MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE
STUDIUM KATALYTICKÝCH VLASTNOSTÍ KOMPLEXŮ TETRAAZAMAKROCYKLICKÝCH LIGANDŮ
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2009
ANTONÍN ŠTĚPÁNEK
Diplomovou práci jsem vypracoval samostatně na Ústavu chemie PřF MU v letech 2008-2009 pod vedením doc. RNDr. Přemysla Lubala, PhD. Všechny použité prameny jsou citovány.
V Brně dne …………
…………………………..
2
Chtěl bych poděkovat vedoucímu diplomové práce, doc. RNDr. Přemyslu Lubalovi, PhD, za cenné rady a připomínky a pomoc při vyhodnocování dat. Dále bych chtěl poděkovat Mgr. Jakubu Vaňkovi za pomoc při fluorimetrických měřeních, prof. Königovi za poskytnutí ligandu 3 a Dr. Janě Hodačové za poskytnutí ligandů 4 a 5. V neposlední řadě děkuji rodičům za finanční a morální podporu.
3
Seznam zkratek:
CHES = 2-(N-Cyklohexylamino)1-ethansulfonová kyselina CAPS = 3-(Cyklohexylamino)-1-propansulfonová kyselina HEPPS = 4-(Hydroxyethyl)-piperazin-1-propansulfonová kyselina AZT = 3´-Azido-3´-deoxythymidin 2-dT = 2-desoxythymidin ATP = adenosin-5-trifosfát NFAc = 4-nitrofenylacetát UMAc = 4-methylumbelliferylacetát K ………..konstanta stability M ……….ion kovu kkat ………katalytická konstanta kobs …........rychlostní konstanta pseudoprvního řádu
4
OBSAH: I. 1.1
Teoretická část Azamakrocyklické sloučeniny ……………………………………………...…….7 1.1.1
Makrocylický efekt ……………………………………………………...…….7
1.1.2
Acidobazické chování a modelování enzymů ……………….………………...8
1.1.3
Tvorba ternárních kompexů …………………………………………...……..12
1.1.4
Azamakrocykly a hydrolýza esterů …………………………………………..16 1.1.4A Mechanismus hydrolýzy, p-nitrofenolát ………….…………………16 1.1.4B Samovolná hydrolýza a katalytický efekt …………….……………..18 1.1.4C Inhibiční efekt ………………………….……………………………22 1.1.4D Dimerní katalyzátory …………………………….…………………..24
1.2
Enzymové reakce ………………………………………………………………...26 1.2.1 Charakterizace enzymů ………………………………………………….……26 1.2.2 Třídy enzymů ……………………………………………………………...….27 1.2.3 Model Michaelise a Mentenové …..…………..………………………...……28
II.
Cíle práce..............................................................................................................35
III.
Experimentální část ………………………………………………………..36
3.1
Chemikálie ………………………………………………………………………..36
3.2
Použité přístroje ……………………………………………………….…………38
3.3
Pracovní postupy ………………………...………………………………………39
IV. Výsledky a diskuse ………………………………………………………….41 4.1
Spektrální vlastnosti substrátů a produktů hydrolýzy………………..…….42
4.2
Závislost rychlosti hydrolýzy na koncentraci substrátů ……………….….45 4.2.1 p-nitrofenylacetát ……………………………………………………………..45 4.2.2 4-methylumbelliferylacetát……………………………………….………...…48
4.3
Vliv teploty a pH při přídavku katalyzátorů …………………………….….49 4.3.1 Zn(cyklen) ……………………………………………………………………49
5
4.3.2 Cd(cyklen) ……………………………………………………………………52 4.3.3 Komplexy M(cyklen).………………………………………………………...56 4.3.4 Jiné tetraazamakrocyklické ligandy ………………………………………….57
4.4
Vliv iontové síly …………………………………………………………………58
4.5
Přídavky bazí ke kovovým komplexům cyklenu....………………………..59 4.5.1 Pyrimidinové baze…………………………...……………………………….59 4.5.1A Pyrimidinové baze a Zn(cyklen)……………………………………..59 4.5.1B Pyrimidinové baze a Cd(cyklen)…………………………………….63 4.5.1C Porovnání Zn(cyklen) a Cd(cyklen)…………………………………65 4.5.2 Purinové baze………………………………………………………...……..68 4.5.3 Imidazol……………………………………………………………………..70 4.5.4 Analýza směsi nukleových bazí ..……………………………………...…..72 4.5.5 Další inhibitory ...…………………………………………………………...74
4.6
V.
Stanovení Zn2+ ve směsi s Cu2+…………………………………………...….75
Závěr …………………………………………………………………………..…76
VI. Použitá literatura ………………………………………………...…………78
6
I. Teoretická část 1.1 Azamakrocyklické sloučeniny 1.1.1 Makrocyklický efekt Azamakrocyklické ligandy jsou cyklické molekuly obsahující ve svém skeletu alespoň 3 dusíkové donorové atomy, přičemž cyklus musí obsahovat nejméně 9 atomů. Díky chelátovému a makrocyklickému efektu jsou schopny komplexovat kovové kationty, přičemž vznikají velmi stabilní komplexy. Stabilita chelátů s cyklickými ligandy je mnohem vyšší než u ligandů s otevřenou strukturou.
Obr. 1: Chelátový a makrocyklický efekt tetraazamakrocyklického ligandu cyklenu pro Cu2+, Cd2+ a Zn2+ (5)
7
1.1.2 Acidobazické chování a modelování enzymů Přechodné kovy, jako např. Zn, se v těchto makrocyklických komplexech stávají podle HSAB teorie měkčími kyselinami. Tendence k hydrolýze se tvorbou komplexu mění. Nejvýrazněji se acidobazické chování hydratovaného zinečnatého kationtu mění při komplexaci Zn2+ v ligandu triazacyklododekanu (12-aneN3), kde dochází již při nízké hodnotě pH (okolo 7) k deprotonaci molekuly vody a vzniku hydroxidového aniontu. Naopak v cyklamu k deprotonaci dochází až při vyšší hodnotě pH, neboť hodnota pKa je vyšší (9,8) než u nekomplexovaného hydratovaného zinečnatého kationtu (9,0).
pK = 7,3
pKa = 7,9
H
H
H
O
O H
N
N
H
Zn
O H
(II)
NH
HN N H
H
Zn-cyklen pKa = 9,0
N
N H
Zn-[14]aneN 4
3
Zn(H20)n
N
N
H
Zn-[12]aneN
4
H
Zn(II)
N H Zn-[12]aneN
pK a= 9,8
H
H
Zn(II) N H
a
Zn-cyklam -
Zn(OH )n
Obr. 2: Acidobazické vlastnosti hydratovaného iontu Zn(II) a jeho komplexu s vybranými azamakrocyklickými ligandy (1)
Tabulka 1: Acidobazické vlastnosti hydratovaných iontů různých kovových kationtů komplexovaných cyklenem; potenciometrická titrace; t = 25°C, I = 0,1M (TBA ClO4- ) (4)
8
U některých jiných přechodných kovů komplexovaných v azamakrocyklických ligandech (např. cyklenu) dochází k hydrolýze a vzniku [M(cyklen-OH]+ při mnohem vyšším pH než u Zn(II) kationtu. Tato skutečnost má význam při katalytickém působení zinku v živých organismech, neboť azamakrocyklické ligandy jsou často podobné struktuře aktivního centra některých metaloenzymů, obsahujících zejména Zn. Jedná se např. o tyto enzymy: DNA a RNA polymerázy, alkalické fosfatázy, peptidázy (např. karboxypeptidáza A), laktamázy, anhydrázy a
karbonát-
alkohol dehydrogenázy. Karbonát-anhydráza A je prvním enzymem, v jehož
aktivním centru byl zinek r. 1936 objeven. Proto je možné Zn(II) komplexy těchto ligandů využít pro modelování funkce uvedených enzymů.
H2O (II)
-
Scys
Nim
Zn
Nim
N im H2O
H H2O
N
N
H
Zn(II) II
HN
Zn
NH
N H
N H
N
H
[12]aneN4 cyklen
[12]aneN
3
Obr. 3: Podobnost aktivního centra enzymů karbonát-anhydrázy (nahoře vlevo) a β-laktamázy II (nahoře vpravo) se zinečnatými komplexy tetraazamakrocyklických ligandů (2,7)
β-laktamázy mají ve svém aktivním centru
2+
kation kovu (β-laktamáza II má Zn
)
obklopený třemi molekulami imidazolu a jednou molekulou cysteinu. Tato struktura je podobná struktuře aktivního centra karbonát-anhydrázy, kde je zinečnatý kation koordinován třemi atomy dusíku molekul histidinu. 9
β-laktamázy patří mezi nejdůležitější bakteriální enzymy, hrající významnou roli při obraně bakterií před některými antibiotiky s β-laktamovým kruhem. Tyto enzymy hydrolyzují peptidovou vazbu těchto antibiotik. O S
NH N O
O O-
Obr. 4: Struktura molekuly β-laktamového antibiotika benzylpenicilinu s vyznačením peptidové vazby
Hydrolýza β-laktamů je zahajována iontem přechodného kovu (Zn, Cu, Ni, Co), který interaguje s karboxylátovou skupinou a dusíkem β-laktamové skupiny. Dochází ke stabilizaci tetrahedrálního meziproduktu a po ataku ionty OH- se rychlost štěpení vazby C-N laktamového kruhu zvyšuje. Podobně jako v případě karbonát-anhydrázy, atakuje hydroxidový anion β-laktamázy II karbonylový uhlík β-laktamového kruhu. R
HO
R
S
NH
S
NH
N
HO
O
N -
Zn
(II)
O
O
O-
Zn
(II)
O-
O H
H pKa
O -
S
(II)
Zn N
N N
HO
? S
N
N (II)
N
Zn N
O
N
Obr. 5: Interakce zinčenatého kationtu při působení β-laktamázy II (7)
10
O
HO S
-
(II)
N
Zn N
N
(10)
Enzym karbonát-anhydráza
, přítomný v erythrocytech, katalyzuje fixaci CO2 na
molekuly vody:
O C
+
H2O
O
O C
k1
C
k -1 HO
O
OH
HO
O
+ H+
Nejprve nukleofilní anion OH- atakuje elektrofilní centrum enzymově vázaného oxidu uhličitého. Poté se regeneruje enzym uvolněním hydrogenuhličitanového aniontu a navázáním další molekuly vody.
O H
H
pKa = 7
O Zn N
HO
(II)
Zn
N
N
N
HCO3
C
-
O
(II)
N
N
-
O
H2O
C H O Zn N
-
O (II)
N
N
Obr.6: Působení enzymu karbonát-anhydráza (10) Při absenci enzymu by v neutrálním pH při 37°C byla hodnota rychlostní konstanty druhého řádu k1 = 0,0027 M-1s-1 (odpovídá konstantě prvního řádu ve vodě 0,15 s-1). Zpětná reakce, dehydratace hydrogenuhličitanového aniontu, by probíhala s hodnotou k-1 = 50 s-1. Rovnovážná konstanta reakce by tedy byla K1=5,4 x 10-5 a poměr [CO2]/[H2O] = 340:1. Karbonát-anhydráza II dokáže vázat molekuly CO2 při rychlostní konstantě kkat = k1 řádově 106 s-1.
11
1.1.3 Tvorba ternárních komplexů Komplexy přechodných kovů (zejména Zn2+) s některými makrocyklickými ligandy (např. cyklenem) jsou schopny tvořit při vyšším pH ternární komplexy s některými nukleotidy a s látkami podobné struktury, což bylo potvrzeno pomocí metody molekulové absorpční spektroskopie již dříve(6). Ke vzniku stabilního ternárního komplexu je nutná deprotonace nukleotidu, neboť na vzniku ternárního komplexu má hlavní podíl koordinačně kovalentní vazba mezi Zn(II) v cyklenu a záporným nábojem deprotonizovaného dusíkového atomu nukleotidu. Pokud sloučenina obsahuje oxoskupiny, jak je tomu např. u uracilu (viz obrázek), nebo jiné funkční skupiny, které jsou schopny tvořit vodíkové vazby s vodíkovými atomy –NH-skupiny cyklenu, je ternární komplex těmito vazbami stabilizován. Vyskytují-li se v nukleotidu či jiné sloučenině aminoskupiny (např. adenin či guanin), dochází k opuzování vodíkových atomů této skupiny s vodíkovými atomy –NH-skupiny skeletu cyklenu a stabilita ternárního komplexu je velmi nízká. NH
NH
N N
O N
N
O H
N
N
H
H
N
H
N
Zn(II)
H
Zn(II) N H
N H
N H
N H
N H
Obr. 7: Stabilní ternární komplex Zn(cyklen) s uracilem a nestabilní komplex s adeninem O
NH2
O NH
NH
H3C
O
U
T
O
N
N
NH NH
NH2
NH
N
NH
O
C
N
A
O N
NH
NH
N
NH2
G
Obr. 8: Vzorce pyrimidinových (uracil, thymin, cytosin) a purinových (adenin, guanin) bazí nukleových kyselin
12
Ternární komplexy se mohou tvořit i s jinými sloučeninami, které jsou
strukturně
podobné s nukleotidům (např. s riboflavinem, inosinem, 3´-Azido-3´-deoxythymidinem = AZT), ale i se strukturně odlišnými (např. halogenidy, SCN-, deriváty kyseliny fosforečné, karboxamidy, sulfonamidy, imidazol apod.), které však již většinou nejsou tolik stabilní jako v případě nukleotidů. O O
O H N
HN
H N
HN
N
HN N HO
O
N
NH
xantin
N
N
hypoxantin HO
O
NH
OH
inosin NH
O
N O
O
ribosa N
N
O
kys. barbiturová NH N
riboflavin
O
Obr. 9: Látky strukturně příbuzné bazím nukleových kyselin
Teprve nedávno (r. 2007) byl objeven ternární komplex Zn(cyklen) s karboxyderivátem pyridinu(8), kyselinou nikotinovou, který existuje ve formě dvou izomerů.
Obr. 10: Krystalová struktura kationtů [{Zn(cyklen)}2(µ-L-O:N,O´)] 3+ a [{Zn(cyklen)}2(µ-LN,O´)] 3+ternárního komplexu Zn(cyklen)- pyridin-3-karboxylová kyselina (8)
13
Tabulka 2: Konstanty stability K ternárního komplexu Zn(cyklen) s některými substráty (1,3,4) t=25°C, I=0,1M (NaClO4, pro Cl- NaNO3 a imidazol TBA ClO4)
substrát
log K
AZT
5,6±0,1
uridin
5,2±0,1
riboflavin
5,6±0,1
SCN-
2,1
Cl-
1,9
imidazol
3,0
K=
[ZnL-S] [ZnL][S]
CH3
O O
S N
-
Zn(II) HN
NH
N H
Obr. 11: Struktura ternárního komplexu Zn(cyklen)-4-methylsulfonamid (1)
Obr. 12: Tvorba ternárního komplexu Zn(cyklen)-fenylfosfát (4)
14
Obr. 13: Tvorba dvojjaderného ternárního komplexu [(Zn(cyklen))2-imidazol] 3+ a komplexu [Cd(cyklen)-imidazol]2+; t=25°C, I=0,1M (TBA ClO4) (4)
15
Azamakrocykly a hydrolýza esterů (9, 12, 13, 14)
1.1.4
1.1.4A Mechanismus hydrolýzy, p-nitrofenolát (12,13) Kovové komplexy některých makrocyklických ligandů mohou katalyzovat hydrolýzu karboxyestrů či estery kyseliny fosforečné, přičemž mechanismus katalytického působení je podobný jako u metaloenzymů. Tyto estery se chovají jako substrát a kovové komplexy makrocyklů jako enzym. O N
O
+
O
-
O
N
O
-
O
+
-
+
N
O
O
P O
O O
1
-
O
-
O
+
N
+
O
O O
O
-
-
-
O
P
O
O
O
N
O
O
-
O P
O
O O
O
P -
O
-
2 H3C O
-
N
+
OH
O
4
3
5
Obr. 14: Přehled esterů podléhajících hydrolýze: (1) 4-nitrofenylacetát, (2) 4-nitrofenylfosfát, (3) bis(4-nitrofenyl)fosfát, (4) ethyl-4-nitrofenylfosfát, (5) 2-hydroxypropyl-4-nitrofenylfosfát
Nejdříve dochází ke vzniku komplexu kovového makrocyklu s esterem, kde se zinečnatý kation váže na kyslíkový atom jeho fosfátové či karboxylové skupiny. Poté atakuje nukleofilní hydroxidový anion, který vzniká deprotonizací molekuly vody vázané na kovovém kationtu, atom fosforu ve fosfátu či uhlíku karboxylu.
Obr. 15: Přechodový stav kinetického intermediátu Zn(cyklen) - ethyl-4-nitrofenylfosfát (12)
16
Produktem hydrolýzy těchto esterů je odštěpený p-nitrofenolát, který lze detekovat spektroforometricky (absorpční maximum při λ = 400 nm). (13)
Molární extinkční koeficient nitrofenolového aniontu se mění v závislosti na hodnotě pH. Platí vztahy: Ka = [NF-][H+] / [HNF] tot
A = εobs d [HNF]
(1)
= εNF- d [NF-]
(2)
εobs je naměřený extinkční koeficient HNF (p-nitrofenol + p-nitrofenolát), εNF- extinkční koeficient p-nitrofenolátu, d je tloušťka kyvety
Ze vztahů (1) a (2) je možno odvodit: +
+
1/εobs = (Ka + [H ])/(εNF- . Ka )= (1 / εNF- )+ ([H ] / εNF- Ka)
(3)
Při vyšších hodnotách pH, kdy je p-nitrofenol zcela disociován, platí εobs = εNF+
Ze závislosti 1/εobs na [H ] (vztah 3) můžeme zjistit molární extinkční koeficient p- nitrofenolátu -1
a konstantu Ka. (pKa = 7,14 ± 0,01; εNF-
, 400nm
-1
= 18279 mol lcm ).
+
Obr. 16: Závislost 1/εobs na [H ] (13) 17
1.1.4B Samovolná hydrolýza a katalytický efekt Samovolná nekatalyzovaná hydrolýza esteru je reakcí druhého řádu. Pro reakční rychlost platí:
(13)
v = k2[OH-][ester] v=
(4)
d(Abs) = kobs [ester] = (kOH[OH-] + k0) [ester] d(t) εobs
kobs = k0 + kOH[OH-]
(5)
(6)
kde kOH je rychlostní konstanta druhého řádu určující sílu nukleofilního ataku OH-, k0 je rychlostní konstanta prvního řádu, která popisuje solvolýzu esteru vůči rozpouštědlu (např. vodě). Obě konstanty závisí na reakčních podmínkách (např. koncentrace a druh pufru, přítomnost organických látek aj.).
Na obr. 17 jsou uvedeny hodnoty konstant pro hydrolýzu 4-nitrofenylacetátu: kOH = 8,16±0,01 M-1s-1, k0 = (6,63±0,02) x 10-7 s-1, zjištěné při uvedených podmínkách (výpočet ze vztahu č. 6)
Obr. 17: Závislost rychlostní konstanty kobs na koncentraci OH-; 50 mM TRIS/HCl, 10% CH3CN, t = 25°C (I=0-50 mM NaCl pro pH=7-8)
(13)
18
Byl zkoumán katalytický vliv uvedených kovových komplexů různých mononukleárních (cyklen; ligandy L1, L3 a L8 – obr. 18) a dinukleárních ligandů na hydrolýzu 4-nitrofenylacetátu. Katalyzátor je látka, která se účastní reakce a sama se nespotřebovává. Analogicky k bazické katalýze hydrolýzy esterů lze psát pro katalytický efekt komplexů: kobs = ks+ kkat[katalyzátor],
(7)
kde ks je rychlostní konstanta nekatalyzované (samovolné) hydrolýzy, kkat je katalytická konstanta. Katalytická účinnost komplexu závisí na koncentraci aktivní species.
Obr. 18: Mononukleární a dinukleární tetraazamakrocyklické ligandy (13)
19
Hodnota kkat velmi závisí na pH reakčního prostředí, přičemž platí, že se vzrůstající hodnotou pH roste i hodnota kkat, až dosáhne svého maxima (kNA). Největší vzrůst je možno pozorovat při pH, které je blízké hodnotě pKa molekuly vody navázané na komplexovaném kovovém kationtu. Podobně jako např. při titracích je možno pozorovat sigmoidní závislost.
Obr. 19: pH-profil rychlostní konstanty kkat pro makrocyklické komplexy ZnL8 a ZnL3; t = 25°C,10% CH3CN, I = 0,1 M NaCl (13)
Obr. 20: Konstanty kobs v závislosti na koncentraci Zn(II) komplexů mononukleárních ligandů; pH = 8 (50 mM TRIS/HCl), 10% CH3CN, I = 0,1 M NaCl, t = 25°C (13)
20
Tabulka 3: Srovnání konstant kkat a kNA (maximální kkat) pro Zn(II) komplexy uvedených mononukleárních ligandů; podmínky viz obr. 20 ligand
102 k kat (M-1s-1)
pK a (Zn-H2O)
pH=7
pH=8
102kNA (M-1s-1)
cyklen
8,06 ± 0,01
1,06 ± 0,03
5,38 ± 0,05
9,57 ± 0,06
L1
8,35 ± 0,03
1,68 ± 0,02
12,01 ± 0,03
39,08 ± 0,10
L3
8,28 ± 0,05
1,39 ± 0,03
9,61 ± 0,02
27,91 ± 0,02
L8
7,89 ± 0,05
6,03 ± 0,05
25,29 ± 0,03
38,63 ± 0,02
Heterocyklické deriváty cyklenu L1, L3 a L8 vykazují větší katalytický efekt než cyklen, přičemž maximální hodnota kkat (kNA) je cca 3-4x vyšší.
Tabulka 4: Srovnání konstant kNA pro Zn(II) komplexy uvedených dinukleárních ligandů; 50 mM CHES, 10% CH3CN, I = 0,1 M NaCl, t = 25°C (13) komplex Zn2L2 Zn2L4
102k NA (M-1 s-1)
pK a
-
410 ± 27
8,09
-
310 ± 19
8,27
-
aktivní species Zn2L(OH )(OH2) Zn2L(OH )(OH2)
Zn2L5
Zn2L(OH )(OH2)
440 ± 31
8,37
Zn2L6
Zn2L(OH-)(OH2)
57,3 ± 0,3
7,45
71,7 ± 0,4
8,85
39,9 ± 0,7
7,65
78,6 ± 0,6
8,11
Zn2L6 Zn2L7 Zn2L7
-
-
Zn2L(OH )(OH ) -
Zn2L(OH )(OH2) -
-
Zn2L(OH )(OH )
U dinukleárních komplexů záleží na stupni kooperace mezi kovovými centry, která je určena délkou arylového řetězce (L5, L6 a L7). U ligandu L7, který má déku řetězce maximální, se již obě kovová centra Zn(II) neovlivňují, proto je hodnota kNA 2x vyšší než u odpovídajícího Zn(II) mononukleárního ligandu L8 (0,79 vs. 0,39 M-1s-1). Dinukleární Zn(II) komplexy s monoarylovým spacerem (L2, L4 a L5) mají mnohem vyšší katalytickou konstantu kNA (cca 40x) než samotný Zn(II) komplex cyklenu.
21
1.1.4C Inhibiční efekt Je-li
v reakční
směsi
přítomna
látka
schopná
tvorby
ternárního
komplexu
s makrocyklickým ligandem, dojde k zablokování katalytické OH-skupiny a inhibici hydrolýzy. Tento inhibiční efekt byl zkoumán např. u oxa-derivátů azamakrocyklických ligandů. Substrátem byl 2-hydroxypropyl-4-nitrofenylfosfát (dále HpPNF). H N
O 2+
Zn N H
N
H
N H H
H
Zn(12[ane]N3O)
N
N
HO
H
N
NH
Zn(9[ane]N3OH)
Zn(12[ane]N3)
O
Zn2+
Zn2+
2+ N Zn NH
O
N H
O
Zn(15[ane]N3O2)
Obr. 21: Zn(II) komplexy derivátů azamakrocyklických ligandů (14)
Obr. 22: Vznik ternárního komlexu 1-oxa-4,7,10-triazacyklododekan-uridin (14)
Tabulka 5: Zjištěné rovnonážné konstanty pro různé Zn(II) komplexy; I = 0,1 M (NaCl), t = 25°C (14)
ligand
12[ane]N3O 12[ane]N4 12[ane]N3 15[ane]N3O2 9[ane]N3OH
log K OH
pK a
log K U-
5,60 5,50 5,90 4,93 4,53
8,18 8,28 7,88 8,85 9,25
4,56 4,57 5,29 3,47 2,65
KOH = [ZnL(OH-)]/[ZnL][OH-] pKa = log KW – log KOH (KW = 1,66 x 10-14) KU- = [ZnLU-]/[ZnL][U-];
[U-] je uridin, L je ligand
22
Obr. 23: Lineární vztah mezi log KOH a log KU-; I = 0,1 M (NaCl), 25°C (14) Čím vyšší (nižší) je afinita Zn(II) komplexu k aniontu OH- (je pKa molekuly vody vázané kationtem), tím vyšší je konstanta stability ternárního komplexu ZnL s uridinem.
Obr. 24: Vliv inhibitoru uridinu na rychlost hydrolýzy HpPNF katalyzované Zn(II) ligandy; pH = 8,0 (20 mM EPPS), I = 0,1 M (NaCl), t = 25°C, [HpPNF] = 20 µM, [ZnL] = 1 mM; kb je rychlostní konstanta po přídavku inhibitoru, kZnL bez přídavku inhibitoru (14) Inhibiční efekt uridinu či jiné látky je tím silnější, čím stabilnější ternární komplex s makrocyklickým ligandem vzniká. Dochází ke strmějšímu poklesu rychlosti hydrolýzy.
23
1.1.4D Dimerní katalyzátory U některých lanthanoidových makrocyklických komplexů, např. s iontem Eu3+, byla potvrzena tvorba dimerních komplexů, které mohou mít ještě větší katalytický účinek než v případě monomeru. Komplexy, v jejichž koordinační sféře jsou vázány pouze 2 molekuly vody (ionty prvků Tb-Yb), však nemusí být katalyticky aktivní, neboť dimerizací je znemožněna tvorba OH- (viz obr. 25). OH O H N
H2O H2O
N 3+
Eu
H2O
N H
N
HO
O
Obr. 25: Makrocyklický komplex EuDO2A+ se 3 molekulami vody a tvorba katalyticky aktivního a neaktivního dimeru (9) Pro tvorbu dimeru (EuDO2A+)2 a jeho vliv na rychlost hydrolýzy substrátu bis(4nitrofenyl)fosfátu (dále BNFF) platí následující schéma: (9)
Schema 1: Matematický popis modelu katalytického chování Eu(III) komplexu
24
Při pH = 9,35 a 25°C byly získány hodnoty rychlostních konstant k1 = 9,1 x 10-3 M-1s-1 a pro dimer k2 = 4,0 M-1s-1. Rovnovážná konstanta tvorby dimeru Kf má při uvedených podmínkách hodnotu 8,2 M-1.
Obr. 26: Závislost koncentrace monomerní a dimerní formy EuDO2A+ na celkové koncentraci EuDO2A+; pH = 9,35, 25°C Kf = 8,2 M -1
(9)
Obr. 27: Závislost rychlostní konstanty kobs na koncentraci EuDO2A+; t = 25 °C, pH = 9,35 (20 mM CHES, I = 0,5 M(CH3)4NCl, [BNFF] = 0,10 mM (9) Jelikož je katalytická konstanta dimeru (EuDO2A+)2 cca 400x větší než u monomeru, není při vyšších koncentracích EuDO2A komplexu, kdy je koncentrace dimeru relativně vysoká, závislost kobs na koncentraci EuDO2A není lineární, nýbrž exponenciální. 25
1.2. Enzymové reakce 1.2.1 Charakterizace enzymů Enzymy jsou katalyzátory biologických systémů umožňující chemické přeměny. Umožňují také transformaci jednoho druhu energie na druhý. Katalýza se uskutečňuje v místě molekuly enzymu nazvaném AKTIVNÍ MÍSTO. Látka, jejíž přeměnu enzym katalyzuje, se nazývá SUBSTRÁT. Enzymy (biokatalyzátory) urychlují ustanovení rovnováhy chemické reakce, neboť snižují aktivační energii reakce, přičemž neovlivňují rovnovážnou konstantu.
Obr. 28: Energetický diagram nekatalyzované a katalyzované reakce (17)
26
1.2.2 Třídy enzymů (18)
Tabulka 6: Třídy enzymů a jejich účinek třída I. oxidoreduktázy dehydrogenázy oxidázy peroxidázy II. Transferázy III. Hydrolázy esterázy glykosidázy éterázy proteinázy IV. Lyasy dekarboxylázy aldolázy NH3-lyázy V. Isomerázy racemázy epimerázy intramolekulární transferázy a lyázy VI. Ligázy
účinek katalýza oxidačně-redukčních reakcí
přenos funkčních skupin acyl-, amino-, glykosyl-, 1-uhlíkaté zbytky, fosfát hydrolytické štěpení estery glykosidy étery proteiny přímé štěpení kovalentní vazby
vznik nových izomerů
syntetické děje za současné spotřeby ATP či jiných makroergických sloučenin vznik nových sloučenin s vazbou uhlíku se S, O, N, C
27
1.2.3 Model Michaelise a Mentenové (10,15,16, 17) Jedná se o nejběžnější model pro popis kinetického chování enzymů. Enzymově řízená reakce probíhá podle reakčního schématu: k-1 E+S
k2
ES
P+E
(A)
k1 [E] …..koncentrace enzymu [S] …..koncentrace substrátu [ES] …koncentrace komplexu enzym-substrát [P] …..koncentrace produktu Platí rovnice: v1 = k1[E][S]
(8)
v-1 = k-1[ES]
(9)
v2 = k2[ES]
(10)
Nejprve se ustanovuje rovnováha a vznikající komplex lze charakterizovat disociační konstantou Ks: Ks =
[E][S]
k-1 =
[ES]
(11)
k1
Pokud substrát dosáhne dostatečně velké koncentrace, dojde k úplné přeměně enzymu na meziprodukt ES. Rychlost celkové reakce se potom řídí rychlostí rozpadu ES na produkty E s P.
v=
d[P] = k2[ES] dt
(12)
V okamžiku, kdy je většina enzymu vázána v meziproduktu ES, reakční rychlost nezávisí na koncentraci S a platí, že časová změna koncentrace ES je nulová. Hovoříme o tzv. stacionárním stavu. d[ES] dt
= k [E][S] - k-1[ES] - k2[ES] = 0 = 1
28
(13)
Obr. 29: Vývoj koncentrací složek enzymové reakce Michaelise-Mentenové (10)
Během reakce jsou hodnoty okamžitých koncentrací [ES] a [E] neměřitelné, lze však určit jejich součet, tedy celkovou koncentraci enzymu Etot. Do rovnice (13) dosadíme za [E] výraz [E] tot – [ES] a dostaneme: 1 [ES] =
k-1+ k2
[E] tot [S]
(14)
+ [S]
k1
KM =
k-1+ k2 k1
= Ks +
k2 k1
(15)
Konstanta KM se nazývá Michaelisova konstanta. Je-li k-1>> k2, je rovna disociační konstantě komplexu. Pro reakční rychlost v platí:
v=
d[P] dt
k2[E] tot [S] = k2[ES] =
(16)
KM + [S]
V okamžiku, kdy je enzym plně saturován substrátem, je v podstatě všechen v podobě komplexu ES a je dosaženo maximální rychlosti reakce Vmax. Toto může nastat pouze při dostatečně velké koncentraci substrátu: [S] >> KM
29
KM + [S] = [S]
Výraz pro reakční rychlost se zjednoduší: v = k2[E] tot = Vmax.
[E] tot =
(17)
Vmax
(18)
k2
Z rovnic (16) a (17) dostaneme základní rovnici enzymové kinetiky, rovnici Michaelise a Mentenové: Vmax [S] v=
(19)
KM + [S]
Michaelisova konstanta je rovna koncentraci substrátu, při které je reakční rychlost rovna polovině maximální rychlosti. Čím vyšší je její hodnota, tím nižší je afinita enzymu k substrátu a naopak. Její hodnota závisí na typu substrátu a podmínkách (pH, teplota, iontová síla). Tabulka 7: Michaelisovy konstanty vybraných enzymů (10, 17) K M(µM)
enzym
substrát
penicillináza
benzylpenicillin
karbonát anhydráza
CO2
8000
chymotrypsin
acetyl-L-tryptofanamid
5000
pyruvát karboxyláza
pyruvát
400
HCO3-
1000
ATP
50
60
Vmax je ukazatelem aktivity enzymu, závisí na katalytickém množství enzymu v experimentu. Dá se užít k vyjádření katalytické účinnosti a čistoty enzymu. V těchto případech se vypočítá tzv. specifická aktivita jako poměr Vmax a množství enzymu. Známe-li látkové množství enzymu, pak specifickou aktivitu vztaženou na látkové množství enzymu nazýváme číslem přeměny (TN=“turnover number“): Vmax / [E] = TN (s-1) = kTN
(20)
30
TN značí počet molů (molekul) substrátu přeměněné 1 molem (molekulou) enzymu za 1s a jde o tzv. katalytickou konstantu kTN (celkovou rychlostní konstantu katalyzované reakce), která je objektivním vyjádřením účinnosti enzymu. Při vyšších koncentracích substrátu platí, že kTN = k2. Tabulka 8: Maximální čísla přeměny některých enzymů (10, 17) enzym k TN (s-1) penicilináza
2000
karbonát anhydráza laktát dehydrogenáza
600000 1000
DNA polymeráza I
15
tryptofan syntetáza
2
Za fyziologických podmínek se hodnoty [S]/KM pohybují v rozmezí 0,01-1,0. Většina aktivních center enzymu je substrátem neobsazena a rychlost enzymové reakce je mnohem nižší než kTN. Jako spolehlivější ukazatel substrátové specificity se ukázal poměr kTN (čím vyšší hodnota, tím účinnější katalýza) a KM (čím nižší hodnota, tím větší afinita enzymu k substrátu). Tabulka 9: Ukazatel substrátové specifity chymotrypsinu (10, 17) aminokyselina
vedlejší řetězec k TN/K M (s-1M-1)
valin
isopropyl
2,0
norvalin
n-propyl
3,6 x 102
fenylalanin
benzyl
1,0 x 105
Parametry rovnice Michaelise a Mentenové (Vmax a KM) je možno určit experimentálně ze závislosti reakční rychlosti na koncentraci substrátu. Rovnici je možno upravit na reciprokou formu (Lineweaver, Burk): 1 v
=
KM
1
Vmax
[S]
+
1
(21)
Vmax
31
Obr. 30: Závislost rychlosti enzymově katalyzované reakce na koncentraci substrátu (vlevo), reciproké vynesení závislosti (vpravo) Ovlivnění rychlosti enzymové reakce (10, 16, 17) Rychlost enzymové reakce lze ovlivnit působením chemických látek – efektorů či modulátorů (positivních a negativních), běžně zvaných aktivátory (zvyšují) a inhibitory (snižují rychlost) enzymů. Existují dva typy inhibitorů: reversibilní a ireversibilní. Reversibilní inhibitory, jež interagují s enzymem vratně, se dají odstranit např dialýzou, gelovou chromatografií apod. Inhibitory ireversibilní se vážou pevně a nevratně. Reversibilní inhibice se dělí na několik typů, z nichž nejvýznamnější je kompetitivní a nekompetitivní. Kompetitivní inhibitor reaguje s volným enzymem a soutěží se substrátem o vazné místo v aktivním centru. Může se navázat pouze na volný enzym. V reakční směsi pak máme kromě E, S a ES ještě formu EI (komplex enzym-inhibitor), který se tvoří vratně mezi volným enzymem a inhibitorem: (10)
(B)
32
Zavedeme-li do vztahu Michaelise a Mentenové faktory (16) Ki = [E][I] / [EI] a [E]tot = [E] + [EI] + [ES]
(22)
dostaneme vztah: v = Vmax . [S] / [KM (1+ [I]/Ki) + [S]],
(23)
kde KM (1+ [I]/Ki) = Kapp
(24)
Po rektifikaci: 1/v = 1/ Vmax + Kapp/Vmax . 1/[S]
(25)
Výraz Kapp se nazývá zdánlivou Michaelisovou konstantou, je vyšší než skutečná přímo úměrně koncentraci inhibitoru a nepřímo Ki.
Nekompetitivní inhibitor není podobný substrátu, váže se jak na volný enzym tak komplex ES. Vytváří komplex EI, jehož koncentrace nezávisí na koncentraci substrátu, ale pouze inhibitoru. (10)
(C) V reakční směsi pak vzniká komplex EI podle rovnice: Et + I <=> EI Zavedením do základní rovnice Michaelise a Mentenové pak dostáváme: (16) v = Vmax (1+ [I]/Ki) . [S] / [KM + [S]]
(26)
a po rektifikaci: 1/v = (1/ Vmax + KM/Vmax . 1/[S]) . 1/(1+ [I]/Ki)
33
(27)
Obr. 31: Reciproké vynesení závislosti rychlosti enzymové reakce po přidání nekompetitivního (křivka b) a kompetitivního (c) inhibitoru na koncentraci substrátu; (a) je katalýza bez inhibitoru
Při nekompetitivní inhibici se v porovnání s neinhibovanou reakcí hodnota KM nemění, mění se pouze Vmax. Při inhibici kompetitivní se mění hodnota KM , hodnota Vmax zůstává zachována.
34
II. Cíle práce Cílem práce je ověřit pomocí molekulové UV-VIS absorpční spektrometrie, popř. fluorescenční spektroskopie, zda je možné využít tetraazamakrocyklické ligandy, především jejich Zn(II) komplexy s cyklenem, jako katalyzátory při hydrolýze esterů (4-nitrofenylacetát, 4methylumbelliferylacetát, popř. jejich fosfáty). Dále prosudovat vliv experimentálních podmínek (především pH a teplota) a najít systém, ve kterém bude pozorován největší katalytický efekt makrocyklů. Získané poznatky využít pro analytické účely jako analytické stanovení Zn(II) ve směsi s jinými přechodnými kovy (např. Cu(II)) a selektivní stanovení bazí nukleových kyselin ve směsích.
35
III. Experimentální část 3.1 Chemikálie
Pufry CHES (pKa = 9,5) p.s.min. 99%, Sigma, Steinheim, Německo CAPS (pKa = 10,4) p.a. >99% (TLC), Fluka, Buchs (Švýcarsko) HEPPS (pKa = 8,0) p.a. >98% (T), Fluka, Buchs (Švýcarsko) Roztoky iontů kovů ZnCl2 (0,1 M odměrný roztok, f = 0,9999) v 0,01 M HCl – standardizováno chelatometricky na indikátor xylenolovou oranž při pH = 6,0 (urotropinový pufr) CdCl2 (0,1 M odměrný roztok, f = 1,1184) v 0,01 M HCl CuCl2 (0,1 M odměrný roztok, f = 1,0045) v 0,01 M HCl NiCl2 (0,1 M odměrný roztok, f = 0,69673) v 0,01 M HCl Nukleové baze a jiné inhibitory Thymin p.a. 99% (HPLC), Merck, Darmstadt (Německo) 2-desoxythymidin p.a. >98% (HPLC), Merck, Darmstadt Thymidin-5-fosfát (disodná sůl) p.a. 99% (HPLC), Sigma Uracil p.a. >98%, Merck, Darmstadt (Německo) Uridin p.a. 99+%, Sigma, USA Uridin-5-fosfát (disodná sůl), 98%, Sigma, USA Cytosin p.a. >99,0% (HPLC), Fluka, Buchs Cytidin p.a. min. 99%, Merck, Darmstadt Cytidin-5-fosfát (disodná sůl) p.a.100%, Sigma, USA Adenin p.a. >99% (HPLC), Merck, Darmstadt Adenosin p.a. >99% (HPLC), Merck, Darmstadt Adenosin-5-monofosfát (disodná sůl) p.a. ≥99,0% (HPLC), Fluka Biochemika (vyrobeno v Německu)
36
Adenosin-5-trifosfát (disodná sůl) p.a. ≥95,8% (HPLC), Fluka Biochemika (vyrobeno v Japonsku) Guanosin p.a. >99%, Merck, Darmstadt Guanosin-5-fosfát (disodná sůl), p.a.99%, Sigma, USA Inosin p.a. 99% (HPLC), Fluka Biochemika (Sigma – Aldrich, USA) Imidazol p.a. ≥99,5% (GC), Fluka, Buchs (vyrobeno v Německu) Kyselina barbiturová p.a. ≥99,5% (HPLC), Fluka, Buchs
Substráty 4-nitrofenylacetát p.a. ≥99% (GC), Fluka, Buchs 4-nitrofenylfosfát (disodná sůl) p.a. ≥99,0% (enzym immunoassay), Fluka, vyrobeno ve VB 4-methylumbelliferylacetát, Sigma, USA 4-methylumbelliferylfosfát, Sigma, vyrobeno ve Švýcarsku
Ligandy Cyklen (=1,4,7,10-Tetraazacyklododekan), p.a. 98%, STREM (USA) Cyklam (=1,4,8,11-Tetaazacyklotetradekan) Ligand 3 syntetizováno na Ústavu org. Chemie, Univerzita Řezno (Německo) Ligand 4 (kap. 4.3.4) syntetizováno na Ústavu org. chemie a biochemie Akademie věd ČR Ligand 5 (kap. 4.3.4) syntetizováno na Ústavu org. chemie a biochemie Akademie věd ČR
Další látky NaClO4 .H2O p.a. >98% (T), Fluka, Buchs (Švýcarsko) NaCl p.a. 99,9%, Lachema n. p. Brno (závod Neratovice), Chemapol Praha NaOH pevný – min 99,0% (acidimetricky), Merck, Darmstadt (Německo)
37
3.2 Použité přístroje
UV-VIS spektrofotometr Unicam UV2 (PYE UNICAM, UK) dvoupaprskový spektrofotometr wolframová a deuteriová výbojka (záměna při 325 – 370 nm) vlnový rozsah 190-900 nm rozlišení 0,1-2 nm instrumentální fotometrická přesnost ± 0,3 – 0,5 nm termostatování pomocí Peltierova článku, přesnost ± 0,1°C (výrobce KEVA Brno)
UV – VIS SPEKTROFOTOMETR HEWLETT PACKARD 8453A (výrobce: Agilent, USA) wolframová a deuteriová výbojka rozsah vlnových délek : 190 – 1100 nm šířka mřížky: 1 nm rozlišení: 2 nm instrumentální fotometrická přesnost ± 0,05 nm termostat KEVA TK-2 (t ± 0,1°C)
AMINCO-Bowman Series 2 Luminiscence Spectrometer vlnový rozsah 200-850 nm rozlišení 0,5 nm šířka pásu 0,5 – 16 nm kontinuální xenonová lampa (150W) pulzní xenonová lampa (450W) fotonásobičový detektor (PMT)
38
3.3 Pracovní postupy Syntéza komplexů Zn, Cd, Cu a Ni(cyklen) Do odměrné baňky (50 ml) byl dán ligand cyklen tak, aby byl v cca 15% přebytku vůči kovovému kationtu. Poté bylo pipetováno odpovídající množství roztoků iontů kovů v 0,01 M HCl. Nakonec byla HCl zneutralizována roztokem NaOH. Zásobní roztoky komplexů Zn(cyklen) a Cd(cyklen) měl vždy koncentraci 42,33 mM, komplexů Cu(cyklen) a Ni(cyklen) 20 mM.
Postup při všech měřeních Všechna měření byla prováděna v 1 cm kyvetě při I = 0,1 M NaClO4 a koncentraci substrátu 4-5
nitrofenylacetátu (6,624 x 10 M) a 4-methylumbelliferylacetátu (5,078 x 10-5 M). Roztok malého množství substrátu byl do kyvety přidáván až po vytemperování roztoku na požadovanou teplotu, celkový objem roztoku v kyvetě byl 3 ml. Data vztahující se ke komplexu Zn(cyklen) a jiným katalyzátorům (kromě komplexu Cd(cyklen)) byla naměřena na spektrofotometru UV-VIS UNICAM UV2, měření s komplexem Cd(cyklen) byla prováděna na přístroji HP 8453A. S 4methylumbelliferylacetátem byla prováděna měření i na fluorimetru AB2 za stejných podmínek, [Zn(cyklen)] = 2,246 x 10-5 M.
Závislost rychlosti hydrolýzy na koncentraci substrátů 4-nitrofenylacetátu a 4methylumbelliferylacetátu Nejprve byla měřena počáteční rychlost
hydrolýzy substrátu při konstantní koncentraci
komplexu Zn(cyklen) 4,233 mM v závislosti na koncentraci substrátu. Poté byl přidáván inhibitor thymin (u teplot 60 a 37°C) o koncentraci 2,997 mM při zachování stejných reakčních podmínek. Měření byla prováděna na přístroji UV-VIS spektrofotometr Unicam UV2 při pH 9,0 (zajištěno přídavkem 100 mM CHES pufru), I = 0,1 M NaClO4 a teplotách 25, 37 a 60°C v případě 4nitrofenylacetátu a 60°C u 4-methylumbelliferylacetátu. Vyhodnocení dat bylo prováděno metodou počáteční rychlosti. Stanovení Zn2+ ve směsi s Cu2+ Byla připravena směs ZnCl2 a CuCl2 a oba kationty byly komplexovány cyklenem podobně jako u komplexů jednotlivých kovů (viz výše). Pro srovnání byl připraven samotný komplex Zn(cyklen). Příprava směsi: ZnCl2 a CuCl2 pipetovány do 50 ml baňky s 15% přebytkem cyklenu
39
(10 ml 0,1 M ZnCl2 v 0,01 m HCl a 10 ml 0,1 M CuCl2 v 0,01 M HCl, koncentrace obou byla 20 mM). Roztok zneutralizován NaOH. Příprava Zn(cyklen): Podobně jako u směsi byl roztok ZnCl2 pipetován do baňky se stejně velkým přebytkem cyklenu a zneutralizován.
Výpočty hodnot kobs: Hodnoty byly vypočítány pomocí vztahu:
ln (1-
At-A0
A - A /A )ln(1- Θ t
) = kobs
(28)
kde At je absorbance v čase t, A0 je absorbance v čase t=0, AΘ je absorbance na konci reakce.
40
IV. Výsledky a diskuse Bylo zkoumáno kinetické chování hydrolýzy 4-nitrofenylacetátu (vzorec 2) a 4methylumbelliferylacetátu (1) a příslušných fosfátů (3 a 4) v závislosti na přídavku katalyzátorů či inhibitorů a reakčních podmínkách. CH3
1
2
O
O2 N
3 O
-
O
P
O2N O
CH3 O
4
CH3
-
O
O
O
O
O
O
H3C
O
-
O
P
O
O
O
CH3 O2N -
O +
CH3COO-
O
O
+ CH3COO-
2-
(HPO4 )
Obr. 32: Zkoumané substráty a produkty jejich hydrolýzy
41
-
O
(HPO42-)
-
4.1 Spektrální vlastnosti substrátů a produktů hydrolýzy p-nitrofenylacetát (dále NFAc)
1,4 1,2 1,0 0,8 A 0,6 0,4 0,2 0,0 250
300
350
400
450
vlnová délka, nm Obr. 33: Spektrum NFAc při hydrolýze katalyzované komplexem Zn(cyklen); pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60 °C, [Zn(cyklen)]= 1,41 mM
Ve spektru je pozorován isosbestický bod při λ = 319 nm. Produkt hydrolýzy, pnitrofenolát, má absorpční maximum při λ = 404 nm. Pro výpočty rychlostních konstant hydrolýzy byla vybrána λ = 400 nm.
p-nitrofenylfosfát a 4-methylumbelliferylfosfát Vedle esterů kyseliny octové byly použity i estery kyseliny fosforečné a bylo zjištěno, že samovolná hydrolýza těchto substrátů pozorována (pH~7), a to ani při vysoké hodnotě pH či přídavku katalyzátoru Zn(cyklen) nebo zahřátí.
42
4-methylumbelliferylacetát (dále UMAc)
0,8
0,6 A 0,4
0,2
0 250
300
350
400
450
vlnová délka, nm Obr. 34: Absorpční spektrum 4-metylumbelliferylacetátu (UMAc) při hydrolýze katalyzované komplexem Zn(cyklen); pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60 °C, [Zn(cyklen)] = 4,23 mM, [UMAc]= 5,078 x 10-5 M Absorpční spektrum 4-methylumbelliferylacetátu má patrný isosbestický bod při λ = 320 nm. Pro výpočty byly vybírány hodnoty absorbancí při λ = 360 nm, kde se nachází absorpční maximum produktu hydrolýzy. Hydrolýza UMAc byla studována I fluorimetricky.
Obr. 35: Excitační spektrum produktu hydrolýzy UMAc 43
Obr. 36: Emisní spektrum UMAc při hydrolýze katalyzované komplexem Zn(cyklen); pH = 9,0 (30 mM CHES), t = 60 °C, [Zn(cyklen)]= 0,71 mM, [UMAc] = 2,246 x 10-5 M, U(PMT) = 500 V
Maximum emisního spektra produktu se nachází při λ = 447 nm, maximum excitačního spektra produktu je při λ = 338 nm.
Obr. 37: Časová závislost intenzity fluorescence při hydrolýze UMAc, λem = 447 nm
44
4.2 Závislost rychlosti hydrolýzy na koncentraci substrátů Účelem těchto měření bylo zjistit stabilitu komplexu Zn(cyklen), který představuje systém napodobující enzym (E), se substráty (
komplex ES), jehož vznik je při katalýze nutný. Byl
použit model enzymové kinetiky Michaelise a Mentenové. Dalším cílem bylo určení typu inhibice porovnáním ziskaných parametrů rovnice Michaelise a Mentenové pro neinhibovanou a inhibovanou hydrolýzu.
4.2.1 p-nitrofenylacetát (NFAc) 6,E-07
4,E-07
v, Ms-1
neinhibovaná 60°C inhibovaná 60°C neinhibovaná 37°C inhibovaná 37°C
2,E-07
0,E+00 0,0E+00
5,0E-05
1,0E-04
1,5E-04
2,0E-04
2,5E-04
[S], M Obr. 38: Závislost počáteční rychlosti hydrolýzy na koncentraci substrátu NFAc, pH = 9,0 (100 mM CHES), [Zn(cyklen)] = 4,23 mM, [thymin] = 2,997 mM
45
4,E+07 y = 1,122E+03x + 3,516E+05 R2 = 9,986E-01
1/v, (M-1s)
3,E+07
y = 1,544E+03x + 3,226E+06 R2 = 9,997E-01
2,E+07
y = 3,124E+02x + 2,390E+06 R2 = 9,681E-01
1,E+07
y = 3,056E+02x + 3,191E+05 R2 = 9,943E-01
0,E+00 0
10000
20000
30000
-1
1/[S], (M ) Obr. 39: Závislost reciproké hodnoty počáteční rychlosti na reciroké hodnotě koncentrace substrátu NFAc při teplotách 60 a 37°C (legenda-viz předchozí obrázek) 9,E+07
37°C 25°C
1/v, (M s)
6,E+07 -1
y = 2,303E+03x + 4,196E+06 R2 = 9,986E-01
y = 1,122E+03x + 3,516E+05 R2 = 9,986E-01
3,E+07
0,E+00 0
10000
20000 -1
1/[S], (M )
Obr. 40: Hodnoty 1/v na 1/S pro neinhibovanou hydrolýzu NFAc 46
30000
Ze závislosti 1/v na 1/S (viz rovnice 21) byly vypočteny parametry rovnice Michaelise a Mentenové pro neinhibovanou hydrolýzu NFAc. Jejich hodnoty jsou uvedeny v následující tabulce.
Tabulka 10 : Hodnoty KM a Vmax hydrolýzy NFAc při různých teplotách t [°C] 60 37 25
neinhibovaná
inhibovaná
K M [M]
Vmax [M s-1]
K M [M]
Vmax [M s-1]
9,577 x 10-4 3,190 x 10-3 5,489 x 10-4
3,134 x 10-6 2,844 x 10-6 2,383 x 10-7
1,307 x 10-4 4,786 x 10-3
4,184 x 10-7 3,100 x 10-7
Hodnoty Vmax se u inhibované a neinhibované hydrolýzy při teplotách 60 i 37°C značně liší, taktéž i hodnoty i KM. Nelze proto jednoznačně říci, o jaký typ inhibice se jedná. Hodnoty Vmax se s rostoucí teplotou vždy zvyšují a po přídavku inhibitoru snižují, u hodnoty KM tento trend není. Katalytická konstanta udávající, kolik molů substrátu se přemění za účasti 1 molu enzymu, byla vypočtena z poměru Vmax pro neinhibovanou hydrolýzu a koncentrace enzymu, tedy komplexu Zn(cyklen): kTN = 5,630 x 10-5 s-1 (25°C) kTN = 6,719 x 10-4 s-1 (37°C) kTN = 7,404 x 10-4 s-1 (60°C) Pro inhibovanou hydrolýzu: kTN = 7,323 x 10-5 s-1 (37°C) kTN = 9,884 x 10-5 s-1 (60°C) Z poměru 1/KM lze vypočítat konstanty stability K komplexu ES. Pro neinhibovanou hydrolýzu NFAc při t = 25°C je log K = 3,26, při t = 37°C je log K = 2,50 a t = 60 °C je log K = 3,02.
47
4.2.2 4-methylumbelliferylacetát (UMAc) 3,E-07
v, Ms-1
2,E-07
neinhibovaná
1,E-07
inhibovaná
0,E+00 0,0E+00
3,0E-05
6,0E-05
9,0E-05
1,2E-04
[S], M
Obr. 41: Závislost počáteční rychlosti hydrolýzy na koncentraci substrátu UMAc, pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60°C, [Zn(cyklen)] = 4,23 mM, [thymin] = 2,997 mM 3,E+07 neinhibovaná inhibovaná
1/v, (M-1s)
2,E+07 y = 5,544E+02x + 6,597E+05 2
R = 9,984E-01
1,E+07 y = 3,871E+02x + 1,367E+05 2
R = 9,999E-01
0,E+00 0
10000
20000
30000 -1
1/[S], M
Obr. 42: Hodnoty 1/v na 1/S pro neinhibovanou hydrolýzu UMAc
48
40000
Tabulka 11: Porovnání parametrů Michaelise a Mentenové pro zkoumané substráty, pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60°C
Stejně jako v případě p-nitrofenylacetátu nelze určit pro substrát UMAc typ inhibice, neboť se oba parametry pro neinhibovanou a inhibovanou hydrolýzu liší. Hodnoty KM a Vmax jsou pro oba substráty při teplotě 60°C řádově stejné, což platí i pro konstanty stability komplexu ES: log K (NFAc) = 3,02; log K (UMAc) = 2,54 (neinhibovaná hydrolýza).
4.3 Vliv teploty a pH při přídavku katalyzátorů Byly zkoumány experimentální podmínky, při nichž bude dosaženo maximálního katalytického účinku komplexu Zn(cyklen), ale i Cd(cyklen) a dalších, kdy proměnnými veličinami byly pH a teplota. Substrátem byl především 4-nitrofenylacetát, vliv katalyzátoru Zn(cyklen) byl zkoumán i pro substrát UMAc. 4.3.1 Zn(cyklen) 20
50°C 37°C k obs (10 -3 s -1)
15
25°C 10
5
0 0
2
4
6
8
10
12
[Zn(cyklen)], mM
Obr. 43: Hodnoty kobs hydrolýzy NFAc v závislosti na koncentraci komplexu Zn(cyklen) při různých teplotách; pH = 10,4 (100 mM CAPS) 49
10
60°C 50°C
8
6
-3
-1
k obs (10 s )
37°C
4
2
0 0
2
4
6
8
10
12
[Zn(cyklen)], mM
Obr. 44: Hodnoty kobs hydrolýzy NFAc v závislosti na koncentraci komplexu Zn(cyklen) při různých teplotách; pH = 9,0 (100 mM CHES)
10
6
-3
-1
k obs (10 s )
8
4
pH=8,0 pH=9,0
2
0 0
2
4
6
8
10
12
[Zn(cyklen)], mM
Obr. 45: Hodnoty kobs hydrolýzy NFAc v závislosti na koncentraci komplexu Zn(cyklen) při pH 9,0 (100 mM CHES) a 8,0 (100 mM HEPPS), t = 60°C
50
8
60°C 6
k obs (10-3 s-1)
50°C 37°C 4
2
0 0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
[Zn(cyklen)], mM
Obr. 46: Hodnoty kobs hydrolýzy UMAc v závislosti na koncentraci komplexu Zn(cyklen) při různých teplotách; pH = 9,0 (100 mM CHES), [UMAc] = 5,078 x 10-5 M
Fluorimetrická měření Se substrátem UMAc byla prováděna i fluorimetrická měření za účasti katalyzátoru Zn(cyklen). Metodou počáteční rychlosti byly vypočítány rychlostní konstanty kobs v závislosti na přídavku katalyzátoru. 1,6
k obs (10-3 s-1)
1,2
60°C 45°C 0,8
0,4
0,0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
[Zn(cyklen)], mM
Obr. 47: Hodnoty kobs hydrolýzy UMAc v závislosti na koncentraci komplexu Zn(cyklen) při různých teplotách; pH = 9,0 (30 mM CHES), [UMAc] = 2,246 x 10-5 M, U(PMT) = 500V 51
Katalytické konstanty získané fluorimetrickým měřením jsou při uvedených podmínkách vyšší při měření na UV-VIS spektrofotometru. Při 60°C byla vypočtena kkat = 0,705±0,042 M-1s-1 (fluorimetrické měření), u absorpční spektrometrie je kkat = 0,488±0,043 M-1s-1 (při výpočtech použito vztahu č. 7 v kap. 1.1.4B). Díky větší citlivosti fluorimetrických měření bylo možno přidávat menší koncentrace katalyzátoru než u metody absorpční spektrometrie. Fluorimetrická měření byla prováděna i při nižších koncentracích substrátu a katalyzátoru (cca 100x), ovšem při těchto koncentracích již nebyl katalytický účinek pozorován, a to patrně z důvodu nízké stability a disociace aktivního komplexu enzym-substrát.
4.3.2 Cd(cyklen) 5
4
-3 -1
k obs (10 s )
60°C 37°C
3
2
1
0 0
2
4
6
8
10
12
14
[Cd(cyklen) mM
Obr. 48: Hodnoty kobs hydrolýzy NFAc v závislosti na koncentraci komplexu Cd(cyklen) při pH = 9,0 (100 mM CHES) a různých teplotách
52
14 12
k obs (10-3 s-1)
10 8 6
37°C
4
25°C
2 0 0
2
4
6
8
[Cd(cyklen)] mM
Obr. 49: Hodnoty kobs hydrolýzy NFAc v závislosti na koncentraci komplexu Cd(cyklen) při pH = 10,4 (100 mM CAPS) a různých teplotách
Ze závislosti rychlostní konstanty hydrolýzy na koncentraci přidávaného katalyzátoru byly vypočteny katalytické konstanty k kat, jejichž hodnoty jsou pro oba substráty uvedeny v následujících tabulkách. Při výpočtu bylo použito vztahu (7) v kap. 1.1.4B. Tabulka 12: Vypočtené katalytické konstanty kkat (M-1s-1) hydrolýzy NFAc katalyzované komplexy Zn(cyklen) a Cd(cyklen) při pH = 9,0 a 10,4 a různých teplotách 9,0
10,4
pH
8,0
katalyzátor
Zn(cyklen)
Zn(cyklen)
Cd(cyklen)
Zn(cyklen)
Cd(cyklen)
60 °C
0,502±0,044
0,711±0,089
0,235±0,036
rychlé
rychlé
50 °C
0,260±0,033
0,439±0,038
0,106±0,021
0,238±0,099
ry chlé
37 °C
0,075±0,020
0,220±0,013
0,063±0,009
0,118±0,002
0, 812±0,073
0,040±0,019
0,681±0,069
25 °C
53
Se vzrůstající teplotou se hodnoty katalytických konstant ve všech případech zvyšují. Komplex Zn(cyklen) má největší katalytickou účinnost při pH=9,0 a teplotě 60°C, zatímco komplex Cd(cyklen) má mnohem větší katalytický efekt při pH=10,4. Je to zřejmě způsobeno faktem, že u komplexu Cd(cyklen) dochází k deprotonaci navázané molekuly vody při vyšším pH (pKa ~ 11) než je tomu u komplexu Zn(cyklen) (pKa = 7,9). Cd(II) ion díky větší velikosti může mít schopnost koordinovat více molekul vody (resp. katalyticky aktivní species obssahující OH-). Při vyšším pH je v roztoku již dostatečně vysoká koncentrace OH- a tím se vliv katalyzátoru Zn(cyklen)-OH- snižuje. Měření při pH=10,4 a teplotě 60°C pro oba katalyzátory a při teplotě
50°C pro
Cd(cyklen) byla již velmi rychlá a málo přesná, neboť při opakování měření bylo dosaženo velmi rozdílných výsledků. Při pH nižším než 9 je již molekula vody navázaná na komplex Zn(cyklen) deprotonovaná jen částečně (při pH 8 asi z 50%), což se projevuje zeslabením jeho katalytického účinku. Tabulka 13: Konstanty kkat (M-1s-1) při hydrolýze substrátů NFAc a UMAc katalyzované komplexem Zn(cyklen); pH = 9,0 (100 mM CHES) t[°C]
NFAc
UMAc
60
0,711±0,089
0,488±0,043
50
0,439±0,038
0,285±0,016
37
0,220±0,013
0,144±0,019
Při hydrolýze UMAc je vliv katalyzátoru Zn(cyklen) při uvedených podmínkách znatelně menší, katalytická konstanta je při všech teplotách asi o 30% nižší.
Výpočet aktivační energie -Ea/RT
Platí Arrheniova rovnice: k = Ae
(29)
Po úpravě: lnk = lnA – Ea/RT,
(30)
kde k je rychlostní konstanta, A frekvenční faktor, Ea aktivační energie, R molární plynová konstanta, T je teplota (K).
54
1/T 0,0030 0
0,0031
0,0032
0,0033
0,0034
y = -5274x + 15 2 R = 0,9999
-1
pH=10,4
ln k kat
pH=9,0
-2
-3
y = -6835x + 20 2 R = 0,9857
-4
Obr. 50: Závislost hodnoty lnkkat na 1/T při pH 9,0 a 10,4 pro NFAc 1/T 0,0030 0
0,0031
0,0032
0,0033
UMAC NFAc
ln k kat
y = -5274x + 15 2
-1
R = 0,9999
y = -5469x + 16 2
R = 0,9993 -2
Obr. 51: Porovnání závislosti lnkkat na 1/T pro NFAc a UMAc při pH = 9,0 (100 mM CHES)
Pomocí vztahu (30) byla vypočtena aktivační energie hydrolýzy NFAc katalyzované komplexem Zn(cyklen). Při pH = 9,0 vyšla její hodnota 43,9±0,3 kJ/mol, při pH = 10,4 má hodnotu 56,8±6,8 kJ/mol. Aktivační energie hydrolýzy UMAc při pH=9,0 je 45,5±1,2 kJ/mol a její hodnota je témeř shodná s hodnotou pro NFAc z důvodu tvorby strukturně podobného acetátového intermediátu.
55
4.3.3 Komplexy M(cyklen) Byl zkoumán katalytický účinek jiných kovových komplexů (Cu, Ni), a také samotného ligandu cyklenu, na hydrolýzu NFAc. 10
Zn(cyklen) 8
k obs (10-3s-1)
Cd(cyklen) Cu(cyklen)
6
Ni(cyklen) 4
2
0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
[katalyzátor], mM
Obr. 52: Hodnoty kobs v závislosti na koncentraci různých komplexů; pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60 °C 10
8
-3 -1
k obs (10 s )
cyklen Zn(cyklen)
6
4
2
0 0
2
4
6
8
10
12
[katalyzátor], mM
Obr. 53: Hodnoty kobs v závislosti na koncentraci katalyzátoru; pH = 9,0 (100 mM CHES, pro cyklen 200 mM), t = 60 °C 56
Tabulka
14: Porovnání katalytických konstant hydrolýzy NFAc katalyzované různými
komplexy a srovnání jejich hodnot s komplexem Zn(cyklen); pH = 9,0 (100 mM CHES, pro cyklen 200 mM), t = 60 °C katalyzátor
k kat [M-1s-1]
% Zn(cyklen)
cyklen
0,224±0,010
32
Cd(cyklen)
0,235±0,036
33
Ni(cyklen)
0,007±0,004
1
Cu(cyklen)
0,073±0,007
10
Zn(cyklen)
0,711±0,089
100
Cu(II) a Ni(II) komplex cyklenu vykazuje velmi slabý katalytický účinek při pH = 9,0 v porovnání s komplexem Zn(cyklen). Této skutečnosti bylo poté využito ke stanovení Zn2+ ve směsi s Cu2+ v nadbytku ligandu. Samotný ligand cyklen má podobný účinek jako komplex Cd(cyklen), oba mají katalytický efekt při uvedených podmínkách 3x nižší než u komplexu Zn(cyklen).
4.3.4 Jiné tetraazamakrocyklické ligandy Kromě cyklenu byly atudovány i jiné Zn(II) komplexy tetraazamakrocyklických ligandů s kationtem Zn2+. Snahou bylo najít efektivnější katalytický systém než komplexy s cyklenem, aby bylo možno přidávat méně katalyzátoru a tím i stanovovaného inhibitoru. H
H
H N
H
N
N
N
H
N
H
H
1
N
N
H
H
N
N
N
N
H
N N
O
CH3
H
3
2
N
N O
H N
N
CH3
H H N
H
N
4
N
N
H
H
N
N
H
H H
N
N
H
H
5
Obr. 54: Použité tetraazamakrocyklické ligandy (1-cyklen, 2-cyklam) 57
N
N
H
Tabulka 15: Porovnání katalytických konstant jednotlivých Zn2+-ligandů při hydrolýze NFAc, pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60°C, konc. 3 a 4 v rozmezí 0-3 mM, 2 0-7 mM
(ligand 3 je ligand
ZnL1 v teoretické části)
ligand -1 -1
k kat [M s ]
1
2
3
4
0,711±0,089 0,137±0,016 0,718±0,043 0,204±0,071
Komplex Zn(cyklam) za uvedených podmínek vykazoval velmi slabou katalytickou aktivitu, což je způsobeno vysokou hodnotou pKa molekuly vody (9,8) - viz teoretická část. Rovněž u ligandu 4 nebylo pozorováno významné katalytické působení, u ligandu 5 již vůbec žádné. Komplex Zn2+ s ligandem 3 má stejnou katalytickou konstantu jako s cyklenem, avšak po přídavku inhibitoru thyminu nebyl pozorován žádný inhibiční efekt. Navíc byla pozorována tvorba sraženiny, proto bylo nutné některá měření opakovat. Při 37°C, kdy její tvorba nebyla již výrazná, byla zjištěna katalytická konstanta tohoto ligandu (0,266±0,012) M-1s-1, u komplexu Zn(cyklen) byla její hodnota (0,220±0,013) M-1s-1. Kvůli nízké dostupnosti ligandu nebyla další měření prováděna.
4.4 Vliv iontové síly Byl zkoumán vliv iontové síly na rychlost hydrolýzy NFAc katalyzované 7 mM komplexem Zn(cyklen) při pH = 9,0 (80 mM CHES) a t = 60°C. Měření bylo prováděno při v rozsahu I = 0-0,2 M (NaClO4) a byl zjištěn slabý vliv iontové síly na hodnotu rychlostní konstanty (I = 0 M: kobs= 6,35±0,15 x 10-3 s-1, I = 0,1 M: kobs = 6,98±0,14 x 10-3 s-1 , I = 0,2 M: kobs= 6,80±0,10 x 10-3 s-1).
58
4.5 Přídavky bazí ke kovovým komplexům cyklenu Ke komplexu Zn(cyklen) byly přidávány potenciální inhibitory, především pyrimidinové a purinové nukleové baze a jejich nukleosidy a nukleotidy, a byl zkoumán jejich vliv na hodnotu rychlostní konstanty katalyzované hydrolýzy. Ke komplexu Cd(cyklen) byly přidávány pouze pyrimidinové baze. Komplex Zn(cyklen) vykazoval největší katalytický účinek při pH = 9,0 (100 mM CHES) a t = 60°C, proto byla všechna měření prováděna za uvedených podmínek při I=0,1 M (NaClO4). Komplex Cd(cyklen) sice nevykazoval tak silný efekt, ale pro porovnání bylo použito stejných reakčních podmínek jako v případě komplexu Zn(cyklen), kdy koncentrace komplexu Zn(cyklen) a Cd(cyklen) byla 7,05 mM. Jako substrát byl použit NFAc o stejné koncentraci jako v předchozích experimentech.
4.5.1 Pyrimidinové baze Baze nukleových kyselin jsou schopny tvořit stabilní neaktivní ternární komplex s katalyzátory Zn(cyklen) a Cd(cyklen), jelikož inhibují jejich katalytický účinek: [M(cyklen)-OH]+ + BH
[M(cyklen)-B]+ + H2O
(D)
(M - Zn(II), Cd(II))
Po přídavcích inhibitorů bylo pozorováno snižování rychlosti hydrolýzy substrátu.
4.5.1A Pyrimidinové baze a Zn(cyklen)
Obr. 55: Časová závislost absorbance 4-nitrofenolátu při hydrolýze NFAc inhibované uridinem o různých koncentracích ( a - 2,95 mM, b - 4,43 mM, c - 7,38 mM, d - 10,33 mM) 59
1,0 uracil uridin uridin-5-P
k b/k ZnL
0,8 0,6 0,4 0,2 0
2
4
6 [baze], mM
8
10
12
Obr. 56: Závislost poměru kobs katalyzované hydrolýzy NFAc po přídavcích uracilu a jeho derivátů (kB) a kobs katalyzované hydrolýzy bez přídavku bazí (kZnL) na jejich koncentraci; kZnL = 7,44x10-3 s-1
1,0
thymin 2-dT thymidin-5-P
k b/k ZnL
0,8
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6 [baze], mM
8
10
12
Obr. 57: Poměr kB/ kZnL při přídavcích thyminu a jeho derivátů; pozn: 2-dT je 2-desoxythymidin
60
Měřením bylo zjištěno, že u uracilu a thyminu a jejich nukleosidů a nukleotidů dochází ke snižování hodnoty rychlostní konstanty hydrolýzy katalyzované komplexem Zn(cyklen) v závislosti na koncentraci přidávaného inhibitoru. Inhibiční účinek nukleotidů uridin-5-fosfát a thymidin-5-fosfát je větší, než je tomu u nukleosidů a samotných nukleových bazí,
což je způsobeno interakcí fosfátové skupiny s
Zn(cyklen) komplexem. (19) 1,0
k b/k ZnL
0,8
uridin 2-dT
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6
8
10
12
[baze], mM Obr. 58: Inhibice uridinem a 2-desoxythymidinem 1,0
k b/k ZnL
0,8
uracil thymin
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6
[baze], mM
Obr. 59: Inhibice uracilem a thyminem
61
8
10
12
Je patrné, že uridin a 2-desoxythymidin tvoří s komplexem Zn(cyklen) ternární komplexy o podobné stabilitě. Totéž platí i pro samotné baze. Thymidin-5-fosfát má o něco větší inhibiční účinek než uridin-5-fosfát. 1,0
uridin-5-P
k b/k ZnL
0,8
thymidin-5-P
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6
8
10
12
[baze], mM
Obr. 60: Inhibice uridin-5-fosfátem a thymidin-5-fosfátem
k b/k ZnL
1,0
cytosin cytidin cytidin-5-P fosfát
0,8
0,6
0,4 0
5
10
15
20
[baze], mM
Obr. 61: Poměr kB/kZnL v závislosti na koncentraci cytosinu a jeho derivátů a samotného fosfátu (Na3PO4)
62
Cytosin ani cytidin nemají inhibiční účinek, neboť repulze vodíkových
atomů
aminoskupiny cytosinu a iminoskupiny ligandu cyklenu znemožňuje vznik stabilního ternárního komplexu Zn(cyklen)-cytosin, popř. cytidin. Ovšem cytidin-5-fosfát již hydrolýzu inhibuje, což je způsobeno interakcí fosfátové skupiny se Zn(II) iontem jako v případě uridin-5-fosfátu a thymidin-5-fosfátu. Komplex Zn(cyklen) může katalyzovat rozklad nukleotidu na nukleosid a samotný fosfát, který vykazuje ještě větší inhibiční efekt než v rámci cytidin-5-fosfátu.
4.5.1B Pyrimidinové baze a Cd(cyklen) 1,0
thymin 2-dT thymidin-5-P
kb/kCdL
0,8
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6
8
10
12
14
[baze], mM Obr. 62: Závislost poměru kobs katalyzované hydrolýzy 4-nitrofenylacetátu po přídavcích thyminových bazí (kB) a kobs katalyzované hydrolýzy bez přídavku bazí (kCdL) na koncentraci bazí; pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60°C
63
1,0
uracil uridin uridin-5-P
k b/k CdL
0,8
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6
8
10
12
14
[baze], mM Obr. 63: Poměr kB/ kCdL při přídavcích uracilových bazí; pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60°C
Také při katalýze komplexem Cd(cyklen) byl po přídavcích pyrimidinových bazí uracilu a thyminu a jejich nukleosidů a nukleotidů pozorován inhibiční efekt, podobně jako v případě Zn(cyklen).
64
4.5.1C Porovnání Zn(cyklen) a Cd(cyklen)
k obs (10-3 s-1)
7
Cd(cyklen) Zn(cyklen)
5
3
1 0
2
4
6
8
10
[uracil], mM Obr. 64: Změny rychlostní konstanty kobs při katalýze komplexy Zn(cyklen) a Cd(cyklen) po přídavcích uracilu; pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60°C 1,0
Cd(cyklen) Zn(cyklen)
k b/k ML
0,8
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6
8
10
12
14
[uracil], mM Obr. 65: kb/kML při přídavcích uracilu ke katalyzátorům Cd(cyklen) a Zn(cyklen) v závislosti na koncentraci uracilu
65
Cd(cyklen) Zn(cyklen)
-3
-1
k obs (10 s )
7
5
3
1 0
2
4
6
8
10
[uridin], mM Obr. 66: Změny rychlostní konstanty při katalýze komplexy Zn(cyklen) a Cd(cyklen) po přídavcích uridinu 1,0
Cd(cyklen) Zn(cyklen)
k b/k ML
0,8
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6
8
10
12
14
[uridin], mM Obr. 67: kb/kML při přídavcích uridinu ke katalyzátorům Cd(cyklen) a Zn(cyklen) v závislosti na koncentraci uridinu
66
Cd(cyklen) Zn(cyklen)
-3
-1
k obs (10 s )
7
5
3
1 0
2
4
6
8
10
[uridin-5-P], mM Obr. 68: Změny rychlostní konstanty při
katalýze komplexy Zn(cyklen) a Cd(cyklen) po
přídavcích uridin-5-fosfátu 1,0
Cd(cyklen) Zn(cyklen)
k b/k ML
0,8
0,6
0,4
0,2 0
2
4
6
8
10
12
[uridin-5-P], mM Obr. 69: kb/kML při přídavcích uridin-5-fosfátu ke katalyzátorům Cd(cyklen) a Zn(cyklen)
67
14
Pokles rychlostní konstanty kobs po přídavcích uvedených nukleových bazí ke komplexu Cd(cyklen) je v porovnání s komplexem Zn(cyklen) málo výrazný, neboť Cd(cyklen) má nižší katalytickou konstantu. Pokles poměru konstant kb/kML je v případě Cd(cyklen) také menší, což ukazuje na nižší stabilitu ternárního komplexu Cd(cyklen)-baze.
4.5.2 Purinové baze Dále byl zkoumán inhibiční účinek purinových bazí adeninu a guaninu a jejich analogů a porovnáván s účinkem pyrimidinových bazí. Obě purinové baze obsahují aminoskupiny, proto bylo předpokládáno, že s komplexem Zn(cyklen) nebudou tvořit ternární komplex a tudíž nebude k inhibici docházet. Díky nízké rozpustnosti guaninu nebylo možné dosáhnout potřebné koncentrace. 1,4 adenin adenosin cytosin
1,2
k b/k ZnL
cytidin guanosin
1,0
0,8 0
5
10
15
[baze], mM Obr. 70: Vliv přídavku purinových bazí a porovnání s cytosinem a cytidinem
68
20
1,0
guanosin-5-P adenosin-5-P cytidin-5-P uridin-5-P thymidin-5-P
k b/k ZnL
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 0
2
4
6
8
[baze], mM
10
12
Obr. 71: Porovnání inhibičního účinku všech nukleotidů
1,0
adenosin-5-P ATP fosfát thymidin-5-P
k b/k ZnL
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 0
2
4
6
8
10
12
[baze], mM Obr. 72: Porovnání inhibičního účinku adenosin-5-fosfátu, adenosin-5-trifosfátu se samotným fosfátem a thymidin-5-fosfátem
69
Také guanosin-5-fosfát a adenosin-5-fosfát mají velmi podobný inhibiční účinek jako cytidin-5-fosfát, ale mnohem menší než v případě thymidin-5-fosfátu a uridin-5-fosfátu. Adenosin-5-trifosfát vykazuje větší inhibiční účinek než adenosin-5-monofosfát či samotný fosfát. Může to být způsobeno rozkladem trifosfátu např. až na nukleosid a trifosfát nebo 3 fosfáty, které mohou tvořit ternární komplex se Zn(cyklen), popř. může docházet k interakci s molekulami fosfátu v rámci ATP (tedy bez rozkladu). Adenin a adenosin hydrolýzu neinhibují, ale mírně katalyzují. Guanosin, podobně jako cytosin a cytidin, nemají žádný efekt.
4.5.3 Imidazol
6
-3
-1
k obs (10 s )
9
3
0 0
1
2
3
[imidazol], mM Obr. 73: Katalytický efekt imidazolu na hydrolýzu NFAc; pH = 9,0 (200 mM CHES), t = 60°C, I = 0,1 M (NaClO4)
70
9
-3
-1
k obs (10 s )
12
6
Zn(cyklen) Cd(cyklen)
3
0 0
1
2
3
4
[imidazol], mM Obr. 74: Katalytický efekt imidazolu po jeho přídavku ke komplexům Zn(cyklen) a Cd(cyklen); pH = 9,0 (200 mM CHES), t = 60°C, I = 0,1 M (NaClO4), [Zn(cyklen)]=[Cd(cyklen)]=7,05 mM Po přídavku imidazolu docházelo k mnohem většímu katalytickému efektu, než tomu bylo u ostatních použitých katalyzátorů. Při pH = 9,0 a t = 60°C byla katalytická konstanta pro imidazol 2,359±0,006 M-1s-1, zatímco pro Zn(cyklen) pouze 0,711±0,089 M-1s-1. Tato skutečnost může být zapříčiněna faktem, že imidazol je silnou bazí schopnou navázání protonu z vody, čímž vznikají anionty OH- způsobující katalýzu: H2L+ + OH-
HL + H2O
+
N H N H H2L+
(E)
N
pK1
N
pK2
N H
N
L-
HL
Obr. 75: Acidobazické vlastnosti imidazolu ve vodném roztoku (konstanty pKa vypočteny pomocí programu ACD/pKa DB: pK1 = 7,18±0,61, pK2 = 14,10±0,55)
71
Katalytický efekt imidazolu je snižován v přítomnosti komplexů Zn(cyklen) a Cd(cyklen), neboť dochází k tvorbě ternárních komplexů. S komplexem Zn(cyklen) se tvoří o něco stabilnější ternární komplex (log K = 3,0) než s komplexem Cd(cyklen) (log K = 2,0). Při vzniku těchto komplexů je bazický dusíkový atom vázán ke kationtu Zn(II) či Cd(II), při vyšším pH může vznikat i dvojjaderný komplex [(Zn(cyklen))2-imidazol]3+ (viz obr. 13 kap. 1.1.3). Z tohoto důvodu je vypočtená kkat imidazolu se Zn(cyklen) nižší (1,198±0,082 M-1s-1) než s Cd(cyklen) (1,723±0,156 M-1s-1). Purinové baze (adenin a guanin) obsahují ve své struktuře skelet podobný imidazolu, což mohlo být důvodem pro pozorování slabého katalytického efektu adeninu ve směsi s komplexem Zn(cyklen). Navíc adenin obsahuje aminoskupinu znemožňující vznik stabilního ternárního komplexu se Zn(cyklen) komplexem, takže nedochází k inhibici. Guanin, resp. guanosin sice také obsahuje imidazolový skelet a aminoskupinu jako v případě adeninu, ovšem u guanosinu žádný efekt pozorován nebyl.
4.5.4 Analýza směsi nukleových bazí Byl zkoumán inhibiční účinek 2-desoxythymidinu ve směsi s cytidinem a guanosinem a poté porovnán s účinkem samotného nukleosidu. Totéž bylo provedeno u thyminu, nejprve s přídavkem adeninu a cytosinu, poté pouze ve směsi s cytosinem. 1,0
samotný směs cytidin+guanosin
k b/k ZnL
0,8
0,6
0,4 0
2
4
6
[2-desoxythymidin], mM
Obr. 76: Porovnání inhibičního účinku 2-desoxythymidinu; [cytidin]=3,44 mM, [guanosin] =2,12 mM 72
1,0 samotný směs A+C
k b/k ZnL
směs s C 0,8
0,6 0
2
4
6
[thymin], mM Obr. 77: Porovnání inhibičního účinku samotného thyminu a thyminu ve směsi; [adenin] = 2,19 mM, [cytosin] = 2,15 mM
Bylo potvrzeno, že je možné stanovit koncentraci 2-desoxythymidinu ve směsi nukleosidů cytidinu a guanosinu, neboť ve směsi má 2-desoxythymidin stejný inhibiční účinek jako v případě samotného nukleosidu. Katalytický efekt adeninu se projevil i ve směsi s thyminem a cytosinem. Směs thymin/cytosin vykazovala již stejný účinek jako samotný thymin, a proto je možné stanovit thymin v přítomnosti cytosinu.
73
4.5.5 Další inhibitory 1,2
k b/k ZnL
1,0
inosin
0,8
uracil kys. barbiturová Cl-
0,6
0,4
0,2
0
10
20
30
40
[baze], mM
Obr. 78: Porovnání závislosti poměru kB a kZnL na koncentraci bazí; pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60°C Inhibiční efekt na hydrolýzu NFAc substrátu mají i některé jiné látky strukturně podobné nukleovým bazím. Byla pozorována inhibice po přídavku inosinu, v jehož strukturním motivu se vyskytuje 1 oxoskupina. Stabilizace ternárního Zn(cyklen) komplexu je možná prostřednictvím pouze jediné vodíkové vazby a konstanta stability vzniklého ternárního komplexu je nižší než např. u uridinu či uracilu (4,2±0,1 pro uridin vs. 5,2±0,1 pro inosin). Inosin má tudíž slabší inhibiční efekt. Podobný efekt jako u inosinu byl pozorován u kyseliny barbiturové. Po přídavku chloridových aniontů nebyl pozorován žádný inhibiční efekt. Vzhledem ke zjištění katalytického působení imidazolu bylo nutno vyloučit možnost, že by přídavek baze nukleové kyseliny měl vliv na rychlost samovolné hydrolýzy bez přitomnosti katalyzátoru. Rychlostní konstanta samovolné hydrolýzy při pH=9,0 a 60°C je 1,39 x 10-3 s-1, po přídavku cca 7 mM 2-desoxythymidinu se její hodnota prakticky nezměnila (kobs=1,44 x 10-3 s-1). Rovněž přídavek nukleotidů něměl téměř žádný efekt (např. 7 mM cytidin-5-fosfát: 1,56 x 10-3 s-1). Po přídavku 5 mM thyminu se již projevoval velmi slabý účinek (kobs=1,91 x 10-3 s-1), ovšem nijak významně.
74
4.6 Stanovení Zn2+ ve směsi s Cu2+ Byla
porovnávána
katalytická
konstanta
komplexu
Zn(cyklen)
ve
směsi
Zn(cyklen)/Cu(cyklen) s katalytickou konstantou pro samotný komplex Zn(cyklen). Katalytická konstanta pro samotný komplex Zn(cyklen) je 0,726±0,044 M-1s-1, ve směsi s Cu(cyklen) je 0,764±0,017 M-1s-1. Obě konstanty jsou srovnatelné, projevuje se pouze slabý katalytický efekt komplexu Cu(cyklen). V případě, že ve vzorku není nadbytek Cu2+ vzhledem k Zn2+, je možné uvedený postup použít pro stanovení Zn2+ ve směsi.
Při přípravě směsi (viz experimentální část) byl k iontům kovů ve směsi přidán nadbytek cyklenu, aby došlo ke komplexaci obou kationtů. Jinak by vznikl kvantitativně pouze komplex Cu(cyklen), neboť měďnatý komplex cyklenu má mnohem vyšší konstantu stability než zinečnatý (viz obr. 1). Pro oba roztoky, tedy směs a samotný Zn(cyklen), bylo nutné použít stejně velký nadbytek ligandu cyklenu, neboť vykazuje také katalytický efekt. 10 y = 0,764x + 1,753 2 R = 0,999
k obs [10-3 s-1]
8
y = 0,726x + 1,780 2 R = 0,993
6
Zn2+ 4
směs 2
0 0
2
4
6
8
10
[Zn(cyklen)], mM
Obr. 79: Porovnání katalytických rychlostních konstant hydrolýzy NFAc při katalýze samotným komplexem Zn(cyklen) a komplexem Zn(cyklen) ve směsi s Cu(cyklen) pH = 9,0 (100 mM CHES), t = 60 °C
75
V. Závěr V diplomové
práci
bylo
studováno
katalytické
působení
kovových
komplexů
tetraazamakrocyklických ligandů, především Zn(II) komplexu cyklenu, na hydrolýzu esterů 4nitrofenylacetátu a 4-methylumbelliferylacetátu, pomocí molekulové absorpční spektroskopie a luminiscenční spektroskopie.
Podle modelu Michaelise a Mentenové byly vypočteny jejich parametry (konstanty stability kinetického intermediátu enzym-substrát a max. rychlost. Bylo zjištěno, že tento intermediát má relativně nízkou stabilitu a byly vypočteny parametry pro inhibovanou a neinhibovanou hydrolýzu. Na základě výsledků nelze jednoznačně potvrdit, o jaký typ inhibice se jedná.
Byly zkoumány experimentální podmínky ovlivňující katalytický efekt kovových komplexů cyklenu. Zn(cyklen) vykazoval největší efekt při pH = 9,0 a t = 60°C. U kompexu Cd(cyklen) docházelo při rostoucí hodnotě pH naopak ke zvyšování jeho katalytické účinnosti. Velikost iontové síly nemá na rychlost hydrolýzy významný vliv. U komplexů Cu(cyklen) a Ni(cyklen) byl při srovnatelných podminkách zjištěn velmi nízký efekt. Této skutečnosti bylo využito ke stanovení Zn2+ ve směsi s Cu2+. Samotný ligand cyklen vykazoval při tomto pH efekt srovnatelný s komplexem Cd(cyklen). Zn(II) komplexy jiných tetraazamakrocyklických ligandů nevykazovaly za zkoumaných poodmínek významnější katalytický efekt.
Byl zjištěn inhibiční efekt pyrimidinových nukleových bazí (uracilu a thyminu) a jejich nukleosidů a nukleotidů při hydrolýze 4-nitrofenylacetátu katalyzované komplexy Zn(cyklen) a Cd(cyklen). Cytosin ani cytidin tento efekt nevykazovaly. Guanosin tento efekt také nevykazoval, adenin a adenosin měl slabý katalytický efekt. Všechny nukleotidy měly inhibiční efekt, a to díky přítomné fosfátové skupině. Hydrolýzu inhibovaly i jiné strukturně podobné látky, a sice inosin a kyselina barbiturová. Zjištěných faktů lze využít ke stanovení thyminu a 2desoxythymidinu ve směsi s jinými bazemi nukleových kyselin.
76
Byl prokázán silný katalytický vliv imidazolu, jehož účinek se snižuje v přítomnosti komplexů Zn(cyklen) a Cd(cyklen) v důsledku tvorby ternárních komplexů. Baze nukleových kyselin neměly na nekatalyzovanou hydrolýzu významný vliv.
77
VI. Použitá literatura 1) Shionoya M., Kimura E., Shiro M., J. Am. Chem. Soc., 115, 6730-6737 (1993) 2) Zhang X., Rudi van Eldik, Inorg. Chem., 34, 5606-5614 (1995) 3) Salter M. H., Jr., Reibenspies J. H., Jones S. B, Hancock R. D., Inorg. Chem. 44, 27912797 (2005) 4) Kruppa, M., Frank, D., Leffler-Schuster, H., König, B., Inorg. Chim. Acta, 359, 11591168 (2006) 5) Lubal P., Chemie makrocyklických sloučenin (C8840) – přednášky rok 2005/2006 6) Štěpánek A., Studium komplexotvorných rovnováh komplexu Zn(cyklen) s některými bioligandy, Bakalářská práce, PřF MU Brno, 2006 7) Koike T., Takamura M, Kimura E., J. Am. Chem. Soc., 116, 8443-8449 (1994) 8) Vargová Z., Kotek J., Rudovský J., Plutnar J.,Gyepes R., Hermann P.,Györyová K., and Lukes I., Eur. J. Inorg. Chem.,3974–3987 (2007) 9) Allen Chang C., Hong Wu Bo, Yuan Kuan Bu, Inorg. Chem., 44, 6646-6654 (2005) 10) Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L.: Biochemistry, International edition, 5. edice (2002) 11) Kimura E., Pure & Appl. Chem., 65, 355-359 (1993) 12) Rawlings J., Cleland W. W., Hengge A. C., J. Inorg. Biochem, 93, 61-65 (2003) 13) Subat M., Woinaroschi K., Anthofer S., Malterer B., König, B., Inorg. Chem., 46, 43364356 (2007) 14) Rossiter C. S., Mathews R. A., and Morrow J. R., Inorg. Chem., 44, 9397-9404 (2005) 15) Treindl L., Chemická kinetika, Slovenské pedagogické nakladateľstvo v Bratislave, 1978 16) Klouda P., Základy biochemie, nakl. Pavel Klouda, Ostrava, 2000 17) Enzymy-enzymová Základy
biochemie
katalýza,
PřF
UP
KBC/BCH,
v Olomouci,
převzato
10.
prezentace 12.
2008
k předmětu z adresy:
ibiochemie.upol.cz/WebGraphics/biochemie/download/Modul-02.ppt 18) Kol. autorů, Malá encyklopédia chémie, Obzor, Bratislava, 1981 19) Koike T., Takashige M., Kimura E., Fujioka H. and Shiro M., Chem. Eur. J., 2, 617 (1996)
78
