MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni sampai September 2009. Pemeliharaan puyuh dilaksanakan di Laboratorium Lapang Nutrisi Ternak Unggas. Puyuh dan ransum selama penelitian diperoleh dari peternakan puyuh di daerah Cemplang, Cibatok, Bogor, Jawa Barat. Analisis ransum konntrol serta tepung daun katuk dilakukan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Analisis kolesterol, lemak, vitamin A dan E serta uji fitokimia tepung daun katuk dilakukan di Laboratorium Biokimia, Fakultas MIPA. Pembuatan ekstrak tepung daun katuk dilakukan di Laboratorium Balitro (Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik) serta uji fitokimia ekstrak tepung daun katuk dilakukan di Laboratorium Nutrisi Ikan Fakultas Perikanan Institut Pertanian Bogor. Materi Ternak dan Bahan Penelitian ini menggunakan ternak puyuh (Coturnix coturnix japonica) betina berumur 8 minggu sebanyak 208 ekor, ditempatkan dalam kandang baterei dan dibagi menjadi 4 perlakuan dengan 4 ulangan yang masing-masing ulangan terdiri dari 13 ekor puyuh, dan bahan perlakuan yaitu ekstrak tepung daun katuk (ETDK ) dan tepung daun katuk (TDK). Peralatan dan Perlengkapan Peralatan yang digunakan adalah tempat pakan yang terbuat dari bambu, tempat air minum yang dicuci setiap hari, alat pembersih kandang, label, timbangan digital untuk menimbang pakan dan telur yang dihasilkan, plastik untuk menampung telur yang telah dipecah dan membungkus pakan per ulangan, yolk colour fan, cawan petri, dan oven untuk mengeringkan tepung daun katuk, penggiling daging, pisau, serta lampu digunakan sebagai penerangan. Persiapan kandang dilakukan dengan mencuci lantai dengan detergen. Melakukan pengapuran dan penyemprotan kandang dengan disinfektan 2 hari sebelum puyuh datang.
17
Metode Pembuatan Tepung Daun Katuk (TDK) Pembuatan tepung daun katuk menurut Suprayogi (1995) yaitu dengan cara melayukan daun katuk segar di udara terbuka selama 1-2 hari kemudian dioven pada suhu 60oC selama 2 jam. Selanjutnya katuk dikeluarkan dari oven dan digiling sampai berbentuk tepung halus. Pembuatan tepung daun katuk dapat dilihat pada Daun katuk
Gambar 6.
Dilayukan selama 24 jam Daun katuk dioven Suhu 60o C selama 24 jam Daun katuk kering
Digiling Tepung daun katuk (TDK)
Gambar 6. Skema Pembuatan Tepung Daun Katuk (TDK) Pembuatan Ekstrak Tepung Daun Katuk (ETDK) Pembuatan ekstrak tepung daun katuk dengan menggunakan pelarut etanol 70%. Simplisia merupakan bahan alamiah yaitu tepung daun katuk yang belum mengalami pengolahan apapun kecuali telah dikeringkan. Pembuatan ekstrak tepung daun katuk dapat dilihat pada Gambar 7. Simplisia dijadikan serbuk
Serbuk silmplisia + pelarut
Diaduk dengan stirer ± 3 jam
Filtrat (1)
Didiamkan/ diendapkan selama 24 jam
Ampas Aduk ± 1 jam Ampas
Disaring dengan kertas saring
Ditambah pelarut
Filtrat (2) Filtrat (1+2)
Diuapkan dengan evaporator
ETDK kental
Gambar 7. Skema Pembuatan Ekstrak Tepung Daun Katuk (ETDK) 18
Pencampuran Ransum Ransum basal yang diperoleh dari peternakan puyuh dicampurkan dengan 0,15% ETDK, 0,30% ETDK, dan 10% TDK. Pencampuran ransum basal dengan ETDK diawali dengan penimbangan ekstrak sesuai dengan kebutuhan perlakuan R1 dan R2, kemudian ekstrak dicampurkan sedikit demi sedikit dengan ransum secara manual menggunakan tangan. Pencampuran ransum basal dengan TDK diawali dengan penimbangan tepung daun katuk sebanyak 10% dari berat ransum, kemudian berat ransum dikurangi sebanyak berat tepung daun katuk. Setelah diperoleh berat masing-masing (tepung daun katuk dan ransum) dicampurkan sedikit demi sedikit secara manual hingga homogen. Pembuatan ransum dilakukan setiap 1 minggu sekali. Kandungan nutrien ransum kontrol, tepung daun katuk dan ekstrak tepung daun katuk disajikan pada Tabel 2, kandungan nutrien ransum perlakuan berdasarkan perhitungan dapat dilihat pada Tabel 3, serta kandungan fitokimia ekstrak tepung daun katuk dan tepung daun katuk berdasarkan uji kualitatif ditunjukan pada Tabel 4.
Tabel 2. Kandungan Nutrien dari Ransum Kontrol, TDK dan ETDK (As fed) Nutrien (%)
Bahan Penelitian Ransum kontrol*
TDK**
ETDK***
Bahan Kering (%)
87,59
83,96
70,35
Abu (%)
10,45
8,36
5.65
Protein Kasar (%)
18,21
30,68
19
Serat Kasar (%)
9.58
15,89
0,21
Lemak Kasar (%)
5,61
4,58
2,40
Beta-N (%)
43,74
24,45
43,21
Ca (%)
3,58
1,03
0,05
P (%)
1,25
0,8
0,03
Energi Bruto (Kal/g)
3980
3812
3122
Keterangan: * Berdasarkan hasil analisis Laboratorium INTP, FAPET, IPB 2010 ** Berdasarkan hasil analisis Laboratorium INTP, FAPET, IPB 2010 *** Berdasarkan hasil analisis Laboratorium Nutrisi Ikan, FPIK, IPB 2011
19
Tabel 3. Kandungan Nutrien Setiap Ransum Berdasarkan Perhitungan Nutrien
Ransum Ransum kontrol
0,15% ETDK
0,30% ETDK
10% TDK
Bahan Kering (%)
87,59
87,56
87,54
87,23
Abu (%)
10,45
10,44
10,44
10,24
Protein Kasar (%)
18,21
18,21
18,21
19,46
Serat Kasar (%)
9,58
9,57
9,55
10,21
Lemak Kasar (%)
5,61
5,61
5,60
5,51
Beta-N (%)
43,74
43,74
43,74
41,81
Ca (%)
3,58
3,57
3,57
3,33
P (%)
1,25
1,25
1,25
1,21
Energi Bruto (Kal/g)
3980
3978
3977
3963,2
Perlakuan Penelitian ini menggunakan 4 ransum perlakuan yang dibedakan berdasarkan level dan bentuk pemberian daun katuk, yakni: R0
: Ransum kontrol tanpa pemberian ekstrak dan tepung daun katuk
R1
: Ransum mengandung ekstrak tepung daun katuk 0,15%
R2
: Ransum mengandung ekstrak tepung daun katuk 0,30%
R3
: Ransum mengandung tepung daun katuk 10%
Pemberian ransum R3 (10% TDK) setara kandungan fitosterol dengan R1 (0,15% ETDK) dalam ransum. Tabel 4. Kandungan Fitokimia ETDK dan TDK Hasil Uji Kualitatif Jenis Fitokimia Alkaloid Flavonoid Fenol Glikosida Steroid Sterol Triterpenoid Tanin Saponin
Hasil ETDK* (+) (++) (-) (+++) (+++) (+) (-)
TDK** (-) (+) (+) (+++) (+) (+++) (+++)
Keterangan : * Berdasarkan hasil analisis Laboratorium Nutrisi Ikan, FPIK, 2011 ** Berdasarkan hasil analisis Laboratorium Biokimia, Fakultas MIPA 2011
20
Pemeliharaan Penelitian dilakukan selama 6 minggu. Kegiatan selama pemeliharaan yaitu setiap hari dilakukan pembersihan kandang, tempat pakan, tempat air minum, serta lingkungan sekitar kandang pemeliharaan. Penimbangan bobot badan puyuh dilakukan sebelum diberikan perlakuan dan di akhir penelitian. Untuk mengurangi cekaman stress dan panas diberi larutan Vita Stres sebelum dan sesudah penimbangan. Pakan diberikan sesuai kebutuhan puyuh yaitu 25 g/ekor/hari, diberikan dua kali pada jam 06.00 dan 15.00. Bentuk fisik pakan yang diberikan yaitu mash sesuai dengan perlakuan masing-masing serta air minum diberikan ad libitum. Prosedur Analisis Kandungan Kolesterol Daging, Hati dan Telur Puyuh Kadar kolesterol daging, hati dan telur diukur pada akhir penelitian dan dianalisis di Laboratorium Biokimia, Fakultas MIPA, IPB. Pengukuran kadar kolesterol dilakukan berdasarkan Metode Liebermann-Burchad (Kleiner dan Dotti, 1962). Sampel yang dianalisis merupakan sampel yang dari 4 ulangan dalam 1 perlakuan. Adapun caranya adalah sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak ± 0,2 g dimasukan ke dalam tabung sentrifuse berskala 15 ml, kemudian ditambahkan campuran alkohol eter 3:1 sebanyak 12 ml dan diaduk hingga bercampur dengan baik. Larutan didiamkan sambil dikocok sekali dua kali salama 30 menit. Pengaduk dibilas dengan alkohol eter 3:1 dan volume disetarakan menjadi 15 ml, lalu di sentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dimasukan ke dalam gelas piala 50 ml dan dipanaskan pada penangas air sampai kering. Ekstrak residu dilarutkan dengan 2,5 khloroform sedikit demi sedikit atau dicuci sebanyak 2 kali atau dimasukan ke dalam tabung reaksi 10 ml untuk disetarakan volumenya menjadi 5 ml. Lima ml kolesterol standar (0,4 mg kolesterol dan 5 ml khoroform) dimasukan ke dalam tabung reaksi yang lain. Keduanya ditambahkan 2 ml asetat anhidrida dan 100 µl H2SO4 pekat, kemudian dikocok sampai timbul warna hijau dan disimpan selama 15 menit di ruang gelap, selanjutnya pembacaan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm. Nilai kolesterol diperoleh dari perhitungan dengan rumus sebagai berikut : Kolesterol (mg/%) = absorbans sampel x 0,4 (konsentrasi standar) x 100 absorbans standar berat sampel 21
Prosedur Analisis Kandungan Lemak Daging, Hati dan Telur Puyuh Kadar lemak daging, hati dan telur diukur pada akhir penelitian dan dianalisis di Laboratorium Biokimia, Fakultas MIPA, IPB. Pengukuran kadar kolesterol dilakukan berdasarkan Metode Sochlet. Metoda analisis ini adalah sebuah labu lemak dengan beberapa butir batu didih di dalamnya, dalam oven dikeringkan dengan suhu 105-110 oC selama 1 jam, dalam eksikator didinginkan selama selama 1 jam dan ditimbang dengan berat a g. Contoh ditimbang kira-kira 1 g dengan catatan jumlah contoh juga tergantung dengan kadar lemak bahan. Contoh tersebut dimasukan ke dalam selongsong yang terbuat dari kertas saring dan ditutup dengan kapas yang bebas lemak. Selongsong dimasukan ke dalam alat fatex-s dan ditambahkan larutan petroleum ether sebagai larutan pengekstrak. Suhu diatur pada alat fatex-s pada suhu 60oC dan waktu selama 25 menit. Proses ekstraksi dilakukan sampai alat berbunyi, kemudian diturunkan larutan petroleum ether bersama lemak yang telah larut. Proses evaporasi dilakukan dengan merubah suhu pada 105oC sampai alat fatex-s berbunyi. Proses ini dilakukan sebanyak 2 kali proses ekstraksi dan evaporasi. Selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam alat pengering oven dengan suhu 10oC selama kira-kira 1 jam, setelah itu didinginkan di dalam eksikator selama 1 jam dan ditimbang kembali dengan berat b g. Perhitungan lemak kasar adalah sebagai berikut:
Kadar lemak kasar =
x 100%
Keterangan: b : berat labu lemak kosong a : berat labu lemak setelah dari oven x : berat sampel
Prosedur Analisis Kandungan Vitamin A Daging, Hati dan Telur Puyuh Analisis vitamin A dilakukan secara komposit di Laboratorium Biokimia, Fakultas MIPA, IPB. Analisis dilakukan berdasarkan Metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Ekstraksi sampel dan standar eksternal untuk dianalisis vitamin A adalah: 0,5 g sampel atau standar eksternal ditambah 400 µl sodium askorbat dan divortex selama 10 detik, kemudian ditambah dengan 20 ml
22
KOH, divortex selama 10 detik. Selanjutnya dilanjutkan saponifikasi dengan menyimpan pada “waterbath” dengan suhu 80oC selama 30 menit, lalu disimpan pada” ice bath” selama 2 menit. Selanjutnya ke dalam campuran dimasukan 3 ml “heksan” dan dikocok selama 10 detik, kemudian ditambahkan 3 ml aquades dan dikocok selama 10 detik. Campuran tersebut disimpan dalam lemari es sampai lapisan organik dan air terpisah. Selanjutnya diambil 2,6 ml lapisan “heksan” (supernatan) dan dipisah dalam tabung lain (A). Kemudian sisanya ditambahkan lagi sebanyak 2 ml heksan dan dikocok selama 10 detik dan disimpan dalam lemari es sampai lapisan organik dan air terpisah dan dimasukan dalam tabung (A) tadi. Selanjutnya supernatan (tabung A) dicuci dengan 4,6 ml asam asetat 5%, dan lapisan organik dipindahkan sebanyak yang bisa diambil, lalu dikeringkan dengan aliran nitrogen, lalu terakhir dilarutkan dalam 3 ml fase mobil sebelum diinjeksikan 50 µl dalam instrument HPLC. Pembuatan standar eksternal retinyl palmitat adalah sebagai berikut: 1. Stock Standar Solution: 10 mg/ml retinyl palmitat dalam heksan. 1 g retinyl palmitat (USP Reference Standar) dilarutkan dalam 100 ml heksan, dikocok sampai terlarut sempurna. 2. Intermediate Standar Solution: 2 ml stock standar solution dipipet dan dimasukan dalam 250 ml volumetric flask lalu diencerkan dengan 250 ml heksan. 3. Working Standar Solution: sekitar 1,6 µl/ml retinyl palmitat. 2 ml Intermediate Standar Solution, dipipet dan dimasukan dalam 100 ml volumetric flask dan diencerkan dengan heksan. Untuk mengukur konsentrasi dari Working
Standar Solution diambil 2 ml
Intermediate Standar Solution dan diencerkan dengan heksan dalam 50 ml volumetric flask. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometri. Cst
= {A325/(2x∑xb)} x 104
Cstd
: Konsentrasi standar
A325
: Absorbansi
∑
: 996, Koefisien extinction dari retinyl palmitat dalam heksan pada 325 nm
B
: 1 cm, panjang cell
Working Standar Solution pada 325 nm
23
Perhitungan kadungan vitamin A dan beta karoten yang menggunakan standar eksternal adalah seebagai berikut: [Retinol]
: L1 x S x V L2 B
Keterangan [Retinol]
: Konsentrasi Retinol (µg/g)
L1
: Luas peak sampel yang memiliki waktu retensi yang sama dengan waktu retensi standar eksternal retinol dilihat dari kromatogram HPLC
L2
: Luas peak standar terinol
S
: Konsentrasi standar retinol (µg/µl atau µg/ml)
V
: Volume akhir yang siap disuntikan pada HPLC
B
: Berat sampel yang diekstrak
Prosedur Analisis Kandungan Vitamin E Daging, Hati dan Telur Puyuh Sampel disiapkan dengan menimbang 0,5 g sampel dan dimasukan ke dalam labu ukur 20 ml dan ditambahkan enzim makatase 40 mg dan 2 ml amonia 0,02%. Campuran tersebut dimasukan ke dalam ultrasonik selama 20 menit pada suhu 65oC. Lalu campuran tersebut didinginkan pada suhu ruang dan ditambahkan etanol 10 ml dan dimasukan kembali dalam ultrasonik selama 10 menit. Kemudian larutan ditambahkan etanol hingga volumenya mejadi 20 ml, dan dikocok kembali. Selanjutnya larutan disentrifus dan 5 ml supernatan diambil dan dimasukan ke dalam labu ukur 5 ml. Larutan siap diinjeksikan ke HPLC. Kondisi alat HPLC adalah kolom C-18, fase gerak metanol 98%, laju fase gerak 1,2 ml/menit, dan detektor UV dengan panjang gelombang 254 nm. Perhitungan: Kadar vitamin E: Luas area sampel x 25 ppm x 10 Luas area standar 0,5 Keterangan 25 ppm
: Konsentrasi standar
10
: Volume akhir (ml)
0,5
: Volume sampel yang diinjeksikan (ml)
24
Peubah yang Diamati 1.
Kandungan kolesterol dalam daging, hati dan telur
2.
Kandungan lemak dalam daging, hati dan telur
3.
Kandungan vitamin A dan E dalam daging, hati dan telur
4.
Konsumsi ransum (g/ekor/hari). Konsumsi ransum dihitung dari selisih ransum yang diberikan dengan sisa ransum yang dikumpulkan setiap minggu.
5.
Produksi Telur Hen day (%). Produksi Telur Hen Day dihitung dari jumlah telur yang diproduksi selama satu minggu dibagi dengan jumlah puyuh yang ada pada minggu tersebut.
6.
Massa telur (g). Produksi massa telur puyuh dihitung dengan cara mengalikan produksi telur selama penelitian dengan rataan bobot telur harian.
7.
Bobot telur (g/butir). Bobot telur dihitung dari produksi telur puyuh/ hari. Konversi ransum. Konversi ransum dihitung dari jumlah ransum yang dikonsumsi dibagi dengan massa telur.
8.
Warna kuning telur. Warna kuning telur diukur dengan menggunakan alat Yolk colour fan.
Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan 4 ulangan. Model matematik dari rancangan yang digunakan adalah : Yij = µ + τi + εij Keterangan: Yij = Nilai pengamatan pada ulangan ke-j dan perlakuan ke-i µ = Nilai rataan umum τi = Pengaruh perlakuan ke-i (suplementasi) εij = Error perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Data performa puyuh (konsumsi rasum, Hen day, massa telur, bobot telur, konversi ransum, dan warna kuning telur) yang diperoleh dianalisis menggunakan Analisa Ragam (analysis of variance, ANOVA) (Steel dan Torrie, 1993), kemudian jika berbeda nyata diuji lanjut dengan duncan, sedangkan pada kandungan kolesterol, lemak, vitamin A dan E dalam daging, hati, dan telur puyuh secara deskriptif.
25
