3 METODE PENELITIAN 3.1 Kerangka Pemikiran Keberhasilan produksi bioinsektisida selain dipengaruhi oleh galur bakterinya, juga dipengaruhi oleh media dan kondisi fermentasi yang digunakan. Untuk memperoleh komplek spora - kristal yang optimum diperlukan kesesuaian nutrisi dan galur Bt yang digunakan. Nilai parameter terbaik untuk suatu galur tidak sama dengan galur yang lain, tetapi secara umum kondisi kultivasi harus dioptimalkan untuk memperoleh jumlah spora yang banyak, konsentrasi protein kristal yang tinggi dan daya toksisitas yang tinggi pula (Dulmage et. al. 1990). Dalam kultivasi B. thuringiensis, karbon mempunyai peran yang sangat penting. Konsentrasi karbon yang tinggi menyebabkan B. thuringiensis menghasilkan asam sehingga terjadi penurunan pH di bawah 5,5 – 5,7 dimana pada kondisi ini kebanyakan galur B. thuringiensis tidak dapat tumbuh sehingga fermentasi terhenti (Dulmage et al. 1990). Sebaliknya, efek kenaikan pH akan terjadi apabila konsentrasi nitrogen dalam media cukup tinggu. Untuk menjaga kondisi ini diperlukan keseimbangan perbandingan karbon – nitrogen dan pH dikontrol dengan cara menambahkan buffer selama proses. Farrera et al. (1998) menjelaskan bahwa keseimbangan rasio C/N secara langsung berpengaruh pada produksi kristal protein. Komponen lain yang sangat penting dalam produksi protein kristal adalah kalsium. Kultivasi B. thuringiensis pada media yang mengandung garam kalsium akan menghasilkan peningkatan produksi protein kristal. Untuk menguji aktivitas bioinsektisida (komplek spora-kristal protein) dari Bt dapat diukur melalui bioassay yaitu metode pengujian insektisida mikrobial yang didesain untuk menentukan berapa banyak bahan yang diperlukan untuk menyebabkan kematian populasi serangga sasaran. Dalam
penggandaan skala
diperlukan penerapan kondisi terbaik
berdasarkan suatu acuan tertentu. Acuan yang umum digunakan adalah berbasis tenaga per volume (Pg/V) tetap atau berdasarkan koefisien transfer oksigen (Kla) konstan. Kultivasi dengan media limbah cair tahu yang memiliki partikel kasar cukup menyulitkan pengontrolan Kla, sehingga basis Pg/V menjadi pilihan yang dapat dilakukan.
22
Analisa Komposisi Media Kadar air,abu, protein, lemak, serat kasar, karbohidrat, C total, N total
Seleksi B. thuringiensis Sumber Bakteri dari culture collection dan ulat sutra Parameter yang dianalisa : jumlah sel hidup (N), jumlah spora hidup (P), penampakan mikroskopik, daya toksisitas terhadap C.binotalis Daya toksisitas terhadap C.binotalis Persiapan Inokulum Penyegaran di agar miring, pembiakan dalam Nutrient Broth, pembiakan dalam limbah cair tahu
Penentuan C/N Rasio pada Kultivasi Skala Laboratorium (500 ml) Parameter yang dianalisa pada jam pengamatan ke 0,3,6,9,12,24,36,48, 72: pH, jumlah sel hidup (N), jumlah spora hidup (P), jumlah substrat sisa (S), pertumbuhan spesifik maksimum (µx-maks.), efisiensi penggunaan substrat, konversi substrat menjadi biomassa (YN/S), konversi substrat menjadi produk (YP/S) ), dan konversi substrat menjadi biomassa (YX/S)
Kultivasi Skala Laboratorium (3 liter) Parameter yang dianalisa pada jam pengamatan ke 0,3,6,9,12,24,36,48, 72 : pH, jumlah sel hidup (N), jumlah spora hidup (P), jumlah substrat sisa (S), laju pertumbuhan spesifik (µ), YN/S, YP/S, YX/S, Penentuan Tenaga per unit Volume (Pg/V) dan daya toksisitas terhadap C.binotalis
Karakterisasi Bioinsektisida Pola Protein dengan SDS-PAGE, Kadar asam amino
Kultivasi Skala Laboratorium (40 liter) Parameter yang dianalisa pada jam pengamatan ke 0,3,6,9,12,24,36,48,: pH, jumlah Gambar sel hidup6(N), jumlahalir spora hidup (P), jumlah substrat sisa (S), Diagram tahapan penelitian laju pertumbuhan spesifik (µ), YN/S, YP/S, YX/S, Penentuan Tenaga per unit Volume (Pg/V) dan daya toksisitas terhadap C.binotalis
Gambar 6 Diagram alir penelitian
23
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian
dilaksanakan
di
Laboratorium
Dasar
Ilmu
Terapan,
Laboratorium Bioindustri, Teknologi Kimia dan Lab Instrumentasi Jurusan Teknologi Industri Pertanian FATETA IPB dan dan Lab Hama dan Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian IPB. Penelitian dimulai pada bulan April 2010 sampai dengan Desember 2010 dan bulan September 2011. 3.3 Alat dan Bahan Kultur B. thuringiensis diperoleh dengan membiakkan campuran sporakristal protein bakteri dari cultur collection pada media agar miring. Isolat diperoleh dari Balitvet, Bogor, yang berasal dari tanah dan kandang domba, Ds. Jatiraga, Kec. Kadipaten Majalengka tahun 2003. Sumber isolat lainnya adalah ulat sutera mati yang diperoleh dari dari Rumah Sutra Ciapus Bogor, Mei 2010). Bahan-bahan lain yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari nutrient agar (NA), nutrient broth (NB), MgSO4.7H2O, MnSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CaCO3, limbah cair tahu dari industri tahu di desa Cibadak Ciampea dan Kayu Manis Salabenda Bogor, garam fisiologis, laktosa, bahan perekat dan perata (Agristick), larutan buffer, air suling, etanol 94%, spiritus, tisu, kapas, alumunium foil, CuSO4, Na2SO4, H2SO4 pekat, NaOH, HCl, indikator mensel, heksana, Pb-asetat, Na-oksalat, fenol, HNO3, HF. Untuk
bioassay
diperlukan ulat kubis (C. binotalis) dan daun kubis organik. Peralatan yang diperlukan diantaranya adalah rotary shaker, autoclave, inkubator, labu erlenmeyer, pemanas listrik, tabung ulir, tabung reaksi, tabung eppendorf, jarum ose, pipet, lemari pendingin, oven, mortar, teflon bom digester, labu Kjedhal, soxhlet, desikator, tanur, spektrofotometer, Spektrofotometri Serapan Atom (SSA), Scanning Electron Microscophy (SEM), neraca analitik, pH meter, kertas saring, cawan petri, cawan alumunium, gelas piala, pinset, bunsen, papan miring serta alat gelas lainnya. 3.4 Metode Penelitian 3.4.1 Analisis komposisi media dan isolasi bakteri 3.4.1.1 Analisis bahan baku Analisis bahan baku media kultivasi ampas tahu dan limbah cair tahu yang meliputi kadar karbon total, kadar nitrogen, kadar air, kadar abu, kadar protein,
24
kadar lemak, kadar serat kasar dan fermentable sugars serta kandungan makro dan mikro elemen. Masing-masing langkah analisis bahan baku dapat dilihat pada Lampiran 1. 3.4.1.2 Isolasi B. thuringiensis Metode isolasi yang digunakan adalah metode cawan tuang. Campuran spora kristal dari cultur collection dan cairan usus ulat sutra digoreskan ke dalam agar miring secara aseptis. Kemudian kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30-32 oC. Masing-masing kultur diambil satu lup ke dalam larutan 9 ml garam fisiologis dan dilakukan renjatan panas pada suhu 80 oC selama 10-15 menit. Larutan selanjutnya diencerkan berseri sampai pada pengenceran 10 -7 dan sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran disebarkan dalam medium agar (pH 7,4). Biakan dalam cawan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30-32 oC. Koloni-koloni yang terpisah dan bentuk yang berbeda selanjutnya dibiakkan dalam agar miring. Masing-masing kultur dalam agar miring ini selanjutnya dilakukan pengamatan mikroskopik menggunakan mikroskop dan Scanning Electron Microscopy (SEM). Sebanyak satu lup isolat kemudian diinokulasikan ke dalam Nutrient Broth dan dikocok dalam rotary shaker selama 24 jam dengan kecepatan 180 rpm. Untuk mempelajari pengaruh jenis media pada isolat bakteri yang dihasilkan maka disiapkan media kultivasi yang berbeda terdiri dari dua macam media yaitu: 1.
Media M1 : Nutrient Broth (NB).
2.
Media M2 : Limbah cair tahu Ke dalam masing-masing media M1 dan M2 yang telah disterilisasi secara
aseptis diinokulasikan kultur dari NB sebanyak 10% dan dikocok dalam rotary shaker selama 48 jam dengan kecepatan 180 rpm. Selanjutnya dilakukan penentuan jumlah sel hidup, jumlah spora dan daya toksisitasnya terhadap C. binotalis. Prosedur penentuan jumlah sel hidup, jumlah spora dan daya toksisitas bioinsektisida dapat dilihat pada Lampiran 2. Untuk mengetahui perbedaan pengaruh perlakuan, data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial yang terdiri dari dua faktor yaitu faktor jenis media (M) dan isolat bakteri (B) dengan dua kali ulangan . Faktor jenis
25
media terdiri dari media NB (M1) dan media LCT (M2). Faktor isolat bakteri meliputi isolat dari Balitvet yang koloni tak bertitik (B1), isolat dari Balitvet yang koloninya bertitik (B2) serta isolat dari ulat (B3). Model matematis yang digunakan untuk percobaan ini sebagai berikut (Hanafiah 2005): Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk Keterangan : Yijk
= nilai variabel respon unit percobaan yang dikenai taraf ke-i faktor jenis media dan isolat bakteri ke-j.
µ
= nilai rata-rata pengamatan yang sesungguhnya.
αi
= pengaruh aditif dari jenis media ke-i.
βj
= pengaruh aditif dari isolat bakteri ke-j.
(αβ)ij = pengaruh interaksi antara jenis media ke-i faktor dan isolat bakteri ke-j. Σk(ij)
= pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan.
Parameter yang diamati meliputi total sel hidup dan jumlah spora. Apabila hasilnya menunjukkan perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program SPSS.
3.4.2
Penentuan rasio karbon/nitrogen media
3.4.2.1 Persiapan inokulum Hasil seleksi galur B. thuringiensis yang memberikan daya toksisitas terbaik pada tahap pertama kemudian akan digunakan pada proses penentuan rasio C/N pada media. Persiapan inokulum medium fermentasi dilakukan dengan mengikuti metode Vandekar dan Dulmage (1982). Satu lup biakan B. thuringiensis diinokulasi dalam 50 ml media NB (labu pembibitan I) dan diinkubasi dalam rotary shaking incubator, dengan kecepatan 181 rpm, pada suhu 28-32 oC, selama 12 jam. Kultur selanjutnya digunakan untuk menginokulasi labu pembibitan II berisi limbah cair tahu dengan komposisi kultur 5% dari volume media pembibitan II. Labu pembibitan II diinokulasi pada kondisi yang sama selama 12 jam.
26
3.4.2.2 Penentuan komposisi rasio karbon/nitrogen terbaik Penentuan komposisi C/N terbaik dilakukan dengan terlebih dahulu menyiapkan media kultivasi dimana sumber karbon berasal dari ampas tahu (AT) dan limbah cair tahu (LCT) dengan perbandingan AT : LCT = 1 : 9 dan sumber N dari urea. Percobaan dilakukan pada labu erlenmeyer 500 ml yang masing-masing berisi 50 ml media kultivasi dengan komposisi berbandingan karbon/nitrogen yang digunakan seperti terlihat pada Tabel 5. Tabel 5 Komposisi rasio C/N pada media kultivasi Kode
C3N
C5N
C7N
C9N
C11N
Rasio C/N
3:1
5:1
7:1
9:1
11:1
Tujuan dari tahap ini adalah untuk mengetahui pengaruh perbandingan dari sumber karbon dan sumber nitrogen pada media terhadap produksi bioinsektisida. Jenis dan konsentrasi mineral yang digunakan dalam penelitian ini sesuai dengan yang digunakan oleh Dulmage dan Rhodes (1971), yaitu 0,3 g/L MgSO4.7H2O, 0,02 g/L MnSO4. H2O, 0,02 g/L ZnSO4.7 H2O, 0,02 g/L FeSO4.7 H2O, dan 1,0 g/L CaCO3. Hasil perhitungan pembuatan media kultivasi secara terperinci dapat dilihat pada Lampiran 3. Sterilisasi ampas tahu, CaCO3, dan limbah cair tahu dilakukan secara terpisah dari urea, trace elementdan, larutan buffer. Semua bahan didinginkan sampai ± 30 0C, dicampurkan dan pH diatur hingga 7,2. Masing-masing labu diinokulasi dengan kultur inokulum dari labu pembibitan II sebanyak 2 % dari media kultivasi secara aseptis. Kemudian diinkubasi dalam rotary shaking incubator pada kondisi suhu 28-32 oC, pH 6,8 – 7,2, agitasi 181 rpm dan waktu pengamatan dilakukan pada jam ke 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48 dan 72 jam (Mummigati dan Raghunatan 1990). Cairan fermentasi tersebut kemudian dianalisis. Metode analisis dapat dilihat pada Lampiran 2 meliputi:
pH cairan fermentasi
Pengukuran pembentukan spora dengan menentukan jumlah spora hidup (viable spore count /VSC)
27
Pengukuran pembentukan koloni total (Total Plate Count/TPC)
Pengukuran total gula sisa dengan menggunakan Metode Fenol
Pengukuran biomassa kering dengan metode yang sama seperti penentuan kadar air.
Penentukan parameter kinetika fermentasi. Parameter kinetika fermentasi yang ditentukan meliputi laju pertumbuhan spesifik maksimum (µx-maks.), efisiensi penggunaan substrat menjadi sel (YN/S), konversi substrat menjadi biomassa (YX/S) dan konversi substrat menjadi produk (YP/S).
Penentuan daya toksisitas bioinsektisida yang dihasilkan dari ke lima perbandingan C/N. Rancangan percobaan yang digunakan untuk menganalisa pengaruh rasio
karbon/nitrogen media terhadap pH, bobot kering biomassa, jumlah sel dan jumlah spora hidup adalah rancangan acak kelompok, dengan dua kali ulangan, mengikuti persamaan berikut ((Hanafiah 2005): Yij = µ + Ai + Bj + εij Dengan i = 1,2,3,4,5 ; j = 1,2,3,4,5,6,7,8,9 Keterangan : Yij
= nilai variabel respon unit percobaan yang dikenai taraf ke-i faktor rasio C/N pada jam pengamatan ke-j.
µ
= nilai rata-rata pengamatan yang sesungguhnya.
Ai
= keragaman akibat taraf kelompok ke-i faktor rasio C/N
βj
= keragaman akibat perlakuan taraf ke-j jam pengamatan
εij
= pengaruh galat dari satuan percobaan ke-ij yang memperoleh kombinasi perlakuan. Data yang diperoleh dari pengukuran parameter, masing-masing dianalisis
menggunakan analisis ragam uji F. Apabila hasilnya menunjukkan perbedaan yang nyata, analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program SPSS. 3.4.3
Penerapan kondisi terbaik pada bioreaktor 3 L dan 40 L Penggandaan skala kultivasi dilakukan pada bioreaktor tangki berpengaduk
dengan volume kerja 3 liter. Kondisi kultivasi yang harus dipenuhi antara lain pH awal 6,8 - 7,2 dan suhu 30-32 oC , aerasi 1 v/v/m agitasi 200 rpm. (Vandekar &
28
Dulmage 1982; Dulmage et al.1990 ; Yulianti 2001 ; Syamsu et al. 2003; Aprifianto 2006). Biakan selanjutnya diamati pada jam ke 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48 dan 72 jam dengan parameter analisa :
Pengukuran pH cairan fermentasi
Pengukuran pembentukan spora dengan menentukan jumlah spora hidup (viable spore count /VSC)
Pengukuran pembentukan sel total (Total Plate Count/TPC)
Pengukuran total gula sisa dengan menggunakan Metode Fenol
Pengukuran biomassa kering dengan metode yang sama seperti penentuan kadar air.
Penentuan daya toksisitas bioinsektisida yang dihasilkan dari ke lima perbandingan C/N. Perhitungan rancang bangun bioreaktor untuk skala pilot 40 L dilakukan
dengan menggunakan metode tenaga per volum tetap (Pg/V). Nilai tenaga per volum pada skala produksi dihitung dengan asumsi bahwa pada efisiensi aerasi yang sama akan diperoleh rendemen produk yang sama baik pada skala kecil maupun skala besar (Banks dalam Wiseman, 1979). Konsumsi tenaga per satuan volum cairan kultivasi di dalam tangki biorekator (P/V) adalah: P/V = N3D3 Keterangan : P: Konsumsi tenaga V: Volume cairan kultivasi N: Laju sirkulasi cairan kultivasi D: Diameter pengaduk Penggandaan
skala
kultivasi
dilakukan
pada
bioreaktor
tangki
berpengaduk dengan volume kerja 25 liter. Kondisi kultivasi yang harus dipenuhi antara lain pH awal 6,8 - 7,2 dan suhu 30-32 oC , dengan nilai aerasi dan agitasi diperoleh dari perhitungan berbasis Pg/V. Hasil kultivasi selanjutnya diamati pada jam ke 0, 6, 12, 18, 24, 36, dan 48 jam dengan parameter analisa :
Pengukuran pH cairan fermentasi
Pengukuran pembentukan sel total (Total Plate Count/TPC)
Pengukuran total gula sisa dengan menggunakan Metode Fenol
29
Pengukuran biomassa kering dengan metode yang sama seperti penentuan kadar air.
Pengukuran pembentukan spora dengan menentukan jumlah spora hidup (viable spore count /VSC).
3.4.4
Penentuan daya toksisitas bioinsektisida yang dihasilkan
Karakterisasi dan uji daya toksisitas bioinsektisida Karakterisasi bioinsektisida yang dihasilkan meliputi pengamatan terhadap
pola protein dan asam amino penyusunnya. Penentuan pola protein dilakukan menggunakan elektroforesis SDS-PAGE sedangkan kandungan asam amino dianalisis dengan HPLC. Uji daya toksisitas bioinsektisida dilakukan terhadap ulat kubis instar II-III. Bioinsektisida yang digunakan untuk uji toksisitas adalah campuran spora-kristal yang dipanen pada saat jumlah spora maksimum sampai dengan akhir waktu inkubasi (72 jam). Prosedur analisa secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 2.
