Masarykova univerzita Lékařská fakulta

Masarykova univerzita Lékařská fakulta

Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Biochemické markery sepse

Vedoucí diplomové práce:

Autor:

Mgr. Milada Nezvedová

Kamila Vránová

Brno, duben 2013

Jméno a příjmení autora: Kamila Vránová Název bakalářské práce: Biochemické markery sepse

Pracoviště: Nemocnice Znojmo, Oddělení klinické biochemie Vedoucí diplomové práce: Mgr. Milada Nezvedová Rok obhajoby bakalářské práce: 2013

Souhrn: Práce podává obecný přehled o nejčastěji pouţívaných biochemických markerech sepse – CRP, PCT a IL-6. Popisuje jejich vlastnosti a význam při diagnostice septických stavů. Podrobně se zabývá metodikou jejich stanovení na OKB Nemocnice Znojmo včetně preanalytické fáze a ekonomické stránky vyšetření. V experimentální části ukazuje na příkladech několika kazuistik praktické vyuţití markerů sepse u pacientů ARO a jejich důleţitou úlohu ve včasném odhalení a léčbě novorozeneckých sepsí. Klíčová slova: marker sepse, OKB, Nemocnice Znojmo, CRP, PCT, IL-6

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Milady Nezvedové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne ......................

.................................................

Děkuji své školitelce Mgr. Miladě Nezvedové za odborné vedení při psaní bakalářské práce, za cenné rady a připomínky. Zároveň děkuji Bc. Haně Říhové za ochotu pomáhat a radit při studiu a celé své rodině za trpělivost a pochopení. Zvláštní poděkování patří mému manželovi za vstřícnost při řešení problémů a za podporu, kterou jsem cítila po celou dobu studia.

Obsah Úvod....................................................................................................................................................7 1

Obecná část ...............................................................................................................................8

1.1

Septické stavy ...........................................................................................................................8

1.1.1

Definice sepse.................................................................................................................8

1.1.2

Patofyziologie sepse .......................................................................................................9

1.1.3

Zánět a odpověď organismu .........................................................................................11

1.2

Diagnostika sepse ...................................................................................................................12

1.2.1

C-reaktivní protein .......................................................................................................14

1.2.2

Prokalcitonin ................................................................................................................15

1.2.3

Interleukin-6 .................................................................................................................17

1.2.4

Další cytokiny...............................................................................................................19

1.3

Řízení antimikrobiální léčby...................................................................................................21

2

Speciální část ..........................................................................................................................22

2.1

Cíl práce ..................................................................................................................................22

2.2

Metodika a přístrojové vybavení OKB ...................................................................................22

2.2.1

Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxC 800 ...........................................................23

2.2.2

Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800.............................................................24

2.2.3

Analyzátor Roche Cobas e 411 ....................................................................................27

2.3

Poţadavky a informace ke stanovení markerů sepse ..............................................................29

2.3.1

Preanalytické poţadavky ..............................................................................................29

2.3.2

Doba stanovení .............................................................................................................30

2.3.3

Interference stanovení ..................................................................................................31

2.3.4

Ekonomika stanovení markerů sepse ...........................................................................32

2.3.5

Statistika poţadavků na jednotlivá vyšetření................................................................33

3

Experimentální část ................................................................................................................37

3.1

Pacient č. 1 ..............................................................................................................................38

3.2

Pacient č. 2 ..............................................................................................................................40

3.3

Pacient č. 3 ..............................................................................................................................42

3.4

Pacient č. 4 ..............................................................................................................................44

3.5

Pacient č. 5 ..............................................................................................................................45

3.6

Pacient č. 6 ..............................................................................................................................46

Závěr .................................................................................................................................................47 Seznam literatury a pouţitých zdrojů................................................................................................48 Seznam pouţitých obrázků a tabulek: ...............................................................................................51

Seznam použitých zkratek

ATB......................................antibiotika D...…....................................Dalton DIC.......................................diseminovaná intravaskulární koagulopatie FN.........................................fakultní nemocnice G+.........................................Gram pozitivní G-..........................................Gram negativní INFγ......................................interferon gama JIP.........................................jednotka intenzivní péče m.h. …..................................molekulová hmotnost NIS........................................nemocniční informační systém PMK......................................permanentní močový katetr RF.........................................revmatoidní faktor TNFα.....................................tumor necrosis factor alfa UPV......................................umělá plicní ventilace

Úvod Problematika sepse, respektive systémového zánětu je v poslední době velmi diskutovaná a to napříč mnoha medicínskými obory. Chceme-li sníţit rizika rozvoje sepse, je třeba stanovit včasnou diagnózu a následně adekvátní terapii. Lékaři se snaţí mnoho let najít vhodný marker pro diagnostiku a monitorování průběhu sepse. Kaţdým rokem se objevují nové markery, které mozaikovitě přispívají ke zjištění správného patofyziologického stavu, ale univerzální marker, který by splňoval podmínky specifity, senzitivity a také dostupnosti, stále nalezen nebyl. V klinické praxi je stále nejvyuţívanější vyšetření C-reaktivního proteinu. Jde ale o obecný ukazatel, jehoţ zvýšená hladina v krvi je známkou probíhající zánětlivé reakce v organismu. V posledních deseti letech je za jeden z nejnadějnějších markerů sepse povaţován prokalcitonin. Jeví se jako marker se selektivní specifitou pro průkaz infekční etiologie systémové zánětlivé reakce organismu. Vedle prokalcitoninu se na čelo vyšetřovaných markerů sepse dostává také interleukin 6, který je označován za spolehlivý parametr pro charakteristiku imunitní reakce u těţkých onemocnění a uplatňuje se zejména v diagnostice neonatální infekce a sepse. Vyšetření těchto biochemických markerů by mělo být běţnou součástí klinické praxe, součástí diagnostických postupů při podezření na sepsi a důleţitým vodítkem k zahájení a ukončení antibiotické terapie.

7

1 Obecná část

1.1 Septické stavy Díky neustále rostoucímu počtu poznatků je problematika sepse a septického šoku pravidelným tématem na stránkách lékařské odborné literatury i na sympoziích a sjezdech. Důvodem je stále vysoká úmrtnost, která septické stavy provází. I kdyţ se prognóza sepse od 50. let nesmírně zlepšila, tak mortalita se stále pohybuje kolem 25 % všech, u nichţ je sepse diagnostikována a dokonce aţ 50 % nemocných postiţených septickým šokem umírá. Úspěchy resuscitační terapie umoţňují bezprostřední přeţití stále většího počtu pacientů v kritických stavech. Zavádí se stále více náročných invazivních zákroků, implantují se cizorodé materiály, zvyšuje se věkový průměr pacientů. To vše představuje vyšší riziko pro vznik septického stavu. (Zima, 2002)

1.1.1 Definice sepse Definice sepse a dělení do jednotlivých stádií prošli v minulosti řadou variant. Konference Critical Care Society v r. 1992 v USA nakonec dospěla k definici, která je uznávaná dodnes. Sepse je definována jako systémová odpověď na infekci. Je to syndrom systémové zánětlivé odpovědi (Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS) v důsledku potvrzeného infekčního procesu. Z její definice zmizel dřívější poţadavek na přítomnost mikroorganismů v cirkulaci. Průběh sepse se dělí na 3 stádia: sepse těţká sepse septický šok K zařazení vývoje sepse do jednotlivých stádií slouţí klinické a laboratorní parametry a také sledování dysfunkce orgánů. (tab. 1)

8

Tabulka 1 Přítomnost příznaků u jednotlivých stádií sepse (Zima, 2002) Příznak

sepse

těžké sepse

septický šok

alterace chování /vědomí

-

+

+

horečka > 38,3 °C nebo hypotermie ˂ 36 °C

+

+

+

tachypnoe > 20/min nebo paCO2 ˂ 4,3 kPa

+

+

+

tachykardie > 90/min

+

+

+

leukocyty > 12 . 109/l nebo ˂ 4 . 109/l nebo > 10% tyčkových forem

+

+

+

dysfunkce nebo hypoperfuze orgánů

-

+

+

hypotenze

-

+

+

+

-

reakce hypotenze na doplnění objemu tekutin

1.1.2 Patofyziologie sepse Infekční inzult V etiologii sepse se můţe uplatnit jakýkoliv mikroorganismus. Nejčastěji to mohou být Gram negativní bakterie, u kterých je účinným spouštěcím mechanismem působení endotoxinu. V poslední době se zvyšující se invazivitou medicínských úkonů vzrůstá podíl případů SIRS způsobených Gram pozitivními bakteriemi, případně patogenními houbami. (Krejsek, 2004) Invaze do krevního řečiště není pro rozvoj sepse nezbytná. Důleţitá role se přičítá lokálnímu nebo systémovému rozsevu signalizačních molekul (např. endotoxin Gram pozitivních bakterií, lipopolysacharid jako kapsulární antigen opouzdřených bakterií). Časná systémová odpověď Rozvoj známek SIRS poukazuje na to, ţe se infekce začíná vymykat lokální kontrole. Rychlost rozvoje SIRS záleţí na mnoţství a rychlosti průniku cytokinů do oběhu. Hlavní cytokiny jsou TNF α, IL-1, IL-6, IFN γ. Působením IL-1 na hypotalamus vzniká horečka. Výhody horečky jsou podpora tvorby imunoglobulinů, makrofágů a růstových faktorů pro neutrofily, horečka zpomaluje růst infekčního agens. 9

Pokročilá systémová odpověď V tomto stádiu jiţ nemocný nemůţe kontrolovat zánětlivý proces. Vzniká dysfunkce endotelu účinkem TNF a IL-1, a tím porucha mikrocirkulace v důsledku vzniku mikrotrombů, hromadění polymorfonukleárů a trombocytů. Porucha endotelu můţe vést k vazodilataci, rozvoji diseminované intravaskulární koagulopatii (DIC), septickému šoku v důsledku úniku intravazálních tekutin mimo oběh. To má za následek centralizaci oběhu a rozvoj multiorgánové dysfunkce. Multiorgánová dysfunkce K tomuto stavu často dochází, pokud úvodní noxa byla intenzivní a postihla základní i další významné ţivotní funkce a také pokud primární inzult nepůsobil pouze místně a došlo k delokalizaci do celého organismu. Narušení funkce orgánů vede k celkové dysregulaci, nacházíme pak různé patologické hodnoty při kontrole mnoha orgánů a systémů. Rozlišujeme: multiorgánovou dysfunkci (Multiorgan Dysfunkcion, MODS). K primární MODS dochází bezprostředně např. po tonutí, po oběšení, po dlouhotrvajícím mimotělním oběhu. Sekundární MODS nastupuje po delším klinicky němém intervalu např. po opakovaném septickém výsevu, po reperfuzi zhmoţděných dolních končetin, při rozvíjející se akutní nekrotizující pankreatitidě. Podstatou sekundárního MODS jsou chemicko-enzymaticko-toxické vlivy endotoxinů, cytokinů, reaktivních kyslíkových forem. Organismu klesají rezervy z vyčerpání regeneračních moţností, postupně klesá i vlastní imunokompetence. multiorgánové a multisystémové selhání. (Multiorgan Failure, MOF) Dochází k přechodnému nebo i k trvalému selhání funkce ţivotně důleţitých orgánů a systémů. V konečném klinickém výsledku tvoří MOF společně se sepsí stejně významnou poloţku jako základní onemocnění či úraz – podílejí se z 50 % na letalitě závaţných a kritických stavů. (Zima, 2002)

10

1.1.3 Zánět a odpověď organismu Sepsi můţeme zařadit do velké skupiny zánětlivé odpovědi organismu.

Zánětem

organismus reaguje na porušení své integrity, jsou to reakce vedoucí k ochraně proti infikování poškozeného místa, k lokalizaci poškození a zhojení. Odpověď organismu na poškození v závislosti na jeho rozsahu a délce trvání můţe být místní nebo celková. Pokud mluvíme o lokálním zánětu, tak první signály k rozvoji zánětlivých reakcí dávají degranulované ţírné buňky a fagocyty, dále pak látky uvolněné z poškozených buněk a součásti mezibuněčné hmoty obnaţené poraněním. (Hořejší, 2002) Tyto rozličné signály způsobí klasické lokální projevy: zčervenání (rubor), otok (tumor), bolestivost (dolor) zvýšení místní teploty (calor). Systémová zánětlivá odpověď vytváří celý soubor příznaků. Hovoříme o SIRS. Jde o nadřazenou pojmovou skupinu sepse. SIRS (ale i zánět obecně) můţeme popsat také jako odezvu organismu na různé antigenní podněty. Nejčastěji jde o infekční mikroorganismy, ale můţe jít i o různé neinfekční inzulty. Mezi neinfekční inzulty řadíme tato působení na organismus (obr. 1): mechanické termické chemické radiační Zánětem můţe organismus reagovat i na ischemii tkáně. Pokud hovoříme o SIRS, musí být přítomné nejméně dva z těchto příznaků: tělesná teplota > 38°C nebo ˂ 36°C tepová frekvence > 90 tepů/min. dechová frekvence > 20 dechů/min. nebo hypoventilace vedoucí ke sníţení PaCO2 na hypokapnickou hodnotu ˂ 4,25 kPa počet leukocytů > 12x109/l nebo 4x109/l, popř. se do oběhu vyplaví více neţ 10 % nezralých forem leukocytů (tyčí) Po narušení integrity vnitřního prostředí organismu následuje aktivace imunitního systému a produkce cytokinů a jiných mediátorů. Systémovým projevem zánětu je horečka, která je způsobena stimulací hypotalamového centra termoregulace prozánětlivými cytokiny, zejména 11

tumornekrotickým faktorem (TNF), interleukinem-1 (IL-1) a interferonem-γ (INF-γ). SIRS indukuje syndrom kompenzační protizánětlivé odpovědi (Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome, CARS). Jde o protireakci organismu, který bojuje moţnostmi tělu vlastními, coţ je především produkce interleukinů IL-4, IL-10, IL-11 a IL-13. (Petrová, 2010) Poměr SIRS a CARS je velice důleţitý – určuje rovnováhu mezi obrannou zánětlivou odpovědí a mírou imunosuprese. Nedostatečnost CARS odpovědi můţe vyústit v syndrom MODS. Pokud vnitřní rezervy organismu a resuscitační postupy nedostačují, můţe MODS vyústit v MOF. Zánětlivá reakce organismu pak vede k velice závaţným, mnohdy fatálním důsledkům. MOF společně se sepsí se podílejí na 50% letalitě závaţných a kritických stavů. (Zima, 2002)

Obrázek 1. Vztahy SIRS, infekce a sepse a jejich hlavní příčiny vzniku (Petrová, 2010)

1.2 Diagnostika sepse Při rozpoznávání septických komplikací hraje čas důleţitou roli. Rozhodují hodiny, aby se včas mohla nasadit vhodná antimikrobiální léčba. Důleţitým faktorem je důsledné odlišení infekčního či neinfekčního původu. Tady má nenahraditelnou roli mikrobiologické vyšetření. 12

Výsledky posledních prací naznačují, ţe léčba těchto stavů je moţná blokádou jednotlivých cytokinů či jejich kombinací (TNF, IL-1). Uspokojující výsledky jsou však dosaţeny pouze při včasném či preventivním podání. Proto je rychlá diagnóza a sledování dynamiky velice důleţitým faktorem v léčbě. (Zima, 2002) Při diagnostice, sledování a léčení nemocných hraje nezastupitelnou úlohu klinickobiochemické vyšetřování. U pacientů dochází k typickým změnám ve vodním a iontovém hospodářství, vývoj sepse provází i změna v intermediárním metabolismu, a proto je nutné tato vyšetření správně indikovat. V posledních dvaceti letech dochází k rozšiřování palety markerů zánětů. Neustále se diskutuje o jejich výpovědní hodnotě a vhodném výběru. Zejména v poslední době jsou předkládány výsledky monitorování řady cytokinů, jejich receptorů, antagonistů těchto receptorů i markerů zánětů, ovšem v klinické praxi je monitorování v oblasti těchto cytokinů zatím nedostupné a to jak z hlediska technického, tak i z hlediska finančního.

Tabulka 2. Seznam a frekvence biochemických vyšetření pro monitoring změn v iontovém a intermediárním metabolismu během sepse (Zima, 2002) Parametr Sérum (plazma) glykemie urea kreatinin Na+, K+ ,ClCa2+, Mg2+, P osmolarita albumin celková bílkovina acidobazická rovnováha kyslíkové parametry laktát reaktanty akutní fáze bílkoviny s krátkým poločasem jaterní testy

Frekvence vyšetření denně, podle potřeby i vícekrát denně denně denně denně, podle potřeby častěji, zejména K+ 2-3 týdně denně denně denně denně, podle potřeby častěji denně, po změně ventilačního reţimu za 30 minut denně, při podezření na mléčnou acidózu denně 2-3 týdně 2-3 týdně

Moč urea kreatinin Na+, K+ ,Closmolarita Obsah sondy drénů Na+, K+ ,Cl-

denně denně denně denně podle stavu, při ztrátách nad 250 ml/den

13

Kromě základních biochemických vyšetření, která monitorují

změny

metabolismu

v organismu v průběhu sepse (tab.2), jsou velice důleţitá vyšetření, která mají danou specifitu a senzitivitu k systémovému zánětu. Paleta a počet vyšetření je ovšem závislá na mnoţství financí, které jsou určeny pro zdravotnictví. V posledních letech se jako markery v diagnostice sepse uplatňují především C-reaktivní protein, prokalcitonin a interleukin-6.

1.2.1 C-reaktivní protein Je to nejpouţívanější marker v klinické praxi, v diagnostice zánětlivých stavů se vyuţívá nejdéle. C reaktivní protein (CRP) byl poprvé objeven Tilletem a Francisem v roce 1930 v séru nemocných pneumokokovou pneumonií. Jeho název je odvozen od jeho schopnosti precipitovat C-polysacharidovou frakci pneumokoků. Je to bílkovina akutní fáze o molekulové hmotnosti 110 000 – 140 000 D. Molekula CRP má cyklickou strukturu sloţenou z pěti podjednotek, které jsou sloţeny z 206 aminokyselin. Jeho gen se nachází na dlouhém raménku 1. chromozomu. Je syntetizován v játrech, méně i na jiných místech organismu např. v endotelu či některých typech lymfocytů. Jeho syntézu v hepatocytech stimulují cytokiny, rozhodující vliv má interleukin-6 za synergického působení interleukinu-1. Je součástí imunologického obranného systému, kdy působí jako opsonin schopný klasicky aktivovat systém komplementu, podporuje i fagocytózu mikrofágů a váţe C-polysacharid pneumokoků. V poslední době se hovoří i o aterogenním působení CRP, tedy jeho účinků, které vedou ke vzniku aterosklerózy: podpora endotelové dysfunkce, prokoagulační účinek, vyvolání oxidačního stresu, podpora adheze monocytů k endotelu. (Racek, 2010) Nejvyuţívanějším je jeho vztah k zánětlivým procesům v těle. Jeho hlavní význam v diagnostice zánětlivých stavů a sepsí spočívá v tom, ţe se jedná sice o nespecifický, ale velice citlivý parametr, kdy ke stimulaci jeho produkce stačí poměrně malá zánětlivá reakce. Je indukován infekcí, zvláště bakteriální. Toho se vyuţívá zejména v ordinacích, kde hladinu CRP můţeme měřit na POCT analyzátorech. CRP slouţí k rychlému orientačnímu rozlišení bakteriální a virové infekce.

14

Zvýšení hladiny CRP: lokalizované infekci (absces, pneumonie), sepse, virové infekce, po operaci. Dynamika změn hladiny CRP je rychlá. K jeho vzestupu dochází cca 6-12 hodin po zánětlivém stimulu, maxima dosahuje za cca 48 hodin, k normalizaci hodnot dochází během 3-7 dnů. Referenční meze: do 5 mg/l (s věkem se nemění) Patologické hodnoty: často 100-200 mg/l, vzácné nejsou ani hodnoty vyšší maximálně do 800 mg/l (např. těţká cholecystitida a těţká pneumonie) Význam v diagnostice: monitorování průběhu a závaţnosti SIRS, časný záchyt infekcí u rizikových pacientů, také díky screeningovému vyšetřování, rozlišení bakteriálních a nebakteriálních forem SIRS, důleţitý parametr v rozhodování, zda nasadit antibiotika či zda se jedná o virovou infekci. Vzhledem k rychlému, jednoduchému a finančně nenáročnému vyšetření má stanovení CRP široké uplatnění.

1.2.2 Prokalcitonin Prokalcitonin (PCT) je poměrně nový biochemický marker. Rok 1975 - objeven prekurzor kalcitoninu – preprokalcitonin a jeho štěpné produkty. Rok 1981 - popsaná struktura prokalcitoninu jako glykoproteinu. Rok 1993 – diskuze o moţnostech vyuţití prokalcitoninu v akutní medicíně na základě extrémně vysokých hodnot plazmatického PCT zaznamenaných u septických pacientů. Rok 1994 -

hlavním stimulátorem tvorby PCT během zánětu označen

lipopolysacharid (LPS). Rok 2000 - objasněn hlavní zdroj tvorby zánětlivého PCT – jaterní buňky. Za posledních 10 let uţ si oprávněně vydobyl své místo v diagnostice zánětlivých stavů. 15

PCT je bílkovina o 116 aminokyselinách s molekulovou hmotností 13 000 D a je identická s prohormonem kalcitoninu. Fyziologicky je produkován C-buňkami štítné ţlázy, ale maximální syntéza během reakce akutní fáze probíhá v játrech. V menší míře je produkovaný i v neuroendokrinních buňkách střev a plic, v monocytech, makrofázích a v hypofýze. Prokalcitonin je velmi citlivý indikátor s rychlou kinetikou. Má poločas 25-30 hodin, je tedy moţné dobře sledovat průběh hladin. Ve srovnání s CRP tedy reaguje rychleji a lépe tak poukazuje na zlepšení nebo zhoršení klinického stavu. (Lenártová, 2008) Syntéza PCT a jeho uvolňování do oběhu je vysoce specifická reakce na systémově působící infekční podnět bakteriálního původu. Na indukovanou syntézu během septické reakce nejsou nevyhnutelné leukocyty. Existuje závislost mezi mírou indukce a charakterem a intenzitou vyvolávajícího podnětu. Prudké zvýšení koncentrace prokalcitoninu nastává přibliţně tři hodiny po uvolnění lipopolysacharidu (endotoxinu) a maximum dosahuje do 6 aţ 12 hodin. Hladina PCT můţe nabýt široký rozsah hodnot, maximální jsou hodnoty cca 2000krát vyšší neţ je norma (dosahují aţ 1000 µg/l). Tvorba prokalcitoninu není omezená jen na bakteriální antigenní stimulaci, protoţe prokalcitonin je indukovaný i během aseptické zánětlivé reakce např. po rozsáhlém chirurgickém výkonu nebo po transplantaci kostní dřeně.

Tabulka 3. Rozsah hodnot PCT a jejich vztah ke klinickému stavu (Malina, 2012) PCT

hodnocení

vybrané klinické stavy

poznámka

(µg/l) 0-0,5

Normální

Zdravé osoby

Nevylučuje lokalizovanou nebo

hodnoty 0,5-2

2-10

jinou neţ bakteriální infekci

Mírné

Lokalizovaný infekční

Hodnoty běţné v časném

zvýšení

zánět, chronický zánět,

pooperačním období a při těţké

virózy

renální insuficienci

Vysoké

Systémová bakteriální

hodnoty

infekce, intenzivní SIRS nebakteriálního původu

10 a více

Velmi vysoké Těţká sepse,

Při těţkých bakteriálních

hodnoty

infekcích aţ 1000 µg/l

multiorgánové selhání

16

Normy pro děti do 48hodin ţivota se liší, novorozenci mají po porodu fyziologický vzestup PCT s maximem za 24 hodin, během 48 hodin hladina klesá na obvyklé hodnoty. Význam v diagnostice: diferenciální diagnostika zánětlivých onemocnění a horeček neznámého původu, rozlišení bakteriální a nebakteriální etiologie, nejsilnější stimulační účinek na uvolňování PCT mají endotoxiny Gram negativních bakterií, srovnatelný vzestup PCT vyvolávají téţ Gram pozitivní bakterie a mykotické infekce, hladina PCT se nezvyšuje (nebo jen velmi mírně) při virových infekcích, hladinu PCT neovlivňují chronická zánětlivá onemocnění, autoimunitní onemocnění, podávané léky, léčebné postupy např. extrakorporální oběh, monitorování kriticky nemocných, kdy vysoké nebo rostoucí hladiny PCT znamenají bakteriální komplikace, hodnocení prognózy pacientů – maximální hladiny PCT u sepse, MODS, nekrotizující pankreatitidy a jiných závaţných stavů znamenají špatnou prognózu, sledování pacientů po transplantaci orgánů nebo pacientů s hematologickými malignitami, u nichţ je důleţitá včasná detekce infekčních komplikací před jejich klinickým rozvojem. Z laboratorního hlediska je výhodou prokalcitoninu velká biostabilita ex vivo, na základě této vlastnosti obsahuje po 12 hodinách při pokojové teplotě vzorek plazmy více neţ 90% testované látky. (Brunkhorst, 2009)

1.2.3 Interleukin-6 Interleukiny jsou zánětlivé mediátory s prozánětlivým i protizánětlivým působením. Patří do velké skupiny cytokinů, která zahrnuje široké spektrum funkčních bílkovin, které plní specifickou imunomodulační funkci. Interleukin-6 (IL-6) je multifunkční protein, který reguluje imunitní odpověď, reakce akutní fáze a hematopoézu. Má rozhodující vliv pro indukci syntézy CRP, stimuluje B-lymfocyty a tím protilátkovou odpověď. Interleukin-6 je produkován lymfatickými a nelymfatickými buňkami, normálními i transformovanými buňkami (T a B lymfocyty, monocyty, fibroblasty, vaskulární endoteliální buňky, buňky kardiálních myxomů, myelomů, astrocytomů, glioblastomů, buňky karcinomu 17

močového měchýře). Produkce IL-6 těmito buňkami je regulována buď pozitivně nebo negativně celou řadou signálů včetně mitogenů, antigenní stimulace, lipopolysacharidů a virů, ale například i hypoxií. Syntéza interleukinu-6 je také výrazně stimulována oběma typy cytokinů (IL-1 a TNF, IL-4 a IL-3). Přestoţe je „distálním“ prozánětlivým cytokinem, jeho účinky pro makroorganismus jsou v konečném výsledku příznivé: je hlavním induktorem syntézy proteinů akutní fáze v hepatocytu (působí synergicky s IL-1 a β glukokortikoidy), tyto proteiny akutní fáze působí všeobecně prospěšně v regulaci zánětu, stimuluje B lymfocyty, a tím protilátkovou odpověď, působí na reparační děje, abiogenezi, podporuje syntézu erytropoetinu. Ani přes mnoho dílčích poznatků není dodneška bohuţel přesně definována role samotného IL-6 při septických stavech. Význam v diagnostice: dynamika vzestupu a poklesu při zánětlivé reakci, hladina IL-6 stoupá pomaleji neţ TNF-α a IL-1 (asi 30-60 minut po nástupu SIRS/sepse ), maximum dosahuje za 6-12 hodin, IL-6 má delší poločas neţ TNF-α a IL-1, předchází vzestupu CRP, ale také i PCT aţ o několik hodin, umoţňuje velmi časný záchyt infekce ještě před rozvojem klinických příznaků (u rizikových pacientů po operacích, imunosupresivní pacienti), monitorování průběhu a závaţnosti SIRS (infekce, zánět, nekróza) a sepse, hladina interleukinu-6 stoupá úměrně s vývojem závaţnosti stavu, velký prognostický význam - plazmatické koncentrace za 48 hodin po přijetí septického pacienta na JIP korelují s APACHE II skóre (klasifikace rizika mortality pacienta) a výslednou mortalitou, pomáhá v diagnostice rozlišení sterilní a infikované pankreatické nekrózy, velké vyuţití při včasném záchytu novorozenecké infekce a sepse, nejdůleţitější parametr, protoţe těsně po narození v případě sepse CRP narůstá pomalu, PCT je 18

naopak u novorozenců fyziologicky vysoký, jedině IL-6 je spolehlivým ukazatelem, lze ho stanovit v pupečníkové krvi, stanovení

v mozkomíšním

moku

odliší

bakteriální

etiologii

meningitidy

od ostatních příčin, stanovení v moči lze vyuţít k časné detekci rejekce štěpu při transplantaci. Ve specializovaných laboratořích lze také vyšetřit poměr IL-6/IL-10. Trvale zvýšené koncentrace IL-6 spolu s klesající syntézou protizánětlivého IL-10 jsou povaţovány za ukazatele rozvoje MODS, a tedy špatnou prognózu vzhledem k přeţití. Na druhé straně vysoké sérové hodnoty IL-10 spojené většinou s mírnějším růstem hladin IL-6 jsou výborným ukazatelem pneumonie zejména u starých pacientů. Věk rozsah reaktivity IL-10 neomezuje. (Zima, 2002) Referenční meze IL-6 : novorozenci do 43 ng/l ostatní do 6,4 ng/l V případě sepse stoupá hladina sérového IL-6 aţ na hodnoty okolo 2-3000 ng/l

1.2.4 Další cytokiny Cytokiny jsou pravděpodobně nejdůleţitější součástí aktivace imunoendokrinologické odpovědi na vnější inzult. Jsou to humorální faktory, které zajišťují mezibuněčnou komunikaci v rámci imunitního systému a také komunikaci mezi imunitním systémem a dalšími tělními soustavami. Jedná se o nízkomolekulární informační molekuly s pleiotropním účinkem, kdy jeden cytokin můţe mít více fyziologických účinků. Na druhé straně i různé cytokiny mohou mít stejné nebo podobné působení. Biologická aktivita cytokinů je značná, projevuje se jiţ v koncentracích pg/ml. Nejvýznamější funkce cytokinů je aktivace a regulace odpovědi buněk zúčastněných v zánětu. Vedle toho se podílejí na regeneraci a reparaci tkání, ovlivňují metabolické děje, endokrinní a mozkové funkce. Funkčně vytvářejí cytokiny sítě tím, ţe indukují nebo suprimují expresi jiných cytokinů. Jejich působení je buď synergické, kdy v případě zánětu a sepse působí prozánětlivě, anebo antagonistické s protizánětlivým působením. Pro některé účely je nezbytně nutné koordinované spolupůsobení několika různých cytokinů.

19

Cytokiny často působí v kaskádě, kdy jeden cytokin indukuje tvorbu druhého. Do určité míry je celý cytokinový systém redundantní, to znamená, ţe jednotlivé cytokiny mohou být nahrazeny jinými. (Koudelková, 2010) Způsoby působení cytokinů : autokrinně - působí na buňku, která jej produkuje, parakrinně – působí na buňky v těsné blízkosti, endokrinně – působí na vzdálené tkáně po transportu cévním řečištěm. Dosud je známo přes 120 cytokinů, neustále jsou objevovány další. Klasifikují se zejména na základě molekulárně-biologických postupů. (Zima, 2002) Přehled nejdůleţitějších cytokinů: tumornekrotizující faktory ( TNF-α, TNF-β ) interleukiny ( IL-1 – IL-18, funkční výjimky IL-3 a IL-8 ) interferony ( INF-α, INF-β, INF-γ ) hemopoetické růstové faktory (např. SCF,EPO,GM-CSF, IL-3) chemokiny ( patří sem IL-8) transformující růstové faktory další růstové faktory např. epidermální,fibroblastové, nervové

Obrázek 2 Kinetika hladin vybraných cytokinů v čase (Malina, 2012) 20

1.3 Řízení antimikrobiální léčby Časně zahájená a správně dávkovaná antimikrobiální léčba sniţuje letalitu pacientů, a to jak u bakteriémie způsobené G+ nebo G- bakteriemi, tak i při septickém šoku. Je nezbytné, aby se začalo s antibiotickou léčbou co nejdříve – nejlépe do jedné hodiny po objevení příznaků sepse nebo septického šoku. Antibiotická léčba bývá obvykle empirická, nejčastěji se kombinují betalaktamy + aminoglykosidy, příp. cefalosporiny III. nebo IV. generace. Mikrobiologické vyšetření hemokultury popř. hnisu z loţiska je nezbytné, na základě výsledku kultivace (za 48-72 hodin) se léčba vyhodnocuje, modifikuje. (Beneš, 2007)

21

případně se

2 Speciální část 2.1 Cíl práce Cílem této práce je: 1) popsat markery sepse, které jsou stanovovány na OKB Nemocnice Znojmo, 2) popsat metody stanovení těchto markerů včetně preanalytických poţadavků, analytických parametrů, 3) zhodnotit ekonomické náklady těchto metod, 4) zhodnotit důleţitost a význam pouţití zánětlivých markerů pro stanovení včasné diagnózy sepse prostřednictvím kazuistik, a to u pacientů na oddělení ARO a pacientů na novorozeneckém oddělení JIP znojemské nemocnice.

2.2 Metodika a přístrojové vybavení OKB Základní zánětlivý marker CRP se vyšetřuje prakticky ve všech biochemických laboratořích včetně těch nejmenších. Vyšetření specifických markerů sepse PCT a IL-6 vyţaduje náročnější přístrojové vybavení i celkově náročnější přístup. Proto by se měly stanovovat jen v laboratořích splňujících veškeré podmínky interní a externí kontroly kvality tak, aby byla zaručena kvalita vyšetření. Nemocnice Znojmo je drţitelem certifikátu ISO 9001:2000 a Oddělení klinické biochemie splnilo podmínky pro získání Auditu I a II NASKL. Pro stanovení markerů sepse v rutinní praxi jsou velmi důleţité preanalytické a analytické podmínky a také časová dostupnost těchto vyšetření. Rychlost stanovení je pro včasnou diagnostiku hodně důleţitá, proto byla tato vyšetření zařazena do bloku „STATIM“, kdy musí být výsledek vyšetření vydán od příjmu do 2 hodin. Při vitálním ohroţení pacienta je moţno vyšetřit vzorek v reţimu „URGENT“. Takový vzorek je nutné zpracovat do 30 minut. Do skupiny urgentních vyšetření je zařazeno i stanovení CRP. Stanovení markerů probíhá na třech analyzátorech: Beckman Coulter UniCel DxC 800 - CRP Roche Cobas e 411 - PCT Beckman Coulter UniCel DxI 800 - IL-6

22

2.2.1 Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxC 800 Analyzátor UniCel DxC 800 obsahuje dva moduly: MC modul a CC modul (obr. 4 a 5). Stanovení CRP probíhá na CC modulu metodou turbidimetrie. Reagenční činidlo obsahuje polyklonální anti-CRP protilátku (kozí a myší), která po vazbě na CRP z pacientského séra vytváří nerozpustný komplex antigen-protilátka. Systém analyzátoru automaticky dávkuje přesný objem vzorku a reagencie do kyvety. Pouţívaný objemový poměr je 1 díl vzorku k 50 dílům reagencie. Systém monitoruje změny absorbance při 600 nanometrech. Změna absorbance je přímo úměrná koncentraci C-reaktivního proteinu ve vzorku a je pouţita systémem pro výpočet koncentrace C-reaktivního proteinu na základě jednobodové předem určené kalibrační křivky. (C-RP, 2005) Průběh reakce: C-RP (antigen) + anti-CRP protilátka → C-RP komplex Antigen - protilátka

Obrázek 3 Schéma turbidimetrie, M – monochromátor, D – detektor (Dastych, 2007)

Obrázek 4 Analyzátor UniCel DxC 800 - celkový pohled 23

Obrázek 5 Analyzátor UniCel DxC 800 - detailní pohled, vlevo MC modul, vpravo CC modul

2.2.2 Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800 Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800 (obr. 7) je kompaktní plně automatický systém, kde se provádí imunochemické stanovení metodou chemiluminiscence. Tento systém vyuţívá enzym alkalická fosfatáza jako marker, paramagnetické mikročástice jako nosiče protilátek resp. antigenů a luminiscenční detekci vyuţívající

přeměnu dioxetanfosfátu

na dioxetan. Analyzátor má velmi dobrou přesnost a reprodukovatelnost výsledků, má také vysokou detekční citlivost při širokém koncentračním rozmezí. Princip stanovení IL-6: nekompetitivní (sendvičové) imunoenzymatické stanovení Průběh reakce: vytvoření alikvotu, ze kterého je část odpipetována do reakční kyvety, do vzorku je pomocí reagenčního pipetoru přidána reagencie s paramagnetickými

částicemi,

potaţenými

monoklonální protilátky proti lidskému IL-6, 24

konjugátem

myší

během inkubace dojde k navázání paramagnetických částic z činidla, po ukončení inkubace je kyveta přesunuta do promývacího karuselu, kde jsou paramagnetické částice pomocí magnetu přitaţeny ke stěnám reakční

kyvety

a

dojde

k odstranění

promývacího

roztoku

s nenavázaným analytem, v dalším kroku je nepipetován chemiluminiscenční

substrát

Lumi-Phos⃰ 530, který reaguje s analytem, na němţ je navázán enzym, dojde k emisi fotonů měřené luminometrem. Produkce světla je přímo úměrná koncentraci IL-6 ve vzorku, měřené hodnoty jsou vyjádřené v relativních světelných jednotkách (RLU). Tyto hodnoty jsou pouţívány spolu s kalibračními daty k výpočtu výsledků. (IL-6, 2006)

Obrázek 6 Obecné schéma nekompetitivní enzymoimunoanalýzy (Dastych, 2011)

25

Obrázek 7 Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800

Pro stanovení CRP a IL6 lze vyuţít jednu zkumavku pacientova séra díky systému UCTA (Unicel Closed-Tube Aliquotter), který je spojovacím modulem UniCel DxC 800 a UniCel DxI 800 (obr. 8). Zkumavka je ve speciálním stojánku dopravena nejdříve do modulu UCTA, kde jsou na základě informací z čárových kódů vytvořeny aliquoty do imunoanalytického analyzátoru (DxI), poté je primární zkumavka dopravena do chemického analyzátoru (DxC). Propojením těchto analyzátorů se výrazně zkrátila celková doba stanovení. Před integrací těchto dvou analyzátorů musela být zkumavka se vzorkem vloţena do kaţdého analyzátoru jednotlivě, coţ stěţovalo organizaci práce a v neposlední řadě prodluţovalo TAT (turn around time - časová odezva).

26

Obrázek 8 Analyzátor UniCel DxC 880i : zleva - UniCel DxI 800, modul UCTA, UniCel DxC 800

2.2.3 Analyzátor Roche Cobas e 411 Analyzátor Roche Cobas e 411 (obr. 9) je plně automatický stolní analyzátor. Je určen pro in vitro kvantitativní a kvalitativní stanovení pomocí elektrochemiluminiscenční technologie – ECLIA (uţivatelská příručka, 2006). Vzorek a reagencie jsou pipetovány v pipetovací stanici do reakční kyvety, která je přesunuta do inkubátoru, kde je ponechána aţ 9 minut. Tady jsou přidávána další činidla nebo mikročástice v závislosti na metodě. V další fázi je reakční kyveta přesunuta do aspirační stanice, kde jehla nasaje k přípravě měřící komůrky roztok ProCell a potom komůrku naplní reakční směsí. Poté jsou paramagnetické mikročástice s navázanými imunokomplexy přichyceny ke stěnám komůrky a nezreagované sloţky vymyty roztokem ProCell. Přidaná protilátka je značena rutheniovým chelátem, který je zodpovědný za světelnou emisi. Iniciátorem elektrochemiluminiscence je tripropylamin (TPA), jehoţ funkcí je přenos elektronu na rutheniový chelát. Přenos se uskutečňuje po vloţení napětí na elektrodu a oxidaci TPA a rutheniového chelátu. Tím dochází k redukci rutheniového chelátu na nestabilní 27

excitovanou formu a při návratu do stabilního stavu dochází k vyzáření fotonu. Jako detektor k měření se pouţívá fotonásobič. Pomocí analog-digitálního konvektoru dojde ke kvantifikaci vyzářených

fotonů.

Jejich

mnoţství

je

přímo

úměrné

koncentraci

analytu

ve

vzorku.(referenční příručka, 2010)

Obrázek 9 Analyzátor Roche Cobas e411 Na tomto analyzátoru se PCT stanovuje na principu nekompetitivní (sendvičové) imunoanalýzy. Stanovení probíhá v těchto krocích: 1. inkubace: antigen ve vzorku (30µl), biotinylovaná monoklonální protilátka proti PCT a monoklonální protilátka proti PCT, značená rutheniovým komplexem, reagují za tvorby sendvičového komplexu. 2. inkubace: po přidání mikročástic, potaţených streptavidinem, se komplex váţe na pevnou fázi prostřednictvím interakce mezi biotinem a streptavidinem. Reakční směs je nasáta do měřící cely, kde jsou mikročástice zachyceny magnetickým polem na povrchu elektrody. Nenavázané sloţky

jsou

odstraněny

roztokem

ProCell.

Přivedené

napětí

na elektrodě vyvolá chemiluminiscenční emisi fotonů, která je změřena fotonásobičem. 28

Výsledky jsou vyhodnoceny z kalibrační křivky, která je specificky vytvořena pro přístroj 2-bodovou kalibrací a master křivky, dodávané v čárovém kódu reagencie.

Obrázek 10 Princip stanovení PCT ( Lenártová, 2008 )

2.3 Požadavky a informace ke stanovení markerů sepse 2.3.1 Preanalytické požadavky Po doručení biologického materiálu na příjem OKB je laborantkou zkontrolováno dodrţování preanalytických poţadavků: typ odběrové zkumavky čas a datum odběru údaje na ţádance a na štítku zkumavky se musí shodovat. Informace o odběrech pro všechna oddělení nemocnice jsou uvedeny v laboratorní příručce. Pokud je pouţíván nemocniční informační systém ( NIS ), pak je typ odběrových nádobek

uveden na ţádance, po vybrání poţadavku na vyšetření se tato informace

automaticky vygeneruje v rámci programu NIS. U stanovení CRP, PCT a IL-6 nejsou potřeba ţádné speciální preanalytické poţadavky. Všechna tři stanovení lze provést jak ze séra, tak z plazmy. Nejčastěji se odebírá nesráţlivá krev do zkumavky s Li-heparinem, coţ umoţňuje rychlé zpracování bez čekání na vysráţení 29

krve. Také centrifugace je o 5 minut rychlejší neţ u sráţlivé krve – zkumavka s nesráţlivou krví se centrifuguje 5 minut při 2000 x g. Sérum nebo plazma musí být fyzicky odděleny od buněk v nejkratším moţném čase. Doporučený čas pro separaci je maximálně do 2 hodin. Stabilita analytů v plazmě a v séru: CRP : při pokojové teplotě 8 hodin, v lednici 48 hodin, déle pouze mraţené, mrazit lze pouze sérum! PCT: při pokojové teplotě 8 hodin, v lednici 24 hodin, déle pouze zmraţené. IL-6: při pokojové teplotě 8 hodin, v lednici 48 hodin, déle pouze zmraţené. Objemy séra (plazmy) pro stanovení: CRP – 6 µl PCT – 30 µl IL-6 – 110 µl

Obrázek 11 Žádanka na biochemické vyšetření

2.3.2 Doba stanovení Vzhledem k akutnosti septických stavů se vzorky nejčastěji vyšetřují v reţimu STATIM, coţ znamená akutní vyšetření. S ohledem na provoz laboratoře je nutné výsledek od příjmu materiálu vydat nejpozději do 2 hodin, ale s ohledem na stav pacienta se vzorky vyšetřují co nejrychleji, pokud moţno nejpozději do hodiny. 30

Pouze vyšetření CRP je moţno stanovit v reţimu URGENT znamenající vitální indikaci. Vyšetření urgentu je nutné provést neprodleně s přesně zaznamenaným časem předání biologického materiálu, výsledek se co moţná nejdříve telefonuje na příslušné oddělení nemocnice. Tabulka 4 Doba stanovení jednotlivých markerů Centrifugace

Centrifugace

Plazma (min)

Sérum (min)

CRP

5

10

15

PCT

5

10

18

IL-6

5

10

35

Analyt

Analýza (min)

Jednotlivé časy uvedené v tabulce jsou časy ideální bez ohledu na provoz, je nutné si uvědomit, ţe jednotlivé parametry jsou stanovovány na různých analyzátorech z jedné zkumavky. Reálný čas stanovení běţných biochemických parametrů společně s CRP a PCT je 40 minut, s vyšetřením IL-6 je potřebný čas o něco delší.

2.3.3 Interference stanovení Jeden z nejčastějších problémů biochemických stanovení jsou chylózní séra. Interference vznikají zejména u zákalových reakcí. U stanovení markerů sepse lipemie séra nejvíce ovlivňuje výsledek vyšetření CRP, protoţe jde o turbidimetrické stanovení. Moderní analyzátory mimo stanovení poţadovaných parametrů provádějí stanovení tzv. indexů hemolýzy, lipemie a ikterie séra nebo plazmy. V analytických parametrech jednotlivých metod jsou nastaveny limity interferencí a v případě jejich překročení není výsledná hodnota daného parametru vydána. Náhradou výsledku je text specifikující interferenci (hemolytické, ikterické ...) Interference CRP : hemoglobin nad 5 g/l bilirubin nad 513 µmol/l lipemie : index vyšší neţ 6 RF > 400 IU/ml 31

Interference PCT: hemoglobin nad 9 g/l bilirubin nad 428 µmol/l triacylglyceridy nad 17 mmol/l Interference IL-6: hemoglobin nad 5g/l bilirubin nad 684 µmol/l triacylglyceridy nad 34 mmol/l

2.3.4 Ekonomika stanovení markerů sepse Počty vyšetření markerů sepse za rok 2012 na OKB Nemocnice Znojmo, bodové ohodnocení pro pojišťovnu a orientačně náklady oddělení na jedno vyšetření, jsou uvedeny v tabulce č. 5. Pro vyšetření CRP a IL-6 není do ceny jednoho vyšetření zahrnuta cena kalibrátorů a kontrol, poněvadţ nejsou součástí soupravy. Je tedy nutné počítat s cenou vyšší, nelze ji ovšem určit zcela přesně z důvodu působení několika faktorů (četnost kalibrace – nová šarţe setu, významný servisní zásah, po kterém by mohlo dojít k posunu hodnot, následně četnost stanovení kontrolního materiálu – po kalibraci, náhodná chyba, opakování stanovení z kontrolního materiálu). Souprava pro stanovení PCT obsahuje kalibrátory a kontrolní séra, z toho důvodu je moţné vyčíslit částku za jedno vyšetření s větší přesností. Po kaţdé kalibraci se u metod CRP a IL-6 stanovují 3 různé hladiny kontrol, u metody PCT jsou to 2 hladiny kontrol. Harmonogram stanovení kontrol: CRP 1x denně vţdy 2 hladiny PCT 3x týdně vţdy jedna hladina 1x denně IL-6 3x týdně vţdy jedna hladina 1x denně

32

Tabulka 5 Ekonomika stanovení CRP

PCT

IL-6

Počet vyšetření

37055

1014

206

Body

147

782

1035

Cena testu (Kč)

65

300-450

400-550

Omezení

-

Jen při hospitalizaci

Jen při hospitalizaci

nízká Přednosti

cena

– rozliší

závaţnost dg. neonatální sepse

dostupnost sledování systémového zánětu – trendu

velmi

časný

(sepse, těţká sepse, marker septický šok )

2.3.5 Statistika požadavků na jednotlivá vyšetření Stanovení CRP patří k nejfrekventovanějším vyšetřením v biochemických laboratořích, druhé místo zaujímá PCT a poslední místo zaujímá stanovení IL-6. Následující tři grafy přináší pohled na počty vyţádaných vyšetření jednotlivých analytů z různých oddělení nemocnice Znojmo za rok 2012. Poţadavky na vyšetření CRP Vyšetření CRP je ordinováno napříč všemi medicínskými obory. Jde o nespecifický, ale velmi dobrý ukazatel zánětlivé reakce. Z grafu je zřejmé, ţe největší počet poţadavků na vyšetření je z centrálního příjmu nemocnice Znojmo. Z toho největší podíl tvoří poţadavky z příjmové ambulance chirurgického a interního oddělení. Na OKB Znojmo bylo v roce 2012 provedeno celkem 37 055 stanovení CRP. Z toho asi 34 500 poţadavků bylo z lůţkových oddělení Nemocnice Znojmo spolu s Centrálním příjmem, zbylý počet tvoří poţadavky od praktických a dětských lékařů.

33

Obrázek 12 Graf počtu požadavků na vyšetření CRP

Poţadavky na vyšetření PCT Stanovení PCT se provádí jen u hospitalizovaných pacientů. Jde o specifický marker sepse a z grafu je zřejmé, ţe stanovení nejvíce vyuţívají oddělení intenzivní medicíny, kde jsou pacienti nejvíce ohroţeni sepsí. V roce 2012 bylo na OKB Znojmo stanoveno 1014 vyšetření PCT.

Obrázek 13 Graf počtu požadavků na vyšetření PCT 34

Poţadavky na vyšetření IL-6 Stanovení IL-6 je také výkon vázaný výhradně na hospitalizaci pacienta. Jde o vyšetření vyuţívané téměř výhradně neonatology a lékaři z dětského oddělení, neboť jde o nejvýznamnější ukazatel časné sepse u novorozenců. I v jiných oborech by měl tento zánětlivý parametr jistě uplatnění. Patrně tomu brání cena jednoho stanovení - 1035 Kč. V roce 2012 bylo na OKB Znojmo stanoveno 206 vyšetření IL-6.

Obrázek 14 Graf počtu požadavků na vyšetření IL-6

35

Pouţité zkratky oddělení: CP – centrální příjem INT – interní oddělení CHIR – chirurgické oddělení INDIAL – hemodialyzační oddělení ODN – oddělení dlouhodobě nemocných HEMA – hematologická ambulance DEO2 – dětské oddělení CHIINT – chirurgicko-interní oddělení AROO – anezteziologicko-resuscitační oddělení CHJIP – oddělení chirurgické JIP POR – ţenské- porodnické oddělení TRNO –plicní oddělení NEUO – neurologické oddělení INNEF – nefrologická ambulance interního oddělení INFOOD – infekční oddělení DEJIP – JIP dětského oddělení INJIP – oddělení interní JIP REHO – rehabilitační oddělení ORTO – ortopedické oddělení NOVJIP – oddělení novorozenecké JIP NOVO – novorozenecké oddělení INGAST – gastroenterologická ambulance interního oddělení

36

3 Experimentální část V této části je prostřednictvím kazuistik poukázáno na důleţitost a význam pouţití zánětlivých markerů pro stanovení včasné diagnózy sepse. Ve spolupráci s lékaři ARO Nemocnice Znojmo jsou zde popsány tři případy hospitalizovaných pacientů, u kterých byla během léčení diagnostikována sepse. Správným léčebným postupem, který byl indikován mimo jiné také díky kaţdodennímu stanovování zánětlivých markerů, došlo ke zlepšení zdravotního stavu pacientů. Z novorozeneckého oddělení JIP jsou popsány tři případy novorozenců, na kterých lze poukázat na důleţitost stanovení interleukinu 6 při odhalování počátků novorozenecké sepse.

37

3.1 Pacient č. 1 Muţ, rok narození 1968 (44 let), diagnóza akutní pankreatitida. Pacient přijat 5.9.2012 na odd. chirurgie s akutní nekrotizující pankreatitidou, byla zavedena konzervativní léčba, stav se horšil, zjištěny známky akutní respirační insuficience a MODS, proto byl dne 10.9.2012 pacient přeloţen k další léčbě na odd. ARO. Další diagnózy: fluidothorax, sepse, MODS, respirační selhání, perforace tlustého střeva. Pravidelně ( většinou denně ) byly v laboratoři vyšetřovány zánětlivé markery CRP a PCT (obr. 15). Hodnoty CRP jsou prakticky v celém období léčby hodně vysoké (v průměru okolo 300 mg/l). Je to zejména z důvodu častých revizí a převazů břicha a přetrvávající peritonitidy. V tomto případě je daleko specifičtějším ukazatelem aktuálního stavu a hrozící sepse parametr PCT. Po počátečním vzestupu hodnoty PCT klesají aţ do chvíle, neţ se u pacienta začínají rozvíjet nozokomiální nákazy. Dne 7.10.2012 se v mikrobiologických nálezech poprvé objevuje nález významných patogenů : o sputum - Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, o hnis z abscesu (pankreas) – Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, o moč - Pseudomonas aeruginosa. Poté hodnota PCT výrazně stoupá a kulminuje 12.10.2012, léčba na tento stav reaguje. Do 7.11.2012 je pacient ohroţen sepsí a MODS, po nahlédnutí do dokumentace je vidět souvislost hodnot PCT s nálezem patogenních bakterií v biologickém materiálu (sputum, hnis z břicha, moč ). Od 7.11.2012 se hodnoty PCT pohybují na úrovni 0,5 µg/l. Tyto hodnoty většinou svědčí o lokalizovaném infekčním loţisku nebo chronickém zánětu. Odpovídá to mírnému riziku sepse. Hodnoty CRP od 7.11.2012 narůstají, lékaři to vysvětlují přetrvávající peritonitidou, neustálými převazy a proplachy břicha. Po celou dobu léčení na odd. ARO měl pacient negativní nálezy v hemokulturách. Dne 5.12.2012 byl pacient přeloţen na chirurgicko-interní oddělění, kde se doléčoval další 4 měsíce. Po celou tuto dobu uţ hodnoty jeho PCT nepřekročily hranici 0,5 µg/l. 38

Obrázek 15 Graf vývoj hodnot zánětlivých markerů pacient č.1

39

3.2 Pacient č. 2 Ţena, rok narození 1939 (73 let), počáteční diagnóza epidurální absces v oblasti páteře, postupně

se

rozvinuly tyto diagnózy:

sepse,

respirační

selhání, selhání ledvin,

bronchopneumonie, fluidothorax. Pacientka 1.10.2012 přijata na odd. ortopedie pro bolesti zad, postupně se rozvíjí sepse z meziobratlové ploténky, v hemokultuře nález Stafylococcus aureus. Překlad na odd. ARO, 6.10.2012 hodnoty PCT 13,1 µg/l, CRP 282 mg/l (obr. 16). Zahájena intenzivní antibiotická terapie, stav se zlepšuje, dne 12.10.2012 poprvé negativní nález v hemokultuře. Během léčby se začínají projevovat nozokomiální infekce, postupně se objevují tyto mikrobiologické nálezy: o sputum - Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, o konec PMK - Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, o moč - Candida albicans. Nález v hemokultuře 29.10.2012: Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, Candida tropicalis. Tomu odpovídá i zhoršený klinický stav (febrilie, tachykardie, pneumonie). Nasazena dvojkombinace antibiotik. Hodnota PCT se dostala na hranici 100 µg/l, hodnota CRP 150,7 mg/l. K další atace sepse dochází 9.11.2012, klinický stav tomu odpovídá (třesavka), nález v hemokultuře : Candida albicans. Nasazena trojkombinace antibiotik. Hodnota PCT stoupla na 18,99 µg/l, hodnota CRP na 187,5 mg/l. 21.11.2012 poprvé negativní nález v hemokultuře, stav pacientky se postupně zlepšuje, tomu odpovídají i sniţující se hodnoty zánětlivých markerů, pacientka je přeloţena na interní oddělení. Pro uspokojivý stav je pacientka do domácího ošetřování propuštěna 4.12.2012

40

Obrázek 16 Graf vývoj hodnot zánětlivých markerů pacient č.2

41

3.3 Pacient č. 3 Ţena, rok narození 1940 (72 let), počáteční diagnóza kámen ţlučníku s cholecystitidou, postupně se pacientka léčí s těmito diagnózami: cholecystektomie, plicní nedostatečnost, fibrilace, hypertenze. Pacientka po třech dnech léčení na odd. chirurgie přeloţena 19.6.2012 na odd. ARO, rozvinut stav sepse, nestabilní oběh, podány katecholaminy a trojkombinace antibiotik. V této době se hodnoty CRP pohybují na hranici 400 mg/l, nejvyšší hodnota PCT dosáhla na 6,56 µg/l (obr. 17). Stav se postupně stabilizuje, nejniţší hodnoty zánětlivých markerů dne 27.6.2012. Den poté se objevuje horečka (teploty neklesají pod 38,5 °C), 30.6.2012 kulminují hodnoty: PCT 13,92 µg/l, CRP 394 mg/l. Rozvíjí se sepse, pneumonie, nestabilní oběh podány katecholaminy, nová trojkombinace antibiotik. Mikrobiologický nález ze dne 30.6.2012: o

hemokultura a stěr z laparostomatu : Enterobacter cloacae - kmen produkující AmpC ( jde o rezistentní kmen, častý původce nozokomiálních nákaz).

U pacientky se objevují další infekce, pravděpodobně související s umělou ventilací, zavedením permanentního močového katetru ( PMK ) a jiných katetrů, neustálými převazy břicha. Mikrobiologické nálezy: o sputum – Pseudomonas aeruginosa, o moč – Candida glabrata, o konec PMK - Pseudomonas aeruginosa,

Enterobacter cloacae AmpC,

Enterococcus faecalis. Dne 8.7.2012 opět hemokultura pozitivní, nález Candida glabrata, hodnoty CRP na maximu ( 393 mg/l ), opět nasazeny nová antibiotika, hodnoty PCT se u této bakteriémie nezvyšují. Následuje období postupného zlepšování stavu, hodnoty zánětlivých markerů postupně klesají. I kdyţ se ještě 19.7.2012 v hemokultuře objevuje Klebsiella pneumonie, na stav pacientky ani na hodnoty PCT a CRP to nemá významnější vliv. Podle dokumentace jsou všechny zbývající infekce zvládnuty bez zvýšeného rizika sepse. Pacientka je dne 17.8.2012 přeloţena na doléčení na odd. chirurgické JIP.

42

Obrázek 17 Graf vývoj hodnot zánětlivých markerů pacient č.3

43

3.4 Pacient č. 4 Novorozenec, chlapec, diagnóza bakteriální sepse novorozence Narozen v termínu, Apgar skóre (bodovací systém pouţívaný k orientačnímu posouzení zdravotního stavu novorozence bezprostředně po narození): 9-10-10, porodní váha 4020 g. Pro hyperbilirubinémii prováděna fototerapie pod UV světlem. Mikrobiologický nález po narození: o výtěr z oka - mikroby neprokázány, o výtěr z ucha – po pomnoţení koaguláza negativní stafylokoky, o stěr z axily – Escherichia coli. Biochemické nálezy:

1. den 3. den 4 .den

CRP mg/l

IL-6 ng/l

Bilirubin µmol/l

4,2

>1570

264,5

51,5

19,6

207,9

22,9

15,8

283,4

Po zjištění biochemických výsledků ještě v den narození nasazena antibiotická léčba (Unasyn, Gentamicin) Propouštěcí zpráva lékaře: „Prováděná vyšetření svědčí pro výrazný zánět. Umístěn do inkubátoru, kanylace periferní ţíly, aplikace ATB. Stav se postupně upravuje jak klinicky, tak laboratorně. Od 4. dne novorozenec umístěn na rooming s matkou, 8.den ATB vysazena. Na postýlce se chová dobře, plně kojen, hmotnost při propuštění 4150 g.“

44

3.5 Pacient č. 5 Novorozenec, dívka, diagnóza bakteriální sepse novorozence, vrozená pneumonie a mírná aţ střední porodní asfyxie Narozena v termínu, po těţkém protrahovaném porodu, Apgar skóre: 4-8-9, porodní váha 3800 g. Vzhledem ke stavu dítě příjato na odd. novorozenecké JIP do inkubátoru. Mikrobiologický nález po narození: o výtěr z oka - po pomnoţení Streptococcus agalactiae, o výtěr z ucha - Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, o stěr z axily - Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Nález bakterie Streptococcus agalactiae svědčí o moţném riziku novorozenecké sepse. Biochemické nálezy :

1. den

CRP mg/l

IL-6 ng/l

Bilirubin µmol/l

< 1,0

> 1570

35,6

Vzhledem ke stavu a zjištěným biochemickým výsledkům nasazena antibiotická léčba (Unasyn, Gentamicin). Druhý den po narození okolo 2.00 hod. v noci se objevují známky hyposaturace kyslíkem, dítě neklidné, více slinní. Stav konzultován s lékaři neonatologie FN Brno a vzhledem ke zhoršení stavu novorozenec přeloţen ve 4.00 hod. na neonatologickou JIP FN Brno.

45

3.6 Pacient č. 6 Novorozenec, dívka, diagnóza bakteriální sepse novorozence Narozena v gestačním stáří 38 týdnů, Apgar skóre: 9-9-10, porodní váha 2690 g. Mikrobiologický nález po narození: o výtěr z oka - mikroby neprokázány, o výtěr z ucha - mikroby neprokázány, o stěr z axily - Enterococcus faecalis, Biochemické nálezy:

1. den 3. den 5. den

CRP mg/l

IL-6 ng/l

Bilirubin µmol/l

< 1,0

>1570

23,0

50,6

42,2

-

17,2

118,6

37,0

Po zjištění biochemických výsledků ještě v den narození nasazena antibiotická léčba (Unasyn, Gentamicin). Propouštěcí zpráva lékaře : „Zralý novorozenec, přeloţen z odd. rooming s podezřením na sepsi, ta klinicky i laboratorně potvrzena, ATB 7 dní, dítě propuštěno domů 10.den po narození, plně kojeno, váha 2780 g.“

46

Závěr Uvedené kazuistiky dokazují uţitečnost stanovování zánětlivý markerů specifických pro včasné odhalení sepse. Stanovení PCT má velký význam pro pacienty na odd. ARO, kde se jeho prostřednictvím včas odhalí počínající sepse a můţe být zahájena okamţitá léčba. Mimo to je také dobrým ukazatelem rizika hrozící sepse. Vyšetřování PCT má význam v prvé řadě na začátku hospitalizace, kdy pacientům hrozí sepse často spojená se stavem, kvůli kterému byli přijímáni na odd. ARO (akutní nekrotizující pankreatitida, sepse z abscesu meziobratlové ploténky, cholecystektomie s komplikacemi). Nemalý význam má pak sledování vývoje hladin PCT během léčby. Pacienti jsou dlouhodobě napojeni na umělou plicní ventilaci, mají zavedené různé katetry a kanyly, i při nejlepší péči se při léčbě často nelze vyhnout nozokomiálním nákazám, které jsou celosvětovým problémem. Sepse, kdy byl patogenní mikroorganismus prokázán v krvi pacienta ( pravděpodobně spojená se zavedeném cévních katetrů ) se objevila u pacientů č.2 a 3. Určitě také díky zjistěným vysokým hodnotám PCT mohla být včas diagnostikována a nasazením vhodné kombinace antibiotik léčena. Stanovení CRP se jeví jako komplexnější ukazatel stavu pacienta. Hladiny CRP reagují na probíhající lokální infekce či chronické záněty, na terapeutické a operační zásahy. Trvale klesající hodnoty CRP vypovídají o celkově zlepšujícím se stavu pacienta. Na příkladě kazuistik novorozenců je demonstrováno, jak značnou mírou přispívá stanovení

IL-6 k diagnostice novorozeneckých sepsí. Během 1. dne po narození

jsou

neonatologové schopni zjistit počínající sepsi a vhodnou kombinací antibiotik předejít moţným komplikacím. Zatímco hladiny CRP by se při rozvíjející sepsi zvyšovali jen pozvolna, hladina IL-6 je jiţ 1. den po narození v případě sepse velmi vysoká, při správně zvolené léčbě rychle klesá. U novorozenců se vyšetření PCT neuplatní, protoţe nemusí být spolehlivým ukazatelem. Normy pro děti do 48 hodin ţivota se liší a dynamika vzestupu hladin je u nich jiná neţ v pozdějším věku. Ve většině případů díky včasnému zahájení léčby odchází z porodnice do 10. dnů po narození zdravý novorozenec, kterému tak byl zajištěn dobrý vstup do ţivota.

47

Seznam literatury a použitých zdrojů

Access IL-6 – originální návod diagnostické soupravy pro UniCell DxI 800, Beckman Coulter, 2006, str. 1-11 Bálková O.,Roche s.r.o., Prokalcitonin klinické vyuţití v dg. septických stavů [online], 2009, [cit. 15.2.2013], http://www.roche-diagnostics.cz/download/prolekare/prokalcitonin.pdf Beneš J., Sepse, [online]. ©2007. [cit. 25.1.2013]. http://jirben.wz.cz Brunkhorst F.M., Markery sepse – klinický význam, [online], 2009, [cit. 25.1.2013] http://www.tribune.cz/clanek/13793 C-RP, Systémy SYNCHRON®, originální návod diagnostické soupravy pro UniCell DxC 800, Beckman Coulter, 2005, str.1-12 Dastych M., Instrumentální technika, Optické metody, str.33, Masarykova univerzita, 2007, ISBN 978-80-210-4226-1 Dastych M.,Breinek P., Klinická biochemie, Imunoanalytické metody, str.42, Masarykova univerzita, 2011, ISBN 978-80-87192-18-4 Elecsys 2010, Referenční příručka, Roche Diagnostics Elecsys 2010 Immunoassay Elecsys BRAHMS PCT – Procalcitonin, originální návod diagnostické soupravy pro analyzátory Elecsys a Cobas e411 , Roche, 2010, str. 1-5 Hořejší V., Bartůňková J., Základy imunologie, Zánět, str. 48-50, Triton, 2002, ISBN 807254-215-X 48

Kieslichová, E., Sepse u pacientů s jaterním selháním, [online], 2009, [cit. 15.2.2013], http://www.hpb.cz/index.php?pId=02-2-3-06 Koudelková M., Sobek O., Kelbich P a kol., Labor Aktuell 01/10, Vyšetření cytokinů v likvoru, str. 14, časopis firmy ROCHE s.r.o., 2010, ISSN 1214-7672 Krejsek J., Kopecký O., Klinická imunologie, Bakterie a imunitní systém, str. 485-486, Nucleus HK®, 2004, ISBN 80-86225-50-X Lenártová R., Labor Aktuell 04/08, Prokalcitonín – kvantitatívne stanovenie, str. 14-16, časopis firmy ROCHE s.r.o., 2008, ISSN 1214-7672 Malina P., FONS informační bulletin 2/2012, Staré a nové markery zánětu, str.21-24, časopis ČSKB, 2012, ISSN 1211-7137 Petrová P., Švábová M., Labor Aktuell 01/10, IL-6, PCT, CRP – pomocné markery v diagnostice septických stavů, str. 10-13, časopis firmy ROCHE s.r.o., 2010, ISSN 12147672 Racek J.,Labor Aktuell 04/10, C-reaktivní protein a ateroskleróza, str.4-6, časopis firmy ROCHE s.r.o., 2010, ISSN 1214-7672 Švábová M., FONS informační bulletin 4/2009, Stanovení interleukinu IL-6 na systému Modular E170, str.28-31, časopis ČSKB, 2009, ISSN 1211-7137 Zazula R, Průcha R, Spálený A., Prokalcitonin nejen v diferenciální diagnostice zánětlivé odpovědi

organismu.

Anest.

intenziv.

Med

[online].

2002,

[cit.

25.1.2013]

http://www.prolekare.cz/anesteziologie-intenzivni-medicina-clanek?id=27121 Zima T,.,Drábková J.,Laboratorní diagnostika, Sepse, str.479-487, Galén, 2002, ISBN 807262-201-3

49

Zima T, Kazda A.,Drábková J.,Laboratorní diagnostika, Laboratorní diagnostika v intenzivní medicíně, str.426-443, Galén, 2002, ISBN 80-7262-201-3

50

Seznam použitých obrázků a tabulek: Obrázek 1. Vztahy SIRS, infekce a sepse a jejich hlavní příčiny vzniku ............................12 Obrázek 2 Kinetika hladin vybraných cytokinů v čase ........................................................20 Obrázek 3 Schéma turbidimetrie ..........................................................................................23 Obrázek 4 Analyzátor UniCel DxC 800 - celkový pohled ...................................................23 Obrázek 5 Analyzátor UniCel DxC 800 - detailní pohled ....................................................24 Obrázek 6 Obecné schéma nekompetitivní enzymoimunoanalýzy ......................................25 Obrázek 7 Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800 ...................................................26 Obrázek 8 Analyzátor UniCel DxC 880i : zleva - UniCel DxI 800, modul UCTA, UniCel DxC 800 ................................................................................................................................27 Obrázek 9 Analyzátor Roche Cobas e411 ............................................................................28 Obrázek 10 Princip stanovení PCT .......................................................................................29 Obrázek 11 Ţádanka na biochemické vyšetření ...................................................................30 Obrázek 12 Graf počtu poţadavků na vyšetření CRP ..........................................................34 Obrázek 13 Graf počtu poţadavků na vyšetření PCT...........................................................34 Obrázek 14 Graf počtu poţadavků na vyšetření IL-6 ...........................................................35 Obrázek 15 Graf vývoj hodnot zánětlivých markerů pacient č.1 .........................................39 Obrázek 16 Graf vývoj hodnot zánětlivých markerů pacient č.2 .........................................41 Obrázek 17 Graf vývoj hodnot zánětlivých markerů pacient č.3 .........................................43 Tabulka 1 Přítomnost příznaků u jednotlivých stádií sepse ...................................................9 Tabulka 2. Seznam a frekvence biochemických vyšetření pro monitoring změn v iontovém a intermediárním metabolismu během sepse ........................................................13 Tabulka 3. Rozsah hodnot PCT a jejich vztah ke klinickému stavu.....................................16 Tabulka 4 Doba stanovení jednotlivých markerů .................................................................31 Tabulka 5 Ekonomika stanovení...........................................................................................33

51