24 BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Perangkat lunak validasi metode analisis ini dibuat dengan menggunakan perangkat lunak pemograman yang biasa dipakai yaitu Microsoft Visual Basic 6.0, dimana perangkat lunak pemograman ini merupakan perangkat lunak berbasic bahasa Basic yang bersifat lebih flexibel dan mudah untuk digunakan terutama untuk programmer pemula dibandingkan bahasa pemograman yang lain. Pada perangkat lunak pemograman ini digunakan beberapa fitur yang mendukung dalam pembuatan perangkat lunak validasi metode analisis, yaitu fitur ADO-DB yang merupakan bagian middle-ware dari Microsoft Visual Basic sebagai fitur database yang menghubungkan visual basic dengan Microsoft Jet dan Microsoft Access sebagai perangkat lunak berbasis database sehingga memungkinkan perangkat lunak validasi metode analisis ini untuk menyimpan data yang dimasukkan kedalam program. Selain itu, fitur lainnya adalah fitur MS-Flex Grid yang merupakan fitur pembuatan tabel, pengisian tabel dan perubahan data dalam tabel, serta fitur web browser sebagai fitur yang berhubungan langsung dengan Internet Explorer yang dapat berfungsi sebagai media cetak sehingga data yang telah diproses dan diperoleh hasil atau kesimpulannya dapat dicetak pada media kertas. Selain itu juga perangkat lunak validasi metode analisis ini menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel XP sebagai media pendukung diluar Microsoft Visual Basic yang digunakan untuk membuat grafik regresi linier dari kurva kalibrasi yang dilakukan perangkat lunak. Perangkat lunak validasi metode analisis terbagi dalam empat bagian besar modul yaitu modul introduksi, modul input data, modul output data, dan modul validasi metode analisis. Pada modul introduksi ditampilkan form yang muncul pertama kali ketika pengguna menjalankan perangkat lunak ini. Didalam form ini terdapat dua combo-box yaitu combo-box untuk nama proyek, dan combo-box untuk nama percobaan. Combo-box nama proyek diisi oleh pengguna dengan nama yang dikehendaki pengguna dan ketika suatu nama proyek dituliskan didalam combo-box ini maka program akan secara otomatis menyimpan nama tersebut didalam database perangkat lunak. Combo-box nama percobaan merupakan combo-box untuk menuliskan nama percobaan dan seperti combo-box nama proyek combo-box ini secara otomatis akan menyimpan nama percobaannya didalam database program. Suatu proyek dalam perangkat lunak ini memungkinkan untuk melakukan beberapa percobaan sehingga setiap percobaan yang dilakukan dan dimasukkan
25 kedalam perangkat lunak dikelompokkan berdasarkan nama proyek yang dituliskan oleh pengguna didalam program ini. Adapun jenis percobaan yang dapat dilakukan dalam perangkat lunak ini ada 6 jenis percobaan yang terbagi dalam dua bagian yaitu jenis percobaan dengan metode kurva kalibrasi yaitu metode untuk membuat kurva kalibrasi dari suatu percobaan dengan input data atau jumlah pengukuran yang dilakukan lebih dari 6 pengukuran dan jenis percobaan yang lain adalah metode single data yaitu metode analisis dengan menggunakan satu kali pengukuran dimana metode ini lebih bersifat penentuan kadar sampel uji dengan menggunakan satu kali pengukuran. Dari setiap metode yang berdasarkan jumlah pengukuran tersebut dibagi dalam tiga jenis metode baku yang digunakan yaitu metode baku luar, metode baku dalam dan metode baku tinambah. Jadi dalam satu proyek, pengguna dapat membuat percobaan yang terdiri enam jenis percobaan dengan jumlah percobaan dalam satu proyek tidak dibatasi. Pada perangkat lunak ini, apabila pengguna menuliskan nama proyek dan nama proyek tersebut telah ada dan tersimpan sebelumnya didalam program, maka program akan langsung mengacu pada proyek yang telah ada tersebut, dan begitu pula untuk nama percobaannya dalam proyek tersebut. Sehingga apabila pengguna menuliskan nama proyek dan nama percobaan yang sama dengan yang telah tersimpan didalam program, maka secara otomatis perangkat lunak akan memberitahu pengguna bahwa percobaan ini telah ada dan akan memanggil kembali data-data yang telah tersimpan didalam percobaan tersebut apabila pengguna menjalankan perangkat lunak dengan nama yang sama tersebut. Modul kedua dari perangkat lunak ini adalah form input data. Pada form input data ini form yang akan muncul adalah form berdasarkan pilihan jenis percobaan yang dipilih pengguna pada form introduksi, jadi apabila pengguna memilih jenis percobaan metode kurva kalibrasi dengan metode baku dalam, maka form yang akan muncul pada form input data adalah form khusus untuk metode kurva kalibrasi dengan menggunakan metode baku dalam, begitu pula untuk metode yang lainnya. Untuk setiap metode dalam form input data dengan pilihan metodenya adalah metode kurva kalibrasi terdapat empat jenis input data yang terdapat didalamnya yaitu input data untuk kalibrasi, input data untuk akurasi dan presisi, input data untuk akurasi dan presisi interday, dan input data untuk penentuan spesifisitas. Seluruh input data yang ada dalam program ini mengacu pada parameter yang digunakan dalam kromatografi cair kinerja tingga (KCKT) dan kromatografi gas. Untuk form input data dengan pilihan metode
26 kalibrasi dengan baku luar parameter yang digunakan adalah konsentrasi sampel uji dengan satuan (µg/mL) dan luas kromatogram sampel dengan satuan mV.det untuk input data kalibrasi, sedangkan untuk input data akurasi dan presisi parameter yang digunakan adalah berat sampel teoritis dalam satuan mg, luas kromatogram dengan satuan mV.det, serta faktor pengenceran. Untuk input data akurasi dan presisi interday parameter yang digunakan sama dengan parameter akurasi dan presisi tetapi didalam form ini terdapat pilihan untuk menentukan jumlah data dan jumlah hari yang ingin dimasukkan kedalam program. Dan input data yang terakhir adalah input data spesifisitas dengan parameter yang digunakan adalah parameter yang digunakan dalam uji kesesuaian sistem dalam KCKT dan kromatografi gas yaitu waktu retensi terbesar dan terkecil, lebar alas kromatogram, lebar kromatogram pada 5 % tinggi, dan jarak dari maksimum ke tepi kromatogram (f) serta parameter waktu retensi terhadap luas kromatogram untuk penentuan keberulangan penyuntikan. Untuk input data kalibrasi, input data akurasi dan presisi, input data akurasi dan presisi interday serta keberulangan penyuntikan setiap pengguna memasukkan data akan tersimpan dalam tabel
yang telah tersedia dengan
terdapat pilihan simpan, edit, dan hapus untuk menyimpan dan merubah dan menghapus input data yang dimasukkan kedalam tabel tersebut. Untuk metode kurva kalibrasi dengan menggunakan baku dalam parameter yang digunakannya adalah konsentrasi sampel uji, luas kromatogram sampel uji, konsentrasi baku dalam, dan luas kromatogram baku dalam. Untuk input akurasi dan presisinya parameternya adalah berat sampel teoritis, angka banding luas kromatogram sampel uji dengan baku, serta faktor pengenceran. Untuk metode kurva kalibrasi dengan baku tinambah parameter yang digunakan adalah konsentrasi sampel uji, konsentrasi sampel uji yang ditambahkan
dan luas kromatogram. Untuk input akurasi dan presisinya
parameternya adalah berat sampel uji, berat baku yang ditambahkan, luas kromatogram dan faktor pengenceran. Untuk input data spesifisitas, pada satu proyek terdapat satu input data spesifisitas, sehingga pada beberapa percobaan dengan proyek yang sama, input spesifisitas pada setiap metode baku akan mengacu pada pada input spesifisitas yang sama. Setelah input data dimasukkan, perangkat lunak akan melakukan pengujian dengan mengecek apakah nilai yang dimasukkan adalah nol semua, pengecekan jumlah input data yang ada apakah kurang atau lebih dari 6 input data untuk kalibrasi dan penentuan akurasi dan presisi, serta 3 input data minimal untuk keberulangan penyuntikan.
27 Form output data pada perangkat lunak validasi metode analisis ini akan ditampilkan kembali data-data dari input data kalibrasi pada tabel kemudian program akan melakukan perhitungan
berdasarkan perintah yang dimasukkan kedalam perangkat lunak selama
perancangan sesuai dengan rumus perhitungan yang telah ditetapkan. perangkat lunak akan menampilkan nilai untuk setiap parameter yang ada yaitu jumlah, rata-rata, jumlah kuadrat, serta simpangan bakunya serta jumlah input data yang dimasukkan. Parameter yang menjadi acuan dalam pembuatan garis regresi berbeda-beda untuk setiap metode baku, dimana konsentrasi sampel uji terhadap luas kromatogram adalah parameter untuk metode baku luar, konsentrasi sampel uji terhadap angka banding luas kromatogram uji dengan baku adalah parameter untuk metode baku dalam, dan konsentrasi baku terhadap luas kromatogram parameter untuk metode baku tinambah. Pada form output ini program akan menghitung dan menampilkan nilai untuk regresinya yaitu kemiringan garis (b), intercept atau garis perpotongan terhadap sumbu Y (a), nilai gawat t (n-2), koefisien korelasi (r), simpangan baku terhadap regresi (Sy/x), koefisien variansi regresi (Vx0), dan rasio respon yang khusus untuk metode baku dalam dengan menggunakan rumus perhitungan yang telah ditetapkan yang ditulis pada saat coding program selama perancangan dengan bahasa yang dapat dibaca oleh perangkat lunak perancang. Pada form output ini juga terdapat tombol untuk melihat grafik regresi linier yang dihasilkan dengan secara langsung akan membuka perangkat lunak pendukung Microsoft Excel dan akan ditampilkan grafik yang dihasilkan. Modul terakhir pada perangkat lunak ini adalah form validasi yang terbagi dalam tiga bagian validasi, yaitu validasi linieritas, validasi akurasi dan presisi, serta validasi spesifisitas. Pada validasi linieritas ditampilkan kembali data-data yang diperlukan untuk validasi linieritas yaitu kemiringan garis (b), intercept atau garis perpotongan terhadap sumbu Y (a), nilai gawat t (n-2), koefisien korelasi (r), simpangan baku terhadap regresi (Sy/x), koefisien variansi regresi (Vx0) dan dilakukan perhitungan oleh program ini nilai slope antar data pada data-data untuk kurva kalibrasi, dilakukan perhitungan nilai batas deteksi dan batas kuantitasi yang terbagi menjadi batas deteksi dan batas kuantitasi menurut IUPAC dan menurut Miller, dimana nilai untuk IUPAC akan dapat ditampilkan apabila jumlah pengukuran yang dilakukan lebih dari 20 pengukuran. Kemudian ditampilkan kesimpulan untuk validasi linieritas yaitu persamaan garis regresi linier yang dihasilkan, koefisien korelasi (r) yang dihasilkan harus lebih besar dari 0,997 sebagai koefisien korelasi untuk bahan obat, koefisien variasi regresi (Vx0) harus lebih kecil dari 2
28 % dan nilai gawat t (n-2) dengan aras keberartian 0,05 yang menunjukkan adanya korelasi yang signifikan antara sumbu X dan sumbu Y. Dari hasil perhitungan perangkat lunak validasi metode analisis ini dengan menggunakan data percobaan dari hasil penelitian terhadap lisinopril yang menggunakan kurva kalibrasi dengan metode baku luar didapatkan bahwa nilai yang diperoleh untuk persamaan garis adalah y = 29785,292x + 110972,057, dengan koefisien korelasinya adalah 0,9997 dan nilai batas deteksi adalah 12,097 µg/ml, dan batas kuantitasi adalah 40,323 µg/ml. Sedangkan dari hasil penelitian persamaan garis yang diperoleh adalah y = 29688,10x + 113306,17, dengan koefisien korelasinya adalah 0,9997 dan nilai batas deteksi adalah 12,80 µg/ml dan batas kuantitasi adalah 42,67 µg/ml. Form validasi akurasi dan presisi ditampilkan dengan menampilkan kembali tabel input data akurasi dan presisi pada tabel baru, kemudian dilakukan perhitungan berat sampel hasil pengukuran pada tabel tersebut dengan cara menginterpolasi luas kromatogram yang diperoleh terhadap persamaan garis yang diperoleh pada kurva kalibrasi dan mengkalikan konsentrasi yang didapat dengan faktor pengenceran menjadi nilai berat sampel hasil pengukuran. Persen perolehan kembali dan persen perolehan kembali rata-rata ditampilkan didalam form ini. Untuk validasi presisi dilakukan perhitungan simpangan baku relatif atau standar deviasi dari persen perolehan kembali dengan menggunakan rumus yang telah ditetapkan, serta dihitung simpangan baku relatif berdasarkan kurva terompet Horwitz (reproduksibilitas), dalam perangkat lunak ini konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi 100 % sehingga nilai reproduksibilitasnya ada 2 %. Kesimpulan presisi ditentukan dengan membandingkan simpangan baku relatif dari persen perolehan kembali yang harus kurang dari reproduksibilitas (2 %) untuk mendapatkan nilai presisi yang baik. Dari hasil perhitungan dengan perangkat lunak validasi metode analisis kromatografi ini dengan metode baku luar didapatkan bahwa terdapat perbedaan nilai perolehan kembali ketika dibandingkan dengan nilai perolehan kembali dari hasil penelitian yang menjadi sumber. Hasil penentuan akurasi dan presisi berdasarkan kurva kalibrasi lisinopril dari hasil penelitian didapatkan rata-rata persen perolehan kembali adalah 99,87 % dengan simpangan baku relatifnya adalah 1,1 %. Sedangkan dari hasil perhitungan perangkat lunak validasi metode analisis ini didapatkan nilai persen perolehan kembali rata-rata adalah 92,856 % dengan nilai simpangan baku relatifnya adalah 1,103 %. Perbedaan nilai
29 persen perolehan kembali ini dapat disebabkan karena tidak tercantumnya nilai faktor pengenceran yang pasti, sehingga faktor pengenceran yang yang dimasukkan penulis pada bagian input data adalah faktor pengenceran dari perhitungan pada prosedur percobaan yang dilakukan pada penelitian tersebut. Pada form validasi akurasi dan presisi ini juga terhubung dengan form validasi akurasi dan presisi interday, dimana pada form ini dilakukan perhitungan akurasi dan presisi interday berdasarkan input data yang dimasukkan pada bagian input data akurasi dan presisi interday. Pada form ini dilakukan perhitungan berat hasil pengukuran dari setiap data yang dimasukkan, kemudian ditentukan persen perolehan kembali berdasarkan pada data yang sama tetapi berbeda hari, serta persen perolehan kembali rata-rata total untuk seluruh data. Simpangan baku relatif dihitung berdasarkan persen perolehan kembali rata-rata total . Form validasi spesifisitas ditampilkan dengan menampilkan kembali data-data yang dimasukkan dalam keberulangan penyuntikan kemudian dilakukan perhitungan simpangan baku relatif dari waktu retensi dan luas kromatogram. Pada form ini juga dilakukan perhitungan untuk nilai pemisahan (resolusi), angka lempeng (N), asimetri (As), faktor kapasitas (k’) dan faktor selektivitas (α). Hasil dari perhitungan diatas kemudian dibandingkan dengan nilai-nilai menurut pustaka, dan ditampilkan memenuhi syarat atau tidaknya parameter-parameter spesifisitas tersebut. Dari hasil penelitian penetapan kadar lisinopril dalam sediaan tablet dengan KCKT ini tidak mencantumkan data-data spesifik mengenai waktu retensi terbesar dan terkecil, lebar alas kromatogram, dan data untuk asimetri, sehingga penulis tidak dapat membandingkan nilai spesifisitas yang diperoleh perangkat lunak validasi metode analisis dengan nilai spesifisitas dari hasil penelitian. Sedangkan untuk simpangan baku relatif untuk waktu retensi dan luas kromatogram menunjukkan perbedaan dimana dari hasil penelitian SBR waktu retensinya adalah 0,13 % dan SBR luas kromatogramnya adalah 0,35 %. Sedangkan menurut hasil perhitungan perangkat lunak validasi metode analisis didapatkan SBR waktu retensi adalah 0,095 % dan SBR luas kromatogram adalah 0,031%. Dari seluruh form validasi metode analisis ini terhubung dengan form khusus yang digunakan untuk mencetak hasil validasi beserta kesimpulannya kedalam media kertas, form ini menggunakan fitur pendukung Microsoft Visual Basic yaitu Web Browser dimana
30 hasil dari perhitungan validasi memungkinkan untuk dikonversikan dan ditampilkan ke dalam Web Browser dan kemudian dicetak ke dalam media kertas. Pada modul single data, dilakukan perhitungan penentuan kadar sampel apabila menggunakan metode analisis dengan menggunakan satu kali pengukuran. Pada metode single data baku luar parameter yang digunakan adalah luas kromatogram sampel uji dengan satuan mV.det, konsentrasi baku dengan satuan µg/mL, luas kromatogram baku, dan luas kromatogram blangko. Biasanya metode baku luar dengan satu kali pengukuran ini dilakukan apabila tidak terdapatnya galat tentu atau galat sistem. Sedangkan untuk metode single data baku dalam parameter yang diukurnya adalah konsentrasi analit pembanding, luas kromatogram analit pembanding, konsentrasi baku, luas kromatogram baku, dan luas kromatogram sampel uji. Pada perhitungannya sebelum penentuan kadar sampel dihitung, perangkat lunak akan menghitung dulu nilai rasio respon (k) dengan melalui perhitungan baku dalam tunggal antara analit pembanding dengan baku dalam, setelah nilai ratio respon diperoleh, maka penentuan kadar sampel uji dihitung terhadap konsentrasi dan luas kromatogram baku. Untuk single data metode baku tinambah, perhitungan dilakukan berdasarkan luas kromatogram sampel sebelum ditambahkan baku dan setelah ditambahkan baku.
