BAB 4
HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN
Validasi merupakan proses penilaian terhadap parameter analitik tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi syarat sesuai tujuan penggunaannya. Pengujian parameter kecermatan dilakukan metode spikedplacebo recovery dengan menggunakan 3 plasebo dan 3 larutan baku. Sampel yang digunakan memiliki kandungan zat aktif sebesar 0,02% sehingga kriteria kecermatan yang diperbolehkan untuk rata-rata persen perolehan kembali sebesar 90-107%. Dari hasil pengukuran larutan baku dan sampel serta koreksi dari plasebo, diperoleh rata-rata persen perolehan kembali sebesar 99.49 ± 1.59%. Berdasarkan parameter kecermatan, pengukuran sampel dengan rata-rata perolehan kembali 99.49 ± 1.59% memenuhi syarat rentang persen perolehan kembali. Dari data tersebut dapat diketahui bahwa larutan baku dan larutan sampel setelah penyaringan memiliki konsentrasi diklazuril yang hampir sama dan terjadi pemisahan sempurna antara diklazuril dengan β karoten, zeaxantin, dan xantofil yang diduga dapat mengganggu pengukuran. Hal ini karena silika gel memiliki sifat yang polar sehingga dapat mengikat atau menahan senyawa-senyawa yang terdapat dalam bahan pembawa tersebut dan diklazuril dapat secara langsung dilewatkan karena bersifat lebih nonpolar. Selain itu, fungsi kromatografi kolom ini adalah untuk menyaring partikelpartikel yang besar agar tidak dapat melewati kolom dan tidak terelusi.
16
17 Tabel 1. Pengukuran Kecermatan
Baku Konsentrasi
Rata-rata
Sampel Kadar
Perolehan
(mg/mL)
Kembali
Serapan
Serapan
0.2464
0.2462
0.016
0.2533
0.2499
0.016
0.2443
0.2492
0.016
0.2479
0.2457
0.015
0.2478
0.2447
0.015
0.24794±(0.0032)
0.24714±(0.0022)
0.016
0.3231
0.3142
0.020
0.3211
0.3178
0.020
0.3255
0.3228
0.020
0.3043
0.3222
0.020
0.3120
0.3259
0.021
0.31720±(0.0084)
0.32058±(0.0044)
0.020
0.4414
0.4347
0.028
0.4496
0.4389
0.028
0.4276
0.4382
0.028
0.4232
0.4366
0.028
0.4313
0.4403
0.028
0.43462±(0.0100)
0.43774±(0.0020)
0.028
0,016mg/mL
0,02mg/mL
0,028mg/mL
98.4%
100.07%
99.99%
Keterangan : nilai rata-rata serapan blanko sebesar 0.00316±(0.0003) digunakan sebagai koreksi dari sampel Pengujian parameter keseksamaan sistem atau keseksamaan sistem dilakukan untuk pengujian sistem yang digunakan yaitu spektrofotometer ultraviolet Beckmann DU-600 dan dilakukan pengukuran berulang sebanyak 6 kali pengukuran menggunakan baku 0.020mg/mL pada λ 282 nm. Hasil pengukuran memiliki rataan serapan sebesar 0.27475 ± 0.0015 dan koefisien variansi sebesar 0,673%. Kriteria koefisien variansi yang diperbolehkan untuk konsentrasi 0,020 mg/mL adalah kurang dari 2%. Dari hasil pengujian Keseksamaan sistem menunjukkan bahwa alat spektrofotometri ultraviolet Beckmann DU-600 yang digunakan memenuhi persyaratan dan memiliki ketertiruan dan keterulangan yang tinggi. Keterulangan ini diperlukan dalam pengukuran analit dalam jumlah yang besar.
18
Tabel 2. Pengukuran Keseksamaan Sistem
Pengukuran
Absorbansi
1
0.2764
2
0.2774
3
0.2745
4
0.2743
5
0.2724
6
0.2735
Rataan
0.27475±(0.0015)
SB
0.00185
KV
0.673%
Kriteria
KV≤2%
Pengujian keseksamaan metode yang digunakan untuk mengetahui keterulangan metode yang dilakukan yaitu dengan pengukuran sebanyak 6 sampel 0.020 mg/mL pada λ 282 nm. Hasil pengujian diperoleh rataan sebesar 0.274 ± 0.0009 dengan koefisien variansi 0.415%. Kriteria kofisien variansi yang diperbolehkan untuk konsentrasi 0,020 mg/mL adalah kurang dari 2%. Hasil pengujian keseksamaan metode menunjukkan bahwa metode yang digunakan memenuhi persyaratan keseksamaan dan dapat digunakan untuk sampel dalam jumlah besar.
19 Tabel 3. Pengukuran Keseksamaan Metode
Pengukuran
Absorbansi
1
0.2754
2
0.2737
3
0.2744
4
0.2748
5
0.2725
6
0.2755
Rataan
0.27438±(0.0009)
SB
0.00114
KV
0.415%
Kriteria
KV≤2%
Kelinieran adalah kemampuan metode analisis menunjukkan respon secara langsung atau matematis, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada rentang tertentu. (Ibrahim, 2005). Penentuan kurva kalibrasi dilakukan dengan menggunakan 5 larutan baku dengan konsentrasi 0.012mg/mL; 0.016mg/mL; 0.020mg/mL; 0.024mg/mL dan 0,028 mg/mL pada λ 282 nm. Dari pengukuran diperoleh persamaan garis linear Y = 0.004844 + 15.505 X dengan koefisien korelasi (r) 0.999 dan nilai koefisien variasi fungsi regresi (Vx0) yang diperoleh adalah 1.725%. Hasil percobaan menunjukkan Vx0 masih berada dalam batas yang diperbolehkan. Nilai Vx0 yang kecil menandakan kelinieran yang cukup, biasanya Vx0 ≤ 2.0% digunakan untuk kurva baku penetapan kadar obat dalam sediaan atau bahan baku (Ibrahim,2005). Untuk mengetahui adanya korelasi antara konsentrasi dan hasil pengukuran absorbansi dilakukan pengujian t gawat. Hasil pengujian t gawat menunjukkan t hitung 36.637 jauh lebih besar daripada t tabel untuk aras keberartian 0.05 dan derajat kebebasan 4 yaitu sebesar 2.132 dan hasil ini menunjukkan terdapatnya korelasi antara konsentrasi dan hasil pengukuran absorbansi.
20 Tabel 4. Pengukuran Linieritas
Konsentrasi
Absorbansi
0.012mg/mL
0.1882 0.1901 0.1894 0.1946 0.1978 0.19202±(0.0034) 0.2464 0.2533 0.2443 0.2479 0.2478 0.24794±(0.0028) 0.3231 0.3211 0.3255 0.3043 0.3120 0.31720±(0.0075) 0.3794 0.3827 0.3853 0.3854 0.3819 0.38294±(0.0024)
0.016mg/mL
0.020mg/mL
0.024mg/mL
0.4414 0.4496 0.4276 0.4232 0.4313 0.43462±(0.0092)
0.028mg/mL
Kurva Kalibrasi
Absorbansi
0.5 0.4 0.3 y = 15.505x + 0.0048
0.2
2
R = 0.998
0.1 0 0
0.01
0.02
0.03
Konsentrasi (mg/mL)
Gambar 2. Hubungan konsentrasi terhadap absorbansi
21
LOD = LOQ =
3.3S y x b 10 S y x b
= =
3.3 × 5.35 × 10−3 = 1.14 × 10−3 mg/mL 15.505
10 × 5.35 × 10−3 = 3.45 × 10−3 mg/mL 15.505
Kepekaan hasil analisis ditunjukkan oleh parameter batas deteksi dan batas kuantisasi. Batas deteksi adalah konsentrasi analit terkecil yang memberi sinyal instrumen yang berbeda secara “nyata” dari sinyal blanko dan sinyal latar belakang. Sedangkan batas kuantisasi adalah konsentrasi analit terkecil yang masih dapat dikuantisasi secara cermat dan seksama (Ibrahim, 2004). Batas deteksi dan batas kuantisasi metode perlu ditentukan kalau metode tersebut digunakan untuk menganalisis sampel yang mengandung analit berkadar rendah. Batas deteksi dan kuantisasi ini ditentukan dari data kurva kalibrasi. Hasil perhitungan menunjukkan batas deteksi 1.14 µg/mL dan batas kuantisasi 3.45 µg/mL dan semua konsentrasi baku yang digunakan untuk kurva kalibrasi berada di atas batas kuantisasi. Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analis, instrumen lot pereaksi, waktu, suhu, hari yang berbeda. Untuk uji ketangguhan pada penelitian ini dilakukan pengujian dalam hari dan pengujian antar hari. Pada pengujian dalam hari, pengujian dilakukan pada pagi hari dan sore hari untuk baku 0.028 mg/mL pada λ 282 nm dan dihitung koefisien variansinya. Dari pengukuran yang dilakukan pada pagi hari memiliki koevisien variansi 2.21% sedangkan pada sore hari, koefisien variansinya adalah 1.40%. Koefisien variansi pada pagi hari dan sore hari memenuhi kriteria koefisien variansi untuk larutan dengan konsentrasi 9.028 mg/mL sebesar 3.426% sehingga keseksamaan dalam hari tinggi, dan pengujian dalam hari tidak berbeda bermakna. Pada pengujian antar hari, dilakukan pengukuran baku 0.020 mg/mL yang sama selama 3 hari dan hasil pengukuran yang telah dianalisis variansinya, nilai Fhitung sebesar 1 lebih kecil dari Ftabel sebesar 3.87 untuk aras 0.05 maupun 7.19 untuk aras 0.01. Fhitung < Ftabel, maka keseksamaan antar hari tinggi, dan pengujian antar hari tidak berbeda bermakna.
22 Tabel 5. Pengukuran Keseksamaan Dalam Hari
Absorbansi
Pengukuran Pagi
Sore
1
0.4414
0.4237
2
0.4496
0.4312
3
0.4276
0.4152
4
0.4232
0.4179
5
0.4313
0.4167
Rataan
0.43462±(0.0092)
0.42094±(0.0056)
SB
0.0096
0.0059
KV
2.21%
1.40%
Tabel 6. Pengukuran Keseksamaan Antar Hari
Pengukuran
Absorbansi Hari ke 1
Hari ke 3
1
0.2764
0.2761
2
0.2774
0.2899
3
0.2745
0.2945
4
0.2743
0.2993
5
0.2724
0.2753
6
0.2735
0.2839
7
0.2789
0.2831
Rataan
0.27534±(0.0018)
0.2860±(0.0032)
SB
0.00249
0.00836
KV
0.904%
2.920%
23
JK total =
∑x
2
(∑ x) −
2
nT
JK total = 1.1038-
15.4410 =0.00087 14
(∑ x ) + (∑ x ) − (∑ x) 2
JK perlakuan = JK perlakuan =
2
1
2
2
n1
n2
nT
3.7149 4.0084 15.4410 =0.0004 + 7 7 14
JK galat = JKTotal − JK Perlakuan JK galat = 0.00087 − 0.0004 = 0.00047
Tabel 7. Perhitungan Uji F Sumber
JK
dk
KR (JK/dk)
Perlakuan
0.0004
6
0.000067
Galat
0.00047
7
0.000067
Total
0.001
13
Fhitung = F( 6,7 ) =
KR perlakuan KRgalat
=1
Untuk Aras 0.05; Ftabel = 3.87 Untuk Aras 0.01; Ftabel = 7.19 Fhitung < Ftabel, maka presisi antar hari tinggi, antar hari tidak berbeda bermakna.
