111. METODE KERJA
3 . 1 . Waktu dun rempat penelitian P e n e l i t i a n d i l a k u k a n pada l a b o r a t o r i u m B i o k i m i a J u r u s a n Kimia, F a k u l t a s M a t e m a t i k a dan Flmu P e n g e t a h u a n Alam, IPBBogor;
dan
di
Laboratorium
Patologi
Veteriner
Fakultas
K e d o k t e r a n Hewan, IPB-Bogor, pada bulan S e p t e m b e r 1999 s a m p a i d e n g a n b u l a n ApriI 2000; dan d i l a n j u t k a n k e m b a l i d i Rumah S a k i t Umum Fakultas Kedokteran Universitas K r i s t e n I n d o n e s i a , J a k a r t a , dan d i Laboratorium Terpndu, Analisa Kimia, l n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor, d a r i bulan Mei 200 1 sampai dengan Agustus 2 0 0 1 .
3.2. Bahan dun ACat Hewan p e r c o b a a n yang dipergunakan d a l a m p e n e l i t i a n i n i a d a l a h marmut ( C a v i a p o r c e l l u s ) j a n t a n , umur 3-6 bulan, b o b o t s e k i t a r 2 0 0 - 500 gram, berasal d a r i B a l a i P e n e l i t i a n V e t e r i n e r , Bogor. M a r m u t m e n j a d i pilihan karena mencit, t i k u s d a n k e l i n c i , produksi
urinnya
sangat
sedikit
sehingga
tidak
cukup
untuk
dilakukan analisa. Asam j e n g k o l a t dimurnikan d a r i buah j e n g k o l yang t u a d a n s e g a r , yang d i b e l i d a r i pasar Bogor. Untuk p e m e l i h a r a a n h e w a n , d i p a k a i k a n d a n g tunggal yang d i l e n g k a p i a l a t p e n a m p u n g urin, d a n makanan hewan b e r u p a rumput, k u l i t j a g u n g m a n i s muda, d a n p e l l e t makanan ayam petelur. Bahan d a n a l a t l a i n n y a a d a l a h B ~ ( O H ) Z5 H z 0 , HzS04 2N, NaOH 6 N , a s a m A s e t a t Glasial 9696, HCl I N , r e a g e n s i a N i n h y d r i n , NaOH l o % , Pb-Asetat 5 % , l a r u t a n G i e m s a , p e w a r n a H e m a t o x y l l i n Eosin, s a r i n g a n Buchner, s e n t r i f u s u l t r a m e r k B e c k m a n , pH m e t e r merk
Horiba,
neraca
analitik
Ohaus,
sentrifus
mikro,
mesin
pengering,
b e j a n a d a n p e l a t K r o m a t o g r a f i L a p i s T i p i s (KLT),
mikroskop biasa, a l a t pembesar f a s e kontras, mikroskop khusus beserta peralatan foto, kamera merk Kodak, a l a t ukur kreatinin merk Coba M i r a Plus, kertas pH 0-14 buatan Merck. Juga dilakukan pemeriksaan tambahan, yaitu pemeriksaan
LD50 d e n g a n m e m a k a i l a r v a u d a n g ( A r r e m i a s a l i n a L e a c h ) ; u j i toksisitas
untuk
pemeriksaan
asam
jengkolat,
makroskopik
CS2,
sederhana
dan
pada
merkaptoetanol;
alat
genitourinaria
marmut saat dibedah; dan pemeriksaan bau jengkol pada urin, feses dan rongga tubuh setelah dibedah. 3 . 3 . Tahapan kerja
3 . 3 . 1 . Pernurnian a s a m j e n g k o l a t Dilakukan pemurnian asam jengkolat ekstraksi
yang
dikembangkan
oleh
van
melalui metode
Veen
dan
Hyman
(1935), yang telah dimodifikasi seperlunya oleh du Vigneaud
dan Patterson (1936), d a n kemudian oleh Oen, Simamora, dan Kusumahastuti (1972) diubah seperlunya. Bahan yang dipakai adaIah jengkol segar, dibeli dari pasar Bogor. Protokol kerja : . Jengkol
segar
14
buah,
dibuang
kulit
keras/halus.
dipotong kecil-kecil, lalu ditimbang 170-175 gram. Potongan ini dibiender selama 15 menit bersama 50 gram Ba(OH)2.5Hz0 dan sedikit air, sampai jadi bubur halus kentzl. Campuran diencerkan dengan air sampai menjadi 1 liter, dan diperiksa PH ( p H 1 1 ) . Bubur didiamkan semalam dalam lemari es, besoknya disaring pakai saringan Buchner, filtrat kuning muda diambil, d a n k e d a l a m f i l t r a t d i t a m b a h k a n H2S04 2 N p e r l a h a n s a m p a i
p H m e n j a d i 3.5, l a l u d i d i a m k a n s e m a l a m d a l a m l e m a r i e s . B a s 0 4 akan mengendap. B e s o k n y a e ~ d a p a nd i p i s a h k a n p a k a i s e n t r i f u s k e c e p a t a n
5000 r p m , s e l a m a 10 m e n i t . F i f t r a t d i a m b i l , d i u a p k a n d i a t a s p e n a n g a s a i r s a m p a i v o l u m e m e n j a d i 100 m l , l a l u d i t a m b a h NaOH 6 N s a m p a i pH 5.5. T e r l i h a t e n d a p a n a s a m j e n g k o l , d a n kemudian didiamkan semalam dalam lemari e s Besoknya
lagi,
endapan
disaring
pakai
saringan
Buchner. Dicuci 3 kali pakai alkohol absolut, dikeringkan dalam
pemanas
dengan
suhu
60
Hasil
OC.
kristal
yang
diperoleh, diperiksa. 3 . 3 . 2 . P e n g u j i a n hasZl p e m u r n i a n
3.3.2.1.Uji Ninhydrin ( H a w a b , 1989) Diambil
kertas
ditaburkan Reagen
saring
sedikit
bersih
serbuk
Ninhydrin
dan
hasil
kering,
pemurnian.
disemprotkan,
d i m a s u k k a n k e p e m a n a s s u h u 110
OC
lalu
selama 5
menit. Visualisai warna coklat keunguan yang muncul, menunjukkan adanya asam amino. 3 . 3 . 2 . 2 . U j i Belerang ( S u l i s t i y a n i , f 987)
Diambil serbuk hasil pemurnian sebanyak 4 mg, lalu
dimasukkan
dalam
botol
reaksi,
dan
k e m u d i a n d i l a r u f k a n d e n g a n HC1 0.1N. D a l a m larutan
ditambahkan
5
ml
NaOH
d i p a n a s k a n d a l a m p e m a n a s s u h u 100
10% OC
dan
selzma
15 m e n i t . S e t e l a h i t u , d i b e r i 2 t e t e s l a r u t a n P b a s e t a t 5%, d a n p e m a n a s a n d i l a n j u t k a n 15 m e n i t lagi. Endapan hitam menunjukkan adanya sulfur.
3.3.2.3. U j i K r o m a t o g r a f i L a p i s T i p i s ( A s h w o r t h , 1969) Disiapkan
bejana
Dimasukkan
dan
pelat
KLT
kedalam bejana,
kering.
cairan eluen
terdiri dari n-butanol, asam asetat glasial dan air,
dengan
perbandingan
4
:
,
Lalu
ditempelkan kertas saring pada salah satu sisi bejana, dan ditutup agar suasana bejana jenuh d e n g a n u a p e l u e n . P e l a t KLT d i a m b i l , d a n ditandai jarak running 10 c m memakai pinsil arang. Sampel ditotolkan pada tanda bawah, lalu pelat tersebut dimasukkan pada bejana dengan garis bawah tepat diatas permukaan eluen.
Pelat
merembes
KLT
diangkat
setelah
eluen
sampai pada garis atas. Reagen
Ninhydrin
disemprotkan
keseluruh
areal
running. Bagian yang tervisualisasi
yaitu
bagian warna coklat keunguan diberi tanda, lalu diukur jaraknya terhadap garis bawah. Hasilnya menunjukkan nilai Rf. 3.3.2.4. U j i K e l a r u t a n d a l a m a i r ( O e n Ditimbang hasil pemurnian 10.0;
10.2;
pemurnian,
dan lalu
10.4
mg
m.1 9 7 2 ) . sebanyak
9.8;
serbuk
hasil
masing-masing
dilarutkan
d a l a m 1 0 ml a i r . D i p e r h a t i k a n t a b u n g y a n g semua larut dan yang masih a d a endapan. Kadar
tertinggi
dari
yang
semua
menunjukkan daya larut dalam air.
larut,
3.3.3. Persiapan hewan c o b a
M a r m u t (C. p o r c e l l u s ) j a n t a n
m u d a , 80 e k o r ,
umur 3-6 bulan, d i b e l i dari Balai Penelitian Veteriner Bogor. d i t a r u h s e n d i r i - s e n d i r i d a l a m k a n d a n g t e r p i s a h , kondisinya diseragamkan lebih d u l u selama sebulan. Diberi makanan campuran yaitu kulit jagung muda dan rumput,
ditambah
pelet
makanan
ayam
petelur.
M i n u m a n d i b e r i k a n s e s u k a n y a (ad l i b i f u r n ) . S e b e l u m perlakuan,
marmut
ditimbang
satu
persatu
dengan
ditimbang
pakai
timbangan merk Tanita. 3 . 3 . 4 . Penentuan satu dosis keracunan
Bubuk
asam
jengkolat
timbangan analitik merk Ohaus, sesuai berat badan marmut,
sejumlah
dosis
keracunan
untuk
marmut
bersangkutan. 1 (satu) dosis keracunan mengacu pada 1 (satu) dosis k e r a c u n a n p a d a m a n u s i a y a i t u a n a k u s i a a n t a r a 4-12 tahun, berat rata-rata
15.000 gram, makan 2 butir
jengkol:
dosis
Perhitungan
keracunan
untuk
tiap
marmut:
D = BB X DK X
Bt
X g
--------------BtP X BBAk
D
dosis tertimbang untuk i l c e k o k k a n pada marmut bersangkutan (mg) BB : B o b o t B a d a n m a r m u t ( g ) DK : 1 unit dosis keracunan untuk marmut (mg) Besarnya dosis peruntukannya memakai dasar: D X a ( a = n 2 + 2 n , n=0,1,2,3) :
P e m b e r i a n d o s i s k e r a c u n a n 0, 1 , 4, 8, 1 4 d o s i s Bt : B u t i r j e n g k o l r a t a - r a t a d i m a k a n a n a k ( 2 b u t i r ) g : gram asam jengkolat hasit ekstraksi BtP: B u t i r j e n g k o l u n t u k p e m u r n i a n ( I 4 b u t i r ) BBAk : B o b o t B a d a n A n a k r a t a - r a t a (15.000 g ) 3 . 3 . 5 . Rancangan percobaan
Marmut
dibagi
5
kelompok
perlakuan
dengan
10
ulangan, lalu dilakukan pencekokan bubuk asam jengkolat hasil isolasi : P e r l a k u a n A : d i c e k o k k a n 0 d o s i s d a l a m 2 ml a i r ( k o n t r o l ) Perlakuan B : dicekokkan
1 d o s i s d a l a m 2 ml a i r
P e r l a k u a n C : d i c e k o k k a n 4 d o s i s d a l a m 2 ml a i r Perlakuan D : dicekokkan 8 dosis dalam 2 ml air P e r l a k u a n E : d i c e k o k k a n 14 d o s i s d a l a m 2 ml a i r . Parameter untuk menyatakan perlakuan yang diberikan teiah menghasilkan keracunan jengkol bila didapat satu atau Iebih t a n d a - t a n d a s e b a g a i b e r i k u t : 1. Terjadi hematuria mikroskopik atau makroskopik
2. T e r d a p a t k r i s t a l a s a m j e n g k o l a t d a l a m u r i n
Tiap jam, selama 8 jam, diperiksa urin marmut :
warna d a n kekeruhan s e c a r a k a s a t m a t a , bau d e n g a n m e n c i u m n y a , p H d e n g a n k e r t a s L a k m u s M e r c k pH 0- 14,
butir e r i t r o s i t , k r i s t a l , d a n bentukan l a i n n y a , m e l a l u i p e m e r i k s a a n m i k r o s k o p i k p e m b e s a r a n 10 X 45. Rhusus untuk butir eritrosit, bila ditemukan eritrosit dalam
urin,
dilakukan
pemeriksaan
mikroskopik
kanjutan m e m a k a i f a s e k o n t r a s . U n t u k p H d i l a k u k a n u j i statistik.
C
3 . 3 . 6 . Pemeriksaan histopatologi
Setelah jam kedelapan, marmut dimatikan dengan pemberian khloroform, lalu dibedah. Cairan kandung kemih dan cairan perut d i a m b i l u n t u k d i u k u r pH; g i n j a l , u r e t e r d a n k a n d u n g k e m i h d i a m b i l untuk pemeriksaan histopatologi, pewarnaan hematoksilin-eosin. Pada pemeriksaan
histopatologi
ini, untuk setiap marmut
(ulangan), data pengamatan dibagi d a l a m 4 gradasi yaitu: n i l a i 0 (-) , b i l a t i d a k a d a k e l a i n a n ; nilai 1 ( + I ) , bila kelainan ringan ( < 2 5 %
wilayah)
nilai 2 (+2), bila kelainan sedang (25-50% wilayah) nilai 3 (+3), bila kelainannya berat (>50% wilayah) Tabel 11: Cara pemberian nilai untuk glomerulus N i l a i Glomerulus 0 +1 +2 +3 Densitas glomerulartuft Enwan di ruang Bowman Eridrosit di ruang Bowman hiembran basal ruatlg Bowman
tidak berubah tidak ada tidak ada
1 utuh
ditemukan pa& (25% dayah
ditemukan pada 25-50% wilayah
ditanukan pada >SO% wilayab
berkurang
belkmang
berhrang
ada
ada
ada
1 ada
1 ada
1 a&
1 menebal sampairusak
Catatan : gradasi nilai 0-12
1
menebal sampairusak
1 menebal sampairusak
Tabel 12: Cara pemberian n i l a i untuk kortek ginjal
Jaringan interstitial
tidak
ada
ada
Nsak
Catatan : gradasi n i l a i 0 - 2 1
ada
ada
Tabel 13: Cara pemberian n i l a i untuk medula ginjal N i l a i Medula 0 ginjal +1 +2 +3 ditemukan pada as%- +Jayah
25-50% wilayah
ditemukan pada >5W?wilayah
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
tidak ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ti& ads
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
EpiteI tubulus rusak
tidak
Vakuola sitoplasma
tidak
Inti s e l piknotik, karioreksis, kariolisis Endapan h i a l i n dilumen tubulus Debris di lumen tubulus
ada
dit-
pada
tidak
tidak Eritrosit ada ada dilumen tubulus Jaringan tidak ada interstitial ada rusak Catatan : gradasi n i l a i 0-21
Tabel 14: Cara pemberian nilai untuk ureter N i l a i Ureter
+1
+2
+3
ditemukan pada <25% wilayah
ditemukan pada 25-50% wilayah
diternukan pada 240% wilayah
0
Kerusakan dinding
tidak ada
ada
ada
ada
Eritrosit di lumen
tidak ada
ada
ada
ada
Endapan hialin di lumen
tldak ada
ada
ada
ada
Endapan debris di lwnen
ti& ada
ada
ada
a&
Catatan : gradasi nilai 0-12
T a b e l 15: C a r a p e m b e r i a n n i l a i u n t u k v e s i k a u r i n a r i a N i l a i Vesika urinaria
+1
-+ 2
+3
ditemukan pada -5% wilayah
ditemulcan pada 25-5% wilayah
ditemdcan pada >SO?? wilayah
0
Kerusakan dinding
tidak ada
ada
ada
ada
Eritrosit d i lumen
tidak ada
ada
ada
ada
Endapan hialin di lumen
tidak ada ada
ada
ada
Endapan debris di lumen
tidak ada ada
ada
ada
-
Catatan : gradasi nilai 0-12
Untuk
tiap
histopatologi antar
dosis
perlakuan,
dijumlahkan.
perlakuan
untuk
setiap
Selanjutnya,
melihat
ulangan
dilakukan
pengaruh
masalah pengujian
pemberian
dosis
keracunan asam jengkolat yang bertingkat. 3 . 3 . 7 . Pemeriksaan fungsi filtrasi Prinsip pemeriksaan: Fungsi (Glomerular
filtrasi
diperiksa
Filtration
Rate),
dengan melalui
mengukur cara
GFR
menghitung
ekskresi bahan d i urin d a n kadar bahan dalam plasma darah. Bahan
yang
dipakai
harus
dengan mudah
dapat
melalui
saringan glomerulus d a n tidak disekresi maupun direabsorpsi oleh
tubulus,
disamping
tidak
bersifat
racun,
tidak
dimetabolisir tubuh, tidak merusak fungsi filtrasi/sekresi, dan relatif mudah diukur dalam urin dan plasma. Bahan yang sangat sesuai untuk itu adalah I n u l i n , suatu polimer fruktosa dengan berat molekul 5200, yang didapatkan pada daun dahlia. Bahan ini sulit diperoleh, dan d a p a t d i g a n t i d e n g a n k r e a t i n i n ( c r e a t i n i n e ) , yaitu sampah metabolisme tubuh, yang tidak diperlukan tubuh sehingga harus dikeluarkan dari tubuh. Pemeriksaan klirens kreatinin dapat dipakai untuk manusia dan mamalia lain seperti kelinci d a n marmut. Protokol kerja: D i p a k a i 3 0 e k o r m a r m u t , u n t u k 3 p e r l a k u a n ( d o s i s 0, 1, d a n 14 k e r a c u n a n j e n g k o l ) d e n g a n 10 u l a n g a n . M a s u k k a n marmut d a l a m kandang tunggal, diberi pakan yang sesuai dan minuman s e c a r a sesukanya ( a d l i b i t u m ) , untuk penyeragaman kondisi.
Timbang marmut, untuk menetapkan dosis keracunannya. Jam 06.00: p e r l a k u a n 1, b e r i k a n 0 d o s i s k e r a c u n a n p e r l a k u a n 2, b e r i k a n
1 dosis keracunan
p e r l a k u a n 3, b e r i k a n 14 d o s i s k e r a c u n a n U n t u k k e t i g a p e r l a k u a n d i l a k u k a n 10 u l a n g a n . Pemberian asam jengkol dilakukan dengan pencekokan b a h a n y a n g t e l a h d i l a r u t k a n d a l a m 2 ml a i r b i a s a . Jam 08.00: Pasang penampung urin dibawah kandang. Penampung urin dibuat dari plastik, bagian tengahnya dipasang saringan dan ditampung dalam gelas piala 25 ml. Jam 08.00 keesokan harinya (24 jam): a. urin diambil, ukur volumenya, aduk merata (sampel urin) b . a m b i l d a r a h 3-5 m l l a n g s u n g d a r i j a n t u n g p a k a i s p u i t s t e r i l 5 m l , m a s u k k a n ke t a b u n g ( s a m p e l d a r a h ) c. Kedua sampel urin dan darah diperiksa kadar kreatininnya dan hasilnya menunjukkan klirens kreatinin. Pemeriksaan klirens dilakukan pakai a l a t otornatik merk C o b a Mira Plus buatan Roche. B i l a hasilnya tidak berbeda nyata, berarti fungsi filtrasi tidak atau hampir tidak terpengaruh oIeh asam jengkol 3 . 3 . 8 . Penentuan LDso
Dilakukan memakai Uji Hayati dengan larva udang
Artemia salina L e a c h . T e l u r u d a n g d i t e t a s k a n k e d a l a m g e l a s piala berisi a i r laut yang dilengkapi aerator. Sesudah 24 jam kemudian telur akan menetas. Siapkan 6 botol kecil, dan kedalamnya masukkan air laut yang diberikan asam jengkolat
d e n g a n k a d a r 0; 0 . 1 ; 1; 10; 1 0 0 ; 1 0 0 0 p p m . D a l a m m a s i n g masing
botol
dimasukkan
10 e k o r
larva
udang.
Hitung
keesokan harinya, yang m a t i d a n yang hidup. Jumlah yang mati dihitung d a n dianalisa rnenggunakan Program Analisis P r o b i t F i n n e y d e n g a n s e l a n g k e p e r c a y a a n 95%. Pengujian dilakukan dengan tiga ulangan. 3 . 3 . 9 . Uji toksisitas pada larva u d a n g A-salina
Dilakukan uji toksisitas dengan bahan asam jengkolat. m e r k a p t o e t a n o l d a n C S 2 p a d a Artenzia s a l i n a d a l a m m t d i a a i r l a u t d a n m e d i a P B S ( p h o p h a t buffer uiltuk
melihat
apakah
terjadi
s a l i n e ) bersama air laut
kematian
dan
pada
jam
keberapa tepatnya terjadi kematian pada larva udang. Bahan yang dipakai untuk uji toksisitas: 1. C S 2
Didasarkan pertimbangan b a h w a asam jengkolat telah diketahui dihidrolisir oleh tanaman tertentu
yaitu oleh
akar tanaman Mimosa p u d i c a (Putri malu) dan bahan ini toksis
terhadap
menjadi
akar jamur,
komponen
yang
diberbagai hutan tropis (Piluk
cacing dan
serangga,
menyebabkan
hujan
dan asam
w.,1998)
2. M e r k a p t o e t a n o l ( M e r c a p t o e t h a n o l , C2HsOS) Berdasarkan pertimbangan bahwa bahan ini mempunyai hau
mirip dengan bau jengkol.
Bahan
ini toksik
biia
terkena kulit, ditelan, dan mengakibatkan iritasi pada mata (keterangan label botol). 3. A s a m j e n g k o l a t h a s i l p e m u r n i a n .
3 . 3 . 1 0 . Pengujian hasil
Data-data
yang diperoleh, kemudian
ditabulasi dan
dianalisa dengan memakai uji statistik seperti Rancangan Acak
L e n g k a p m e l a l u i B e d a N y a t a .Jujur ( B N J ) ,
statistik nonparametrik
Kruskal-Wallis
satu
dan uji
arah
dengan
a n a l i s i s v a r i a n m e l a l u i p e r i n g k a t ( D a n i e l 1987). Untuk metode Kruskal-Wallis, langkah yang diambil: H a s i l p e n g a m a t a n , n l , n2,
......nk, d i u b a h k e d a l a m n o m o r
p e r i n g k a t . H a s i l t e r e n d a h d i b e r i p e r i n g k a t 1, s e d a n g h a s i l t e r t i n g g i d i b e r i p e r i n g k a t k. U n t u k h a s i l y a n g s a m a n i l a i n y a , diambil rata-rata peringkatnya. Jumlahkan peringkat tiap kelompok perlakuan Hasilnya diuji dengan rumus:
k ,j u m l a h k e l o m p o k nj ,j u m l a h p e n g a m a t a n p a d a k e l o m p o k j n ,j u m l a h s e l u r u h p e n g a m a t a n . Rj , t o t a l d a r i p e r i n g k a t d i k e l o m p o k j Signifikansi hasil H dilihat pada tabel,
L
.
bila 5 atau lebih pengamatan
H , bila kurang dari 5 pengamatan
Ho Ha
.
Untuk seluruh uji statistik, hipotesis yang diambil a d a l a h : distribusi populasi semua sama
. setidaknya
terdapat
salah
menunjukkan nilai lebih besar
satu
dari
populasi
yang
