MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE

Bakalářská práce

Brno 2016

Marie Nováková

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

ÚSTAV CHEMIE

NEFELOMETRICKÉ A TURBIDIMETRICKÉ METODY VE VÝUCE ANALYTICKÉ CHEMIE Bakalářská práce

Marie Nováková

Vedoucí práce: RNDr. Marta Farková, CSc.

Brno 2016

Bibliografický záznam Autor:

Marie Nováková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav chemie

Název práce:

Nefelometrické a turbidimetrické metody ve výuce analytické chemie

Studijní program:

Chemie

Studijní obor:

Analytický chemik − manažer chemické laboratoře

Vedoucí práce:

RNDr. Marta Farková, CSc.

Akademický rok:

2015/2016

Počet stran:

59

Klíčová slova:

nefelometrie, turbidimetrie, chloridy, sírany, C-reaktivní protein

Bibliographic Entry Author:

Marie Nováková Faculty of Science, Masaryk University Department of Chemistry

Title of Thesis:

Nephelometric and turbidimetric methods in teaching analytical chemistry

Degree Programme:

Chemistry

Field of Study:

Analytical Chemist − Manager of chemical laboratory

Supervisor:

RNDr. Marta Farková, CSc.

Academic Year:

2015/2016

Number of Pages:

59

Keywords:

nephelometry, turbidimetry, chlorides, sulfates, C-reactive protein

Abstrakt Tato bakalářské práce se věnuje využitím nefelometrických a turbidimetrických metod ve výuce analytické chemie. Cílem byl vývoj analytických postupů pro stanovení anorganických iontů a následné vytvoření úlohy pro praktikum z analytické chemie a sepsání návodu. Byl vyvinut postup pro nefelometrické stanovení chloridových a síranových aniontů ve vzorcích pitných a minerálních vod. Dále bylo pomocí imunoturbidimetrie a imunonefelometrie testováno stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) ve vzorcích Protein control level. Jedná se o roztoky lidského plazmatu s fyziologickým roztokem a s fosfátovým pufrem.

Abstract This thesis deals with using nephelometric and turbidimetric methods in teaching analytical chemistry. The aim was to develop analytical procedures for the determination of inorganic ions and subsequently to create a task for practical lessons in analytical chemistry and also to write instructions. The method for the nephelometric determination of chloride and sulfate anions in samples of drinking and mineral waters was developed. Furthermore, the immunonephelometric and the immunoturbidimetric determination of C-reactive protein (CRP) in samples of Protein control level was tested. Samples of Protein control level are dilutions of human plasma with saline and phosphate buffer.

Poděkování Ráda bych na tomto místě chtěla poděkovat RNDr. Martě Farkové, CSc. za vedení mé bakalářské práce, za její podnětné rady a připomínky. Dále děkuji mé konzultantce Ing. Heleně Zavadilové za ochotu, pomoc a rady při práci v laboratoři. Mé poděkování patří i doc. RNDr. Přemyslu Lubalovi, Ph.D. za čas, který mi ochotně věnoval, i za jeho cenné rady při konzultacích.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 27. května 2016

............................................. Marie Nováková

Obsah 1

Úvod.......................................................................................................................... 9

2

Teoretická část ........................................................................................................ 10 2.1

Optické metody ................................................................................................ 10

2.1.1

2.1.1.1

Emisní metody ................................................................................... 10

2.1.1.2

Absorpční metody ............................................................................. 10

2.1.2

Nespektrální metody ................................................................................. 11

2.1.3

Elektromagnetické záření ......................................................................... 11

2.2

Kolorimetrie ..................................................................................................... 12

2.3

Nefelometrie a turbidimetrie ............................................................................ 14

2.3.1

Rozptyl záření ........................................................................................... 14

2.3.2

Princip nefelometrie a turbidimetrie ......................................................... 17

2.3.3

Instrumentace ............................................................................................ 19

2.3.3.1

Zdroj záření ....................................................................................... 19

2.3.3.2

Monochromátor ................................................................................. 19

2.3.3.3

Prostor pro kyvetu se vzorkem .......................................................... 20

2.3.3.4

Detektor ............................................................................................. 20

2.3.3.5

Vyhodnocovací zařízení .................................................................... 20

2.3.4 2.4

3

Spektrální metody ..................................................................................... 10

Aplikace .................................................................................................... 21

Metody určení výsledku stanovení................................................................... 22

2.4.1

Metoda kalibrační křivky .......................................................................... 22

2.4.2

Metoda přídavku standardu ...................................................................... 22

Experimentální část................................................................................................. 24 3.1

Použité chemikálie ........................................................................................... 24

3.2

Použité přístroje ............................................................................................... 24

3.3

Stanovení chloridů nefelometricky .................................................................. 26

7

3.3.1

Metoda kalibrační křivky .......................................................................... 26

3.3.2

Metoda přídavku standardu ...................................................................... 30

3.4

Stanovení síranů nefelometricky ...................................................................... 35

3.4.1 3.5

Stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) imunoturbidimetricky ..................... 39

3.5.1 3.6

Metoda kalibrační křivky .......................................................................... 35

Metoda kalibrační křivky .......................................................................... 40

Stanovení C-reaktivního proteinu imunonefelometricky ................................. 42

4

Závěr ....................................................................................................................... 44

5

Bibliografie ............................................................................................................. 45

6

Příloha ..................................................................................................................... 48 6.1

Grafy ................................................................................................................ 48

6.2

Návod do praktika z analytické chemie ........................................................... 53

8

1 Úvod Nefelometrie a turbidimetrie jsou hojně využívané nejen v chemickém průmyslu, ale také například v průmyslu potravinářském či farmaceutickém nebo v lékařství. [1] Využívají se zejména k hodnocení kvality vod, nápojů, potravin, ke kontrole kvality ovzduší a také k rozborům tělních tekutin. [1; 2; 3] Jednou z mnoha látek, které se stanovují v lidském séru, je C-reaktivní protein (CRP). Jedná se o protein, který je produkován játry a řadí se do skupiny proteinů akutní fáze. [4] Při zánětlivých procesech se výrazně zvyšuje jeho obsah v krvi. Souvisí s mnoha onemocněními, zvýšený obsah předpovídá dokonce i riziko infarktu myokardu. U zdravého člověka by měla být koncentrace CRP v intervalu 0−5 mg∙l-1. [5] V této práci bude nefelometrie využita pro stanovení koncentrace chloridových a síranových aniontů ve vzorcích pitných a minerálních vod. Dále budou testovány možnosti imunoturbidimetrické stanovení CRP.

.

9

2 Teoretická část 2.1 Optické metody Optické metody můžeme zařadit mezi fyzikální metody, jež jsou v dnešní době běžně využívané při kvalitativních a také kvantitativních analýzách. V analytické chemii se často setkáváme s metodami, které pro stanovení látek využívají jevů, které vznikají vzájemnou interakcí mezi stanovovanou látkou a elektromagnetickým zářením. Název optické metody má historické důvody, neboť zpočátku byla pro analytické účely využívána viditelná složka elektromagnetického záření. [6] Optické metody můžeme rozdělit do dvou hlavních skupin. Jedná se o metody, při kterých dochází k výměně energie mezi látkou a zářením a při kterých nedochází k výměně energie mezi látkou a zářením.

2.1.1 Spektrální metody Optické metody, při kterých dochází k výměně energie mezi látkou a zářením, označujeme také jako metody spektrální. U těchto metod při vyhodnocování dat můžeme získat

spektrum,

které

charakterizuje

závislost

veličiny

(např.

intenzita

elektromagnetického záření) na frekvenci záření. Běžně se zde také využívají veličiny, jako je vlnová délka či vlnočet. Mezi tyto metody patří metody emisní a absorpční. 2.1.1.1 Emisní metody Emisní metody jsou takové metody, kde dochází k emisi částic na základě dodání tepelné energie, elektrické energie, proudu částic či elektromagnetického záření vzorku a následnému měření těchto emitovaných částic. Mezi emisní metody řadíme např. atomovou emisní spektrometrii. 2.1.1.2 Absorpční metody Absorpční metody jsou metody, u nichž dochází k absorpci záření vzorkem a toto absorbované záření je poté měřeno. U absorpčních metod lze využít záření o různých vlnových délkách, podle kterých je můžeme dělit na atomovou absorpční spektrometrii, ultrafialovou a viditelnou spektrometrii, infračervenou spektrometrii, Ramanovu spektrometrii a další.

10

2.1.2 Nespektrální metody Nedochází u nich k výměně energie mezi látkou a zářením, ale při interakci látky se zářením můžeme sledovat jiné změny vlastností záření, mezi které řadíme například rychlost záření, rozptyl záření či stáčení roviny polarizovaného světla. Zahrnujeme sem polarimetrii, refraktometrii, interferometrii, nefelometrii a turbidimetrii.

2.1.3 Elektromagnetické záření Elektromagnetické záření je druh energie, která je v prostoru přenášena velkou rychlostí. [7] Na elektromagnetické záření je z jedné strany nahlíženo jako na vlnění a z druhé strany je popisováno jako proud částic, které mají nulovou klidovou hmotnost a nazývají se fotony. Z hlediska vlnění jsou pro záření důležitými parametry vlnová délka, frekvence, rychlost, amplituda a vlnočet. U fotonu je potom důležitá jeho energie, která je přímo úměrná frekvenci záření. Tyto dva pohledy na záření jako na částice a vlny se vzájemně nevylučují. [7] Elektromagnetické záření má mnoho forem, z nichž nejznámější a také nejsnadněji rozeznatelné je světlo a tepelné záření. [7] Mezi další formy, které se běžně v analytické chemii využívají, se podle rozsahu vlnové délky řadí záření radiofrekvenční, mikrovlnné, infračervené, ultrafialové, rentgenové a γ. Mezi infračervenou a ultrafialovou oblastí záření se vyskytuje viditelné záření, jehož rozsah vlnových délek je velmi úzký: přibližně 400 až 800 nm. [6] Obrázek č. 1 zobrazuje spektrum elektromagnetického záření včetně oblastí vlnových délek a frekvencí.

Obrázek 1 Spektrum elektromagnetického záření

11

O záření lze mluvit jako o monochromatickém či polychromatickém v závislosti na tom, zda se skládá ze záření o jedné vlnové délce či více. V analytické chemii hovoříme například u laseru o monochromatickém záření. Příkladem polychromatického záření, tedy složeného záření, je například sluneční světlo. Každé bílé světlo je vlastně polychromatické záření, jelikož obsahuje záření všech vlnových délek z viditelné oblasti elektromagnetického spektra.

2.2 Kolorimetrie Vizuální kolorimetrie, jedna z nejstarších analytických metod, byla používána již v dobách dávných Řeků a Římanů, ačkoliv až v roce 1729 začala nabírat modernějšího vědeckého charakteru, když Pierre Bouguer postuloval, že pokud daná šířka barevného skla absorbuje polovinu světla vycházejícího ze zdroje, poté bude dvojnásobná šířka snižovat intenzitu na čtvrtinu její počáteční hodnoty. [8] Nezávisle na Bouguerovi se v roce 1760 Jean-Henri Lambert zabýval vztahem mezi intenzitou světla a neprůsvitností prostředí. Auguste Beer pak v roce 1850 odvodil vztah mezi koncentrací a optickou hustotou (nyní nazývanou jako absorbance), který vedl k současné formě Lambert-Beerova zákona (též nazývaného Bouguer-Lambert-Beerův zákon). [8] Lambert-Beerův zákon tedy vyjadřuje závislost absorbance na tloušťce vrstvy l, na molárním absorpčním koeficientu ε a také na koncentraci roztoku c:

𝐴=𝑙 ∙ 𝜀 ∙𝑐

(1)

Tloušťka vrstvy je udávána v cm, molární absorpční koeficient se vyjadřuje v dm3∙mol−1∙cm−1 a molární koncentrace v mol∙dm−3. Absorbance je tudíž bezrozměrná veličina. Absorbance A je také spojena s transmitancí T, protože molekula absorbuje záření o určité vlnové délce a čím více molekul se v roztoku nachází, tím více je záření o této vlnové délce absorbováno a tím méně je toto záření propouštěno dále roztokem. Vztah mezi absorbancí a transmitancí vyjadřuje následující rovnice:

𝐴 = − log 𝑇

(2)

12

Rovnici číslo (2) můžeme ještě dále upravit, když víme, že transmitanci lze vyjádřit jako poměr intenzity záření prošlého vzorkem I a intenzity záření, které vstoupilo do vzorku, I0. Poté vztah (2) můžeme přepsat do následujícího tvaru:

𝐴 = − log

𝐼

(3)

𝐼0

Hodnoty transmitance jsou často vyjadřovány v procentech. Jestliže víme, že hodnota transmitance je 100 %, tedy veškeré záření, které vstoupilo do vzorku, jím také prošlo, hodnota absorbance je nulová, vzorek nepohltil žádné záření. V opačném případě, když je hodnota transmitance nulová, vzorek pohltil veškeré záření, které do něj vstoupilo, má absorbance určitou číselnou hodnotu. Na obrázku č. 2 je zmíněný vztah mezi absorbancí a transmitancí vyjádřen graficky. 2,0

Absorbance

1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0

20

40

60

80

100

Transmitance [%] Obrázek 2 Vztah mezi absorbancí a transmitancí

Kolorimetrie je založena na absorpci elektromagnetického záření z oblasti ultrafialového až infračerveného záření látkou. Tento fakt je velmi důležitý a v současné době hojně využívaný pro kvantitativní stanovení. Vzhledem k Lambert-Beerovu zákonu lze ze specifické absorbance látky při určité vlnové délce stanovit její koncentraci v roztoku. Technika kolorimetrie je používána ke stanovení koncentrace barevných sloučenin v roztoku. [9] Kolorimetrie se netýká pouze sloučenin, které mají absorpční spektra v oblasti UV/Vis spektra, ale lze ji také aplikovat na všechny sloučeniny, které po změně specifickými činidly poskytují deriváty, umožňující měření absorpce. [8] Samotné

13

měření nemusí být provedeno pouze jednou, jelikož lze pozorovat změny v absorbanci v průběhu reakce v důsledku probíhajících změn v koncentraci barevných složek. Mezi kolorimetrické techniky spojené s Lambert-Beerovým zákonem patří také nefelometrie a turbidimetrie.

2.3 Nefelometrie a turbidimetrie Jak již bylo zmíněno v kapitole Optické metody, řadíme nefelometrii a turbidimetrii do metod nespektrálních. Mezi látkou a zářením nedochází k výměně energie, ale je sledován rozptyl záření. Je důležité uvědomit si, že rozptyl spojený s nefelometrií a taktéž i s turbidimetrií (na rozdíl od Ramanovy spektroskopie) nezahrnuje žádnou ztrátu zářivé energie; je ovlivněn pouze směr šíření záření. [7]

2.3.1 Rozptyl záření Rozptyl záření je komplexní jev: zahrnuje odraz, lom a také částečnou absorpci záření heterogenními částicemi, převážně v koloidních roztocích, suspenzích a na jemných vrstvách pevných částeček. [10] Při dopadu záření na vzorek, který obsahuje malé částečky, dojde k vytvoření sekundárního záření stejné vlnové délky a toto záření následně vychází z částečky do všech směrů. Pro charakter a intenzitu rozptýleného záření je rozhodující velikost částečky, která má být blízká vlnové délce dopadajícího záření. [2] Pro viditelné záření by měla být velikost částečky menší nebo rovna 0,8 μm a pro ultrafialové záření menší nebo rovna 0,3 μm. Zde má rozhodující význam parametr α, jehož vztah k vlnové délce a k poloměru částice vidíme v následující rovnici.

𝛼=

2𝜋𝑟 𝜆

(4)

kde r vyjadřuje poloměr částice, λ vyjadřuje vlnovou délku dopadajícího záření. Má-li částice mnohem menší velikost, než je vlnová délka dopadajícího záření, pak se emitované záření do ostatních směrů do značné míry ruší mimo směr dopadajícího záření, u velkých částeček zase převažuje odraz záření. [10] Částečky můžeme rozdělit podle velikosti do tří skupin:

14

1. Malé částečky Do skupiny malých částeček řadíme ty, které mají průměr menší než 0,1λ. Po dopadu paprsku na malou částečku získáme charakteristický rozptyl záření, který je relativně symetrický. Rozptyl záření od molekul nebo shluků molekul s velikostí výrazně menší než vlnová délka záření se nazývá Rayleighův rozptyl. [7] Teorie Rayleighova rozptylu z roku 1871, původně odvozená pro plyny, je vhodná pro kapaliny s malou koncentrací suspendovaných částic, které spolu navzájem neinteragují. [1] Intenzita rozptýleného záření závisí na vlnové délce, na polarizovatelnosti částice a také na již zmíněné velikosti částečky. Pro intenzitu rozptýleného záření platí Rayleighův zákon: 𝑛′

𝑁𝑉 2

𝑛

𝜆4 𝑟 2

𝐼𝜃 = 𝐼0 ∙ ( − 1)2 ∙ (

) ∙ (1 + cos 2 𝜃)

(5)

kde 𝐼𝜃 vyjadřuje intenzitu rozptýleného záření do úhlu 𝜃, 𝐼0 intenzitu počátečního záření, 𝑛′ index lomu částice, 𝑛 index lomu prostředí, 𝑟 vzdálenost od částic k bodu měření, 𝑁 počet částic, 𝑉 objem částic. [1] Intenzita záření je tedy nepřímo úměrná čtvrté mocnině vlnové délky. S rostoucí velikostí částice roste rozptyl až do zrcadlového odrazu a exponent u vlnové délky ve výrazu se zmenšuje ze čtvrté mocniny až na druhou mocninu. [2] 2. Větší částečky Většími částečkami se rozumí částečky s průměrem mezi 0,1λ a 0,8λ. Jak bylo uvedeno, s rostoucí velikostí částic roste rozptyl a mění se vliv vlnové délky na intenzitu rozptýleného záření. U větších částeček už nepozorujeme symetrické rozložení rozptýleného záření, ale značně nesymetrické. Destruktivní interference světla rozptýleného ve zpětném směru vede k vychýlení rozptylu světla vpřed. [1] Pro skupinu částeček, jejichž velikost se přibližuje a přesahuje vlnovou délku záření, je vhodnější takzvaný Mieův rozptyl. Jedná se o teorii rozptylu, která pochází z roku 1908 od německého fyzika Gustava Miea, jenž se zabýval rozptylem záření od kulových částic všech průměrů. Nevýhodou však je, že Mieova teorie je složitější.

15

3. Velmi velké částečky Mezi velmi velké částečky řadíme ty, jejichž průměr je větší než 0,8λ. I pro takto velké částice však můžeme použít Mieovu teorii rozptylu. Pro částice větší než ~0,4 μm v průměru se v rozptylových obrazcích objevují široké oscilace. [1] Pro částice o průměru větším než 1 μm se objevuje extrémní koncentrace rozptýleného záření v přímém směru (kvůli vzájemným destruktivním efektům zpětného rozptylu) spolu s druhotnými vrcholky v úhlovém rozložení rozptýleného světla. [1] Na obrázku č. 3 lze vidět, jak velikost částeček ovlivňuje směr rozptýleného záření. Na prvním směrovém diagramu lze vidět symetrický tvar pro malé částice o průměru menším než 0,1λ, druhý diagram pro velké částice o průměru přibližné velikosti 0,25λ již symetrický není a lze vidět vychýlení rozptylu světla v přímém směru záření. Třetí diagram zobrazuje velmi velkou částici o průměru větším než 0,8λ a její charakteristické vychýlení rozptylu vpřed spolu s dalšími vychýlenými vrcholky v různých úhlech. Pro nefelometrické měření se zdrojem záření v oblasti UV/Vis by měla být velikost částeček mezi 0,1−1 μm.

Obrázek 3 Vliv velikosti částeček na rozptyl záření

Na rozptyl záření má značný vliv i koncentrace částic. Útlum paralelního paprsku rozptylem ve zředěné suspenzi je dán vztahem: [7]

𝐼 = 𝐼0 𝑒 −𝜏𝑙

(6)

kde 𝐼 vyjadřuje intenzitu záření prošlou prostředím, 𝐼0 počáteční intenzitu záření, 𝜏 koeficient zakalení prostředí, 16

𝑙 délka prostředí. Hodnota koeficientu zakalení je spojena s koncentrací částic c. [7] Lze odvodit vztah analogický k Lambert-Beerovu zákonu, který zní:

− log

𝐼 𝐼0

= 𝑘𝑙𝑐

(7)

kde 𝑘 = 2,3 𝜏/𝑐. Vztah číslo (7) je využíván v turbidimetrických analýzách stejně, jako je LambertBeerův zákon používán ve fotometrických analýzách. [7] Tento vztah nebere v úvahu ztráty záření vzniklé při absorpci suspendovanými částicemi nebo odrazem od stěn nádoby. [1] S rozptylem světla souvisí i takzvaný Tyndallův jev, na němž jsou založena nefelometrická měření. Jedná se o difúzní rozptyl záření, které prochází prostředím s rozptýlenými částicemi (zejména koloidními). Záření dopadající na částici se v důsledku následného rozptylu stává dostatečně intenzivním a lze ho sledovat pouhým okem. [7] Má tvar kužele a jeho vrchol se nachází v místě, kde záření vstupuje do prostředí s částicemi. Toto záření lze vidět při pozorování v úhlu jiném než 180° ke vstupujícímu záření do prostředí. [11] V homogenním prostředí není Tyndallův jev pozorovatelný. Jev, který sice už roku 1857 objevil Faraday, avšak poprvé jej popsal až fyzik John Tyndall [12], lze sledovat běžně i v přírodě, jestliže jsou v setmělém prostředí ve vzduchu přítomny částečky prachu a dopadají na ně sluneční paprsky.

2.3.2 Princip nefelometrie a turbidimetrie Nefelometrie a turbidimetrie jsou úzce spojené analytické metody, jež pro stanovení využívají rozptylu záření na částicích. [7] Tyto částice způsobují zakalení roztoků. Mezinárodní organizace pro standardizaci (ISO) definuje zákal jako snížení průhlednosti kapaliny způsobené přítomností nerozpuštěné hmoty. [13] Zákal je vyjádření optické vlastnosti prostředí, která způsobuje rozptyl záření a absorpci spíše než jeho propustnost v přímém směru vzorkem. [1] Jako vzorek se pro tato měření běžně využívá kapalina, která obsahuje částečky nutné pro rozptyl počátečního záření. Pokud je tedy vzorek zakalený, není dostatečně čistý a také není průhledný. V takovém případě můžeme

17

hovořit o zákalu jako o protikladu čirosti. Proto lze zákal interpretovat jako měřítko relativní čistoty vody. [14] Čím více je vzorek zakalený, tím více obsahuje různých částic. Záření procházející kapalným prostředím může být rozptýleno a absorbováno nehomogenními částicemi v cestě záření, zejména pevnými částicemi bláta, jílem, řasami planktonem, mikroby, organickou hmotou. [1] Jestliže záření dopadá na roztok s vyjmenovanými částicemi nebo jim podobnými, interagují tyto částice s dopadajícím paprskem tak, že absorbují světelnou energii a poté opět vyzáří energii do různých směrů. Uvnitř částice je záření převedeno na jinou formu energie, například na tepelnou, a probíhá tak absorpce záření. Následně dochází k vyzáření do všech směrů, tedy k rozptylu záření, o kterém bylo v kapitole Rozptyl záření uvedeno, že se jedná o komplexní jev, jelikož zahrnuje jak odraz od povrchu částice uvnitř prostředí, tak lom uvnitř částice. Může však nastat i situace, kdy dojde k několika odrazům uvnitř částice. Rozptyl světla je často doprovázený absorpcí. [1] Snížení energie kolimovaného paprsku v důsledku rozptylu částicemi je základem turbidimetrických metod. [7] Oproti turbidimetrickým metodám jsou nefelometrické metody založeny na měření rozptýleného záření obvykle v pravém úhlu k dopadajícímu paprsku. [7] Obě metody se tedy odlišují pouze tím, kde je umístěn detektor. V turbidimetrii je detektor v ose paprsku a měřeno je záření prošlé vzorkem, které je ochuzené o rozptýlenou složku. [6] V nefelometrii lze detektor umístit pod úhlem 10° až 90° vzhledem k dopadajícímu záření, nejčastěji se však rozptýlené záření měří v kolmém směru. Turbidimetrie je vhodná pro měření koncentrovanějších roztoků s relativně velkými částečkami, nefelometrických měření se využívá pro vzorky s nižší koncentrací částic o menší velikosti. Oproti gravimetrickým metodám mohou turbidimetrie a nefelometrie poskytnout značné výhody týkající se úspory času při stanovení koncentrace částic. [1] Co se týče citlivosti, je nefelometrie obecně citlivější než turbidimetrie. U obou metod je nevýhodou jejich poměrně obtížná reprodukovatelnost. Abychom mohli provádět reprodukovatelné měření, je důležité dodržovat stejné podmínky pro všechna měření. Mezi rozhodující podmínky patří konstantní teplota prostředí, dodržování stejného časového intervalu jak pro míchání roztoku, tak i pro odečet hodnoty z přístroje a neměnná velikost a tvar částeček. [15] Často se do nestabilního roztoku přidává ochranný koloid pro jeho stabilizaci. Jedná se o látku, která se adsorbuje na povrchu částeček a zabraňuje jejich koagulaci. [11] Jako ochranné koloidy se běžně využívají povrchově aktivní látky,

18

mezi něž patří například polyethylenglykol, želatina, Tween 20 či 80, glycerin, arabská guma a další.

2.3.3 Instrumentace Zeslabené záření nebo míra zákalu měřená v přímém směru vzhledem k dopadajícímu paprsku jsou běžně měřeny na fotometrech či spektrofotometrech, nefelometrická měření rozptýleného záření jsou prováděna na fluorimetrech, které jsou uzpůsobeny pro měření v kolmém směru od dopadajícího paprsku. [16] Většina přístrojů pro turbidimetrická a nefelometrická měření má obvykle 5 základních komponent. [1] Jsou jimi zdroj záření, monochromátor, prostor pro vložení kyvety se vzorkem, fotosenzor a vyhodnocovací zařízení. 2.3.3.1 Zdroj záření Jako zdroj záření se využívají různé druhy žárovek. Mezi nejběžněji používané patří wolframová žárovka. Relativně nízká intenzita však způsobuje horší využitelnost u vzorků s malým rozptylem záření. [17] Dalším běžným zdrojem záření bývá xenonová lampa. Můžeme se však setkat i s nefelometry, které jako zdroj záření využívají rtuťovou obloukovou lampu, halogenovou lampu, světlo emitující diody a také lasery. Laserové nefelometry mají obvykle helium-neonový laser. [18] Všechny tyto zdroje mají vyšší intenzitu než wolframové žárovky. [17] Různé typy zdrojů záření se používají proto, že v závislosti na látce dochází k emisi záření při různých frekvencích. [19] Výhodou laserového nefelometru je vysoká intenzita záření a díky kolimovanému paprsku odpadá nutnost jeho zaostřování. 2.3.3.2 Monochromátor Monochromátor (resp. filtr) slouží k izolaci úzkého intervalu vlnových délek. Nejjednodušším a nejlevnějším monochromátorem je filtr povolující průchod pouze diskrétní vlnové délky. [17] Lze použít téměř všechny monochromátory, které se běžně používají u fotometrických měření. U fluorimetrů nebo spektrofluorimetrů, které jsou uzpůsobené pro užití jako nefelometry, se musí nastavit vlnová délka pro rozptýlené (emitované) záření tak, aby byla stejná jako pro dopadající záření. [17] Nefelometry jsou často vybaveny uzavíracím filtrem, který brání vstupu fluorescenčního záření do detektoru. [20]

19

2.3.3.3 Prostor pro kyvetu se vzorkem U nefelometrů používaných především v imunoanalýze klinických vzorků je důležité zejména to, že prostor pro kyvetu se vzorkem musí být navržen takovým způsobem, který umožňuje neustálé promíchávání vzorku, aby bylo zajištěno, že jsou agregáty jednotné. [19] Kyveta může mít buď válcovitý tvar, nebo tvar hranolu. Pro nefelometrická měření prováděná pod jiným úhlem než 90° ke vstupujícímu paprsku jsou vhodnější kruhové kyvety než kyvety hranaté. [20] Výhodou kruhových kyvet je minimalizace odrazu měřeného záření od stěn kyvety. [20] S přístrojem jsou často dodávány kyvety s formazinovými standardy pro jeho kalibraci. 2.3.3.4 Detektor Detektor slouží k detekci signálu a následně předá informaci vyhodnocovacímu zařízení, kde se na displeji či monitoru objeví číselná hodnota signálu. [19] Jako detektor se u většiny přístrojů používá buď fotodioda, nebo fotonásobič. U nefelometrů využívaných pro klinickou analýzu se častěji setkáváme s fotonásobiči. Aby nedošlo k chybám, které by mohly vzniknout při detekování vnějšího světla, je důležité, aby byly detektory dobře stíněné a tak minimalizovaly případné interference. [20] Jak bylo uvedeno v kapitole Princip nefelometrie a turbidimetrie, lze detektor umístit do úhlu v rozmezí 10° až 90° vzhledem k dopadajícímu paprsku. Některé nefelometry také umožňují měnit polohu detektorů 2.3.3.5 Vyhodnocovací zařízení Vyhodnocovací zařízení obdrží elektrický signál od detektoru a poskytne uživateli výstupní hodnotu. Výstupní hodnota může být udávána v libovolných jednotkách intenzity rozptýleného světla. [17] V nefelometrii se nejběžněji můžeme setkat s nefelometrickou jednotkou zákalu (tzv. Nephelometric Turbidity Unit = NTU). [1] Existují však další jednotky zákalu, jako je například FNU (Formazin Nephelometric Unit), FTU (Formazin Turbidity Unit), FAU (Formazin Attenuation Unit) či JTU (Jackson Turbidity Unit).

20

Obrázek 4 Schéma turbidimetru

Obrázek 5 Schéma nefelometru

2.3.4 Aplikace Nefelometrie a turbidimetrie jsou v dnešní době hojně užívané analytické metody. Využití

nachází

v odvětvích

nejen

chemického

průmyslu,

ale

například

i ve farmaceutickém průmyslu, v potravinářském průmyslu. [1] Lze je uplatnit například při kontrole potravin a nápojů, stanovení koncentrací iontů (např. SO42-, Cl-, Ag+, Na+) na základě vytvoření sraženiny, stanovení makromolekul, proteinů, globulinů a albuminů krevního systému, rozborech tělních tekutin a obecně při měření znečištění ovzduší i kapalin. [6; 2; 21; 3] Jsou důležité v potravinářství zejména při hodnocení kvality vod, dále také při sledování kvality produktu zvláště v mléčném průmyslu a v pivovarnictví. [1] V různých odvětvích průmyslu jsou nefelometrie i turbidimetrie užitečné rovněž při sledování a kontrole účinnosti filtračního procesu. [21; 3] Jako imunonefelometrie a imunoturbidimetrie jsou využívány při sledování imunologických reakcí, při kterých dochází ke vzniku imunoprecipitátu na základě interakce antigenu a protilátky. Tyto imunochemické metody slouží k důkazu protilátky v séru či v jiném vzorku za předpokladu, že máme k dispozici známý antigen. Příkladem protilátek jsou imunoglobuliny různých tříd. Mezi základní řadíme IgG, IgM, IgA, IgE a IgD. Několik příkladů nefelometrického a turbidimetrického stanovení iontů na základě vytvoření sraženiny je uvedeno v tabulce I.

21

Tabulka I Příklady nefelometrického a turbidimetrického stanovení iontů [7]

Ion

Činidlo

Sraženina

Metoda

Cl-

AgNO3

AgCl

turbidimetrie, nefelometrie

SO42-

BaCl2

BaSO4

turbidimetrie, nefelometrie

Ag+

NaCl

AgCl

turbidimetrie, nefelometrie

NaZn(UO2)3(OAc)9

turbidimetrie, nefelometrie

Na+

Zn(OAc)2 a UO2(OAc)2

Au3+

SnCl2

Au

turbidimetrie

Ca2+

H2C2O4

CaC2O4

turbidimetrie

2.4 Metody určení výsledku stanovení Většina analytických metod patří mezi metody relativní, u nichž je pro kvantitativní vyhodnocení signálu zapotřebí kalibrace. [2] Mezi dvě nejčastěji využívané kalibrační metody patří metoda kalibrační křivky a metoda přídavku standardu. U obou metod jsou neznámé vzorky porovnávány se standardy.

2.4.1 Metoda kalibrační křivky U metody kalibrační křivky je důležité připravit si sadu kalibračních roztoků. Kalibrační roztoky jsou standardy obsahující známý, postupně se zvyšující obsah stanovované látky. Je žádoucí, aby se koncentrace stanovované látky v analyzovaném vzorku nacházela v rozmezí koncentrací kalibračních roztoků. Na základě změření kalibračních roztoků sestavíme graf závislosti analytického signálu na koncentraci látky. [6] Body v grafu proložíme přímkou. Pro účely analýz je nejvýhodnější lineární tvar kalibrační křivky. Parametry kalibrační závislosti lze vypočítat pomocí regresní analýzy. [22] Místo grafického vyhodnocení lze použít i numerický postup. Získáme rovnici přímky ve tvaru y = a + bx. Obsah stanovované látky ve vzorku zjistíme změřením signálu a následným výpočtem z této rovnice či graficky. Nevýhodou metody kalibrační křivky je vliv matrice vzorku na analytický signál.

2.4.2 Metoda přídavku standardu Metoda přídavku standardu eliminuje vliv matrice. U metody přídavku standardu pracujeme se stejnými množstvími vzorku a k nim přidáváme různá množství standardu o známé koncentraci. Odměrné baňky s roztoky jsou doplněny po rysku destilovanou

22

vodou. Připravené roztoky jsou proměřeny a je vytvořen graf, kde na ose x je vyneseno látkové množství přidaného standardu a na ose y odpovídající analytický signál. Body proložíme přímkou a zjistíme průsečík této přímky s osou x. Tento průsečík odpovídá látkovému množství n0 látky ve vzorku. Na obrázku č. 6 je znázorněna metoda kalibrační křivky, na obrázku č. 7 pak lze vidět metodu přídavku standardu, kde n0 je látkové množství stanovované látky ve vzorku.

Obrázek 6 Metoda kalibrační křivky

Obrázek 7 Metoda přídavku standardu

23

3 Experimentální část 3.1 Použité chemikálie 

Chlorid sodný, NaCl, p. a., Lach-ner, s.r.o., Česká republika



Kyselina dusičná 1M, HNO3, p. a., Lach-ner, s.r.o., Česká republika



Dusičnan stříbrný, AgNO3, p.a., Spolana n. p., Neratovice



Síran draselný, K2SO4, Lachema, n.p., Československo



Kyselina chlorovodíková 1M, HCl, p. a., Lach-ner, s.r.o., Česká republika



Chlorid barnatý dihydrát, BaCl2 ∙ 2H2O, Spolek pro chemickou a hutní výrobu, Československo



CRP Calibrator, Erba Lachema s.r.o., Česká republika



Protein control level 1, Erba Lachema s.r.o., Česká republika



Protein control level 2, Erba Lachema s.r.o., Česká republika



R1 pufr, Erba Lachema s.r.o., Česká republika



R2 protilátka, Erba Lachema s.r.o., Česká republika

3.2 Použité přístroje Kompaktní fotometr: MN PF-12Plus, MACHEREY-NAGELGmbH & Co. KG, Německo 

jednopaprskový filtrový fotometr



rozsah vlnových délek: 340–860 nm



860 nm LED pro měření NTU



xenonová výbojka



detektor: křemíková fotodioda



kyvety s kruhovým průměrem 16 mm

Spektrofotometr UV-Vis: Lightwave II, WPA, Biochrom Ltd., Anglie 

jednopaprskový



rozsah vlnových délek: 190–1100 nm



xenonová výbojka



detekce diodovým polem

24

Senzor zákalu (nefelometr): TRB-BTA, Vernier Software & Technology, LLC., USA Minitermostat: Thermostat TK-1, KEVA, Ing. Pavel Krásenský, Česká republika Analytické váhy: PioneerTM, OHAUS Corporation, USA Čistička ultrazvuková: Sonorex RK 100H, Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Německo Míchačka magnetická: MM 4, Lavat a. s., Česká republika

25

3.3 Stanovení chloridů nefelometricky Principem stanovení chloridů nefelometricky je reakce chloridových aniontů s dusičnanem stříbrným. Po interakci těchto látek dochází ke vzniku sraženiny chloridu stříbrného a objevuje se mléčný zákal. Ag+ + Cl- → ↓ AgCl Míra zákalu je přímo úměrná koncentraci aniontů. Stanovení chloridů nefelometrickým měřením zákalu v rámci předmětu C6250 Metody chemického výzkumu – praktikum bylo dosud měřeno na senzoru zákalu TRBBTA. Do výukové laboratoře byl nově zakoupen fotometr MN PF-12Plus, a tak bylo potřeba uzpůsobit stanovení chloridů pro tento přístroj. Pro srovnání byla měření provedena i na senzoru TRB-BTA. Míra zákalu byla na obou přístrojích měřena v úhlu 90° od dopadajícího paprsku. Vyhodnocení bylo provedeno pomocí metody kalibrační křivky a přídavku standardu. Jako vzorky byly využity pitné a minerální vody: 

pitná voda z Univerzitního kampusu Bohunice (pitná voda (kampus))



pitná voda z domu v Novém Lískovci (pitná voda (N. Lískovec))



Ondrášovka, jablko a višňový květ, neperlivá, Olomoucko, Česká republika



Korunní, tonic, perlivá, Karlovarsko, Česká republika



Mattoni, active citrón, neperlivá, Karlovarsko, Česká republika



Bílinská kyselka, perlivá, okres Teplice, Česká republika



Vincentka, Luhačovice, Česká republika



Vittel, neperlivá, Vosges, Francie



Perrier, perlivá, Vergèze, Francie



Acqua Panna, neperlivá, Toskánsko, Itálie



San Pellegrino, jemně perlivá, Lombardie, Itálie

3.3.1 Metoda kalibrační křivky Pro sestrojení kalibrační závislosti bylo využito roztoku o koncentraci 100 mg∙l-1 Cl-. Byla připravena sada kalibračních roztoků postupným pipetováním 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 a 3,0 ml připraveného roztoku Cl- do Erlenmeyerových baněk o objemu 50 ml. Do každé baňky byla poté přidána destilovaná voda tak, aby výsledný objem byl 10 ml.

26

Následně bylo potřeba připravit srážecí roztok. Ten byl připraven do 250 ml odměrné baňky odměřením 100 ml 1% AgNO3, přidáním 12,5 ml 1M HNO3 a doplněním po rysku destilovanou vodou. Ke každému kalibračnímu roztoku bylo přidáno 10 ml srážecího roztoku. Vzorky byly připraveny pipetováním 2,5 ml analyzované vody do Erlenmeyerovy baňky, doplněním destilovanou vodou na 10 ml a přidáním 10 ml srážecího roztoku. U nefelometrických i turbidimetrických měření hraje velmi důležitou roli faktor času. Protože se s časem mění míra a barva zákalu, je důležité dodržovat dobu stání a následného měření jednotlivých roztoků. Proto bylo nejprve zjištěno, jaká doba je pro měření chloridů optimální. Na obrázku č. 8 lze vidět vývoj míry zákalu v čase pro pátý kalibrační roztok. Změna byla měřena na fotometru MN PF-12Plus. Pro následující měření byla vybrána jako ideální doba 15 minut, jelikož po delším stání roztoky začaly černat, což by mohlo negativně ovlivnit výsledky stanovení. Po uplynutí této doby byly roztoky přelity do kyvety a byla změřena míra zákalu. 200

zákal (NTU)

160 120 80 40 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

čas (min) Obrázek 8 Znázornění změny zákalu v čase

1. Měření na fotometru MN PF-12Plus Fotometr MN PF-12Plus je uzpůsoben pro měření nefelometrického zákalu, využívá LED lampu s vlnovou délkou 860 nm. Na fotometru byly proměřeny všechny vzorky zmíněné výše. U prvních pěti vzorků bylo provedeno 10 měření, u dalších šesti 5. Na obrázku č. 9 je znázorněna kalibrační přímka získaná měřením roztoků kalibrační sady, v tabulce II jsou uvedeny její parametry. Každý kalibrační roztok byl změřen třikrát.

27

Pro testování významnosti úseku byl použit vzorec 𝑡𝑎 =

|𝑎| 𝑠𝑎

. Hodnota 𝑡𝑎 se

porovnává s kritickou hodnotou Studentova rozdělení 𝑡𝛼 (𝜈), kde α vyjadřuje zvolenou 2

hladinu významnosti a ν představuje počet stupňů volnosti, kde 𝜈 = 𝑛 − 2 . [23] Jestliže je 𝑡𝑎 menší než příslušná kritická hodnota, lze považovat úsek za statisticky nevýznamný a pro další vyhodnocování je použita přímka o rovnici y = bx. V tomto případě je úsek statisticky významný, jelikož 𝑡𝑎 = 4,46 a 𝑡𝛼 (19) = 2,09, tedy 𝑡𝑎 > 𝑡𝛼 (19). 2

2

Protože některé experimentálně získané koncentrace se značně liší od teoretických, bylo ještě provedeno měření a vyhodnocení pomocí metody přídavku standardu. Dále bylo zkoumáno, zda srážecí roztok reaguje s jinými anionty (Br-, I- a F-), které mohou stanovení chloridů ovlivňovat. Při reakci bromidových (taktéž i jodidových) aniontů se srážecím roztokem byla zjištěna vyšší hodnota zákalu než při reakci s chloridy, fluoridové anionty se srážecím roztokem poskytovaly oproti chloridům nízké hodnoty zákalu. U bromidů vznikl bílý zákal, u jodidů světle žlutý, fluoridy téměř žádný zákal neposkytovaly. Tedy stanovení chloridů může ovlivňovat přítomnost bromidových, jodidových a v malé míře i fluoridových aniontů. 140 120

zákal (NTU)

100 80 y = 8,59x + 9,14 R² = 0,9869

60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

koncentrace Cl- (mg∙l-1) Obrázek 9 Kalibrační přímka stanovení Cl- na fotometru MN PF-12Plus Tabulka II Parametry kalibrační přímky stanovení Cl- na fotometru Směrnice b 8,59 Úsek a

9,14

Směrodatná odchylka směrnice sb

0,23

Směrodatná odchylka úseku sa

2,1

Směrodatná odchylka sy,x

5,2

28

Interval spolehlivosti pro a

(9,1 ± 4,3)

Interval spolehlivosti pro b

(8,59 ± 0,48)

2. Měření na senzoru zákalu TRB-BTA Na tomto přístroji byly změřeny pouze 4 vybrané vzorky: pitná voda (N. Lískovec), Mattoni, Korunní a Ondrášovka. Pro sadu kalibračních roztoků byla získána kalibrační přímka, jež je zobrazena na obrázku č. 10. Body byly proloženy přímkou obecnou i přímkou procházející počátkem, jejich parametry jsou uvedeny v tabulce III. 350

zákal (NTU)

300 250 200 150

y = 17,68x + 28,34 R² = 0,9514

100 50 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

koncentrace Cl- (mg∙l-1) Obrázek 10 Kalibrační přímka (obecná) stanovení Cl- na přístroji TRB-BTA Tabulka III Parametry kalibrační přímky, obecné i procházející počátkem, stanovení Clna přístroji TRB-BTA přímka obecná přímka procházející počátkem Směrnice b

17,68

20,30

Úsek a

28,34

-

Směrodatná odchylka směrnice sb

1,8

1,2

Směrodatná odchylka úseku sa

16

-

Směrodatná odchylka sy,x

24

27

Interval spolehlivosti pro a

(28 ± 41)

-

Interval spolehlivosti pro b

(17,7 ± 4,6)

(20,3 ± 2,8)

Byl proveden test významnosti úseku, ve kterém 𝑡𝑎 = 1,76 a 𝑡𝛼 (5) = 2,57, tedy 2

𝑡𝑎 < 𝑡𝛼 (5). Z tohoto důvodu, ale také proto, že naměřené hodnoty zákalu pro vzorky byly 2

29

příliš malé a výsledné koncentrace chloridů by byly záporné, byla použita přímka procházející počátkem. 350 300

zákal (NTU)

250 200 150 y = 20,30x R² = 0,9213

100 50 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

koncentrace Cl- (mg∙l-1) Obrázek 11 Kalibrační přímka (procházející počátkem) stanovení Cl- na přístroji TRBBTA

Z naměřených hodnot zákalu jednotlivých vzorků pitné vody (N. Lískovec), Mattoni, Korunní a Ondrášovky byl vypočítán obsah chloridových aniontů. Jednotlivé experimentálně získané koncentrace spolu s teoretickým obsahem jsou uvedeny v tabulce IV. Tabulka IV Experimentálně získané a teoretické hodnoty koncentrace Cl- ve vzorcích vod experimentální hodnota, vzorek

-1

teoretická hodnota,

c (mg∙l )

c (mg∙l-1)

Pitná voda (N. Lískovec)

14,5

do 50,0

Mattoni

1,2

12,0

Korunní

2,9

6,0

Ondrášovka

3,3

10,8

Experimentálně získané koncentrace chloridů ve vzorcích se neblížily teoretickým hodnotám, které udává výrobce. Koncentrace získané měřením na fotometru byly výrazně přesnější

3.3.2 Metoda přídavku standardu Metoda přídavku standardu s doplňováním na konstantní objem byla prováděna pouze na fotometru MN PF-12Plus. Každý vzorek byl nejprve v kádince vložen na 5 minut do ultrazvukové lázně, aby došlo k odplynění. Mezitím bylo připraveno 6 30

Erlenmeyerových baněk o objemu 50 ml, do kterých byly později roztoky připravovány. Jako standardní roztok byl použit roztok NaCl o koncentraci 100 mg∙l-1 Cl-, srážecí roztok byl tentýž jako u metody kalibrační křivky. Obecný postup pro všechny vzorky byl následující. Do baněk bylo pipetováno určité množství vzorku, k němu byl přidán roztok standardu, destilovaná voda a na závěr srážecí roztok. Směs byla vždy promíchána, ponechána 15 minut při laboratorní teplotě a následně proměřena. Pipetovaná množství vzorků, roztoku standardu, destilované vody a srážecího roztoku u přípravy jednotlivých roztoků vzorků jsou uvedeny v tabulkách V až X. Vzorky Bílinská kyselka a San Pellegrino byly ještě před vložením do ultrazvukové lázně 10 krát dohromady zředěny, Vincentka byla před odplyněním 200 krát dohromady zředěna. Tabulka V Objemy pro míchání roztoků vzorku pitné vody (N. Lískovec), pitné vody (kampus) a Perrier č. roztoku 1 2 3 4 5 6 objem vzorku (ml)

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

objem roztoku NaCl (ml)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

objem dest. vody (ml)

3,75

3,25

2,75

2,25

1,75

1,25

objem srážecího roztoku (ml)

5,00

5,00

5,00

5,00

5,00

5,00

Tabulka VI Objemy pro míchání roztoků vzorku Ondrášovky a Mattoni č. roztoku 1 2 3 4 5

6

objem vzorku (ml)

3,00

3,00

3,00

3,00

3,00

3,00

objem roztoku NaCl (ml)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

objem dest. vody (ml)

2,00

1,75

1,50

1,25

1,00

0,75

objem srážecího roztoku (ml)

5,00

5,00

5,00

5,00

5,00

5,00

Jelikož u vzorku Ondrášovky byla poslední naměřená hodnota příliš vysoká a ovlivňovala by konečný výsledek, byla vyloučena a kalibrační přímka byla sestavena pouze z prvních 5 získaných hodnot. U vzorku Mattoni se nepodařilo získat hodnoty, které by po proložení přímkou vytvořily jasnou lineární funkci. Problémem mohlo být, že v samotném vzorku plavaly hnědé kousky. Proto byl vzorek krátce povařen, avšak ani tak nebyly získány lepší hodnoty. Z tohoto důvodu je pravděpodobně získaná koncentrace značně nepřesná.

31

č. roztoku

Tabulka VII Objemy pro míchání roztoků vzorku Korunní 1 2 3 4 5

6

objem vzorku (ml)

2,50

2,50

2,50

2,50

2,50

2,50

objem roztoku NaCl (ml)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

objem dest. vody (ml)

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00

objem srážecího roztoku (ml)

5,00

5,00

5,00

5,00

5,00

5,00

Tabulka VIII Objemy pro míchání roztoků vzorku Bílinské kyselky č. roztoku 1 2 3 4 5

6

objem vzorku (ml)

1,50

1,50

1,50

1,50

1,50

1,50

objem roztoku NaCl (ml)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

objem dest. vody (ml)

3,50

3,25

3,00

2,75

2,50

2,25

objem srážecího roztoku (ml)

5,00

5,00

5,00

5,00

5,00

5,00

Tabulka IX Objemy pro míchání roztoků vzorku Vincentky a Acqua Panny č. roztoku 1 2 3 4 5 6 objem vzorku (ml)

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

objem roztoku NaCl (ml)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

objem dest. vody (ml)

1,25

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00

objem srážecího roztoku (ml)

2,50

2,50

2,50

2,50

2,50

2,50

Tabulka X Objemy pro míchání roztoků vzorku Vittel a San Pellegrina č. roztoku 1 2 3 4 5

6

objem vzorku (ml)

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

objem roztoku NaCl (ml)

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

objem dest. vody (ml)

1,25

1,15

1,05

0,95

0,85

0,75

objem srážecího roztoku (ml)

2,50

2,50

2,50

2,50

2,50

2,50

32

400 350

zákal (NTU)

300 250 200 y = 46 075,39x + 57,83 R² = 0,9914

150 100 50

-0,002

0 -0,001 -50 0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

látkové množství Cl- (mmol) Obrázek 12 Metoda přídavku standardu – pitná voda (N. Lískovec)

Na obrázku č. 12 lze vidět graf získaný pro vzorek pitné vody (N. Lískovec). Ostatní grafy jsou zařazeny do přílohy. V tabulce XI jsou uvedeny experimentálně získané koncentrace Cl- pro jednotlivé vzorky vyhodnocené metodou kalibrační křivky a také metodou přídavku standardu, pro srovnání jsou uvedeny i teoretické hodnoty. V tabulce XII a XIII je pak statistické vyhodnocení výsledků získaných metodou kalibrační křivky a metodou přídavku standardu. Tabulka XI Experimentálně zjištěné koncentrace Cl- ve vzorcích vod na fotometru, vyhodnocené metodou kalibrační křivky i přídavku standardu metoda kalibrační metoda přídavku teoretická hodnota, vzorek křivky, c (mg∙l-1) standardu, c (mg∙l-1) c (mg∙l-1) pitná voda (N.

39,1

35,6

do 50,01

51,8

53,1

do 50,0

Mattoni

4,8

20,2

12,0

Korunní

6,8

5,5

6,0

Ondrášovka

11,0

10,3

10,8

Perrier

28,7

30,2

25,0

Acqua Panna

13,5

8,7

9,0

Vittel

4,9

3,9

4,0

San Pellegrino

108,6

57,7

54,8

Bílinská kyselka

513,5

184,1

224,0

Lískovec) pitná voda (kampus)

33

Vincentka 1

618,6

2034,0

1761,0

Hodnota je udána pro velmi čistou vodu, mezní hodnota je 100 mg∙l-1. Tabulka XII Statistické vyhodnocení výsledků stanovení Cl- (metoda kalibrační křivky) průměrná směrodatná relativní interval hodnota

odchylka

směrodatná

spolehlivosti

(mg∙l-1)

(mg∙l-1)

odchylka (%)

(mg∙l-1)

39,1

1,9

5,0

(39,1 ± 4,1)

51,8

1,9

3,6

(51,8 ± 3,9)

Mattoni

4,8

2,4

49

(4,8 ± 5,0)

Korunní

6,8

2,3

35

(6,8 ± 4,9)

Ondrášovka

11,0

2,3

21

(11,0 ± 4,8)

Perrier

28,7

2,6

8,9

(28,7 ± 5,3)

Acqua Panna

13,5

2,7

20

(13,5 ± 5,7)

Vittel

4,9

0,66

13

(4,9 ± 1,4)

San Pellegrino

108,6

2,7

2,5

(108,6 ± 5,7)

Bílinská kyselka

513,5

11

2,2

(513 ± 24)

Vincentka

618,6

82

13

(62 ± 17)∙101

vzorek pitná voda (N. Lískovec) pitná voda (kampus)

Tabulka XIII Statistické vyhodnocení výsledků stanovení Cl- (metoda přídavku standardu) průměrná směrodatná relativní interval vzorek

hodnota -1

odchylka

směrodatná

spolehlivosti

(mg∙l )

(mg∙l )

odchylka (%)

(mg∙l-1)

35,6

5,2

15

(36 ± 11)

53,1

11

20

(53 ± 22)

Mattoni

20,2

5,7

28

(20 ± 12)

Korunní

5,5

1,1

19

(5,5 ± 2,2)

Ondrášovka

10,3

1,7

17

(10,3 ± 3,7)

Perrier

30,2

5,8

19

(30 ± 12)

Acqua Panna

8,7

1,3

15

(8,7 ± 2,7)

Vittel

3,9

0,85

22

(3,9 ± 1,8)

pitná voda (N. Lískovec) pitná voda (kampus)

-1

34

San Pellegrino

57,7

4,2

7,3

(57,8 ± 9,0)

Bílinská kyselka

184,1

4,4

2,4

(184,1 ± 9,3)

Vincentka

2034,0

55∙101

27

(20 ± 12)∙102

Tabulka XIV Porovnání koncentrací Cl- ve vzorcích, zjištěných měřením na fotometru MN PF-12Plus a senzoru TRB-BTA, vyhodnocených metodou kalibrační křivky MN PF-12Plus, senzor TRB-BTA, teoretická hodnota, vzorek c (mg∙l-1) c (mg∙l-1) c (mg∙l-1) pitná voda (N. Lískovec)

39,1

14,5

do 50,0

Mattoni

4,8

1,2

12,0

Korunní

6,8

2,9

6,0

Ondrášovka

11,0

3,3

10,8

Z tabulky XIV, ve které jsou uvedeny zjištěné koncentrace Cl- ve vzorcích vod na novém fotometru i na senzoru, lze vyvodit, že pomocí fotometru MN PF-12Plus byly získány výrazně přesnější výsledky. Proto bych pro další měření doporučovala fotometr a vyhodnocení výsledků metodou přídavku standardu, jelikož je eliminován vliv matrice.

3.4 Stanovení síranů nefelometricky Principem nefelometrického stanovení síranů je reakce chloridu barnatého se síranovými anionty za vzniku bílé sraženiny BaSO4. Stejně jako u chloridů i zde lze pozorovat mléčný zákal. Ba2+ + SO42- → ↓ BaSO4 Měření bylo provedeno pouze na fotometru MN PF-12Plus. Koncentrace síranů byla stanovena ve stejných vzorcích vod jako chloridy a byla stanovována pouze metodou kalibrační křivky, protože experimentálně zjištěné koncentrace síranových aniontů přibližně odpovídaly teoretickým hodnotám udávaným na obalech lahve.

3.4.1 Metoda kalibrační křivky Navážením potřebného množství K2SO4 byl nejprve připraven zásobní roztok o koncentraci 1 g∙l-1 SO42-. Na přípravu 100 ml roztoku bylo naváženo 0,1814 g K2SO4. Toto množství bylo kvantitativně převedeno do odměrné baňky, rozpuštěno v destilované vodě a baňka byla doplněna po rysku destilovanou vodou.

35

Následně bylo potřeba připravit 1M HCl a 1% roztok BaCl2. 1M HCl byla připravena odměřením 15,5 ml 35% HCl do odměrné baňky o objemu 500 ml. Poté byla baňka doplněna po rysku destilovanou vodou. Roztok BaCl2 byl připraven navážením 1,0000 g BaCl2 ∙ 2H2O do odměrné baňky o objemu 100 ml a doplněním destilovanou vodou po rysku. V dalším kroku byla připravena sada kalibračních roztoků o koncentraci 0, 20, 40, 60, 80 a 100 mg∙l-1 SO42-. Do odměrných baněk o objemu 50 ml byl pipetován předem vypočtený objem zásobního roztoku, ke každému roztoku bylo přidáno 5 ml 1M HCl a baňky byly doplněny po rysku destilovanou vodou. Před samotným měřením byly také předpřipraveny vzorky vod. Každý vzorek vody byl nejprve vložen v kádince na 5 minut do ultrazvukové lázně, aby došlo k jeho odplynění. Do odměrných baněk o objemu 50 ml se poté pipetovalo vždy 40 ml vzorku minerálky (některé byly předem ještě zředěny) či 20 ml vzorku pitné vody. Ke vzorkům bylo přidáno 5 ml 1M HCl a všechny baňky byly následně doplněny destilovanou vodou po rysku. Na závěr byly připravené roztoky pečlivě promíchány. Při měření kalibračních roztoků se postupovalo následujícím způsobem. Na magnetickou míchačku byla umístěna Erlenmeyerova baňka o objemu 50 ml a do ní bylo vloženo míchadélko. Do baňky pak byly postupně pipetovány 2 ml roztoku BaCl 2 jako srážedla, 8 ml destilované vody a nakonec 10 ml roztoku z kalibrační sady. Stejně se postupovalo u měření roztoků vzorků, pouze místo 10 ml kalibračního roztoku bylo pipetováno 10 ml připraveného roztoku vzorku. Před vlastním proměřením roztoků byl opět zjištěn optimální čas pro jejich měření. Na obrázku č. 13 lze vidět vývoj zákalu v čase pro jednotlivé kalibrační roztoky, měřené po dvou minutách. Naměřené hodnoty zákalu se s časem prakticky neměnily, proto byla za účelem zkrácení analýzy vybrána doba pro změření signálu 2 minuty od smíchání roztoků.

36

200 160

zákal (NTU)

K1 120

K2 K3

80

K4 K5

40 0 0

2

4

6

8

10

12

čas (min) Obrázek 13 Vývoj zákalu v čase pro jednotlivé kalibrační roztoky

Směs tedy byla 2 minuty míchána na míchačce, ihned poté byla přelita do kyvety a byl změřen signál. Každý kalibrační roztok byl změřen třikrát. Na obrázku č. 14 je znázorněna kalibrační přímka, v tabulce XV jsou uvedeny její parametry. 180 160

zákal (NTU)

140 120 100

y = 1,74x + 6,33 R² = 0,9824

80 60 40 20 0 0

20

40

60

80

100

koncentrace SO42- (mg∙l-1) Obrázek 14 Kalibrační přímka stanovení SO42- na fotometru MN PF-12Plus Tabulka XV Parametry kalibrační přímky, obecné i procházející počátkem, stanovení SO42přímka obecná přímka procházející počátkem Směrnice b

1,74

1,83

Úsek a

6,33

-

Směrodatná odchylka směrnice sb

0,058

0,035

37

Směrodatná odchylka úseku sa

3,5

-

Směrodatná odchylka sy,x

8,5

9,0

Interval spolehlivosti pro a

(6,3 ± 7,5)

-

Interval spolehlivosti pro b

(1,74 ± 0,12)

(1,830 ± 0,074)

Při testování významnosti úseku a bylo zjištěno, že 𝑡𝑎 = 1,79 a 𝑡𝛼 (16) = 2,12, 2

tedy 𝑡𝑎 < 𝑡𝛼 (16). Úsek není statisticky významný. Pro výpočet koncentrace SO42- je 2

však zachován klasický tvar y = a + bx, protože zde nebyl problém s nízkými hodnotami zákalu jako u chloridů. Experimentálně stanovené koncentrace síranových aniontů jsou uvedeny v tabulce XVI, kde je také uveden teoretický obsah. V tabulce XVII je uvedeno statistické vyhodnocení výsledků stanovení SO42- jednotlivých vzorků vod. Tabulka XVI Porovnání experimentálně zjištěných a teoretických hodnot koncentrací SO42- ve vzorcích vod experimentální hodnota, teoretická hodnota, vzorek -1 c (mg∙l ) c (mg∙l-1) pitná voda (N.

41,1

do 80,02

53,0

do 80,0

Mattoni

32,7

40,0

Korunní

46,7

48,4

Ondrášovka

10,1

10,6

Perrier

48,5

46,1

Acqua Panna

26,9

22,7

Vittel

143,0

120,0

San Pellegrino

528,2

445,0

Bílinská kyselka

535,4

568,0

0,0

neudána

Lískovec) pitná voda (kampus)

Vincentka 2

Hodnota je udána pro velmi čistou vodu, mezní hodnota je 250 mg∙l-1.

38

Tabulka XVII Statistické vyhodnocení výsledků stanovení SO42- ve vzorcích vod průměrná směrodatná relativní interval vzorek

hodnota

odchylka

-1

směrodatná

spolehlivosti

(mg∙l )

(mg∙l )

odchylka (%)

(mg∙l-1)

41,1

2,1

5,2

(41,1 ± 1,5)

53,0

2,9

5,4

(53,0 ± 2,0)

Mattoni

32,7

1,9

5,8

(32,7 ± 1,4)

Korunní

46,7

2,8

5,9

(46,7 ± 2,0)

Ondrášovka

10,1

1,3

13

(10,09 ± 0,91)

Perrier

48,5

2,8

5,7

(48,5 ± 3,3)

Acqua Panna

26,9

1,2

4,6

(26,9 ± 1,5)

Vittel

143,0

9,9

6,9

(143 ± 12)

San Pellegrino

528,2

59

11

(528 ± 69)

535,4

34

6,3

(535 ± 40)

0,0

-

-

-

pitná voda (N. Lískovec) pitná voda (kampus)

Bílinská kyselka Vincentka

-1

3.5 Stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) imunoturbidimetricky Imunoturbidimetrická stanovení proteinů jsou v současné době hojně využívána v lékařství při vyšetřování pacientů. CRP je protein, který se tvoří v játrech a řadíme ho do skupiny bílkovin akutní fáze. [4] V krvi se objevuje ve zvýšené koncentraci během zánětlivých procesů. Jeho stanovení se tedy u pacientů provádí například ke zjištění infekčního a revmatologického onemocnění. Zvýšená koncentrace předpovídá i riziko infarktu myokardu, vyšší obsah byl prokázán také u pacientů mající diabetes mellitus [24], či u pacientů s obezitou. [4] Stanovení koncentrace CRP v krvi lze využít pro zjištění, zda je vhodné nasadit pacientovi antibiotika. [5] U zdravého člověka by měla být koncentrace CRP v intervalu 0−5 mg∙l-1. [5] Principem stanovení CRP je reakce vzorku (lidského séra) se specifickou protilátkou proti lidskému CRP. CRP + protilátka → ↓[CRP-protilátka] 39

Vzniklý imunokomplex způsobuje zakalení, které je měřeno při vlnové délce 340 nm. Ke vzorku CRP se nejprve přidává pufr, jehož složení je uvedeno v tabulce XVIII, a poté protilátka. Složení protilátky je uvedeno v tabulce XIX. Tabulka XVIII Složení pufru přidávaného ke vzorku CRP látka koncentrace fosfátový pufr pH 7,4 polyethylenglykol (PEG) chlorid sodný

35 mmol∙l-1 45 g∙l-1 150 mmol∙l-1

azid sodný

0,95 g∙l-1 Tabulka XIX Složení protilátky přidávané ke vzorku CRP látka koncentrace

fosfátový pufr pH 7,4

35 mmol∙l-1

kozí antisérum proti lidskému CRP

variabilní

azid sodný

0,95 g∙l-1

Měření bylo provedeno na spektrofotometru Lightwave II, WPA. K vyhodnocení výsledků byla použita metoda kalibrační křivky.

3.5.1 Metoda kalibrační křivky Pomocí CRP Calibratoru, což je roztok lidského séra s vyšším obsahem CRP, byly nejprve připraveny kalibrační roztoky. Do první ze 7 předem připravených mikrozkumavek bylo pipetováno 200 μl CRP Calibratoru. Do následujících 6 bylo pipetováno 200 μl 0,09% roztoku NaCl. Do druhé mikrozkumavky bylo k roztoku NaCl přidáno 200 μl CRP Calibratoru a směs byla důkladně promíchána. Před promícháním bylo vždy velmi důležité vyměnit špičku od automatické pipety. Z této směsi bylo odebráno 200 μl a přidáno k roztoku NaCl do následující mikrozkumavky, kde se vše opět řádně promíchalo. Stejným způsobem se postupovalo až do přípravy roztoku v předposlední mikrozkumavky. V poslední zkumavce zůstal pouze roztok NaCl (blank). Tak byla vytvořena kalibrační sada o koncentracích 100 %; 50 %; 25 %; 12,5 %; 6,25 % a 3,125 % CRP. Při samotném měření se postupovalo následujícím způsobem. Do suchých mikrozkumavek se napipetoval 1 ml reakčního činidla 1 (pufr) a k němu se přidalo 80 μl blanku (resp. standardu, vzorku). Směs se pečlivě promíchala a v mikrozkumavce vložila 40

na 5 minut do termostatu nastaveného na 37 °C. Po uplynutí 5 minut se směs přelila do kyvety a při 340 nm byla změřena první absorbance. Poté se směs opět přelila do mikrozkumavky, přidalo se k ní 250 μl reakčního činidla 2 (protilátka), vše se pečlivě promíchalo a v mikrozkumavce se směs opět nechala 5 minut temperovat na teplotu 37 °C. Následně byla v kyvetě proměřena druhá absorbance. Výsledná absorbance se získala odečtem první absorbance od druhé. Stejným postupem se změřily absorbance roztoků standardu i vzorků. Jako vzorek posloužil Protein control level 1 a Protein control level 2 (roztoky lidského plazmatu). Turbidimetricky získaná kalibrační křivka je zobrazena na obrázku č. 15 a její parametry jsou uvedeny v tabulce XX. Experimentálně stanovené koncentrace CRP u vzorků jsou spolu s teoretickou hodnotou a výrobcem udávaným intervalem uvedeny v tabulce XXI. Teoretické koncentrace byly stanoveny v profesionálním laboratorním prostředí na speciálních přístrojích ERBA XL. 1,4 1,2

absorbance

1,0 0,8 0,6

y = 0,0074x - 0,0310 R² = 0,9990

0,4 0,2 0,0 0

50

100

150

200

koncentrace CRP (mg∙l-1) Obrázek 15 Kalibrační přímka stanovení koncentrace CRP turbidimetricky

Směrnice b

Tabulka XX Parametry kalibrační přímky stanovení CRP 0,0074

Úsek a

− 0,0310

Směrodatná odchylka směrnice sb

11∙10-5

Směrodatná odchylka úseku sa

92∙10-4

Směrodatná odchylka sy,x

16∙10-3

Interval spolehlivosti pro a

(− 0,031 ± 0,025)

Interval spolehlivosti pro b

(0,00736 ± 0,00032)

41

Tabulka XXI Porovnání experimentálních a teoretických koncentrací CRP u vzorků experimentální hodnota teoretická hodnota interval vzorek (mg∙l-1) (mg∙l-1) (mg∙l-1) Protein control level 1 Protein control level 2

24,2

18,6

15,6–21,6

40,6

41,8

35,5–48,1

Experimentálně stanovená koncentrace CRP u prvního vzorku je vyšší a nenachází se ani v intervalu, který udává výrobce. Měření však bylo z důvodu malého množství vzorku provedeno pouze jednou.

3.6 Stanovení C-reaktivního proteinu imunonefelometricky Nefelometrické měření bylo prováděno na fotometru MN PF-12Plus téměř stejným způsobem jako u imunoturbidimetrie. Problémem bylo, že souprava Calibratoru, činidel a vzorků byla dodána pro imunoturbidimetrické měření a ve velmi malém množství. Pro nefelometrická měření však fotometr vyžaduje větší množství roztoku v kyvetě, než s kterým se pracovalo při imunoturbidimetrii. Proto bylo nejprve do kádinky pipetováno 3,7 ml 0,09% roztoku NaCl a k tomuto roztoku se přidávalo stejné množství činidel a standardu jako u imunoturbidimetrie. Dalším rozdílem bylo temperování směsi. Samotná směs se musela temperovat ve vodní lázni, jelikož u turbidimetrie využívaný minitermostat TK-1 je stavěný pouze na mikrozkumavky a není možné v něm temperovat větší objem roztoku. Nefelometricky byly proměřeny pouze roztoky kalibrační sady, naměřené signály lze vidět na obrázku č. 16.

42

30

zákal (NTU)

25 20 15 10 5 0 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

koncentrace CRP (mg∙l-1) Obrázek 16 Nefelometricky naměřené signály kalibračních roztoků

Signály prvních čtyř kalibračních roztoků byly blízké, jejich hodnota se postupně nezvyšovala, jak by měla. Příčinou bylo pravděpodobně přílišné zředění roztoků a tedy jejich velmi nízká koncentrace. Ředění zde však bylo nutné z důvodu nutnosti většího množství roztoku v kyvetě. Proto nebyly ani vzorky Protein control level 1 a Protein control level 2 změřeny. S dodaným množstvím roztoku CRP Calibrator, činidel, Protein control level 1 a Protein control level 2 nebylo možné analýzu plně uskutečnit. Fotometr MN PF-12Plus vyžadující podstatně větší objem roztoku v měřicí kyvetě není vhodný pro toto stanovení. Pro nefelometrické stanovení CRP by byly vhodné přístroje ne tak náročné na objem roztoku v kyvetě. V laboratoři tato možnost bohužel není. Stanovení CRP se běžně provádí na klinických analyzátorech, např. systémy XL-200, XL-640.

43

4 Závěr V této bakalářské práci byl vyvinut postup pro nefelometrické stanovení chloridových a síranových aniontů ve vzorcích pitných a minerálních vod na fotometru MN PF-12Plus. Stanovení chloridů může ovlivňovat přítomnost bromidů, jodidů a v malé míře i fluoridů, proto je pro ně vhodné vyhodnocení metodou přídavku standardu. Stanovení síranů by neměly ovlivňovat žádné další látky, proto pro vyhodnocení postačuje metoda kalibrační křivky. Chloridové a síranové anionty byly stanoveny v 11 vzorcích vod. Experimentálně získané hodnoty koncentrací se téměř ve všech případech signifikantně nelišily od teoretických koncentrací, které udávají výrobci na obalech lahví. Dále byl testován postup pro imunoturbidimetrické a imunonefelometrické stanovení C-reaktivního proteinu. Imunoturbidimetricky byl stanoven obsah Creaktivního proteinu ve vzorcích Protein control level 1 a Protein control level 2, což jsou roztoky lidského plazmatu. Nefelometricky nebyly vzorky změřeny, jelikož dodané množství činidel a vzorků nebylo pro měření na fotometru dostačující. V budoucnu lze tuto metodu otestovat na speciálním klinickém analyzátoru, systému XL. Byly také vytvořeny úlohy pro praktikum z analytické chemie na nefelometrické stanovení chloridů a síranů ve vodách a imunoturbidimetrické stanovení C-reaktivního proteinu ve vzorcích Protein control level. Pro tyto úlohy byl sepsán návod.

44

5 Bibliografie [1] LAWLER, Damian. SPECTROPHOTOMETRY | Turbidimetry and Nephelometry. Encyclopedia of Analytical Science. Elsevier, 2005, 343-351 p. DOI: 10.1016/B012-369397-7/00718-4. ISBN 9780123693976. [2] SOMMER, Lumír. Základy analytické chemie II. Vyd. 1. Brno: VUTIUM, 2000, 347 s. ISBN 80-214-1742-0. [3] VONDRÁK, Dalibor a Jaroslav VULTERIN. Analytická chemie. 1. vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1985, 262 s. [4] YUDKIN, John, Coen STEHOUWER, Jef EMEIS a Simon COPPACK. C-Reactive Protein in Healthy Subjects: Associations With Obesity, Insulin Resistance, and Endothelial Dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 1999, 19(4), 972-978 p. DOI: 10.1161/01.ATV.19.4.972. ISSN 1079-5642. [5] GRøNN, M., S. SLøRDAHL, S. SKREDE a S. LIE. C-reactive protein as an indicator of infection in the immunosuppressed child. European Journal of Pediatrics. 1986, 145(1-2), 18-21 p. DOI: 10.1007/BF00441846. ISSN 0340-6199. [6] KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. Druhé, upravené a doplněné vydání. Ostrava: Pavel Klouda, 700 30 Ostrava, Hýlova 2, 2003, 132 s. ISBN 80-86369-072. [7] SKOOG, Douglas a Donald WEST. Principles of Instrumental Analysis. 2nd ed. Philadelphia: Saunders College, 1980, 769 p. ISBN 4-8337-0003-4. [8] ROUESSAC, Francis a Annick ROUESSAC. Chemical analysis: modern instrumentation methods and techniques. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley, 2007, xxiii, 574 p. ISBN 978-0-470-85903-2. [9] HOUSECROFT, Catherine a Edwin CONSTABLE. Chemistry: An introduction to organic, inorganic and physical chemistry. 3rd ed. Harlow: Pearson Education Limited, 2006, xxix, 1285 s. ISBN 01-312-7567-4. [10] SOMMER, Lumír. Analytická spektrometrie I. 1. vyd. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1986, 173 s. [11] ČAKRT, Miroslav. Praktikum z analytickej chémie. 1. vyd. Bratislava: Alfa, 1989, 644 s. Edicía chemickej literatúry. ISBN 80-050-0112-6.

45

[12] BENEŠ, Jiří, Jaroslava KYMPLOVÁ a František VÍTEK. Základy fyziky pro lékařské a zdravotnické obory: pro studium i praxi. 1. vyd. Praha: Grada, 2015, 224 s., [4] s. obr. příl. ISBN 978-80-247-4712-5. [13] ISO Online Browsing Platform (OBP) [online]. b.r. [cit. 2016-04-05]. Dostupné z: https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:7027:ed-3:v1:en [14] SADAR, Mike. Turbidity Measurement: A Simple, Effective Indicator of Water Quality Change. In: http://www.ott.com/ [online]. b.r. [cit. 2016-04-12]. Dostupné z: http://www.ott.com/download/turbidity-white-paper/ [15] KOLTHOFF, Izaak a Henry YUTZY. The Nephelometric Determination of Chloride. Journal of the American Chemical Society. 1933, 55(5), 1915-1922 p. DOI: 10.1021/ja01332a019. ISSN 0002-7863. [16] KOLTHOFF, Izaak (ed.) a Philip ELVING (ed.). Treatise on analytical chemistry. New York: Interscience encyclopedia, 1964, Part I, vol. 5, Chapter 63. [17] HAVEN, Mary, Gregory TETRAULT a Jerald SCHENKEN. Laboratory instrumentation. 4th ed. New York: Van Nostrand Reinhold, 1995, xix, 492 p. ISBN 04-420-1520-8. [18] CHROMÝ, Vratislav. Bioanalytika: analytické metody v klinické chemii a laboratorní medicíně. 2., přeprac. a dopl. vyd. Brno: Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Ústav chemie, 2011, 331 s. ISBN 978-80-904539-3-7. [19] STANLEY, Jacqueline. Essentials of immunology serology. Albany, NY: Delmar Thomson Learning, 2002, xxi, 538 p. ISBN 07-668-1064-X. [20] BURNETT, David a John CROCKER. The science of laboratory diagnosis. 2nd ed. Hoboken, NJ: Wiley, 2005, xxi, 542 p. ISBN 04-708-5912-1. [21] JANČÁŘOVÁ, Irena a Luděk JANČÁŘ. Analytická chemie. První vydání. Brno: Mendelova univerzita v Brně, 2003, 195 s. ISBN 978-80-7157-647-1. [22] PLŠKO, Eduard. Všeobecná analytická chémia. 1. vyd. Český Těšín: 2 Theta, 2011, 193 s. ISBN 978-80-86380-61-2. [23] ECKSCHLAGER, Karel, Zdeněk KODEJŠ a Ivan HORSÁK. Vyhodnocování analytických výsledků a metod. 1. vyd. Praha: SNTL, 1980, 223 s. Česká matice technická (SNTL).

46

[24] PRADHAN, Aruna. C-Reactive Protein, Interleukin 6, and Risk of Developing Type 2 Diabetes Mellitus. The Journal of the American Medical Association. 2001, 286(3), 327-334 p. DOI: 10.1001/jama.286.3.327. ISSN 0098-7484.

47

6 Příloha 6.1 Grafy 350 300

zákal (NTU)

250 200 y = 36 047,26x + 67,46 R² = 0,9689

150 100 50

-0,003

0 -0,001 -50

0,001

0,003

0,005

0,007

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 1 Metoda přídavku standardu – pitná voda z Univerzitního kampusu

120 100

zákal (NTU)

80 60

y = 29 307,81x + 25,67 R² = 0,9757

40 20

-0,0010

-0,0005

0 0,0000 -20

0,0005

0,0010

0,0015

0,0020

0,0025

0,0030

látkové množství Cl- (mmol)

Graf č. 2 Metoda přídavku standardu – Ondrášovka

48

40 35

zákal (NTU)

30 25 20 y = 7 482,27x + 12,81 R² = 0,8547

15 10 5 0

-0,002

-0,001

-5

0

0,001

0,002

0,003

0,004

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 3 Metoda přídavku standardu – Mattoni

225

zákal (NTU)

175 125

y = 29 800,78x + 11,65 R² = 0,9984

75 25

-0,001 -25 0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 4 Metoda přídavku standardu – Korunní

49

350 300

zákal (NTU)

250 200 150

y = 74 525,58x + 58,06 R² = 0,9997

100 50

-0,0010

0 -0,0004 -50

0,0002

0,0008

0,0014

0,0020

0,0026

0,0032

0,0038

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 5 Metoda přídavku standardu – Bílinská kyselka

300

zákal (NTU)

250 200 150 y = 34 730,43x + 36,94 R² = 0,9892

100 50

-0,0015

0 -0,0005 -50

0,0005

0,0015

0,0025

0,0035

0,0045

0,0055

0,0065

0,0075

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 6 Metoda přídavku standardu – Perrier

50

300

zákal (NTU)

250 200 150 y = 66 489,57x + 23,84 R² = 0,9899

100 50

-0,0005

0 0,0000 -50

0,0005

0,0010

0,0015

0,0020

0,0025

0,0030

0,0035

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 7 Metoda přídavku standardu – Vincentka

500

zákal (NTU)

400 300 y = 123 633,05x + 37,83 R² = 0,9977

200 100

-0,0005

0 0,0000

0,0005

0,0010

0,0015

0,0020

0,0025

0,0030

0,0035

-100

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 8 Metoda přídavku standardu – Acqua Panna

51

250

zákal (NTU)

200 150 y = 140 461,41x + 19,40 R² = 0,9938

100 50

-0,0002

0 0,0000

0,0002

-50

0,0004

0,0006

0,0008

0,0010

0,0012

0,0014

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 9 Metoda přídavku standardu – Vittel

300

zákal (NTU)

250 200 150

y = 168 790,04x + 34,37 R² = 0,9986

100 50

-0,0003

0 -0,0001 -50

0,0001

0,0003

0,0005

0,0007

0,0009

0,0011

0,0013

0,0015

látkové množství Cl- (mmol) Graf č. 10 Metoda přídavku standardu – San Pellegrino

52

6.2 Návod do praktika z analytické chemie NEFELOMETRIE A TURBIDIMETRIE ÚKOLY: 1.1. Stanovení množství chloridů ve vzorcích vod metodou přídavku standardu 1.2. Stanovení množství síranů ve vzorcích vod metodou kalibrační křivky 1.3. Stanovení C-reaktivního proteinu ve vzorku Protein control level PŘÍSTROJE: Fotometr MN PF-12Plus, UV-Vis spektrofotometr Lightwave II, minitermostat TK-1 ultrazvuková lázeň, magnetická míchačka POMŮCKY: Kyveta, Erlenmeyerova baňka (50 ml), odměrná baňka (250 ml, 100 ml, 50 ml), pipeta, pipetovací balónek, automatická pipeta, odměrný válec, kádinka, magnetické míchadélko CHEMIKÁLIE: NaCl, 1% AgNO3, koncentrovaná HNO3, K2SO4, 1M HCl, 1% BaCl2, standardy zákalu pro kalibraci fotometru MN PF-12Plus (NULL, 1 NTU, 4 NTU, 100 NTU, 400 NTU), CRP Calibrator, reakční činidlo 1 (pufr), reakční činidlo 2 (protilátka) V tabulce 1 a 2 je uvedeno složení pufru, tedy reakčního činidla 1, a protilátky, reakčního činidla 2. Tab. 1 Složení pufru přidávaného ke vzorku CRP látka koncentrace fosfátový pufr pH 7,4 polyethylenglykol (PEG) chlorid sodný

35 mmol∙l-1 45 g∙l-1 150 mmol∙l-1

azid sodný

0,95 g∙l-1 Tab. 2 Složení protilátky přidávané ke vzorku CRP látka koncentrace

fosfátový pufr pH 7,4

35 mmol∙l-1

kozí antisérum proti lidskému CRP

variabilní

azid sodný

0,95 g∙l-1

53

1. ÚVOD Nefelometrie a turbidimetrie patří do skupiny optických metod využívajících rozptylu světla částicemi v suspenzích či koloidních roztocích. U roztoků je po delší době často pozorován zákal. Je to proto, že při měření využíváme srážecích reakcí. Vzniklý zákal je optickou vlastností prostředí a lze ho definovat jako snížení průhlednosti kapaliny. Neprůhlednost je způsobena přítomností nerozpuštěné hmoty. Zákal je přímo úměrný koncentraci částic a slouží jako měřítko relativní čistoty vod. Míra zákalu je nejčastěji vyjadřována v NTU (Nephelometric Turbidity Unit). U nefelometrie je měřeno rozptýlené záření nejčastěji pod úhlem 90° od dopadajícího záření. Je však možné setkat se i s přístroji majícími detektor umístěný v úhlu od 10° do 90° od dopadajícího záření. U turbidimetrie se naopak měří záření, které prošlo vzorkem a je ochuzené o rozptýlenou složku záření. Detektor je tedy umístěn ve směru záření. Jako nefelometr lze použít uzpůsobený fluorimetr, pro turbidimetrická měření lze zase využít fotometry či spektrofotometry. U vlastního měření je důležité dodržovat stejné podmínky. Měření ovlivňují zejména velikost a tvar částic v roztoku, teplota prostředí, doba stání roztoků a intenzita míchání. Do nestabilních roztoků se často přidávají ochranné koloidy, což jsou povrchově aktivní látky sloužící ke stabilizaci suspenze. Nefelometrie i turbidimetrie se v dnešní době využívají především při hodnocení kvality potravin a nápojů a celkově v potravinářském průmyslu, ale také ve farmaceutickém průmyslu i v lékařství při stanovování makromolekul, proteinů, globulinů a dalších látek v krevním séru. 1.1. STANOVENÍ MNOŽSTVÍ CHLORIDŮ METODOU PŘÍDAVKU STANDARDU Principem stanovení množství chloridů je reakce chloridového aniontu s dusičnanem stříbrným. Po jejich reakci vzniká bílá sraženina chloridu stříbrného. Ag+ + Cl- → ↓AgCl V této úloze budeme stanovovat obsah chloridů ve vzorku pitné vody a ve vzorku minerálky za použití fotometru MN PF-12Plus.

54

1.1.1. Postup přípravy roztoků Připravíme si standardní roztok NaCl o koncentraci 100 mg∙l-1 Cl-. Poté přelijeme zhruba 15 ml vzorku minerálky do kádinky a vložíme na 5 minut do ultrazvukové lázně, aby došlo k odplynění. Mezitím si připravíme srážecí roztok. Do odměrné baňky o objemu 250 ml nalijeme 100 ml 1% AgNO3 (odměřený odměrným válcem) a přidáme 12,5 ml koncentrované HNO3. Baňku doplníme destilovanou vodou po rysku. Příprava vzorku pitné vody: Do 6 Erlenmeyerových baněk o objemu 50 ml pipetujeme 1,25 ml odplyněného vzorku. Poté přidáme standardní roztok NaCl podle následující tabulky. V dalším kroku doplníme všechny baňky na 5 ml destilovanou vodou. č. roztoku

Tab. 3 Tabulka objemů pro přípravu roztoků pitné vody 1 2 3 4 5

6

objem vzorku (ml)

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

1,25

objem roztoku NaCl (ml)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

objem dest. vody (ml)

3,75

3,25

2,75

2,25

1,75

1,25

Příprava vzorku minerálky: Jestliže koncentrace Cl- udaná na obalu láhve minerálky přesahuje hodnotu 20 mg∙l-1, postupujeme stejně jako u vzorku pitné vody. Pokud je obsah Cl- několikanásobně vyšší, minerálku před vložením do lázně naředíme na koncentraci zhruba 35 mg∙l-1 Cl-. U minerálek s nižší koncentrací připravíme roztoky podle tabulky č. 4.

č. roztoku

Tab. 4 Tabulka objemů pro přípravu roztoků minerálky 1 2 3 4

5

6

objem vzorku (ml)

3,00

3,00

3,00

3,00

3,00

3,00

objem roztoku NaCl (ml)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

objem dest. vody (ml)

2,00

1,75

1,50

1,25

1,00

0,75

Poté k roztokům jak pitné vody, tak minerálky přidáme vždy s odstupem 1 minuty (to proto, abychom později dodrželi stejný čas pro všechna měření) 5 ml srážecího roztoku. Vše pečlivě promícháme a každý roztok necháme 15 minut stát při laboratorní teplotě. Poté roztoky přelijeme do kyvety, kterou před měřením otřeme, a proměříme. Při měření postupujeme vždy od roztoků s nejmenším přídavkem standardu. Před měřením druhého vzorku kyvetu pečlivě vypláchneme destilovanou vodou a necháme vyschnout. 55

1.1.2. Kalibrace fotometru MN PF-12Plus a měření roztoků: 1. Fotometr zapneme stiskem klávesy

.

2. Vybereme metodu nefelometrického měření zákalu zadáním čísla 906. 3. Kalibraci zahájíme stiskem

. Poté vložíme jeden po druhém standardní roztoky

testovací soupravy NANOCONTROL NANOTURB, měření provedeme stiskem klávesy

. Ukončení kalibrace potvrdíme stiskem

. Nyní je přístroj

nakalibrován. 4. Při měření přelijeme roztok z baňky do kyvety, kyvetu uzavřeme, pečlivě otřeme a vložíme ji do kyvetového otvoru. Stiskem klávesy

roztok proměříme.

Hodnotu zákalu zobrazenou na displeji si zapíšeme. Kyvetu vkládáme do kyvetového otvoru vždy stejným směrem. 5. Po ukončení měření kyvetu pečlivě vypláchneme destilovanou vodou a vypneme fotometr stiskem klávesy

.

1.1.3. Vyhodnocení analýzy 1. Do protokolu vložíme grafy, kde na osu y vyneseme naměřené hodnoty zákalu (NTU) a na osu x látkové množství přidaného Cl-. 2. Body v grafu proložíme přímkou a z rovnice této přímky zjistíme látkové množství chloridových aniontů v neznámém vzorku, které poté přepočítáme na molární a hmotnostní koncentraci. 2.1. STANOVENÍ MNOŽSTVÍ SÍRANŮ METODOU KALIBRAČNÍ KŘIVKY Principem stanovení množství síranů je reakce síranového aniontu s chloridem barnatým za vzniku bílé sraženiny síranu barnatého. Ba2+ + SO42- → ↓BaSO4 V úloze budeme stanovovat obsah síranů ve vzorku pitné vody a ve vzorku minerálky za použití fotometru MN PF-12Plus. 2.1.1. Postup přípravy roztoků Zhruba 25 ml vzorku pitné vody, 45 ml minerálky (případně zředěné na koncentraci přibližně 50 mg∙l-1 SO42-) vložíme v kádince na 5 minut do ultrazvukové lázně, aby došlo k odplynění. 56

Mezitím si do odměrné baňky o objemu 100 ml připravíme navážením potřebného množství K2SO4 standardní roztok o koncentraci 1 g∙l-1 SO42-. Kalibrační roztoky: Do 5 odměrných baněk o objemu 50 ml napipetujeme předem vypočtený objem standardního roztoku SO42- tak, abychom po doplnění baňky po rysku získali sadu kalibračních roztoků o koncentraci 0, 20, 40, 60, 80 a 100 mg∙l-1 SO42-. Do každé baňky přidáme 5 ml 1M HCl, baňky doplníme po rysku destilovanou vodou a promícháme. Vzorek pitné vody: Po odplynění napipetujeme 20 ml vzorku do odměrné baňky o objemu 50 ml, přidáme 5 ml 1M HCl a doplníme destilovanou vodou po rysku. Poté směs promícháme. Vzorek minerálky: Po odplynění napipetujeme 40 ml vzorku do odměrné baňky o objemu 50 ml. Přidáme 5 ml 1M HCl, baňku doplníme po rysku destilovanou vodou a směs promícháme. 2.1.2. Postup měření 1. Na magnetickou míchačku umístíme Erlenmeyerovu baňku a do ní vložíme magnetické míchadlo. 2. Změříme zákal destilované vody, tedy kalibračního roztoku o nulové koncentraci SO42-). Do baňky postupně pipetujeme 2 ml 1% BaCl2 a 18 ml destilované vody. Směs necháme 2 minuty míchat. 3. Poté naplníme kyvetu po rysku roztokem, otřeme vnějšek, vložíme ji do otvoru pro kyvetu a stiskneme

. Hodnotu z displeje si zapíšeme.

4. Na míchačku postavíme suchou baňku a pipetujeme postupně 2 ml 1% BaCl2, 8 ml destilované vody a 10 ml kalibračního roztoku číslo 1. Opět necháme 2 minuty míchat a následně roztok proměříme. 5. Stejným způsobem postupujeme i u dalších kalibračních roztoků a také u vzorků. Před měřením pitné a minerální vody vypláchneme kyvetu destilovanou vodou. 6. Po ukončení měření kyvetu vypláchneme destilovanou vodou a fotometr vypneme stiskem klávesy

.

2.1.3. Vyhodnocení analýzy 1. Sestrojíme kalibrační graf. 2. Z rovnice kalibrační přímky vypočítáme koncentraci síranových aniontů ve vzorku pitné vody a minerálky. 57

3.1. STANOVENÍ C-REAKTIVNÍHO PROTEINU (CRP) TURBIDIMETRICKY CRP je protein, který se objevuje v krvi ve zvýšené koncentraci během zánětlivých procesů. Jeho stanovení se tedy u pacientů provádí zejména k prokázání zánětlivých procesů, například ke zjištění infekčního a revmatologického onemocnění. U zdravého člověka by měla být koncentrace CRP v intervalu 0−5 mg∙l-1. Principem metody je reakce vzorku (lidského séra) se specifickou protilátkou proti lidskému C-reaktivnímu proteinu. CRP + protilátka → ↓[CRP-protilátka] Vzniklý imunokomplex způsobuje zákal, který je měřen při vlnové délce 340 nm. V této úloze budeme stanovovat CRP ve vzorku Protein control level, což je roztok lidského plazmatu s fyziologickým roztokem, fosfátovým pufrem a s přídavkem ochranného azidu sodného. Měření budeme provádět na UV-Vis spektrofotometru Lightwave II, WPA a vyhodnocení metodou kalibrační křivky. 3.1.1. Postup přípravy roztoků Do 50 ml odměrné baňky si navážíme potřebné množství NaCl, aby byl po doplnění po rysku destilovanou vodou vytvořen 0,09% roztok NaCl. Roztok použijeme jako blank a při přípravě kalibračních roztoků. Kalibrační roztoky připravíme pomocí CRP standardu, jímž je CRP Calibrator. Jde o roztok lidského séra s vysokým obsahem CRP, s fyziologickým roztokem a s fosfátovým pufrem. Obsahuje i azid sodný. Připravíme si 7 mikrozkumavek. Do první napipetujeme 80 μl CRP Calibrator, do dalších šesti napipetujeme 200 μl 0,09% roztoku NaCl. K prvnímu z nich přidáme 200 μl CRP Calibrator, vyměníme si špičku a pečlivě promícháme. Z tohoto roztoku odpipetujeme 200 μl do následující mikrozkumavky. Opět vyměníme špičku a promícháme. Tímto způsobem připravíme 5 kalibračních roztoků. Je důležité před každým promícháním vyměnit špičku! Poslední mikrozkumavka obsahuje pouze roztok NaCl, který slouží jako blank. Vytvořili jsme tedy sadu 6 kalibračních roztoků o koncentraci 100 %; 50 %; 25 %; 12,5 %; 6,25 % a 3,125 % CRP.

58

3.1.2. Postup měření 1. Spektrofotometr zapneme černým tlačítkem pro zapnutí/vypnutí. 2. Pomocí kláves s čísly nastavíme hodnotu vlnové délky na 340 nm. 3. Do kyvety dáme 0,09% roztok NaCl (blank) a hodnotu blanku nastavíme stiskem modrého tlačítka. 4. Při vlastním měření roztoků postupujeme tak, že do čistých mikrozkumavek napipetujeme 1 ml reakčního činidla 1 (pufr) a k němu přidáme 80 μl blanku (popř. standardu, vzorku). 5. Směs promícháme a necháme 5 minut temperovat v minitermostatu nastaveném na teplotu 37 °C. 6. Poté ji ihned přelijeme do kyvety a stiskem zeleného tlačítka odečteme první absorbanci. 7. Směs vrátíme zpět do mikrozkumavky, přidáme k ní 250 μl reakčního činidla 2 (protilátky), promícháme a opět necháme 5 minut temperovat na 37 °C. 8. Poté směs přelijeme do kyvety a změříme druhou absorbanci. 9. Stejným postupem pokračujeme při měření kalibračních roztoků a roztoku vzorku. Při měření postupujeme od nejméně koncentrovaného roztoku k nejkoncentrovanějšímu. 3.1.3. Vyhodnocení analýzy 1. Absorbanci jednotlivých kalibračních roztoků, která je vynášena do grafu, získáme rozdílem naměřených absorbancí. 2. Sestrojíme kalibrační graf. Na osu y vyneseme výslednou absorbanci kalibračních roztoků zmenšenou o absorbanci blanku. Na osu x vyneseme koncentraci CRP. 3. Z rovnice přímky vypočítáme koncentraci CRP v neznámém vzorku.

59