1431 H

UJI ANTIOKSIDAN DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK AIR DAUN KECOMBRANG (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) SEBAGAI PENGAWET ALAMI TERHADAP Escherichia coli DAN Staphylococcus aureus

RINA NINGTYAS

PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2010 M/ 1431 H

UJI ANTIOKSIDAN DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK AIR DAUN KECOMBRANG (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) SEBAGAI PENGAWET ALAMI TERHADAP Escherichia coli DAN Staphylococcus aureus

SKRIPSI Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

RINA NINGTYAS 106095003214

PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2010 M/ 1431 H

UJI ANTIOKSIDAN DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK AIR DAUN KECOMBRANG (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) SEBAGAI PENGAWET ALAMI TERHADAP Escherichia coli DAN Staphylococcus aureus

SKRIPSI Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

RINA NINGTYAS 106095003214

Menyetujui : Pembimbing 1,

Pembimbing 2,

DR. Ira Djajanegara, M.Sc NIP.19640826.199302.2.004

Dra. Nani Radiastuti, M.Si NIP.19650902.20011.2.001

Mengetahui : Ketua Prodi Biologi

DR. Lily Surayya Eka Putri, M.Env.Stud NIP.1969404.200501.2.005

PENGESAHAN UJIAN Skripsi berjudul “Uji Antioksidan Dan Antibakteri Ekstrak Air Daun Kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) Sebagai Pengawet Alami Terhadap Escherichia coli Dan Staphylococcus aureus ” yang ditulis oleh Rina Ningtyas, NIM 106095003214 telah diuji dan dinyatakan LULUS dalam Sidang Munaosah Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta pada tanggal 9 Desember 2010. Skripsi ini telah diterima Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Biologi.

Menyetujui : Penguji 1,

Penguji 2,

DR. Lily Surayya Eka Putri, M.Env.Stud NIP .1969404.200501.2.005

Dini Fardila, M.Si NIP.19800330.200901.2.009

Pembimbing 1,

Pembimbing 2,

DR. Ira Djajanegara, M.Sc NIP .19640826.199302.2.004

Dra. Nani Radiastuti, M.Si NIP.19650902.20011.2.001

Mengetahui :

Dekan Fakultas Sains dan Teknologi

DR. Syopiansyah Jaya Putra, M.Sis NIP .19680117.200112.1.001

Ketua Prodi Biologi

DR. Lily Surayya Eka Putri, M.Env.Stud NIP . 1969404.200501.2.005

PERNYATAAN DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI BENAR-BENAR HASIL KARYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI DAN LEMBAGA MANAPUN

Jakarta, Desember 2010

Rina Ningtyas 106095003214

ABSTRAK Uji Antioksidan Dan Antibakteri Ekstrak Air Daun Kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) Sebagai Pengawet Alami Terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus Penggunaan bahan pengawet dan antioksidan sintetis tidak direkomendasikan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) karena diduga dapat menimbulkan penyakit kanker (carcinogenic agent). Kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) adalah tanaman asli Indonesia yang berpotensi sebagai pengawet alami. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kemampuan antibakteri dan antioksidan ekstrak air daun kecombrang yang berpotensi sebagai pengawet alami. Ekstraksi dilakukan dengan maserasi menggunakan pelarut aquadest. Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa ekstrak air daun kecombrang mengandung senyawa bioaktif berdasarkan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) dengan nilai LC50 53,08 ppm. Hasil pengujian antioksidan dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) diketahui aktivitas antioksidan sangat kuat dengan nilai IC50 24,394 mg/l. Aktivitas antibakteri ekstrak diamati dengan metode difusi cakram menunjukkan ekstrak dapat menghambat pertumbuhan E. coli dan S. aureus. Hasil pengujian antibakteri ekstrak air daun kecombrang terhadap S. aureus pada konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80% dan 100% diperoleh zona hambatan yang berbeda yaitu 8,663 mm, 14,223 mm, 15,33 mm, 20.08 mm dan 21,36 mm. Ekstrak air daun kecombrang menghambat pertumbuhan E. coli hanya pada konsentrasi 100% dengan zona hambat sebesar 10 mm. Diameter zona hambat kloramfenikol 10 μg mendekati zona hambat diameter ekstrak air daun kecombrang pada S. aureus konsentrasi 60% sebesar 17,5 mm. Pada E. coli zona hambat kloramfenikol 10 μg sangat berbeda bila dibandingkan dengan zona hambat ekstrak air daun kecombrang yaitu 22,66 mm. Nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) E. coli pada konsentrasi 90%, sedangkan untuk S. aureus pada konsentrasi 15%. Identifikasi ekstrak air daun kecombrang menggunakan GC-MS (Kromatografi gas spektroskopi massa) diperoleh 62 senyawa dengan jumlah tertinggi adalah butanadiol dan eicosane. Kata Kunci: antibakteri, antioksidan, ekstrak air daun kecombrang, pengawet alami

ABSTRACT Antioxidant and Antibacterial Of Kecombrang Leaf Extract (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) As Natural Preservative Against Escherichia coli and Staphylococcus aureus The use of synthetic preservatives and antioxidants are not recommended by the Food and Drug Supervisory Agency (BPOM) for allegedly can cause cancer (carcinogenic agent). Kecombrang (Etlingera elatior (Jack) RM Smith) is a plant native to Indonesia which has the potential as a natural preservative. The purpose of this research is to determine the ability of antibacterial and antioxidant of kecombrang leaf extract as a natural preservative. The extraction was done by maceration using aquadest solvent. The results showed that kecombrang leaf extract contain bioactive compounds based on the BSLT method (Brine Shrimp Lethality Test) with LC50 value 53,08 ppm. Antioxidants test with DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) method was resulted in a very strong antioxidant activity at IC50 24,394 mg/l. Antibacterial activity of extracts was observed with disc diffusion method and it showed the extract can inhibit the growth of E. coli and S. aureus. The results antibacterial testing of kecombrang leaf extract for S. aureus at 20%, 40%, 60%, 80% and 100% concentrations resulted in different inhibition zone, which were 8,663 mm, 14,223 mm, 15,33 mm, 20,08 mm and 21,36 mm respectively. However, kecombrang leaf extract inhibited E. coli growth only at concentration 100% and the inhibition zone was 10 mm. Chloramphenicol 10 μg/l inhibition zone diameter similar to kecombrang leaf extract on S. aureus at 60% concentration, inhibition which was 17,5 mm. The inhibition zone E. coli of chloramphenicol 10 μg was very different compared to kecombrang leaf extract was 22,66 mm. The KHM value (Minimum Inhibitory Consentration) for E. coli at 90% concentration, while for S. aureus at 15% concentration. There were 62 compounds identified in kecombrang leaf extract use GCMS (Gas Chromatography Mass Spectrometer) and the highest number compound was found butanediol and eicosane . Keyword: antibacterial, antioxidant, kecombrang leaf extract, natural preservative

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim Assalamu’alaikum. Wr. Wb Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah S.W.T atas rahmat dan ridhonya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Antioksidan dan Antibakteri Ekstrak Air Daun Kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) Sebagai Pengawet Alami Terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus” disusun sebagai syarat tugas akhir pada Program Studi Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Selama penyusunan skripsi, berbagai pihak telah banyak memberikan bantuan dan dorongan. Oleh karena itu, pada kesempatan ini disampaikan rasa hormat dan ucapan terima kasih terutama diberikan kepada : 1. Bapak DR. Syopiansyah Jaya Putra, M.Sis., selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta 2. Ibu Dr. Lily Surayya E.P, M.Env.Stud., selaku Ketua Prodi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta 3. Ibu Priyanti, M.Si., selaku Sekretaris Program Studi Biologi. 4. Ibu Fahma Widjayanti. M.Si selaku pembimbing akademik. 5. Ibu Dr. Ira Djajanegara, M.Sc selaku dosen pembimbing I dan Ibu Dra. Nani Radiastuti, M.Si., selaku dosen pembimbing II yang telah banyak meluangkan waktu dan

tenaga

untuk

memberikan

bimbingan,

saran

dan

dorongan

hingga

terselesaikannya skripsi ini.

i

6. Dosen-dosen Penguji baik seminar proposal, hasil maupun sidang (Ibu Megga R.Pikoli, M.Si, Ibu Reno Fitri, M.Si, Bapak Lao Ode Sumarlin, M.Si, Ibu Lily Surayya E.P, M.Env.Stud dan Ibu Dini Fardila, M.Si) 7. Kepala Lab. Biologi, Ibu Megga R. Pikoli, M.Si beserta Staf laboratorium k’bahri, mba’Ida, mba’Puji. Kepala Lab. Kimia beserta Staf laboratorium k’erni dan p’haris. Kepala Lab. Pangan beserta staf laboratorium pangan k’ pipit dan mba’ prita. 8. Balitro (Balai Penelitian Obat dan Aromatik) Bogor, Herbarium Bogoriense - LIPI Cibinong, dan Laboratorium Forensik Mabes Polri, Jakarta Selatan. 9. Semua dosen yang telah mengajarkan penulis selama kuliah S1 ini, terutama dosendosen di Prodi Biologi yang telah memberikan ilmu yang tiada terhingga dengan penuh kesabaran dan keikhlasan, Laboran di laboratorium utama lantai 4 yang selama ini telah memberikan ilmu dan pengalaman teknik dalam laboratorium dan tata usaha di lingkungan Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan informasi kepada penulis. 10. Untuk Mama dan ayah tercinta yang tidak pernah lelah memberi bantuan materil dan non materil, atas segala kasih sayang tulus, doa dan motivasi yang tak terhenti sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Adik-adikku (Dyas dan Nana) dan keponakan ku tersayang (Nadya) atas segala keceriaan dan senyuman yang selalu menemani. 11. Sahabat-sahabat ku, Yelvi, Nunu, dan Iis (ayank-ayangan). 12. Adeng Hudaya, sahabat dan partner penelitian yang telah bersama dalam suka dan duka dalam penelitian dan mengejar Januari.

ii

13. Rekan-rekan seangkatan Biologi 2006 (Nunu, Yelvi, Iis, Anggi, Pipit, Lidya, Jihan, Nana, Nita, Hera, Nununk, Note, Adenk, Deden, Adus, Eko, Ryan, Muhib, Ikbal, Ipin, Bams, Malik dan Iyvan). Semoga Allah selalu menjaga persahabatan kita. 14. Temen-temen dari Farmasi yang penelitian bareng (Alim, Tiwi, Yaya, Sobir, Dani, Silma, Nadia dll) dan temen2 semua dari Kimia (Pipit, Mita, Indra dll) 15. Temen2 KKN ( Muhib, Hasan, Prop, Ubaid dan Ali) Akhirnya, penulis berdoa semoga amal baik yang telah diberikan mendapat balasan yang berlipat ganda dari Allah S.W.T. Amin. Semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan pemikiran demi kemajuan dan keberhasilan bersama. Amin. Wassalamu’alaikum Wr.Wb

Penulis

iii

DAFTAR ISI

Halaman KATA PENGANTAR....................................................................................

i

DAFTAR ISI..................................................................................................

iv

DAFTAR GAMBAR.....................................................................................

vii

DAFTAR TABEL..........................................................................................

viii

DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................

ix

BAB I

1

BAB II

PENDAHULUAN.................................................................... 1.1. Latar Belakang ..........................................................................

1

1.2. Perumusan Masalah...................................................................

4

1.3. Hipotesa ....................................................................................

4

1.4. Tujuan Penelitian.......................................................................

5

1.5. Manfaat Penelitian………………………………………..……

5

TINJAUAN PUSTAKA………………………………….…..

6

2.1. Pengawet Alami..........................................................................

6

2.2. Kecombrang……………………...............................................

8

2.2.1.

Klasifikasi Kecombrang…………………...................

8

2.2.2.

Deskripsi Kecombrang................................................

9

2.2.3.

Manfaat dan Kandungan Kecombrang........................

10

2.3. Ekstraksi ....................................................................................

11

2.4. Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)...................................

13

2.5. Antioksidan................................................................................

14

2.6. Antibakteri.................................................................................

16

2.6.1. Mekanisme Kerja Antibakteri.......................................

18

2.6.2. Pengukuran Aktivitas Antibakteri.................................

18

2.7. Kloramfenikol............................................................................

20

2.8. Bakteri Uji.................................................................................

21 iv

2.8.1. Escherichia coli............................................................

21

2.8.2. Staphylococcus aureus..................................................

22

2.9. GC-MS......................................................................................

24

2.9.1. Prinsip Dasar GC-MS...................................................

24

2.9.2. Proses Pemisahan Pada GC-MS.....................................

25

2.9.3. Teknik Sampling pada GC-MS......................................

25

METODE PENELITIAN..........................................................

26

3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian.....................................................

26

3.2. Bahan dan Alat..........................................................................

26

3.2.1. Bahan.............................................................................

26

3.2.2. Alat................................................................................

26

3.3. Cara Kerja..................................................................................

27

3.3.1. Preparasi sampel............................................................

27

3.3.2. Ekstraksi........................................................................

27

3.3.3. Uji BSLT.......................................................................

28

3.3.3.1. Penetasan Larva udang..................................

28

3.3.3.2. Persiapan Larutan Sampel yang akan diuji....

28

BAB III

3.3.3.3. Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT………………………………………..

28

3.3.4. Pengujian Antioksidan..................................................

30

3.3.4.1. Pembuatan Kurva Standar...............................

30

3.3.4.2. Pengujian Antioksidan....................................

30

3.3.5. Pembuatan Medium......................................................

31

3.3.5.1. Pembuatan Medium Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB)……………………

31

3.3.5.2. Pembuatan Medium Mueller Hinton Agar (MHA)………………………………………

31

3.3.6. Peremajaan Bakteri Uji dan Pembuatan Suspensi Bakteri………………………………………………… 3.3.7. Pembuatan Inokulum....................................................

32 32 v

3.3.8. Pengujian Antibakteri....................................................

32

3.3.7.1. Difusi Cakram..................................................

32

3.3.7.2. MIC (Minimum Inhibitory Consentration)….

33

3.3.9. Analisis GCMS..............................................................

33

3.4. Analisis Data..............................................................................

33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................

34

4.1. Ekstraksi Daun Kecombrang.....................................................

34

4.2. Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)....................................

35

4.3. Uji Antioksidan.........................................................................

38

4.4. Uji Antibakteri..........................................................................

41

4.3.1. Uji Antibakteri menggunakan metode difusi cakram..

41

4.3.2. MIC (Minimum Inhibitory Consentration)..................

48

4.5. Analisis GC-MS........................................................................

51

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………

58

5.1. Kesimpulan…………………………………………….….......

58

5.2. Saran………………………………………………….….........

59

DAFTAR PUSTAKA.................................................................................. ..

60

LAMPIRAN...................................................................................................

68

vi

DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1.

Bahan Alami di Indonesia yang Mempunyai Efek Antibakteri...

7

Tabel 2.

Perhitungan Akumulasi Mati Tiap Konsentrasi..............................

29

Tabel 3.

Perhitungan Akumulasi Hidup Tiap Konsentrasi............................

29

Tabel 4.

Hasil Uji BSLT Ekstrak Air Daun Kecombrang........................

36

Tabel 5.

Hasil Pengujian Aktifitas Antioksidan Ekstrak Air Daun Kecombrang…………………………………………………….

Tabel 6.

Tabel 7.

40

Hasil MIC atau Konsentrasi Hambat Minimum pada Ekstrak Air Daun Kecombrang…………………………………………….

49

Hasil GC-MS Ekstrak Air Daun Kecombrang…………………….

52

vii

DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar1. Kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith)……………

9

Gambar 2. Struktur DPPH............................................................................

16

Gambar 3. Kloramfenikol.............................................................................

21

Gambar 4. Ekstraksi Daun Kecombrang (a) Serbuk daun kecombrang, (b) Hasil ekstrak daun kecombrang……………………………

35

Gambar 5. Reaksi DPPH Dengan Antioksidan...........................................

38

Gambar 6. Kurva Standar BHA (Butil hidroksianisol).................................

39

Gambar 7. Diameter Zona Hambat Ekstrak Air Daun Kecombrang pada Escherichia coli dan Staphylococcus aureus……………………

43

Gambar 8. Diameter Zona Hambat Bakteri Uji terhadap Kloramfenikol........

47

Gambar 9. Kromatogram Hasil GC-MS Ekstrak Air Daun Kecombrang dengan Pelarut Etanol.................................................................

51

Gambar10. Struktur Kimia Lima Senyawa Terbanyak dengan Similaritas Minimal 90% (1)butanediol (C4H10O2), (2) penol (C6H5O-) (3) nanodecane (C19H40), (4) Trycosane (C23H48), dan (5) Eicosane (C20H42)………………………………………….

53

viii

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Kecombrang ..............................

68

Lampiran 2. Kerangka Berpikir....................................................................

69

Lampiran 3. Pengukuran Nilai LC50 Daun Kecombrang Uji BSLT............ . Lampiran 4. Jumlah Inokulum Bakteri........................................................

70 71

Lampiran 5. Penghambatan Escherichia coli (1,67. 107 sel/ml)..................

72

Lampiran 6. Penghambatan Staphylococcus aureus (2,26. 107 sel/ml)........

73

Lampiran 7. Kontrol Positip dan Kontrol Negatif.......................................

74

Lampiran 8. Data Statistik Staphyloccocus aureus......................................

75

Lampiran 9. Data Statistik Escherichia coli................................................

76

Lampiran 10. Uji Antioksidan.......................................................................

77

Lampiran 11. Hasil GCMS Ekstrak Air Daun Kecombrang dengan Pelarut Etanol…………………………………………………………

78

ix

1

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang Bahan pangan merupakan kebutuhan pokok bagi manusia di samping pendidikan, kesehatan dan sandang lainnya yang akan terus meningkat sesuai dengan laju pertumbuhan penduduk. Namun, bahan pangan tersebut mudah mengalami perubahan yang tidak diinginkan seperti pembusukan dan ketengikan (Barus, 2009). Kerusakan bahan pangan ini umumnya disebabkan oleh mikroorganisme melalui proses enzimates dan oksidasi, terutama yang mengandung protein dan lemak sementara karbohidrat mengalami dekomposisi. Dalam rangka menghambat proses kerusakan pangan digunakan bahan pengawet dan antioksidan sintetis seperti formalin,

asam

benzoat,

BHA

(butilated

hydroxyanisol),

BHT

(butylated

hidroxytoluene) dan TBHQ (tertier butylated hydroxyanisole) (Tranggono, 1990) Penggunaan bahan pengawet dan antioksidan sintetis tidak direkomendasikan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) karena diduga dapat menimbulkan penyakit kanker (carcinogen agent). Karena itu perlu dicari alternatif lain yaitu bahan pengawet dan antioksidan alami yang bersumber dari bahan alam (Barus, 2009). Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai pengawet alami adalah kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith), yang merupakan tanaman rempah asli Indonesia yang secara tradisional telah lama digunakan masyarakat. Pemanfatan daun

2

tanaman ini adalah sebagai salah satu jenis sayuran dan dapat digunakan juga sebagai pengobat luka dan penghilang bau badan (Hidayat dan Hutapea, 1991). Hasil penelitian oleh Jaafar et al. (2007) pada daun, batang, bunga dan rimpang tanaman ini menunjukkan adanya beberapa jenis minyak esensial yang kemungkinan bersifat bioaktif. Penelitian Chan et al. (2007) ekstrak etanol dan metanol dari daun tanaman ini memiliki aktivitas antoksidan dengan cara mengukur Ferric-Reducing Antioxidant Power (FRAP) dan Abrorbic Acid Equivalent Capacity (AEAC). McKeen et al. (1997) melaporkan ekstrak etanol dari daun tanaman kecombrang ini memiliki kemampuan membunuh mikroba secara kualitatif dengan metode disc diffusion dan secara kuantitatif dengan metode tube dilution terhadap bakteri gram positif (Bacillus cereus dan Bacillus megatrium) dan gram negatif (Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa). BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) adalah uji pendahuluan untuk mengetahui adanya senyawa aktif dalam suatu ekstrak. Juniarti (2009) melakukan uji BSLT menggunakan larva udang Artemia salina sebagai pendahuluan uji antioksidan untuk mengetahui adanya senyawa aktif dalam ekstrak daun saga dengan nilai LC50 606,736 ppm. Hasil positif dari uji ini menunjukkan adanya senyawa aktif yang berpotensi sebagai antimikroba, antioksidan, dan antikanker. Dalam Rohman dan Riyanto (2005), ekstrak etanol daun kemuning diuji daya antioksidan dengan menggunakan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Andayani et al. (2008) dan Hanani (2005) juga menguji aktifitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH. Metode uji antioksidan dengan DPPH dipilih karena

3

metode ini adalah metode yang sederhana untuk evaluasi aktifitas antioksidan dari senyawa bahan alam (Fraglino, 1999) Naufalin (2005) menguji aktifitas bunga kecombrng dengan menggunakan metode difusi cakram sebagai pendahuluan adanya aktifitas ekstrak terhadap bakteri uji. Selanjutnya, ekstrak dilakukan uji KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) sebagai uji untuk mengetahui adanya konsentrasi terkecil yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Cossentio et al. (1999) menuliskan KHM adalah konsentrasi yang dapat menghambat 90% bakteri uji dalam waktu 24 jam. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri yang biasa mengkontaminasi bahan pangan yaitu Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Selain itu, kedua bakteri ini adalah perwakilan bakteri gram negatif dan positif. Beberapa hasil penelitian telah dilakukan dengan mengekstrak daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) menggunakan pelarut etanol (McKeen et al. 1997; Habsah et al. 2005; Chan et al. 2007) dan heksana (Widiatmojo, 2009). Oleh karena itu penelitian ini menggunakan pelarut air yang berbeda dari penelitian sebelumnya. Selain itu, pelarut air biasa diterapkan dalam pembuatan makanan sehari-hari maupun industri makanan. Mengingat adanya potensi dari daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) sebagai pengawet alami, maka perlu dikumpulkan bukti ilmiah yang terkait dengan kemampuannya sebagai antibakteri terutama pada ekstrak airnya. Penekanan ekstrak air menjadi penting karena hasil penelitian sebelumnya dilakukan ekstraksi dengan pelarut-pelarut organik, seperti pelarut etanol dan heksana. Pelarut

4

organik tidak dapat diterapkan dalam pembuatan makanan sehari-hari maupun industri makanan. Sehingga perlu dilakukan kajian menggunakan pelarut air terhadap kemampuannya sebagai antioksidan dan antibakteri.

1.2. Rumusan Masalah 1. Apakah ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki senyawa bioaktif berdasarkan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)? 2. Apakah ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki aktivitas antioksidan? 3. Apakah ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Stphylococcus aureus?

1.3. Hipotesis 1. Ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki senyawa bioaktif berdasarkan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). 2. Ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki aktivitas antioksidan. 3. Ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Stphylococcus aureus.

5

1.4. Tujuan Penelitian 1. Untuk meneliti ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki senyawa bioaktif berdasarkan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). 2. Untuk mengetahui ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki kemampuan antioksidan. 3. Untuk meneliti ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.

1.5. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan mampu memberikan bukti ilmiah yang terkait tentang ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) terhadap kemampuannya sebagai pengawet alami. Penggunaan pengawet alami

diharapkan

mengurangi penggunaan bahan pengawet sintetis yang diduga dapat menimbulkan penyakit kanker (carcinogen agent).

6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengawet Makanan Menurut Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 722/Menkes/Per/IX/88, yang dimaksud dengan pengawet adalah bahan tambahan makanan yang mencegah atau menghambat fermentasi, pengasaman atau penguraian lain terhadap makanan yang disebabkan oleh mikroorganisme. Pengawet yang diijinkan penggunaannya dalam makanan antara lain asam benzoat, asam propionat, asam sorbat, natrium nitrit dan kalium sulfit (Fardiaz, 2002). Efektivitas dari bahan pengawet ditentukan oleh konsentrasi, macam bahan pengawet, dan lingkungan bagi bahan pengawet itu ditambahkan. Semakin tinggi konsentrasi bahan pengawet yang diberikan semakin besar pula efektivitasnya, jika bahan pengawet tidak membahayakan bagi kesehatan (Supardi dan Sukamto, 1999). Menurut Food and Drugs Administration (FDA), keamanan suatu pengawet makanan harus mempertimbangkan jumlah yang mungkin dikonsumsi dalam produk makanan atau jumlah zat yang akan terbentuk dalam makanan dari penggunaan pengawet, efek akumulasi dari pengawet dalam makanan dan potensi toksisitas yang dapat terjadi dari pengawet jika dicerna oleh manusia atau hewan termasuk potensi menyebabkan kanker (Andrew, 2006). Pengawet kimia selama ini umum digunakan sebagai barier tambahan untuk mengontrol jumlah mikroorganisme yang hidup didalam pangan. Kekhawatiran

7

konsumen terhadap bahaya keracunan yang mungkin terjadi karena penggunaan pengawet kimia yang berlebihan, memaksa industri pangan untuk menghindari penggunaan pengawet kimia pada produknya, atau mencari alternatif lain yang lebih alami untuk mempertahankan atau memperpanjang umur simpan produk. Penelitian mengenai potensi pengawet alami yang dikembangkan dari tanaman rempah (seperti jahe, kayu manis, andaliman, daun salam dan sebagainya) maupun dari produk hewani (seperti lisozim, laktoperoksidase, kitosan dan sebagainya) sendiri sebenarnya telah banyak dilakukan di berbagai perguruan tinggi di Indonesia. Pada Tabel 1 dapat dilihat beberapa hasil penelitian in vitro tanaman di Indonesia yang mempunyai efek antibakteri yang berpotensi sebagai pengawet alami.

Tabel 1. Bahan alami di Indonesia yang mempunyai efek antibakteri. No

Bahan Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Scheff Boerl) Jeruk (Citrus auratifolia Swingle: Rutaceae

Bagian Daging Buah

3

Asam Jawa (Tamarindus indica Linn)

Daun

4

Cabe Jawa (Pipet petrofractum Vahl. Piperaceae)

Daun

5

Sirih merah (Piper crocatum)

Daun

6

Rosella (Hibiscus sabdariffa L)

Bunga

7

Bawang putih (Allium sativum L.)

Umbi

8

Belimbing (Averrhoea carambola L)

Daun

1 2

Daun

Sumber

Pustaka Rohyami Buah (2008) Minyak Parawidjayanti atsiri (2009) Ekstrak Kurniawati etanol (2008) Minyak Irawati (2009) atsiri Ekstrak Juliantina et etanol al. (2009) Ekstrak Yani (2010) metanol Ekstrak Sativa (2009) Etanol Ekstrak Sukadana metanol (2009)

8

9

Jambu biji (Psidium guajaya L.) daging buah putih dan daging buah merah

Daun

Ekstrak Adnyana et al. etanol (2004)

10

Jambu mede (Anacardium occidentale L)

Buah

Infusa

Wibowo (2009)

Ekstrak etil Naufalin asetat dan (2005) etanol Ekstrak McKeen et al.. Daun ethanol (1997) Minyak Parwata dan Rimpang atsiri Dewi (2008) Bunga

11

Kecombrang

12

Lengkuas (Languas galanga Stunz.)

2.2. Kecombrang 2.2.1. Klasifikasi Kecombrang Kecombrang memiliki beberapa nama latin, seperti Nicolaia speciosa Horan, Nicolaia elatior Horan, Etlingera elatior, Phaeomeria maggnifica, Phaemoria spesiosa, P .intermedia Valet (Tampubolon et al. 1983). Nama-nama daerah lain tanaman ini yaitu Kala (Gayo), Puwar kijung (Minangkabau), Kecombrang (Jawa Tengah) Horije (Sunda), Atimengo (Gorontalo), Katimbang (Makasar), Salahawa (Seram), Petikala (Ternate), Petikala (Tidore) (Hidayat dan Hutapea, 1991), sedangkan di luar negeri dikenal dengan ginger bud (Inggris), xiang bao jiang (Cina), kantan (Malaysia), boca de dragon (Spanyol) dan kaa laa (Thailand). Tumbuhan kecombrang merupakan tumbuhan yang tersebar cukup luas di Indonesia. Penggunaan kecombrang sebagai bahan obat sangat banyak ragamnya. Tumbuhan ini digunakan sebagai bahan pangan dan juga dapat digunakan untuk pengobatan (Antoro, 1995).

9

2.2.2. Deskripsi Kecombrang Tanaman kecombrang merupakan tanaman tahunan yang berbentuk semak dengan tinggi 1-3 m. Tanaman ini mempunyai batang semu, tegak, berpelepah, membentuk rimpang, dan berwarna hijau. Daunnya tunggal, lanset, ujung dan pangkal runcing tetapi rata, panjang daun sekitar 20-30 cm dan lebar 5-15 cm, pertulangan daun menyirip, dan berwarna hijau. Bunga kecombrang merupakan bunga majemuk yang berbentuk bongkol dengan panjang tangkai 40-80 cm. Panjang benang sari ± 7,5 cm dan berwarna kuning. Putiknya kecil dan putih. Mahkota bunganya bertaju, berbulu jarang dan warnanya merah jambu. Biji kecombrang berbentuk kotak atau bulat telur dengan warna putih atau merah jambu. Buahnya kecil dan berwarna coklat. Akarnya berbentuk serabut dan berwarna kuning gelap (Syamsuhidayat, 1991)

Gambar 1. Kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) (Dokumen Pribadi, 2010)

10

2.2.3. Manfaat dan Kandungan Kecombrang Hampir seluruh bagian dari tumbuhan ini dapat dimanfaatkan. Dalam kecombrang terkandung zat aktif seperti saponin, flavonoida, dan polifenol. Zat aktif tersebut dikenal sebagai deodoran alami yang akan mengurangi bau badan yang kurang enak bagi orang yang mengkonsumsinya. Kecombrang juga kaya vitamin dan mineral. Khasiat lain dari kecombrang adalah memperbanyak ASI, dan pembersih darah. Hal ini sangat baik bagi ibu yang sedang menyusui. Di beberapa kalangan masyarakat, kecombrang dipercaya sebagai penetral kolesterol (Anonim, 2010). Hal ini tidaklah mengejutkan mengingat adanya beberapa hasil penelitian yang menunjukkan kandungan senyawa-senyawa bioaktif dari tanaman ini seperti antibakteri, antioksidan dan antikanker. Hasil penelitian oleh Jaffar et al. (2007) pada daun, batang, bunga dan rimpang tanaman ini menunjukkan adanya beberapa jenis minyak esensial yang kemungkinan bersifat bioaktif. Ekstraksi minyak esensial dilakukan dengan metode hidrodistilasi

sedangkan

analisanya

dilakukan

dengan

alat

GC-MS

(Gas

Chromatography Mass Spectrometer). Dari penelitian ini terungkap kandungan minyak esensial tertinggi adalah pada daun yaitu sebesar 0,0735%, bunga sebesar 0,0334%, batang sebesar 0,0029% dan rimpang sebesar 0,0021%. Komponen utama minyak esensial pada daun adalah β-pinene (19,7%), caryophyllene (15,36%) dan βfarnesene (27,9%). McKeen et al. (1997) menguji ekstrak etanol dari daun tanaman kecombrang dalam kemampuannya untuk membunuh mikroba baik secara kualitatif dengan

11

metode disc diffusion dan secara kuantitatif dengan metode tube dilution terhadap bakteri gram positif (Bacillus cereus dan Bacillus megatrium) dan gram negatif (Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa). Hasil pengujian menunjukkan adanya aktivitas antibakteri dengan konsentrasi hambatan minimum berkisar 100–800 μg/ml dan konsentrasi lethal minimum berkisar 400–800 μg/ml. Hal ini menunjukkan potensi pemakaian daun tanaman ini sebagai pengawet makanan alami. Ekstrak etanol dan metanol dari bunga, daun dan rhizome tanaman ini diuji aktivitas antioksidannya dengan cara mengukur Ferric-Reducing Antioxidant Power (FRAP) dan Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity (AEAC).

Hasil

penelitian tersebut megindikasikan semua ekstrak mengandung aktivitas antioksidan dimana ekstrak yang berasal dari daun menunjukkan aktivitas tertinggi diikuti ekstrak bunga dan terrendah adalah ekstrak rimpang (Chan et al. 2007). Dibuktikan bahwa senyawa-senyawa

aktif

1,7-bis

(4-hydroxyphenyl)-

2,4,6-

heptatrienone,

demethoxycurcumin dan 1,7-bis (4-hydroxyphenyl)- 1,4,6-heptatrien- 3-one dari rimpang tanaman ini mempunyai kekuatan menghambat peroksidasi pada lemak yang lebih kuat daripada α-tocopherol sebagai kontrol positif (Habsah et al. 2005).

2.3. Ekstraksi Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya. Ekstraksi merupakan proses pemisahan suatu bahan dari campurannya, ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai

12

cara. Ekstraksi menggunakan pelarut didasarkan pada kelarutan komponen terhadap komponen lain dalam campuran (Suyitno et al. 1989). Ekstraksi tumbuhan adalah proses penarikan zat aktif dalam tumbuhan dengan menggunakan pelarut tertentu. Senyawa atau kandungan dalam tumbuhan memiliki kelarutan berbeda-beda dalam pelarut yang berbeda. Pelarut-pelarut yang biasa digunakan antara lain: kloroform, eter, aseton, alkohol, metanol, etanol dan etil asetat (Harbone, 2006). Metode ektraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah maserasi. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, airetanol, pelarut lain. Keuntungan metode ini adalah pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diperoleh. Namun, kerugian metode ini yaitu pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna (Endah, 2008). Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah air. Air adalah pelarut yang kuat, melarutkan banyak jenis zat kimia. Zat-zat yang bercampur dan larut dengan baik dalam air (misalnya garam-garam) disebut sebagai zat-zat "hidrofilik" (larut air), dan zat-zat yang tidak mudah tercampur dengan air (misalnya lemak dan minyak), disebut sebagai zat-zat "hidrofobik" (tidak larut dalam air). Kelarutan suatu zat dalam air ditentukan oleh dapat tidaknya zat tersebut menandingi kekuatan gaya tarik-menarik listrik (gaya intermolekul dipol-dipol) antara molekul-molekul air. Jika suatu zat tidak mampu menandingi gaya tarik-menarik antar molekul air, molekulmolekul zat tersebut tidak larut dan akan mengendap dalam air (Azis, 2009).

13

2.4. Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Metode uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) diperkenalkan oleh Meyer pada tahun 1982 yang digunakan untuk memantau adanya aktifitas farmakologi (terutama anti kanker) dari suatu fraksi atau fraksi-fraksi tanaman. Metode BSLT ini mempunyai keunggulan: waktu pelaksanaan cepat, biaya relatif murah, praktis, tidak memerlukan teknik aseptis, tidak memerlukan perawatan khusus, menggunakan sampel relatif sedikit, tidak memerlukan serum hewan, hasil uji berkorelasi baik dengan beberapa metode uji sitotoksik. Prinsip uji BSLT adalah menarik hubungan antara konsentrasi larutan fraksi atau ekstrak terhadap respon kematian Artemia salina (Wahyono dan Rahman, 1995). Artemia salina Leach merupakan organisme sejenis udang-udangan yang berukuran kecil dan dikenal dengan nama brine shrimp. Artemia salina Leach digunakan sebagai hewan uji untuk menentukan ketoksikan suatu senyawa dalam ekstrak tumbuhan yang diwujudkan sebagai racun terhadap hewan uji. Senyawa bioaktif kebanyakan bersifat toksik pada dosis tinggi. Jadi, pengujian dengan organisme yang sederhana secara zoologis dapat digunakan secara monitor yang meyakinkan untuk skrining dan fraksinasi dalam penemuan senyawa bioaktif yang baru (Baraja, 2008). Juniarti et al. (2009) melakukan uji BSLT terhadap ekstrak daun saga (Abrus precatorius L.) menggunakan konsentrasi 10 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm dan 1000 ppm serta kontrol (0 ppm). Konsentrasi ini dilakukan untuk mengetahui

14

konsentrasi terkecil (LC10) dan konsentrasi terbesar (LC90) yang dapat mematikan Artemia salina. Hasil uji BSLT akan diketahui adanya senyawa bioaktif dengan mengetahui nilai LC50. Nilai LC50 merupakan angka yang menunjukan konsentrasi ekstrak yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50% dari jumlah hewan uji. Dalam Meyer (1982 dalam Juniarti et al. 2009), suatu zat dikatakan aktif bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak dan < 30 ppm untuk suatu senyawa.

2.5. Antioksidan Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegahnya terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat mencegah reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Akibatnya kerusakan sel dapat dihambat (Winarsi, 2007). Radikal bebas adalah senyawa kimia yang memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya, sehingga dapat menyerang senyawasenyawa lain seperti DNA, membran lipid, dan protein. Radikal ini akan merebut elektron dari molekul lain yang ada disekitarnya untuk menstabilkan diri, sehingga spesies kimia ini sering dihubungkan dengan terjadinya kerusakan sel, kerusakan jaringan, dan proses penuaan (Halliwell dan Gutteridge, 1999).

15

Dalam Winarsi (2007), secara umum antioksidan dikelompokkan menjadi 2, yaitu antioksidan enzimatis dan non-enzimatis. Antoksidan enzimatis misalnya enzim Super Oksidase Dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase. Antioksidan non-enzimatis masih dibagi dalam dua kelompok lagi yaitu antioksidan larut lemak seperti –tokoferol, karetonoid, flavonoid, quinon, dan bilirubin dan antioksidan larut air, seperti asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein pengikat heme. Antioksidan non-enzimatis dalam sayuran dan buah-buahan. Komponen yang bersifat antioksidan dalam sayuran dan buah-buahan meliputi vitamin C, E dan ßkaroten, flavonoid, isoflavon, antosianin, katekin, isokatekin dan asam lipoat. Senyawa fitokimia ini membantu melindungi sel dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas. Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, kateksin, flavonol dan kalkon. Sementara turunan asam sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-lain (Pokorni et al. 2001). Fungsi utama antioksidan digunakan sebagai upaya untuk memperkecil terjadinya proses oksidasi dari lemak dan minyak, memperkecil terjadinya proses kerusakan dalam makanan, memperpanjang masa pemakaian dalam industri makanan, meningkatkan stabilitas lemak yang terkandung dalam makanan serta mencegah hilangnya kualitas sensori dan nutrisi. Lipid peroksidasi merupakan salah

16

satu faktor yang cukup berperan dalam kerusakan selama dalam penyimpanan dan pengolahan makanan (Hernani dan Raharjo, 2005). Antioksidan tidak hanya digunakan dalam industri farmasi, tetapi juga digunakan secara luas dalam industri makanan, industri petroleum, industri karet dan sebagainya (Tahir et al. 2003). Pemeriksaan antioksidan dalam penelitian dilakukan dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Uji kimia ini telah digunakan secara luas pada penelitian fitokimia untuk menguji aktivitas penangkap radikal dari ekstrak atau senyawa murni. DPPH adalah suatu radikal stabil yang mengandung nitrogen organik, berwarna ungu gelap dengan absorbansi yang kuat pada panjang gelombang maksimum 517 nm. Setelah bereaksi dengan antioksidan warna larutan akan berkurang dan berubah menjadi kuning. Perubahan warna ini dapat diukur secara spektrofotometri (Reynertson, 2007)

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Gambar 2. Struktur DPPH Penurunan intensitas warna yang terjadi disebabkan oleh berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH. Hal ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan

17

satu elektron oleh zat antioksidan, menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk beresonansi (Pratimasari, 2009).

2.6. Antibakteri Penggunaan senyawa antimikroba khususnya yang alami, secara umum meningkat dari tahun ke tahun. Senyawa antimikroba merupakan senyawa yang mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Senyawa antimikroba yang terkandung dalam berbagai jenis ekstrak tanaman diketahui dapat menghambat beberapa mikroorganisme patogen maupun perusak pangan (Branen dan Davidson, 1993). Senyawa antimikroba yang berasal dari tanaman, sebagian besar diketahui merupakan metabolit sekunder tanaman, terutama golongan fenolik dan terpena. Sebagian besar metabolit sekunder dibiosintesis dari banyak metabolit primer seperti dari asam-asam amino, asetil ko-A, asam mevalonat, dan metabolit antara (Helber, 1995). Ditambahkan oleh Nychas dan Tassou (2000), beberapa senyawa yang bersifat antimikroba alami berasal dari tanaman diantaranya adalah fitoaleksin, asam organik, minyak essensial (atsiri), fenolik dan beberapa kelompok pigmen tanaman atau senyawa sejenis. Mikroorganisme dapat menyebabkan infeksi, menimbulkan penyakit, dan merusak bahan pangan. Mikroorganisme dapat dihilangkan, dihambat dan dibunuh dengan cara fisik maupun kimia. Senyawa antimikroba adalah zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme dan dapat digunakan untuk penelitian

18

pengobatan infeksi pada manusia, hewan dan tumbuhan. Antimikroba meliputi antifungi, antibakteri, antiprotozoa dan antivirus (Inayati, 2007). Antibakteri adalah suatu bahan yang mematikan bentuk-bentuk vegetatif bakteri (Pelczar dan Chan, 1988). Antibakteri adalah suatu zat yang dapat mencegah terjadinya pertumbuhan dan reproduksi bakteri. Antibakteri merupakan senyawa yang berfungsi sebagai bahan pengawet makanan untuk memperpanjang umur simpan suatu makanan dengan cara menghambat pertumbuhan mikroba. Efektifitas dari suatu bahan pengawet antibakteri ditentukan oleh konsentrasi dan jenis bahan pengawet. Umumnya bahan pengawet makanan hanya bersifat bakteriostatik karena jumlah yang ditambahkan ke dalam makanan sangat kecil agar tidak berbahaya bagi kesehatan manusia (Supardi dan Sukamto, 1999). Utami (2010) telah menguji aktivitas antibakteri distilat rimpang lengkuas merah dan ekstrak daun mengkudu dengan metode difusi kertas cakram dengan menggunakan konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80% dan 100%. Khoiriyah (2010) juga menggunakan konsentrasi yang sama untuk menguji aktivitas antibakteri dari minyak atsiri Jahe. 2.6.1. Mekanisme Kerja Antibakteri Mekanisme penghambatan dan kerusakan mikroorganisme oleh senyawa antibakteri berbeda-beda. Penghambatan mikroba oleh senyawa antibakteri secara umum dapat disebabkan oeh: (1) gangguan pada komponen penyusun sel; terutama komponen penyusunan dinding sel, (2) reaksi dengan membran sel yang dapat mengakibatkan perubahan permeabilitas dan kehilangan komponen penyusun sel, (3)

19

penghambatan terhadap sintesis protein dan (4) gangguan fungsi material genetik (Davidson, 2001). Menurut Kanazama et al. (1995) mekanisme terjadinya proses tersebut diatas disebabkan oleh adanya pelakatan senyawa antimikroba pada permukaan sel mikroba dan senyawa tersebut berdifusi ke dalam sel. 2.6.2. Pengukuran Aktivitas Antibakteri Di dalam Kusmiyati dan Agustini (2006), Pengukuran aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan metode pengenceran. Metode difusi merupakan salah satu metode yang sering digunakan, metode difusi dapat dilakukan 3 cara yaitu metode silinder, lubang dan cakram kertas. Metode pengenceran yaitu mengencerkan zat antimikroba dan dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi steril. Ke dalam masing-masing tabung itu ditambahkan sejumlah mikroba uji yang telah diketahui jumlahnya. Pada interval waktu tertentu, dilakukan pemindahan dari tabung reaksi ke dalam tabung-tabung berisi media steril yang lalu diinkubasikan dan diamati penghambatan pertumbuhan. Seleksi aktivitas antibakteri dengan difusi sumur dan difusi cakram digunakan sebagai uji pendahuluan. Metode ini dipengaruhi oleh ketebalan lapisan agar dan volume ekstrak yang terserap dalam cakram (Dorman dan Deans, 2000). Metode cakram kertas yaitu meletakkan cakram kertas yang telah direndam larutan uji di atas media padat yang telah diinokulasi dengan bakteri. Setelah diinkubasi, pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan disekeliling cakram (Kusmiyati dan Agustini, 2006).

20

Penghambatan mikroorganisme oleh suatu senyawa antibakteri dinyatakan dengan nilai MIC (Minimum Inhibitory Consentration) yaitu konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme sebanyak 90 % dari inokulum asal selama inkubasi 24 jam (Cossentio et al., 1999). Nilai MIC dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration) senyawa antibakteri dari ekstrak rempah-rempah maupun tanaman berbeda-beda bergantung pada jenis mikroorganisme dan senyawa antimikroba. Fase pertumbuhan bakteri berpengaruh terhadap sensitifitas antibakteri terhadap senyawa antimikroba. Bakteri pada fase stasioner lebih sensitif terhadap antibakteri (Thompson dan Hinton, 1996). Pengujian antibakteri dilakukan pada fase midlog yaitu pertengahan fase logaritmik (eksponensial), yaitu dimana bakteri sedang aktifnya membelah diri, sehingga pengaruh senyawa antibakteri dapat dilihat dengan adanya kematian atau hambatan pada pertumbuhan bakteri.

2.7. Kloramfenikol Kloramfenikol merupakan suatu antibiotik spektrum luas yang berasal dari beberapa jenis Streptomyces misalnya S. venezuelae, S. phaeochromogenes var. chloromyceticus, dan S.omiyamensis (Kurniawan, 2006). Antibiotik ini memberikan efek dengan cara bereaksi pada subunit 50S ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase. Enzim ini berfungsi membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang baru melekat pada tRNA dengan asam amino yang masih

21

berkembang. Sebagai akibatnya sintesis protein bakteri akan terhenti seketika (Pratiwi, 2002). Dalam Kurniawan (2006) dijelaskan kloramfenikol mempunyai rumus kimia yang cukup sederhana yaitu 1-(pnitrofenil)- 2-dikloroasetamido-1,3-propandiol:

Gambar 3. Struktur kloramfenikol

Kloramfenikol adalah salah satu antibiotik yang secara kimiawi diketahui paling stabil dalam segala pemakaian. Kloramfenikol memiliki stabilitas yang sangat baik pada suhu kamar dan kisaran pH 2 sampai 7, stabilitas maksimumnya dicapai pada pH 6. Pada suhu 25oC dan pH 6, memiliki waktu paruh hampir 3 tahun (Connors, 1992).

2.8. Bakteri Uji Berdasarkan perbedaannya dalam menyerap warna, bakteri dibagi atas dua golongan yaitu bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif menyerap zat warna pertama yaitu kristal violet yang menyebabkannya berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif menyerap zat warna kedua yaitu safranin dan menyebabkan warna merah (Dwidjoseputro, 1988). Bakteri gram positif memiliki

22

kandungan peptidoglikan yang tinggi (dapat mencapai 50%) dibandingkan bakteri gram negatif (sekitar 10%). Sebaliknya kandungan lipida dinding sel bakteri gram positif lebih rendah sedangkan pada dinding sel bakteri gram negatif tinggi yaitu sekitar 11-22% (Lay, 1992). 2.8.1. Escherichia coli Escherichia coli adalah salah satu contoh dari bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek (kokobasil), selnya berukuran 0,5-1,0 x 1,0-3,0 μm. Bakteri ini tidak membentuk spora, tidak tahan asam, sebagian besar bergerak (motil) dengan flagel peritricus (merata tersebar ke seluruh permukaan sel) tetapi ada pula yang nonmotil, dan beberapa strain mempunyai kapsul. Bakteri ini dapat tumbuh secara anaerob fakultatif (umumnya bersifat kemoheterotrof). Nilai pH optimum untuk pertumbuhan adalah 7,0-7,5 serta kisaran suhu pertumbuhannya 10oC - 40oC dengan suhu optimum 37oC. E.coli sangat sensitif terhadap panas (Fardiaz, 1983). Khotimah (2009) telah meneliti fase pertumbuhan E. coli dengan menggunakan metode turbidimetri pada medium Nutrient Broth, diketahui fase adaptasi berlangsung dari menit ke-0 sampai menit ke-210, selanjutnya diikuti dengan fase logaritmik berlangsung dari menit ke-210 sampai menit ke-450. Setelah itu, bakteri berada pada fase stasioner dimana jumlah sel yang tumbuh hampir sama dengan jumlah sel yang mati dan akhirnya bakteri mengalami penurunan jumlah sel, hal ini diakibatkan oleh nutrisi yang semakin berkurang atau terakumulasinya limbah metabolisme.

23

E. coli bersifat patogen oportunis, banyak ditemukan pada manusia dan hewan sebagai penghuni normal dalam saluran pencernaan, habitat pada umumnya adalah tanah, lingkungan aquatik, makanan, air seni, dan tinja (Fardiaz, 1983). Karena sifatnya patogen, bakteri ini dapat menyebabkan beberapa infeksi primer pada usus (misalnya diare pada anak), infeksi pada saluran pada kemih, pneumia, abses, dan maningritis pada bayi yang baru lahir (Jawezt et al. 1996). 2.8.2. Staphylococcus aureus Staphylococcus adalah salah satu perwakilan dari bakteri gram positif, bentuk kokus dengan susunan berpasangan atau bergerombol, seperti anggur. Bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif, katalase positif, oksidase negatif, bersifat non motil, tidak membentuk spora. Staphylococcus tumbuh dengan cepat pada beberapa tipe media dan aktif melakukan metabolisme serta melakukan fermentasi karbohidrat. Staphylococcus menghasilkan bermacam-macam pigmen, dari warna putih hingga kuning gelap (Brooks et al. 2005). Fase pertumbuhan S. aureus dengan menggunakan metode turbidimetri pada medium Nutrient Broth, diketahui fase adaptasi berlangsung dari menit ke-0 sampai menit ke-360, selanjutnya diikuti dengan fase logaritmik berlangsung dari menit ke360 sampai menit ke-600. Setelah itu, bakteri berada pada fase stasioner dimana jumlah sel yang tumbuh hampir sama dengan jumlah sel yang mati dan akhirnya bakteri mengalami penurunan jumlah sel, hal ini diakibatkan oleh nutrisi yang semakin berkurang atau terakumulasinya limbah metabolisme (Khotimah, 2009).

24

Hanya galur-galur tertentu S. aureus menghasilkan enterotoksin. Pada umumnya galur ini adalah koagulasi positif, yaitu mempunyai kemampuan mengkoagulasi plasma darah yang diberi sitrat atau oksalat. Enterotoksin ini tahan panas, tidak berubah walau telah didihkan selama 30 menit. Dibiarkannya makanan yang tercemar pada suhu ruang selama 8 sampai 10 jam cukup untuk menghasilkan toksin dalam jumlah yang memadai untuk menyebabkan keracunan makanan. Walaupun makanan ini disimpan dalam lemari es selama berbulan-bulan, toksinnya tidak akan termusnahkan. Jika dilakukan pemanasan kembali pada makanan tersebut, maka tidak mengurangi kandungan toksin tersebut (Irianto, 2006)

2.9. GC-MS 2.9.1. Prinsip Dasar GC-MS Kromatografi

gas

spektroskopi

massa

adalah

teknik

analisis

yang

menggabungkan dua metode analisis yaitu Kromatografi Gas dan Spektroskopi Massa. Kromatografi gas merupakan metode analisis dimana sampel terpisahkan secara fisik menjadi bentuk molekul-molekul yang lebih kecil (hasil pemisahan dapat dilihat berupa kromatogram). Sedangkan spektroskopi massa adalah metode analisis dimana sampel yang akan dianalisis diubah menjadi ion-ionnya, dan massa dari ionion tersebut dapat diukur (hasil deteksi dapat dilihat berupa spektrum massa) (Lingga, 2004). Pada GC hanya terjadi pemisahan untuk mendapatkan komponen yang diinginkan, sedangkan bila dilengkapi dengan MS (berfungsi sebagai detektor) akan

25

dapat mengidentifikasi komponen tersebut, karena bisa mendapat spektrum bobot molekul pada suatu komponen yang dapat dibandingkan langsung dengan Library (reference)

pada

software.

Sampel-sampel

yang

dapat

dianalisis

dengan

menggunakan GCMS, harus memenuhi beberapa syarat, diantaranya (Lingga, 2004): 1) Dapat diuapkan pada hingga suhu 400oC 2) Secara termal stabil (tidak terdekomposisi pada suhu 400oC) 3) Sampel-sampel lainnya dapat dianalisis setelah melalui tahapan preparasi khusus. 2.8.2 Proses Pemisahan Pada GC-MS Pemisahan komponen senyawa dalam GC-MS terjadi di dalam kolom (kapiler) GC dengan melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam adalah zat yang ada di dalam kolom, sedangkan fase gerak adalah gas pembawa (Helium maupun Hidrogen dengan kemurnian tinggi, yaitu ± 99,995 %) (Hermanto, 2008). Lebih lanjut Hermanto (2008), proses pemisahan dapat terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan alir dari tiap molekul di dalam kolom. Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan afinitas antar molekul dengan fase diam yang ada di dalam kolom. Selanjutnya komponen-komponen yang telah dipisahkan tersebut masuk ke dalam ruang MS yang berfungsi sebagai detektor secara instrumentasi, MS adalah detektor bagi GC.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Kimia dan Pangan Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Analisis GC-MS dilaksanakan di Laboratorium Forensik Mabes Polri, Jakarta Selatan. Adapun waktu penelitian dilaksanakan pada Bulan April sampai Oktober 2010.

3.2. Bahan dan Alat 3.2.1. Bahan Bahan yang digunakan adalah daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) yang diperoleh dari Balai Tanaman Rempah dan Obat (Balitro), larva udang (Brine Shrimp), larutan garam 10%, Nutrient Agar, Nutrient Broth, Mueller Hinton Agar, biakan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi PLT UIN Jakarta, kloramfenikol, kertas cakram dan kertas whatman no.1. 3.2.2. Alat Alat yang digunakan adalah belender, alat penyerbuk (grinding mill), vakum evaporator, vial, beaker glass, tabung reaksi, erlenmeyer, cawan petri, timbangan analitik, spekrofotometer, GC-MS Agilent 19091S-436 HP-5MS dan autoklaf.

26

3.3. Cara Kerja Metode yang dilakukan dalam penelitian ini adalah preparasi sampel, ekstraksi dengan maserasi, uji adanya senyawa bioaktif dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test), pembuatan medium, peremajaan bakteri uji, pembuatan inokulum, uji antibakteri dengan metode difusi (cakram kertas), uji MIC (Minimum Inhibitory Consentration) dan Analisis senyawa menggunakan GCMS (Gas Chromatography Mass Spectrometer). Tahapan penelitian akan dilakukan sebagai berikut:

3.3.1. Preparasi Sampel Daun kecombrang kering didapatkan dari Balai Tanaman Obat dan Aromatik (Balitro) Bogor dan dideterminasi di Herbarium Bogoriense - LIPI Cibinong.

3.3.2. Ekstraksi Ekstrak

daun

dihasilkan

melalui

ekstraksi

yang

dilakukan

dengan

menggunakan metode maserasi. Daun kering diserbukkan dengan menggunakan grinding mill, kemudian serbuk daun kecombrang direndam dengan aquabidest selama 3 hari. Setelah itu hasil rendaman disaring dengan kertas saring Whatman no.1. Hasilnya dipekatkan menggunakan vakum rotary evaporator dengan suhu 50oC dengan kecepatan 90 rpm sehingga yang tersisa adalah ekstrak daun berupa gel.

27

3.3.3. Uji Senyawa Bioaktif dengan Metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) 3.3.3.1. Penetasan Larva udang Bejana disiapkan untuk penetasan larva udang. Proses pemetasan larva di dalam bejana yang diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, sedangkan diruangan sebelahnya diberi larutan garam (Larutan Nacl 10% (b/v)). Ke dalam larutan garam dimasukkan ± 50-100 mg telur udang untuk diteteskan. Pada bagian telur ditutup dengan allumunium foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur. Larva udang diambil dengan menggunakan pipet dan selanjutnya akan digunakan untuk uji BSLT. 3.3.3.2. Persiapan Larutan Sampel yang akan diuji Ekstrak sampel dibuat dalam konsentrasi 10, 100, 200, 500, dan 1000 ppm dalam larutan garam. 3.3.3.3. Prosedur Uji Senyawa Bioaktif dengan Metode BSLT Sebanyak 100 μL larutan garam yang mengandung larva udang sebanyak 1012 ekor dipipet dan dimasukkan ke dalam vial. Kemudian, larutan garam tersebut ditambahkan masing-masing sebanyak 100 μL ekstrak air daun kecombrang dengan konsentrasi 10, 100, 200, 500 dan 1000 ppm. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan (triplikat). Larutan diaduk sampai homogen. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel. Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan masih hidup dari tiap vial. Angka mati dihitung dengan menjumlahkan larva yang mati dalam setiap konsentrasi (3 vial). Angka

28

hidup dihitung dengan menjumlahkan larva yang hidup dalam setiap konsentrasi (3 vial). Tabel 2. Perhitungan akumulasi mati tiap konsentrasi (Juniarti et al. 2009) Konsentrasi (ppm)

Angka Mati

10

Angka mati pada konsentrasi 10 ppm

100

Angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100 ppm

200 500 1000

Angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100 ppm + angka mati pada konsentrasi 200 ppm Angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100 ppm + angka mati pada konsentrasi 200 ppm + angka mati pada konsentrasi 500 ppm Angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100 ppm + angka mati pada konsentrasi 200 ppm + angka mati pada konsentrasi 500 ppm + angka mati pada konsentrasi 1000 ppm

Tabel 3. Perhitungan akumulasi hidup tiap konsentrasi (Juniarti et al. 2009) Konsentrasi (ppm) 10

100 200 500 1000

Angka Hidup Angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup pada konsentrasi 200 ppm + angka hidup pada konsentrasi 100 ppm + angka hidup pada konsentrasi 10 ppm Angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup pada konsentrasi 200 ppm + angka hidup pada konsentrasi 100 ppm Angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup pada konsentrasi 200 ppm Angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm Angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm

29

Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara: akumulasi mati dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Nilai LC50 merupakan konsentrasi dimana zat menyebabkan kematian 50% yang diperoleh dengan menggunakan softwear regresi. Suatu zat dikatakan aktif bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak dan < 30 ppm untuk suatu senyawa.

3.3.4. Uji Antioksidan 3.3.4.1. Pembuatan Kurva Standar 200 µl BHA standar konsentrasi 0 ppm, 18 ppm, 36 ppm, 72 ppm, dan 90 ppm dimasukkan masing-masing ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya, 800 µl Tris Hcl pH 7,4 dan 1 ml DPPH ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Larutan dalam tabung reaksi divortex hingga homogen dan diinkubasi 20 menit di ruang gelap. Selanjutnya diukur jumlah antioksidan dengan melihat serapannya dengan spekrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. 3.3.4.2. Pengujian Antioksidan 200 µl sampel konsentrasi 0 ppm (kontrol), 10 ppm, 30 ppm, 50 ppm, 70 ppm, dan 90 ppm dimasukkan masing-masing ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya, 800 µl Tris Hcl pH 7,4 dan 1 ml DPPH ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Larutan dalam tabung reaksi divortex hingga homogen dan diinkubasi 20 menit di ruang gelap. Selanjutnya jumlah antioksidan diukur dengan melihat serapannya dengan spekrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm.

30

Aktivitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan radikal DPPH melalui perhitungan persentase inhibisi serapan DPPH dengan menggunakan rumus : % Inhibisi = Abs. Kontrol – Abs. Sampel x 100 % Abs. Kontrol Ket : Abs. kontrol : Serapan radikal kontrol Abs. Sampel : Serapan sampel Selanjutnya ditentukan harga IC50, yakni konsentrasi larutan uji yang memberikan peredaman DPPH sebesar 50% dengan menggunakan softewear regresi.

3.3.5. Pembuatan Medium 3.3.5.1. Pembuatan Medium Nutrient Broth (NB) dan Nutrient Agar (NA) Sebanyak 8 gram bubuk NB atau 23 gram NA dilarutkan dalam 1 liter aquadest dalam enlenmeyer kemudian diaduk menggunakan magnetic stirer sampai homogen. Selanjutnya larutan disterilisasi di autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. 3.3.5.2. Pembuatan Medium Mueller Hinton Agar (MHA) Sebanyak 38 gram MHA dilarutkan dalam 1 L aquadest kemudian dipanaskan dan diaduk dengan menggunakan magnetik stirer sampai homogen. Media disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC, tekanan 1,5 atm dan selama 15 menit. Setelah disterilisasi, medium Medium MHA dimasukkan ke dalam cawan petri sebanyak 15 ml dan dibiarkan mengeras. 31

3.3.6. Peremajaan Bakteri Uji dan Pembuatan Suspensi Bakteri Bakteri uji dibiakkan pada agar miring steril kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Bakteri yang telah dibiakkan pada agar miring ditambahkan larutan fisiologis NaCl 0,9% steril sebanyak 5 ml kemudian dihomogenkan dengan vortek

3.3.7. Pembuatan Inokulum Suspensi bakteri uji sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam 100 ml medium NB. Selanjutnya medium NB diinkubasi di shaker inkubator dengan kecepatan shaker 120 rpm, suhu ruang, sampai bakteri uji mencapai 8 jam.

3.3.8. Pengujian Antibakteri 3.3.8.1. Difusi Cakram Pengujian ini dilakukan dengan metode difusi kertas cakram dengan menggunakan konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80% dan 100%. Biakan dalam NB sebanyak 0.1 ml dimasukkan ke dalam 15 ml MHA yang sudah padat. Ekstrak kecombrang dibuat dengan dengan berbagai konsentrasi sebanyak 0,03 ml diambil menggunakan mikropipet 0,01 ml pada kertas cakram steril berdiameter 1,6 cm kemudian ditanam pada medium MHA padat dalam cawan petri. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Selanjutnya diameter zona hambat diukur dan dibandingkan dengan zona hambat pada kontrol kloramfenikol 10µg.

32

3.3.8.2. MIC (Minimum Inhibitory Consentration) Penentuan MIC dilakuan dengan metode kontak. Sebanyak 1 ml ekstrak dan 0,1 ml inokulum dimasukkan ke tabung uji yang berisi medium NB 3,9 ml yang telah disterilkan. Selanjutnya, tabung uji diinkubasi dalam shaker incubator pada suhu kamar selama 24 jam dengan kecepatan 120 rpm. Setelah diinkubasi, media diambil sebanyak 10 µl dan ditanam pada media NA. Setelah 24 jam dilakukan perhitungan jumlah bakteri yang tumbuh. Nilai MIC yaitu konsentrasi minimum ekstrak yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji sebanyak 90% selama 24 jam.

3.3.9. Analisa GC-MS Dalam penelitian ini digunakan analisa GC-MS untuk menganalisa dan mengidentifikasi senyawa yang terdapat pada hasil ekstraksi daun kecombrang. GCMS yang digunakan adalah Agilent 19091S-436 HP-5MS. Untuk menganalisa hasil ekstraksi daun kecombrang sebanyak ± 0.5 µl sampel dimasukkan kedalam kolom polar, 0.25mm, 60m, 0.25um.

3.4. Analisis Data Semua analilisa akan diulang sebanyak tiga kali dari sampel yang berbeda dan akan diuji dengan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf α 0,05.

33

35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Ekstraksi Daun Kecombrang Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah air. Pelarut air adalah pelarut yang biasa digunakan dalam kehidupan sehari-hari dan insdustri pangan. Selain itu, penggunaan pelarut air diharapkan mampu mengekstrak zat aktif yang bersifat polar. Dalam Naufalin (2005), ekstrak heksana (nonpolar) bunga kecombrang tidak menunjukkan aktifitas antibakteri, sedangkan ekstrak etanol (polar) bunga kecombrang mampu menghambat aktifitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Aeromonas hydrophilia, dan Pseudomonas aeruginosa.

Walaupun

aktifitas

antibakteri

ekstrak

etil

asetat

(semipolar)

menunjukkan aktifitas yang lebih tinggi daripada ekstrak etanol (polar). Hasil ekstraksi daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) secara maserasi dengan menggunakan air menghasilkan 59 ml ekstrak dari 90 gram serbuk daun kecombrang kering (Gambar 4a) dalam 1500 ml pelarut air. Hasil ekstrak berwarna kecoklatan dan penampakan cairan agak kental (Gambar 4b) dengan viskositas 0,01 menit 40 detik.

35

(a)

(b)

Gambar 4. Ekstraksi Daun Kecombrang (a) Serbuk daun kecombrang, (b) Hasil ekstrak daun kecombrang

4.2. Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Uji BSLT adalah uji pendahuluan yang dilakukan untuk mengetahui adanya suatu senyawa aktif didalam ekstrak, yang ditandai dengan matinya hewan uji yaitu Artemia salina. Senyawa bioaktif kebanyakan bersifat toksik pada dosis tinggi. Jadi, pengujian dengan organisme yang sederhana secara zoologis dapat digunakan secara monitor yang meyakinkan untuk skrining dan fraksinasi dalam penemuan senyawa bioaktif baru (Baraja, 2008). Senyawa-senyawa tersebut kemungkinan merupakan senyawa bioaktif yang dapatsdigunakan dalam dunia kedokteran misalnya sebagai antikanker (Khurniasari, 2004). Pada Tabel 4 menunjukkan persentasi mortalitas Artemia salina sebesar 7,35% sampai 100%. Pada konsentrasi 0 ppm persentasi kematiannya sebesar 7,35%, 10 ppm persentasi kematiannya 31,3%, 100 ppm persentasi kematiannya 80,3%, 500

35

ppm persentasi kematiannya 100% dan 1000 ppm persentasi kematiannya sebesar 100%. Selanjutnya data tersebut dimasukkan ke dalam softwear regresi hasilnya nilai LC50 Artemia salina terhadap ekstrak air daun kecombrang adalah 53,08 ppm. Tabel 4. Hasil Uji BSLT Ekstrak Air Daun Kecombrang Konsentrasi (ppm)

Angka Mati

Angka Hidup

Akumulasi Mati

Akumulasi Hidup

Akumulasi mati/total

Mortalitas (%)

0

5

28

5

63

5/68

7,35

10

11

25

16

35

16/51

31,3

100

25

7

41

10

41/51

80,3

200

28

3

69

3

69/72

95,8

500

33

0

102

0

102/102

100

1000

30

0

132

0

132/132

100

LC50*

53,08 ppm

Ket: * = Hasil LC50 didapat dengan menggunakan softwear regresi

Dari Tabel 4 terlihat semakin tinggi konsentrasi ekstrak, mortalitas Artemia salina juga semakin besar. Hal ini sesuai dengan Harborne (1994) yang menyebutkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka sifat toksiknya akan semakin tinggi, sehingga semakin tinggi kematian Artemia salina. Adanya larva uji dalam kontrol yang mati disebabkan karena kematian yang alami. Menurut Nurhayati et al. (2006) Artemia yang mati pada kontrol mengalami penurunan aktivitas. Hal ini dapat dilihat dari perlakuan artemia sesaat sebelum mati. Semakin lama, Artemia dalam kontrol semakin lemah dan berada dalam dasar tabung.

35

Sedangkan Artemia yang mati dalam tabung percobaan karena perlakuan, mengalami disorentasi gerak (gerakaannya tidak teratur). Artemia dalam tabung ini tetap aktif bergerak, akan tetapi tetap berputar-putar dalam satu titik. Menurut Meyer (1982 dalam Juniarti et al. 2009), suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ekstrak dan < 30 ppm untuk suatu senyawa. Nilai LC50 merupakan angka yang menunjukan konsentrasi ekstrak yang dapat menyebabkan kematian sebesar 50% dari jumlah hewan uji. Berdasarkan uji bioaktivitas didapatkan hasil nilai LC50 adalah 53,08 ppm, sehingga ekstrak air daun kecombrang dikatakan aktif atau memiliki senyawa aktif. Senyawa aktif ini dapat berupa antimikroba (antibakteri dan antikapang), antioksidan dan antikanker. Sifat aktif dari daun kecombrang disebabkan oleh kandungan senyawa yang ada di dalamnya. Dari hasil analisa GCMS diketahui ekstrak air daun kecombrang dengan pelarut etanol mengandung 62 komponen senyawa (Lampiran 14). Dalam Hidayat dan Hutapea (1991), daun kecombrang mengandung saponin dan flavonoida Sedangkan berdasarkan hasil GCMS, minyak atsiri daun kecombrang memiliki 62 komponen kimia, yang terbanyak adalah 3-carene (28,167%) dan ß-pinen (20,937%), keduanya merupakan golongan monoterpena yang mempunyai aktivitas antimikroba (Widiatmojo, 2009). Dalam Jaffar et al. (2007) minyak esensial daun kecombrang mengandung ß–pinena (19.7%), karyofilena (15,36%) dan (E)-ßfarnesena (27,90%).

35

4.3. Uji Antioksidan Antioksidan adalah bahan yang dalam kadar rendah dapat

mencegah

terjadinya oksidasi dari substrat yang mudah teroksidasi. Metode uji antioksidan dengan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) dipilih karena metode ini adalah metode sederhana untuk evaluasi aktivitas antioksidan dari senyawa bahan alam (Fagliano 1999). DPPH adalah suatu radikal stabil yang mengandung nitrogen organik, berwarna ungu gelap dengan absorbansi yang kuat pada panjang gelombang maks 517 nm. Setelah bereaksi dengan antioksidan warna larutan akan berkurang dan berubah menjadi kuning. Perubahan warna ini dapat diukur secara spektrofotometri (Reynertson, 2007). Peredaman tersebut dihasilkan oleh bereaksinya molekul Difenil Pikril Hidrazil dengan atom hidrogen yang dilepaskan satu molekul komponen sampel sehingga terbentuk senyawa Difenil Pikril Hidrazin (Gambar 5). H N-N(C6H5)2 O2N

N-N(C6H5)2

NO2

O2N

NO2

+ AH

NO2

+ A

NO2

DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) + Antioksidan → 1,1-Difenil-2-picrilhidrazin + Antioksidan

Gambar 5. Reaksi DPPH Dengan Antioksidan

Untuk mengetahui banyaknya senyawa antioksidan dalam ekstrak daun kecombrang, terlebih dahulu dibuat kurva standar. Dalam Kusnawidjaja (2007), kurva standar melukiskan hubungan antara konsentrasi dan optical dencity (OD).

35

Pembuatan

kurva

standar

dilakukan

dengan

menggunakan

BHA

(butil

hidroksianisol). Dalam Widianti (2010), BHA adalah antioksidan sintesis yang biasa digunakan untuk lemak dan minyak makanan. BHA digunakan sebagai pembanding pada antioksidan pada ekstrak air daun kecombrang. Hasil kurva standar dapat dilihat pada Gambar 6.

Gambar 6. Kurva standar BHA (butil hidroksianisol) Kurva standar juga menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang erat antara konsentrasi dengan persentasi inhibisi. Hal ini diperlihatkan dengan nilai r (koefisien korelasi). Nilai r yang mendekati 1 membuktikan bahwa persamaan regresi tersebut adalah linier dan simpangan baku yang kecil menunjukkan ketepatan yang cukup tinggi. Nilai koefisien korelasi menyatakan bahwa terdapat korelasi antara konsentrasi sampel dengan persentase inhibisi sebesar 0,96. Hal ini menunjukkan bahwa lebih dari 96% keakuratan data dipengaruhi oleh konsentrasi bahan, sedangkan kurang dari 4% dipengaruhi oleh faktor lain.

35

Tabel 5. Hasil pengujian aktifitas antioksidan ekstrak air daun kecombrang Konsentrasi Optical dencity % inhibisi IC50* (ppm) (OD) 0 0,5734 0 10 0,5131 10, 51 30 0,504 12,1 24,39 mg/L 50 0,4363 23,89 70 0,3958 30,97 90 0,3182 44,5 Ket: * = Hasil LC50 didapat dengan menggunakan softwear regresi

Hasil pengujian aktifitas antioksidan ekstrak air daun kecombrang dapat dilihat pada Tabel 5. Hasil pengujian menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi pelarut, maka semakin tinggi persentase inhibisinya, hal ini disebabkan pada sampel yang semakin banyak, maka semakin tinggi kandungan antioksidannya sehingga berdampak juga pada tingkat penghambatan radikal bebas yang dilakukan oleh zat antioksidan tersebut. Dalam Mardawati et al. (2008), secara spesifik suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 50, kuat untuk IC50 bernilai 50-100, sedang jika IC50 bernilai 100-150, dan lemah jika IC50 adalah 151200.

IC50

adalah

bilangan

yang

menunjukkan

konsentrasi

ekstrak

(mikrogram/mililiter) yang mampu menghambat proses oksidasi sebesar 50 %. Semakin kecil nilai IC50 berarti semakin tinggi aktivitas antioksidan. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak air daun kecombrang menggunakan metode DPPH (2,2-diphenil1-picrylhydrazil radical) memberikan nilai IC50 sebesar 24,39 mg/L, sehingga dapat diketahui aktifitas dari ekstrak air daun kecombrang sangat kuat.

35

Dalam Rohman dan Riyanto (2005), ekstrak etanol daun kemuning diuji daya antioksidannya dengan metode DPPH dan hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun kemuning mempunyai nilai IC50 sebesar 126,17 μg/ml, 15 kali lebih lemah dibanding dengan vitamin E (IC50 vitamin E = 8,27 μg/ml). Zuhra et al. (2008) menuliskan senyawa flavonoid dari daun katuk (Sauropus androginus (L) Merr.) memiliki nilai IC50 sebesar 80,81 μg/ml. Dalam Andayani et al. (2008), nilai IC50 dari ekstrak metanol buah tomat adalah 44,06 µg/ml. Hanani (2005) meneliti nilai IC50 dari vitamin C dan BHT (butil hidroksitoluen) yaitu 3,45 µg/ml dan 3,81 µg/ml. Dengan membandingkan nilai IC50, maka diketahui ekstrak air daun kecombrang memiliki kemampuan antioksidan lebih rendah dibandingkan dengan vitamin E, vitamin C dan BHT (butil hidroksitoluen) namun lebih tinggi dibanding dengan ekstrak etanol daun kemuning, daun katuk (Sauropus androginus (L) Merr.) dan ekstrak metanol buah tomat.

4.4. Uji Antibakteri 4.4.1. Uji Antibakteri menggunakan metode difusi cakram Metode difusi cakram adalah uji antibakteri yang dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk menyeleksi adanya aktivitas antibakteri dari daun kecombrang terhadap bakteri uji, dalam ini diwakili oleh bakteri gram positif Staphylococcus aureus dan bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli. Aktivitas antibakteri diketahui dengan melihat ada tidaknya daerah hambatan (zona hambat) disekeliling

35

cakram pada pertumbuhan bakteri di media padat. Semakin besar diameter zona hambat, maka semakin besar aktivitas antibakteri. Hasil penelitian diperoleh variasi diameter zona hambat yang dihasilkan ekstrak air daun kecombrang terhadap bakteri S. aureus dan E. coli dapat dilihat pada Gambar 7. Ekstrak air daun kecombrang dapat menghambat pertumbuhan bakteri E. coli pada konsentrasi tertinggi yaitu 100%. Namun, ekstrak air daun kecombrang sudah dapat menghambat pertumbuhan S. aureus pada konsentrasi 20%. Dari hasil tersebut mengindikasikan bahwa untuk menghambat pertumbuhan E. coli dibutuhkan konsentrasi yang lebih besar dibandingkan dengan untuk menghambat S. aureus. Hasil diameter zona hambat ekstrak air daun kecombrang terhadap S. aureus pada konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80% dan 100% didapatkan besar zona hambat yang berbeda-beda, yaitu berturut adalah 8,663 mm, 14,223 mm, 15,33 mm, 20,08 mm, dan 21,36 mm. Dari hasil uji diketahui semakin tinggi konsentrasi yang digunakan maka semakin tinggi daya hambatnya. Hal ini dikarenakan semakin tinggi konsentrasi semakin banyak kandungan bahan aktif antibakterinya. Menurut Jenie dan Kuswanto (1994) bahwa keefektifan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan tergantung pada sifat mikroba uji, konsentrasi dan lamanya waktu kontak. Sifat biostatistik dapat meningkat dengan semakin tingginya konsentrasi yang ditambahkan.

35

Gambar 7. Diameter zona hambat ekstrak air daun kecombrang pada Escherichia coli dan Staphylococcus aureus Mengacu pada standart umum yang dikeluarkan oleh Departemen Kesehatan (1988) disebutkan bahwa mikroba dinyatakan peka terhadap antimikroba asal tanaman apabila mempunyai ukuran diameter daya hambatannya 12 - 24 mm. Hasil pengamatan tersebut menunjukkan bahwa ekstrak air daun kecombrang peka atau sensitif pada konsentrasi 40% terhadap pertumbuhan bakteri S. aureus dengan diameter daya hambat yang dihasilkan lebih dari standart yang ditentukan oleh Departemen Kesehatan yaitu berdiameter 12 sampai 24 milimeter. Namun ekstrak air daun kecombrang tidak peka atau sensitif terhadap E. coli karena kurang dari standart yang ditentukan oleh Departemen Kesehatan. Berdasarkan analisis statistik menggunakan anova satu arah pada ekstrak air daun kecombrang terhadap S. aureus didapatkan bahwa H0 diterima dan H1 ditolak sehingga hipotesis yang diterima adalah tidak ada perbedaan yang nyata dan signifikan. Hal ini dikarenakan tidak ada perbedaan yang terlalu jauh antara diameter zona hambat dengan besarnya konsentrasi yang digunakan. Berdasarkan analisa

35

statistik menggunakan anova satu arah pada ekstrak air daun kecombrang terhadap E. coli didapatkan analisa yaitu H0 ditolak dan H1 diterima sehingga hipotesis yang diterima adalah perbedaan yang nyata dan signifikan antara diameter zona hambat dengan besarnya konsentrasi yang digunakan. Ekstrak air daun kecombrang memiliki efektifitas menghambat lebih tinggi terhadap S. aureus dibanding E. coli. Dalam Palmer et al. (1998) bakteri gram positif seperti S. aureus lebih sensitif terhadap 21 jenis minyak atsiri tumbuhan dibandingkan bakteri gram negatif. Kusmiyati dan Agustini (2006) menuliskan aktivitas ekstrak B dari kultur Porphyridium cruentum tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif (E. coli), tetapi dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (Bacillus subtilis dan S. aureus). Selain itu, Hartini et al. (2008) membuktikan hasil aktivitas antimikroba ekstrak etanol buah, ekstrak etanol kulit batang pulasari, ekstrak etanol buah adas dan kulit batang pulasari (4 : 3) menunjukkan bahwa aktivitas terhadap S. aureus lebih besar dibandingkan terhadap E. coli. Respon yang berbeda dari dua golongan bakteri terhadap senyawa ini disebabkan karena adanya perbedaan kepekaan pada bakteri gram positif dan bakteri Gram negatif terhadap senyawa antibakteri yang terkandung dalam ekstrak air daun kecombrang. Bakteri gram positif cenderung lebih sensitif terhadap komponen antibakteri. Hal ini disebabkan oleh struktur dinding sel bakteri gram positif lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antibakteri untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja, sedangkan struktur dinding sel bakteri gram

35

negatif lebih kompleks dan berlapis tiga, yaitu lapisan luar berupa lipoprotein, lapisan tengah yang berupa peptidoglikan dan lapisan dalam lipopolisakarida (Pelczar dan Chan, 1986). Pengaruh antimikroba juga dipengaruhi oleh pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi. Air bersifat relatif polar sehingga senyawa yang tersari relatif bersifat polar. Kepolaran senyawa inilah yang mengakibatkan senyawa ini lebih mudah menembus dinding sel bakteri Gram positif sehingga terlihat diameter zona hambat S. aureus lebih besar dibandingkan dengan E. coli. Hal ini disebabkan mayoritas dinding sel bakteri gram negatif terdiri atas kandungan lipid yang lebih banyak daripada sel bakteri gram positif yang mayoritas kandungan dinding selnya adalah peptidoglikan. Sehingga, jika senyawa yang bersifat polar sukar untuk melalui dinding sel gram negatif. Hougton dan Raman (1998) menuliskan senyawa polar lebih mudah larut dalam pelarut polar dan senyawa nonpolar lebih mudah larut dengan pelarut nonpolar. Naufalin (2005) membuktikan komponen bioaktif pada ekstrak bunga kecombrang berbeda-beda sesuai dengan polaritasnya. Komponen fitokimia ekstrak heksana terdiri dari steroid, triterpenoid, alkaloid, dan glukosida. Komponen fitokimia ekstrak etil asetat adalah steroid, terpenoid, alkaloid, flavonoid, dan glikosida. Sedangkan ekstrak etanol menghasilkan komponen fenolik, terpenoid, alkaloid, saponin, dan glikosida. Menurut Kanazawa et al. (1995) suatu senyawa yang mempunyai polaritas optimum akan mempunyai aktivitas antimikroba maksimum, karena untuk interaksi

35

suatu senyawa antibakteri dengan bakteri diperlukan keseimbangan hidrofilikhidrofilik (HLB : hydrophilic lipopphilic balance). Menurut Branen dan Davidson (1993), polaritas senyawa merupakan sifat fisik senyawa antimikroba yang penting. Sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa antimikroba larut dalam fase air yang merupakan tempat hidup mikroba,tetapi senyawa yang bekerja pada membran sel hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik; sehingga senyawa antibakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik-hidrofilik untuk mencapai aktivitas yang optimal. Pada metode ini digunakan kloramfenikol (10 µg) sebagai kontrol positif untuk pengujian aktivitas antibakteri, karena merupakan salah satu antibiotika yang mempunyai spektrum kerja yang luas. Dalam Pratiwi (2002) menuliskan antibiotik memberikan efek dengan cara bereaksi pada subunit 50S ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase. Enzim ini berfungsi membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang baru melekat pada tRNA dengan asam amino yang masih berkembang. Sebagai akibatnya sintesis protein bakteri akan terhenti seketika.

35

80 %

100 %

Gambar 8. Diameter zona hambat bakteri uji terhadap kloramfenikol Hasil pengujian antibakteri kloramfenikol (10 µg) yang dapat dilihat pada Gambar 8. Hasil penelitian diketahui kalau kloramfenikol (10 µg) adalah antibiotik yang berspektrum luas atau memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri gram positip dan bakteri gram negatif, dalam penelitian diwakili oleh S. aureus dan E. coli yaitu dengan menghasilkan diameter zona hambat sebesar 17,5 mm dan 22,66 mm. Dalam Prescott dan Klein (2009) menuliskan bakteri terhadap kloramfenikol (30 µg) dibagi tiga yaitu yang memiliki diameter 12 mm termasuk resisten, 13-17 mm termasuk intermediet dan lebih dari 18 mm merupakan bakteri yang sensitif. Berdasarkan zona hambat yang didapatkan diketahui bahwa kedua bakteri tersebut termasuk kategori yang bersifat sensitif terhadap kloramfenikol karena dihsilkan zona hambat lebih besar dari 18 mm. Diameter zona hambat ekstrak air pada konsentarasi 80% daun kecombrang pada S. aureus sebesar 20,08 mm melebihi zona hambat kloramfenikol 10 µg yaitu

35

17,5 mm. Namun pada E. coli zona hambat ekstrak air daun kecombrang pada konsentrasi 100% sebesar 10 mm sangat berbeda bila dibandingkan dengan zona hambat kloramfenikol 10 µg yaitu 22,66 mm. Sehingga dapat diketahui ekstrak air daun kecombrang pada konsentarasi 60% memiliki kemampuan yang sama dengan kloramfenikol (10 µg) dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus. Namun, ekstrak air daun kecombrang memiliki kemampuan menghambat bakteri E. coli yang lebih rendah dibanding kloramfenikol (10 µg).

4.4.2. MIC (Minimum Inhibitory Consentration) Hasil uji antibakteri menggunakan metode difusi cakram diketahui ekstrak air daun kecombrang mempunyai kemampuan dalam menghambat pertumbuhan kedua bakteri uji. Sehingga perlu diketahui nilai dari konsentrasi hambat minimum (KHM) atau MIC (Minimum Inhibitory Consentration) yaitu konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebanyak 90% dari inokulum asal selama inkubasi 24 jam (Cossentio et al. 1999). Konsentrasi pada pengujian KHM mengacu terhadap konsentrasi terkecil yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri pada metode difusi cakram, yaitu konsentrasi untuk E. coli adalah 5%, 10%, 15%, 20%, 25% dan 30% dan untuk S. aureus adalah 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan 100%. Hasil pengujian KHM diketahui persentasi penghabatan ekstrak air daun kecombrang terhadap bakteri uji pada berbagai konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 6. Nilai KHM ekstrak air daun kecombrang terhadap E. coli adalah pada konsentrasi 90%, dimana konsentrasi tersebut sudah dapat mematikan 92,57%. Sedangkan nilai

35

KHM ekstrak air daun kecombrang terhadap S. aureus pada konsentrasi 15%, dimana konsentrasi tersebut sudah dapat mematikan 96.11%. Tabel 6.

Hasil MIC atau konsentrasi hambat minimum pada ekstrak air daun kecombrang

Jenis Bakteri

Escherichia coli (sel vegetatif awal No= 1,62. 107 sel/ml)

Konsentrasi Ekstrak (%) 50 60 70 80 90* 100

Jumlah Bakteri (sel/ml) inkubasi 24 jam (Nt) TBUD TBUD 1,12. 106 4. 106 1,24. 106 7,4. 105

% Penghambatan = 100 % - (Nt/No x 100 %) 32,4 76,1 92,57 95,6

5 TBUD 6 10 2,84. 10 89,37 Stapylococcus 15* 1,04. 106 96,11 aureus (sel vegetatif awal 20 100 No= 2,67.107 sel/ml) 25 100 30 100 Ket: * = MIC atau konsentrasi hambat minimum pada ekstrak air daun kecombrang terhadap bakteri uji

Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi cakram dan metode kontak memberikan hasil konsentrasi ekstrak yang berbeda. Hal ini karena perbedaan laju difusi antibakteri pada jenis media yang berbeda. Tabak et al. (1996) telah membandingkan pengukuran medium padat dan medium cair untuk melihat pengaruh ekstrak thyme pada bakteri Helicobacter pilory, hasilnya diketahui bahwa pengahambatan timol lebih efektif pada medium cair dibandingkan dengan medium padat. Pada konsentrasi timol 3,5 mg/ml penghambatannya pada medium padat masih dapat teramati, sedangkan pada medium cair sudah membunuh semua bakteri yang ada. Demikian juga yang telah dilakukan oleh Wan et al. (1998), minyak

35

essensial basil tidak memberikan pengaruh penghambatan terhadap Pseudomonas flourescens dengan metode difusi agar, sedangkan bila menggunakan medium cair pengaruh penghambatan dapat teramati. Pada medium padat, difusi antimikroba akan tertahan dengan adanya agar pada medium. Hasil penelitian Juliantina et al. (2009) menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum) mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan dan membunuh S. aureus (gram positif) pada konsentrasi 25%. Sedangkan kemampuan menghambat pertumbuhan dan membunuh E. coli (gram negatif) pada konsentrasi 6,25%. Hasil penelitian Suryani dan Stepriyani (2007) menunjukkan bahwa

infusa

daun

mahkota

dewa

memiliki

daya

antibakteri

terhadap

Staphylococcus aureus dengan MIC 3,125%. Infusa daun mahkota dewa tidak memiliki daya antibakteri terhadap Eschericia coli dengan MIC lebih besar dari 25%. Parwata dan Dewi (2008) menuliskan hasil uji aktivitas minyak atsiri dari rimpang lengkuas (Alpinia galanga L.) terhadap bakteri E. coli pada konsentrasi 100 ppm dan 1000 ppm menunjukkan diameter daerah hambatan sebesar 7 mm dan 9 mm, sedangkan minyak atsiri hanya mampu menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus pada konsentrasi 1000 ppm sebesar 7 mm. Dari penelitian diatas diketahui kemampuan antibakteri dari ekstrak air daun kecombrang lebih rendah dibanding dengan ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum) dan infusa daun mahkota dewa. Namun ekstrak air daun kecombrang memiliki aktifitas antibakteri lebih tinggi dibanding dengan minyak atsiri dari rimpang lengkuas (Alpinia galanga L.).

35

4.5. Analisis GC-MS Komponen senyawa ekstrak air daun kecombrang yang telah kering dilarutkan dalam etanol dan dianalisa menggunakan GC-MS kolom kedalam kolom Capillary Column Agilent 19091S-436 HP-5MS yang bersifat polar. Gambar 9 adalah kromatogram hasil GC-MS dengan pelarut etanol. Berdasarkan data tersebut, diketahui ekstrak air daun kecombrang mengandung 62 komponen senyawa (Lampiran 14). Dari 62 komponen senyawa tersebut diketahui 16 komponen senyawa memiliki similaritas minimal 90% (tabel 7).

Gambar 9. Kromatogram hasil GC-MS ekstrak air daun kecombrang

35

Tabel 7. Hasil GC-MS ekstrak air daun kecombrang No. 1 2 3 4 5 6

Nama senyawa 2, 3-Butanediol* Tetraethyl silicate Phenol* Phenol, 2-methoxy Phenol, 4-ethyl Naphthalene,1,2-dihydro1,1,6-trimethyl

7

Tetradecanol-018

8 9 10 11

Cyclododecane 1-tetradecana Cyclotetradecane (-) – loliolide

12

Nanodecana

13 14 15

Eicosane* Trycosane* 2-methyldocosane

16

Nanodecane*

Waktu Retensi 5.28 6.78 6.83 8.08 8.78 10.83

% area

Golongan

29.38 1.65 2.26 1.65 0.48 0.68

Alkohol Silikat Fenolik Fenolik Fenolik Aromatik

11.63

0.66

12.72 13.29 14.23 14.32 15.57

0.77 1.89 0.77 0.99 0.80

19.82 17.84 19.53 21.05

1.93 2.01 0.69 2.80

Alkohol, rantai panjang Alkana Alkana Alkana Alkana Alkena, rantai panjang Alkana Alkana Alkana Alkena, rantai panjang

Ket: * = 5 senyawa terbanyak dengan similaritas minimal 90% Hasil GC-MS ekstrak air daun kecombrang diketahui terdapat 5 komponen senyawa ekstrak air daun kecombrang dengan pelarut etanol adalah komponen fenolik, alkana, alkena, alkohol dan senyawa aromatik. Diketahui juga, hasil analisa GC-MS ekstrak air daun kecombrang dengan pelarut etanol mendapatkan 5 senyawa terbanyak dengan similaritas minimal 90%

yaitu 2,3-Butanediol, Nanodecane,

Phenol, Trycosane, dan Eicosane. Struktur senyawa dapat dilihat pada Gambar 10. Senyawa terbanyak yang terdeteksi dalam penelitian ini adalah 2,3-Butanediol

35

(29,38%). 2,3-butanediol adalah senyawa kimia yang terdiri dari karbon, hidrogen, dan oksigen dengan formula adalah C4H10O2.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Gambar 10. Struktur kimia lima senyawa terbanyak dengan similaritas minimal 90% (a)Butanediol (C4H10O2), (b) penol (C6H5O-), (c) nanodecane (C19H40), (d) Trycosane (C23H48), dan (e) Eicosane (C20H42). Dari analisis GC-MS ekstrak air daun kecombrang diketahui terdapat senyawa yang diasumsikan memiliki keterikatan dengan kemampuan antibakteri dari ekstrak tersebut yaitu golongan fenolik (Phenol, Phenol, 2-methoxy dan Phenol, 4ethyl),

golongan

monoterpen

alkohol

(2,3-Butanediol

(Cyclododecane)

dan

dan

aromatik

Tetradecanol-018)

golongan

(Naphthalene,1,2-dihydro-1,1,6-

trimethyl) dan senyawa yang diasumsikan memiliki keterikatan dalam kemampuan antioksidan yaitu golongan fenolik (Phenol, Phenol, 2-methoxy dan Phenol, 4-ethyl). Komponen fenolik yang terdeteksi dalam GC-MS adalah Phenol, Phenol, 2methoxy, dan Phenol, 4-ethyl. Senyawa fenolik merupakan substansi yang mempunyai cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksil sehingga sifatnya

35

mudah larut dalam pelarut polar. Menurut Nychas dan Tassou (2000), senyawa yang bersifat antimikroba alami berasal dari tanaman salah satunya adalah fenolik. Cara kerja fenol dalam membunuh mikroorganisme yaitu dengan cara mendenaturasi protein sel (Pelczar dan Chan, 1981). Fenol berikatan dengan protein melalui ikatan hidrogen sehingga mengakibatkan struktur protein menjadi rusak. Sebagian besar struktur dinding sel dan membran sitoplasma bakteri mengandung protein dan lemak. Penelitian mengenai aktifitas antibakteri dari golongan fenolik tanaman telah banyak dilakukan, diantaranya oleh Puupponen-Pimia et al. (2000) membuktikan senyawa fenolik dalam ekstrak berry mampu menghambat bakteri gram negatif, diantaranya adalah Salmonella enterica SH-5014 dan Escherichia coli CM871. Selain itu, Haraguchi et al. (1998) membuktikan senyawa fenolik tanaman memiliki aktifitas antibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif seperti Stapylococcus sp. dan Bacillus sp. ataupun terhadap bakteri gram negatif seperti Pseudomonas sp. dan bakteri koliform. Alkohol adalah senyawa yang biasa digunakan untuk membuhuh mikroba. Hasil penelitian Sacchetti et al. (2005) menunjukkan bahwa Zingiber officinale mengandung minyak atsiri alkohol yang mampu bertindak sebagai antimikroba, terutama untuk menghambat pertumbuhan khamir dan kapang. Pertumbuhan sel bakteri Escherichia coli dapat terganggu oleh komponen fenol atau alkohol dari ekstrak etanol daun beluntas (Pluchea indica less).

35

Brook (2005) menuliskan etil alkohol atau metanol (alkohol) menunjukkan aktifitas antimikroba yang cepat dengan struktur luas melawan bakteri vegetatif, jamur, tetapi tidak sporosidal. Dalam Rahayu (2007), kekuatan etanol dalam membunuh Stapylococcus aureus jauh lebih besar daripada fenol. Todar (2000) menuliskan fenol digunakan sebagai antiseptik pada konsentrasi yang rendah dan bekerja dengan efek mendenaturasi protein dan merusak membran sel. Siswandono dan Soekardjo (2000) menuliskan turunan fenol berinteraksi dengan sel bakteri melalui proses absorbsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar rendah komplek protein–fenol dengan ikatan lemah dan segera mengalami penguraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel menyebabkan presipitasi serta denaturasi protein. Pada kadar tinggi fenol menyebabkan koagulasi protein dan sel mengalami membran lisis. Turunan fenol dapat mengubah permeabilitas membran sel bakteri, sehingga menimbulkan kebocoran konstituen sel yang essensial dan mengakibatkan bakteri mengalami kematian. Senyawa alkohol dapat menimbulkan denaturasi protein sel bakteri dan proses tersebut memerlukan air. Hal ini ditunjang oleh fakta bahwa alkohol absolut yang tidak memerlukan air, mempunyai aktifitas antibakteri jauh lebih rendah dibanding alkohol yang mengandung air. Selain itu, turunan alkohol juga menghambat sistem fosforilasi dan efeknya terlihat jelas pada mitokondria, yaitu hubungan substrat–nikotiamid adenine nukleotida (NAD) (Siswandono dan Soekardjo, 2000)

35

Cyclododecane adalah salah satu senyawa yang termasuk golongan alkana yang merupakan monoterpen. Monoterpen adalah salah satu jenis terpenoid. Terpenoid merupakan penyusun utama minyak atsiri yang merupakan senyawa antimikroba. Dalam Jaffar et al. (2007) minyak esensial Etlingera elatior (JACK) R.M. SMITH mengandung Cyclododecane 1,57% pada daun kecombrang, 3,23% pada batang, 40,32% pada bunga dan 34,45% pada rimpang. Penelitian mengenai aktifitas antibakteri monoterpen dari tanaman telah dilakukan, diantaranya oleh Kubo et al. (1992) membuktikan senyawa monoterpen efektif untuk menghambat pertumbuhan Bacillus subtilis, Stapylococcus aureus dan Escherichia coli. Demikian juga hasil penelitian dari Vagi et al. (2005) menunjukkan bahwa senyawa monoterpen dari ekstrak tanaman marjoram (Oryganum majonara L.) memiliki aktifitas antibakteri terhadap Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens dan Bacillus cereus. Fenolik juga merupakan antioksidan. Dalam Pokorni et al. (2001) menuliskan senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Dalam Karadeniz et al. (2005) juga menuliskan senyawa fenolik telah diketahui memiliki berbagai efek biologis seperti aktivitas antioksidan melalui mekanisme sebagai pereduksi, penangkap radikal bebas, pengkhelat logam, peredam terbentuknya oksigen singlet serta pendonor elektron. Menurut Bravo (1998), aktifitas antioksidan berhubungan

35

dengan kandungan gugus hidroksil polifenol yang mampu menyumbangkan atom hidrogen ke dalam radikal bebas untuk menetralkan sifat radikal. Dalam Winarsi (2007), teh kaya akan antioksidan polifenol yang dipercaya sebagai komponen aktif yang bermanfaat kesehatan. Menurut Bravo (1998), teh memiliki khasiat kesehatan karena mengandung zat bioaktif yang disebut polifenol terutama katekin teh yang bersifat sebagai senyawa antioksidan yang berperan dalam meredam aktifitas radikal bebas yang sangat berbahaya bagi tubuh sehingga bermanfaat bagi pencegahan beberapa penyakit kronis misalnya penyakit jantung dan kanker. Masuda (1994) juga membuktikan senyawa yang fenolik curcumin berasal dari kunyit (Curcuma longa) bersifat antioksidan dan antiimflamasi.

58

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan 1. Ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki senyawa bioaktif berdasarkan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Nilai LC50 yang didapatkan adalah 53,08 ppm. 2. Ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki aktivitas antioksidan. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak air daun kecombrang menggunakan metode DPPH (2,2-diphenil-1-picrylhydrazil) memberikan nilai IC50 sebesar 24,39 mg/L. 3. Ekstrak air daun kecombrang (Etlingera elatior (Jack) R.M. Smith) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Hasil uji antibakteri dengan metode difusi cakram diketahui ekstrak air daun kecombrang dapat menghambat pertumbuhan bakteri E. coli pada konsentrasi yaitu 100 % dan S. aureus pada konsentrasi 20 %. Berdasarkan nilai KHM dengan metode kontak didapatkan KHM E. coli adalah 90 % dan KHM S. aureus adalah 15 %.

59

5.2. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai antikapang dari ekstrak air daun kecombrang, pengaruh faktor lingkungan terhadap kemampuan antibakteri, mekanisme kerja ekstrak air daun kecombrang terhadap bakteri uji dan fraksinasi komponen antibakeri dan antioksidan ekstrak air daun kecombrang.

60 DAFTAR PUSTAKA Andayani1, R, Y. Lisawati, dan Maimunah. Penentuan aktivitas antioksidan, kadar fenolat total, dan licopen psda buah tomat (Solanum Lycopersicum L). Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, (13) 1 Adnyana, I.K, E. Yulinah, J.I. Sigit, N. Fisheri., M. Insanu. 2004. Efek ekstrak daun jambu biji daging buah putih dan jambi biji daging buah merah sebagai antidiare. Acta Pharmaceutica Indonesia, 29 (1) Andrew. 2006. Pengawet Alami Pengganti Formalin Sudah ada Sejak Dulu. http: www.andrew57.wordpress.com/2006/03/20/ pengawet-alamipenggantiformalinsudah-ada-sejak-dulu. Diakses Rabu, 16 Juli 2008, pk 05:35 WIB. Antoro, E.D. 1995. Skrining fitokimia rimpang Nicolaia speciosa Horan. secara mikrokimiawi kromatografi lapis tipis,dan spektrofotmetri UV. FF-UGM. Diakses Rabu, 16 Agustus 2010, pk 15.08 WIB.

Anonim . 2010. Kecombrang Apa Sih Manfaatnya?. http//www.artikelpopuler.com . Diakses Rabu, 16 Agustus 2010, pk 15.24 WIB. Azis. A. A. 2009. Penentuan Kadar Air dan Ninyak Sawit Mentah (CPO) Pada Tangki Penyimpan di Pabrik Kepala Sawit PT PN.IV kebun Adolina. Karya Ilmiah Program Diploma-3 Kimia Industri Fakultas MIPA Universitas Sumatra Utara. Medan Baraja, M. 2008. Uji toksisitas ekstrak dau Ficus elastica Nois ex Blume terhadap Artemia salina Leach dan Profil Kromatografi Lapis Tipis. Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Barus, P. 2009. Pemanfaatan bahan pengawet dan antioksidan alami pada industri bahan makanan. Pidato Pengukuhan Jabatan Guru Besar Tetap dalam Bidang Ilmu Kimia Analitik pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, diucapkan di hadapan Rapat Terbuka Universitas Sumatera Utara. Universitas Sumatra Utara Medan Branen A.L dan Davidson PM. 1993. Antimicrobial in Food. Marcel Dekker. New York Brooks, GF, Butel, JS dan Morse, SA. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Terj. Texbook asli : Medical Mycrobiology. Penerbit Salemba Medika. Chan, E.W.C, Y.Y. Lim, L.F. Wong, F.S. Lianto, S.K. Wong, K.K.Lim, C.E. Joe, & T.Y. Lim. 2008. Antioxidant and tyrosinase inhibition properties of leaves and rhizomes of ginger spesies. Food Chemistry, 109 (3) : 477-483 Connors, K. 1992. Stabilitas Kimiawi Sediaan Farmasi. Jilid I dan II. IKIP Semarang Press. Semarang

61

Cosentio, S. C.I.G. Tuberoso, B. Pisano1, M. Satta, V. Mascia1, E. Arzedi1 and F. Palmas1. 1999. In vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinial Thymus essensial oils. Letters in Appl Microbiol, 29 : 130-135. Davidson P.M. 2001. Chemical preservatives and natural antimicrobial compounds. Food Microbiology. ASM Press, Washington DC. Departemen Kesehatan. 1988. Inventaris Obat Indonesia Jilid I. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta. Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-dasar Mikrobiologi. Cetakan Ke-13. Djambatan. Jakarta. Endah, N.A. 2008. Optimasi pembuatan ekstrak daun dewantaru (Eugenia uniflora L.) menggunakan metode soxhletasi dengan parameter kadar total senyawa fenolik dan flavonoid. Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Fardiaz, D. 2002. Panduan Pengolahan Pangan yang Baik bagi Industri Rumah Tangga. Jakar: Badan Pengawas Obat dan Makanan. Halliwel, B and Gutteridge, J.M.C. 1999. Free Radicals in Biology and Medicine, Third Edition, Oxford University Press, New York. Hanani, E, A. Mun’im, R. Sekarini. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callyspongia sp. dari kepulauan seribu. Majalah kefarmasian, 2 (3) : 127-133. Haraguchi, Haraguchi H, Kuwata Y, Inada K, Shingu K, Miyahara K, Nagao M, Yagi A. 1998. Antifungal activity from A. galanga and the compotition for incoporation of unsaturated fatty acid in cell growth. Plant med 62 (4) : 308. Harbone, J.B. 1996. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan (Penerjemah Padmawinata, K dan I. Soediro). ITB Bandung. Hasbah, Lajis, Abas, Ali, Sukari, Kikuzaki, dan Nakatana. 2005. Antioxidant dan antibacterial activity of leaves of Etlingera elatior (Zingiberaceae) in Peninsular Malaysia. Journal of Natural Products, 68 (2) : 285-288 Hartini, Y, C.J. Soegihardjo, A.I.C.Putri, M.I.A. Setyorini, D.Kurniawan. 2008. Daya antibakteri campuran ekstrak buah adas (Foeniculum vulgare Mill) dan kulit batang pulasari (Alyxia reinwardtii BL). Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta Helbert, R.B. 1995. Biosintesis Metabolit Sekunder. Terj Srigandono. IKIP Semarang Press. Semarang. Hernani, Raharjo, M., (2005). Tanaman berkhasiat Antioksidan, Penebar Swadya, Jakarta,.

62

Hermanto, S. 2008. Mengenal Lebih Jauh Teknik Analisa Kromatografi dan Spektrofotometri. Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Jakarta. Hidayat dan Hutapea. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Balai Penelitian dan Pengembangan Departemen Kesehatan RI. Houghton, P.J dan Raman. 1998. Laboratory Handbook for The Fractonation of Natural Extract. Chapman & Hall. London. Hugo, W.B, dan Russell, A.D. 1998. Pharmaceutical Microbiology sixth edition. Blackwell Science. Oxford. Inayati, H. 2007. Potensi antibakteri ekstrak daun kedondong bangkok. Skripsi Departemen Biologi FMIPA. Institut Pertanian Bogor. Bogor Irawati, P. 2009. Uji aktivitas dan mekanisme penghambatan pertumbuhan bakteri oleh bakteri minyak atsiri daun cabe jawa (Piper petrofractum Vahl. Piperaceae). Skripsi Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Menguak Tentang Mikroorganisme Jilid 2. Yrama Widya. Bandung Jaafar F.M, C.P. Osman, N.H. Ismail, dan K. Awang. 2007. Analysis of essensial oils of leaves, stems, flowers and rhizomes of Etlingera elatior (JACK) R. M. SMITH. The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 11 (1) : 269-273 Jawetz E. Adelberg E.A and Melniek J. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Terj. Enugroho E & Maulana RF. Edisi ke-20. Jakarta: EGC Jenie, B.S.L. dan Kuswanto. 1994. Aktivitas antimilcroba dari pigmen angkak yang diproduksi oleh Monasnrs purpuracs terhadap beberapa milcroba patogen dan perusak makanan. Prosiding Pertemuan Ilmiah Tahunan Permi, hal. 53-62. Juliantina, F, D.A. Citra, B. Nirwani, T. Nurmasitoh, E.T.Bowo. 2009. Manfaat sirih merah (Piper crocatum) sebagai agen anti bakterial terhadap bakteri gram positip dan bakteri gram negatif. Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia Yogyakarta. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia. Juniarti, D. Osmeli, dan Yuhernita. 2009. kandungan senyawa kimia, uji toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) dan antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazyl) dari ekstrak Daun saga (Abrus precatorius L.). MAKARA SAINS, 13(1) : 50-54

63 Kanazama, A.T. Ikeda T, Endo. 1995. A Novel approach to made of action on cationic biocides: morfological effect on antibacterial activity. J Appl. Bacteriol, 78:5560 Khoiriyah. 2010. Sifat Fisikokimia dan uji aktivitas antibakteri dari minyak atsiri Jahe (Zingiber officinale). Skripsi Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Khotimah, F.K. 2010. Isolasi senyawa aktif antibakteri minyak atsiri bunga cengkeh (Syzygium aromaticum). Skripsi Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Khurniasari, D. W. 2004. Potensi antikanker senyawa bioaktif ekstrak kloroform dan metanol makroalgae sargassum duplicatum J. Agardh. Skripsi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Jogjakarta. Jogjakarta. Kubo, A, Lunde, C.S., dan Kubo, I. 1992. Antimicrobial activity of the olive oil flavor compounds. J Agric Food Chem, 49(1):1-32. Kurniawan, I.S. 2006. Pengaruh cara sterilisasi terhadap penguraian kloramfenikol dalam sediaan tetes mata dengan metode uji dipercepat. Laporan Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran. Jatinangor. Kurniawati, S. 2008. Aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol daun asam jawa (Tamarindus indica Linn.) terhadap kultur aktif Stapylococcus aureus dan Escherichia coli. Skripsi Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Kusmiyati dan N.W. S. Agustini. 2006. Uji aktivitas senyawa antibakteri dari mikroalga Porphyridium cruentum.Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong. Biodiversitas, 8: 48-53 Lay, B. W dan Sugyo, H. 1992. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. Raja Grasindo Persada. Jakarta. Lingga, N. 2004. Laporan Kegiatan Training Instrumen GCMS Shimadzu QP 2010 Mardawati, E, F. Filian, dan H. Marta. 2008. Kajian aktivitas antioksidan ekstrak kulit manggis (Garcinia mangostana L) dalam rangka pemanfaatan limbah kulit manggis di Kecamatan Puspahiang Kabupaten Tasikmalaya. Penelitian Staf Pengajar Jurusan Teknologi Industri Pangan Fakultas Teknologi Industri Pertanian Universitas Padjadjaran Masuda, T. & Jitoe, A. 1994. Antioxidative and anti-inflammatory compounds from tropical gingers. J. Agric. Food Chem, 42: 1850-1856.

64 Mckeen, M. M., A.M. Ali, S.H. El-Sharkawy, M.Y. Manap, K.M. Salleh, N.H. Lajis, dan K. Kamazu. 1997. Antimicrobial and cytotoxic properties of some Malaysian Traditional vegetables (Ulam). Pharmaceumatical Biology, 35 (3): 174-178 Naufalin, R. 2005. Kajian sifat antimikroba ekstrak bunga kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) terhadap berbagai mikroba patogen dan merusak pangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana IPB Bogor. Nurhayati, A.P.D, N. Asdulgani, dan R. Febriyanto. 2006. Uji toksisitas ekstrak Echeuma alvarezii terhadap Artemia salina sebagai study pendahuluan potensi antikanker. Akta Kimindo, 2 ( 1): 41-46. Nychas dan Tassou. 2000. Tradicional preservatives-oil and spices. Encylopedia of food mycrobiology volume 1. Academy Press London. Palmer, S.A, Stewart, dan Fyfe. 1998. Antimicrobial properties of plant essensial oils and assansials against five important food-borne pathogens. Letters App Microbiol, 26:118-122. Pariwidjayanti, A.M. 2009. Uji aktivitas dan mekanisme penghambatan pertumbuhan bakteri oleh bakteri minyak atsiri daun jeruk nipis (Citrus auratifolia Swingle: Rutaceae). Skripsi Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Parwata, I.M.O.A dan P.F.S. Dewi. 2008. Isolasi dan uji aktivitas antibakteri minyak atsiri dari rimpang lengkuas (Alpinia galanga L.). JURNAL KIMIA, 2 (2): 100104 Pokorny, J., Yanishlieva, N. and Gordon, M., 2001, Antioxidants in Food, Practical Applications, 1-123, Wood Publishing Limited, Cambridge, England. Pratiwi, S.T. 2002. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Yogyakarta. Pratimasari, D. 2009. Uji aktifitas penangkal radikal buah Carica papaya L dengan metode DPPH dan penetapan kadar fenolik serta flavonoid totalnya. Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Pelczar, M dan Chan. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi jilid I. Diterjemahkan Ratna Sri Hadioetomo, dkk. Jakarta: UI-PRESS. Puupponen-Pimia, R, L. Nohynek, C. Meier1, M. KaÈhkoÈnen, M. Heinonen, A. Hopia and K.-M. Oksman-Caldentey. 2000. Antimicrobial properties of phenolic compounds from berries. Journal of Applied Microbiology, 90 : 494±507 Prescott, H dan Klein. 2005. Microbiology Sixth Edition. Mc Graw Hill Higher Education

65 Rahayu, I.D. 2007. The sensitivity of Staphylococcus aureus as Mastitis Pathogen Bacteria Into Teat Dipping Antiseptic in Dairy Cows. Jurnal Protein.14 (1) Reynertson, K. A. 2007. Rytochemical analysis of bioactive constituen from edible Myrtaceae fruit. Disertation, The City University of New York. Rohman, A dan S. Riyanto. 2005. Daya antioksidan ekstrak etanol Daun Kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) secara in vitro. Majalah Farmasi Indonesia, 16 (3): 136 – 140 Rohyami, Y. 2008. Penentuan kandungan flavonoid dari ekstrak metanol daging buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa Scheff Boerl). Jurnal Penelitian & Pengabdian Volume 5-Nomor 1-Agustus 2008. Direktorat Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (DPPM) Univervitas Islam Indonesia (UII) Yogyakarta Sacchetii, G et al., 2005. Comperatife evaluation of 11 essential oil of different origin as function antioxidant, antiradical dsan antimicrobial in food. Food Chem, 91: 621-632. Sativa, P.R. 2009. Uji daya antibakteri ekstrak etanol bawang (Allium sativum L.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan Escherichia coli ATCC 11229 secara in vitro. Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Surakarta. Siswandono dan Soekardjo B. 2000. Kimia Medisinal. Airlangga University Press. Surabaya. Hal: 10 – 14. Sukadana, Y.M. 2009. Senyawa antibakteri golongan flavonoid dari buah belimbing manis (Averrhoa carambola Linn.L). JURNAL KIMIA, 3 (2) : 109-116 Supardi dan Sukamto. 1999. Mikrobiologi dalam Pengelolaan dan Keamanan Pangan. Bandung. ALUMNI. Suryani, L dan S. Stepriyani. 2007. Daya antibakteri infusa daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) terhadap Staphylococcus aureus dan Eschericia coli. Mutiara Medika Edisi Khusus, 7 (1): 23 - 28 Suyitno, Haryadi, Supriyanto, Budi S, Haryanto D, Adi D.G, Wahyu S. 1989. Petunjuk Laboratorium Rekayasa Pangan. PAU Pangan dan Gizi UGM. Yogyakarta. Swantara, I.M.D. 2005. Identifikasi senyawa aktif antibakteri dalam tumbuhan kwentukkentut (Paederia foetida Auct.). J. Alchemy, 4 (2) : 54-66 Syamsuhidayat, S.S. 1991. Inventarisasi Tanaman Obat Indonesia. Departemen Kesehatan RI. Badan Penelitian dan Pengembangan. Jakarta.

66 Tabak, Armon, Potasman, dsan Neman. 1996. In vitro inhibition of Helicobacter pylory by extract of thyme. J Appl Bacteriol, 80 : 667. Tampubolon, O.T, Suhatsyah, Sastrapradja. 1983. Penelitian pendahuluan kimia kecombrang (Nicolaia spesiosa Horan). Risalah Simposium Penelitian Tumbuhan Obat III. Fakultas Farmasi UGM. Yogyakarta. Tahir, I., Wijaya, K., Widianingsih, D., (2003). Seminar on Chemometrics- Chemistry Dept Gadjah Mada University, Terapan Analisis Hansch Untuk Aktivitas Antioksidan senyawa Turunan Flavon/Flavonol, 25 Januari. Thompson dan Hinton. 1996. Inhibition of Growth of mycotoxigenic Fusarium sp. by buthylated hydroxyanisole and/or carvacrol. Journal Food Protect, 59 : 412-415 Todar,

K. 2005. Staphylococcus. Available at: http://www.textbookofbacteriology net/staph.html . Diakses Rabu, 16 Juli 2008, pk 05:35 WIB.

Tranggono, 1990. Bahan Tambahan Pangan (Food Additive). Pusat Antar Universitas. Pangan dan Gizi. UGM. Yogyakarta. Utami, S. 2010. Aktivitas antibakteri distilat rimpang lengkuas merah (Alpinia purpurata) dan ekstrak daun mengkudu (Morinda citrifolia L). Skripsi Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Vagi, E, Simandi, B, Suhadja, A, Hethelvy, E. 2005. Essential oil compotition and antimicxrobial activity of Oryganum majonara L. extracts obtaineds with ethyl alcohol ansd supercritical carbon dioxide. Food Research International, 38 : 5157 Wahyono, S, dan Rahman. 1995. Uji Toksisitas beberapa tanaman obat Indonesia. 10844. Wan J, Wilcock A, Cpventry MJ. 1998. The effect of essensial oils basil on the growth of Aeromonas hydrophila sdan Pseusdomonas Fluorescens. J Appl Microbiol, 84: 152-158 Wibowo, A.S. 2009. Uji aktivitas antibakteri infusa buah jambu monyet (Anacardium occidentale L.) terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 11229 secara in-vitro. Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Surakarta. Widiatmojo, H. 2009. Uji potensi antibakteri minyak atsiri daun kecombrang (Nicolaia spesiosa Horan) terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Skripsi Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Winarsi, Hery. 2007. Antioksidan Alami & Radikal Bebas Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan. Kanisius. Yogyakarta.

67

Yani, R.F. 2010. Uji aktivitas ekstrak metanol bunga (Hibiscus sabdariffa L.) terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Skripsi Departemen Kimia Fakultas MIPA universitas Sumatera Utara. Zuhra, C.F, J.Br. Tarigan dan H. Sitohang. 2008. aktivitas antioksidan senyawa flavonoid dari daun katuk (Sauropus androginus (L) Merr.). Jurnal Biologi Sumatera, : 710.

70

Lampiran 3. Pengukuran Nilai LC50 Daun Kecombrang Uji BSLT

Jumlah larva

Jumlah larva

Total

Total

uji

hidup

larva

larva

Konsentrasi

Mortalitas (akumulasi Akumulasi

akumulasi

Akumulasi

mati / akumulasi total) x 100%

ul

ul

ul

ul

ul

ul

(ppm)

1

2

3

1

2

3

Hidup

mati

Mati

hidup

total

Kontrol

10

11

12

9

8

11

28

5

5

63

68

7,35

10

12

12

12

8

8

9

25

11

16

35

51

31,3

100

10

10

12

5

0

2

7

25

41

10

51

80,3

200

11

10

10

1

2

0

3

28

69

3

72

95,8

500

11

10

12

0

0

0

0

33

102

0

102

100

1000

10

10

10

0

0

0

0

30

132

0

132

100

LC 50

53,08

70