas, + = aktivitas lemah, ++ = aktivitas sedang, +++ = aktivitas kuat

Vanilin Sulfat + (ungu gelap) + (Ungu gelap)

Interpretasi Hasil Terpenoid Terpenoid


84

Hasil isolat yang diperoleh keduanya adalah golongan senyawa terpenoid. Kedua isolat tersebut memiliki kisaran nilai Rf yang sama yaitu 0,74 – 0,78 dengan sistem fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Isolat pertama aktif sebagai penangkap radikal bebas dan UV protection tetapi tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. aureus yang merupakan bakteri Gram positif, sedangkan isolat kedua aktif sebagai penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri. Isolat kedua lebih poten dibandingkan isolat pertama. Hal ini tidak berarti bahwa kurkuminoid yaitu bisdemetoksi kurkumin, demetoksi kurkumin, dan kurkumin yang terkandung pada ekstrak rimpang kunyit tidak memiliki aktivitas. Aktivitas kurkuminoid sebagai penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri tidak dilakukan dalam penelitian ini karena penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa aktif yang terkandung pada ekstrak rimpang kunyit selain kurkuminoid.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. 2. Isolat pertama memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection, sedangkan isolat kedua memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri. Kedua isolat merupakan golongan senyawa terpenoid. B. Saran 1. Penelitian ini perlu dilanjutkan dengan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection secara kuantitatif pada masing – masing isolat. 2. Perlu dilakukan elusidasi struktur pada kedua isolat hasil kromatografi kolom dengan metode elusi step – gradient chromatography menggunakan fase gerak n-heksan : kloroform (75 : 25 v/v) dan n-heksan : kloroform (50 : 50 v/v).

85


DAFTAR PUSTAKA Alam, G., Mufidah, Massi, N., Kurnia, F. R. T., Rahim, A., Usmar, 2012, Skrining Komponen Kimia dan Uji Aktivitas Mukolitik Ekstrak Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.) terhadap Mukosa Usus Sapi Secara in Vitro, Majalah Farmasi dan Farmakologi, 16 (3), 123 – 126. Azizah, B., Salamah, N., 2013, Standarisasi Parameter non Spesifik dan Perbandingan Kadar Kurkumin Ekstrak Etanol dan Ekstrak Terpurifikasi Rimpang Kunyit, Jurnal Ilmiah Kefarmasian, 3 (1), 21 – 30. Balakrishnan, K.P., dan Narayanaswamy, N., 2011, Botanicals as Sunscreens: Their Role in the Prevention of Photoaging and Skin Cancer, International Journal of Research in Cosmetic Science, 1 (1), 1- 12. Bergeron, C., Carrier, D. J., Ramaswamy, S., (Eds.), 2012, Biorefinery Co – Products: Phytochemicals, Primary Metabolites, and Value – Added Biomass Processing, John Wiley & Sons, Ltd., United Kingdom, pp. 264. Cespedes, C. L., Morales, M. V, Avila, J. G., Hafidi, M. E., Alarcon, J.,dan Lopez, O. P., 2009, Phytochemical Profile and the Antioxidant Activity of Chilean Wild Black – berry Fruits, Aristotelia chilensis (Mol) Stuntz (Elaeocarpaceae), Food Chemistry, 119 (2010), 886 – 885. Chhetri, H.P, Yogol, N.S., Sherchan J., Anupa, K.C., Mansoor, S., Thapa, P., 2008, Phytochemical and Antimicrobial Evaluations of Some Medicinal Plants of Nepal, Kathmandu University Journal of Science, Engineering, and Technology, 1 (5), 49 – 54. Choi, H.Y., 2009, Antioxidant Activity of Curcuma longa L., Novel Foodstuff, Mol. Cell. Toxicol, 5 (3), 237 – 242. Choma, I.M., dan Grzelak, E.M., 2010, Bioautography Detection in Thin – Layer Chromatography, Journal of Chromatography A, 1218 (19), 2684 – 2691. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986, Sediaan Galenik, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta, pp. 10 – 13. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1989, Materia Medika Indonesia, jilid V, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta, pp. 20. Deputi Bidang Pengawasan Obat Tradisional, Kosmetik, dan Produk Komplemen, 2010, Acuan Sediaan Herbal, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, pp. 7. Ganpati, K. S., Bhaurao, S. S., Iranna, K. K., Dilip, C. R., Nilkanth, Y. P., 2011, Comparative Studies on Curcumin Content in Fresh and Stored Samples of Turmeric Rhizomes, IRJP, 2 (4), 127 – 129. Garcia, E.J., Oldoni, T.L.C., Alencar, S.M., Reis, A., Loguercio, A.D., dan Grande, R.H.M., 2012, Antioxidant Activity by DPPH Assay of Potential Solutions to be Applied on Bleached Teeth, Braz Dent J, 23 (1), 22 – 27.

86


87

Gillespie, S., 1994, Medical Microbiology Illustrated, Butterworth – Heinemann Ltd., London, pp. 238. Hajnos, M. W., Sherma, J., Kowalska, T., (Eds.), 2008, Thin Layer Chromatography in Phytochemistry, CRC Press, U.S., pp. 5 – 8. Harmita, Radji, M., 2006, Buku Ajar Analisis Hayati, Ed. 3., Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 2. Helen, M. P. A., Prinitha, Sree, J. S., Abisha, M. S. M., Jacob, A., 2012, Phytochemical Characterization and Antimicrobial Activity of Oil and Solvent Extracts of Curcuma longa, RJPBCS, 3 (3), 49 – 55. Hostettmann, K., Marston, A., Hostettmann, M., 1997, Preparative Chromatography Techniques: Applications in Natural Product Isolation, Sprnger, Germany, pp. 33 – 35. Hurtubise, R. J., 2010, Encyclopedia of Chromatography, Taylor and Francis, New York, pp. 10. Jawetz, E., Melnick, J. L., dan Adelberg, E., 2005, Mikrobiologi Kedokteran, Salemba Medika, Jakarta, pp. 20, 21. Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J., 2009, Antimicrobial Susceptibility Testing: a Review of General Principles and Contemporary Practices, Medical Microbiology, 49 (1), 1749 – 1755. Jork, H., Funk, W., Fischer, W., Wimmer, H., 1990, Thin – Layer Chromatography : Reagents and Detection Methods, VCH, Germany, pp. 147 – 148. Kareru, P. G., Keriko, J. M., Kenji, G. M., Thiong’o, G. T., Gachanja, A. N., Mukiira, H. N., 2010, Antimicrobial Activities of Skincare Preparations from Plant Extract, Afr. J. Trad. CAM¸ 7 (3), 214 – 218. Kedare, S. B., Singh, R. P., 2011, Genesis and Development of DPPH Method of Antioxidant Assay, J. Food Sci. Technol., 48 (4), 412 – 422. Komsta, L., Hajnos, M. W., Sherma, J., (Eds.), 2014, Thin Layer Chromatography in Drug Analysis, CRC Press, U. S., pp. 218. Kuntorini, E.M., Astuti, M.D., dan Miliana, N., 2011, Struktur Anatomi dan Kerapatan Sel Sekresi serta Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol dari Rimpang Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb) Asal Kecamatan Pengaron Kabupaten Banjar Kalimantan Selatan, Bioscientiae, 8 (1), 28 – 37. Latha, M.S., Martis, J., Shobha, V., Shinde, R. S., Bangera, S., Krishnankutty, B., et al., 2013, Sunscreening Agents, JCAD, 6 (1), 16 – 26. Lodhia, M. H., Bhatt, K. R., Thaker, V. S., 2009, Antibacterial Activity of Essential Oils from Palmarosa, Evening Primerose, Lavender, and Tuberose, Indian J. Pharm. Sci., 71 (2), 134 -136. Mahon, C. R., Lehman, D. C., Manuselis, G., 2011, Textbook of Diagnostic Microbiology, Saunders Company, USA, pp. 281. Marliana, E., 2007, Analisis Senyawa Metabolit Sekunder dari Batang Spatholobus ferrugineus (Zoll & Moritzi) Benth yang Berfungsi sebagai Antioksidan, Jurnal Penelitian MIPA, 1 (1), 23 – 29.


88

Marston, A., 2011, Thin – Layer Chromatography with Biological Detection in Phytochemistry, Journal of Chromatography A, 1218 (2011), 2676 – 2683. Nahak, G., Sahu, R. K., 2011, Evaluation of Antioxidant Activity in Ethanolic Extracts of Five Curcuma Species, IRJP, 2 (12), 243 – 248. Naz, S., Jabeen, S., Ilyas, S., Manzoor, F., Aslam, F., Ali, A., 2010, Antibacterial Activity of Curcuma longa Varieties Against Different Strains of Bacteria, Pak. J. Bot., 42 (1), 455 – 462. Nugroho, A. E., 2012, Farmakologi: Obat – Obat Penting dalam Pembelajaran Ilmu Farmasi dan Dunia Kesehatan, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 192, 193. O’Neil, M. J., 2001, The Merck Index – an Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, (Ed.), 13th ed, Whitehouse Station, NJ: Merck and Co., Inc., U. S. A., pp. 313. Pangkalan Ide, 2011, Health Secret of Tumeric (Kunyit), PT Elex Media Komputindo, Jakarta, pp. 8. Petkovsek, Z., Elersic, K., Gubina, M., Bertok, D. Z., Erjavec, M. S., 2009, Virulence Potential of Escherichia coli Isolates from Skin and Soft Tissue Infections, J. Clin. Microbiol, 47 (6), 1811 – 1817. Pundir, R.K., dan Jain, P., 2010, Comparative Studies on the Antimicrobial Activity of Black Pepper (Piper nigrum) and Turmeric (Curcuma Longa) Extracts, IJABPT, 1 (2), 492 – 501. Rastuti, U., 2012, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Kalba (Albizia falcataria) dengan Metode DPPH (1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil) dan identifikasi Senyawa Metabolit Sekundernya, Molekul, 7 (1), 33 – 42. Rathaur, P., Raja, W., Ramteke P.W., John, S. A., 2012, Turmeric: the Golden Spice of Life, IJSPR, 3 (7), 1987 – 1994. Revathy, S., Elumalai, S., Benny, M., Antony, B., 2011, Isolation, Purification, and Identification of Curcuminoids from Turmeric (Curcuma longa L.) by Column Chromatography, JES, 2 (7), 21 – 25. Robinson, Y., 1991, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Penerbit ITB, Bandung, pp. 209. Rohyami, Y., 2008, Penentuan Kandungan Flavonoid dari Ekstrak Metanol Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Scheff Boerl), Logika, 5 (1), 1-8. Sarkar, F. H., 2012, Nutraceuticals and Cancer, (Ed.), Springer, New York, pp. 262. Sarker, S. D., Latif , Z., Gray, A. I., (Eds.), 2006, Natural Product Isolation, Humana Press Inc., New Jersey, pp. 33. Sherma, J., Fried, B., (Eds.), 2003, Handbook of Thin Layer Chromatography, 3rd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 793. Singh, R., Chandra, R., Bose, M., dan Luthra, P.M., 2002, Antibacterial Activity of Curcuma longa Rhizome Extract on Phatogenic Bacteria, Current Science, 83 (6), 737 – 740.


89

Sudirman, L. I., 2005, Deteksi Senyawa Antimikroba yang Diisolasi dari Beberapa Lentinus Tropis dengan Metode Bioautogafi, Hayati, 12 (2), 67 – 72. Suleiman, M. M., McGaw, L. J., Naidoo, V., Eloff, J. N., 2010, Detection of Antimicrobial Compounds by Bioautography of Different Extracts of Leaves of Selected South African Tree Species, Afr. J. Trad. CAM, 7 (1), 64 – 78. Taganna, J. C., Quanico, J. P., Perono, R. M. G., Amor, E. C., Rivera, W. L., 2011, Tannin – rich Fraction from Terminalia catappa Inhibits Quorum Sensing (QS) in Chromobacterium violaceum and the QS – Controlled Biofilm Maturation and LasA Staphylolytic Activity in Pseudomona aeruginosa, Journal of Ethnopharmacology, 134 (2011), 865 – 871. Tan, H., Reed, M., Gahm, K. H., King, T., Seran, M. D., Bostick, T., et al., 2008, An Integrated High – Throughput Screening Approach for Purification of Solid Organic Compounds by Trituration and Crystallization in Solvents, Org. Process Res. Dev., 12 (1), 58 – 65. Tarigan, J. Br., Zuhra, C. F., Sihotang, H., 2008, Skrining Fitokimia Tumbuhan yang Digunakan oleh Pedagang Jamu Gendong untuk Merawat Kulit Wajah di Kecamatan Medan Baru, Jurnal Biologi Sumatera, 3 (1), 1 – 6. Thomas, A. N. S., 1989, Tanaman Obat Tradisional, Kanisius, Yogyakarta, pp. 33 – 34. Tilak, J.C., Banerjee, M., Mohan, H., Devasagayam, T.P., 2004, Antioxidant Availability of Turmeric in Relation to its Medicinal and Culinary Uses, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15551376, diakses tanggal 8 Februari 2014. Tini, N., Amri, K., 2002, Mengebunkan Jati Unggul Pilihan Investasi Prospektif, PT. Agromedia Pustaka, Jakarta, pp. 17 – 18. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011, Phytochemical Screening and Extraction : a Review, IPS, 1 (1), 98 – 106. Tjay, T. H., Rahardja, K., 2007, Obat – Obat Penting: Khasiat, Penggunaan, dan Efek – Efek Sampingnya, edisi keenam, PT. Elex Media Komputindo, Jakarta, pp. 57, 58. Tringali, C., 2001, Bioactive Compounds from Natural Sources: Isolation, Characterisation and Biological Properties, (Ed.), Taylor & Francis Inc., New York, pp.339, 341. Tungriani, D.A., Karim, A., Seniwati, A., 2012, Analisis Kandungan -Karoten dan Vitamin C pada berbagai Varitetas Talas (Colocasia esculenta), http://repository.unhas.ac.id/bitstream/handle/123456789/2845/Jurnal%2 0Defi%20Angelin%20Tungriani%20(H311%2008%20259).pdf?sequenc e=1, diakses tanggal 9 Februari 2014. Ueno, H., Yamakura, S., Arastoo, R. S., Oshima, T., Kokubo, K., 2014, Systematic Evaluation and Mechanistic Investigation of Antioxidant Activity of Fullerenols Using β – Carotene Bleaching Assay, Journal of Nanomaterials, 2014 (2014), 1 – 7.


United

90

States Department of Agriculture, Plant Database, http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=CULO#, diakses tanggal 9 Februari 2014. Utami, P., 2012, Antibiotik Alami untuk Mengatasi Aneka Penyakit, PT. Agro Media Pustaka, Jakarta Selatan, pp. 8, 30 – 31. Vasanthakumari, R., 2009, Practical Microbiology, BI Publications Pvt Ltd., New Delhi, pp. 60. Wagner, H., Bladt, S., 1984, Plant Drug Analysis a Thin Layer Chromatography Atlas, Springer, Verlag Berlin Heidelberg, pp. 164. Warnaini, C., 2013, Uji Efektivitas Ekstrak Kunyit sebagai Antibakteri terhadap Pertummbuhan Bakteri Bacillus sp. dan Shigella dysentriae secara in vitro,http://pustaka.unpad.ac.id/wpcontent/uploads/2013/12/PUSTAKA_UNPAD_UJI_EFEKTIVITAS_EK STRAK_KUNYIT.pdf, diakses tanggal 6 Mei 2014. Wu, S., Liang, J., Berthod, A., 2012, Comparing Two Models of Gradient Elution in Counter – Current Chromatography, J. Chromatogr. A., 1274 (2013), 77 – 81. Zala, S. P., Patel, K. P., Patel, K. S., Parmar, J. P., Sen, D. J., 2012, Laboratory Techniques of Purification and Isolation, IJDDR, 4 (2), 41 – 55. Zengin, H., Baysal, A. H., 2014, Antibacterial and Antioxidant Activity of Essential Oil Terpenes against Pathogenic and Spoilage – Forming Bacteria and Cell Structure – Activity Relationship Evaluated by SEM Microscopy, Molecules, 19, 17773 – 177798. Zhai, H., Wilhelm, K. P., Maibach, H. I., (Eds.), 2008, Dermatotoxicology, 7th ed., CRC Press, U.S., pp. 601.


LAMPIRAN Lampiran 1.

Surat determinasi rimpang kunyit

91


92


Lampiran 2.

Sertifikat hasil uji bakteri E. coli dan S. aureus

a. Sertifikat hasil uji bakteri E. coli

93


b. Sertifikat hasil uji bakteri S. aureus

94


Lampiran 3.

Foto simplisia kering rimpang kunyit

95


Lampiran 4.

96

Perhitungan susut pengeringan simplisia rimpang kunyit

a. Penetapan bobot tetap cawan petri kosong pada suhu 105 t (menit) 0 30 60

Replikasi 1 (gram) 29,613 29,611 29,611

Replikasi 2 (gram) 29,597 29,596 29,596

Replikasi 3 (gram) 44,751 44,747 44,747

b. Penimbangan cawan petri dan simplisia

Cawan kosong Cawan + isi Isi

Replikasi 1 (gram) 29,611 30,669 1,058

Replikasi 2 (gram) 29,596 30,587 0,991

Replikasi 3 (gram) 44,747 45,811 1,064

c. Susut pengeringan simplisia pada suhu 105 Replikasi 1 (gram) Cawan Bobot Petri + Isi Isi 30 30,577 0,966 60 30,565 0,954 90 30,560 0,949 120 30,558 0,947 d. Hasil susut pengeringan Menit ke -

Replikasi 2 (gram) Cawan Bobot Petri + Isi Isi 30,491 0,895 30,482 0,886 30,476 0,880 30,477 0,881

1) Hasil susut pengeringan replikasi 1 30 menit = 60 menit = 90 menit = 120 menit = 2) Hasil susut pengeringan replikasi 2 30 menit =

Replikasi 3 (gram) Cawan Bobot Petri + Isi Isi 45,715 0,968 45,705 0,958 45,696 0,949 45,697 0,950


97

60 menit = 90 menit = 120 menit = 3) Hasil susut pengeringan replikasi 3 30 menit = 60 menit = 90 menit = 120 menit =

Rata – rata nilai persentase susut pengeringan pada simplisia rimpang kunyit =


Lampiran 5.

Perhitungan rendemen ekstrak rimpang kunyit

Bobot wadah kosong 193,3 gram Bobot wadah + ekstrak etanolik rimpang kunyit 328,7 gram Bobot ekstrak rimpang kunyit 135,4 gram Bobot simplisia rimpang kunyit yang digunakan = 919,7 gram Perhitungan rendemen

= = = 14,72%

x 100% =

98


Lampiran 6.

99

Susut pengeringan ekstrak

a. Penetapan bobot tetap cawan petri kosong pada suhu 105 t (menit) 0 30 60

Replikasi 1 (gram) 40,089 40,080 40,080

Replikasi 2 (gram) 36,300 36,294 36,294

Replikasi 3 (gram) 37,007 37,001 37,000

b. Penimbangan cawan petri dan isi

Cawan kosong Cawan + zat Cawan + zat + silika Isi

Replikasi 1 (gram) 40,080 40,572 41,079 0,999

Replikasi 2 (gram) 36,294 36,807 37,297 1,003

Replikasi 3 (gram) 37,000 37,517 38,040 1,040

c. Susut pengeringan ekstrak rimpang kunyit pada suhu 105 Replikasi 1 (gram) Cawan Isi Petri + Isi 30 41,044 0,964 60 41,037 0,957 90 41,029 0,949 120 41,024 0,944 150 41,017 0,937 180 41,012 0,932 210 41,007 0,927 240 41,003 0,923 270 41,000 0,920 300 40,996 0,916 330 40,993 0,913 360 40,991 0,911 d. Hasil susut pengeringan Menit ke -

Replikasi 2 (gram) Cawan Isi Petri + Isi 37,257 0,963 37,247 0,953 37,238 0,944 37,228 0,934 37,219 0,925 37,211 0,917 37,204 0,910 37,200 0,906 37,196 0,902 37,192 0,898 37,190 0,896 37,189 0,895

1) Hasil susut pengeringan replikasi 1 Setelah 2 jam = Setelah 4 jam =

Replikasi 3 (gram) Cawan Isi Petri + Isi 38,001 1,001 37,991 0,991 37,980 0,980 37,970 0,970 37,961 0,961 37,950 0,950 37,941 0,941 37,935 0,935 37,931 0,931 37,929 0,929 37,928 0,928 37,928 0,928


100

Setelah 6 jam = 2) Hasil susut pengeringan replikasi 2 Setelah 2 jam = Setelah 4 jam = Setelah 6 jam = 3) Hasil susut pengeringan replikasi 3 Setelah 2 jam = Setelah 4 jam = Setelah 6 jam =

Rata – rata nilai persentase susut pengeringan pada ekstrak =


Lampiran 7.

101

Optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis

a. Preparasi sampel Berat ekstrak kunyit = 0,0053 gram Konsentrasi ekstrak kunyit dalam etanol =

5,3 mg/ mL

b. Optimasi fase gerak 1) Fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100 : 11 : 11 : 20 v/v)

Visual

UV 254 nm

UV 366 nm

2) Fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v)

Visual

UV 254 nm

UV 366 nm


3) Fase gerak n-heksan : etil asetat (2 : 3 v/v)

Visual

UV 254 nm

UV 366 nm


Visual

UV 254 nm

UV 366 nm


Visual

UV 254 nm

UV 366 nm

102


Lampiran 8.

Isolasi senyawa

a. Triturasi 1) Penyiapan sampel Bobot wadah kosong Bobot wadah + ekstrak kental rimpang kunyit Bobot wadah + ekstrak + sea sand Bobot wadah + sisa Bobot ekstrak + sea sand

149,647 gram 154,677 gram 159,724 gram 149,946 gram 9,778 gram

2) Hasil triturasi n-heksan Bobot cawan kosong Bobot cawan + isi Bobot isi

61,530 gram 62,348 gram 0,818 gram

Rendemen = 3) Hasil triturasi kloroform: metanol (95:5 v/v) Bobot cawan kosong Bobot cawan + isi Bobot isi

62,551 gram 65,127 gram 2,576 gram

Rendemen = 4) Hasil perbandingan KLT ekstrak dan hasil triturasi a) Penimbangan (1) Ekstrak kental Bobot ekstrak = 0,0023 gram = 2,3 mg Konsentrasi larutan =

= 4,6 mg/ mL

(2) Hasil triturasi n-heksan Bobot hasil triturasi n-heksan = 0,0027 gram = 2,7 mg

103


Konsentrasi larutan =

104

= 5,4 mg/ mL

(3) Hasil triturasi kloroform : metanol (95:5 v/v) Bobot hasil triturasi kloroform : metanol (95:5 v/v) = 0,0024 gram = 2,4 mg Konsentrasi larutan =

= 4,8 mg/ mL

b) Nilai Rf hasil triturasi

Ekstrak Visual

Hasil triturasi nheksan Hasil triturasi klo:met (95:5 v/v) Ekstrak

UV 254 nm

Hasil triturasi nheksan Hasil triturasi klo:met (95:5 v/v) Ekstrak

UV 366 nm

Hasil triturasi nheksan Hasil triturasi klo:met (95:5 v/v)

Bercak Bercak pertama kedua 0,22 – 0,34 – 0,28 0,38

Bercak ketiga 0,48 – 0,56

-

-

-

0,22 – 0,28 0,22 – 0,28

0,34 – 0,38 0,34 – 0,38

0,48 – 0,56 0,48 – 0,56

-

-

-

0,22 – 0,28 0,22 – 0,28 0,22 – 0,28 0,22 – 0,28

0,34 – 0,38 0,34 – 0,38

0,48 – 0,56 0,48 – 0,56

-

-

-

0,34 – 0,38

0,48 – 0,56

-

b. Kromatografi kolom 1) Optimasi pelarut yang akan digunakan a) Penimbangan hasil triturasi n-heksan Bobot hasil triturasi n-heksan = 0,0026 gram = 2,6 mg Konsentrasi larutan =

5,2 mg/ mL

Bercak keempat 0,74 – 0,78 0,74 – 0,78 0,74 – 0,78 -


b) Profil KLT

A

B

C

D

Visual

Keterangan : A. Fase gerak yang digunakan n-heksan : kloroform (50:50 v/v) B. Fase gerak yang digunakan n-heksan : kloroforom (25:75 v/v) C. Fase gerak yang digunakan kloroform D. Fase gerak yang digunakan kloroform : metanol (98:2 v/v) 2) Penimbangan sampel untuk kromatografi kolom Bobot wadah kosong Bobot wadah + isi Bobot isi

149,6606 gram 149,9577 gram 0,2971 gram

Bobot silika = 0,2960 = 296 mg 3) Profil KLT hasil kromatografi kolom a) Profil KLT hasil kromatografi kolom putaran pertama

Profil KLT putaran pertama

105


b) Profil KLT hasil kromatografi kolom putaran kedua

Profil KLT putaran kedua 4) Perhitungan rendemen hasil kromatografi kolom a) Isolat 1 Bobot flakon kosong Bobot flakon + isi Bobot isi

17,9851 gram 18,1263 gram 0,1412 gram

Rendemen = b) Isolat 2 Bobot flakon kosong Bobot flakon + isi Bobot isi

Rendemen =

18,2759 gram 18,2926 gram 0,0173 gram

106


Lampiran 9.

107

Identifikasi golongan senyawa dengan reagen semprot pada

isolat 1) Deteksi secara fisik Isolat 1

Isolat 2

UV 254 nm

Isolat 1

Isolat 2 UV 366 nm

2) Deteksi golongan senyawa dengan reagen semprot A

B

A Reagen AlCl3

B

Reagen FeCl3


A

B

A Reagen Dragendorff Keterangan: A. Isolat 1 B. Isolat 2

B

Reagen vanilin sulfat

108


109

Lampiran 10. Uji kualitatif penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri a. Uji kualitatif penangkap radikal bebas 1) Penimbangan ekstrak kunyit Bobot ekstrak kunyit = 0,0047 gram Konsentrasi ekstrak kunyit dalam etanol = =

4,7 mg/ mL

2) Uji kualitatif penangkap radikal bebas pada ekstrak kental Ekstrak kunyit 6 totolan 8 totolan

Standar Kurkumin

Nilai Rf 0,22 – 0,28 0,34 – 0,38 0,48 – 0,56 0,74 – 0,78

+

+++

Keterangan : (+) Daya aktivitas lemah. (+++)Daya aktivitas kuat.

3) Uji kualitatif antioksidan pada isolat

K

K

A

A

B

C

K D E Setelah disemprot DPPH

B

C

K

D

5 jam setelah disemprot DPPH

E

F

F


110

Keterangan: K. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 47 µg) A. Isolat 1 dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 10 µg) B. Isolat 1 dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 20 µg) C. Isolat 1 dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 30 µg) D. Isolat 2 dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 10 µg) E. Isolat 2 dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 20 µg) F. Isolat 2 dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 30 µg) b. Uji kualitatif UV protection 1) Penimbangan bahan a) Penimbangan -carotene Bobot -carotene = 0,0042 gram Konsentrasi -carotene =

= 0,0525 mg/ mL

b) Penimbangan ekstrak kunyit Bobot ekstrak kunyit = 0,0047 gram Konsentrasi ekstrak kunyit dalam etanol = = 2) Indikator warna

4,7 mg/ mL


111

3) Optimasi intensitas cahaya

Ket.

h = 100 cm max = 5,97 lux min = 5,82 lux Rata – rata = 5,895 lux

h = 50 cm max= 15,14 lux min = 14,88 lux Rata – rata = 15,01 lux

h = 35 cm max= 30,96 lux min = 30,00 lux Rata – rata = 30,48 lux

t (menit) 0 1 3 6 9 12 15 0 1 3 6 9 12 15 0 1 3 6 9 12 15

1 6 5 3 3 2 2 2 6 3 2 2 2 1 1 6 2 1 0 0 0 0

Replikasi ke – (indikator ke - ) 2 3 4 6 6 6 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 6 6 6 2 2 3 2 2 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 6 6 6 2 1 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

5 6 3 3 2 2 2 1 6 2 2 2 1 1 1 6 1 1 0 0 0 0

Rata rata

SD

6 3,4 2,6 2,2 2 2 1,4 6 2,4 2 1,6 1,2 1 1 6 1,6 1 0 0 0 0

0,00 0,89 0,55 0,45 0,00 0,00 0,55 0,00 0,55 0,00 0,55 0,45 0,00 0,00 0,00 0,55 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

4) Uji aktivitas UV protection pada ekstrak kunyit

Rep 1

Rep 2

Rep 3

Rep 4

Rep 5


112

5) Uji aktivitas UV protection pada isolat

E

A

B

C

E

Isolat 1

A

B

C

Isolat 2

Keterangan: K. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 47 µg) A. Isolat dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 10 µg) B. Isolat dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 20 µg) C. Isolat dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 30 µg) c. Uji kualitatif antibakteri 1) Penimbangan bahan a) Ekstrak kental kunyit Bobot ekstrak kental kunyit = 0,0047 gram Konsentrasi ekstrak kunyit dalam etanol =

4,7 mg/ mL

b) Amoksisilin Bobot amoksisilin = 0,0051 gram Konsentrasi amoksisilin dalam aquadest =

= 5,1 mg/mL


113

2) Hasil pengamatan bioautografi kontak ekstrak kunyit terhadap E. coli dan S. aureus

A

B C

Aktivitas antibakteri ekstrak kunyit terhadap E. coli

C

B

A

Aktivitas antibakteri ekstrak kunyit terhadap S. aureus Keterangan : A. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 15 µL (mass loading = 75 µg) B. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 100 µg) C. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 150 µg)


114

3) Hasil pengamatan uji daya antibakteri isolat terhadap S. aureus dengan metode Kirby – Bauer

A

C

B

D

Keterangan : A. Isolat pertama dengan volume penotolan 50 µL (mass loading = 50 µg) B. Isolat pertama dengan volume penotolan 100 µL (mass loading = 100 µg) C. Isolat kedua dengan volume penotolan 50 µL (mass loading = 50 µg) D. Isolat kedua dengan volume penotolan 100 µL (mass loading = 100 µg)


115

BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi berjudul “Isolasi dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection Ekstrak Rimpang Kunyit (Curcuma longa L.)” memiliki nama lengkap Elyn Prameswari. Penulis lahir di Bogor pada tanggal 7 September 1993 sebagai putri ketiga dari tiga bersaudara pasangan Wasi Tedjo Radjatmo dan Ignatia Sukarti. Pendidikan Formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Sandhy Putra Balikpapan (1997 – 1999), SD St. Aloysius Semarang (1999 – 2005), SMP Maria Mediatrix Semarang (2005 – 2008), SMA Kolese Loyola Semarang (2008 – 2011), dan kemudian melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis aktif dalam beberapa kegiatan diantaranya: bendahara Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi (2013 – 2014), ketua Komisi Pemilihan Umum Gubernur BEMF dan Ketua DPMF Farmasi (KPU 2013), sekretaris TITRASI (2013), sekretaris Donor Darah JMKI “We are One in Blood Donation (2012), anggota UKF basket (2011 – 2013), dan anggota UKM basket (2011 2012). Penulis juga pernah memenangkan pertandingan basket di antaranya: Juara II Potensi MIPA Fair UII Se – DIY tahun 2012, juara III Farmasi Cup (Basketball Competition Fakultas/ Jurusan Kesehatan Se - DIY) tahun 2011, juara III, Farmasi UGM Cup tahun 2012, dan juara III Pharmacy Performance and Event Cup tahun 2012. Selain itu, penulis pernah menjadi Asisten Praktikum untuk matakuliah Bentuk Sediaan Farmasi dan Biokimia pada tahun 2013.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents