Vztah mutace genu TP53 a přežití pacientů s chronickou lymfocytární leukémií

ROČNÍK

3

Journal

•

ČÍSLO

of

2

•

11.

b ř ezna

2011

Clinical Oncology

P Ů V O D N Í

S D Ě L E N Í

Vztah mutace genu TP53 a přežití pacientů s chronickou lymfocytární leukémií Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Raymonde Busch, Tina Denzel, Sonja Häbe, Dirk Winkler, Andreas Bühler, Jennifer Edelmann, Manuela Bergmann, Georg Hopfinger, Manfred Hensel, Michael Hallek, Hartmut Döhner a Stephan Stilgenbauer Viz související článek na str. 64 University of Ulm, Ulm; University of Cologne, Cologne; Technical University of Munich; Ludwig‑Maximilians‑University, Munich; University of Heidelberg, Heidelberg, Germany; Hanusch Hospital, Vienna, Austria. Podáno 23. prosince 2009;   přijato 28. května 2010; publikováno online před tiskem na www.jco.org   9. srpna 2010. Psáno pro German Chronic Lymphocytic Leukemia Study Group. Podpořeno German José Carreras Leukemia Foundation (Grant No. R06/28v), Deutsche Krebshilfe (Grants No. 108355, 105142 a 70‑2353), Global CLL Research Foundation, Competence Network Lymphoma Bundesministerium für Bildung und Forschung, Cologne, a Medac Schering Onkologie, Munich. Prohlášení autorů o možném střetu zájmů a podíl jednotlivých autorů na přípravě článku se nacházejí na jeho konci. Odkaz na databázi klinických studií je dostupný na JCO.org. Adresa pro korespondenci: Stephan Stilgenbauer, MD, Department of Internal Medicine III, University of Ulm, Albert‑Einstein‑Allee 23, 89081 Ulm, Germany; e‑mail: stephan.stilgenbauer@uniklinik‑ulm.de.

S

U

H

R

N

Cíl Přesný prognostický význam mutace genu TP53 je stále nejasný, stejně tak jako její začlenění do léčebných schémat pro chronickou lymfocytární leukémii (chronic lymphocytic leukemia, CLL). Rozhodli jsme se definovat význam mutace TP53 u CLL. Pacienti a metody Pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie (high‑performance liquid chromatography, HPLC) jsme hodnotili mutace TP53 (exony 2 až 11) u pacientů zařazených do prospektivní rando‑ mizované studie (n = 375), s dobou sledování 52,8 měsíce (German CLL Study Group CLL4 trial; fludarabin [F] vs. F + cyklofosfamid [FC]). Výsledky Nalezli jsme mutaci TP53 u 8,5 % pacientů (28 z 328 pacientů). Žádný pacient s mutací TP53 nedo‑ sáhl léčbou kompletní remise. Pacienti s mutací TP53 měli ve srovnání s pacienty bez mutace TP53 statisticky signifikantně zkrácenou (p < 0,001) dobu do progrese (progression‑free survival, PFS; 23,3 vs. 62,2 měsíce) i celkové přežití (overall survival, OS; 29,2 vs. 84,6 měsíce). Mutace TP53 byla nalezena v případě absence delece 17p u 4,5 % pacientů. PFS a OS byly obdobné u pacientů s delecí 17p i u pacientů s mutací TP53 bez delece 17p. Dle mnohorozměrné analýzy byla mutace TP53 nejsilnějším prognostickým faktorem ovlivňujícím PFS (poměr rizik [hazard ratio, HR] = 3,8; p < 0,001) a OS (HR = 7,2; p < 0,001). Ostatními nezávislými prediktory pro OS byly stav mutace IGHV (HR = 1,9), delece 11q (HR = 7,2), delece 17p (HR = 2,3) a léčba kombinací FC (HR = 0,6). Závěr Pacienti s CLL s mutací TP53, nezávisle na přítomnosti delece 17p, mají špatnou prognózu, pokud jsou léčeni chemoterapií založenou na  fludarabinu. Proto by měla být zahrnuta analýza mutace TP53 do celkového zhodnocení před zahájením léčby pacientů s CLL. U pacientů s mutací TP53 byly měly být zvažovány jiné možnosti léčby. J Clin Oncol 28:4473‑4479. © 2010 by American Society of Clinical Oncology

© 2010 by American Society of Clinical Oncology

ÚVOD

0732-183X/10/2829-4473/$20.00 DOI: 10.1200/JCO.2009.27.8762

O

Molekulární prognostické markery jako nemu‑ tovaný gen IGHV, exprese ZAP70, delece 11q a především delece 17p se zdají být důležitější pro výsledek léčby pacientů s chronickou lymfo­ cytární leukémií (chronic lymphocytic leuke‑ mia, CLL) než vlastní volba iniciální léčby.1‑7 Na základě genomických aberací byl ustanoven hierarchický prognostický model a byl potvrzen v prospektivních studiích.2,6,8,9 Opakovaně se pro‑ kázalo, že delece 17p predikuje špatnou odpověď na chemoterapii a je spojena s nejkratším celko‑ vým přežitím (overall survival, OS).1,3,6,10 Rezi‑ stence na léčbu CLL s delecí 17p byla přisouzena faktu, že zbývající alela TP53 na úseku 17p13 je mutovaná.1,10,11 Ačkoli je většina současných léčeb‑

Journal of Clinical Oncology, Vol 28, No 29 (October 10), 2010: pp 4473–4479

ných protokolů postavena na účinku konvenč‑ ních cytostatik, toto poslední zjištění je z praktic‑ kého hlediska velmi zajímavé, protože začínají být dostupné nové látky, které mohou účinkovat nezá‑ visle na poškození DNA a/nebo p53.12,13 Současné studie začínají vyhodnocovat léčbu (specifickou pro genotyp) u pacientů s delecí 17p. Nicméně tato podskupina představuje pouze 5–7 % všech pacientů před zahájením chemoterapie první linie. Počet pacientů, jejichž nemoc neodpovídá na režimy založené na fludarabinu, je ale výrazně vyšší a delece 17p vysvětluje pouze část těchto rezistencí na fludarabin.14,15 Proto je potřeba hle‑ dat další markery pro špatnou prognózu a pro selhání standardní léčby. Prognostický vliv mutace TP53 u CLL byl již mnohokrát naznačen.1,10,16‑20 Bohužel nedosta‑ © 2010 by American Society of Clinical Oncology  57

Zenz et al.

tek podrobných genetických analýz, malé skupiny vzorků a hete‑ rogenita jednotlivých kohort komplikovaly přesné definování role mutace TP53 ve vztahu k deleci 17p. Ve většině studií byla zjištěna mutace TP53 při absenci delece 17p (prostá mutace TP53) u zhruba 5 % pacientů. S ohledem na jiné známé prognostické faktory jsou zapotřebí velké prospektivní studie, aby byl potvrzen prognostický vliv mutace TP53.10,11,21 Doposud jediná prospektivní studie plně publikovaná, která byla zaměřena na prognostický význam mutace TP53 a deleci 17p, byla US Eastern Cooperative Oncology Group 2997 trial. V ní nebyl prokázán prognostický význam mutace TP53. Nicméně nepotvrzené mutace a polymorfismy v zárodečných lini‑ ích byly spojeny se skutečnými mutacemi ve stejné skupině, což výrazně ztěžuje interpretaci.6 Ve  snaze zhodnotit prognostický význam mutace TP53 ve vztahu k deleci 17p jsme analyzovali velkou CLL studiovou popu‑ laci (German CLL Study Group CLL4 trial; randomizace fludarabin [F] vs. F + cyklofosfamid [FC] v první linii léčby).22 Naše poznatky pevně ustanovují mutaci TP53 jako ústřední prognostický faktor u CLL, který je nezávislý na deleci 17p. Stanovení mutace TP53 by mělo být začleněno do prognostických modelů pro CLL, aby sku‑ pině pacientů s primárně špatnou prognózou léčených konvenční chemoterapií mohla být nabídnuta léčba specifická pro určitý geno‑ typ nemoci. PACIENTI A METODY Pacienti, materiál, metody Do studie CLL4 byli zařazeni pacienti s CLL, kteří vyžadovali léčbu. Podrobnosti týkající se vedené studie byly již dříve publikovány.22 Dia‑ gnostika, požadavky na léčbu a vyhodnocování léčebných odpovědí bylo založeno na  doporučeních pracovní skupiny, která se opírala o  dopo‑ ručení National Cancer Institute (NCI).23 Pacienti byli zařazeni do stu‑ die v případě, že měli nemoc ve stadiu Binet C, anebo A či B, a to jen v případě, že nemoc rychle progredovala, nebo se zhoršovaly symptomy podmíněné zvětšením lymfatických orgánů, nebo pacienti měli závažné symptomy B (pozn. překl.: standardní důvody pro zahájení léčby CLL). Léčba ve studii byla umožněna všem nepředléčeným pacientům s CLL ve  věku 18–65 let. Léčebný protokol byl schválen revizní radou mni‑ chovské univerzity. Před vstupem do studie všichni pacienti podepsali informovaný souhlas. Randomizace a léčebné schéma Studie byla zahájena v červenci 1999 a nábor byl dokončen v červenci 2003. Dohromady bylo zařazeno 375 pacientů. Celkem 13 pacientů nespl‑ nilo vstupní či vylučovací kritéria, a proto byli vyřazeni z analýzy. Podle ramena randomizace dostávali pacienti buď fludarabin (F 25 mg/m2) apli‑ kovaný intravenózně 5 dní, nebo fludarabin a cyklofosfamid (F 30 mg/m2; FC 250 mg/m2) aplikované intravenózně po dobu 3 dnů. Oba režimy byly opakovány v intervalu 28 dní, v maximálním počtu šesti sérií. Genetická analýza Analýza pomocí fluorescenční hybridizace in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH) a sekvenování IGHV byly prováděny stejně, jako bylo již v minulosti publikováno.2,24 Shoda zárodečných linií 98 % byla určena jako cut‑off (hraniční bod) mezi IGHV‑mutovanými a IGHV‑nemu‑ tovanými vzorky. Genomická nerovnováha a chromosomální disomie (pozn. překl.: zdvojení stejného chromosomu) byly analyzovány ve sku‑ pině 13 vzorků s  prostou mutací TP53, a  to pomocí Affymetrix 500k SNP array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Data byla analyzována pomocí Copy Number Analyzer for GeneChip (Cancer Genomics Project, http://www.genome.umin.jp/).

58  © 2010 by American Society of Clinical Oncology

TP53 denaturing High‑Performance Liquid Chromatography a sekvenování Metoda vysokovýkonné kapalinové chromatografie (Denaturing High‑Performance Liquid Chromatography, DHPLC) byla užita k iden‑ tifikaci vzorků obsahující mutace v exonech 2 až 11 (kódující gen TP53; n = 328 s dostupnou DNA). DHPLC analýza je založena na teplotně závis‑ lých rozdílech retenčních časů v chromatografické koloně u produktů poly‑ merázové řetězové reakce (polymerase chain reaction, PCR), které jsou roz‑ dílné pro homoduplexní (wild‑type) a heteroduplexní (mutovanou) DNA. Pro detekování homozygotní mutace byl každý vzorek smíšen se známou wild‑type DNA kontrolou (20 %). Stejně tak byly přímo sekvenovány ty vzorky s delecí 17p, ve kterých nebyla mutace TP53. Všechny vzorky byly denaturovány a pomalu zchlazeny na pokojovou teplotu před provedením DHPLC, aby byla umožněna maximální heteroduplexní formace (95 °C 2 min, následně pokles o 1 °C každých 40 s do dosažení teploty 45 °C [30 min]). Oligonukleotidové primery stejně jako podmínky DHPLC byly zvoleny stejné, jaké byly již dříve publikovány (dostupné na vyžádání).10,25 Ukázalo se již dříve, že tato metoda je lepší než single strand conformation polymorphism a spolu s přímým sekvenováním je metodou volby v mnoha centrech, kde se provádějí analýzy mutace TP53.26,27 Všechny vzorky byly podrobeny automatickému fluorescenčnímu sek‑ venování pomocí Big Dye Terminator Kit a sekvenátoru ABI 3100 (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany). Sekvence primeru jsou dostupné na požádání. Primery byly navrženy tak, aby zahrnuly všechny kódující exony a hranice mezi introny a exony. Statistická analýza založená na  principu intent‑to‑treat zahrno‑ vala všechny zařazené pacienty s dostupnou DNA. Čas do události (time to event) byl odhadnutý pomocí Kaplanových‑Meierových diagramů a výsledky léčby byly porovnávány pomocí log‑rank testu. Celkové pře‑ žití bylo stanoveno jako doba od randomizace do úmrtí a doba do pro‑ grese (progression‑free survival, PFS) byla stanovena jako doba od rando‑ mizace do zjištění progrese nemoci nebo do úmrtí. Doba přežití bez léčby (treat­ment‑free survival) byla počítána jako čas od ukončení léčby do zahá‑ jení léčby druhé linie nebo do úmrtí. Odpovědi na léčbu byly stanovovány pro všechny pacienty, kteří absolvovali alespoň jednu sérii chemoterapie. Medián doby sledování přežívajících pacientů byl 52,8 měsíce. Statistická významnost byla stanovena hodnotou p < 0,05. Analýza byla provedena s použitím SPSS, verze 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Srovnání jednotlivých skupin podle klinických, laboratorních a genetických dat bylo provedeno pomocí Fisherova exaktního testu (skupinové parametry). Prognostické fak‑ tory pro OS a PFS byly analyzovány pomocí Coxových regresních modelů. Kromě mutace TP53 zahrnovaly modely věk, rameno léčby, stadium nemoci dle Bineta, genomické aberace a přítomnost/nepřítomnost mutace IGHV.

VÝSLEDKY

Incidence Celkově jsme nalezli mutaci TP53 u 8,5 % pacientů (28 z 328 pacientů). Čtrnáct z 16 pacientů s delecí 17p mělo mutaci TP53 (87,5 %). U  těch dvou pacientů s  delecí 17p, u  kterých nebyla nalezena mutace TP53, bylo dle FISH malé zastoupení buněk 17p (19–21 %), což by mohlo být vysvětleno určitými limity této techniky. Nepřítomnost mutace u zmíněných dvou pacientů byla potvrzena i jinými metodami (přímé sekvenování a resekveno‑ vání [Amplichip, Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA]). Mutaci TP53 bez přítomnosti delece 17p jsme nalezli u  4,5 % pacientů (14 z 291 pacientů). U pacientů s prostou mutací TP53 jsme potvrdili nepřítomnost delece 17p pomocí metody single nucleotid polymorphism array (n = 13). Nicméně 3 ze 13 pacientů (23 %) měli disomii v oblasti 17p včetně lokusu pro TP53.

Journal of Clinical Oncology

Mutace genu TP53 a přežití u chronické lymfocytární leukémie

Srovnání genomického profilu CLL s mutací či bez mutace TP53 ukazuje tab. 1. I když nebyly signifikantní rozdíly u pacientů s mutací či bez mutace TP53 ve vztahu ke stavu genu IGHV byly i tak v obou skupinách genomické rozdíly. Ve skupině s mutací TP53 byla vyšší incidence delece 17p (p < 0,001) a nízká incidence trisomie 12. chromosomu (podle pořadí; 13,9 % vs. 0 %; p = 0,03). Pacienti s mutací TP53 byli starší, měli vyšší koncentraci laktátde‑ hydrogenázy a častěji měli lymfadenopatii (> 5 cm; tab. 1). Podle typu mutace TP53 jsme pozorovali 3 splice‑site mutace, tři delece, jednu inzerci a 24 missens mutací v exonech 5 až 8. Missens a posuvné (frameshift) mutace byly výhradně lokalizo‑ vány v DNA vazebné doméně. Tři pacienti měli dvě odlišné mutace (Dodatek). Jedenáct z 24 missense mutací byly tranzice, kdežto trans­verze byly u 13 z 24 mutací (Dodatek). Výsledky u pacientů s mutací TP53 Pro zhodnocení celkového vlivu mutace TP53 u CLL jsme nej‑ dříve hodnotili léčebnou odpověď, PFS a OS s ohledem na přítom‑ nost/chybění mutace TP53. Odpověď na léčbu byla signifikantně horší u pacientů, kteří měli mutaci TP53 nebo deleci 17p (tab. 2). Deset pacientů (40 %) z 25 s mutací TP53 nedosáhlo ani kompletní (complete response, CR) ani parciální remise (partial response, PR)

na rozdíl od 25 (8,9 %) z 282 pacientů bez mutace TP53 (p < 0,001). Nikdo z pacientů s mutací TP53 nedospěl do kompletní remise (0 z 25 pacientů), kdežto 39 (13,8 %) z 282 pacientů bez mutace kompletní remise dosáhlo (p = 0,055). Pacienti s CLL bez mutace TP53 (n = 281) měli PFS 62,2 měsíce, a to při mediánu sledování (follow-up) 52,8 měsíce. Naproti tomu pacienti s mutací TP53 (n = 26) měli PFS 23,3 měsíce (p < 0,001; obr. 1A). Medián OS byl u pacientů s mutací TP53 výrazně kratší (29,2 měsíce; n = 28) ve srovnání s pacienty bez mutace TP53 (84,6 měsíce; n = 300; p < 0,001; obr. 1B). Výsledky pacientů s mutací TP53 bez delece 17p Špatná prognóza pacientů s mutací TP53 by mohla být způ‑ sobena vysokou konkordancí s delecí 17p, která je spojena se špat‑ nou odpovědí na chemoterapii a krátkými PFS a OS. K posouzení, zda je samotná mutace TP53 prognosticky významná, byla sku‑ pina pacientů s mutací TP53 bez delece 17 p (prostá mutace TP53) hodnocena samostatně proti skupině pacientů s delecí 17p. V tab. 2 jsou léčebné remise výsledných tří skupin pacientů. Celková odpo‑ věď na léčbu (overall response rate, ORR) byla signifikantně lepší u pacientů bez prosté mutace TP53, nebo delece 17p (ORR: 91 % vs. 60 % pro 17p‑mutaci a 67 % pro prostou mutaci TP53; p < 0,001;

Tabulka 1.  Genetický profil a klinické charakteristiky pacientů s CLL stratifikovaných dle mutace TP53 Absence mutace TP53 Genetika a charakteristika Cytogenetika (FISH)

Počet pacientů

%

290

Přítomnost mutace TP53 Počet pacientů

%

p

27*

17p‑

2

0,7

14

51,9

< 0,001

11q‑

62

22,7

3

11,1

0,16

trisomie 12

38

13,9

0

0

0,03

normální

72

26,4

5

18,5

0,49

13q‑ prostá

99

36,3

5

18,5

0,09

Gen IGHV

294

27

nemutovaný

188

63,9

21

77,8

mutovaný

106

36,1

6

22,2

0,2

Klinické charakteristiky stadium dle Bineta A

26

8,9

2

7,1

B

166

56,8

15

53,6

C „B“ symptomy

100

34,2

11

39,3

0,85

119

41,5

14

50

0,43

203

72

23

82,1

79

28

pohlaví muž žena splenomegalie lymfadenopatie > 5 cm

0,25 5

17,8

240

83,6

24

85,7

1,0

49

18,7

9

37,5

0,036

počet leukocytů, medián, /μl

71,750

65,2

0,42

hemoglobin, medián, g/l

130

125,5

6,5

počet trombocytů, medián, /μl

145,0

136,0

0,11

medián LDH, U/l

219,5

282,5

0,034

věk, medián, roky

58

61

0,001

terapie fludarabin

153

51

11

39,3

fludarabin + cyklofosfamid

147

49

17

60,7

0,32

Zkratky: CLL (chronic lymphocytic leukemia), chronická lymfocytární leukémie; FISH (fluorescence in situ hybridization), fluorescenční hybridizace in situ;   LDH (lactate dehydrogenase), laktátdehydrogenáza. * Výsledky FISH byly dostupné u 27 z 28 pacientů. Absence delece 17p u pacienta s chybějícím výsledkem FISH byla potvrzena pomocí single nucleotide polymorphism array.

www.jco.org

© 2010 by American Society of Clinical Oncology  59

Zenz et al.

Tabulka 2.  Odpověď na léčbu u pacientů s CLL po první linii s F nebo FC podle genetiky Bez mutace TP53/bez 17p‑ (n = 261) Počet pacientů

%

Refrakterní

Odpověď

23

8,8

CR

37

14,2

Počet pacientů

6

Celkem (N = 288)

Mutace TP53/bez   17p‑ (n = 12)

17p‑ (n = 15) % 40

1

Počet pacientů

4

6,7

%

Počet pacientů

%

33

11,5

38

13,2

33,3

0

0

p

0,001 0,47

Zkratky: CLL (chronic lymphocytic leukemia), chronická lymfocytární leukémie; F (fludarabine), fludarabin; FC (fludarabine and cyclophosphamide), fludarabin a cyklofosfamid; CR (complete response), kompletní remise. * Dle kritérií National Cancer Institute (nedosažení parciální nebo kompletní remise alespoň na 6 měsíců).23

A

Část pacientůČást přežívajících pacientů přežívajících

B B

1,0

bez mutace TP53 (n = 281) mutace TP53 (n = 26)

0,9 0,8 0,7 1,0 0,6 0,9 0,5 0,8 0,4 0,7 0,3 0,6 0,2 0,5 0,1 0,4 0,30

bez mutace TP53 (n = 281) mutace TP53 (n = 26)

12

24

36

0,2 0,1 1,0 0 0,9

48

60

12

24

36

48

60

96

108

bez mutace TP53 (n = 300) mutace TP53 = 28) 108 72 84 (n 96

Čas (měsíce)

0,7 1,0 0,6 0,9 0,5 0,8 0,4 0,7 0,3 0,6 0,2 0,5 0,1 0,4

bez mutace TP53 (n = 300) mutace TP53 (n = 28)

12

24

36

0,2

48

60

72

84

96

108

Čas (měsíce)

0,1 0

84

Čas (měsíce)

0,8

0,30

72

12

24

36

48

60

A

B B

1,0 0,9 0,8 0,7 1,0 0,6 0,9 0,5 0,8 0,4 0,7 0,3 0,6 0,2 0,5 0,1 0,4 0,30

72

84

96

108

Obrázek 1.  Mutace TP53 je spojena se špatnými výsledky léčby chronické lymfocytární leukémie (chronic lymphocytic leukemia, CLL). (A) Při mediánu sledování (follow‑up) 52,8 měsíců měli pacienti s CLL bez mutace TP53 medián doby do progrese (progression free survival, PFS) 62,2 měsíců (n = 281; modrá křivka). Pacienti s CLL s mutací TP53 měli PFS 23,3 měsíců (n = 26; zlatá křivka; p < 0,001). (B) Celkové přežití pacientů s mutací TP53 bylo špatné, s mediánem 29,2 měsíců (n = 28; zlatá křivka) proti 84,6 měsícům u pacientů bez mutace TP53 (n = 300; modrá křivka; p < 0,001).

12

24

36

0,2 0,1 1,0 0 0,9

48

60

72

84

96

108

72

84

96

108

72

84

96

108

Čas (měsíce) 12

24

36

48

60

Čas (měsíce)

0,8 0,7 1,0 0,6 0,9 0,5 0,8 0,4 0,7 0,3 0,6 0,2 0,5 0,1 0,4 0,30 0,2 0,1

Čas (měsíce)

60  © 2010 by American Society of Clinical Oncology

A Část pacientůČást bez pacientů progrese bez progrese

Část pacientůČást bez pacientů progrese bez progrese

A

neměli žádnou z výše uvedených genetických abnormalit (61,8 měsíce; p < 0,001; obr. 2A). Negativní prognostický vliv prosté mutace TP53 nebo delece 17p byl ještě výraznější, pokud se mezi jednotlivými skupinami porovnávalo celkové přežití. Po dobu sle‑ dování nebylo u pacientů bez žádné z výše uvedených genetických abnormalit dosaženo mediánu OS. Medián OS byl 30,2 měsíce

Část pacientůČást přežívajících pacientů přežívajících

tab. 2). Nikdo z pacientů s prostou mutací TP53 nedospěl do kom‑ pletní remise, kdežto 6,7 % (n = 1) pacientů s delecí 17p (pozn překl.: bez mutace TP53) a 14,2 % pacientů bez mutace TP53 a bez delece 17p kompletní remise dosáhlo (p = 0,47). Tyto výsledky naznačují, že pacienti s prostou mutací TP53 mají obdobně špatnou prognózu jako pacienti s CLL s delecí 17p. Medián PFS byl také obdobný u pacientů s delecí 17p (19,2 měsíce) a u pacientů s prostou mutací TP53 (23,3 měsíce). Obě skupiny měly kratší PFS ve srovnání se zbývajícími pacienty, kteří

12

24

36

48

60

Čas (měsíce)

Obrázek 2.  Pacienti s  chronickou lymfocytární leukémií (chronic lymphocytic 12 TP53 24 bez36 4817p měli 60 podobné 72 84 96jako108 0 s mutací leukemia, CLL) delece výsledky pacienti s CLL s delecí 17p. (A) Doba do progrese (progression free survival, PFS) pacientů Čas (měsíce) s delecí 17p (n = 15; šedá křivka), pacientů s prostou mutací TP53 (bez delece 17p; n = 13; zlatá křivka) a zbývajících pacientů (n = 260; modrá křivka). Medián PFS byl signifikantně kratší u pacientů s delecí 17p (19,2 měsíců) a s prostou mutací TP53 (23,3 měsíců) ve  srovnání s  pacienty bez žádné z  uvedených abnormalit (61,8 měsíců; p < 0,001). (B) Celkové přežití (overall survival, OS) pacientů s delecí 17p (n = 16; šedá křivka), pacientů s prostou mutací TP53 (n = 14; zlatá křivka) a zbývajících pacientů (n = 277; modrá křivka). Medián OS byl signifikantně kratší u  pacientů s  delecí 17p (19,2 měsíců) a  s  prostou mutací TP53 (30,2 měsíců) ve  srovnání s  pacienty bez žádné z  uvedených abnormalit (medián OS nebyl dosažen; p < 0,001).

Journal of Clinical Oncology

Mutace genu TP53 a přežití u chronické lymfocytární leukémie

u pacientů s prostou mutací TP53 a 19,2 měsíce u pacientů s delecí 17p (p < 0,001, obr. 2B).

sledované parametry (PFS 23,3 měsíce pro F vs. 19,2 měsíce pro FC; OS 31,2 měsíce pro F vs. 29,2 měsíce pro FC; obr. 3A a 3B).

Mutace TP53 a účinek léčby Ke zhodnocení potenciálního léčebného účinku v jednotlivých ramenech studie (F vs. FC) dle stavu TP53 (ztráta nebo mutace) jsme sledovali účinek léčby v jednotlivých genetických podsku‑ pinách (obr. 3). Výsledky léčby pacientů s delecí 17p a prostou mutací TP53 byly v obou ramenech léčby obdobné (data nejsou k dispozici). Bez mutace TP53 dosáhlo 5,6 % pacientů CR v  rameni F (8 ze 142 pacientů) a 22,1 % v rameni FC (31 ze 140 pacientů). U žádného pacienta s mutací TP53 nebylo ani v jednom z léčebných ramen dosaženo CR (F 0 z 10 pacientů; p = 1,0; FC 0 z 15 pacientů; p = 0,043). U pacientů bez mutace TP53 bylo ORR 84,5 % v rameni F (120 ze 142 pacientů) a 97,9 % v rameni FC (137 z 140 pacientů). U pacientů s mutací TP53 bylo ORR 60 % v obou ramenech léčby (F 6 z 10 pacientů; p = 0,069; FC 9 z 15 pacientů; p < 0,001). Druh léčby neměl u pacientů s mutací TP53 vliv na časem definované

Mnohorozměrný model prognostických faktorů Pro zhodnocení, zda je mutace TP53 nezávislý prognostický faktor, jsme vytvořili mnohorozměrný model, který zahrnoval následující parametry: věk, stadium dle Bineta, genomické aberace (delece 17p a delece 11q), stav mutace IGHV a stav mutace TP53. Nezávislými předpovědními faktory pro PFS byla léčba v rameni FC (poměr rizik [hazard ratio, HR] = 0,6), delece 11q (HR = 1,7) a mutace TP53 (HR = 3,8), kdežto delece 17p predik‑ tivním faktorem nebyla (tab. 3). Pro OS byly nezávislými předpo‑ vědními faktory mutace TP53 (HR = 7,2), nemutovaný stav genu IGHV (HR = 1,9), delece 11q (HR = 1,9), delece 17p (HR = 2,3) a léčba FC (HR = 0,6; tab. 3). Model, který zahrnoval deleci 17p s mutací TP53, měl výsledky podobné.

Část pacientů bez progrese

A

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Část pacientů přežívajících

B

12

24

36

48

60

72

84

96

108

72

84

96

108

Čas (měsíce) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

12

24

36

48

60

Čas (měsíce) Obrázek 3.  Léčebný účinek (fludarabin [fludarabine, F] vs. F + cyklofosfamid [fludarabine and cyclophosphamide, FC]) u  jednotlivých podskupin pacientů s  chronickou lymfocytární leukémií (chronic lymphocytic leukemia, CLL) podle mutace TP53 (A) Doba do  progrese (progression free survival, PFS) skupiny s  mutací TP53 podle léčebného ramene. PFS byl identický u  pacientů s  CLL s  mutací TP53, kteří dostávali F (23,3 měsíců; n = 10; modrá křivka) či FC (19,2 měsíců; n = 16; zlatá křivka; p = 0,76). (B) Celkové přežití (overall survival, OS) skupiny s mutací TP53 podle léčebného ramene. OS byl identický u pacientů s CLL s mutací TP53, kteří dostávali F (medián OS 31,2 měsíců; n = 11; modrá křivka) či FC (medián OS 29,2 měsíců; n = 17; zlatá křivka; p = 0,92).

www.jco.org

DISKUSE

Genomické aberace hodnocené metodou FISH umožňují rozdělení jednotlivých skupin CLL dle délky přežití.2,3,9,12 Mezi ostatní pro‑ gnostické faktory u CLL patří koncentrace sérových markerů, stav genu IGHV a exprese ZAP70.4,5,7,28,29 I když existuje velké množ‑ ství markerů, studie zaměřené na genotypické podskupiny CLL byly uskutečněny teprve nedávno, a to na skupině pacientů s CLL s delecí 17p, kteří mají špatnou prognózu. Přes uvedené pokroky je ale zřejmé, že delece 17p vysvětluje jen u části pacientů jejich špatnou prognózu.15 Tato současná studie zaměřená na nalezení dalších podsku‑ pin pacientů s CLL s vysokým rizikem zkoumala vliv mutace TP53 u pacientů zařazených do randomizované studie CLL4 srovnáva‑ jící F s FC v první linii léčby. Bez selekčního zkreslení (bias) jsme byli schopni analyzovat 328 ze 362 zařazených pacientů. Dosta‑ tečně dlouhá doba sledování (follow-up) je velmi důležitá, aby byly správně zhodnoceny prognostické faktory u chronických onemoc‑ nění. Objevili jsme nezávislý prognostický vliv mutace TP53 na PFS a hlavně na OS. Jako klíčový nález můžeme označit to, že skupina pacientů s mutací TP53 bez delece 17p má podobné početní zastou‑ pení i léčebné výsledky jako skupina pacientů s delecí 17p. Ačkoli jsou tyto výsledky podobné těm z předchozích studií retrospektivních kohort, předchozí prospektivní studie zaměřená na vliv mutace TP53 (US Eastern Cooperative Oncology Group 2997) neprokázala prognostický význam této mutace na léčebnou odpověď či PFS. Nicméně ve srovnání s naší prací měla výše uve‑ dená studie relativně krátké sledování a nepotvrzené mutace byly sloučeny do stejné skupiny se skutečnými mutacemi TP53, což výrazně komplikuje interpretaci výsledků.6 Naše výsledky jasně ukazují souvislost mezi špatnými klinic‑ kými výstupy a přítomností mutace TP53, zároveň ale nasvěd‑ čují tomu, že abnormality p53 vysvětlují špatnou prognózu jen části pacientů s refrakterní CLL. Odhadovalo se, že část pacientů s CLL refrakterní k chemoterapii, která má ztrátu nebo mutaci TP53, tvoří 40–50 %.15,30 Naše data ale naznačují, že 29 % pacientů s F‑refrakterní CLL léčených v první linii může mít mutaci TP53 a/nebo deleci 17p. Mutace TP53 je spojena se špatnou prognózou u celé řady maligních nádorů (např. karcinom prsu, karcinomy hlavy a krku, vysoce maligní lymfomy).31,32 Klinický význam mutace TP53 je © 2010 by American Society of Clinical Oncology  61

Zenz et al.

Tabulka 3.  Coxova regresní analýza PFS (n = 280, * 147 událostí) a OS (n = 293, * 79 událostí) Parametry

Poměr rizik pro progresi

95% CI

p

PFS† randomizace: F vs. FC

0,616

0,44–0,85

11q‑: ano vs. ne

1,735

1,2–2,48

0,002

mutovaný TP53: ano vs. ne

3,784

2,38–6,01

< 0,001

0,004

OS‡ stav genu IGHV: mutovaný vs. nemutovaný

1,92

1,1–3,34

0,021

randomizace: F vs. FC

0,6

0,38–0,94

0,027

17p‑: ano vs. ne

2,31

1,09–4,91

0,029

11q‑: ano vs. ne

1,91

1,16–3,15

0,011

mutovaný TP53: ano vs. ne

7,24

3,86–13,56

< 0,001

POZNÁMKA: Mnohorozměrný model zahrnoval věk, stadium dle Bineta, genomické aberace (delece 17p a delece 11q), mutace genu IGHV a mutace TP53. Zkratky: PFS (progression‑free survival), čas do progrese; OS (overall survival), celkové přežití; F (fludarabine), fludarabin; FC (fludarabine and cyclophosphamide), fludarabin a cyklofosfamid. * Počet analyzovaných pacientů (se všemi dostupnými parametry). † Následující parametry nebyly signifikantní: věk (< 60 let vs. ≥ 60 let), stadium dle Bineta (A, B vs. C), status IGHV a 17p‑. ‡ Následující parametry nebyly signifikantní: věk (< 60 let vs. ≥ 60 let), stadium dle Bineta (A, B vs. C).

zvláště významný u CLL, což může být také vysvětleno relativně indolentním průběhem nemoci u pacientů bez mutace. Zájem o prognostické faktory je způsoben i tím, že máme pro pacienty s CLL stále se rozšiřující možnosti léčby, které se výrazně navzájem odlišují v intenzitě i mechanismu účinku. 33‑35 Určení sku‑ piny pacientů s odlišnou prognózou je proto velmi důležité. Sou‑ časná studie umísťuje podskupinu pacientů s mutací TP53 (bez ohledu na deleci 17p) do stejné kategorie s pacienty s CLL s delecí 17p. Tyto nálezy mohou mít okamžité důsledky, protože se zkou‑ mají různé alternativní protokoly v léčbě CLL v první linii, včetně časné alogenní transplantace u zmíněné podskupiny pacientů. Na tyto současné výsledky je ale potřeba nahlížet v kontextu změny v první linii léčby zahrnující chemoterapii/imunoterapii s režimy jako FC plus rituximab (FCR). Analýza studie CLL8 nazna‑ čuje, že léčebné remise a výsledky se u pacientů s delecí 17p přidá‑ ním rituximabu příliš nevylepšují.9 Časné výsledky studie CLL8 (FC vs. FCR) publikované ve formě abstraktu také ukazují špatnou pro‑ gnózu pacientů s mutací TP53, což znamená, že pacienti s mutací TP53 jsou kandidáty pro klinické studie a alogenní transplantace i v éře režimu FCR.36 Uvedené výsledky také naznačují, že by měla být analýza TP53 začleněna do diagnostických laboratorních vyšetření u pacientů s CLL vyžadujících léčbu. V současných postupech (guidelines) je doporučeno zhodnocení cytogenetiky metodou FISH v klinic‑ kých studiích i mimo ně, kdežto zhodnocení mutace IGHV, CD38 a ZAP70 je doporučeno jen v klinických studiích.37 Na základě našich výsledků byl měla být mutace TP53 zařazena na seznam genetických testů u CLL. Závěrem lze tvrdit, že CLL s mutací TP53 má špatnou pro‑ gnózu nezávisle na přítomnosti delece 17p. Proto by mělo být tes‑ tování mutace TP53 začleněno do genetického vyšetření pacientů s CLL a výsledky by měly být zohledněny v léčebných indikacích. Začleněním mutace TP53 do laboratorních vyšetření by se prav‑ děpodobně zdvojnásobil počet pacientů se špatnou prognózou, kteří by optimálně měli být léčeni odlišnými protokoly. Závěrem lze konstatovat, že léčebné výsledky by měly být u CLL hodno‑

62  © 2010 by American Society of Clinical Oncology

ceny v kontextu typických genetických změn, stejně jako u ostat‑ ních typů leukémií. PROHLÁŠENÍ AUTORŮ O MOŽNÉM STŘETU ZÁJMŮ Všichni autoři vyplnili toto prohlášení; následující autoři udali finanční nebo jiný zájem, který je relevantní pro látku posuzovanou v tomto článku. Určité vztahy označené písmenem „U“ jsou ty, za něž nebyla obdržena žádná kompenzace; vztahy označené písmenem „C“ byly kompenzovány. Pro detailní popis kategorií prohlášení nebo pro více informací o politice střetu zájmů ASCO odkazujeme čtenáře na Author Disclosure Declaration a kapitolu Disclosures of Potential Conflicts of Interest v informacích pro autory. Zaměstnání nebo vedoucí pozice: Nikdo Funkce konzultanta nebo poradce: Stephan Stilgenbauer, Bayer Schering Pharma (C)Vlastnictví akcií: Nikdo Honoráře: Thorsten Zenz, Bayer Schering Pharma Financování výzkumu: Stephan Stilgenbauer, Bayer Schering Pharma Znalecký posudek: Nikdo Jiné odměny: Nikdo

PODÍL AUTORŮ NA ČLÁNKU Koncepce a návrh: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Michael Hallek, Hartmut DÖhner, Stephan Stilgenbauer Administrativní pomoc: Barbara Eichhorst Poskytnutí studijních materiálů nebo pacientů: Barbara Eichhorst, Manuela Bergmann, Georg Hopfinger, Manfred Hensel, Michael Hallek, Hartmut Döhner, Stephan Stilgenbauer Sběr a kompletace údajů: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Raymonde Busch, Tina Denzel, Sonja Häbe, Dirk Winkler, Andreas Bühler, Jennifer Edelmann, Michael Hallek, Stephan Stilgenbauer Analýza a interpretace údajů: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Raymonde Busch, Tina Denzel, Sonja Häbe, Dirk Winkler, Andreas Bühler, Jennifer Edelmann, Michael Hallek, Hartmut Döhner, Stephan Stilgenbauer Psaní rukopisu: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Hartmut Döhner, Stephan Stilgenbauer Konečné schválení rukopisu: Thorsten Zenz, Barbara Eichhorst, Raymonde Busch, Tina Denzel, Sonja Häbe, Dirk Winkler, Andreas Bühler, Jennifer Edelmann, Manuela Bergmann, Georg Hopfinger, Manfred Hensel, Michael Hallek, Hartmut Döhner, Stephan Stilgenbauer

Journal of Clinical Oncology

Mutace genu TP53 a přežití u chronické lymfocytární leukémie

LITERATURA   1. Döhner H, Fischer K, Bentz M, et al: p53 gene deletion predicts for poor survival and non‑response to therapy with purine analogs in chronic B‑cell leuke‑ mias. Blood 85:1580‑1589, 1995   2. Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al: Genomic aberrations and survival in chronic lympho‑ cytic leukemia. N Engl J Med 343:1910‑1916, 2000   3. Catovsky D, Richards S, Matutes E, et al: Assessment of fludarabine plus cyclophosphamide for patients with chronic lymphocytic leukaemia (the LRF CLL4 Trial): A randomised controlled trial. Lancet 370:230‑239, 2007   4. Crespo M, Bosch F, Villamor N, et al: ZAP‑70 expression as a  surrogate for immunoglobulin‑ variable‑region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 348:1764‑1775, 2003   5. Damle RN, Wasil T, Fais F, et al: Ig V  gene mutation status and CD38 expression as novel prog‑ nostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 94:1840‑1847, 1999   6. Grever MR, Lucas DM, Dewald GW, et al: Comprehensive assessment of genetic and molecular features predicting outcome in patients with chronic lymphocytic leukemia: Results from the US Inter‑ group phase III trial E2997. J Clin Oncol 25:799‑804, 2007   7. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al: Unmu‑ tated Ig V(H) genes are associated with a  more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 94:1848‑1854, 1999   8. Stilgenbauer S, Eichhorst BF, Busch R, et al: Biologic and clinical markers for outcome after fluda‑ rabine (F) or F plus cyclophosphamide (FC): Compre‑ hensive analysis of the CLL4 trial of the GCLLSG. Blood 112:2089, 2008 (abstr)   9. Stilgenbauer S, Zenz T, Winkler D, et al: Genomic aberrations, VH mutation status and outcome after fludarabine and cyclophosphamide (FC) or FC plus rituximab (FCR) in the CLL8 trial. Blood 112:781, 2008 (abstr) 10. Zenz T, Kröber A, Scherer K, et al: Monoal‑ lelic TP53 inactivation is associated with poor prog‑ nosis in chronic lymphocytic leukemia: Results from a  detailed genetic characterization with long‑term follow‑up. Blood 112:3322‑3329, 2008 11. Dicker F, Herholz H, Schnittger S, et al: The detection of TP53 mutations in chronic lympho‑ cytic leukemia independently predicts rapid disease progression and is highly correlated with a complex aberrant karyotype. Leukemia 23:117‑124, 2009 12. Grever MR, Lucas DM, Johnson AJ, et al: Novel agents and strategies for treatment of p53‑defective

www.jco.org

chronic lymphocytic leukemia. Best Pract Res Clin Haematol 20:545‑556, 2007 13. Pettitt AR, Matutes E, Oscier D: Alemtuzumab in combination with high‑dose methylprednisolone is a  logical, feasible and highly active therapeutic regimen in chronic lymphocytic leukaemia patients with p53 defects. Leukemia 20:1441‑1445, 2006 14. Zenz T, Mohr J, Edelmann J, et al: Treatment resistance in chronic lymphocytic leukemia: The role of the p53 pathway. Leuk Lymphoma 50:510‑513, 2009 15. Zenz T, Häbe S, Denzel T, et al: Detailed anal‑ ysis of p53 pathway defects in fludarabine-refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL): Dissecting the contribution of 17p deletion, TP53 mutation, p53‑p21 dysfunction, and miR34a in a prospective clinical trial. Blood 114:2589‑2597, 2009 16. el Rouby S, Thomas A, Costin D, et al: p53 gene mutation in B‑cell chronic lymphocytic leukemia is associated with drug resistance and is indepen‑ dent of MDR1/MDR3 gene expression. Blood 82:3452‑3459, 1993 17. Fenaux P, Preudhomme C, Laï JL, et al: Muta‑ tions of the p53 gene in B‑cell chronic lymphocytic leukemia: A report on 39 cases with cytogenetic anal‑ ysis. Leukemia 6:246‑250, 1992 18. Newcomb EW: P53 gene mutations in lymphoid diseases and their possible relevance to drug resistance. Leuk Lymphoma 17:211‑221, 1995 19. Sturm I, Bosanquet AG, Hermann S, et al: Mutation of p53 and consecutive selective drug resistance in B‑CLL occurs as a  consequence of prior DNA‑damaging chemotherapy. Cell Death Differ 10:477‑484, 2003 20. Trbusek M, Malcikova J, Smardova J, et al: Inactivation of p53 and deletion of ATM in B‑CLL patients in relation to IgVH mutation status and previous treatment. Leukemia 20:1159‑1161, 2006 21. Rossi D, Cerri M, Deambrogi C, et al: The prog‑ nostic value of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia is independent of Del17p13: Implications for overall survival and chemorefractoriness. Clin Cancer Res 15:995‑1004, 2009 22. Eichhorst BF, Busch R, Hopfinger G, et al: Fludarabine plus cyclophosphamide versus fludara‑ bine alone in first‑line therapy of younger patients with chronic lymphocytic leukemia. Blood 107:885‑891, 2006 23. Cheson BD, Bennett JM, Grever M, et al: National Cancer Institute‑sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: Revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 87:4990‑4997, 1996 24. Kröber A, Seiler T, Benner A, et al: V(H) muta‑ tion status, CD38 expression level, genomic aberra‑

tions, and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood 100:1410‑1416, 2002 25. Zenz T, Häbe S, Denzel T, et al: How little is too much? p53 inactivation: From laboratory cutoff to biological basis of chemotherapy resistance. Leukemia 22:2257‑2258, 2008 26. International Agency for Research on Cancer: TP53 sequencing methods. http://www‑p53.iarc.fr/ p53sequencing.html 27. Yamanoshita O, Kubota T, Hou J, et al: DHPLC is superior to SSCP in screening p53 mutations in esophageal cancer tissues. Int J Cancer 114:74‑79, 2005 28. Hallek M, Langenmayer I, Nerl C, et al: Elevated serum thymidine kinase levels identify a  subgroup at high risk of disease progression in early, nonsmoldering chronic lymphocytic leukemia. Blood 93:1732‑1737, 1999 29. Wierda WG, O’Brien S, Wang X, et al: Charac‑ teristics associated with important clinical end points in patients with chronic lymphocytic leukemia at initial treatment. J Clin Oncol 27:1637‑1643, 2009 30. Lozanski G, Heerema NA, Flinn IW, et al: Alem‑ tuzumab is an effective therapy for chronic lympho‑ cytic leukemia with p53 mutations and deletions. Blood 103:3278‑3281, 2004 31. Young KH, Leroy K, Møller MB, et al: Struc‑ tural profiles of TP53 gene mutations predict clinical outcome in diffuse large B‑cell lymphoma: An inter‑ national collaborative study. Blood 112:3088‑3098, 2008 32. Poeta ML, Manola J, Goldwasser MA, et al: TP53 mutations and survival in squamous‑cell carcinoma of the head and neck. N Engl J Med 357:2552‑2561, 2007 33. Keating MJ, Flinn I, Jain V, et al: Therapeutic role of alemtuzumab (Campath‑1H) in patients who have failed fludarabine: Results of a  large interna‑ tional study. Blood 99:3554‑3561, 2002 34. Hillmen P, Skotnicki AB, Robak T, et al: Alem‑ tuzumab compared with chlorambucil as first‑line therapy for chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol 25:5616‑5623, 2007 35. Montserrat E, Moreno C, Esteve J, et al: How I treat refractory CLL. Blood 107:1276‑1283, 2006 36. Zenz T, Hoth P, Busch R, et al: TP53 mutations and outcome after fludarabine and cyclophosphamide (FC) or FC plus rituximab (FCR) in the CLL8 trial of the GCLLSG. Blood 114:1267, 2009 (abstr) 37. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, et al: Guide‑ lines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: A  report from the Interna‑ tional Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute‑Working Group 1996 guidelines. Blood 111:5446‑5456, 2008

© 2010 by American Society of Clinical Oncology  63