MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE

Bakalářská práce

Brno 2016

Monika Ondroušková

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE

STANOVENÍ POTRAVINÁŘSKÝCH BARVIV SPEKTROFOTOMETRICKY A METODOU HPLC

Bakalářská práce

Monika Ondroušková

Vedoucí práce: RNDr. Marta Farková, CSc.

Brno 2016

Bibliografický záznam

Autor:

Název práce:

Monika Ondroušková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav chemie Stanovení potravinářských barviv spektrofotometricky a metodou HPLC

Studijní program:

Chemie

Studijní obor:

Chemie se zaměřením na vzdělávání, Matematika se zaměřením na vzdělávání

Vedoucí práce:

RNDr. Marta Farková, CSc.

Akademický rok:

2015/2016

Počet stran:

62

Klíčová slova:

spektrofotometrie, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, HPLC, potravinářská barviva

Bibliographic Entry Author

Title of Thesis:

Monika Ondroušková Faculty of Science, Masaryk University Department of chemistry Determination of food dyes using spectrophotometry and HPLC

Degree programme:

Chemistry

Field of Study:

Chemistry with a view to Education, Mathematics with a view to Education

Supervisor:

RNDr. Marta Farková, CSc.

Academic Year:

2015/2016

Number of Pages:

62

Keywords:

spectrophotometry, high performance liquid chromatography, HPLC, food dyes

Abstrakt Tato bakalářská práce se zaměřuje na stanovení potravinářských barviv s využitím spektrofotometrické metody a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). První část je věnována základní charakteristice použitých metod. Druhá část popisuje vývoj metody pro jednosložkovou a vícesložkovou analýzu barviv spektrofotometricky a vývoj metody postupu pro stanovení barviv pomocí HPLC. Vyvinutými postupy byly analyzovány reálné vzorky. Součástí práce bylo vytvoření návodu k úloze do praktika z analytické chemie zabývající se spektrofotometrickým stanovením potravinářských barviv v reálných vzorcích.

Abstract Presented thesis is dealing with on aplication of spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) on determination of food dyes in real samples. The first part is focused on the basic characteristics of the used methods. In the second part, the optimization of condition for spectrophotometric method applied for the one-component and multiple-component analysis of dyes in real samles was described. The thesis includes the development analysis for determination of food dyes by HPLC and the analysis in real sample. Method that use spectrophotometric determination for the analysis of food dyes was elaborated for the purpose of laboratory exercise for students.

Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat RNDr. Martě Farkové, CSc., vedoucí mé bakalářské práce, za odborné vedení, užitečné rady, připomínky a čas, který mi věnovala při tvorbě této bakalářské práce. Dále děkuji své konzultantce Mgr. Vendule Roblové za pomoc, nápady a odborné rady při vypracování bakalářské práce. V neposlední řadě patří velké poděkování Ing. Heleně Zavadilové za vstřícný a ochotný přístup při experimentální části, umožnění vyzkoušení úlohy do praktika ve výuce a využití prostoru výukové laboratoře.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 7. 5. 2016

……………………………… Monika Ondroušková

Obsah 1

Úvod a cíl práce................................................................................................................ 10

2

Teoretická část .................................................................................................................. 11 2.1

Optické metody.......................................................................................................... 11

2.1.1

Molekulová absorpční spektroskopie v oblasti ultrafialového a viditelného

záření

………………………………………………………………………………….12

2.1.1.1 2.2

Chromatografické metody ......................................................................................... 16

2.2.1

3

Metody a přístroje ....................................................................................... 14

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie ......................................................... 17

2.2.1.1

Základní charakteristiky chromatogramu ................................................... 18

2.2.1.1

Rozlišení píků ............................................................................................. 19

2.2.1.2

Účinnost chromatografické kolony ............................................................. 20

2.3

Potravinářská barviva ................................................................................................ 21

2.4

Stanovení potravinářských barviv ............................................................................. 25

2.5

Statistické vyhodnocení výsledků ............................................................................. 26

Praktická část .................................................................................................................... 28 3.1

Přístrojové vybavení .................................................................................................. 28

3.2

Chemikálie ................................................................................................................. 29

3.3

Spektrofotometrické stanovení barviv ....................................................................... 30

3.3.1

Stanovení barviva E110 v reálném vzorku ........................................................ 31

3.3.2

Stanovení barviva E133 v reálném vzorku ....................................................... 33

3.3.3

Stanovení barviva E120 v reálném vzorku ........................................................ 34

3.3.4

Vícesložková analýza ......................................................................................... 36

3.4

3.3.4.1

Modelové vzorky ........................................................................................ 38

3.3.4.2

Reálný vzorek ............................................................................................. 40

Stanovení barviv metodou HPLC .............................................................................. 40

3.4.1

Stanovení barviva E110 v reálném vzorku ........................................................ 42

3.4.2

Stanovení barviva E133 v reálném vzorku ........................................................ 43

3.4.3

Vícesložková analýza ......................................................................................... 45

3.5 4

Srovnání metod .......................................................................................................... 46

Závěr................................................................................................................................. 47

Seznam literatury...................................................................................................................... 48 Seznam tabulek ........................................................................................................................ 50 Seznam obrázků ....................................................................................................................... 50 PŘÍLOHA 1: Úloha do praktika z analytické chemie .............................................................. 52

1 Úvod a cíl práce Potravinářská barviva jsou široce využívána na zlepšení barvy potravin, protože čerstvost, zralost a chuť jsou spjaty s jejich vzhledem. V neposlední řadě také během výrobního procesu dochází ke ztrátě barvy, proto se do potravin a nápojů přidávají převážně syntetická barviva, která jsou levnější a stabilnější oproti přírodním. Bohužel, některá potravinářská barviva mají potenciální negativní dopady na lidské zdraví, speciálně pokud se konzumují ve větším množství. Povolená množství barviv v potravinách a nápojích se v jednotlivých zemích liší. Z tohoto důvodu, pro zajištění zdravotní nezávadnosti pro spotřebitele, se stanovují přípustné hranice koncentrací jednotlivých barviv v potravinách. Otázkou je, jakým způsobem v co nejkratším čase a s největší správností barviva stanovit. Využívají se různé metody, např. tenkovrstvá chromatografie, izotachoforéza, kapilární elektroforéza. V této práci budou studovány možnosti použití spektrofotometrické metody a HPLC. Cílem práce je vývoj postupů pro analýzu vybraných potravinářských barviv spektrofotometricky a metodou HPLC. Bude vyvinuta i metoda pro vícesložkovou spektrofotometrickou analýzu barviv. S využitím těchto postupů bude provedena analýza reálných vzorků (nápojů). Součástí práce je také příprava návodu pro praktikum z analytické chemie, týkající se stanovení potravinářských barviv metodou spektrofotometrie v oblasti ultrafialového a viditelného záření a sepsání návodu pro studenty.

10

2 Teoretická část Analytická chemie je vědní obor, který se zabývá kvalitativním a kvantitativním rozborem vzorku. Kvalitativním rozborem se rozumí zjištění všech přítomných analytů. Kvantitativním rozborem se rozumí zjištění obsahu jednotlivých prvků nebo určitých skupin. Schéma chemické analýzy: Vzorek + činidlo → analyticky významné produkty + ostatní látky Podle činidla se analytické metody rozdělují do 5 skupin: 1. Chemické metody - činidlem je známá sloučenina nebo prvek. •

Kvalitativní analýza - vyhodnocují se produkty provedené reakce

•

Vážková analýza - vyhodnocuje se množství vzniklých produktů

•

Volumetrické metody - vyhodnocuje se spotřeba činidla při reakci se vzorkem

2. Elektrochemické metody - činidlem jsou elektrony, které vzorek předává nebo odebírá elektrodě. 3. Separační metody - činidlem jsou plynné, kapalné nebo pevné sloučeniny za určitých podmínek (tlak, teplota atd.), které umožnují rozdělení vzorků na jednotlivé složky a stanovení jejich obsahu. 4. Optické metody - činidlem je elektromagnetické záření 5. Ostatní metody - např. radiometrické, imunochemické apod. [1] V této práci budou podrobněji popsány metody optické, především spektrální v oblasti ultrafialového a viditelného záření (UV-Vis) a separační se zaměřením na vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii.

2.1 Optické metody Optické metody jsou založeny na interakci záření s analyzovanou složkou, dříve se využívala pouze oblast viditelného světla, ale nyní se metoda vztahuje na celé spektrum elektromagnetických vln, které je v tab. č. 1. [2] Dělí se na metody spektroskopické a nespektroskopické: •

Spektroskopické - při interakci analyzované složky se zářením dochází k výměně energie,

patří

sem

např.

molekulová absorpční

spektroskopie,

molekulová

fluorescenční spektroskopie, atomová absorpční spektroskopie, viz tab. č. 1.

11

•

Nespektroskopické - při interakci mezi analyzovanou složkou a zářením nedochází k výměně energie, např. refraktometrie, polarimetrie, nefelometrie apod. [2], [3]

Spektroskopie Principem metody je absorpce zářivé energie molekulou a následný přechod valenčních elektronů do vyšších energetických stavů (v UV-Vis) nebo ke změnám vibračních a rotačních stavů molekuly (infračervená a Ramanova spektroskopie). Excitovaná molekula poté přechází do základního stavu. Jednotlivé oblasti elektromagnetického záření, druh excitace a jim odpovídající spektrální metody jsou uvedeny v tab. č. 1. [2], [4], [5] tab. č. 1: Oblasti elektromagnetického záření a jednotlivé spektrální metody Oblast záření kosmické záření

λ [µm] 10-8–10-6

gama záření

10-6–10-5

RTG záření vzdálené UV blízké viditelné blízké IR střední vzdálené mikrovlnné

10-5–10-2 10-2–0,2 0,2–0,4 0,4–0,8 0,8–2 2–20 20–100 100–104

Typ excitace atomová jádra vnitřní elektrony

Metoda Mössbauerova spektroskopie RTG spektroskopie

valenční elektrony

AAS, AES, AFS, MAS

vibrace a rotace molekul

IR a Ramanova spektroskopie

rotace molekul

mikrovlnná spektroskopie

radarové 104–106 spiny elektronů ESR 6 8 televizní 10 –10 jaderné spiny NMR 8 10 radiové vlny 10 –10 Vysvětlivky: IR - infračervené záření, AAS - atomová absorpční spektroskopie, AES - atomová emisní spektroskopie, AFS - atomová fluorescenční spektroskopie, MAS - molekulová absorpční spektroskopie, ESR - paramagnetická resonanční spektroskopie, NMR - nukleární magnetická rezonanční spektroskopie

2.1.1

Molekulová

absorpční

spektroskopie

v oblasti

ultrafialového

a viditelného záření Tato metoda je založena na absorpci záření chromofory v oblasti vlnových délek 190–800 nm. Při přechodu valenčních elektronů do vyšších energetických stavů dochází ke změnám vibračních a rotačních stavů molekuly, počet blízkých elektronových přechodů je značný. Tyto blízké přechody nelze rozlišit jako izolované čáry, ale výsledkem jsou absorpční 12

pásy, které se objevují kolem určité vlnové délky. Absorpční spektrum látky je grafické znázornění závislosti absorbance na vlnové délce. [2], [6] Systematickým sledováním UV-Vis spekter byla zjištěna souvislost mezi absorpčním spektrem a strukturou látek. Teoretickým výkladem těchto stavů se zabývá kvantová chemie. Látky, které se jeví jako bezbarvé, absorbují záření v oblasti ultrafialového záření. Látky, které absorbují z bílého světla některé vlnové délky, se jeví našemu oku jako barevné. Vlnová délka absorbovaného záření odpovídá barvě doplňkové (komplementární) k barvě, kterou vnímáme, viz tab. č. 2. Dopadá-li na předmět denní světlo a je jim zcela odráženo, jeví se předmět našemu oku jako bílý. Pokud předmět působí dojmem černé barvy, pohlcuje všechny paprsky, které na něho dopadají. [2], [7], [8] tab. č. 2: Souvislost mezi absorbovanou a komplementární barvou, spektrální barvy ve Vis Komplementární barva

Absorbovaná barva

λ [nm]

žlutozelené žluté oranžové červené purpurové fialové modré zelenomodré modrozelené

fialové modré zelenomodré modrozelené zelené žlutozelené žluté oranžové červené

380–435 435–480 480–490 490–500 500–560 560–580 580 - 595 595 - 610 610 - 750

Poznámka: Kombinací žlutých a modrých paprsků získáme denní světlo, ale smícháním modrého a žlutého barviva získáme zelenou barvu. Barvy uvedené v tabulce jsou orientační. Absorpční spektra a maximální absorbance při dané vlnové délce jsou charakteristické pro danou látku. Kvantitativní analýza je založena na Lambert-Beerově zákonu. Lambert-Beerův zákon =

∙ ∙

kde Aλ – absorbance při dané vlnové délce, ελ – dekadický absorpční koeficient při dané vlnové délce [l∙g-1∙cm-1], c – koncentrace [g∙l-1], l – šířka kyvety [cm] Absorbance je bezrozměrná a aditivní veličina, tj. pokud při dané vlnové délce absorbují záření dvě a více látek, je výsledná absorbance rovna součtu jednotlivých absorbancí.

13

=

=

∙

∙

kde Aλi – absorbance i–tého analytu při dané vlnové délce, ελi – dekadický absorpční koeficient i–tého analytu při dané vlnové délce [l∙g-1∙cm-1], ci – koncentrace i–tého analytu [g∙l-1], l – šířka kyvety [cm] Různé látky mají při dané vlnové délce rozdílnou absorbanci Aλ a rozdílný absorpční dekadický koeficient ελ. Tento koeficient je závislý na vlnové délce a analytu. Platnost zákona je ovlivněna odchylkami způsobenými disociací, asociací, polymerací, dimerací, tvorbou komplexů a dalšími reakcemi. Stanovení je prováděno v koncentračním rozsahu, kde závislost absorbance na koncentraci je lineární nebo se přímce blíží. Linearita je zachována přibližně do koncentrace 10-2 mol∙l-1, při vyšších koncentracích je závislost absorbance na koncentraci nelineární, viz obr. č. 1. [1], [2], [7] ,[9]

obr. č. 1: Závislost absorbance na koncentraci

2.1.1.1 Metody a přístroje Fotometrická a spektrofotometrická stanovení jsou založena na měření záření absorbovaného roztokem látky. U fotometrů jsou zdrojem monochromatického záření barevné filtry, u spektrofotometrů je záření získáváno pomocí hranolového nebo mřížkového monochromátoru. Zdrojem spojitého záření je např. H2, D2 výbojka, xenonová lampa, wolframová žárovka. [2], [5]

14

Absorpční prostředí tvoří kyveta s roztokem. Pro UV oblast (pod 350 nm) oblast se používají křemenné, pro Vis (350–800 nm) skleněné. Nejčastěji používaným rozpouštědlem je voda, která neabsorbuje záření v rozmezí vlnových délek 190–1000 nm. Některá organická rozpouštědla absorbují záření o určité vlnové délce, viz tab. č. 3. Je proto nutné volit takovou vlnovou délku, aby rozpouštědlo neabsorbovalo záření, které prochází roztokem, a tím neovlivňovalo výsledné absorpční spektrum látky. tab. č. 3: Rozpouštědla v UV spektrofotometrii Rozpouštědlo aceton acetonitril benzen chloroform cyklohexan ethanol

Spodní mez [nm] 330 220 280 245 210 215

Rozpouštědlo kyselina octová kyselina sírová methanol sirouhlík toluen voda

Spodní mez [nm] 270 210 210 380 285 190

Při měření je nutné určit z polychromatického záření úzkou oblast (vlnovou délku), kde absorbance nabývá svého maxima. Zdroj zářivé energie, může být jeden nebo dva, musí v požadovaném intervalu vlnových délek zajišťovat spojité záření o dostatečné intenzitě. Záření prochází roztokem vzorku v kyvetě nejčastěji o rozměru 1 cm, dopadá na detektor, kde signál je zesílen a veden do zapisovací části. Pro registraci záření se používají fotoelektrické detektory (selenový hradlový fotočlánek, fotonka, fotonásobič). Po dopadu záření na detektor vzniká fotoelektrický proud, který se měří mikroampérmetrem, kde na stupnici jsou hodnoty absorbance (= extinkce) nebo u modernějších přístrojů přímo koncentrace. Registrační spektrofotometry jsou vybaveny zapisovačem, který poskytuje grafický záznam spektra, tj. znázornění závislosti absorbance na vlnové délce. Obecné schéma spektrofotometru je znázorněno na obr. č. 2. Kvantitativní analýza se provádí porovnáním absorbance vzorku s absorbancí standardních roztoků různými metodami např. přídavku standardu, kalibrační křivky. [1], [2], [3], [7]

15

obr. č. 2: Obecné schéma spektrofotometru

2.2 Chromatografické metody Chromatografické metody umožňují kvalifikaci a kvantifikaci analytu v komplexních vzorcích se složitou matricí. Principem metody je rozdílná distribuce dělených látek mezi dvě nemísitelné fáze – mobilní a stacionární. Fází mobilní je kapalina nebo plyn, který protéká určitou rychlostí sorbentem v koloně a unáší analyzovanou látku. Fáze stacionární, kterou je buď kapalina, nebo pevná látka (velikost jednotky až stovky mikrometrů), je umístěná v koloně. Pro jednoduchost je zvykem označovat jakoukoli stacionární fázi jako sorbent. O průběhu separačního procesu v chromatografii rozhodují vzájemné interakce mezi stacionární fází, mobilní fází a analytem. Chromatografické metody lze rozdělit podle skupenství mobilní a stacionární fáze, viz tab. č. 4. Tato práce se věnuje vysokoúčinné kapalinové chromatografii, která bude popsána podrobněji. [2], [10] tab. č. 4: Základní rozdělení chromatografických metod Fáze mobilní

Fáze stacionární

plyn

kapalina

plyn

pevná látka

kapalina

kapalina

kapalina

kapalina

kapalina

pevná látka

kapalina

pevná látka

Technika plynová rozdělovací chromatografie plynová adsorpční chromatografie kapalinová rozdělovací chromatografie gelová permeační chromatografie kapalinová absorpční chromatografie iontově výměnná chromatografie

Zkratka GLC GSC LLC GPC LSC IEC 16

2.2.1

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Při vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC = High Performance Liquid Chromatography) je vzorek unášen mobilní fází, která je přiváděna do systému za zvýšeného tlaku pomocí čerpadla. Vzorek je postupně zachycován stacionární fází, která je umístěna v koloně. Míra zachycování je ovlivněna afinitou analytu k dané stacionární fázi, tedy na konci kolony jsou látky zachycované méně (látky s menší afinitou vůči stacionární fázi). Při průchodu detektorem jsou separované zóny analytů vycházející z kolony zaznamenávány a signál je převeden do chromatografického záznamu – chromatogramu (časová závislost intenzity vybrané veličiny), který obsahuje píky eluční křivky. Schematické znázornění separace analytů v koloně je na obr. č. 3. Jednotlivé části chromatografu jsou znázorněny na obr. č. 4.

obr. č. 3: Separace směsi dvou látek v chromatografickém zařízení

obr. č. 4: Schéma HPLC zařízení 17

Podle povahy mobilní fáze, která se čerpá pomocí pístového nebo membránového čerpadla, se eluce dělí na izokratickou, kdy mobilní fáze má konstantní složení o stejné eluční síle, a gradientovou, kdy složení mobilní fáze je programově měněno během měření. Čím větší je hodnota retenčního času, tím déle daná látka setrvává v koloně, kde přechází mnohokrát z mobilní fáze do stacionární a zpět. Počet interakcí mezi mobilní a stacionární fází určují pořadí analytu v koloně. Po zavedení vzorku, který je unášen mobilní fází, se jednotlivé složky pohybují stejnou rychlostí jako mobilní fáze, nebo jsou vázány na povrchu sorbentu, a tedy se nepohybují vůbec. Navenek se jeví, že vzorek putuje kolonou konstantní rychlostí. Před nástřikem vzorku na kolonu je nutné provést odplynění mobilní fáze, aby nedošlo poškození stacionární fáze uvnitř kolony. Po průchodu kolonou jsou jednotlivé separované zóny zaznamenány detektorem a vyhodnoceny příslušným softwarem. [2], [9], [10]

2.2.1.1 Základní charakteristiky chromatogramu Kvalitativní informaci chromatogramu popisuje retenční čas, zatímco pro určení kvantity stanovaného analytu ve vzorku se využívá plochy a výšky píků, které rostou s obsahem složky ve vzorku. [2], [4], [9], [10] Retenční (eluční) čas tR – doba od nástřiku analyzované látky po dosažení maxima píku (eluční křivky) – kvalitativní charakteristika, viz obr. č. 5 Mrtvý retenční čas

– retenční čas složky, která není na koloně zadržována (pohybuje se

stejnou rychlostí jako mobilní fáze), viz obr. č. 5 Retenční (eluční) objem VR – objem mobilní fáze, která proteče kolonou za dobu retenčního času. Vztah pro výpočet je

=

∙

, kde Fm je objemový průtok mobilní fáze

Plocha píku A [min2], výška píku h – kvantitativní charakteristiky, viz obr. č. 5

18

obr. č. 5: Kvalitativní a kvantitativní charakteristiky chromatogramu (plocha píku – A; výška píku – h; mrtvý retenční čas – t0; retenční čas – tR) Retenční faktor k – míra retence dělených látek Redukovaný retenční čas

´

– strávený čas analytu ve stacionární fázi

Střední lineární rychlost mobilní fáze

2.2.1.1

:

´

=

−

= , kde L je délka kolony

Rozlišení píků

V ideálním případě by píky měly být rozlišeny na základní linii s ostrým ohraničením. Nejčastějším problémem při separaci je tzv. chvostování píku, které lze pozorovat při separaci bazických látek. Méně častým a těžko odstranitelným je pík frontující. Na chromatogramu se mohou objevit negativní píky nebo více či méně píků, než se očekává, což může být způsobeno nečistotami ve vzorku nebo přítomností více izomerních struktur. Další příčinou většího počtu píků v chromatogramu může být, rozklad vzorku v průběhu separace. Menší počet pozorovaných píků může být způsoben snížením účinnosti kolony, nízkou koncentrací stanovovaného analytu nebo špatně zvolenou mobilní fází. Při dávkování velkého množství vzorku o vysoké koncentraci analytu může docházet k saturaci detektoru a tím vzniku tzv. plat („uřezaných píků“) místo píků s gaussovským profilem. Vliv rozmývání eluční zóny na tvar píku je znázorněno na obr. č. 6. [10], [11]

19

obr. č. 6: Vliv rozmývání eluční zóny na tvar píku Kvalitu separace popisují následující parametry: Rozlišení

,

– míra kvality separace dvou sousedních píků 1 a 2 ,

−

=

/2

kde tR1, tR2 – retenční časy složek 1, 2, w1, w2 – šířka píků na úrovni základní linie Selektivita α #= kde k1, k2 – retenční faktory,

´

,

´

´ ´

$ $

– redukované retenční časy [10]

2.2.1.2 Účinnost chromatografické kolony Požadavkem je stanovení analytů v co nejkratším čase s píky blížící se gaussovskému profilu. Účinnost kolony charakterizuje bezrozměrná veličina N, která je nazývána počet teoretických pater. Celá kolona je rozdělena na velké množství pater (elementárních jednotek), ve kterých dochází k ustavení rovnováhy. Difúze ve směru mobilní fáze je zanedbatelná a průtok mobilní fáze se uskutečňuje po malých přírůstcích o objemu patra, tedy není kontinuální.

20

Počet teoretických pater N % = 16 ∙ kde w – šířka píku při jeho základně, tR – retenční čas Účinnost chromatografických kolon lze porovnávat na základě hodnot výškového ekvivalentu teoretického patra. Výškový ekvivalent teoretického patra H – Výškový ekvivalent teoretického patra je délka kolony, v níž se dosahuje rovnováhy mezi oběma fázemi [µm] (=

) %

Cílem je dosáhnout největšího počtu teoretických pater – maximální účinnosti. Rozlišení dvou sousedících píků je možné snížením průtokové rychlosti mobilní fáze, použitím delší kolony nebo zapojením kolony s jemnějším zrněním sorbentu. Všechny zmíněné kroky vedou ke zvýšení počtu teoretických pater a tím k zlepšení separace. Další možností je zvýšení retenčního faktoru např. mobilní fáze s menší eluční silou. [10]

2.3 Potravinářská barviva V této práci budou analyzována potravinářská barviva spektrofotometricky a metodou HPLC. Potravinářská barviva se používají na zlepšení vzhledu potravin jako doklad jejich čerstvosti a zralosti nebo pro dodání typické příchutě (např. pistáciová zmrzlina). Barviva se mohou přidávat pro asociaci opatrnosti vůči dané potravině, např. červené barvivo v chilli. Ztráta jasné barvy potraviny během výrobního procesu je dalším důvodem přidávání barviv do potravin. [14], [15] Barviva ovšem mohou mít také negativní dopad na lidské zdraví, zejména pokud se konzumují ve větším množství. Některá z dříve používaných barviv byly karcinogenní, z důvodu ochrany spotřebitele je nutné povolené druhy barviv a jejich množství kontrolovat. [16], [17] Potravinářská barviva se dělí do kategorií dle různých parametrů.

21

Dělení barviv podle původu: •

Přírodní barviva

•

Syntetická barviva identická s přírodními

•

Syntetická barviva

Přírodní barviva Jsou součástí potravin živočišného nebo rostlinného původu, patří sem např. pigmenty řas, hub, lišejníků či mikroorganismů. Řadí se mezi ně i barevné látky získané z přírodních surovin, které se získávají technologickými procesy, např. karamel. Do této skupiny lze zařadit rovněž anorganické pigmenty, např. oxid titaničitý. [15], [17] Podle struktury se přírodní barviva dělí na: •

Dusíkaté heterocyklické sloučeniny – pigmenty odvozené od pyrrolu, indolu, isochinolinu atd.

•

Kyslíkaté heterocyklické sloučeniny – fenolové sloučeniny zejména tzv. flavonoidy

•

Fenoly – stilbeny, kurkuminoidy, chinony atd.

•

Terpenoidy – tetraterpernové pigmenty zvané karotenoidy, iridoidy

Syntetická barviva Mají intenzivnější barvu, která má stálejší odstín a nevnáší charakteristickou chuť a vůni jako přírodní barviva. Jsou levnější a stabilnější než přírodní barviva. Podle struktury se dělí na: •

Azobarviva

•

Difenylmethanová a trifenylmethanová barviva

•

Pyrazolonová barviva

•

Nitrobarviva barviva

•

Xanthenová barviva

•

Antrachinonová barviva

•

Chinolinová barviva

•

Indigoidní barviva

22

Dle rozpustnosti se dělí na barviva: •

Rozpustná ve vodě

•

Rozpustná v tucích

Dle fyzikálně–chemických vlastností se rozdělují na barviva: •

Kyselá – látky, které obsahují sulfonové, karboxylové a hydroxid skupiny (patří sem většina azobarviv, některá di- a trifenylmethanová barviva, nitrobarviva)

•

Zásaditá – obsahují jednu nebo více volných nebo substituovaných aminoskupin (patří sem většina di- a trifelmenthanových barviv a některá azobarviva)

•

Neutrální [15], [17] V této práci budou analyzována barviva žluť SY (E110), karmín (E120) a brilantní

modř (E133), která jsou rozpustná ve vodě. Žluť SY – E110 Toto žluto-oranžové barvivo s názvem Sunset Yellow je syntetické barvivo, které je hojně využívané v nealkoholických nápojích, sladkostech, pekařských výrobcích, marcipánu, zmrzlině nebo v hořčici. Dříve se vyrábělo z uhelného dehtu, ale nyní o výrobním procesu není moc informací. Žluť SY řadí se do skupiny azobarviv, viz obr. č. 7, chemicky odvozené je od látky Sudan I, což je prokázaný karcinogen a objevuje ve žluti jako nečistota. Nežádoucími účinky barviva E110 jsou alergické reakce (např. kopřivka), zvracení, průjem, otoky kůže atd. Tato látka je zakázána v Norsku a Finsku, ale je podaný návrh na zákaz po celé EU. Denní limit je 4 mg na 1 kg tělesné hmotnosti. [18] OH N N NaO3S

SO 3Na

obr. č. 7: Strukturní vzorec žluti SY Brilantní modř – E133 Toto jasně modré barvivo s názvem brilantní modř (brilliant blue FCF) je syntetické barvivo, které se vyrábí z uhelného dehtu. Jedná se o trifenylmethanové barvivo jeho strukturní vzorec je na obr. č. 8. Používá se k barvení mnoha látek např. cukrovinek, limonád,

23

cereálií, pudinků, ale využívá se také v kosmetickém průmyslu např. do barvy na vlasy, deodorantů, make-upech nebo zubní pasty. Studie nežádoucích účinků, které byly prováděny na krysách, zjistily výskyt zhoubných nádorů v místě vpichu po jehle. Výzkumy na dobrovolných pacientech prokázaly toxicitu barviva, negativními účinky byly pokles tlaku, zbarvení moči, fekálií a pokožky. Maximální denní limit je 12,5 mg na kg tělesné hmotnosti. [19] CH3 N

+

O S O

-

O

O N O

O S O

O

-

-

S O

CH3

obr. č. 8: Strukturní vzorec brilantní modři

Košelina, karmíny – E120 Košelina je antrachinonové barvivo, živočišného původu. Získává se z oplodněných samiček červce nopálového (Dactylopius coccus), viz obr. č. 9, žijícího jako parazit na kaktusech, který pochází z Mexika. 22 % košeliny tvoří sušina hmyzu, hlavní barevnou složkou je kyselina karmínová, její vzorec je na obr. č. 10. Kyselina karmínová je stálá, ve vodě rozpustná. Intenzitu zbarvení jejího roztoku určuje pH (při pH ≈ 3 je oranžový, při pH ≈ 5,5 červený a při pH ≈ 7 purpurový). Hlinitý nebo hořečnatý lak kyseliny karmínové na hydroxidu hlinitém se označuje jako karmín (intenzivnější červené barvivo). Košelina může způsobovat rakovinu, alergické reakce a hyperaktivitu u dětí. Barvivo je vyžíváno v cukrovinkách, džemu, mléčných výrobcích nebo také ve farmaceutickém průmyslu k výrobě vnější struktury tabletek, v kosmetice se přidává do šampónů, očních stínů nebo rtěnek. Maximální denní limit je 5 mg na 1 kilogram tělesné hmotnosti. [17], [20], [21]

24

obr. č. 9: Červec nopálový – Dactylopius coccus CH2OH HO O

OH

O

CH3 COOH

HO OH HO

OH OH

O

obr. č. 10: Strukturní vzorec kyseliny karmínové

2.4 Stanovení potravinářských barviv Pro stanovení potravinářských barviv se dříve používaly především chromatografické, spektrofotometrické a elektrochemické metody. Při metodě spektrofotometrie v UV-Vis je často kvantitativní vyhodnocování často zatíženo velkou chybou 10–15 % z důvodu, že vzorky obsahují směsi barviv s podobnými absorpčními vlastnostmi. V současné době se využívají hlavně metody chromatografické (kapalinová chromatografie, iontově výměnná chromatografie apod.). [12] Např. metodou HPLC s detektorem s diodovým polem (DAD) umožňujícím snímání více vlnových délek bylo analyzováno 10 potravinářských barviv v 15 vzorcích jogurtů a mléčných výrobků. Jednalo se gradientovou eluci řízenou programově. Mobilní fází byl acetát amonný a směs methanol:acetonitril (80:20), průtok byl 1,2 ml∙min-1, byla použita kolona NUCLEODUR C18ec. Vzorky byly skladovány při 5 °C a upravovány náročným 25

postupem, kde prvním krokem byla reakce s K4Fe(CN)6∙3H2O a ZnSO4∙H2O kvůli přítomným proteinům. [13] Dále bylo metodou HPLC – DAD kvalitativně a i kvantitativně analyzováno 14 standardů barviv za méně než 50 min. Byla použita gradientová eluce, kde mobilní fází byl 100 mM methylacetát (pH 7,0) a acetonitril. Byla použitá kolona Purospher RP-18e a teplota byla udržována na 50 °C. [14] Izokratická eluce byla využita pro stanovení 11 syntetických barviv v 21 vzorcích nealkoholických nápojů na koloně DEVELOSIL ODS 5. Mobilní fází byla směs acetonitrilu s 50mM NaH2PO4, obsahující 2mM cetyltrimethylamoniumchlorid a 3mmo∙l-1 tetra-nhexylamoniumbromid (pH 3,0) = 3 : 2 (v/v). Z nápojů byla barviva nejdříve zachycena na kolonu s polyamidem a poté byla dávkována na HPLC systém. [12] V této práci budou analyzována barviva žluť SY (E110), brilantní modř (E133) a karmín (E120) spektrofotometricky a metodou HPLC.

2.5 Statistické vyhodnocení výsledků Při získání dat z jednotlivých měření je nutné je zpracovat, k tomu slouží popisná statistika. Popisná statistika je vědní disciplína, která popisuje a sumarizuje informace do tabulek, grafů, funkcí a číselných charakteristik pomocí matematických operací. Cílem je dané informace zpřehlednit, zhustit a popsat. Při zpracování dat se pracuje s výběrovým souborem a rozlišují se postupy výpočtů pro různý počet měření. Při zpracování dat bylo počítáno s následujícími vzorci. Aritmetický průměr *̅ – součet hodnot xi dělený jejich počtem n *̅ =

1 ,

*

Rozptyl s2 – střední hodnota kvadrátů odchylek od střední hodnoty - =

1 ,−1

* − *̅

Směrodatná odchylka s – kladná odmocnina rozptylu - = .26

Interval spolehlivosti L2,1, podle Deana a Dixona [6] )

,

= *̅ ± - ∙

0/ (1)

√,

kde 0/ (1) – kritická hodnota Studentova rozložení pro zvolenou hodnotu α a počet stupňů volnosti 3 = , − 1 (pro měření v této práci n = 3, α = 0,1 je roven 2,920)

K proložení souboru dat přímkou v grafu slouží regresní přímka –vystižení závislosti veličiny y na veličině x 4 =5 +5 ∙* kde 5 =

678 678

, 5 = 49 − 5 ∙ *̅ , kovariance - , s12 – směrodatná odchylka hodnot x [22]

27

3 Praktická část 3.1 Přístrojové vybavení Spektrofotometr WPA Lightwave II UV/Visible Spectrophotometer Výrobce: Biochrom, Cambridge, UK Rozsah vlnových délek: 190–1100 nm přesnost ± 2 nm Fotometrický rozsah absorbance: – 0,300-2,500 Zdroj světla: xenonová žárovka Optický systém: Monochromatická holografická mřížka Detektor: 1024 CCD array Počet kyvetových prostorů: 1 Kyveta: UV-Vis HPLC systém Výrobce: Watrex Praha s. r. o., Česká republika Separační kolona: Watrex 250 × 4 mm Reprosil 100, C18, 5 μm Pumpa: DeltaChrom™ P102 pump s maximálním pracovním tlakem 42 MPa a průtokem 0,01–9,99 ml∙min-1 Fotometrický detektor: UVD 250, měřící rozsah: 190–650 nm Vyhodnocovací software: EZ Start Dávkovací zařízení: DeltaChrom™ Manual Injection Kit s objemem 20 µl Metoda: metoda_test_245 nm Analytické váhy Pioneer (Ohaus) Schoeller instruments, s.r.o., Praha, Česká Republika Ultrazvuková lázeň SONOREX TECHNIK RM, výrobce: BANDELIN electronic GmbH & Co. KG

28

3.2 Chemikálie Rozpouštědla •

Destilovaná voda o Přístroj: Aqua osmotic 02A od firmy AquaOsmotic s.r.o., Tišnov, Česká Republika

•

Methanol – obsah 99,5 % o CAS: 67-56-1, výrobce: Lach:ner, Neratovice, Česká Republika

Standardy •

Karmín E120 o CAS: 1390-65-4, výrobce: Sigma-Aldrich, Peru

•

Brilantní modř E133 – čistota 97,0 % o CAS: 3844-45-9, výrobce: Sigma-Aldrich, Švýcarsko

•

Žluť SY E110 – čistota 90 % o CAS: 2783-94-0, výrobce: Sigma-Aldrich, Indie

Reálné vzorky Jako reálné vzorky pro stanovení potravinářských barviv byly vybrány nápoje: •

HELLO Sirup kiwi, výrobce: LINEA NIVNICE, a.s., o pro stanovení barviva E133

•

HELLO Ovocný sirup extra hustý jahoda, výrobce: LINEA NIVNICE, a.s. o pro stanovení barviva E120

•

CARTINE ACTIVITY DRINK ananas, výrobce: NUTREND D. S. o pro stanovení barviva E110

•

Puschkin Time Warp (zlatý), výrobce: Berentzen Distillers CR spol. s.r.o. o pro stanovení barviv E110 a E133

29

Příprava reálných vzorků Pro spektrofotometrické stanovení byly vzorky pipetovány do 50ml odměrné baněk a doplněny destilovanou vodou. Pro stanovení metodou HPLC byly vzorky pipetovány a do 25ml odměrné baňky a doplněny methanolem. Takto připravené vzorky byly vloženy na 7 minut do ultrazvukové lázně.

3.3 Spektrofotometrické stanovení barviv Standardní roztoky barviv E110 a E133 a reálné vzorky s barvivy E110, E120 a E133 byly rozpuštěny v destilované vodě, a byly dány na 7 minut do ultrazvukové lázně. Vzhledem neúplné rozpustnosti barviva E120 ve vodě se nejdříve rozpustilo v malém množství methanolu a doplnilo se destilovanou vodou, bylo opět vloženo do ultrazvukové lázně na 7 minut. Byl testován vliv methanolu na absorpční spektrum barviv a bylo zjištěno, že přídavek methanolu do směsi neměl vliv na absorpční vlastnosti. Pro stanovení barviv metodou kalibrační křivky a metodou přídavku standardu byl každý standard změřen v kyvetě při maximální vlnové délce, viz absorpční spektra na obr. č. 11. Absorpční spektra byla měřena u roztoků o koncentracích pro barvivo E110 0,008 g∙l-1, barvivo E133 0,03 g∙l-1 a pro barvivo E120 0,03 g∙l-1. Reálné vzorky byly měřeny třikrát stejným postupem. Zvolené maximální vlnové délky byly pro barvivo E110 483 nm, pro E133 409 nm a pro barvivo E120 530 nm.

obr. č. 11: Absorpční spektra barviv a) E110, b) E133, c) E120 30

Závislost absorbance na čase Měření časové závislosti absorbance bylo prováděno po 2 minutách po dobu 50 minut (barviva E110 a E120) a 130 minut (barvivo E133). Jednotlivé koncentrace měřených roztoků byly pro barvivo E110 0,008 g∙l-1, barvivo E133 0,03 g∙l-1 a pro barvivo E120 0,03 g∙l-1. U barviv E110 a E120 se absorbance po dobu 50 minut výrazně neměnila, viz obr. č. 12. Absorbance barviva E133 mírně stoupala, proto byla následující měření prováděna až po ustálení hodnot, což bylo po 50 minutě. Roztok s obsahem barviva E133 se vždy nechal 50 minut stát, až poté s ním bylo prováděno měření.

obr. č. 12: Časová závislost absorbanci barviv E110, E120, E133

3.3.1

Stanovení barviva E110 v reálném vzorku

Jako reálný vzorek obsahující toto barvivo byl vybrán CARTINE ACTIVITY DRINK ananas. Tento nápoj je světle žluté barvy, podle výrobce NUTREND D. S. měl by obsahovat žluté barvivo E110. Zásobní roztok barviva E110 byl o koncentraci 0,1 g∙l-1. Nejdříve byla sestavena kalibrační závislost, o koncentraci 0,001–0,01 g∙l-1 a body byly proloženy přímkou, viz obr. č. 13. Index determinace byl 0,9992, to znamená, že je regresní přímkou vysvětleno 99,92 % variability. Získaná přímka byla použita pro výpočet koncentrace barviva E110 v reálném vzorku, kde bylo měření prováděno na dvou koncentračních hladinách. Do dvou 50ml odměrných baněk bylo napipetováno 15 a 20 ml nápoje. Ze změřených absorbancí byla

31

pomocí vypočtena kalibrační přímky koncentrace 5,08 ± 0,24 mg barviva E110 v 1 litru nápoje, viz tab. č. 5.

obr. č. 13: Graf závislosti absorbance na koncentraci pro barvivo E110 tab. č. 5: Množství barviva E110 v nápoji Metoda kalibrační křivky V [ml]

∅

[-]

c [mg∙l-1]

interval spolehlivosti [mg∙l-1]

15

0,064

5,08

5,08 ± 0,24

20

0,094

5,37

5,37 ± 0,14

c [mg∙l-1]

interval spolehlivosti [mg∙l-1]

1,05

5,27 ± 0,10

Metoda přídavku standardu ∅

[-]

Nápoj

0,048

Nápoj + standard

0,185

Pro metodu přídavku standardu byly vzorky připraveny do dvou 50ml odměrných baněk, kde první obsahovala 10 ml nápoje a druhá obsahovala 10 ml nápoje a přídavek standardu 1,5 ml ze zásobního roztoku (0,1 g∙l-1). Metodou přídavku standardu bylo vypočtené množství 5,27± 0,02 mg na 1 litr nápoje, viz tab. č. 5. Metoda přídavku standardu v této práci byla počítána dle vzorce: =

1; 1;<=ř

−

1;

∙

6

∙

=ř

1;

32

kde Avz – změřená veličina vzorku (sirup, nápoj), Avz+př – změřená veličina standardu + vzorek, cst – koncentrace standardu, Vpř – objem přidaného zásobního roztoku, Vvz – objem vzorku Zatímco metodou kalibrační přímky obsah barviva E110 v CARTINE ACTIVITY DRINK ananas byl 5,08 ± 0,24 mg∙l-1, metodou přídavku standardu byl 5,27 ± 0,02 mg∙l-1. Přídavek standardu je přesnější metoda z důvodu, že zahrnuje veškerý obsah reálného vzorku. Nápoj obsahuje další žluté barvivo E102 s podobnou strukturou, které nebylo zahrnuto při metodě kalibrační přímky na rozdíl od metody přídavku standardu. Výrobce odmítl sdělit množství barviva E110 v nápoji. V ČR je maximální obsah barviva E110 50 mg∙l-1 nebo 50 mg∙kg-1, kde obě metody tento limit potvrdily. [23]

3.3.2

Stanovení barviva E133 v reálném vzorku

Jako reálný vzorek obsahující toto barvivo byl vybrán HELLO kiwi sirup. Tento sirup je jasně zelené, podle výrobce LINEA NIVNICE a.s. měl by obsahovat modré barvivo E133. Zásobní roztok barviva E133 byl o koncentraci 0,1 g∙l-1. Nejprve byla sestavena kalibrační závislost, o koncentraci 0,01–0,07 g∙l-1 a body byly proloženy přímkou, viz obr. č. 14. Index determinace byl 0,9993, to znamená, že je regresní přímkou vysvětleno 99,93 % variability. Získaná přímka byla použita pro výpočet koncentrace barviva E133 v sirupu, kde bylo měření prováděno na dvou koncentračních hladinách. Do dvou 50ml odměrných baněk bylo napipetováno 5 a 10 ml sirupu. Ze změřených absorbancí byla pomocí kalibrační přímky vypočtena koncentrace 209,3 ± 0,79 mg barviva E133 v 1 litru sirupu, viz tab. č. 6.

obr. č. 14: Graf závislosti absorbance na koncentraci pro barvivo E133

33

Pro metodu přídavku standardu byly vzorky připraveny do dvou 50ml odměrných baněk, kde první obsahovala 10 ml sirupu a druhá obsahovala 10 ml sirupu a přídavek standardu 7,5 ml ze zásobního roztoku (0,1 g∙l-1). Metodou přídavku standardu bylo vypočtené množství 196,7 ± 3,19 mg na 1 litr sirupu, viz tab. č. 6. tab. č. 6: Množství barviva E133 v sirupu Metoda kalibrační křivky V [ml]

∅

[-]

c [mg∙l-1]

interval spolehlivosti [mg∙l-1]

5

0,347

208,6

208,6 ± 1,79

10

0,689

209,3

209,3 ± 0,79

c [mg∙l-1]

interval spolehlivosti [mg∙l-1]

196,7

196,7 ± 3,19

Metoda přídavku standardu ∅

[-]

Sirup

0,678

Sirup + standard

0,936

Metodou kalibrační přímky obsah barviva E133 v HELLO kiwi sirup byl 209,3 ± 0,79 mg∙l-1, metodou přídavku standardu byl 196,7 ± 3,19 mg∙l-1, předpokládá se, že přídavek standardu je přesnější metoda z důvodu, protože zahrnuje veškerý obsah reálného vzorku. Nápoj obsahuje další žluté barvivo E160a, které danou analýzu mohlo zkreslit. Spektrofotometrické stanovení je ovlivněno dalším složením sirupu např. sacharidy, barvivy. Výrobce LINEA NIVNICE a.s. sdělil obsah barviva E133 v sirupu kiwi jako interval 2,0–2,4 mg∙kg-1, záleží na dané dávce sirupu. Vyšší obsah vypočteného barviva E133 mohl být způsoben dalším složením sirupu, pro správnější výsledky by bylo nutné reálný vzorek předem upravit nebo separovat. V ČR je maximální obsah barviva E133 50 mg∙l-1 nebo 50 mg∙kg-1 [23], ze známého množství od výrobce je vidět, že výsledek byl ovlivněn dalším složením sirupu.

3.3.3 Stanovení barviva E120 v reálném vzorku Jako reálný vzorek obsahující toto barvivo byl vybrán HELLO Ovocný sirup extra hustý, jahoda. Tento sirup je tmavě červené barvy, podle výrobce LINEA NIVNICE a.s. měl by obsahovat červené barvivo E120. Z důvodu velké hustoty sirupu bylo nutné odměřování provádět pomocí mikropipety s postupem pro husté roztoky.

34

Zásobní roztok barviva E133 byl o koncentraci 0,1 g∙l-1. Nejprve byla sestavena kalibrační závislost, pro koncentrace 0,01–0,07 g∙l-1 a body byly proloženy přímkou, viz obr. č. 15. Index determinace byl 0,9997, to znamená, že je regresní přímkou vysvětleno 99,97 % variability. Získaná přímka byla použita pro výpočet koncentrace barviva E120 v sirupu, kde bylo měření prováděno na dvou koncentračních hladinách. Do dvou 50ml odměrných baněk bylo napipetováno 7,5 a 10 ml sirupu. Ze změřených absorbancí byla pomocí kalibrační přímky vypočtena koncentrace 180,6 ± 0,95 mg barviva E120 v 1 litru sirupu, viz tab. č. 7.

obr. č. 15: Graf závislosti absorbance na koncentraci pro E120 Pro metodu přídavku standardu byly vzorky připraveny do dvou 50ml odměrných baněk, kde první obsahovala 10 ml sirupu a druhá obsahovala 10 ml sirupu a přídavek standardu 7,5 ml ze zásobního roztoku (0,1 g∙l-1). Metodou přídavku standardu bylo vypočtené množství 139,8 ± 0,74 mg na 1 litr sirupu, viz tab. č. 7. tab. č. 7: Množství barviva E120 v sirupu Metoda kalibrační křivky V [ml]

∅

[-]

c [mg∙l-1]

interval spolehlivosti [mg∙l-1]

7,5

0,272

182,0

182,0 ± 0,64

10

0,362

180,6

180,6 ± 0,95

c [mg∙l-1]

interval spolehlivosti [mg∙l-1]

139,8

139,8 ± 0,74

Metoda přídavku standardu ∅

[-]

Sirup

0,368

Sirup + standard

0,566

35

Metodou kalibrační přímky obsah barviva E120 v HELLO Ovocný sirup extra hustý, jahoda byl 180,6 ± 0,95 mg∙l-1, metodou přídavku standardu byl 139,8 ± 0,74 mg∙l-1. Nápoj obsahuje sacharidy, barvící a rostlinné extrakty, které nebyly zahrnuty při metodě kalibrační přímky na rozdíl od metody přídavku standardu a které mohly zkreslit danou analýzu. Vyšší obsah vypočteného barviva E120 je pravděpodobně způsoben dalším složením sirupu, pro správnější výsledky by bylo nutné reálný vzorek předem upravit nebo separovat. V ČR je maximální obsah barviva E120 50 mg∙l-1 nebo 50 mg∙kg-1 [23], kde metoda přídavku standardu tento limit potvrzuje.

3.3.4 Vícesložková analýza Úkolem vícesložkové analýzy je současné stanovení koncentrací popř. hmotnosti několika složek v roztoku vedle sebe. Obsahuje-li roztok větší počet vzájemně neinteragujích absorbujících složek, kde pro každou platí Lambert-Beerův zákon, je výsledná absorbance při dané vlnové délce dána součtem dílčích absorbancí jednotlivých složek, tedy = ∑@

@

∙

@

∙ .

kde Ai – absorbance roztoku při vlnové délce i, εik - dekadický absorpční koeficient k-té složky při i-té vlnové délce [l∙g-1∙cm-1], ck – koncentrace složky k-tého roztoku [g∙l-1], l – délka kyvety [cm] Stanovení koncentrací jednotlivých složek roztoku je možné, když A ≥ ,, tedy je-li roztok proměřen alespoň při tolika vlnových délkách, kolik je absorbujících látek v směsi. Výsledkem je i rovnic o n neznámých koncentrací. Ze závislosti absorbance na vlnové délce jednotlivých složek směsi se určí vlnové délky, kde absorbance nabývá svých největších rozdílů. Dekadické absorpční koeficienty se získají z kalibrační závislosti jednosložkového systému, dekadický absorpční koeficient n-té složky při i-té vlnové délce se vypočte z kalibrační přímky n-té složky při i-té vlnové délce, která prochází počátkem. [24] Podle postupu popsaného výše byly zvoleny vlnové délky ze absorpčních spekter, kde absorbance nabývají svých největších rozdílů, viz obr. č. 16 a obr. č. 17. Absorpční spektra byla měřena u roztoků o koncentracích pro barvivo E110 0,008 g∙l-1, barvivo E133 0,03 g∙l-1 a pro barvivo E120 0,03 g∙l-1. Pro dvojsložkovou analýzu barviv E110 a E133 byly zvolené vlnové délky 407 nm a 480 nm, pro barviva E110 a E120 vlnové délky 370 nm a 429 nm, pro E120 a E133 byly vlnové délky 466 nm a 575 nm. Pro třísložkovou analýzu barviv E110, E120 a E133 byly vybrány vlnové délky 407, 429 a 566 nm, viz tab. č. 8.

36

obr. č. 16: Graf závislosti absorbance na vlnové délce pro barviva a) E110 a E133 b) E120 a E133

obr. č. 17: Graf závislosti absorbance na vlnové délce pro barviva a) E110 a E120 b) E110, E120 a E133 tab. č. 8: Vlnové délky pro vícesložkovou analýzu barviv E110, E120 a E133 Kombinace barviv

λ [nm]

E110 + E133

407 a 480

E120 + E133

466 a 575

E110 + E120

429 a 370

E110 + E120 + E133

407, 429 a 566

Pomocí kalibračních závislostí jednosložkového systému tj. barviv E110, E120 a E133 při vybraných vlnových délkách, které jsou uvedeny v tab. č. 8, byly dopočteny dekadické absorpční koeficienty. Koncentrace kalibračních závislostí, které se proložily počátkem, byly pro barvivo E110 0,001–0,005 g∙l-1 a pro barviva E120 a E133 0,01–0,05 g∙l-1. Příklad vypočtení dekadického absorpčního koeficientu pro barvivo E110 při vlnové délce 407 nm. Nejdříve byly roztoky kalibrační závislosti barviva E110 o koncentracích 0,001–0,005 g∙l-1 změřeny při vlnové délce 407 nm. Po sestrojení kalibrační závislosti, která 37

se proložila počátkem, se dopočetla regresní přímka, tedy konkrétně y = 7,8727x, kde y je absorbance a x je koncentrace (tvar

=

∙ ∙ , l = 1 cm). Výsledný dekadický absorpční

koeficient složky E110 při vlnové délce 407 nm je 7, 87 l∙g-1∙cm-1. Tímto postupem byly získány všechny dekadické absorpční koeficienty, které jsou uvedeny v tab. č. 9. tab. č. 9: Dekadické absorpční koeficienty pro stanovené vlnové délky [l∙g-1∙cm-1]

λ [nm] E110

E120

E133

370

7,87

12,71

4,47

407

16,29

10,20

15,98

429

18,82

8,67

4,28

466

38,66

7,31

0,44

480

44,86

7,56

0,65

549

2,84

10,67

12,01

556

2,27

11,07

15,76

566

1,69

12,55

22,93

575

1,25

13,21

29,70

3.3.4.1 Modelové vzorky Do čtyř 50ml odměrných baněk byly vytvořeny modelové vzorky všech kombinací barviv o známých koncentracích (tj. E110 + E133, E110 + E120, E120 + E133 a E110 + E120 + E133). Jednotlivé koncentrace naměřených barviv byly pro E110 0,01 g∙l-1, pro E120 0,05 g∙l-1 a pro E133 0,02 g∙l-1. Připravené vzorky roztoků, které se doplnily vodou, byly proměřeny v kyvetě UV-Vis při vybraných vlnových délkách z absorpčních spekter barviv, které jsou uvedeny v tab. č. 8. Příklad pro kombinaci barviv E110 + E120 Do 50ml odměrné baňky se napipetovaly roztoky barviv E110 a E120 ze zásobního roztoků o koncentraci 0,1 g∙l-1, aby koncentrace barviva E120 byla 0,05 g∙l-1 a barviva E110 0,01 g∙l-1. Z tab. č. 8 vhodné vlnové délky jsou 370 a 429 nm, při kterých se daný roztok proměřil v kyvetě. Získané absorbance se dosadily do rovnice

=

C

∙

D

∙

E

∙

F

∙ ,

dekadické absorpční koeficienty barviv při stanovených vlnových délkách jsou v tab. č. 9,

38

l = 1 cm. Výsledkem jsou dvě rovnice o dvou neznámých, ze kterých se dopočetly koncentrace barviv E110 a E133. Sestavení rovnic: 0,720 = 7,87 ∙

J

0,647 = 18,82 ∙

J

∙ 1 + 12,71 ∙

J

∙1

∙ 1 + 8,67 ∙

J

∙1

tab. č. 10: Vícesložková analýza E110 a E120 λ [nm]

∅ [-]

370 429

0,720 0,647

pro E110 [l∙g-1∙cm-1] 7,87 18,82

pro 120 [l∙g-1∙cm-1] 12,71 8,67

E110 E120

Teoretická Vypočtená c [g∙l-1] c [g∙l-1] 0,0100 0,0116 0,0500 0,0495

Teoretická koncentrace barviva E110 byla 0,0100 g∙l-1 a vypočtená 0,0116 g∙l-1, teoretická koncentrace barviva E120 byla 0,0500 g∙l-1 a vypočtená 0,0495 g∙l-1, viz tab. č. 10. Je možné si všimnout podobnost teoretické a vypočtené koncentrace. Stejný postup měření a výpočtu byl aplikován na ostatní roztoky. tab. č. 11: Vícesložková analýza E110 a E133 λ [nm] 407 480

∅ [-]

0,512 0,475

pro E110 [l∙g-1∙cm-1] 16,29 44,86

pro E133 [l∙g-1∙cm-1] 15,98 0,65

E110 E133

Teoretická Vypočtená c [g∙l-1] c [g∙l-1] 0,0100 0,0103 0,0200 0,0216

E120 E133

Teoretická Vypočtená c [g∙l-1] c [g∙l-1] 0,0500 0,0481 0,0200 0,0213

tab. č. 12: Vícesložková analýza E120 a E133 λ [nm]

∅ [-]

466 575

0,361 1,268

pro E120 [l∙g-1∙cm-1] 7,31 13,21

pro E133 [l∙g-1∙cm-1] 0,44 29,70

tab. č. 13: Vícesložková analýza E110 , E120 a E133 λ [nm] 407 429 566

∅ [-]

1,029 0,740 1,094

pro E110 [l∙g-1∙cm-1] 16,29 18,82 1,69

pro E120 [l∙g-1∙cm-1] 10,20 8,67 12,55

pro E133 [l∙g-1∙cm-1] 15,98 4,28 22,93

Teoretická Vypočtená c [g∙l-1] c [g∙l-1] E110 0,0100 0,0132 E120 0,0500 0,0460 E133 0,0200 0,0215

39

Z tab. č. 10, tab. č. 11, tab. č. 12 a tab. č. 13 je možné si všimnout podobnosti teoretické a vypočtené koncentrace ve všech čtyřech modelových vzorcích barviv. Tento postup vícesložkové analýzy barviv je správný a dosti přesný. Nyní bude analytický postup aplikován na reálný vzorek alkoholického nápoje Puschkin, kde výrobce deklaruje složení mimo jiné i barviva E110 a E133.

3.3.4.2 Reálný vzorek Jako reálný vzorek pro vícesložkovou analýzu barviv metodu spektrofotometrie byl vybrán Puschkin Time Warp. Tento alkoholický nápoj je zlato-žluté barvy, kde výrobce Berentzen Distillers CR spol. s.r.o. deklaruje složení žlutého barviva E110 a modrého barviva E133. Do 50ml odměrné baňky bylo napipetováno 10 ml nápoje a doplněno destilovanou vodou. Vzorek byl třikrát změřen v kyvetě UV-Vis ve stejném směru při stanovených vlnových délkách 407 a 480 nm, viz tab. č. 8. Průměrné absorbance a dekadické absorpční koeficienty při 407 a 480 nm jsou uvedeny v tab. č. 14. tab. č. 14: Vícesložková analýza Puschkinu λ [nm] 407 480

∅ [-]

0,511 0,217

pro E110 16,29 44,86

pro E133 15,98 0,65

E110 E133

Vypočtená c [g∙l-1] 0,0044 0,0274

c [mg∙l-1] 22,2 ± 0,001 137,3 ± 0,001

Metodou vícesložkové analýzy obsah barviv v Puschkin Time Warp byl 22,2 mg barviva E110 a 137,3 mg barviva E133. Vyšší obsah vypočteného barviva E133 je pravděpodobně způsoben dalším složením nápoje, pro správnější výsledky by bylo nutné reálný vzorek předem upravit nebo separovat. V ČR je maximální obsah barviv E133 a E110 50 mg∙l-1 nebo 50 mg∙kg-1 [23]. Daný nápoj obsahoval další látky, které ovlivnily kvantifikaci např. glukózofruktózový sirup, E102 (potravinářská žluť), E129 (červeň Alurra AC). Pro správnější analýzu je nutné určit všechny vzájemně neinteragujích absorbujících složky, kde pro každou platí Lambert-Beerův zákon.

3.4 Stanovení barviv metodou HPLC Pro přípravu roztoků standardů barviv byl použit 99,5 % methanol, čímž došlo ke snížení šumu základní linie oproti použití vody jako rozpouštědla. Standardní roztoky byly

40

připravovány do 50ml odměrných baněk, doplněny methanolem, poté byly vloženy na 7 minut do ultrazvukové lázně. Pro separaci byla vybrána na základě literatury jako mobilní fáze 70% roztok methanolu [13]. Průtoková rychlost byla optimalizována s ohledem na dostatečné rozlišení píků během krátké doby analýzy. Pro jednosložkovou analýzu byl zvolen průtok 0,5 ml∙min-1, pro vícesložkovou byl kvůli většímu rozlišení jednotlivých píků zvolen průtok nižší (0,3 ml∙min-1), protože průtoková rychlost má vliv na kvalitu separace. Na začátku každé série měření a po jejím skončení byla kolona promývána mobilní fází po dobu 40 minut. Standardy o koncentraci 0,05 g∙l-1 pro barvivo E110 o koncentraci 0,1 g∙l-1 pro barvivo E133 byly změřeny třikrát při průtokové rychlosti 0,5 a 0,3 ml∙min-1 při vlnové délce 245 nm, nástřik vzorku byl 20 µl. Retenční časy barviv jsou uvedeny v tab. č. 15. Ukázka chromatogramu při průtoku 0,5 ml∙min-1 pro barvivo E110 a pro barvivo E133 při průtoku 0,3 ml∙min-1 jsou uvedeny na obr. č. 18. Barvivo E120 nebylo kvůli špatné rozpustnosti v použitých (voda, methanol) rozpouštědlech možné analyzovat pomocí HPLC za zvolených podmínek. Analýza barviva E120 by vyžadovala podrobnější optimalizaci přípravy vzorku a separačních podmínek. Z tohoto důvodu s ním nebylo dále pracováno. tab. č. 15: Retenční časy barviv E110 a E133 při průtoku 0,3 a 0,5 ml∙min-1 Průtoková rychlost [ml∙min-1] 0,5 0,3

Průměrný retenční čas [min] E110 E133 2,623 2,691 4,302 4,399

41

obr. č. 18: Chromatogram barviva a) E133 pří průtoku 0,3 ml∙min-1, c = 0,1 g∙l-1, nástřik 20µl b) E110 pří průtoku 0,05 ml∙min-1 c = 0,05 g∙l-1, nástřik 20µl

Z hodnot retenčního času pro jednotlivá barviva byla spočítána teoretická patra kolony, která jsou uvedena v tab. č. 16, kde je vidět, že při sníženém průtoku dochází ke zvýšení efektivnosti kolony (větší počet teoretických pater) a lepší separaci píků kvůli. tab. č. 16: Počet teoretických pater z retenčních časů standardů barviv a šířky píku pří jeho základně, kolona C18 Průtoková rychlost [ml∙min-1]

Průměrný retenční čas [min]

Průměrná šířka píku w [min]

Počet teoretických pater

E110

E133

E110

E133

E110

E133

0,5

2,623

2,691

0,662

0,692

251,2

241,8

0,3

4,302

4,399

1,001

0,857

295,5

421,6

3.4.1 Stanovení barviva E110 v reálném vzorku Jako reálný vzorek byl použit nápoj CARTINE ACTIVITY DRINK ananas světle žluté barvy, který ve svém složení mimo jiné deklaruje barvivo E110. Stanovení barviva bylo prováděno metodou přídavku standardu. Do dvou 25ml odměrných baněk bylo pipetováno 1 ml nápoje a přídavek činil 24 ml roztoku o koncentraci 0,025 g∙l-1, na kolonu C18 bylo dávkováno 20µl vzorku. Každý vzorek byl třikrát změřen, průměrné hodnoty retenčních časů a průměrné hodnoty velikosti ploch píků jsou zaznamenány v tab. č. 17 . Retenční čas stanovaného barviva E110 byl 2,62 minuty, velikosti ploch píků postupně činily 140959 a 209063 min2, viz obr. č. 19. Vypočtené množství barviva E110 v nápoji CARTINE ACTIVITY DRINK ananas pomocí přídavku standardu bylo 43,38 mg na 42

1 litr nápoje. Množství barviva v nápoji není výrobcem deklarováno, podle výsledků spektrofotometrie je předpokládáno, že daný obsah barviva je vyšší než skutečný obsah, možným vysvětlením je, daný vzorek obsahoval další žluté barvivo E102 s podobnou strukturou, což mohlo vést koeluci píků a tím falešně pozitivnímu navýšení výsledku. tab. č. 17: Množství barviva E110 metodou přídavku standardu v nápoji, kolona C18 Průměrná plocha píku [min2]

c [mg∙l-1]

interval spolehlivosti [mg∙l-1]

Nápoj

140959

43,38

43,38 / 2,57

Nápoj + standard

2090632

obr. č. 19: Chromatogram nápoje CARTINE ACTIVITY DRINK ananas s přídavkem standardu, nástřik vzorku 20 µl, kolona C18 V ČR je maximální obsah barviva E110 50 mg∙l-1 nebo 50 mg∙kg-1 [23], kde metodou HPLC bylo stanoveno bylo 43,38 mg∙l-1, tento limit nebyl dodržen, ale spektrofotometrické stanovení metodou kalibrační přímky (5,08 / 0,24 mg∙l-1) a metodou přídavku standardu (5,27 / 0,02 mg∙l-1) se jeví jako správnější výsledek z důvodu, kdyby nápoj obsahoval, tak velké množství barviva E110 měl by mnohem výraznější oranžovo-žluté zbarvení. Jako nejvhodnější metoda pro stanovení barviva E110 v CARTINE ACTIVITY DRINK ananas se jeví spektrofotometrická metodou přídavku standardu, kde je zahrnut veškerý obsah barviva.

3.4.2 Stanovení barviva E133 v reálném vzorku Jako reálný vzorek byl použit sirup HELLO kiwi sirup jasně zelené barvy, který ve svém složení mimo jiné deklaruje barvivo E133. Stanovení barviva bylo prováděno metodou 43

přídavku standardu. Do dvou 25ml odměrných baněk bylo pipetováno 0,5 ml sirupu a přídavek činil 24,5 ml roztoku o koncentraci 0,05 g∙l-1, na kolonu C18 bylo injektován 20 µl vzorku. Každý vzorek byl třikrát změřen, průměrné retenční časy a průměrné velikosti ploch píků jsou zaznamenány v tab. č. 18. Retenční čas stanovaného barviva E110 byl 2,69 minuty, velikosti ploch píků postupně činily 165338 a 827553 min2, viz obr. č. 20. Vypočtené množství barviva E133 v zeleném sirupu HELLO kiwi pomocí přídavku standardu bylo 61,17 mg barviva E133 na 1 litr sirupu. Výrobce LINEA NIVNICE a.s. sdělil obsah barviva E133 v sirupu kiwi jako interval 2,0–2,4 mg∙kg-1, záleží na dané dávce sirupu. Vyšší obsah vypočteného barviva E133 je možné vysvětlit dalším složením sirupu, pro správnější výsledky by bylo nutné reálný vzorek předem upravit nebo separovat. Ze známého množství od výrobce je vidět, že výsledek byl ovlivněn dalším složením sirupu např. žlutým barvivem E160a, která má podobnou strukturu jako barvivo E110. Z tab. č. 15 je možné si všimnout, že barviva E110 a E133 mají podobné retenční časy, tedy je usouzeno i barvivo E160a bude mít podobný retenční čas, což mohlo vést ke koeluci píků a tím falešně pozitivnímu navýšení výsledku. tab. č. 18: Množství barviva E133 metodou přídavku standardu v sirupu, kolona C18 Průměrná plocha píku

c [mg∙l-1]

interval spolehlivosti [mg∙l-1]

Sirup

165338

61,17

61,17 ± 3,67

Sirup + standard

827553

44

obr. č. 20: Chromatogram sirupu HELO kiwi s přídavkem standardu, nástřik vzorku 20 µl, kolona C18 V ČR je maximální obsah barviva E110 50 mg∙l-1 nebo 50 mg∙kg-1 [23], avšak metodu HPLC stanovené hodnoty obsahu barviva tuto maximální hodnotu překročila o více než 11 mg∙l-1. Spektrofotometrické stanovení přineslo taktéž rozdílné vysoké hodnoty výsledků, metodou kalibrační přímky bylo 209,3 ± 23,9 mg∙l-1 a metodou přídavku standardu bylo 186,1 ± 4,38 mg∙l-1.

3.4.3 Vícesložková analýza Pomocí HPLC metody byl proveden pokus vícesložkové analýzy za stejných podmínek měření v reálném vzorku alkoholického nápoje Puschkin Time Warp, u kterého výrobce deklaruje obsah barviv E110 a E133. Pro dosažení lepší separační účinnosti, byla snížena průtoková rychlost mobilní fáze na 0,3 ml∙min-1. Do 25ml odměrné baňky byly připraveny roztoky, kde bylo 0,5 ml reálného vzorku doplněný methanolem, přídavek barviva E110 byl 2 ml roztoku barviva o koncentraci 0,05 g∙l-1 a přídavek barviva E133 byl 7,5 ml barviva E133 o koncentraci 0,1 g∙l-1. Každý vzorek byl třikrát injektován, retenčních časy barviv E110 a E133 jsou velmi blízké, viz tab. č. 15 (4,302 a 4,339 minuty), proto docházelo k koleuci píků, viz obr. č. 21. Pro další stanovení barviv by bylo potřeba optimalizovat podmínky separace, z tohoto důvodu nebyla vícesložková analýza realizována. .

45

obr. č. 21: Chromatogram vícesložková analýza Puschkinu a) přídavek E133 b)přídavek E110

3.5 Srovnání metod Spektrofotometrická metoda pracuje s analytem v kyvetě, oproti tomu metoda HPLC separuje jednotlivé zóny, což je výhodnější z důvodu zabránění ovlivnění dalším složením zkoumané látky. Přesnější metoda je metoda přídavku standardu, protože měření zahrnuje složení reálného vzorku oproti metodě kalibrační přímky, i když regresní přímka má vysoký koeficient determinace. V této práci nejvhodnější metoda pro stanovení barviva E110 v CARTINE ACTIVITY DRINK ananas se jeví spektrofotometrická metodou přídavku standardu, jelikož pravděpodobně u HPLC metody došlo ke koeluci píků ostatních barviv a tím falešně pozitivnímu navýšení výsledné hodnoty. Pro stanovení barviva E133 v HELLO kiwi sirup se nejvíce blížila správnějšímu výsledku metoda HPLC, kde docházelo separaci jednotlivých složek oproti metodě spektrofotometrické. Pokud by byly optimalizovány podmínky metody HPLC např. změněním mobilní fáze, aby rozdělila všechny zóny přítomných látek na jednotlivé píky, tato metoda by byla nejvhodnější pro správnou kvantifikaci barviv v nápoji. Další možností větší správnosti výsledků by bylo nutné reálné vzorky upravit nebo separovat barviva, které by následně mohla být analyzována.

46

4 Závěr Tato práce se zabývala stanovením potravinářských barviv spektrofotometricky a metodou HPLC. Cílem práce byl vývoj metody pro vícesložkovou spektrofotometrickou analýzu potravinářských barviv, vývoj analytického postupu pro stanovení potravinářských barviv metodou HPLC a analýza reálných vzorků. Prvním úkolem byl vývoj postupu spektrofotometrické analýzy. Pro analýzu jako rozpouštědlo byla zvolena voda a vlnové délky byly zjištěny z absorpčních spekter barviv E110, E120 a E133. Při zvolených podmínkách byly analyzovány tři reálné vzorky metodou kalibrační přímky a metodou přídavku standardu. Reálné vzorky nápojů byly HELLO sirup kiwi s obsahem barviva E133, HELLO ovocný sirup extra hustý s barvivem E120 a CARTINE ACTIVITY DRINK ananas, který obsahoval barvivo E110. Metoda přídavku standardu zahrnuje obsah nápoje. Při analýze bylo kvantitativní vyhodnocování ovlivněno dalším složením nápojů jako např. barvivy, sacharidy apod., pro správnější výsledky by bylo nutné vzorek separovat nebo před samotnou analýzou upravit. Byl vyvinut analytický postup pro vícesložkovou analýzu metodou spektrofotometrie, jehož správnost byla ověřena na modelových vzorcích všech čtyřech kombinací barviv, a postup byl aplikován na reálném vzorku Puschkin Time Warp. Metodou HPLC, kde mobilní fáze byl 70 % roztok methanolu a průtokové rychlosti 0,5 ml∙min-1, byly analyzována barviva E110 a E133 za méně než 3 minut při vlnové délce 254 nm na koloně Watrex 250 × 4 mm Reprosil 100, C18. Tento postup byl aplikován na dva reálné vzorky HELLO sirup kiwi s obsahem barviva E133 a CARTINE ACTIVITY DRINK ananas s obsahem barviva E110 metodou přídavku standardu. Vyhodnocování bylo ovlivněno podobností retenčních časů dalšího složení nápoje, kde docházelo ke koeluci píků a tím navýšení výsledků. Součástí bakalářské práce bylo vytvoření úlohy pro praktikum z analytické chemie pro studenty, které je v příloze. Tato úloha byla vyzkoušena studentem v analytických laboratořích při výuce, kde průběh proběhl hladce bez komplikací a dle očekávaných výsledků.

47

Seznam literatury [1]

BEKÁREK, Vojtěch a Iveta FRYŠOVÁ. Optické metody v chemické analýze. 2., přeprac. vyd. Olomouc: Univerzita Palackého, 2003. ISBN 80-244-0605-5.

[2]

KŘÍŽEK, Martin a Jan ŠÍMA. Analytická chemie. 1. vyd. České Budějovice: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, 2015. ISBN 978-80-7394-486-5.

[3]

OPEKAR, František. Optické metody [online]. UK Praha, 2011 [cit. 2016-04-15]. Dostupné z: https://web.natur.cuni.cz/~opekar/analchem/anchem14a.doc

[4]

FARKOVÁ, Marta. Instrumentální analytická chemie - praktikum. Vyd. 1. Brno: Masarykova univerzita, 2011. ISBN 978-80-210-5534-6.

[5]

KANICKÝ, Viktor. Molekulová spektrometrie [online]. MU Brno [cit. 2015-10-15]. Dostupné z: https://is.muni.cz/auth/el/1431/jaro2015/C5230/um/mol.spektrom.cele.pdf

[6]

FARKOVÁ, Marta, Blanka VRBKOVÁ a Helena ZAVADILOVÁ. Metody chemického výzkumu - praktikum. Vyd. 1. Brno: Masarykova univerzita, 2012. ISBN 978-80-210-5783-8.

[7]

STUŽKA, Václav. Instrumentální metody chemické analysy. 1. vyd. Olomouc: Univerzita Palackého, 1975.

[8]

HABEL, Jiří. O světle [online]. ČVUT Praha, 2011 [cit. 2016-01-16]. Dostupné z: http://slideplayer.cz/slide/2011228/

[9]

KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003. ISBN 80-863-6907-2.

[10] NOVÁKOVÁ, Lucie a Michal DOUŠA. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1.

vyd.

Praha

[i.e.

Hradec

Králové]:

Lucie

Nováková,

2013.

ISBN 978-80-260-4243-3. [11] NOVÁKOVÁ, Lucie a Michal DOUŠA. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Praha [i.e. Hradec Králové]: Lucie Nováková, 2013. ISBN 978-80-260-42433. [12] Stanovení syntetických barviv v potravinách separačními metodami. Chemické listy. 95, (2001), 163-168. [13] BENTO, Waleska de Araújo Siqueira; LIMA, Bruno Parente; PAIM, Ana Paula S. Simultaneous determination of synthetic colorants in yogurt by HPLC. Food chemistry, 2015, 183: 154-160. 48

[14] KIRSCHBAUM, J., et al. Development and evaluation of an HPLC-DAD method for determination of synthetic food colorants. Chromatographia, 2003, 57.1: S115-S119. [15] KARANIKOLOPOULOS, G., et al. Determination of synthetic food colorants in fish products by an HPLC-DAD method. Food chemistry, 2015, 177: 197-203. [16] JORISSEN, Dave. High Sensitivity Analysis of 12 Synthetic Food Colorants by U-HPLC with Diode Array Detection [online]. Hitachi High Technologies America, Inc., z:

2008

[cit.

2016-05-05].

Dostupné

http://www.chromatographyonline.com/high-sensitivity-analysis-12-synthetic-

food-colorants-u-hplc-diode-array-detection [17] VELÍŠEK,

Jan. Chemie

potravin.

Vyd.

2.

upr.

Tábor:

OSSIS,

2002.

ISBN 80-866-5902-X. [18] E110 - Žluť SY (Cl potravinářská žluť 3) [online]. www [cit. 2016-05-26]. Dostupné z: http://www.zdravapotravina.cz/seznam-ecek/E110 [19] E133 - Brilantní modř FCF ( Cl potravinářská modř 2 ) [online]. www [cit. 2016-0526]. Dostupné z: http://www.zdravapotravina.cz/seznam-ecek/E133 [20] E120 - Košenila, kyselina karmínová, karmíny [online]. www [cit. 2016-05-26]. Dostupné z: http://www.zdravapotravina.cz/seznam-ecek/E120 [21] Dactylopius

coccus [online].

Španělsko,

2011

[cit.

2016-04-16].

Dostupné

z:http://www.biodiversidadvirtual.org/insectarium/Dactylopius-coccusimg184386.html [22] BUDÍKOVÁ, Marie, Pavel OSECKÝ a Štěpán MIKOLÁŠ. Popisná statistika. Vyd. 3., dopl. Brno: Masarykova univerzita, 1998. ISBN 80-210-1831-3. [23] Seznam barviv povolených při výrobě potravin nebo skupiny potravin a podmínky jejich

použití [online].

eAgri,

2008

[cit.

2016-05-05].

Dostupné

z: http://eagri.cz/public/web/mze/legislativa/ostatni/100065004.html [24] CÍDLOVÁ, Hana a Luděk JANČÁŘ. Vícesložková spektrofotometrická analýza: současné

stanovení

vybraných

potravinářských

barviv

v

nealkoholických

nápojích [online]. Katedra chemie PdF MU: [cit. 2016-05-27]. Dostupné z: http://www.ped.muni.cz/wchem/sm/hc/analchem/c.pdf

49

Seznam tabulek tab. č. 1: Oblasti elektromagnetického záření a jednotlivé spektrální metody ......................... 12 tab. č. 2: Souvislost mezi absorbovanou a komplementární barvou, spektrální barvy ve Vis . 13 tab. č. 3: Rozpouštědla v UV spektrofotometrii ....................................................................... 15 tab. č. 4: Základní rozdělení chromatografických metod ......................................................... 16 tab. č. 5: Množství barviva E110 v nápoji................................................................................ 32 tab. č. 6: Množství barviva E133 v sirupu................................................................................ 34 tab. č. 7: Množství barviva E120 v sirupu................................................................................ 35 tab. č. 8: Vlnové délky pro vícesložkovou analýzu barviv E110, E120 a E133 ...................... 37 tab. č. 9: Dekadické absorpční koeficienty pro stanovené vlnové délky ................................. 38 tab. č. 10: Vícesložková analýza E110 a E120 ........................................................................ 39 tab. č. 11: Vícesložková analýza E110 a E133 ........................................................................ 39 tab. č. 12: Vícesložková analýza E120 a E133 ........................................................................ 39 tab. č. 13: Vícesložková analýza E110 , E120 a E133 ............................................................. 39 tab. č. 14: Vícesložková analýza Puschkinu ............................................................................ 40 tab. č. 15: Retenční časy barviv E110 a E133 při průtoku 0,3 a 0,5 ml∙min-1.......................... 41 tab. č. 16: Počet teoretických pater z retenčních časů standardů barviv a šířky píku pří jeho základně, kolona C18 ............................................................................................................... 42 tab. č. 17: Množství barviva E110 metodou přídavku standardu v nápoji, kolona C18 .......... 43 tab. č. 18: Množství barviva E133 metodou přídavku standardu v sirupu, kolona C18 .......... 44

Seznam obrázků obr. č. 1: Závislost absorbance na koncentraci ......................................................................... 14 obr. č. 2: Obecné schéma spektrofotometru ............................................................................. 16 obr. č. 3: Separace směsi dvou látek v chromatografickém zařízení ....................................... 17 obr. č. 4: Schéma HPLC zařízení ............................................................................................. 17 obr. č. 5: Kvalitativní a kvantitativní charakteristiky chromatogramu (plocha píku – A; výška píku – h; mrtvý retenční čas – t0; retenční čas – tR).................................................................. 19 obr. č. 6: Vliv rozmývání eluční zóny na tvar píku .................................................................. 20 obr. č. 7: Strukturní vzorec žluti SY......................................................................................... 23 obr. č. 8: Strukturní vzorec brilantní modři .............................................................................. 24 obr. č. 9: Červec nopálový – Dactylopius coccus .................................................................... 25 50

obr. č. 10: Strukturní vzorec kyseliny karmínové .................................................................... 25 obr. č. 11: Absorpční spektra barviv a) E110, b) E133, c) E120 ............................................. 30 obr. č. 12: Časová závislost absorbanci barviv E110, E120, E133 .......................................... 31 obr. č. 13: Graf závislosti absorbance na koncentraci pro barvivo E110 ................................. 32 obr. č. 14: Graf závislosti absorbance na koncentraci pro barvivo E133 ................................. 33 obr. č. 15: Graf závislosti absorbance na koncentraci pro E120 .............................................. 35 obr. č. 16: Graf závislosti absorbance na vlnové délce pro barviva a) E110 a E133 b) E120 a E133 ....................................................................................................................................... 37 obr. č. 17: Graf závislosti absorbance na vlnové délce pro barviva a) E110 a E120 b) E110, E120 a E133 ............................................................................................................................. 37 obr. č. 18: Chromatogram barviva a) E133 pří průtoku 0,3 ml∙min-1, c = 0,1 g∙l-1, nástřik 20µl b) E110 pří průtoku 0,05 ml∙min-1 c = 0,05 g∙l-1, nástřik 20µl ................................................ 42 obr. č. 19: Chromatogram nápoje CARTINE ACTIVITY DRINK ananas s přídavkem standardu, nástřik vzorku 20 µl, kolona C18 ........................................................................... 43 obr. č. 20: Chromatogram sirupu HELO kiwi s přídavkem standardu, nástřik vzorku 20 µl, kolona C18 ............................................................................................................................... 45 obr. č. 21: Chromatogram vícesložková analýza Puschkinu a) přídavek E133 b)přídavek E110 .................................................................................................................................................. 46

51

PŘÍLOHA 1: Úloha do praktika z analytické chemie Analýza barviv metodou spektroskopie v oblasti UV/VIS CÍLE ÚLOHY •

Seznámit se spektrofotometrem a s jeho funkcemi

•

Kvantitativně analyzovat barviva v reálných vzorcích

•

Provést vícesložkovou analýzu barviv

TEORIE Spektrofotometrie je optická metoda, která je založena na absorpci záření chromofory v oblasti vlnových délek 190–800 nm. Při přechodu valenčních elektronů do vyšších energetických stavů dochází ke změnám vibračních a rotačních stavů molekuly, počet blízkých elektronových přechodů je značný. Tyto blízké přechody nelze rozlišit jako izolované čáry, ale výsledkem jsou absorpční pásy, které se objevují kolem určité vlnové délky. Absorpční spektrum látky je grafické znázornění závislosti absorbance na vlnové délce. Spektrofotometr je přístroj na měření světelné absorpce. Absorpční prostředí tvoří kyveta s roztokem. Pro UV oblast (pod 350 nm) oblast se používají křemenné, pro Vis (350– 800 nm) skleněné. Nejčastěji používaným rozpouštědlem je voda, která neabsorbuje záření v rozmezí vlnových délek 190–1000 nm. Při měření je nutné určit z polychromatického záření úzkou oblast (vlnovou délku), kde absorbance nabývá svého maxima. Zdroj zářivé energie, může být jeden nebo dva, musí v požadovaném intervalu vlnových délek zajišťovat spojité záření o dostatečné intenzitě. Záření prochází roztokem vzorku v kyvetě nejčastěji o rozměru 1 cm, dopadá na detektor, kde signál je zesílen a veden do zapisovací části. Pro registraci záření se používají fotoelektrické detektory (selenový hradlový fotočlánek, fotonka, fotonásobič). Po dopadu záření na detektor vzniká fotoelektrický proud, který se měří mikroampérmetrem, kde na stupnici jsou hodnoty absorbance (= extinkce) nebo u modernějších přístrojů přímo koncentrace. Registrační spektrofotometry jsou vybaveny zapisovačem, který poskytuje grafický záznam spektra, tj. znázornění závislosti absorbance na vlnové délce. Obecné schéma spektrofotometru je znázorněno na obr. č. 1.

52

obr. č. 1: Obecná schéma spektrofotometru Kvantitativní analýza se provádí porovnáním absorbance vzorku s absorbancí standardních roztoků různými metodami např. přídavku standardu, kalibrační křivky. Absorpční spektra a maximální absorbance při dané vlnové délce jsou charakteristické pro danou látku. Kvantitativní analýza je založena na Lambert-Beerově zákonu. Lambert-Beerův zákon =

∙ ∙

kde Aλ – absorbance při dané vlnové délce, ελ – dekadický absorpční koeficient při dané vlnové délce [l∙g-1∙cm-1], c – koncentrace [g∙l-1], l – šířka kyvety [cm] Absorbance je bezrozměrná a aditivní veličina, tj. pokud při dané vlnové délce absorbují záření dvě a více látek, je výsledná absorbance rovna součtu jednotlivých absorbancí. =

=

∙

∙

kde Aλi – absorbance i–tého analytu při dané vlnové délce, ελi – dekadický absorpční koeficient i–tého analytu při dané vlnové délce [l∙g-1∙cm-1], ci – koncentrace i–tého analytu [g∙l-1], l – šířka kyvety [cm] Různé látky mají při dané vlnové délce rozdílnou absorbanci Aλ a rozdílný absorpční dekadický koeficient ελ. Je-li c vyjádřena v g∙l-1 a šířka kyvety v cm, pak koeficient ελ je v l∙ L-1∙cm-1. Tento koeficient je závislý na vlnové délce a analytu.

53

V této úloze se budou metodou spektrofotometrie stanovovat potravinářská barviva s využitím Lambert-Beerova zákona. Potravinářská barviva Potravinářská barviva se používají na zlepšení vzhledu potravin jako doklad jejich čerstvosti a zralosti nebo pro dodání typické příchutě (např. pistáciová zmrzlina). Barviva se mohou přidávat pro asociaci opatrnosti vůči dané potravině, např. červené barvivo v chilli. Ztráta jasné barvy potraviny během výrobního procesu je dalším důvodem přidávání barviv do potravin. Barviva ovšem mohou mít také negativní dopad na lidské zdraví, zejména pokud se konzumují ve větším množství. Některá z dříve používaných barviv byly karcinogenní, z důvodu ochrany spotřebitele je nutné povolené druhy barviv a jejich množství kontrolovat. V této úloze budou analyzována barviva žluť SY (E110), karmín (E120) a brilantní modř (E133), která jsou rozpustná ve vodě. Žluť SY – E110 Toto žluto-oranžové barvivo s názvem Sunset Yellow je syntetické barvivo, které je hojně využívané v nealkoholických nápojích, sladkostech, pekařských výrobcích, marcipánu, zmrzlině nebo v hořčici. Dříve se vyrábělo z uhelného dehtu, ale nyní o výrobním procesu není moc informací. Žluť SY řadí se do skupiny azobarviv, viz obr. č. 2, chemicky odvozené je od látky Sudan I, což je prokázaný karcinogen a objevuje ve žluti jako nečistota. Nežádoucími účinky barviva E110 jsou alergické reakce (např. kopřivka), zvracení, průjem, otoky kůže atd. Tato látka je zakázána v Norsku a Finsku, ale je podaný návrh na zákaz po celé EU. Denní limit je 4 mg na 1 kg tělesné hmotnosti. OH N N NaO3S

SO 3Na

obr. č. 2: Strukturní vzorec žluti SY Brilantní modř – E133 Toto jasně modré barvivo s názvem brilantní modř (brilliant blue FCF) je syntetické barvivo, které se vyrábí z uhelného dehtu. Jedná se o trifenylmethanové barvivo jeho 54

strukturní vzorec je na obr. č. 3. Používá se k barvení mnoha látek např. cukrovinek, limonád, cereálií, pudinků, ale využívá se také v kosmetickém průmyslu např. do barvy na vlasy, deodorantů, make-upech nebo zubní pasty. Studie nežádoucích účinků, které byly prováděny na krysách, zjistily výskyt zhoubných nádorů v místě vpichu po jehle. Výzkumy na dobrovolných pacientech prokázaly toxicitu barviva, negativními účinky byly pokles tlaku, zbarvení moči, fekálií a pokožky. Maximální denní limit je 12,5 mg na kg tělesné hmotnosti. CH3 +

N

O S O

-

O

O N O

O S O

-

S O

CH3 O

-

obr. č. 3: Strukturní vzorec brilantní modři

Košelina, karmíny – E120 Košelina je antrachinonové barvivo, živočišného původu. Získává se z oplodněných samiček červce nopálového (Dactylopius coccus), viz obr. č. 4, žijícího jako parazit na kaktusech, který pochází z Mexika. 22 % košeliny tvoří sušina hmyzu, hlavní barevnou složkou je kyselina karmínová, její vzorec je na obr. č. 5. Kyselina karmínová je stálá, ve vodě rozpustná. Intenzitu zbarvení jejího roztoku určuje pH (při pH ≈ 3 je oranžový, při pH ≈ 5,5 červený a při pH ≈ 7 purpurový). Hlinitý nebo hořečnatý lak kyseliny karmínové na hydroxidu hlinitém se označuje jako karmín (intenzivnější červené barvivo). Košelina může způsobovat rakovinu, alergické reakce a hyperaktivitu u dětí. Barvivo je vyžíváno v cukrovinkách, džemu, mléčných výrobcích nebo také ve farmaceutickém průmyslu k výrobě vnější struktury tabletek, v kosmetice se přidává do šampónů, očních stínů nebo rtěnek. Maximální denní limit je 5 mg na 1 kilogram tělesné hmotnosti.

55

obr. č. 4: Červec nopálový – Dactylopius coccus CH2OH HO O

OH

O

CH3 COOH

HO OH HO

OH OH

O

obr. č. 5: Strukturní vzorec kyseliny karmínové Chemikálie Methanol, standardy barviv: Carmine (E120), Brilliant Blue FCF (E133), Sunset Yellow FCF (E110), reálné vzorky obsahující E110, E120 a E133 např.: HELLO sirup kiwi (E133), CARTINE ACTIVITY DRINK ananas (E110), Puschkin Time Warp (E110 + E133) Sklo 100ml odměrná baňka (3×), 50ml odměrná baňka (26×), pipetovací balónek, pipety dělené (5ml, 20ml) a nedělené (10ml), plastové kapátko, kyveta pro UV/VIS, navažovací lodička Přístroje Spektrofotometr (Typ: Biochrom WPA Lightwave II UV/Visible Spectrophotometer), ultrazvuková lázeň (SONOREX TECHNIK RM), analytické váhy (Pioneer Ohaus Schoeller instruments)

56

PRACOVNÍ POSTUP

Příprava kalibračních roztoků, měření absorpčních spekter Zásobní roztoky Do tří 100ml odměrných baněk připravíme zásobní roztoky barviv E110, E120 a E133 o koncentraci 0,1 g∙l-1. Vypočtené množství barviva E110, popř. E133 odvážíme na analytických vahách, kvantitativně spláchneme do 100ml odměrné baňky a doplníme destilovanou vodou po rysku. Vypočtené množství barviva E120 odvážíme na analytických vahách, pomocí střičky s methanolem kvantitativně spláchneme do 100ml odměrné baňky a přidáváme methanol do té doby, dokud se barvivo nerozpustí (přibližně 8-10 ml methanolu). Poté 100ml odměrnou baňku doplníme destilovanou vodou po rysku. Takto připravené roztoky vložíme na 7 minut do ultrazvukové lázně. Roztoky pro kalibrační křivky Do pěti 50ml odměrných baněk odpipetujeme takové množství zásobního roztoku, aby výsledná koncentrace pro barvivo E110 byla 0,006; 0,007; 0,008; 0,009 a 0,01 g∙l-1. Baňky doplníme destilovanou vodou po rysku. Stejným postupem napipetujeme takové množství zásobního roztoku, aby koncentrace barviva E120 byly 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 a 0,05 g∙l-1 a barviva E133 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 a 0,05 g∙l-1. Pokud je potřeba, vložíme roztoky na 7 minut do ultrazvukové lázně. Práce s kyvetou Kyvetu držíme vždy za matnou část, plníme ji maximálně do 2/3 celkového objemu, před měřením ji zbavíme nečistot pomocí vatových tampónků. Při vkládání do kyvetového prostoru dbáme zvýšené opatrnosti, aby nedošlo k vylití roztoku. Kyvetu vždy vkládáme stejným směrem do spektrofotometru a paprsek procházel přes průhlednou část. Měření absorpčních spekter Pomocí spektrofotometru změříme absorpční spektra roztoků barviv E110, E120 a E133 v rozsahu vlnových délek 350–650 nm. Pro roztok barviva E110 o koncentraci 0,008 g∙l-1, pro barviva E120 a E133 roztok o koncentraci 0,03 g∙l-1. Spustíme spektrofotometr, měříme následujícím postupem:

57

a) Na spektrofotometru zvolíme metodu 3. wavescan → potvrdíme zeleným tlačítkem (ok), pomocí šipek a numerické klávesnice nastavíme rozsah 350 až 650 nm → zelené tlačítko (ok). b) Kyvetu naplníme destilovanou vodou a vložíme do kyvetového prostoru → vynulujeme stisknutím modrého tlačítka. c) Kyvetu naplníme příslušným roztokem barviva a vložíme do kyvetového prostoru → zelené tlačítko na spektrofotometru, vybereme a zapíšeme vlnovou délku, kdy absorbance nabývá svého maxima, graf absorpčního spektra a data exportujeme do počítače. Bod c) opakujeme u všech měřených roztoků (získáme tři spektra pro barviva E110, E120 a E133). Měření absorbancí kalibračních závislostí, sestavení kalibračních křivek Při maximální vlnové délce z absorpčního spektra proměříme všech pět roztoků kalibrační závislosti pro dané barvivo. Doporučené vlnové délky jsou pro barviva E110 483 nm, pro E120 530 nm a pro E133 409 nm. Porovnáme ji se získanými maximy ze spekter, příp. odchylky konzultujeme s vyučujícím. a) Červeným tlačítkem se dostaneme na úvodní stránku spektrofotometru, zvolíme metodu 1. single wavelength, pomocí numerické klávesnice a šipek nastavíme vlnovou délku → zelené tlačítko. b) Kyvetu naplníme destilovanou vodou a vložíme do kyvetového prostoru → vynulujeme stlačením modrého tlačítka. c) Kyvetu naplníme prvním roztokem kalibrační křivky daného barviva a vložíme do kyvetového prostoru → zelené tlačítko, zapíšeme hodnotu absorbance. Kyvetu naplníme postupně všemi roztoky kalibrační křivky příslušného barviva a změříme jejich absorbance (opakovat postup c). d) Sestavíme kalibrační křivku pro příslušné barvivo ze získaných hodnot absorbancí (z bodu c) - 5 hodnot) - sestavíme graf závislosti absorbance na koncentraci, graf doplníme spojnicí trendu a připojíme regresní přímku. e) Postup a) – d) opakujeme u dalších roztoků kalibrační závislosti pro další dvě barviva.

58

Určování množství barviva v nápojích Barvivo E110 1. Metodou kalibrační křivky Do 50ml odměrných baněk napipetujeme 10, (příp. 20 ml) nápoje s předpokládaným obsahem barviva E110 a doplníme destilovanou vodou po rysku. Vložíme na 5 minut do ultrazvukové lázně. Změříme třikrát absorbanci vzorku při maximální vlnové délce ze spektra barviva E110. a) Na úvodní stránku displeje spektrofotometru se dostaneme stlačením červeného tlačítka, zvolíme metodu 1. single wavelength, pomocí numerické klávesnice a šipek nastavíme maximální vlnovou délku pro dané barvivo → potvrdíme zeleným tlačítkem. b) Kyvetu naplníme destilovanou vodou a vložíme do kyvetového prostoru → modré tlačítko. c) Kyvetu naplníme roztokem nápoje a vložíme do kyvetového prostoru → změříme stlačením zeleného tlačítka, zapíšeme hodnotu absorbance. d) Z rovnice z kalibrační závislosti pro dané barvivo vypočítáme množství barviva v roztoku a dopočítáme množství barviva v mg na 1 litr tohoto nápoje.

2. Metodou přídavku standardu Do 50ml odměrné baňky napipetujeme 10 ml nápoje a doplníme destilovanou vodou po rysku. Do druhé 50ml odměrné baňky napipetujeme 10 ml nápoje + 1,5 ml zásobního roztoku o koncentraci 0,1 g∙l-1. Roztoky vložíme na 5 minut do ultrazvukové lázně. Měření absorbance provedeme podle předchozího postupu (dle bodů a) – c)) u metody kalibrační křivky. Každý připravený roztok třikrát proměříme. Množství barviva v nápoji spočítáme dle uvedeného vzorce a dopočítáme množství barviva E110 v mg na 1 litr tohoto nápoje. =

1;

1;<=ř −

1;

∙

6

∙

=ř

1;

kde Avz – absorbance vzorku (sirup, nápoj), Avz+př – absorbance standardu + vzorek, cst – koncentrace standardu, Vpř – objem přidaného vzorku, Vvz – objem standardního roztoku

59

Barvivo E133 1. Metodou kalibrační křivky Do 50ml odměrných baněk napipetujeme 5 ml (příp. 10 ml) nápoje a doplníme destilovanou vodou po rysku. Vložíme na 5 minut do ultrazvukové lázně. Postup měření provedeme analogicky jako u předcházejícího nápoje při maximální vlnové délce pro barvivo E133. Spočítáme množství barviva v nápoji a dopočítáme množství barviva E133 v mg na 1 litru tohoto nápoje. 2. Metodu přídavku standardu Do 50ml odměrné baňky napipetujeme 10 ml nápoje a doplníme destilovanou vodou po rysku. Do druhé 50ml odměrné baňky napipetujeme 10 ml nápoje + 7,5 ml zásobního roztoku o koncentraci 0,1 g∙l-1. Roztoky vložíme na 5 minut do ultrazvukové lázně. Postup měření provedeme analogicky jako u předešlého nápoje. Měříme při maximální vlnové délce ze spektra. Spočítáme množství barviva v nápoji a dopočítáme množství barviva E133 v mg na 1 litru tohoto nápoje.

Vícesložková analýza Úkolem vícesložkové analýzy je současné stanovení koncentrací popř. hmotnosti několika složek v roztoku vedle sebe. Obsahuje-li roztok větší počet vzájemně neinteragujích absorbujících složek, kde pro každou platí Lambert-Beerův zákon, je výsledná absorbance při dané vlnové délce dána součtem dílčích absorbancí jednotlivých složek, tedy = ∑@

@

∙

@

∙ .

kde Ai – absorbance roztoku při vlnové délce i, εik - dekadický absorpční koeficient k-té složky při i-té vlnové délce [l∙g-1∙cm-1], ck – koncentrace složky k-tého roztoku [g∙l-1], l – délka kyvety [cm] Stanovení koncentrací jednotlivých složek roztoku je možné, když A ≥ ,, tedy je-li roztok proměřen alespoň při tolika vlnových délkách, kolik je absorbujících látek v směsi. Výsledkem je i rovnic o n neznámých koncentrací. Ze závislosti absorbance na vlnové délce jednotlivých složek směsi se určí vlnové délky, kde absorbance nabývá svých největších rozdílů. Dekadické absorpční koeficienty se získají z kalibrační závislosti jednosložkového

60

systému, dekadický absorpční koeficient n-té složky při i-té vlnové délce se vypočte z kalibrační přímky n-té složky při i-té vlnové délce, která prochází počátkem. Např. pokud si vybereme vlnové délky 407 a 480 nm a analyzujeme barviva E133 a E110, sestrojíme kalibrační závislost pro barvivo E110 při vlnové délce 407 nm, proložíme ji počátek a připojíme rovnici regresní přímky. Koeficient u x je dekadický absorpční koeficient pro barvivo E110 při vlnové délce 407 nm. Analogicky určíme dekadické absorpční koeficienty pro barvivo E110 při vlnové délce 407 nm a pro barvivo E133 při vlnových délkách 407 nm a 480 nm. Dosazením do Lambert-Beerova zákona můžeme určit koncentrace jednotlivých barviv =

C

∙

D

∙

E

∙

F

∙ , konkrétně např. M N

=

M N,O

∙

O

+

M N,O PP

∙

O PP

MQ

=

MQ ,O

∙

O

+

MQ ,O PP

∙

O PP

Modelový vzorek Do 50ml odměrné baňky napipetujeme 10 ml zásobního roztoku E120 a 5 ml zásobního roztoku E100, doplníme destilovanou vodou po rysku. Vyneseme absorpční spektra barviv E110 a E120 do jednoho grafu a zvolíme vlnové délky dle postupu výše (doporučené 370 a 429 nm, příp. odchylky konzultujte s vyučujícím). Měření absorbance roztoků a) Na spektrofotometru zvolíme metodu 6. Multi wavelength, pomocí numerické klávesnice a šipek nastavíme příslušné vlnové délky → zelené tlačítko. b) Kyvetu naplníme destilovanou vodou a vložíme do kyvetového prostoru → modré tlačítko. c) Kyvetu naplníme roztokem modelového vzorku a vložíme do kyvetového prostoru → zelené tlačítko, zapíšeme hodnoty absorbancí. Vzorek třikrát proměříme. Dekadické absorpční koeficienty d) Postupem c) proměříme kalibrační roztoky barviv E110 a E120 při nastavených vlnových délkách, zapíšeme absorbance. e) Sestrojíme 4 grafy: graf závislosti absorbance na koncentraci pro barvivo E110 při první vlnové délce, graf závislosti absorbance na koncentraci pro barvivo E110 při druhé vlnové délce, graf závislosti absorbance na koncentraci pro barvivo E133 při 61

první vlnové délce, graf závislosti absorbance na koncentraci pro barvivo E133 při druhé vlnové délce. U všech grafů zobrazíme spojnici trendu, proložíme přímku počátkem (získáme dekadický absorpční koeficient postupem popsaným výše). f) Pomocí Lambert-Beerova zákona dopočítáme množství barviva v modelovém vzorku a srovnáme s napipetovaným množstvím.

Množství barviv v neznámém vzorku Např. Puschkin je nápoj, který ve svém složení mimo jiné deklaruje barviva E110 a E133. Do 50ml odměrné baňky napipetujeme 10ml nápoje, doplníme destilovanou vodou po rysku. Analogickým postupem jako u modelového vzorku kvantitativně analyzujeme množství barviv E110 a E133 v nápoji. Doporučené vlnové délky jsou 407 a 480 nm. UKONČENÍ ANALÝZY Kyvetu vypláchneme destilovanou vodou a vrátíme do krabičky na kyvety. Odměrné baňky a pipety vyprázdníme, opláchneme destilovanou vodou. Spektrofotometr i počítač vypneme.

VYHODNOCENÍ Uvedeme: •

absorpční spektra barviv E110, E120 a E133

•

kalibrační křivky a regresní přímky pro barviva E110, E120 a E133

•

kvantitativní vyhodnocení barviva E110 a E133 v nápojích metodou kalibrační křivky a metodou přídavku standardu, porovnat obě metody

•

kvantitativní analýzu modelového vzorku

•

kvantitativní analýzu barviv E113 a E110 v nápoji

•

zdůvodnění možných příčin chybného měření při kvantitativním stanovování barviv v nápojích

62