ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM POSITIF
SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi
Oleh : FEBRIYATI NIM : 106102003404
PROGRAM STUDY FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2010 M/1431 H
LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI
NAMA : FEBRIYATI NIM
: 106102003404
JUDUL : ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper betle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM POSITIF
Disetujui oleh :
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Andria Agusta
Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt.
NIP. 196908161994031003
NIP.195601061985101001
Mengetahui, Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. NIP. 195601061985101001
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI Skripsi dengan judul ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper betle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM POSITIF Telah disetujui, diperiksa dan dipertahankan dihadapan tim penguji oleh : Febriyati NIM: 106102003404 Menyetujui, Pembimbing: 1. Pembimbing I
Dr. Andria Agusta
........................
2. Pembimbing II
Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................
Penguji: 1. Ketua Penguji
Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................
2. Anggota Penguji I
Zilhadia, M.Si, Apt.
........................
3. Anggota Penguji II
Eka Putri, M.Si, Apt.
........................
4. Anggota Penguji III
Ofa Suzanti Betha, M.Si, Apt.
........................
Mengetahui, Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Prof. Dr (hc). dr. M. K. Tadjudin, Sp, And Tanggal lulus : 25 Agustus 2010
LEMBAR PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul :
ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM POSITIF
Adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka.
Penulis,
Febriyati
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya serta shalawat dan salam selalu tercurah kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW karena dengan segala rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan judul “ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM POSITIF”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi Universutas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya serta setulus-tulusnya kepada: 1. Bapak Prof. Dr. Komarudin Hidayat, selaku Rektor Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Bapak Prof. Dr (hc) dr. M. K. Tadjudin Sp,And, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Bapak Dr. Andria Agusta dan Bapak Drs. M. Yanis Musdja, Msc., Apt, sebagai pembimbing yang baik dan dengan sabar telah memberikan pengarahan, bimbingan, nasehat dan petunjuk selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. 4. Bapak dan Ibu dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 5. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Munawar dan Ibunda Aripah yang selalu memberikan kasih sayang yang tiada terkira serta tiada pernah hentinya memberikan doa, semangat, dan dukungan baik moril maupun materil sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Tiada apapun di dunia ini yang dapat membalas semua kebaikan, cinta dan kasih sayang yang telah kalian berikan.
6. Kepada kakanda dan adinda-adindaku tersayang terima kasih atas nasehat, dukungan, serta kasih sayang yang telah kalian berikan, hingga penulis selalu semangat menyelesaikan skripsi ini. 7. Kepada Angayi Hari Suryono, ST dan keluarga yang selalu memberikan dukungan, motivasi dan inspirasi serta dengan segala kesabarannya tiada henti memberikan semangat dikala penulis merasa bimbang, lelah dan terjatuh dalam menyelesaikan skripsi sehingga penulis dapat bangkit kembali untuk menyelesaikan skripsi. 8. Bapak Prof. Dr. Eko Baroto Walujo, APU, sebagai kepala bidang Botani dari Herbarium Bogoriense LIPI Cibinong yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melakukan penelitian di LIPI Cibinong. 9. Ibu Dr. Praptiwi dan Yuliasri Jamal, Msc, yang senantiasa memberikan bimbingan dan bantuan dikala penulis mengalami kesulitan selama penelitian dan penyusunan skripsi. 10. Bapak Dedi Rosadi dan Dedi Kustiwa dari balitro yang telah menyediakan sampel dan melakukan distilasi 11. Saudara Ahmad Futhoni dan kang Asep yang telah memberikan bantuan selama penelitian. 12. Kepada sahabat-sahabatku tersayang, Aminah Nurhadiyah, Fiestyo Alim, Erny Fitriana, Rahmania Hidayah dan Nida Nurnabila terima kasih atas dukungan dan doa kalian, masa-masa kuliah bersama kalian tidak akan pernah terlupakan sampai kapanpun. 13. Kepada teman-teman seperjuangan dalam penelitian yang selalu membantu dan senantiasa menyemangati, Erny Fitriana, Nurul Gustiari, Nuryatni, Vika Fauziah, Mustikaning Ayu, Nurul Farihah, Lidya Pratiwi dan Ulfah Sadiah. 14. Kepada teman-teman Farmasi angkatan 2006, kebersamaan kita didalam suka dan duka akan selalu terkenang di dalam hati sanubari. 15. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut membantu menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, dengan segala
kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.
Jakarta, 25 Agustus 2010
Penulis
ABSTRAK ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM POSITIF Sirih (Piper betle Linn.) merupakan salah satu jenis tanaman dari famili Piperaceae yang sering digunakan untuk menyirih. Fraksi minyak atsiri daun sirih diperoleh dengan cara destilasi uap air dan difraksinasi berdasarkan perbedaan waktu penyulingan. Kandungan relatif yang terdapat pada masing – masing fraksi secara berurutan adalah 0,061%, 0,034%, 0,027% dan 0,015%. Analisis fraksi minyak atsiri dengan GC-MS dari fraksi jam ke 1, 2,4, dan 6 menunjukkan adanya 5 komponen kimia utama yang diduga berperan pada aktivitas antibakteri yaitu kavibetol, kariofilen, pacouli alkohol,fenol,2-metoksi-4(1-profenil)-asetat dan 4alil-1,2-diasetoksibenzene. Fraksi minyak atsiri daun sirih telah diuji aktivitas antibakteri dan mekanisme penghambatan terhadap beberapa jenis bakteri gram positif. Aktivitas antibakteri minyak atsiri daun sirih menggunakan mikrodilusi menunjukkan bahwa ke-4 fraksi minyak atsiri daun sirih aktif terhadap Staphylococcus epidermidis dan Steptococcus mutan namun tidak menunjukkan aktivitas terhadap Bacillus subtilis . Nilai MIC pada setiap fraksi terhadap Staphylococcus epidermidis sebesar 0,25% sedangkan Steptococcus mutan memilki aktivitas yang paling sensitif terhadap F4 pada nilai MIC 0,25%. Mekanisme penghambatan pertumbuhan bakteri oleh fraksi minyak atsiri daun sirih terjadi melalui pengerusakan dinding sel mikroba uji setelah perlakuan 1 MIC dan 2 MIC. Kata kunci : Piper betle, minyak atsiri, fraksi, aktivitas antibakteri, bakteri gram positif,.
ABSTRACT ANALYSIS OF CHEMICAL COMPONENTS OF ESSENTIAL OIL FRACTIONS OF BETLE LEAVES (Piper betle Linn.) AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY TEST AGAINST SOME GRAM POSITIVE BACTERIA. Beetle (Piper betle Linn) is a plant belongs to Piperaceae that often used in beetle chewing. Essential oils fractions of beetle leaves was given by steam and water distilation and fractionated based on time periods. The result showed that fraction yield of F1, F2, F3 and F4 were 0,061%, 0,034%, 0,027% and 0,015%. respectively. Analysis of essential oils by GC-MS showed that 5 main chemical components were chavibetol, caryophyllene, patchouli alcohol, phenol,2-metoksi4(1-prophenyl)-acetate and 4-allyl-1,2-diacetoxybenzene respectively. All of these main chemical constituents were propose to responsible for its antibacterial activity. The anti-bacterial activity of essential oils of beetle leaves was evaluate with a microdilluton method. The results showed all of essential oil fractions tested active against Staphylococcus epidermidis dan Steptococcus mutan but not active to Bacillus subtilis. The MIC values of Staphylococcus epidermidis for all of essential oil fractions were 0,25% While Steptococcus mutan were the most sensitive to fourth fraction by 0.25%. Inhibition mechanism their activity was indicated through microbial cell walls vandalism test after treatment 1 MIC and 2 MIC of the oils. Key words: Piper betle,,essential oil, fractions, antibacterial activity, gram positive bacteria
DAFTAR ISI
Hal LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI...............................................................
ii
LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI................................................................
iii
LEMBAR PERNYATAAN.................................................................................
iv
KATA PENGANTAR..........................................................................................
v
ABSTRAK............................................................................................................
viii
ABSTRACT..........................................................................................................
ix
DAFTAR ISI.........................................................................................................
x
DAFTAR TABEL ..............................................................................................
xiii
DAFTAR GAMBAR............................................................................................
xiv
DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................
xv
BAB I
PENDAHULUAN.........................................................................
1
1.1.
Latar Belakang................................................................................
1
1.2.
Rumusan Masalah...........................................................................
3
1.3.
Hipotesa..........................................................................................
4
1.4.
Tujuan Penelitian............................................................................
4
1.5.
Manfaat Penelitian..........................................................................
4
TINJAUAN PUSTAKA................................................................
5
Tanaman Daun Sirih.......................................................................
5
2.1.1. Klasifikasi ............................................................................
5
2.1.2.Nama Daerah.........................................................................
5
2.1.3. Deskripsi Tanaman...............................................................
5
2.1.4. Kandungan Kimia.................................................................
6
2.1.5. Khasiat..................................................................................
6
Minyak atsiri...................................................................................
6
2.2.1. Deskripsi Minyak Atsiri........................................................
6
2.3.1. Deskripsi Bakteri..................................................................
7
2.3.2. Bakteri Uji.............................................................................
8
BAB II 2.1.
2.2.
2.4.
Aktivitas Antibakteri.......................................................................
10
2.4.1. Aktivitas Antibakteri.............................................................
10
2.4.2. Mekanisme Kerja Antibakteri...............................................
11
2.4.3. Metode Pengujian Antibakteri..............................................
13
BAB III
KERANGKA KONSEP...............................................................
14
BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN..................................................
15
4.1.
Waktu dan Tempat Penelitian.........................................................
15
4.2.
Pengambilan Sampel.......................................................................
15
4.3.
Determinasi Tanaman.....................................................................
15
4.4.
Alat da Bahan..................................................................................
15
4.5.
Metode Penelitian...........................................................................
16
4.6.
Prosedur kerja
17
4.6.2. Identifikasi Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih.......................................................................................
18
4.6.3. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih.............................................................................
18
4.6.4. Analisis Protein dan Asam Nukleat......................................
22
2+
BAB V 5.1.
+.
4.6.5. Analisis Ion Logam Ca dan K ..........................................
23
4.6.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel dengan SEM..................
23
HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................
25
Hasil................................................................................................
25
5.1.1. Isolasi dan Penentuan Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih ..................................................................
25
5.1.2. Pengujian Aktivitas Antibakter i Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih.............................................................................
29
5.1.4. Analisis Kebocoran Protein dan Asam nukleat....................
31
5.1.5. Analisis Ion Logam Ca2+ dan K+..........................................
31
5.1.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel Bakteri S. epidermidis dengan SEM ........................................................................
32
5.2.
Pembahasan....................................................................................
33
KESIMPULAN DAN SARAN.....................................................
43
6.1.
Kesimpulan.....................................................................................
43
6.2.
Saran...............................................................................................
44
DAFTAR PUSTAKA...........................................................................................
45
LAMPIRAN..........................................................................................................
48
BAB VI
DAFTAR TABEL
Hal Tabel 1. Perbandingan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri daun Sirih ............................................................................................... 27 Tabel 2. Penggolongan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri daun Sirih ............................................................................................... 28 Tabel 3. Aktivitas fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap 3 jenis bakteri uji gram positif pada konsentrasi 50 %.................................................. 29 Tabel 4. Penentuan MIC fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap bakteri uji B. subtilis........................................................................................... 30 Tabel 5. Penentuan MIC fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap bakteri uji S.epidermidis dan S. mutan..................................................................... 30
DAFTAR GAMBAR
Hal Gambar 1. Daun sirih........................................................................................... 25 Gambar 2. Perbandingan komatogram antar fraksi minyak atsiri daun sirih....... 30 Gambar 3. Nilai absorbansi asam nukleat dan protein fraksi jam ke-1 pada sel S. epidermidis...................................................................... 31 Gambar 4. Hasil pengukuran konsentrasi ion logam Ca2+ dan K+ fraksi jam ke-1 pada supernatan biakan S.epidermidis konsentrasi 1 MIC dan 2 MIC.............................................................................. 36 Gambar 5. Morfologi sel S. epidermidis............................................................. 37
DAFTAR LAMPIRAN
Hal Lampiran 1. Hasil determinasi daun sirih (Piper betle Linn.)............................. 48 Lampiran 2. Skema Kerja..................................................................................... 49 Lampiran 3. Hasil uji sensitivitas minyak atsiri daun sirih terhadap ketiga jenis bakteri uji gram positif................................................ 56 Lampiran 4. Pertumbuhan bakteri uji terhadap fraksi minyak atsiri daun sirih dengan metode plating...................................................... 57 Lampiran 5. Nilai absorbansi asam nukleat dan protein fraksi jam ke-1 pada sel S.epidermidis................................................................... 58 Lampiran 6. Hasil pengukuran konsentrasi ion logam Ca2+ dan K+ fraksi jam ke-1 pada supernatan biakan bakteri S.epidermidis konsentrasi 1 MIC dan 2 MIC............................................................................ 58 Lampiran 7. Perhitungan konsentrasi MIC bakteri uji B. subtilis........................ 62 Lampiran 8. Perhitungan konsentrasi MIC bakteri uji S. epidermidis dan S. mutan........................................................................................... 63
BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Pengetahuan tentang obat tradisional yang banyak digunakan oleh nenek moyang pada zaman dahulu, saat ini sedang banyak digali. Hal ini tidak terlepas dari banyaknya kendala yang ditimbulkan oleh penggunaan obat sintetis, seperti harganya yang mahal, terjadinya resistensi bila penggunaannya kurang tepat dan dapat menimbulkan efek samping yang tidak dikehendaki. Masyarakat kini lebih cenderung untuk menggunakan obat dari bahan alami dan melakukan pengobatan secara tradisional seperti yang dilakukan pada zaman dahulu. Tumbuhan sebagai obat tradisional, biasanya digunakan secara tunggal (satu jenis tumbuhan) atau majemuk (campuran dari beberapa jenis tumbuhan). Bagian tumbuhan yang umum digunakan sebagai obat tradisional adalah daun, bunga, buah, kulit batang, atau akarnya. Penggunaannya ada yang secara langsung dalam keadaan yang masih segar, ada pula yang diseduh ataupun direbus (Tengah, 2005). Sirih (Piper betle) merupakan salah satu jenis tumbuhan dari famili Piperaceae yang telah dikenal luas sehingga memiliki beberapa nama daerah, diantaranya : sireh, suruh (Jawa). Pemanfaatan sirih yang paling umum adalah sebagai bahan untuk sirih pinang. Bagian tumbuhan sirih untuk bahan sirih pinang adalah daun (umumnya di Indonesia bagian barat) dan buah (umumnya di Indonesia bagian timur). Tumbuhan dari Genus Piper, seperti Piper nigrum, P. methysticum, P. auritum dan P. betle telah dikenal sejak lama sebagai komoditi pertanian untuk rempah, insektisida pada lahan
pertanian dan bahan obat - obatan dengan nilai ekonomi yang tinggi (Sumarni et al., 2009 ). Minyak atsiri merupakan minyak yang mudah menguap yang akhirakhir ini menarik perhatian dunia, hal ini disebabkan minyak atsiri dari beberapa tanaman bersifat aktif biologis sebagai antibakteri dan antijamur. Kandungan minyak atsiri daun sirih dilaporkan memiliki daya antibakteri. Kemampuan tersebut karena adanya kandungan 4,2% minyak atsiri yang sebagian besar terdiri dari senyawa betelphenol yang merupakan isomer eugenol, methil eugenol, kariofilen (siskuiterpen), kavikol, kavibekol, estragol dan terpinen (Sastroamidjojo, 1997). Analisis komponen kimia penyusun minyak atsiri Piper betle telah dilakukan juga oleh beberapa peneliti dan diketahui bahwa sebagai komponen utama penyusun minyak atsirinya antara lain kariofilena (30%), Isoeugenol (22%) dan α-kubebena (9%) (Agusta, 2000; Sulianti dan Chairul, 2002; Hertiani dan Purwantini, 2002). Beberapa hasil penelitian tentang daun sirih telah dilaporkan, misalnya bahwa ekstrak daun sirih pada konsentrasi 2,5%, 5% dan 10% secara invitro dapat menghambat pertumbuhan S. aureus dan E. coli (Hermawan, 2007). Nalina dan Rahim (2007) melaporkan bahwa ekstrak air daun sirih memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. mutan. Telah dilaporkan pula bahwa minyak atsiri pada daun sirih, rimpang temu kunci, rimpang lengkuas, dan kunyit berperan dalam aktivitas sebagai antibakteri dan anti jamur. Diduga aktivitas tersebut disebabkan adanya kandungan senyawa fenolik bermolekul rendah yang banyak terdapat di dalam minyak atsiri tersebut (Parwata et al., 2008).
Suppakul et al., (2006) melaporkan adanya sifat antibakteri dan antioksidan pada minyak atsiri daun sirih dan nilai MIC minyak atsiri sirih pada kisaran 12,5 - 100 µLml-1 dapat menghambat pertumbuhan semua mikroorganisme yang diuji kecuali P. aeruginosa. Sediaan obat kumur minyak atsiri daun sirih 2,5% dapat menghambat pertumbuhan E. coli dan sediaan 10% mampu menghambat pertumbuhan S. aureus (Rahmat et al., 2000). Minyak atsiri daun sirih juga memiliki aktivitas dan daya hambat terhadap S. epidermidis dengan nilai MIC 5% ( Alfarisi, 2009). Dari penelitian sebelumnya dilaporkan bahwa minyak atsiri daun sirih memiliki aktivitas sebagai antibakteri dengan mekanisme pengrusakan dinding sel bakteri. Pada penelitian ini dilakukan fraksinasi komponen kimia minyak atsiri daun sirih dan uji aktivitasnya terhadap bakteri gram positif B. Subtilis, S. epidermidis dan S. mutan. Maka, pada penelitian ini ditujukan pada komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih yang diperoleh dari variasi waktu pengambilan distilat terhadap aktivitas antibakteri untuk beberapa jenis bakteri gram positif B. Subtilis, S. epidermidis dan S. mutan.
1.2. Rumusan masalah Dalam penelitian ini yang menjadi rumusan masalah adalah sebagai berikut : 1. Apa saja komponen kimia yang terdapat dalam fraksi minyak atsiri daun sirih yang diperoleh berdasarkan variasi waktu pengambilan fraksi? 2. Bagaimana aktivitas komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih yang diperoleh pada jam ke-1, jam ke-2, jam ke-4 dan jam ke-6 terhadap aktivitas bakteri gram positif B. subtilis, S. epidermidis dan S. mutan?
1.3. Hipotesa Fraksi minyak atsiri daun sirih yang diperoleh pada jam ke-1, jam ke-2, jam ke-4 dan jam ke-6 memiliki komponen kimia yang berbeda dan aktivitas antibakteri terhadap bakteri gram positif B. subtilis, S. epidermidis dan S. mutan dengan merusak membran sel.
1.4. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui komponen kimia yang terdapat dalam setiap fraksi minyak atsiri daun sirih yang diperoleh pada jam ke-1, jam ke-2, jam ke-4 dan jam ke-6. 2. Mengetahui aktivitas antibakteri setiap fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap bakteri gram positif B. subtilis, S. epidermidis dan S. mutan. 3. Mengetahui mekanisme antibakteri fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap bakteri uji.
1.5. Manfaat Penelitian Memberikan landasan ilmiah dan informasi mengenai komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih dan aktivitasnya terhadap beberapa jenis bakteri gram positif untuk menunjang penggunaan daun sirih sebagai bahan obat.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Tanaman Daun Sirih 2.1.1. Klasifikasi Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae Kelas
: Dicotyledoneae
Ordo
: Piperales
Family
: Piperaceae
Genus
: Piper
Spesies
: Piper betle Linn
2.1.2. Nama Daerah Burangir, napuran (Batak), siriah (Minang), buyu, ayap (Dayak), seureuh (Sunda), sedah, suruh (Jawa), kuta kowa (Sumba), papek, ruange (Sul.Utara), ain kamu, amu (Seram), gies, bido (Halmahera), kenaan, bido (Irian Jaya) (Agusta, 2000).
2.1.3. Deskripsi Tanaman Merupakan tanaman memanjat tinggi 5-15 m. Helaian daun berbentuk bundar telur atau bundar telur lonjong, pada bagian pangkal berbentuk jantung atau agak bundar. Tulang daun bagian bawah gandul
atau berambut pendek, tebal,berwarna putih. Panjangnya 5-18 cm dan lebar 2,5-10,5 cm (Sudarsono et al.,1996).
2.1.3. Kandungan Kimia Daun sirih mengandung minyak atsiri dengan kadar berkisar antara 0,13-0,33% (v/v). Terdiri dari kavibetol, katekol, kadinen, karvakrol, kariofilen, kavikol, 1.8 sineol, estragol, eugenol, metil eugenol, pirokatekin, terpenil asetat, sesquiterpen, triterpen dan terpenoid . Disamping itu juga terdapat senyawa neolignan (piperbetol, metilpiper betol, piperol A, piperol B), krotepoksid suatu senyawa yang mempunyai potensi sebagai sitotoksik (Sudarsono et al., 1996).
2.1.4. Khasiat Secara empiris tanaman sirih digunakan untuk obat batuk, asma, hidung berdarah (mimisan), mulut berbau, kepala pusing, demam nifas (daun), gusi bengkak (getah), dan minyak atsirinya untuk radang tenggorokan (Pudjiastuti, 1996; Sudarsono et al., 1996).
2.2. Minyak atsiri 2.2.1. Deskripsi Minyak Atsiri Minyak atsiri adalah zat berbau yang terkandung dalam tanaman. Minyak ini disebut juga minyak menguap karena pada suhu biasa (suhu kamar) mudah menguap di udara terbuka. Komponen utama minyak
atsiri adalah isoprenoid, karena molekul-molekulnya tersusun dari unitunit isopren. Beberapa sifat umum dari minyak atsiri antara lain tersusun oleh bermacam-macam komponen senyawa, memiliki bau khas, mempunyai rasa getir, menggigit tergantung dari jenis komponen penyusunnya, dalam keadaan segar dan murni minyak atsiri umumnya tidak berwarna, tidak stabil terhadap pengaruh lingkungan baik pengaruh udara, sinar matahari dan panas, tidak dapat bercampur dengan air dan larut dalam pelarut organik. Minyak atsiri dapat terbentuk secara langsung oleh protoplasma akibat adanya peruraian lapisan resin dari dinding sel atau oleh hidrolisis dari glikosida tertentu. Minyak atsiri sendiri bagi tanaman berguna untuk menarik serangga yang membantu proses penyerbukan sebagai cadangan makanan, untuk mencegah kerusakan tanaman oleh serangga atau hewan lain dan mempengaruhi proses transpirasi (Didik dan Mulyani, 2004).
2.3. Bakteri 2.3.1. Deskripsi Bakteri Bakteri merupakan kelompok sel prokariotik uniseluler. Salah satu karakteristik utama sel bakteri adalah ukuran, bentuk, struktur dan penataan selnya yang mencakup morfologi sel. Reproduksi terutama dengan aseksual atau pembelahan biner. Ciri umum lainnya adalah dimana
dinding
sel
mengandung
molekul
kompleks
disebut
mukopeptida yang berperan memberi kekakuan pada struktur selnya
(Pelczar et al., 1998). Komponen bakteri secara umum terdiri dari substansi membran sel, dinding sel, bahan nukleat dan ribosom (Brooks et al., 2005; Pelczar et al., 1998).
2.3.2. Bakteri Uji a. Bacillus subtilis Bacillus subtilis dapat diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Tumbuhan Divisi
: Protophyta
Class
: Schizomycetes
Ordo
: Eubacteriales
Family
: Bacillaceae
Genus
: Bacillus
Species
: Bacillus subtilis
B.subtilis merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang, bersifat aerob dan dapat membentuk spora. Bakteri ini banyak terdapat dalam tanah, air, udara dan tumbuh-tumbuhan (Jawetz et al., 1996). B.subtilis dapat menyebabkan beberapa jenis penyakit seperti meningitis,
endokarditis,
infeksi
mata
dan
lain-lainnya
(Syahrurachman et al., 1994). b. Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis di klasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Procariotae Divisi
: Ciano Cyanobacteria
Class
: Bakteria
Ordo
: Eubacterialees
Family
: Micrococcaceae
Genus
: Staphylococcus
Spesies
: Staphylococcus epidermidis
S. epidermis merupakan bagian dari flora normal pada kulit manusia, saluran pernafasan dan saluran pencernaan, dapat ditemukan di udara dan lingkungan sekitar kita. Kuman ini tidak patogen, tidak bersifat invasive, nonhemolitik, berwarna putih, tidak membentuk koagulasi. Staphylococcus patogen sering menghemolisis darah dan mengkoagulasi plasma (Warsa et al., 1993). S. epidermis juga dapat menyebabkan endokarditis infektif jika sebagian besar bakteri ini masuk ke dalam aliran darah dan menempel di katup-katup jantung. Bakteri ini juga sering disebut S. albus (Jawetz et al., 1996). c. Streptococcus mutan Streptococcus mutan di klasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Bacteria Divisi
: Firmicutes
Class
: Diplococcic
Ordo
: Lactobacillales
Family
: Streptococcaceae
Genus
: Streprococcus
Spesies
: Streptococcus mutan
S. mutan merupakan bakteri gram positif berbentuk bulat, yang memiliki karakteristik dapat membentuk pasangan atau rantai selama pertumbuhannya. S. mutan dapat mensintesa berbagai macam polisakarida seperti dextrans atau levans dari sukrosa yang memiliki peranan penting pada proses pembentukan karies gigi (Brooks et al., 2005).
2.4. Antibakteri 2.4.1. Aktivitas Antibakteri Antibakteri adalah obat pembasmi bakteri khususnya bakteri yang merugikan manusia. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada bakteri
yang
bersifat
(bacteriostatic)
dan
(bactericidal).
Sulfonamid,
merupakan
antibiotik
ada
menghambat yang
pertumbuhan
bakteri
membunuh
bakteri
bersifat
kloramfenikol,
yang bersifat
dan
bakteriostatik.
tetrasikiklin Sedangkan
sefalosforin, rifampisin, aminoglikosid, isoniazid, dan kotrimoksazol bekerja secara bakterisid (Bilbiana dan Hastowo, 1992). Konsentrasi minimal yang diperlukan untuk menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri masing-masing dikenal sebagai nilai MIC dan MBC. Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat menjadi bakterisid bila kadar antibakterinya ditingkatkan melebihi MIC (Setiabudy dan Gan, 1995).
2.4.2. Mekanisme Kerja Antibakteri a. Inhibitor Sintesis Dinding Sel Kerusakan
dinding
sel
atau
penghambatan
pada
pembentukannya dapat menyebabkan sel menjadi lisis. Dinding sel bakteri terdiri dari polipeptidoglikan yang merupakan kompleks mukopeptida (glikopeptida). Zat antibakteri menghambat sintesis peptidoglikan dinding sel bakteri dengan menghambat keja enzim traspeptidase dan enzim rasemase alanin atau dengan menghambat sintesa asam muramat. Senyawa penisilin dan sefalosforin yang secara struktur mirip, dan senyawa-senyawa yang tidak mirip seperti sikloserin, vankomisin, dan basitrain merupakan zat antibakteri yang bekerja dengan menghambat sintesis dinding sel (Setiabudy dan Gan, 1995; Chambers, 2007). b. Inhibitor Fungsi Membran Sel Senyawa
yang
bekerja
langsung
pada
membran
sel
mikroorganisme, mempengaruhi permeabilitas dan menyebabkan kebocoran senyawa-senyawa intraselluler. Dalam hal ini termasuk senyawa yang bersifat detergen seperti polimiksin dan amfoterisin B yang berikatan dengan sterol-sterol dinding sel (Chambers, 2007). Kerusakan membran sel akan mengakibatkan keluarnya berbagai komponen penting dalam sel bakteri yaitu protein, asam nukleat dan lain-lain (Setiabudy dan Gan, 1995).
c. Inhibitor Sintesis Protein Sel Bakteri memiliki ribosom dengan 70S, sedangkan manusia memiliki 80S. Unit ribosom pada bakteri adalah 30S dan 50S.Síntesis protein dihambat dengan memengaruhi fungsi subunit ribosom 30S atau 50S sehingga menyebabkan penghambatan síntesis protein yang reversibel dan mengakibatkan kematian sel. Obat bakteriostatik ini meliputi kloramfenikol, golongan tetrasiklin, eritromisin, klindamisin, pristinamin dan aminoglikosida (Setiabudy dan Gan, 1995; Chambers, 2007). d. Inhibitor Sintesis Asam Nukleat Antibakteri yang tergolong kelompok ini adalah golongan kuinolon dan rifampin. Dalam hal ini, derivat rifampin akan berikatan dengan enzim polimerase-RNA (pada sub unit) sehingga menghambat sintesis RNA oleh enzim tersebut. Sementara asam nalidiksat bekerja dengan menggaggu sintesis DNA . Sedangkan golongan kuinolon bekerja dengan menghambat topoisomerase (Bilbiana dan Hastowo, 1992; Chambers, 2007) e. Inhibitor Metabolisme Sel Bakteri Dalam kelompok ini termasuk sulfonamida. Pada umumnya bakteri memerlukan para-aminobenzoat (PABA) untuk sintesis asam folat, yang diperlukan dalam sintesis purin. Sulfonamida memiliki struktur
seperti
PABA,
sehingga
penggunaan
sulfonamida
menghasilkan asam folat yang tidak berfungsi (Bilbiana dan Hastowo, 1992).
2.4.3. Metode Pengujian Antibakteri a. Metode Difusi Metode ini hanya menyajikan informasi kualitatif atau semikuantitatif terhadap
mengenai
antibiotik
yang
kerentanan diberikan.
mikroorganisme Uji
dilakukan
tersebut dengan
mengaplikasikan cakram Kertas saring berisi sejumlah obat tertentu diatas permukaan medium agar (medium padat) yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji. Setelah inkubasi 18-24 jam, dilakukan pengukuran daerah hambatan yang jernih disekitar cakram. Diameter daerah tersebut tergantung pada aktivitas obat terhadap mikroba yang diuji. Nilai standar untuk ukuran daerah hambatan masing-masing spesies
bakteri
dan
masing-masing
antibiotik
memungkinkan
klasifikasi isolat secara klinis sebagai resisten, intermediet, atau rentan (Chambers, 2007). b. Metode Dilusi Metode ini menggunakan antimikroba dengan kadar yang menurun secara bertahap (seri pengenceran), baik dengan media cair atau padat. Kemudian media diinokulasi bakteri uji dan dieramkan. Tahap akhir dilarutkan antimikroba dengan kadar menghambat atau mematikan (Brooks et al., 2005; Pratiwi, 2008).
BAB III KERANGKA KONSEP
Sampel daun sirih segar
Determinasi Tanaman
Disortasi dan dirajang
Didistilasi uap dan air
Pengambilan fraksi minyak atsiri Analisa kimia dengan GCMS
Uji aktivitas antibakteri
Penentuan diameter daerah
Penentuan MIC
hambat
Analisis Protein & Asam
Analisis Ion-Ion
Nukleat Dengan Uv-Vis
Logam Dengan AAS
Analisis SEM
BAB IV METODOLOGI PENELITIAN
4.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni hingga Agustus 2010 dan bertempat di Laboratorium Biosain, Puslit biologi, LIPI Cibinong, Bogor.
4.2. Pengambilan Sampel Sampel daun sirih (Piper betle Linn.) diambil dari tanaman yang terdapat di
BALITRO (Balai Tanaman Obat dan Rempah),
Cimanggu,
Bogor. Waktu pengambilan sampel dilakukan pada bulan Mei 2010.
4.3. Determinasi Tanaman Sampel daun sirih diidentifikasi di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Puslit biologi, LIPI Cibinong, Bogor.
4.4. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain perangkat distilasi uap dan air, cawan petri, inkubator, neraca analitik, Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, jarum ose, mikropipet, microplate, oven, tabung reaksi, rak tabung reaksi, spektrofotometer Uv-Vis Perkin Elmer, spektrofotometer AAS Perkin Elmer a Analist 700, Gas Chromatography-
Mass Spectrophotometer (GC-MS) Varian Saturn 2000, Scanning Eletron Microscope (SEM) JEOL seri JSM-5310 LV, refrigerator, pipet tetes, erlenmeyer, vial, ependrof, inkubator, inkubator shaker, vortek dan sentrifus. 2. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih (Piper bettle Linn.), aquadest, NaSO4 anhidrat, tween 80, aquadest steril, Blood Agar Base, Nutrient Agar, Mueller Hinton Agar, Mueller Hinton Broth, darah kambing steril, dapar fosfat pH 7,4; cacodylate buffer, glutaraldehid 2,5%, alkohol 50%, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 95%, alkohol 96%, tannin acid, terbutanol dan osmium tetraoksida 1%. 3. Bakteri Uji Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis dan Steptococcus mutan.
4.5. Metode Penelitian Kegiatan yang dilakukan untuk mencapai sasaran : 1. Isolasi fraksi minyak atsiri daun sirih 2. Identifikasi komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih 3. Pengujian aktivitas antibakteri fraksi minyak atsiri daun sirih a. Sterilisasi alat dan bahan b. Pembuatan medium c. Pembiakan bakteri uji d. Pembuatan suspensi bakteri uji e. Pembuatan larutan uji
f. Penentuan Minimum Inhibitor Concentration (MIC) 4. Analisis protein dan asam nukleat 5. Analisis ion logam Ca2+ dan K + 6. Analisis Perubahan Morfologi Sel dengan Scanning Electron Microscope (SEM)
4.6. Prosedur Kerja 4.6.1. Isolasi Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih Sampel daun sirih yang diperoleh dari Balai Penelitian Obat dan Aromatik (BALITRO) dan sudah dideterminasi di Herbarium Bogoriensis, LIPI Puslit Biologi, Cibinong, Jawa Barat. Diambil dalam keadaan segar kemudian di sortasi dan ditimbang sebanyak ± 30 kg lalu dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan segala jenis kotoran yang melekat. Setelah pencucian selesai, kemudian dilakukan perajangan dan proses distilasi uap dan air selama 6 jam dengan variasi waktu pengambilan distilat untuk mendapatkan fraksi minyak atsiri dari dalam tanaman. Setiap fraksi minyak atsiri yang telah berhasil didapatkan kemudian ditambahkan NaSO4 anhidrat untuk
menghilangkan
kandungan
air.
Kemudian
menentukan
presentase kadar setiap fraksi minyak atsri yang berhasil di dapat. Presentase kadar fraksi minyak atsiri didapat berdasarkan berat fraksi minyak atsiri yang diperoleh perberat sample x 100%.
4.6.2. Identifikasi Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih Identifikasi komponen fraksi minyak atsiri daun sirih dilakukan selama 1 jam dengan menggunakan instrumentasi GC-MS Varian Saturn 2000 di Laboratorium Analisis Umum, LIPI Cibinong. Preparasi sample fraksi minyak atsiri dilakukan dengan penambahan dietil eter. Jenis kolom yang digunakan adalah VF-17 MS panjang 30mm dan ID sebesar 0,25 mm. Gas pembawa adalah helium dengan kecepatan aliran 1,3 ml/menit dan tekanan sebesar 10,7 Psi. Suhu kolom diprogram dari 50 oC sampai 250 oC dengan dua tahap kenaikan. Pada tahap awal suhu kolom dibuat konstan 50 oC selama 3 menit, lalu dinaikkan sampai 150 oC dengan temperatur 5 oC/menit dan selanjutnya dinaikkan menjadi 250 oC dengan temperatur 3 o
C/menit. Kondisi ini dipertahankan selama 3.67 menit. Suhu injektor
selama analisis berlangsung diprogram konstan pada suhu 230 oC. Sementara temperatur interface adalah 250 oC dan autosampling sebanyak 2 µl. Solvent cut time selama 3 menit dan Scan MS 50-450 (M/Z).
4.6.3. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih 4.6.3.1. Sterilisasi Alat dan Bahan a. Sterilisasi Alat Sterilisasi dilakukan dengan cara yang sesuai terhadap masing-masing alat. Alat-alat yang akan disterilkan harus dalam
keadaan bersih dan kering. Tabung reaksi, gelas ukur, vial, erlenmeyer ditutup mulutnya dengan alumunium voil, kemudian semuanya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 ˚C, selama 15 menit. Pinset, jarum ose, disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen. b. Sterilisasi Bahan Untuk media pembenihan, aquadest, tween 20 disterilkan dan larutan NaCl dengan autoklaf pada temperatur 121 oC selama 15 menit. Pengerjaan aseptis dilakukan di dalam lemari aseptis yang sebelumnya telah dibersihkan dengan larutan alkohol, lalu disterilkan dengan UV yang dinyalakan selama lebih kurang 2 jam sebelum digunakan.
4.6.3.2.Pembuatan Medium a. Blood Agar Base (BAB) Pada pembiakan bakteri S. mutan media yang digunakan adalah Blood Agar Base sebanyak 40 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit. Kemudian ditambahkan darah pada suhu 35-40 0
C sekitar 5%.
b. Nutrient Agar (NA) Pada pembenihan bakteri B.subtilis dan S. Epidermidis media yang digunakan Nutient Agar. Serbuk NA sebanyak 23
gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit. c. Mueller Hinton Agar Sebanyak 38 gr serbuk Mueller Hinton Agar dilarutkan dalam 1 liter aquadest, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit. d. Mueller Hinton Broth Sebanyak 21 gr serbuk Mueller Hinton Broth dilarutkan dalam 1 liter aquadest, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit.
4.6.3.3. Pembiakan Bakteri Uji Bakteri B. Subtilis dan S. epidermidis diinokulasikan ke media Nutrien Agar miring sedangkan S. mutan diinokulasikan ke media Blood Agar Base miring menggunakan ose yang telah disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam.
4.6.3.4. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Stok bakteri uji yang telah diremajakan pada agar nutrien miring, Diambil dengan jarum ose (1 ose) dan dimasukkan kedalam tabung yang berisi 5 ml Mueller Hinton Broth, media untuk S. mutan ditambahkan darah steril. Kemudian divortek.
Dan diinkubasi selama 18 jam. Selanjutnya dituang ke dalam nutrien agar dan media untuk S. mutan ditambahkan darah steril. Diencerkan hingga diperoleh suspensi (105) sel bakteri/ml. Suspensi ini yang akan digunakan dalam pengujian.
4.6.3.5. Pembuatan Larutan Uji Larutan induk dibuat emulsi dengan menggunakan cara mencampur fraksi minyak atsiri daun sirih dengan pelarut 0.5% tween 80, etanol absolut 2% dan aquadest. Kemudian diencerkan hingga 17,5%; 15%; 12,5%; 10%; 7,5%; 5%; 2,5%; 1%; 0.5%; 0,25%; 0,125%.
4.6.3.6. Penentuan MIC (Rodriguez et.al., 2002) Metode penentuan minimum inhibitor concentration adalah adalah sebagai berikut : Menyiapkan larutan uji yang sudah dibuat dan juga larutan kontrol. Menyiapkan media Mueller Hinton Broth, menyiapkan microplate, selanjutnya tiap-tiap sumuran diisi dengan 100 µl media MHB, 100 µl suspensi bakteri 1x105 sel/ml, dan 50 µl larutan uji dengan berbagai konsentrasi, dan juga larutan kontrol, dan dibuat homogen.
Kemudian diinkubasikan dalam shaker 150 rpm pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Pembacaan hasil percobaan didasarkan pada keruh atau tidaknya sumuran percobaan dibandingkan kontrol untuk menentukan MIC dan juga dengan cara plating pada media agar di cawan petri. Percobaan dilakukan secara duplo.
4.6.4. Analisis Protein dan Asam Nukleat (Carson et al., 2002) Suspensi bakteri uji yang telah diinkubasi selama 18 jam dalam media Muller Hinton Broth. Sentrifus dingin, kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Selanjutnya filtrat dibuang dan pellet dalam tabung dicuci dengan dapar fospat Ph 7,4 sebanyak 2 kali. Lalu suspensikan kedalam dapar fospat Ph 7,4 hingga volume 10 ml. Ditambahkan fraksi minyak atsiri daun sirih dengan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC sesuai kebutuhan. Diinkubasi kembali selama 24 jam dalam shaker 150 rpm 37 ºC. Kemudian suspensi disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm, lalu saring dan ambil cairan supernatan. Selanjutnya ukur absobansi dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
4.6.5. Analisis Ion Logam Ca2+ dan K + (Cox et al., 2000) Untuk analisis ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca2+ dan K+ yang keluar dari membran sel bakteri akibat perlakuan dengan minyak atsiri. Analisis kebocoran ion dilakukan pada pelet bakteri yang dipersiapkan seperti pada pengukuran kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran dinyatakan dengan terukurnya ion-ion logam yang terdapat pada bakteri uji setelah dikontakkan dengan minyak atsiri pada perlakuan 1 MIC dan 2 MIC. Kebocoran ion Ca2+ dan K+ dideteksi dengan menggunkan AAS (Atomic Absorption Spectrophotometre) Perkin Elmer a Analist 700. Larutan sel hasil kontak dengan minyak atsiri diambil untuk diukur kandungan ion-ionnya.
4.6.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel dengan SEM (Fathillah et al., 2009) Suspensi bakteri (umur 24 jam) diberi perlakuan 1 MIC, 2 MIC fraksi minyak atsiri dan kontrol. Diinkubasi selama 24 jam pada shaker 150 rpm suhu 37 ºC. Selanjutnya suspensi bakteri tersebut disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, cairan dibuang untuk mendapatkan masa sel bakteri (pelet). Kemudian pelet dicuci dengan dapar fospat sebanyak 2 kali. Pelet difiksasi dengan glutaraldehid 2,5% selama 4 jam, Selanjutnya disentrifus dan supernatan dibuang. Pelet direndam kembali dengan larutan tannin acid 2% selama 18 jam selanjutnya disentrifus. Supernatan dibuang dan pelet direndam dengan cacodylate buffer sebanyak 2 kali masing-masing selama 10 menit.
Kemudian disentrifus kembali, dibuang supernatan dan pelet direndam dalam osmium tetraoksida 1% dalam cacodylate buffer dibiarkan dalam refrigerator selama 1 jam. Setelah direndam, disentrifus kembali dan pelet dicuci dengan alkohol 50% dingin, dibiarkan 10 menit dan disentrifus kembali selama 5 menit. Kemudian supernatan dibuang dan pelet dikeringkan berturut-turut dengan alkohol 50%, 70%, 80% dan alkohol 95% masing-masing selama 10 menit. Dicuci dengan alkohol absolut dan disentrifus 5 menit sebanyak 2 kali dan dicuci kembali dengan terbutanol 2 kali. Kemudian Oleskan apusan sel diatas potongan bujur sangkar cover slip (slip glas) dan dikeringkan dengan terbutanol. Slip glas yang telah diolesi dengan sel tersebut diletakkan pada stub alumunium untuk dicoating dengan emas dalam ion coater selama 1 jam pada kondisi vakum. Kemudian diamati dengan alat Scanning Electron Microscope tipe JEOL seri JSM-5310 LV.
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Hasil 5.1.1. Isolasi dan Penentuan Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih
Gambar 1: Daun sirih Metode yang digunakan untuk proses pemisahan komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih segar yang berasal dari Balitro, Cimanggu (Bogor), adalah distilasi uap dan air (Sugiastuti, 2002; Sulianti dan Chairul, 2002). Proses distilasi ini dilakukan dengan menggunakan variasi waktu pengambilan minyak atsiri yaitu pada jam ke-1, jam ke-2, jam ke-4 dan jam ke-6. Perbedaan waktu pengambilan distilat ini memberikan hasil yang berbeda pada kandungan komponen kimia fraksi minyak atsirinya (tabel 1). Begitu pula terhadap nilai presentase kadar yang dihasilkan masing – masing fraksi 1,2,3 dan 4 yaitu 0.061%, 0.034%, 0.027% dan 0.015%. Namun demikian, minyak yang diperoleh masih memiliki aroma dan warna yang sama, dengan aroma daun sirih yang khas dan berwarna kuning jernih.
Dari hasil analisis GCMS diketahui bahwa keempat fraksi minyak atsiri tersebut memiliki
kromatogram yang berbeda satu sama lain
(gambar 1). Fraksi jam ke-1 memiliki 64 komponen kimia penyusun. Sedangkan pada fraksi jam ke-2 dan jam ke-6 terdeteksi sebanyak 56 puncak dan 73 puncak untuk fraksi jam ke-4. Identifikasi masing-masing puncak pada kromatogram masingmasing fraksi minyak atsiri memperlihatkan bahwa komponen kimianya terdiri dari monoterpena, monoterpena alkohol, seksuiterpena, seskuiterpena alkohol dan turunan fenil propanoid. Kemudian masingmasing komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih dikelompokkan berdasarkan golongan senyawanya seperti terlihat pada (tabel 2).
Gambar 2. Perbandingan kromatogram antar fraksi minyak atsiri daun sirih Keterangan: a: Minyak atsiri daun sirih tunggal b: Minyak atsiri daun sirih fraksi jam ke-1 c: Minyak atsiri daun sirih fraksi jam ke-2 d: Minyak atsiri daun sirih fraksi jam ke-4 e: Minyak atsiri daun sirih fraksi jam ke-6
Tabel 1. Perbandingan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri daun sirih No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Waktu Retensi 10,84 11,23 12,36 12,73 13,09 13,39 13,55 14,07 15,10 15,69 18,93 19,62 20,74 21,35
15 16
21,65 21,98
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
22,40 22,62 23,08 23,32 23,91 24,24 24,57 24,66 24,97 25,61 25,89 26,12 26,33 26,46
31 32 33 34 35 36
26,83 27,04 27,19 27,38 27,60 27,85
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
27,97 28,13 28,30 28,43 28,59 29,17 29,90 31,07 31,29 31,44 31,65 31,77 32,03 32,35
51 52
32,52 32,92
53 54 55 56 57 58
33,30 33,45 33,61 33,78 34,07 34,52
Nama Senyawa Sabinen 2-β-pinen α-Terpinen dl-Limonen β-Felandren 3-Karen Tidak teridentifikasi γ-Terpinen α-Humulen Linalil Isobutirat Origanol α-Terpinenil asetat Estragol Asam benzoat, 2-hidroksi,metil ester α-Kubeben 1-(1-Etil-2,3-dimetilsiklopen-2-enil)-etanon β-Bourbenen α-Kopaen Kavikol β-Elemen α-Bergamot Trans-α-Bergamot Kariofilen α-Guaien Aromadendren Fenol 1,4-(2-profenil)-asetat α-Humulene p-Eugenol Valensen Naptalen,1,2,3,4,4a,5,6,8aoktahidro-7-metil-4-metilen1-(1-metilethil) Kavibetol β-Selinen α-Selinen ∆- Gurjunena Bisiklogermakren Benze,1,2-dimetoksi-4-(2propenil) α-Pacuelen β-Kadinena (-)-α-Panasinsen β-Kadinena Kadina-1,4-diena γ-Himakalen γ-Gurjunena Veridiflorol γ-Gurjunene poksid-(2) β-Guaien Kariofilen oksida (-)-Kariofilen oksida Kubenol 2,3,3-Trimetil-2-(3-methilbuta-1,3-dienil)-sikloheksan 3-Alil-6-metoksipenil asetat fenol,2-metoksi-4-(1profenil)-asetat β-Guaien t-Kadinol β-Bisabolol Toreyyol Junipen Agarospirol
48
Rumus Molekul C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C15H24 C14H24O2 C10H18O C12H20O2 C10H12O C8H8O3
BM 136 136 136 136 136 136 136 204 224 154 196 148 152
F1 0,65 0,10 0,06 0,05 0,29 0,39 0,19 0,10 0,05 0,59 0,37 0,09 0,16 1,00
Kandungan Relatif (%) F2 F3 0,12 0,09 0,18 0,07 0,10 0,06 0,06 0,04 1,07 1,28
C15H24 C11H18O
204 166
0,20 0,06
0,29 0,14
0,24 0,17
0,29 0,15
C11H18O C15H24 C9H10O C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C11H12O2 C15H24 C10H12O2 C15H24 C15H24
166 204 134 204 204 204 204 204 204 176 204 164 204 204
0,05 0,31 1,61 2,85 0,16 0,06 4,82 1,21 0,20 10,34 3,82 0,59 0,50 1,01
0,13 0,69 1,44 4,41 0,31 0,12 8,70 2,63 0,55 0,02 4,97 1,09 1,28
0,17 0,80 1,90 3,94 0,37 0,14 8,54 3,56 0,73 0,03 4,97 1,39 1,46
0,13 0,71 1,47 4,33 0,32 0,12 8,61 2,65 0,55 0,02 4,85 1,09 1,30
C10H12O2 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C11H14O2
164 164 204 204 204 204
10,61 0,78 1,60 1,74 3,11 0,12
9,60 2,97 2,58 3,83 4,11 0,07
10,50 3,64 3,02 4,63 3,16 0,09
9,90 2,88 2,63 3,78 4,08 0,08
C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H26O C15H24 C15H26O C15H24O C15H24 C15H24O C15H24O C15H26O C14H22O
204 204 204 204 204 222 204 204 220 222 220 220 222
0,47 0,43 0,20 0,06 0,05 0,03 0,05 0,07 0,05 0,17 0,10 0,05 0,59 0,10
0,55 0,72 0,29 0,08 0,30 0,14 0,37 0,10 0,07 0,22
0,69 1,02 0,42 0,03 0,13 0,59 0,24 0,57 0,14 0,10 0,08 0,27
0,54 0,72 0,30 0,09 0,30 0,14 0,37 0,11 0,07 0,22
C12H14O3 C12H14O3
206 206
0,34 13,89
0,51 12,95
0,38 10,77
0,52 13,01
C15H24 C15H26O C15H26O C15H26O C15H24 C15H26O
204 222 222 222 222 222
0,12 0,05 0,05 0,12 0,45 0,12
0,17 0,08 0,04 0,18 0,89 0,39
0,21 0,12 0,04 0,20 1,52 0,80
0,17 0,08 0,04 0,17 0,90 0,40
F4 0,12 0,18 0,10 0,06 1,30
59 60 61 62
35,30 35,48 35,76 37,03
Pacouli Alkohol Longiborneol γ-Eudesmol 4-Alil-1,2-diasetoksibenzen
C15H26O C15H26O C15H24O C13H14O4
222 222 220 234
4,95 0,00 0,07 27,31
10,23 14,53
12,62 0,12 6,32
10,08 14,64
63 64
38,62 38,77
C11H15NO2S
225
0,09 0,22
0,17 0,66
0,31 1,08
0,18 0,83
65 66 67 68 69 70
25,29 25,53 25,98 26,66 26,90 31,98
Tidak teridentifikasi fenol,3,5-dimetil-4(metiltio)-metilkarbamat β-Pacuelen Kavisil asetat Seychellen α-Sedren β-Bisabol 4-Alil-1,2diasetoksibenzene
C15H24 C11H12O2 C15H24 C15H24 C10H12O2 C13H14O4
204 176 204 204 164 234
-
0,04 1,55 2,27 0,31 0,02 0,36
0,06 1,04 2,80 0,37 0,27
0,04 1,54 2,28 0,01 0,36
71 72
33,04 39,73
C15H26O C15H22
222 202
-
0,04 0,10
0,06 0,13
0,04 0,08
73 74 75 76 77 78 79
24,09 30,10 30,77 30,87 32,59 34,37 34,67
C10H10O2 C15H24 C15H24 C15H24 C15H26O C12H18O
162 204 204 204 222 178
-
-
-
-
-
0,04 0,33 0,17 0,04 0,33 0,03 0,10
80 81 82
34,76 35,01 36,09
C15H24 C7H6Cl2O
204 176
-
-
0,14 0,07 0,03
-
83 84 85 86 87
36,22 37,20 37,44 41,74 42,78
Epiglobulol 4,4-Dimetil-3-(3-metilbut-3eniliden)-2-metilen bisiklo(4.1.0)heptan Safrol (-)-α-Selinen Selina-3,7(11)diena (-)-Kariofilen-(l1) β-Guaien Tidak teridentifikasi 2-Propenol,3- (2,6,6 trimetil1-siklpheksen-1-yl) Tidak teridentifikasi γ-Selinen Bisiklo(3.2.0)hept-2-en-6one,7,7-dikloro Eudesm-7(11)-en-4-ol 4-Alil-1,2-diasetoksibenzen Sedrenol (+)-α-Siperone Tidak teridentifikasi
C15H26O C13H14O4 C15H24O C15H22O -
222 222 220 218 -
-
-
0,06 0,06 0,13 0,08 0,09
0,07 -
-
Keterangan : F1: Fraksi jam ke-1 F2: Fraksi jam ke-2 F3: Fraksi jam ke-4 F4: Fraksi jam ke-6 - : tidak teridentifikasi
Tabel 2. Penggolongan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri daun sirih No . 1. 2. 3. 4. 5 6 7
Golongan Senyawa
Monoterpena Monoterpena Alkohol Seskuiterpena Seskuiterpena Alkohol Turunan Fenil Propanoid Lain - lain Tidak teridentifikasi Total Keterangan: F1: Fraksi jam ke-1 F2: Fraksi jam ke-2 F3: Fraksi jam ke-4 F4: Fraksi jam ke-6
F1 1,63 0,37 24,49 6,00 66,07 1,16 0,28 100
Presentase (%) F2 F3 0,12 0,09 0,10 0,06 44,36 49,21 11,26 15,15 42,54 32,83 1,45 2,09 0,17 0,57 100 100
F4 0,12 0,10 43,72 11,20 43,07 1,61 0,18 100
5.1.2. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih Aktivitas antibakteri fraksi minyak atsiri sirih terhadap tiga bakteri uji dapat dihitung dengan mengukur diameter daerah hambat (DDH) pertumbuhan bakteri disekitar kertas cakram yang terlihat jernih. Berdasarkan hasil pengujian yang disajikan dalam tabel 3 dapat diketahui bahwa fraksi minyak atsiri sirih pada konsentrasi 50% dapat mempengaruhi pertumbuhan ketiga bakteri dengan tingkat hambatan yang berbeda. F2 dan F4 minyak atsiri daun sirih memiliki tingkat sensitifitas yang paling tinggi terhadap ketiga bakteri uji dibandingkan dengan ketiga fraksi lainnya (tabel.3). Tabel 3. Aktivitas fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap 3 jenis bakteri uji gram positif pada konsentrasi 50% No 1 2 3
Bakteri uji B. subtilis S. epidermidis S. mutan Kontrol metanol
Diameter Daerah Hambat (mm)* F1 F2 F3 F4 4 8 7 7,5 2 4,5 2,5 5,5 5,5 13 4,5 8,5 -
Keterangan: F1: Fraksi jam ke-1 F2: Fraksi jam ke-2 F3: Fraksi jam ke-4 F4: Fraksi jam ke-6 * : rata-rata dari dua ulangan – : tidak ada diameter daerah hambat
5.1.3. Penentuan MIC Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih Penentuan nilai MIC berdasarkan atas konsentrasi minimal fraksi minyak atsiri daun sirih yang dapat menghambat pertumbuhan ketiga bakteri uji gram positif (tabel 4 dan tabel 5).
Tabel 4. Penentuan MIC fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap bakteri uji B. subtilis Konsentrasi MIC (%) 1 17,5 2 15,5 3 12,5 4 10 5 7,5 6 5 7 2,5 Kontrol pelarut* No
F1 + + + + + + + -
Nilai MIC B. subtilis F2 F3 + + + + + + + + + + + + + + -
F4 + + + + + + + -
Keterangan: F1: Fraksi jam ke-1 F2: Fraksi jam ke-2 F3: Fraksi jam ke-4 F4: Fraksi jam ke-6 “-“: tidak ada pertumbuhan bakteri + : ada pertumbuhan bakteri *: 0,5% tween 80, 2% etanol absolut dan aquadest
Tabel 5. Penentuan MIC fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap bakteri uji S. epidermidis dan S. mutan No
Konsentrasi MIC (%)
Nilai MIC Nilai MIC S.mutan S.epidermidis F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 1 5 2 2,5 3 1 + 4 0,5 + + + 5 0,25 + + + 6 0,125 + + + + + + + + Kontrol pelarut* Keterangan: F1: Fraksi jam ke-1 F2: Fraksi jam ke-2 F3: Fraksi jam ke-4 F4: Fraksi jam ke-6 “-“: tidak ada pertumbuhan bakteri + : ada pertumbuhan bakteri *: 0,5% tween 80, 2% etanol absolut dan aquadest
5.1.4. Analisis Kebocoran Protein dan Asam Nukleat Pemberian fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih pada beberapa dosis MIC mengakibatkan terjadinya kerusakan sel yang diamati dengan adanya kebocoran protein dan asam nukleat dari sel bakteri. Fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih menyebabkan kebocoran sel yang diamati dengan adanya peningkatan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (gambar 3). Senyawa-senyawa yang memberikan serapan pada panjang gelombang 260 nm adalah asam nukleat (RNA dan DNA), sedangkan pada panjang gelombang 280 nm diidentifikasi sebagai protein.
Gambar 3. Nilai absorbansi asam nukleat dan protein fraksi jam ke-1 pada sel S .epidermidis
5.1.5. Analisis Ion Logam Ca2+ dan K+ Fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih juga dapat menyebabkan terlepasnya ion Ca2+ dan K+ dari sel bakteri S.epidermidis. Ion-ion yang keluar dari sel dapat dilihat pada gambar 4.
Gambar 4. Hasil pengukuran konsentrasi ion logam Ca2+ dan K+ fraksi jam ke-1 pada supernatan biakan S.epidermidis konsentrasi 1 MIC dan 2 MIC
5.1.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel Bakteri S. epidermidis Dengan SEM Fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih dengan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC juga dapat menyebabkan kebocoran pada membran sel, hal ini bisa dilihat pada gambar 5. Dari gambar foto yang di dapatkan oleh Scanning Electron Microscope dapat terlihat adanya perubahan morfologi sel. Perubahan morfologi sel dapat ditunjukkan dari gambar 5(a) dimana hasilnya menunjukkan
bakteri
S. epidermidis yang
normal, sel-selnya masih terlihat kompak, dan berbentuk bulat. Kemudian terjadi perubahan sel yang ditunjukkan oleh gambar 5(b) dan gambar 5(c) dimana sel bakteri S. epidermidis yang sudah diberi perlakuan minyak atsiri daun sirih dengan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC terjadi perubahan sel jadi mengkerut dan berlubang.
Berlubang
Berlubang dan Mengkerut
(a) (b) (c) Gambar 5. Morfologi sel S.epidermidis. (a) kontrol, (b) Sel S.epidermidis setelah perlakuan 1 MIC, (c) Sel S.epidermidis setelah perlakuan 2 MIC (perbesaran 10.000x). Tanda panah adalah terjadinya kebocoran.
5.2. Pembahasan Sirih dikenal karena hampir semua bagian tanaman digunakan sebagai obat, disamping sebagai ramuan makan sirih. Selain itu dianggap juga dapat menguatkan gigi, mencegah gangguan perut, menambah ketahanan tubuh, stimulan syaraf dan lain – lain (Pudjiastuti, 1996). Pada penelitian ini telah dilakukan isolasi fraksi minyak atsiri, identifikasi komponen kimia fraksi, dan uji aktivitas antibakteri dari daun sirih dalam bentuk fraksi minyak atsiri untuk mendapatkan alternatif antibakteri. Daun sirih yang digunakan dalam penelitian ini merupakan daun sirih segar yang berasal dari Balitro, Cimanggu, Bogor dan telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Puslit Biologi LIPI seperti yang tertera pada lampiran 1. Metode yang digunakan untuk proses pemisahan komponen fraksi minyak atsiri daun sirih adalah metode distilasi uap dan air (Sugiastuti, 2002; Sulianti dan Chairul, 2002). Sebelum proses distilasi, daun sirih terlebih dahulu disortasi dan dicuci untuk memisahkan dan menghilangkan pengotor
yang melekat pada sampel.Kemudian dirajang dengan cara dipotong – potong kecil untuk memperluas ukuran permukaan partikelnya agar mempermudah kontak antara bahan sampel dengan uap air sehingga proses distilasi dapat berlangsung dengan baik (Novalny, 2006). Proses fraksinasi distilat ini dilakukan dengan menggunakan variasi waktu pengambilan distilat yaitu pada jam ke-1 (F1), jam ke-2 (F2), jam ke-4 (F3) dan jam ke-6 (F4) untuk dapat mengamati hasil distilat yang diperoleh. Perbedaan waktu pengambilan distilat memberikan hasil yang berbeda pada volume distilat yang diperoleh. Hal ini berpengaruh terhadap presentase kadar masing – masing fraksi. Hasil distilasi uap dan air secara berurutan untuk fraksi 1,2,3, dan 4 diperoleh minyak atsiri daun sirih dengan presentase 0.061%, 0.034%, 0.027% dan 0.015%. Namun demikian, minyak yang diperoleh masih memiliki aroma dan warna yang sama, dengan aroma daun sirih yang khas dan berwarna kuning jernih. Dari hasil analisa GCMS diketahui bahwa keempat fraksi tersebut memiliki kromatogram yang berbeda satu sama lain (gambar 1). F1 memiliki 64 komponen kimia penyusun. Dengan komponen utamanya (>5%) terdiri dari fenol 4-(2-profenil)-asetat (10,34%), kavibetol (10,61%), fenol,2metoksi-4(1-profenil)-asetat
(13,89%)
dan
4-alil-1,2-diasetoksibenzen
(27.31%). Pada F2 terdeteksi sebanyak 56 puncak dan memilki 5 komponen utama penyusunnya, antara lain kariofilen (8.70%), kavibetol (9.60%), fenol,2-metoksi-4(1-profenil)-asetat (12.95%), pacouli alkohol (10.23%), dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen (14.53%). Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa ada perbedaan jumlah komponen kimia mayor dan minor antara F1
dengan F2. Hasil identifikasi komponen kimia penyusun F2 menunjukkan bahwa 48 komponen diantaranya merupakan komponen yang sama dengan komponen penyusun F1 (Tabel 1). 16 komponen lainnya yang berbeda adalah sabinen, β-pinen, α-terpinen, dl-limonen, β-felandren, γ-terpen, α-humulen, estragol, γ-himakalen, β-cadine, γ-gurjunen, kubenol, longiberneol, dan γeudesmol. Untuk F3 terdeteksi sebanyak 73 puncak dengan komponen utamanya adalah kariofilen (8.54%), kavibetol (10.50%), fenol,2-metoksi-4 (1-profenil) –asetat (10.766%), pacouli alkohol (12.62%), dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen (6.318%). Bila dibandingkan dengan komponen F2,
sebagian komponen
penyusun F3 merupakan komponen penyusun F2 (tabel 1). 16 senyawa lainnya sebagai penysusun komponen F3 antara lain β-kadinena; kubenol; γeudesmol; safrol; (-)-α-selinene; selina-3,7(l1)diena; (-)-kariofilen-(l1); βguaein; 2-propenol,3-(2,6,6-trimetil-1-sikloheksen-1-yl); γ-Selinen; Bisiklo (3.2.0) hept-2-en-6-one,7,7-dikloro; Eudesm-7(11)-en-4-ol; sedrenol; dan (+)α-siperon. Jika dibandingkan dengan komponen senyawa F1, terdapat 14 komponen yang berbeda. Komponen berbeda tersebut merupakan komponen yang sama-sama tidak terdeteksi di F2 pada F1. Pada F4 terdapat 56 senyawa yang terdeteksi dengan kandungan komponen utamanya antara lain kariofilen (8.61%), kavibetol (9,90%), fenol,2-metoksi-4 (1-profenil) –asetat (13.01%), pacouli alkohol (10.08%), dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen (14.64%). Jika dibandingkan dengan F3, terdapat 19 senyawa yang tidak dimiliki oleh F4. Sebanyak 16 senyawa diantaranya adalah komponen kimia penyusun F4 dan 3 senyawa lainnya
merupakan komponen penyusun yang sama pada F1 dan F3 yaitu β-kadinena, kubenol dan γ-eudesmol. Jika dibandingkan dengan F2 tidak terdapat senyawa yang berbeda. Jika dibandingkan dengan F1 terdapat 16 senyawa yang berbeda. Yaitu senyawa yang sama – sama tidak terdeteksi pada F2 (tabel 1) .Bila dibandingkan dengan hasil analisa minyak atsiri pada daun sirih yang telah dilakukan para peneliti, terdapat beberapa persamaan komponen utama penyusunnya, antara lain kariofilen, kavikol, β-pinen, kopaen, dan kamfen (Harapini et al., 1996; Rahmat et al., 2000; Jamal dan Agusta, 2001; Parwata et al., 2009). Identifikasi masing-masing puncak pada kromatogram masing-masing fraksi minyak atsiri memperlihatkan bahwa komponen kimianya terdiri dari monoterpena, monoterpena alkohol, seksuiterpena, seskuiterpena alkohol dan turunan fenilpropanoid. Kemudian masing-masing komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih dikelompokkan berdasarkan golongan senyawanya seperti yang tercantum pada tabel 2. Pengujian aktivitas antibakteri fraksi minyak atsiri menggunakan metode difusi cakram dan mikrodilusi. Metode difusi cakram merupakan skrining awal untuk mengetahui sensivitas bakteri terhadap fraksi minyak atsiri yang ditunjukkan dengan terbentuknya diameter daerah hambatan yang berupa zona bening disekitar cakram kertas saring. Uji dilakukan dengan mengaplikasikan cakram kertas saring berisi sejumlah fraksi minyak atsiri diatas permukaan medium agar (medium padat) yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji. Setelah inkubasi 18 jam, dilakukan pengukuran daerah hambatan yang jernih disekitar cakram.. Diameter daerah tersebut tergantung
pada aktivitas fraksi minyak atsiri terhadap bakteri yang diuji (Chamber, 2007). Semakin luas diameter hambatan tersebut menunjukkan semakin besar daya antibakteri fraksi minyak atsiri daun sirih. Dari hasil pengujian difusi cakram menunjukkan bahwa konsentrasi 50% masing –masing fraksi minyak atsiri daun sirih dapat menghambat pertumbuhan ketiga bakteri uji. Antara lain B. subtilis, S. mutan dan S. epidermidis. Diameter penghambatan yang terbentuk antar tiap fraksi dan bakteri berbeda. Fraksi 2 dan Fraksi 4 merupakan fraksi yang memiliki sensivitas tertinggi terhadap ketiga bakteri uji (tabel 3). Hal ini dapat dilihat dari besarnya zona bening yang terbentuk disekililing cakram uji .Sedangkan bakteri yang memiliki sensitiviyas tertinggi terhadap semua fraksi minyak atsiri daun sirih adalah S. mutan (Tabel 3). Aktivitas penghambatan yang tinggi dari fraksi 2 dan fraksi 4 diduga karena kedua fraksi ini memiliki kandungan senyawa minor (<5%) asam benzoat,2-hidroksi-,metil ester; αkubeben; 3-alil-6-metoksifenil asetat dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen dengan kandungan yang lebih tinggi daripada fraksi 1 dan 3 (tabel 1.) Penentuan MIC menggunakan metode mikrodilusi (Maan dan Markham, 1998; Taguri et al., 2006). Yaitu metode seri pengenceran dengan penurunan kadar secara bertahap. Nilai MIC merupakan nilai terendah suatu senyawa, dalam hal ini senyawa fraksi minyak atsiri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri setelah inkubasi 24 jam (Chamber, 2007). Pada bakteri B. subtilis dan S. epidermidis, hasil MIC masing – masing fraksi tidak ada perbedaan secara bermakna. Hasil pengujian mikrodilusi didapatkan nilai MIC Fraksi 1 – 4 minyak atsiri sirih pada B. subtilis adalah > 17.5% (v/v),
terhadap S. epidermidis adalah 0.25% (v/v), terhadap S. mutan adalah 2.5% (F1), 1% (F2 dan F3), 0.25% (F4) beturut-turut. Walaupun S. mutan adalah bakteri yang paling senstitif pada saat pengujian secara difusi, tetapi aktivitasnya terhadap fraksi minyak atsiri kurang begitu peka dibandingkan dengan S. epidermidis pada metode mikrodillusi. Dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fraksi minyak atsiri sirih tidak bersifat broad sprectrum terhadap aktivitas ketiga bakteri uji tersebut. Bakteri S. epidermidis lebih peka terhadap semua fraksi minyak atsiri sirih dibandingkan bakteri S. mutan dan B. s subtilis. Sedangkan untuk fraksi minyak atsiri yang paling aktif dalam menghambat pertumbuhan bakteri S.mutan adalah fraksi 4 (jam ke-6). Kemungkinan ini dikarenakan adanya kontribusi komponen yang aktif pada F4 yaitu senyawa asam benzoat,2-hidroksi-,metil ester; α-kubeben; 3-alil-6metoksifenil asetat; dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen. Kemampuan suatu antibakteri juga sangat erat kaitannya dengan perbedaan jumlah dan intensitas komponen penyusun senyawa kimia mayor dan minor setiap fraksi minyak atsiri sirih serta perbedaan komposisi dinding sel bakteri. Walaupun B.Subtilis termasuk bakteri gram positif, akan tetapi bakteri ini dapat melindungi dirinya dari molekul fraksi minyak atsiri dengan cara pembentukan spora (Scocibusik et al., 2006, Brooks et al., 2005). Sehingga pada saat diplating, bakteri ini kembali bergerminasi dengan kemampuan bertahan diri membentuk spora. Jadi, untuk menembus pertahanan spora, maka dibutuhkan lebih banyak lagi molekul fraksi minyak atsiri daun sirih. Sehingga nilai MIC nya jauh lebih tinggi dari S. epidermidis dan S. mutan.
Aktivitas antibakteri pada fraksi minyak atsiri sirih diduga disebabkan adanya kontribusi dari senyawa – senyawa dengan gugus alkoholik dan senyawa fenolik alami yang di kandungnya. Fraksi minyak atsiri daun sirih mengandung senyawa alkoholik ( pacouli alkohol ) dan senyawa fenolik (kavibetol,
4-alil-1,2-diasetoksibenzen,
asetat). Menurut
fenol,2-metoksi-4-1(1-propfenil)-
Hertiani et al (2002) dalam daun sirih ditemukan adanya
senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antimikroba dalam minyak atsiri adalah isoeugeunol dan
kariofilen. Dalam daun sirih juga mengandung
hidroksikavikol, asam stearat dan palmitat yang mempunyai aktivitas sebagai antimikroba (Nalina dan Rahim, 2006). Rahmat, et al (2000)
menduga
senyawa yang berperan sebagai antibakteri dalam minyak atsiri daun sirih adalah isoeugenol dan p-allifen . Senyawa fenolik dapat berfungsi sebagai antimikroba karena adanya gugus OH yang bersifat racun terhadap mikroba dan semakin banyak gugus OH yang ada pada senyawa tersebut maka senyawa tersebut semakin beracun bagi mikroba (Cowan, 1999). Perubahan atau kerusakan pada sel bakteri oleh senyawa bakteri umumnya dapat di amati dalam bentuk kebocoran sel. Kerusakan sel bakteri merupakan hasil interaksi senyawa antibakteri dengan bagian sel tertentu. Interaksi senyawa antibakteri tersebut dapat menyebabkan sejumlah perubahan atau kerusakan pada sel bakteri yang berpengaruh pada mekanisme inaktivasi bakteri. Pada dosis yang tidak mematikan, bakteri mengalami luka (injury), terjadi sejumlah perubahan dan kerusakan struktur sel bakteri yang akhirnya dapat mempengaruhi fungsi metabolisme sel, sedangkan pada kerusakan yang parah dapat menyebabkan kematian sel.
Pemberian fraksi 1 minyak atsiri daun sirih pada sel S. epidermidis dengan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC dapat mengakibatkan terjadinya kebocoran sel dan perubahan ukuran sel. Kebocoran sel dapat diamati dari tingkat kerusakan dinding sel dan membran sel. Derajat tingkat kerusakan dinding sel dapat diukur dari jumlah ion Ca2+ dan ion K+ yang terdapat pada dinding sel, sedagkan tingkat kerusakan membran dapat di ukur dari bahan – bahan yang dilepaskan oleh sel yang dapat diserap pada panjang gelombang 260 nm untuk asam nukleat dan 280 nm untuk protein dengan menggunakan spektofotometer
UV-Vis
(Carson
et
al.,
2002).
Menurut
Burt
(2004) yang dikutip oleh Miksusanti (2009), Asam nukleat yang terdeteksi pada panjang gelombang
260 nm adalah RNA dan turunan RNA yaitu
nukleotida (purin, pirimidin dan ribonukleotida), sedangkan senyawa protein yang terdeteksi adalah
tirosin dan triptofan. Meningkatnya jumlah
kandungan sel yang ditemukan pada permukaan sel menandakan terjadinya kerusakan membran sel atau perubahan permeabilitas Dari gambar 3 dapat diketahui bahwa pemberian konsentrasi fraksi 1 minyak atsiri daun sirih terhadap sel bakteri S. epidermidis
dengan
konsentrasi 1 MIC dan 2 MIC memberikan perbedaan pada peningkatan nilai absorbansi di panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi untuk sel kontrol S.epidermidis pada panjang gelombang 260 nm adalah 0.423. Pada konsentrasi 1 MIC
absorbansinya mengalami peningkatan
menjadi 1.539 dan pada konsentrasi 2 MIC terjadi peningkatan absorbansi sekitar 2 kali yaitu 2.498. Pada panjang gelombang 280 nm, absorbansi untuk sel normal, perlakuan 1 MIC dan 2 MIC juga mengalami peningkatan dari
0.437 menjadi 1.680 dan
3.010 secara berurutan. Dari hasil tersebut
menunjukkan bahwa peningkatan absorbansi protein
pada panjang
gelombnag 280 nm lebih tinggi daripada absorbansi untuk asam nukleat di panjang gelombang 260 nm. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi dosis MIC yang diberikan, maka kebocoran metabolit seluler baik protein maupun asam nukleat semakin meningkat. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Suliantari (2009) bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun sirih yang diberikan terhadap bakteri gram positif (S. aureus, B. cereus dan L. monocytogenes) maka kebocoran asam nukleat dan protein dari sel bakteri yang terjadi semakin tinggi pula. Kandungan ion-ion logam yang berada dalam sel bakteri S. epidermidis seperti Ca2+ dan K+ akan mengalami perubahan jika diberikan senyawa antibakteri. Pemberian 1 MIC dan 2 MIC fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih menyebabkan perubahan kandungan ion-ion Ca2+ dan K+ pada sel medium tumbuh. Pada gambar 3 didapatkan bahwa nilai yang didapat untuk ion Ca2+ untuk kontrol dan pemberian fraksi jam ke-1 minyak atsiri 1 MIC, dan 2 MIC berturut-turut adalah 0.08 ppm, 36 ppm, dan 45 ppm. Sedangkan untuk nilai ion K+ berturut-turut adalah 64 ppm; 80 ppm; 95 ppm. Dari hasil ini didapatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi yang diberikan maka semakin tinggi pula kerusakan membran sel yang terjadi. Indikasi adanya kerusakan membran sitoplasma adalah terjadinya kebocoran kandungan ionion Ca2+ dan K+ merupakan tanda kerusakan permeabilitas membran (Cox et.al., 2001). Menurut Brooks et al 2005 Kekuatan struktur pada membran ini
disebabkan oleh adanya ikatan hidrogen, hidrofobik dan kation Mg2+ dan Ca2+ bersama fosfolipida. Seperti yang terjadi pada kebocoran sel, makin tinggi konsentrasi MIC fraksi jam ke-1 (F1) minyak atsiri daun sirih yang digunakan, maka morfologi sel bakteri juga semakin mengalami perubahan dibandingkan sel normal. Kerusakan morfologi sel bakteri diamati dengan menggunakan SEM (Fathillah et al., 2009 ). Pada S. epidermidis perbesaran 10.000 kali menunjukkan dalam keadaan normal berbentuk bulat dengan permukaan yang licin seperti yang terlihat pada gambar 4.a. Dengan adanya perlakuan pemberian F1 minyak atsiri daun sirih 1 MIC, terjadi perubahan morfologi pada membran sel nya yaitu sel menjadi berlubang dengan permukaan yang masih rata (gambar 4.b). Sedangkan perlakuan pada konsentrasi 2 MIC, sel berlubang dan permukaannya menjadi mengkerut dan kasar (gambar 4.c). Dari hasil penelitian ini terlihat bahwa pada perlakuan konsentrasi 1 MIC F1 minyak atsiri daun sirih, belum menyebabkan sel bakteri rusak berat dibandingkan dengan perlakuan 2 MIC. Walaupun terjadi kerusakan struktur sel dan sel kehilangan isinya (ion Ca2+ dan K+), namun keseluruhan bentuk sel masih dapat diamati.
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan 1. Fraksi minyak atsiri daun sirih yang berasal dari Balitro, Cimanggu. Bogor memiliki presentase kadar yang dihasilkan secara berurutan untuk fraksi 1,2,3 dan 4 sebesar 0,061%; 0,034%; 0,027% dan 0,015%. dan memiliki komponen kimia
sebanyak 64 senyawa (F1), 56 senyawa (F2), 73
senyawa (F3) dan 56 senyawa (F4). Sebanyak 4 senyawa kimia sebagai penyusun komponen mayor (>5%) F1, dan 5 senyawa kimia sebagai komponen penyusun untuk F2, F3 dan F4. Komponen senyawa utama yang paling tertinggi pada F1, F2, dan F4 adalah 4-alil-1,2diasetoksibenzen (27,35%; 14,53% dan 14,64%), sedangkan pada F3 adalah Pacouli alkohol (12,62%) 2. Fraksi Minyak atsiri daun sirih memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri S. mutan, S. epidermidis, dan B. subtilis. Nilai MIC yang diperoleh dari setiap fraksi minyak atsiri terhadap S. epidermidis adalah 0,25 % (v/v). B. subtilis >17,5% (v/v)., sedangkan S. mutan F1 sebesar 2,5% (v/v) , F2 dan F3 sebesar 1% (v/v)., dan F4 sebesar 0,25% (v/v). 3. Mekanisme penghambatan antibakteri fraksi 1 minyak atsiri daun sirih terhadap
S. epidermidis adalah merusak membran sel bakteri, yang
ditandai dengan terjadinya peningkatan pelepasan senyawa metabolit seluler seperti asam amino, protein, dan ion logam Ca2+ dan K+.
6.2. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut secara invivo untuk mengetahui efektifitas dan toksisitasnya. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap bakteri patogen lain untuk mengetahui aktivitas antibakterinya.
DAFTAR PUSTAKA
Agusta, A. 2000. Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika Indonesia. Penerbit ITB. Bandung. AlFarisi, S . 2009. Uji Mekanisme Penghambatan Antibakteri Minyak Atsiri Daun Sirih (Piper Bettle Linn; Piperaceae ) Terhadap Staphylococcus Epidermidis. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Jakarta. Bilbiana,L., dan Hastowo,S. 1992. Mikrobiologi. Jakarta : Rajalawi Pers. Brooks, G.F., Butel, J.S., dan Morse, S.A., 2005. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Mikrobiologi Kedokteran (Medical Microbiology). diterjemahkan oleh Eddy M, Kuntaman, Eddy BW, Ni Made M, Setio H, dan Lindawati A. Edisi 1. Jilid 1. Salemba Medika. Jakarta. Carson, C.F., Brian, J.M., Riley, T.V., 2002. Mechanism of Action of Melaleuca alternifolia (Tea Tree) Oil on Staphylococcus aureus Determined by Time Kill, Lyses, Leakage, and Salt Tolerance Assays and Electron Microscopy. Antimicrobial Agent and Chemotherapy 6 : 1914-1920. Chambers, HF. 2007. Goodman dan Gilman Dasar Farmakologi Terapi, diterjemahkan oleh Cucu ., Ella, E., Winny, RS., Amalia, H., July, M. Edisi 10. Jilid 2. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Cowan, M.M. 1999. Plant product asd antimicrobial agents. J. Microbiology Reviews 612 (4) : 564 – 582. Cox, S.D., Mann, C.M., Markham, J.L., Bell, H.C., Gustafson, J.E., Warmington, J.R. and Wyllie, S.G.. 2000. The Mode of Antibacterial Action of The Essential Oil of Melaleuca Alternifolia (Tea Tree Oil). J of Applied Microbiology 88 : 170-175. Didik, G., dan Mulyani, S. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid I. Penebar Swadaya. Jakarta Fathillah, A.R., Yusoff M, Rahim ZHA. The Effect of Psidium guajava and Piper betle extracts on the Morphology of Dental Plaque Bacteria. Pak J Med Sci 2009;25(6):928-933. Harapani, M., Agusta, A., dan Rahayu,DC. 1996. Komponen kimia minyak atsiri dari dua macam sirih (daun kuning dan hijau). Prosiding Symposium Tanaman Obat Dan Aromatic. Puslitbang biologi-LIPI. Bogor. 58-63. Hermawan, A. 2007 . Pengaruh ekstrak daun sirih (piper betle l.) terhadap pertumbuhan staphylococcus aureus dan escherichia coli Dengan metode difusi disk. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan UAIR.
Hertiani,T., dan Purwantini, A.2002. Hasil distilasi ekstrak etanol daun sirih (Piper betle L) dari beberapa daerah di Yogyakarta dan aktivitas antijamur terhadap Candida albicans.Majalah Farmasi Indonesia 13 (4) : 193-199. Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A. 1995. Medical Microbiology, Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20. Alih Bahasa: Edi Nugroho dan RF Maulany. EGC, Jakarta Mann, C.M dan Markham, J.L. 1998. A new method for determining the minimum inhibitory concentration of essential oils. Journal of Applied Microbiology 84. 538-544. Miksusanti. 2009. Aktivitas dan mekanisme minyak atsiri Temu Kunci (Kaempheria pandurata Roxb) serta inkoporasinya dalam pati sagu sebagai film edibel antibakteri. Disertasi. IPB Nalina, T., and Rahim, Z.H.A. 2007. The Crude Aqueos Extract of Piper betle L. and its Antibacterial Effect Toward Streptococcus mutans. American Journal of Biotechnology and Biochemistry 3(1). 2007. 10-15. Novalny, D. 2006. Pengaruh ukuran rajangan daun dan lama penyulingan terhadap rendemen dan karakteristik minyak sirih (Piper betle Linn.). Skripsi. IPB Parwata, I.O.A.M., Rita, WS., Yoga, R. 2009. Isolasi dan uji antiradikal bebas minyak atsiri pada Daun sirih (Piper betle Linn.) secara spektroskopi ultra violet-tampak. Jurnal kimia 3 (1), Januari 2009 : 7-13 Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga Pelczar, M.J., dan E.C.S, Chan. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 1. UI Press. Jakarta. Pudjiastuti, 1996. Tinjauan Hasil Penelitian Tanaman Obat di Berbagai Instituti. Jilid 111. Departemen Kesehatan. Jakarta.. Rachmat, M., Hartati, M.S., dan Wahyuono, S., 2000. Aktivitas Antibakteri dan Sediaan Obat Kumur Beriisi Minyak Atsiri daun Sirih (Piper betle Linn.) dan Analisis komposisi Minyak Atsirinya. Majalah Farmasi Indonesia Vol.II, N0.4, 2000 , 235-240. Rodriguez-Tudela J.L., Barchiesi, F., Bille, J., Chryssanthou, E., Cuence, M., Denning, D., Donelly, J.P., Dupont, B., Fegeler, W., Moore, C., Richardson, M., Verwiej, P.E. 2002. Method for The Determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by Broth Dilution of Fermentative Yeasts. EUCAST. E.Dis 7.1 Sastroamidjojo S., 1997. Obat Asli Indonesia. Dian Rakyat. Jakarta.
Setiabudi, R.,dan Gan, V.H.S.1995. Farmakologi dan Terapi, Edisi 4. bagian Farmakologi FKUI. Jakarta. 571-583 Skocibusic,M., Bezic, N., Dunkic, A. 2006. Phytochemicals composition and antimicrobial activities of essential oils from satureja subspicata vis growing in Croatia. Food Chem 96: 20 – 28. Sudarsono., Pudjoarinto A., Gunawan D., Wahyuono S., Donatus IA., Dradjad., Wibowo S., dan Ngatidjan. 1996. Tumbuhan Obat. PPOT UGM. Yogyakarta. Suliantari. 2009. Aktivitas antibakteri dan mekanisme penghambatan ekstrak sirih hijau (Piper betle Linn) terhadap bakteri patogen pangan. Disertasi.IPB Sulianti, SB., dan Chairul. 2002. Perbandingan komponen kimia penyusun minyak atsiri sirih liar (piper ornatum) yang berasal dari Sulawesi Selatan dan pulau Seram dengan sirih biasa (Piper betle). Berita biologi Vol:3, No.3, 2002. Sumarnie., Priyono., Praptiwi . Identifikasi senyawa kimia dan aktivitas Antibakteri ekstrak piper sp. Asal papua. Bidang Botani. Puslit.Biologi-LIPI CSC Cibinong Jabar. Jurnal teknologi lingkungan Vol : 10, No.3, 2009 : 271 – 276 Suppakul, P., Sanla-Ead, N., Phoopuritham, P. 2006. Antimicrobial and Antioxidant Activities of Betel Oil. Kasetsart J. (Nat. Sci) 40 (Suppl. 2006 : 91-100. Syahrurachman, Agus, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Binarupa Aksara. Jakarta. Taguri, T., Tanaka, T., dan Kounol. 2006. Antibacterial spectrum of plant polyphenol and exracts depending upon hydroxyphenyl structure. Biology pharmacy bull 29 (11) : 2226 – 2235 Tengah, I. G. P., 2005, Studi tentang: Inventaris, Determinasi, dan Cara PenggunaanTanaman Obat pada “Lontar Usada” diBali, Departemen Kesehatan RI. Jakarta. Warsa, U.C., Karsinah., Lucky H.M., Suharto., dan Aidilfiet C. 1993. Buku ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta. 18-22, 47-48, 103-112. Y, Jamal., dan Agusta, A. 2001. Komponen kimia minyak atsiri tiga piperaceae. Laporan teknik,proyek inventarisasi dan karakterisasi sumberdaya hayati.194-201
LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil determinasi daun sirih (Piper betle Linn.)
Lampiran 2. Skema Kerja 2.1. Isolasi dan penentuan komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih
Daun sirih segar ditimbang ± 30 kg
Disortasi dan dirajang
Didistilasi uap dan air selama 6 jam
Penampungan distilat pada jam ke-1, ke-2, ke-4 dan ke-6
Diperoleh distilat
Ditambahkan NaSO4 anhidrat
Diperoleh fraksi minyak atsiri
Identifikasi komponen kimia fraksi minyak atsiri dengan GCMS
Dihitung presentase kadarnya
Lampiran 2. Lanjutan 2.2 . Pembuatan Stok dan Suspensi Bakteri Uji
Bakteri uji
Dibiakkan pada media agar miring
Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam
Diambil 1 ose bakteri dan disuspensikan ke dalam 5 ml MHB
Diinkubasi shaker selama 18 jam
Diperoleh suspensi bakteri
Lampiran 2. Lanjutan 2.3. Penentuan Diameter Daerah Hambat Bakteri
Media MHA cair
Dituang kedalam cawan petri dan dibiarkan memadat
Diinolukasikan dengan 0,1 ml suspensi bakteri
Diletakkan kertas cakram berdiameter 6 mm yang telah ditetesi 10 µl larutan uji dan dibiarkan mengering sebelum diletakkan diatas media
Diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam
Diukur daerah bening yang terbentuk disekitar cakram
Lampiran 2. Lanjutan 2.4. Pengenceran suspensi bakteri (Pengenceran 3 kali) Suspensi bakteri yang telah diinkubasi shaker 18 jam
1 ml Suspensi bakteri + 9 ml aquadest
101
1 ml Suspensi bakteri + 9 ml aquadest
102
1 ml Suspensi bakteri + 9 ml aquadest
103
Diambil 0,1 ml lalu diplating dalam cawan petri yang berisi Na
Diinkubasi selama 24 jam
Dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh
Misalkan didapat 30 koloni maka 30x10x103 = 3x105 sel bakteri/ml, pengenceran dilakukan hingga jumlah bakteri 105
Lampiran 2. Lanjutan 2.5. Penentuan MIC
Media MHB dalam microplate
Kontrol
Penentuan MIC
Ditambah suspensi bakteri
Media
Media+Inokulum
Ditambah larutan uji
Diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam
Diplating ke agar pada cawan petri dan diinkubasi selama 24 jam
Diamati pertumbuhan yang terjadi
Diperoleh nilai MIC
Media+pelarut
Media+Inokulum +Pelarut
Lampiran 2. Lanjutan 2.6. Analisis Kebocoran Protein, Asam Nukleat dan Ion Logam
10 ml Suspensi bakteri
Disentrifus 3500 rpm selama 15 menit
Pelet dicuci 2 kali dengan dapar fosfat
Disuspensikan dalam dapar fosfat sampai volume 10 ml
Diinkubasi shaker suhu 37 ºC selama 24 jam
Disentrifus 3500 rpm selama 15 menit
Disaring dan cairan supernatan diambil
Diukur kadar ion K+dan Ca++ dengan AAS
Diukur absorban λ 260 nm dan 280 nm dengan spektro UV-Vis
Lampiran 2. Lanjutan 2.7. Analisis perubahan morfologi sel Pelet bakteri dari analisis sebelumnya direndam dalam glutaraldehid 2,5% selama 4 jam dan disentrifus
Pelet direndam dengan tannin acid (2% dlm cacodylate buffer) selama 12 jam dan disentrifus. Direndam dengan cacodylate buffer selama 10 menit dan disentrifus
Pelet direndam dlm larutan osmium tetraoksida 1% selama 1 jam
Pelet dicuci dgn alkohol 50%, dibiarkan 10 menit dan disentrifus
Dicuci dengan alkohol 50%, 70%, 80% dan 95%, masing-masing selama 10 menit, disentrifus dan dicuci dgn alkohol absolut 2 kali dan terbutanol 2 kali
Endapan sel ditambah sedikit terbutanol, dioleskan pada slip gelas dan dikeringkan. Kemudian diletakkan diatas stub aluminium
Dimasukkan kedalam ion coater untuk dilapisi dengan emas dalam kondisi vakum dan diamati dengan SEM
Lampiran 3. Hasil uji sensitivitas minyak atsiri daun sirih terhadap ketiga jenis bakteri uji gram positif No
Bakteri uji
1
Bacillus subtilis
2
Staphylococcus epidermidis
3
Streptococcus mutan
Hasil uji fraksi minyak atsiri daun sirih dengan metode difusi cakram
Ket : F1: Fraksi jam ke-1 F2: Fraksi jam ke-2 F3: Fraksi jam ke-4 F4: Fraksi jam ke-6 K : Kontrol metanol
Lampiran 4. Pertumbuhan bakteri uji terhadap fraksi minyak atsiri daun sirih dengan metode plating
No Bakteri uji 1
B.subtilis
2
2 S.epidermidis
3
3 S.mutan
Keterangan:
: Media : Media + Pelarut : Media + Inokulum : Media + Inokulum + Pelarut : Fraksi jam ke-1 (F1) : Fraksi jam ke-2 (F2) : Fraksi jam ke-4 (F3) : Fraksi jam ke-6 (F4)
Hasil MIC
Lampiran 5. Nilai absorbansi asam nukleat dan protein fraksi jam ke-1 pada sel S. epidermidis
Konsentrasi Kontrol 1MIC 2MIC
Nilai Absorban λ260 nm λ 280 nm 0.423 0.437 1.539 1.680 2.498 3.010
Lampiran 6. Hasil pengukuran konsentrasi ion logam Ca2+ dan K+ fraksi jam ke-1 pada supernatan biakan S.epidermidis konsentrasi 1 MIC dan 2 MIC
Keterangan: *: Nilai ion – ion logam Ca2+ dan K + bakteri S. epidermidis Fp :100 x, maka nilai ion – ion logam pada bakteri S. epidermidis adalah sebagai berikut : Nilai ion logam Konsentrasi Ca2+ K+ Kontrol 0.08 ppm 64 ppm 1 MIC 36 ppm 80 ppm 2 MIC 45 ppm 95 ppm
Lampiran 7. Perhitungan konsentrasi MIC bakteri uji B. subtilis
a. Konsentrasi larutan uji
: 17,5%; 15%; 12,5%; 10%; 7,5%; 5%; 2,5%
b. Larutan induk
: 17,5% X 5 = 87,5%
c. Volume sumuran mikroplate
: 250 µl
d. Volume yang di ambil untuk masing – masing konsentrasi :
Konsentrasi 17,5% 87,5% = 5 250 = 50 µl Lar. uji, 10 µl Media dan 100 µl inokulum 17,5% 5
Konsentrasi 15% 87,5% = 5,83 250 = 42,9 µl Lar. uji,107,1 µl Media dan 100 µl inokulum 15% 5,83
Konsentrasi 12,5% 87,5% = 7 250 = 35,7 µl Lar. uji, 117,3 µl Media dan 100 µl inokulum 12,5% 7
Konsentrasi 10% 87,5% = 8,75 250 = 28,6 µl Lar. uji, 121,4 µl Media dan 100 µl inokulum 10% 8,75
Konsentrasi 7,5% 87,5% = 11,67 250 = 21,4 µl Lar. uji, 128,6 µl Media dan 100 µl inokulum 7,5% 11,67
Konsentrasi 5% 87,5% = 17,5 5%
250 = 14,3 µl Lar. uji, 135,7 µl Media dan 100 µl inokulum 17,5
Konsentrasi 2,5% 87,5% = 35 250 = 7,1 µl Lar. uji, 142,9 µl Media dan 100 µl inokulum 2,5% 35
Lampiran 8. Perhitungan konsentrasi MIC bakteri uji S. epidermidis dan S. mutan
a. Konsentrasi larutan uji
: 5%; 2,5%; 1%; 0,5%; 0,25%; 0,125%
b. Larutan induk
: 5% X 5 = 25%
c. Volume sumuran mikroplate
: 250 µl
d. Volume yang di ambil untuk masing – masing konsentrasi :
Konsentrasi 5% 25% = 5 5%
250 = 50 µl Lar. uji, 10 µl Media dan 100 µl inokulum 5
Konsentrasi 2,5% 25% = 10 250 = 25 µl Lar. uji,125 µl Media dan 100 µl inokulum 2,5% 10
Konsentrasi 1% 25% = 25 1%
250 = 10 µl Lar. uji, 140 µl Media dan 100 µl inokulum 25
Konsentrasi 0,5% 25% = 50 0,5%
250 = 5 µl Lar. uji, 145 µl Media dan 100 µl inokulum 50
Konsentrasi 0,25% 25% = 100 250 = 2,5 µl Lar. uji, 147,5 µl Media dan 100 µl inokulum 0,25% 100
Konsentrasi 0,125% 25% = 200 250 = 1,3 µl Lar. uji, 148,7 µl Media dan 100 µl inokulum 0,125% 200
