MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA NÁRODNÍ CENTRUM PRO VÝZKUM BIOMOLEKUL ____________________________________________________________________
Analýza genu a proteinu SF3B1 u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií
Diplomová práce
Michaela Hložková
Vedoucí práce: Mgr. Martin Trbušek, Dr.
Brno 2014
Bibliografický záznam Autor:
Mgr. Michaela Hložková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Národní centrum pro výzkum biomolekul
Název práce:
Analýza genu a proteinu SF3B1 u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Genomika a proteomika
Vedoucí práce:
Mgr. Martin Trbušek, Dr.
Akademický rok:
2014/2015
Počet stran:
72
Klíčová slova:
CLL, SF3B1, Sangerovo sekvenování, western blot
Bibliographic Entry Author:
Mgr. Michaela Hložková Faculty of Science, Masaryk University National Centre for Biomolecular Research
Title of Thesis:
Analysis of SF3B1 gene and protein in chronic lymphocytic leukemia patients
Degree Programme: Biochemistry
Field of Study:
Genomics and proteomics
Supervisor:
Mgr. Martin Trbušek, Dr.
Academic Year:
2014/2015
Number of Pages:
72
Keywords:
CLL, SF3B1, Sanger sequencing, western blot
Abstrakt Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je nejčastějším typem leukémie v západním světě. Během posledních několika let byly objeveny rekurentně mutované geny, jejichž inaktivace v patogenezi CLL nebyla předtím předpokládána. Největším překvapením byla identifikace mutací v genu SF3B1 (sestřihový faktor 3 podjednotka 1), který je důležitou komponentou sestřihového aparátu. Tato diplomová práce se zabývá analýzou genu a proteinu SF3B1 u pacientů s CLL. Identifikace mutací v genu SF3B1 byla prováděna pomocí Sangerova sekvenování a analýza proteinové hladiny byla stanovována westernovým přenosem. Mutační screening genu SF3B1 byl následně vyhodnocen ve vztahu k proteinové hladině SF3B1 a k molekulárně cytogenetickým datům pacientů. Metodika byla aplikována na souboru 80 pacientů s diagnostikovanou CLL, u nichž bylo nalezeno celkem 19 patologických sekvenčních změn (mutací). Výsledky mutačních analýz byly statisticky zhodnoceny v kontextu s výsledky molekulárně cytogenetických vyšetření a byly nalezeny statisticky významné souvislosti mezi výskytem mutací v genu SF3B1 a mutacemi v genu ATM a rovněž inaktivací dráhy ATM/p53. Zjištěné poznatky podtrhují význam defektů v genu SF3B1 pro patogenezi CLL a také jejich významnost pro prognózu pacientů.
Abstract Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common type of leukemia in the Western world. Recurrently mutated genes, whose inactivation in CLL pathogenesis had not been previously anticipated, have been discovered during the last few years. The most surprising was the identification of mutations in the gene SF3B1 (splicing factor 3 subunit 1), which is an important component of the spliceosome. This diploma thesis deals with the analysis of SF3B1 gene and protein in patients with CLL. Identification of mutations in the gene was performed using Sanger sequencing and analysis of the protein level was done using western blot. The outputs of the mutation screening were subsequently correlated with the SF3B1 protein level and molecular cytogenetic data of patients. The methodology was applied to a cohort of 80 patients diagnosed with CLL, in which 19 pathological sequence variations (mutations) were detected. Results of the mutational analysis were statistically evaluated in the context of the molecular cytogenetic data. Statistically significant associations were observed between the presence of mutations in SF3B1 and (a) ATM mutations, and (b) ATM/p53 pathway inactivation. The findings underscore the importance of SF3B1 mutations for CLL pathogenesis and also for patients´ prognosis.
Poděkování: Na tomto místě bych ráda vyjádřila své velké poděkování vedoucímu mé diplomové práce panu Dr. Martinu Trbuškovi, a to nejen za odborné vedení mé diplomové práce, ale i za velmi lidský a laskavý přístup. Mé díky patří také mým konzultantkám Mgr. Veronice Navrkalové, Ph.D a RNDr. Ludmile Šebejové za cenné rady a připomínky při realizaci laboratorních experimentů. Taktéž děkuji celému pracovnímu kolektivu pracoviště Centra molekulární biologie a genové terapie za vytvoření příjemného pracovního prostředí a cennou pomoc. Mé poděkování také patří celé mé rodině za všestrannou podporu nejen během vypracování této práce, ale během celého mého studia. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat mému příteli Lukášovi za všechno, co se nedá vyjádřit jen několika slovy.
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci na téma Analýza genu a proteinu SF3B1 u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií vypracovala samostatně pod vedením vedoucího diplomové práce a s použitím odborné literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou všechny citovány v práci a uvedeny v seznamu použité literatury.
Brno
2014
…………………………..... Michaela Hložková
OBSAH SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK .......................................................................................................... 11 1.
ÚVOD .................................................................................................................................................... 13
2.
NÁDOR A NÁDOROVÁ BUŇKA...................................................................................................... 14 CHARAKTERISTICKÉ RYSY NÁDOROVÝCH BUNĚK.......................................................................... 14
2.1. 3.
HEMATOONKOLOGICKÁ ONEMOCNĚNÍ ................................................................................. 17 3.1
NÁDOROVÁ LYMFOPROLIFERATIVNÍ ONEMOCNĚNÍ ............................................................................ 17
3.1.1 4.
Chronická lymfocytární leukémie (CLL) .................................................................................. 19
SF3B1 (SESTŘIHOVÝ FAKTOR 3 PODJEDNOTKA 1) ............................................................... 27 4.1
SETŘIH (SPLICING) ............................................................................................................................. 28
4.2
SF3B1 ................................................................................................................................................ 29
4.3
SF3B1 A CLL .................................................................................................................................... 30
5.
CÍLE PRÁCE ....................................................................................................................................... 32
6.
MATERIÁL A METODY ................................................................................................................... 34 6.1
BIOLOGICKÝ MATERIÁL ..................................................................................................................... 34
6.2
PŘÍSTROJE .......................................................................................................................................... 34
6.3
CHEMIKÁLIE....................................................................................................................................... 35
6.4
IDENTIFIKACE MUTACÍ V GENU SF3B1 POMOCÍ SANGEROVA SEKVENOVÁNÍ ..................................... 35
6.4.1
Izolace DNA a stanovení její koncentrace ............................................................................... 35
6.4.2
Polymerázová řetězová reakce (PCR) ..................................................................................... 36
6.4.3
Přečištění produktu PCR ......................................................................................................... 38
6.4.4
Sekvenační PCR ....................................................................................................................... 38
6.4.5
Přečištění sekvenčního produktu.............................................................................................. 40
6.4.6
Sekvenační analýza .................................................................................................................. 40
6.5
6.5.1
Příprava vzorků pro Western Blotting ..................................................................................... 41
6.5.2
SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného) 42
6.5.3
Western blotting ....................................................................................................................... 44
6.5.4
Imunodetekce proteinů ............................................................................................................. 45
6.5.5
Detekce chemiluminiscence expozicí na fotografický film ....................................................... 47
6.6 7.
STANOVENÍ PROTEINOVÉ HLADINY PROTEINU SF3B1 POMOCÍ WESTERNOVÉHO PŘENOSU ................. 41
STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ .............................................................................................................. 48
VÝSLEDKY.......................................................................................................................................... 49 7.1
OPTIMALIZACE ZAVEDENÝCH METOD ................................................................................................ 49
7.1.1
Optimalizace PCR reakce ........................................................................................................ 49
7.1.2
Optimalizace westernového přenosu ........................................................................................ 51
7.2
IDENTIFIKACE MUTACÍ POMOCÍ SANGEROVA SEKVENOVÁNÍ .............................................................. 53
7.3
VYHODNOCENÍ HLADINY PROTEINU SF3B1 POMOCÍ WESTERNOVÉHO PŘENOSU U CLL PACIENTŮ...... 58
7.4
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ MUTAČNÍHO SCREENINGU VZHLEDEM K MOLEKULÁRNĚ CYTOGENETICKÝM
DATŮM PACIENTŮ ........................................................................................................................................ 60
7.4.1
Vyhodnocení výsledků mutačního screeningu genu SF3B1 ve vztahu k ATM defektům a p53
mutacím ................................................................................................................................................. 60 7.4.2
Vyhodnocení výsledků mutačního screeningu genu SF3B1 ve vztahu k času do první terapie
(TTFT) ................................................................................................................................................. 62 8.
DISKUSE .............................................................................................................................................. 64
9.
ZÁVĚRY ............................................................................................................................................... 67
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .......................................................................................................... 68
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ATM
gen mutovaný u onemocnění ataxia telangiectasia
BCR
B-buněčný receptor
BSA
hovězí sérový albumin
CLL
chronická lymfocytární leukémie
ddNTP
dideoxynukleotidtrifosfát
dNTP
deoxynukleotidtrifosfát
FBS
fetální bovinní sérum
HEAT repetice
Huntingtin, elongační faktor 3 (EF3), proteinová fosfatasa 2A (PP2A), kvasinková kináza TOR1
IGHV
variabilní oblast těžkého řetězce imunoglobulinového genu
O/N
kultivace přes noc
PAGE
polyakrylamidová gelová elektroforéza
PBS
fosfátový pufr
PCR
polymerázová řetězová reakce
PHF5A
PHD finger-like doména obsahující 5A
SAP155
sestřihový faktor 3 podjednotka 1 (ozn. také SF3B1, SF3b155)
SDS-PAGE
elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného
SF3B1
sestřihový faktor 3 podjednotka 1 (ozn. také SAP155, SF3b155)
SF3B14
pre-mRNA větvící místo proteinu p14
snRNAs
malé jaderné RNA
snRNPs
malé jaderné ribonukleoproteiny
TBS
angl. Tris-buffered saline
TLR
toll-like receptor
TP53
gen kódující nádorový supresor p53
TTFT
čas do první terapie
WHO
světová zdravotnická organizace
wt
wild-type (normální funkční gen nebo protein)
ZAP-70
zeta asociovaný protein o velikosti 70 kDa
11
TEORETICKÁ ČÁST
1. Ú VOD Chronická lymfocytární leukémie (CLL) se projevuje akumulací monoklonálních zralých B-lymfocytů (fenotyp povrchových znaků CD5+, CD19+, CD20+ a CD23+) v periferní krvi, kostní dřeni, játrech, slezině a lymfatických orgánech. CLL je nejčastějším typem leukémie v západním světě (Evropa a Severní Amerika) a postihuje převážně pacienty ve vyšším věku (medián v době diagnózy je zhruba 60 let). Toto onemocnění, které je dosud nevyléčitelné, je charakteristické extrémně variabilním přežitím pacientů s rozsahem 1 měsíc až 25 let. Během posledních dvou dekád prošel výzkum CLL bouřlivým rozvojem a přinesl řadu cenných poznatků nejenom pro tuto leukémii, ale i pro onkologii obecně. V několika posledních letech pak patří mezi největší úspěchy bezesporu objev rekurentně mutovaných genů, jejichž inaktivace v patogenezi onemocnění nebyla předtím známa. S využitím technologie „sekvenování nové generace“ byly identifikovány u CLL takovéto rekuretní mutace přibližně v 15-ti protein-kódujících genech. Největším překvapením byla identifikace mutací v genu SF3B1, která byla podle zveřejněné studie Wanga et al. (2011) druhou nejčastější mutací vyskytující se u 15 % pacientů s CLL. SF3B1 (sestřihový faktor 3 podjednotka 1) je kritickou komponentou sestřihového aparátu. Gen SF3B1 obsahuje 25 exonů a je lokalizován na chromozomu 2 v oblasti q33.1. Protein SF3B1 je vysoce konzervovaný a podílí se jak na hlavním, tak na vedlejším sestřihu. V současné době jsou funkční dopady mutací v SF3B1 u pacientů s CLL podrobně zkoumány. Mutace v SF3B1 jsou detekovány u pacientů s pokročilejším stadiem CLL a s nežádoucími biologickými vlastnostmi. Hlavním cílem této diplomové práce byla analýza genu SF3B1 a identifikace příslušných mutací ve vzorcích pacientů s CLL pomocí metody Sangerova sekvenování a analýza proteinové hladiny proteinu SF3B1 u CLL pacientů pomocí westernového přenosu. Dalším cílem bylo vyhodnocení celkových výsledků mutačního screeningu genu SF3B1 na pracovišti ve vztahu k molekulárně cytogenetickým datům pacientů.
13
2. N ÁDOR A NÁDOROVÁ BUŇKA Nádor je abnormální tkáňová masa, která je vytvářena chorobným procesem, neoplazií, charakterizovaným nekontrolovatelnou buněčnou proliferací. Neoplázie, abnormální akumulace buněk, se objevuje díky nerovnováze mezi buněčnou proliferací a buněčným zánikem (Nussbaum et al., 2004). Nádory můžeme rozdělit na nádory benigní, jejichž buňky sice masivně proliferují, ale zůstávají pohromadě a tvoří jednotlivou masu nádoru a na nádory maligní, jejichž růst není kontrolovaný, jsou schopny metastazovat (šířit se) a kolonizovat teritoria normálně vyhrazená pro jiné buňky. Maligní nádor se od benigního odlišuje rychlostí proliferace; buněčnou diferenciací a anaplazií, architekturou tkáně; lokálně infiltrativním a destruktivním růstem a tvorbou metastáz (Adam et al., 2003). Procesy buněčného dělení a buněčné smrti jsou regulovány řadou genů, jejichž změny jsou zodpovědné za vznik nádoru. Nádory tedy představují genetickou nemoc. Mutace v těchto genech se objevují v jedné somatické buňce, která následně nekontrolovatelně roste a dělí se. Odlišný genotyp nádorových buněk je důsledkem genetických abnormalit, které mohou být vyvolány faktory fyzikálními (ionizující záření), chemickými (karcinogeny) i biologickými (onkogenní viry). Po zahájení zhoubného bujení kterýmkoliv mechanismem dochází při jeho vývoji ke hromadění dalších genetických změn buněčného aparátu zodpovědného za opravu poškozené DNA a udržování cytogenetické stability. Poškození kritických genů vede k dalšímu zhoršení regulačních mechanismů proliferace a zániku buňky (apoptózy), což umožňuje původnímu klonu neoplastických buněk vyvinutí do mnoha sublinií s různým stupněm malignizace.
2.1.
CHARAKTERISTICKÉ RYSY NÁDOROVÝCH BUNĚK
Z buněk zdravé tkáně vznikají buňky nádorové, které získávají své vlastnosti během vícestupňového procesu zvaného kancerogeneze. Tato řada abnormálních vlastností je nezbytná pro úspěšnost nádorové buňky z hlediska jejího přežití a jejich kombinace je odlišná u různých nádorů. Nicméně byl sestaven obecný seznam klíčových vlastností, kterými se nádorové buňky liší od buněk zdravých. Tento seznam, navrhnutý Hanahanem a Weinbergem (2000), zahrnuje šest nejvýznamnějších znaků, kterými jsou: soběstačnost v produkci růstových signálů, necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus, schopnost tvorby metastáz, neomezený replikační potenciál, posílení angiogeneze a poškození apoptózy. 14
K původním šesti rysům nádorových buněk je obecně přidávána ještě genetická nestabilita jako nutná podmínka pro vznik ostatních vlastností. Genetická nestabilita významně zvyšuje frekvenci mutací. Mutace vedoucí k vývoji nádorů, vznikají spontánně, jako výsledek nepřesností v replikaci DNA a poruch mechanismů opravujících DNA. Tyto mutace postiženým buňkám neubližují, naopak jim mohou udělit zvýhodnění v soutěži o přežití s ostatními buňkami. A právě tato výhoda, kterou individuální buňka s danou mutací získává, vede ke katastrofě mnohobuněčného organismu jako celku (Pospíšilová et al., 2013). Jiným zdrojem navýšení genetické nestability může být zvýšený výskyt chromozomálních zlomů a přestaveb či u některých buněk kritické zkrácení telomer. Ve vývoji nádoru hrají také důležitou roli záněty. Buňky imunitního systému, které jsou v kontaktu s nádorem, mohou být výsledkem úsilí imunitního systému o zničení nádoru, nicméně záněty mohou vývoj kancerogeneze i podporovat (Grivennikov et al., 2010). Záněty přispívají ke zmíněným vlastnostem nádorových buněk skrze aktivní molekuly, kterými jsou růstové faktory a cytokiny. Záněty také mohou uvolňovat látky, například reaktivní formy kyslíku, působící mutagenně na ostatní buňky. Mezi další faktory navrhnuté Hanahanem a Weinbergem (2011), které lze zařadit na seznam obecných vlastností nádorových buněk, patří přeprogramování energetického metabolismu buňky a odolnost vůči odstranění imunitním systémem. Rychle se dělící nádorové buňky přepínají svůj metabolismus na glykolýzu i za přítomnosti kyslíku a přizpůsobují ho tak vlastním potřebám. Buňky vyvíjejícího se nádoru musí mít také schopnost uniknout odhalení imunitním systémem, neboť většina počínajících nádorů je imunitním systémem odstraňována. Imunitní systém tedy zaujímá při kancerogenezi dvojí funkci, a to nápomocnou při transformaci nádorových buněk na buňky více maligní a eliminující, kdy se snaží nádory odstraňovat. Základní rysy nádorových buněk jsou ilustrovány na Obr. 1.
Obr. 1: Znaky nádorových buněk převzato a upraveno z http://www.fluofarma.com/client/ccach/co ntenu/800_______cancer-cell-basedassay-services-cro_346.jpg 28.8.2014 inspirováno Hanahan a Weinberg, 2011
15
Nádor ovšem není jen homogenní masa transformovaných buněk, ale jeho nedílnou součástí jsou i zdravé buňky tvořící mikroprostředí nádoru. Stroma karcinomu je tedy tvořena nejen nádorovými epiteálními buňkami, ale i nenádorovými mezenchymálními buňkami mezi které patří např. endoteliální buňky, pericyty, buňky imunitního systému, fibroblasty, kmenové buňky a další (Obr. 2). Mikroprostředí nádoru se podílí na typických znacích nádoru a aktivně přispívá k jeho vývoji.
Obr. 2: Buňky mikroprostředí nádoru převzato a upraveno z Hanahan a Weinberg, 2011
16
3. H EMATOONKOLOGICKÁ ONEMOCNĚNÍ Hematoonkologická onemocnění zaujímají zvláštní postavení mezi nádorovými chorobami. Vychází totiž z nižšího počtu genetických změn nutných pro vznik nádorového fenotypu a z časté spojitosti konkrétního typu onemocnění s charakteristickou specifickou genetickou změnou. U těchto typů nádorů je maligní transformací postižena kmenová krvetvorná buňka nebo některý z progenitorů jednotlivých řad hematopoézy. Pro nádorovou transformaci hematopoetické buňky jsou většinou dostačující pouze změny vedoucí k narušení kontroly buněčného dělení, případně mutace způsobující poruchy v expresi genů účastnících se řízení apoptózy (Adam et al., 2003). Mezi nádorová onemocnění krvetvorné tkáně patří leukémie s převážně difuzním charakterem rozšíření maligních buněk v krvi a lymfomy s nádorovými ložisky predominantně v lymfatické tkáni. Hematoonkologická onemocnění lze rozdělit na základě postižené krevní vývojové řady nebo klinického průběhu. Je-li maligní transformací zasažena myeloidní prekurzorová buňka, rozvíjí se chronická nebo akutní myeloidní leukémie (= myeloproliferativní choroby), v případě transformace lymfoidní prekurzorové buňky dochází k progresi chronické nebo akutní lymfoidní leukémie (= lymfoproliferativní choroby). Myeloidní leukémie jsou nádorovými chorobami vlastního krvetvorného systému, zatímco lymfoidní leukémie a lymfomy jsou nádorovým onemocněním imunitního systému (Adam et al., 2003). 3.1 NÁDOROVÁ LYMFOPROLIFE RATIVNÍ ONEMOCNĚNÍ Nádorová lymfoproliferativní onemocnění jsou nádory vycházející z lymfocytů (Češka et al., 2010). Tato heterogenní skupina onemocnění, která zahrnuje jak leukémie, tak lymfomy a mnohočetný myelom, je podle WHO (World Health Organization) klasifikace rozdělena na lymfoproliferace vycházející z B- nebo T-lymfocytů. Obě tyto skupiny jsou dále členěny na lymfoproliferace prekurzorové, které vycházejí z vývojových stádií buněk a lymfoproliferace periferní vycházející z diferencovaných lymfocytů. Zvláštní kategorií je Hodgkinův lymfom, který je charakterizován nádorovou populací buněk RS (ReedovéSternberga), které tvoří asi 1-2 % buněk v celém postiženém nádoru a neexprimují žádné znaky typické pro lymfoidní řadu. Pro představu rozsáhlosti této skupiny onemocnění je v Tab. I uvedena její WHO klasifikace.
17
Tabulka I: WHO klasifikace lymfoproliferativních onemocnění (převzato a upraveno z Češka et al., 2010) Prekurzorové B-lymfoproliferace: Prekurzorové T-lymfoproliferace: T-lymfoblastová leukémie/lymfoblastový lymfom B-lymfoblastová leukémie/lymfoblastový (T-ALL/LL) lymfom (B-ALL/LL) − blíže nespecifikovaný − s nenáhodnými genetickými změnami Periferní B-lymfoproliferace: Periferní T-lymfoproliferace: Chronická lymfatická leukémie/malobuněčný T-prolymfocytární leukémie (T-PLL) lymfom (CLL/SLL) T-velkobuněčná granulární leukémie (T-LGL) B-prolymfocytární leukémie (B-PLL) Agresivní NK leukémie Leukémie z vlasatých buněk (HCL) EBV pozitivní T-buněčné lymfoproliferace Lymfoplazmocytický lymfom (LPL) dětského věku Lymfom z plášťových buněk (MCL) T-leukémie/lymfom dospělých (ATLL) Difúzní velkobuněčný lymfom z B-lymfomů Extranodální NK/T-lymfom, nazální typ (DLBCL) T-lymfom spojený s enteropatií − blíže nespecifikovaný Hepatosplenický γδ T-lymfom − DLBCL bohatý na T-lymfocyty T-lymfom podobný podkožní panikulitis − primární DLBCL CNS Mycosis fungoides − primárně kožní DLBCL – postihující nohu Sezaryho syndrom − EBV pozitivní DLBCL starších lidí Primární kožní CD30 pozitivní T-lymfom Další lymfomy z velkých B-lymfocytů Primární kožní γδ T-lymfom − primárně mediastinální velkobuněčný B Periferní T-lymfom blíže nespecifikovaný lymfom (PMBCL) (PTL NOS) − intravaskulární velkobuněčný B-lymfom Angioimunoblastický T-lymfom − DLBCL spojený s chronickým zánětem Anaplastický velkobuněčný lymfom ALK − lymfomatoidní granulomatóza pozitivní (ALCLALK+) − velkobuněčný B-lymfom vycházející Anaplastický velkobuněčný lymfom ALK z HHV-8 spojenou Castlemannovou negativní (ALCLALK-) chorobou − lymfom primárně z výpotků Burkittův lymfom (BL) Folikulární lymfom (FL) Primární kožní folikulární lymfom Plazmablastický lymfom Lymfom z marginální zóny splenický (SMZL) Extranodální lymfom z marginální zóny MALT tkáně (MZL MALT) Lymfom z marginální zóny nodální Nezařazený B-lymfom s rysy DLBCL i BL Nezařazený B-lymfom s rysy DLBCL i HL Nádory z plazmatických buněk (mnohočetný myelom) Choroba těžkých řetězců Hodgkinův lymfom (HL) Nodulární lymfocytárně predominantní HL Klasický Hodgkinův lymfom − HL typu nodulární sklerózy − HL smíšeně buněčný − HL bohatý na lymfocyty − HL chudý na lymfocyty Lymfoproliferativní nádory spojené s imunodeficiencí (LPD) Lymfoproliferativní nádory spojené s primární imunodeficiencí Lymfomy spojené s HIV infekcí Posttranslační lymfoproliferace Ostatní iatrogenní lymfoproliferace spojené s imunodeficiencí
18
3.1.1 Chronická lymfocytární leukémie (CLL) CLL je nejčastější leukémií dospělých v Evropě a Severní Americe, kde tvoří 25-30 % všech leukémií, nicméně vzácně se vyskytuje i u asijské populace. Její incidence je cca 6/100 000 obyvatel. Medián věku při stanovení diagnózy je 65 let, ale 20-30 % pacientů je mladších 60 let a 5-10 % pacientů je mladších 50 let (Adam et al., 2008). Muži jsou postižení častěji (poměr muži/ženy = 2,5/1) a také je mužské pohlaví negativním prognostickým faktorem. CLL má vysoce variabilní klinický průběh. Některé formy nemoci mohou mít totiž roky trvající bezpříznakové období, kdy je diagnóza stanovena z náhodného vyšetření krevního obrazu, ve kterém je pozorován vzestup počtu lymfocytů. Na straně druhé jsou jiné formy nemoci, s agresivnějším průběhem, kde se stav nemocného rychle zhoršuje i přes odpovídající léčbu. Mezi příznaky progredující CLL patří infiltrace nelymfatických orgánů (mízní uzliny, slezina a játra) lymfocyty, klinicky se pak nemoc u pacientů projevuje malátností, úbytkem hmotnosti, zvýšenou teplotou a nočním pocením. Pro stanovení diagnózy CLL je zapotřebí, aby byly splněny dvě základní podmínky – absolutní lymfocytóza ≥ 5 x 109/l a potvrzení typického klonálního imunofenotypu (CD5+; CD19+; CD20 slabě+; CD23+; CD79b slabě+; FMC7-).
Podle starších kritérií byl
podmínkou opakovaný nález zvýšeného počtu lymfocytů v periferní krvi v intervalu jednoho měsíce. Možnost imunofenotypického potvrzení diagnózy však činí tuto podmínku zbytečnou (Adam et al., 2004). Pohled na biologii CLL se v posledních několika letech výrazně změnil. Od konceptu prosté akumulace zralých, nefunkčních lymfocytů se prohloubila znalost rozvoje CLL směrem ke komplexnímu obrazu změn zahrnujících mimo jiné zásadní podíl proliferačního poolu buněk stojících mimo G0/G1 fázi buněčného cyklu, podíl B-buněčného receptoru (BCR), vliv antigenů a reakci na imunitní odpověď (Češka et al., 2010). Hlavní biologické principy přispívající k patogenezi CLL zahrnují (1) neměnnou, ale řídkou (1 %/rok) descendenci CLL z CD5+ monoklonální B-buněčné lymfocytózy; (2) molekulární aberace, které podstatně přispívají k variabilitě pacientů v klinické progresivitě a agresivitě CLL; (3) charakteristické rekurentní CLL vnitrobuněčné abnormality, včetně získaných genomických aberací, genetických mutací, transkriptomálních a epigenetických deregulací; (4) důležitou roli anti-apoptotických proteinů v CLL biologii; (5) centrální roli Bbuněčného receptoru v patogenezi CLL; (6) důležitý podíl interakcí mezi CLL buňkami souhrnně označovaných jako mikroprostředí; (7) získanou rezistenci na terapii a konečnou progresi k CLL rezistentní na léčiva a (8) CLL-asociovanou degradaci imunitního systému vedoucí k závažným chorobám včetně náchylnosti na infekce a autoimunitním cytopeniím. 19
Pro zahájení léčby CLL jsou nutné projevy klinických příznaků, mezi které lze zařadit např. progresivně se zvětšující lymfatické uzliny, pokles hladiny hemoglobinu a trombocytů v důsledku narůstající infiltrace kostní dřeně či zhoršování anémie. Nemocní, kteří nemají tyto příznaky, jsou pouze sledováni a ani samotná přítomnost negativních prognostických faktorů není indikací k zahájení léčby. Cílem všech standardních léčebných procesů je vždy navodit kompletní remisi (= normalizaci hodnot krevního obrazu a velikosti lymfatických uzlin, jater a sleziny). Prvními léčebnými prostředky s potenciálem navodit remisi CLL byla alkylační činidla, zejména chlorambucil, který je podáván některým starším pacientům dodnes. Tato léčba alkylačními cytostatiky dosáhne kolem 10 % kompletních remisí a celkový počet léčebných odpovědí se pohybuje mezi 50-60 % (Adam et al., 2008). Purinová analoga, především fludarabin, poskytla u CLL pacientů výraznější léčebné odpovědi, vyšší počet kompletních remisí, ale i jejich delší trvání. Další možnosti léčby přinesla imunoterapie monoklonálními protilátkami, zejména ovšem ve variantě kombinace s chemoterapií. Mezi nejpoužívanější protilátky v terapii CLL patří rituximab, alemtuzumab a ofatumumab. Rituximab je chimérická monoklonální protilátka cílená proti antigenu CD20, alemtuzumab je humanizovaná protilátka antiCD52 a ofatumumab je lidská monoklonální protilátka rovněž namířená proti epitopu na molekule CD20. Všechny tyto protilátky jsou velmi dobře tolerovatelné a poskytují jasné klinické zlepšení u pacientů refrakterních na alkylační činidla a purinové analogy (Nabhan et al., 2004; Keating et al., 2002; Wierda et al., 2010). Nicméně stejně jako jiné léčebné postupy, je i účinnost léčby monoklonálními protilátkami úzce spojena s typem CLL a jejích genetických abnormalit, což dokazují i novější studie jako např. Sebejova et al., 2014. V současnosti je v první linii terapie volena imunochemoterapie FCR – kombinace fludarabinu, cyklofosfamidu a rituximabu. V případě mladších nemocných s nepříznivou formou CLL je možné při selhání léčby první volby zvážit provedení alogenní transplantace, která je ale zatížena vysokou mortalitou.
3.1.1.1 Prognostické faktory Prognóza pacienta závisí na velikosti tumorózní masy, rychlosti progrese a senzitivitě na chemoterapii (Mayer et al., 2002). Z důvodu již zmíněné vysoké variability této nemoci je proto nutné rozdělit pacienty právě podle jejich prognózy a podle toho pro ně vybrat vhodnou terapii. Mezi prognostické faktory patří nejen klinické zhodnocení stavu pacienta, ale i biochemické a cytogenetické markery. 20
Klinické stadium Klasifikace stupně pokročilosti choroby a velikosti masy maligních buněk je definována na základě rozdělení, které nezávisle publikovali Rai a Binet. Rai et al. (1975) vytvořil podle klinických nálezů u pacientů pět stadií nemoci (0 – IV) – viz Tab. II. Binet et al. (1977; 1981) později systém zjednodušil na tři stadia A, B a C – viz Tab. III. Pro zařazení pacienta do jednotlivých prognostických skupin je potřebné fyzické vyšetření (např. zvětšení mízních uzlin) a laboratorní rozbor krve (množství lymfocytů, počet krevních destiček či hladina hemoglobinu). Tabulka II: Klinická klasifikace CLL podle systému Rai (Adam et al., 2008; Mayer et al., 2002; upraveno)
Stadium
Riziko
0
Nízké
Znaky Pouze lymfocytóza v krvi a v kostní dřeni
Medián přežití (roky) 12-15
Lymfocytóza a lymfadenopatie
9
II
Lymfocytóza a splenomegalie a (nebo) hepatomegalie
5
III
Lymfocytóza a anémie, hemoglobin < 110 g/l
< 1-2
Lymfocytóza a trombocytopenie, trombocyty < 100.10 9 /1
< 1-2
I Střední
Vysoké IV
21
Tabulka III: Klinická klasifikace CLL podle systému Binet (Adam et al., 2008; Mayer et al., 2002; upraveno)
Stadium
Znaky
Medián přežití (roky)
A
Jsou splněny podmínky 1, 2 a 3: 1. počet postižených oblastí < 3 2. koncentrace hemoglobinu ≥ 100 g/l 3. počet trombocytů ≥ 100.10 9 /1
8
B
Jsou splněny podmínky 1, 2 a 3: 1. počet postižených oblastí ≥ 3 2. koncentrace hemoglobinu ≥ 100 g/l 3. počet trombocytů ≥ 100.10 9 /1
8
C
Bez ohledu na organomegalii je splněna podmínka 1 nebo obě podmínky: koncentrace hemoglobinu < 100 g/l počet trombocytů < 100.10 9 /1
2
Definice postižených oblastí: uzliny hlavy a krku a lymfatická tkáň Waldeyerova okruhu, uni- nebo bilaterální postižení axilárních uzlin, uni- nebo bilaterální postižení tříselných a povrchových femorálních uzlin, hmatná zvětšená slezina, hmatná zvětšená játra, za signifikantní adenopatii se považuje průměr uzliny > 1 cm
Biochemické markery Ke starším, ale stále platným biochemickým parametrům patří zvýšená koncentrace beta2-mikroglobulinu, zvýšená hladina tymidikinázy a zvýšená sérová hladina solubilního antigenu CD23 (Hallek et al., 2008).
MicroRNA MicroRNA jsou malé nekódující molekuly RNA, které tvoří zhruba 3-5 % všech genů v genomu. Jejich funkce zahrnuje ovlivňování stability a translace mRNA cílových strukturních genů, úlohu v buněčné diferenciaci, proliferaci a apoptóze. V mnoha studiích byla popsána aberantní exprese microRNA u různých hematologických malignit. U některých microRNA podílejících se na regulaci buněčného cyklu a apoptózy byla prokázána jejich role v patogenezi CLL (Mraz et al., 2009). Analýzu exprese microRNA lze užít k rozlišení pacientů dle statusu IGHV a exprese ZAP-70 (zeta asociovaný protein, 70 kD). Deregulaci microRNA lze také asociovat s mnohými dalšími prognostickými
22
faktory a progresí onemocnění, a je pravděpodobné, že některé z nich se stanou novými klinickými markery (Pospíšilová et al., 2013). Mutační status IGHV Určení mutačního stavu variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinového genu (IGHV) patří dnes, i přes časovou a metodickou náročnost, k základnímu diagnostickému vyšetření CLL pacientů. Mutační stav IGHV determinuje dva zcela prognosticky odlišné subtypy CLL (Hamblin et al., 1999). Pacienti s nemutovaným lokusem (bez somatických hypermutací v IGHV) mají nepříznivou prognózu, se střední dobou přežití přibližně 8 let, zatímco CLL s mutovaným IGHV lokusem má podstatně lepší prognózu s mediánem přežití přibližně 25 let. Srovnávající křivky přežití pacientů s mutovaným a nemutovaným genem pro IGHV jsou zobrazeny na Obr. 3. Somatické hypermutace v IGHV se fyziologicky odehrávají u B-lymfocytů v germinálních centrech. Otázka, zjevné rozdílnosti obou subtypů CLL ve vztahu k průchodu germinálními centry, není stále dostatečně objasněna. Pokusy nalézt vhodný náhradní marker IGHV statusu, jehož detekce by nebyla tak náročná, vedly k zavedení měření exprese intracelulárního proteinu ZAP-70 a exprese molekuly CD38, jejichž podstatnou výhodou je možnost jejich stanovení pomocí průtokové cytometrie, která je základní metodikou v určení samotné diagnózy CLL. Jejich zvýšená exprese je asociována s agresivnějším klinickým průběhem, celkově horší prognózou a kratší dobou přežití.
Obr. 3: Kaplan-Meierovy křivky přežití srovnávající pacienty s mutovaným a nemutovaným genem pro IGHV převzato a upraveno z Hamblin et al., 1999
23
Cytogenetické aberace Fluorescenční in situ hybridizace umožňuje detekci chromozomálních aberací v nedělících se buňkách. A právě díky této metodě může být detekováno portfolio čtyř základních genomických aberací spojovaných s CLL, přičemž alespoň jedna z těchto abnormalit se vyskytuje až u 80 % pacientů. Přítomnost těchto genetických abnormalit v době stanovení diagnózy nebo v průběhu onemocnění má důležitou prognostickou hodnotu – koreluje s pravděpodobností přežití a může pomoci v predikci rezistence na léčbu (Bertilaccio et al., 2010). Nejčastějšími chromozomálními abnormalitami CLL jsou delece 13q u přibližně 55 % případů, delece 11q u 12 %, delece 17p u 8 % a trizomie chromozomu 12 u 15 % případů CLL (Bertilaccio et al., 2010). Cytogenetický nález je spojen s rychlostí progrese onemocnění a celkovým časem přežití CLL pacientů, což vedlo k vytvoření hierarchické klasifikace chromozomálních aberací podle jejich vlivu na prognózu pacienta, kterou publikoval Döhner et al. (2000) – zatímco např. medián přežití u pacientů s delecí 17p a 11q je nízký (32 a 72 měsíců), pacienti s delecí 13q mají excelentní prognózu s mediánem přežití 133 měsíců. Prognostický význam cytogenetiky je zobrazen pomocí Kaplan-Meierových křivek přežití na Obr. 4.
Obr. 4: Kaplan-Meierovy křivky přežití srovnávající pacienty s jednotlivými cytogenetickými aberacemi převzato a upraveno z http://www.nature.com/nrclinonc/journal/v8/n1/images/nrclinonc.2010.167-f2.jpg 14.9.2014; Döhner et al., 2000
24
Delece 13q14 je nejčastější chromozomální aberace u CLL pacientů, která je přítomna ve většině případů. Na rozdíl od ostatních opakujících se aberací může být heterozygotní nebo (méně často) homozygotní. V případě jejího výskytu jako jediné abnormality předpovídá nejdelší dobu přežití, a to dokonce delší než u pacientů s normálním karyotypem (Döhner et al., 2000). Významný pokrok v desítky let trvající snaze definovat klíčový gen v oblasti 13q14 a charakterizovat tak aberaci podílející se na patogenezi CLL učinili Calin et al. (2005), kteří ukázali, že delece 13q14 je spojena se sníženou expresí microRNA miR-15a a miR-16-1, které regulují expresi antiapoptotického proteinu Bcl-2. Další nejčastější aberací CLL je trizomie chromozomu 12 (10-20 %) (Zenz et al., 2011). Pacienti s touto aberací mají podobný medián přežití jako ti s normálním karyotypem. Trizomie 12 je spojena s atypickou morfologií a imunofenotypem (Adam et al., 2008), ale potenciální geny zapojené do patogeneze CLL ve spojitosti s trizomií 12 nejsou zatím známé (Zenz et al., 2011). Asi jedna pětina pacientů s indikací léčby vykazuje deleci 11q. Pacienti s touto delecí mají rychlejší progresi onemocnění, kratší medián přežití a rozsáhlé lymfadenopatie. Oblast 11q22-23 obsahuje gen ATM (z angl. ataxia telangiectasia mutated). Kináza ATM reaguje na poškození buněčné DNA, a proto jsou často pacienti s touto aberací refrakterní na některé typy terapie, založené právě na poškození DNA a následné indukci apoptózy. Delece úseku 17p13, který zahrnuje gen TP53, se nachází ve 3-8 % případů CLL v době stanovení diagnózy / v první linii léčby, ačkoli u refrakterních typů CLL může výskyt dosáhnout až 30 %. Tato delece, související se ztrátou nádorového supresoru p53, je spojována s nízkým počtem léčebných odpovědí, krátkým přežitím a celkově velmi špatnou prognózou. Delece 17p není charakteristikou pouze pro CLL, ale je také opakující se aberací u jiných typů nádorů (Zenz et al., 2011). Ačkoli byly aberace v genech ATM a TP53 považovány za vzájemně se vylučující, v práci Malčíkové et al. (2009) byla pozorována přítomnost delece genu ATM současně s monoalelickou inaktivací genu TP53. Tato společná inaktivace by mohla být výsledkem selekčního tlaku v CLL buňkách, který má vliv na jistou společnou aktivitu proteinu p53 a ATM. V případě bialelické inaktivace TP53 byla četnost delece ATM podstatně menší, což ukazuje na vzájemně se vylučující selekci defektů v genech ATM a TP53 v průběhu nemoci.
25
Mutace ATM V oblasti 11q se kromě delece objevují i mutace v genu ATM, které se mohou vyskytovat buď souběžně s ní (často), nebo samostatně (spíše výjimečně). Bylo prokázáno, že mutace genu ATM se vyskytují u 12 % pacientů s CLL a u 30 % pacientů s delecí 11q (Austen et al., 2005; Austen et al., 2007). Tyto mutace mohou být buď zárodečné (u malé části mutovaných pacientů) nebo somatické, tedy vzniklé až v populaci B-lymfocytů. Austen et al. (2007) uvádějí, že samotná delece oblasti 11q22-23 nevede k inaktivaci proteinu ATM a že tato delece je asi u třetiny pacientů CLL spojena s mutací druhé alely genu ATM. Obě inaktivované alely (delece a mutace nebo dvě mutace) vedou k nefunkčnímu proteinu, což způsobuje celkově horší prognózu. Úloha jiných genů v oblasti 11q22-23 zůstává zatím nevyřešena, prokázán však byl efekt dávky genů (gene dosage effect) ležících v deletované oblasti (Zenz et al., 2011).
Mutace TP53 Dalšími nezávislými prognostickými faktory asociovanými s nepříznivým vlivem na průběh nemoci, slabou léčebnou odpovědí a celkovým přežitím pacientů, jsou mutace v genu TP53 (Rossi et al., 2009; Malcikova et al., 2009). Na rozdíl od ostatních nádorových supresorů vykazuje gen TP53 neobvyklou škálu mutací, které tvoří ve více než 75 % případů bodové (missense) alterace, které vedou k záměně aminokyselin a tvorbě proteinu se změněnými vlastnostmi. Tyto identifikované záměnové substituce by se měly vždy ověřovat v databázi z hlediska jejich závažnosti ohledně klinického dopadu, zatímco jiné mutace TP53 mají zřetelný vliv i bez této analýzy (např. nonsense a frameshift mutace odstraňující DNA vazebnou doménu) (Trbusek and Malcikova, 2013). Je potřeba zdůraznit, že selekce mutací je urychlována léčbou a nedochází k ní pouze během spontánní mutageneze. Podle doporučení organizace ERIC (European Research Initiative on CLL) by měla být proto analýza mutací zahrnuta do rutinní diagnostiky CLL (Pospisilova et al., 2012). Zatímco posouzení přítomnosti delece 17p13 je relativně snadné, citlivé a poskytuje kvantitativní informaci o podílu zasažených buněk, vyšetření genetických mutací TP53 je komplikovanější a dosud nebyl stanoven žádný standardizovaný postup (Trbusek and Malcikova, 2013).
26
Další prognostické markery Po velmi krátké stagnaci ve výzkumu mutageneze na poli CLL se pomocí technologie sekvenování nové generace podařilo identifikovat několik dalších genů, které jsou rekurentně mutovány u pacientů s CLL. Mezi nejvýznamnější geny, u kterých byl již prokázán negativní prognostický význam jejich mutací, patří NOTCH1, BIRC3 a MYD88. NOTCH1 kóduje transmembránový protein I. třídy, který slouží jako ligandem aktivovaný transkripční faktor regulující buněčnou diferenciaci, proliferaci a apoptózu (Martínez-Trillos et al., 2013). BIRC3 funguje jako inhibitor nekanonické dráhy skupiny transkripčních faktorů NFκB, které se váží na promotory RNA polymerázy II a ovlivňují tak expresi genů důležitých pro imunitu, buněčný růst, zánětlivou odpověď a apoptózu. Protein MYD88 je kritický adaptor signální dráhy toll-like receptorů (TLR), vyskytujících se na povrchu cytoplazmatických membrán a schopných rozeznávat cizí, a tedy potenciálně nebezpečné struktury. Dalším nově identifikovaným genem je gen SF3B1 (sestřihový faktor 3 podjednotka 1), jehož rekurentní mutace se vyskytují u více jak 15 % CLL pacientů.
4. SF3B1 (SESTŘIHOVÝ FAKTOR 3 PODJEDNOTKA 1) Nástup sekvenování nové generace znamenal zásadní mezník pro pochopení molekulárních základů nádorového onemocnění, včetně krevních malignit. Jedním z nejvíce překvapujících nálezů u CLL byl objev mutované podjednotky 1 sestřihového faktoru 3 (SF3B1). SF3B1 mutace byly identifikovány zejména u myelodysplastického syndromu (30 % pacientů) (Cazzola et al., 2013), ale také u CLL zaujímají nemalých 15 % pacientů. Tyto mutace byly zjištěny i u jiných myeloidních hematopoietický malignit a u 1-5 % jedinců s některými typy solidních tumorů, jakožto i u četných rakovinných linií různého původu (Hahn and Scott, 2011). U CLL jsou mutace SF3B1 asociovány s větší progresivitou nemoci a s kratší dobou přežití. Ačkoli příčinná souvislost mezi mutacemi SF3B1 a patogenezí CLL zůstává nejasná, z několika důkazů vyplývá spojitost těchto mutací s genomovou stabilitou a epigenetickými modifikacemi (Wan and Wu, 2013).
27
4.1 SETŘIH (SPLICING) Spliceozomální
(sestřihové)
mutace
reprezentují
novou
generaci
získaných
genetických změn. Tyto mutace mohou vést ke špatnému sestavení spliceozomálního aparátu, deregulaci celkového sestřihu mRNA, změnám v exportu transkriptů mezi jádrem a cytoplazmou či změně exprese některých genů (Damm et al., 2012). SF3B1, který můžeme v literatuře najít i pod názvy SAP155 či SF3B155, je kritickou komponentou sestřihového aparátu. Sestřih pre-mRNA (prekurzorové mediátorové RNA) definuje proces, pomocí kterého jsou z primárního transkriptu odstraňovány nekódující sekvence (introny). Jedná se o rozhodující post-transkripční proces zajišťující integritu, rozmanitost a přesnost konečného bílkovinného produktu. Sestřih pre-mRNA je katalyzován spliceosomem, makromolekulou skládající se z 5 malých jaderných RNA (small nuclear RNA, snRNAs), které jsou spojeny s proteiny, se kterými vytváří částice nazývané malé jaderné ribonukleoproteiny (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) (Cazzola et al., 2013). U většiny eukaryot, včetně člověka, existují dvě třídy intronů: hlavní typ U2, který představuje více než 99 % lidských intronů, a vedlejší typ U12. Odstraňování těchto dvou typů intronů je pak katalyzováno dvěma různými spliceosomy – tzv. U2- a U12dependentními spliceosomy, lišícími se složením snRNA, ale sdílejících většinu proteinů. Schematické znázornění sestřihu pre-mRNA je zobrazeno na Obr. 5.
Obr. 5: Schematické znázornění sestřihu prekurzorové mRNA (pre-mRNA) převzato a upraveno z Cazzola et al., 2013
28
Ke skládání spliceosomu dochází opakovaně na každou novou pre-mRNA, která obsahuje specifické sekvence řídící a regulující tento proces. Rozhodující signální sekvence nezbytné pro dvě transesterifikační reakce, kterými je sestřih zprostředkován, jsou donorové místo sestřihu (5´ konec), tzv. větvící místo (blízko 3´ konce) a akceptorové místo sestřihu (3´ konec intronu) (Obr. 5). V hlavním U2 dependentním spliceosomu je donorové místo rozpoznáváno U1 snRNP, zatímco větvící místo je rozpoznáváno U2 snRNP. Do proteinů, které interagují s U1 a U2 snRNAs v počáteční fázi intronového rozpoznávání a formování spliceosomu patří mimo jiné (SRSF2, U2AF1, ZRSR2, U2AF65, SF1, SF3A1, PRPF40B) i SF3B1. Protein SF3B1 je hlavní složkou spliceozomální U2 snRNP, která je dále formována z proteinu SF3A a jednotky 12S RNA. SF3B1 umožňuje vazbu na větvící bod blízko 3´ sestřihového místa a páruje se s intronovou RNA. Hlavní funkcí tohoto komplexu je zabránit nevhodnému nukleofilnímu ataku dalšími složkami spliceosomu před počáteční transesterifikační reakcí (Visconte et al., 2012).
4.2 SF3B1 Sestřihový faktor 3B podjednotka 1 je protein, který je kódován stejnojmenným genem. Gen SF3B1 obsahuje 25 exonů, je lokalizován na chromozomu 2 v oblasti q33.1 a jeho velikost je zhruba 43 kb. Protein SF3B1 je součástí proteinového komplexu SF3B (Obr. 6), což je 450 kDa multiproteinový komplex složený z podjednotek SF3B1, SF3B2, SF3B3, SF3B4, SF3B5, SF3B14 (pre-mRNA větvící místo proteinu p14) a PHF5A (PHD finger-like doména obsahující protein 5A) (Visconte et al., 2012). Největší z těchto podjednotek je právě SF3B1 o velikosti 150 kDa. SF3B1 je vysoce konzervovaný protein, který se podílí jak na hlavním, tak vedlejším sestřihu. SF3B1 se skládá ze dvou oblastí: Nterminální domény (NTD, aminokyseliny 1-430) a C-konce (aminokyseliny 431-1304) (Cass and Berglund, 2006). C-konec SF3B1 je vysoce konzervativní a skládá se z 22 tzv. HEAT repetic (Huntingtin, elongační faktor 3 (EF3), protein fosfatasa 2A (PP2A), kvasinková kinasa TOR1). HEAT repetice obsahují 37-47 aminokyselinových zbytků utvářejících dva antiparalelní α-helixy a dvě otáčky s konzervovanými zbytky argininu a kyseliny asparagové a krátkými flexibilními spojeními mezi repeticemi. Tyto repetice zprostředkovávající protein-proteinové interakce různých proteinů jsou důležité především pro buněčnou signalizaci, jaderno-cytoplazmatický transport a mRNA translaci (Bonnal et al., 2012). Pomocí kryo-elektronové mikroskopie bylo zjištěno, že SF3B1 HEAT repetice svírají jádro SF3B komplexu, které obsahuje větvící místo interagující s proteinem p14 (Golas et al., 2003). Proto je možné, že SF3B1 mutace mění vlastnosti větvícího místa 29
rozpoznáním SF3B komplexu (Bonnal et al., 2012). N-terminální doména SF3B1 je méně konzervativní než C-terminální oblast a obsahuje vazebná místa pro faktory asociované se sestřihem U2AF65, p14 a cyklin E (Cass and Berglund, 2006). N-terminální doména SF3B1 je protáhlá, částečně nestrukturovaná molekula. Tato strukturální elasticita je důležitá pro mnoho interakcí této domény při skládání a katalýze spliceosomu. Studie RNA vazeb ukazují, že N-terminální doména SF3B1 váže RNA nespecificky, a že zaujímá především rozvinutou strukturu, která funguje jako lešení pro usnadnění interakcí proteinprotein a protein-RNA (Cass and Berglund, 2006).
Obr. 6: Dva oddělené pohledy (rotace 90° kolem vertikální osy) komplexu SF3B převzato a upraveno z Golas et al., 2003
4.3 SF3B1 A CLL Mutace v SF3B1 jsou detekovány u pacientů s pokročilejším stádiem CLL a s nežádoucími biologickými vlastnostmi jako je např. zvýšený β-mikroglobulin a nemutovaný gen IGHV (Martínez-Trillos et al., 2013). V některých studiích jsou SF3B1 mutace asociovány s delecí chromozomální oblasti 11q22 a ATM mutacemi, stejně tak jako s horší prognózou a rezistencí na fludarabin (Wang et al., 2011; Quesada et al., 2011). Nejvíce mutací SF3B1 u CLL je detekováno mezi pátou a osmou HEAT repeticí, které jsou kódovány exony 14-16. Mutace SF3B1 jsou téměř vždy zastoupeny missense substitucemi v těchto hot-spot exonech, v nichž nejčastější mutovaná místa jsou K700 (v cca 50 % zjištěných případů), G742 (19 %), K666 (12 %) a H662 (4 %) (Wan and Wu, 2013). V současné době jsou funkční dopady mutací v genu SF3B1 u CLL pacientů podrobně zkoumány. Zjištění, že SF3B1 mutace u CLL jsou převážně missense substituce cílené na vysoce konzervované sekvence proteinu vede k hypotéze, že jsou tyto mutace selektovány 30
pro modifikaci interakcí mezi SF3B1 a ostatními proteiny spliceozomálního komplexu, spíše než pro narušení celkové funkčnosti SF3B1 (Rossi, Fangazio and Gaidano, 2012; Foà et al. 2013).
31
5. C ÍLE PRÁCE Stanovení optimálních podmínek mutační analýzy genu SF3B1 Stanovení optimálních podmínek westernového přenosu pro protein SF3B1 Analýza mutací v genu SF3B1 pomocí metody Sangerova sekvenování u vzorků pacientů s CLL Analýza proteinové hladiny proteinu SF3B1 u CLL pacientů pomocí westernového přenosu Vyhodnocení celkových výsledků mutačního screeningu genu SF3B1 na pracovišti ve vztahu k molekulárně cytogenetickým datům pacientů
32
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
6. M ATERIÁL A METODY 6.1 BIOLOGICKÝ MATERIÁL Biologickým materiálem používaným pro tuto diplomovou práci byla periferní krev od pacientů s CLL léčených na Interní hematologické a onkologické klinice Fakultní nemocnice Brno. Všichni pacienti poskytli informovaný souhlas s genetickým vyšetřením. Část vzorků pro analýzu byla vybrána na základě předchozí znalosti mutačního stavu genu SF3B1. Konkrétně se jednalo o vzorky od 32 pacientů, u kterých byla již dříve na pracovišti provedena mutační analýza hot-spot exonů 14-16; u těchto vzorků byla v rámci diplomové práce provedena mutační analýza celého genu, tj. 25 exonů s cílem (a) ověřit již dříve identifikované mutace a (b) nalézt případné další mutace mimo hot-spot exony. V druhé části diplomové práce pak byla provedena mutační analýza hot-spot exonů od dalších 48 pacientů, bez předchozí znalosti mutačního stavu SF3B1. Pro optimalizaci westernového přenosu proteinu SF3B1 byla použita buněčná linie RAJI, získaná z Německé sbírky mikroorganismů a tkáňových kultur (DSMZ). Následující informace o této buněčné linii jsou převzaty z oficiálních stránek DSMZ.
RAJI Označení podle DSMZ: ACC 319 Druh: člověk (Homo sapiens) Typ buněk: Burkittův lymfom Původ: Založená v roku 1963 z levé maxily 12 letého afrického chlapce s Burkittovým lymfomem. Jde o první stálou lidskou hematopoietickou buněčnou linii. Buňky nesou translokaci t(8;14) vedoucí k fúznímu genu MYC-IGH. Bezpečnostní stupeň: 1
6.2 PŘÍSTROJE Kromě běžně dostupného laboratorního vybavení byly použity i následující přístroje:
NanoDrop: ND-1000 Spektrofotometr; Thermo Scientific
C1000 Touch® amplifikátor; Bio-Rad
chlazená centrifuga: Rotanta 460R; Hettich Zentrifugen
sekvenátor: ABI 3130xl Genetic Analyzer; Applied Biosystems
centrifuga: MiniSpin® plus; Eppendorf 34
spektrofotometr: Bio Photometer; Eppendorf
suchý termoblok: DRI-BLOCK® DB-2D; Techne
elektroforetická aparatura pro SDS-PAGE: Mini-Protean II Cell; Bio-Rad
western blotting: Trans-Blot SD, Semi Dry Transfer Cell; Bio-Rad Mini Trans-Blot® Cell; Bio-Rad
6.3 CHEMIKÁLIE Chemikálie jsou popsány u jednotlivých metodických postupů. Většina z běžných chemikálií pocházela od firem LachNer, Serva a Sigma-Aldrich.
6.4 IDENTIFIKACE
MUTACÍ
V GENU
SF3B1
POMOCÍ
SANGEROVA SEKVENOVÁNÍ Identifikace mutací v genu je založeno na vyhledávání rozdílů v sekvenci DNA oproti kontrolní DNA. Určení pořadí nukleotidů se nejčastěji provádí na principu tzv. Sangerova sekvenování (též dideoxynukleotidová terminační reakce). 6.4.1 Izolace DNA a stanovení její koncentrace Izolace DNA je purifikační proces získávání DNA ze zkoumaného vzorku za pomoci fyzikálních a chemických metod. Podstatou těchto metod je získání čisté DNA bez příměsí, kterými mohou být proteiny, tuky či jiné nukleové kyseliny. Použité chemikálie DNeasy® Blood & Tissue Kit; Qiagen sterilní voda
Postup Izolace celkové genomové DNA byla prováděna pracovníky Centra molekulární biologie a genové terapie ze zamražených lymfocytů CLL pomocí kitu DNeasy Blood & Tissue Kit dle pokynů výrobce. Následovalo stanovení její koncentrace na přístroji NanoDrop (Thermo Scientific). Ze získané DNA bylo na měření použito 1,5 μl, blankem byla sterilní voda. Kvalita DNA je posuzována podle hodnot poměrů absorbancí při vlnových délkách 260/280 nm a 260/230 nm, které ukazují případnou kontaminaci jinou nukleovou kyselinou, proteiny či chemikáliemi použitými při izolaci. 35
6.4.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR je metoda, která umožňuje získat prakticky neomezené množství kopií specifického úseku DNA na základě jediné templátové kopie. Amplifikovaný genový úsek je vymezen dvojicí primerů (krátké oligonukleotidové segmenty) o velikosti 15-30 nukleotidů, z nichž každý je komplementární k sekvenci na protilehlých řetězcích úseku cílového genu. Primery slouží jako startující místa pro exponenciální replikaci DNA, která je katalyzovaná enzymem DNA polymerázou. Při samotné PCR je dvouřetězcová DNA nejprve teplotně denaturována (94-98 ºC) na jednořetězcovou formu. Reakční směs je v druhém kroku ochlazena na teplotu, při které primery nasedají na své komplementární cílové sekvence (při teplotách v rozmezí 55-65 ºC dle jejich délky a podílu CG-párů) a úsek templátové DNA mezi primery je dále syntetizován DNA polymerázou (72 ºC). Produkty amplifikace z prvního cyklu PCR slouží jako templáty v dalších cyklech amplifikace, která probíhá za stejných podmínek, a proto každý následující cyklus teoreticky zdvojnásobí množství požadovaného DNA produktu. Hlavním produktem PCR je dvouřetězcová DNA, definovaná na 5´-konci a 3 ´-konci oligonukleotidovým primerem, jejíž délka odpovídá vzdálenosti obou primerů. Použité chemikálie genomová DNA primery; Generi Biotech polymeráza HotStarTaq; Qiagen 10x PCR pufr; Qiagen dNTP mix; Thermo Scientific sterilní voda
Postup Amplifikace 25 exonů genu SF3B1 probíhala pomocí primerů navržených v Centru molekulární biologie a genové terapie (syntéza firmou Generi Biotech) v amplifikátoru C1000
Touch®
(Bio-Rad).
V následujících
tabulkách
jsou
uvedeny
rozpisy
připravovaného master mixu na jednu reakci s 20 ng DNA (Tab. IV) a charakteristika primerů pro PCR a sekvenační PCR (Tab. V). Teplotní protokoly pro jednotlivé primery exonů byly optimalizovány a jsou uvedeny v kapitole 7.1.1.
36
Tabulka IV: Chemikálie a objemy použité na přípravu master mixu jedné reakce PCR Chemikálie 10x PCR pufr 10 mM dNTPs mix 10 mM primer F daného exonu 10 mM primer R daného exonu HotStarTaq polymeráza genomová DNA o koncentraci 20 ng/μl sterilní voda
μl/1 reakci 1 0,2 0,2 0,2 0,052 1 doplněno do objemu 10 μl
Tabulka V: Charakteristika primerů pro PCR a sekvenační PCR Název
Sekvence
TGCATTGTGTTGGGAGTTCTTTTG SF3B1_1F TCCAGATTAAACCAGATGGCTGC SF3B1_1R GAATCTTTGCATATTCTTTC SF3B1_2F AGACATTCACTTTTCTTTAGC SF3B1_2R GTGCTTTATGGTGTTCTGATTTTTG SF3B1_3F CAAAGGGCTAAAGACAACTTAATAC SF3B1_3R CTAGTCATAGTTATTTGTAGTCAGG SF3B1_4F CTGATTTATCTGCCCTGCTC SF3B1_4R GAGCAGGGCAGATAAATCAGTTG SF3B1_5F AGAAACCTAACAGTCTCTCAATCAC SF3B1_5R GGATGTTAAGTGGAAGTGATTGCG SF3B1_6F TGGCAACCCAAGCAGACTAATAC SF3B1_6R ATTATTTCTGTGTGGGTGTGTG SF3B1_7F ACATATCACTCAACATTTCACCC SF3B1_7R GTTTTGAGTATAACTGTTTGAG SF3B1_8F TTAATAGTACACAGAATACCAC SF3B1_8R GGATTGATCTTAACTGTCTTTTATC SF3B1_9F TATCCTAAATACCACCTCATTC SF3B1_9R AAGAAAATCCTAAACTGTCT SF3B1_10-11F CTGTCTCTACAAAAACTACAA SF3B1_10-11R ATAAAGAAACCACACCTATTAC SF3B1_12F GGAAAAGGTCTAGGAGAATATG SF3B1_12R CTTCTTCTCTTTTCTCTTTTTC SF3B1_13-14F AGTTACATTACAACTTACCA SF3B1_13-14R GTTGGGGCATAGTTAAAACCTG SF3B1_15-16F SF3B1_15-16R GAACCATGAAACATATCCAGTTTAC TCACGTAATCAGCAATGAGTAT SF3B1_17F GACTAAAGAATGAGTTGAAAGGAC SF3B1_17R CTTGGAAAAGCAGTCTAAAAGG SF3B1_18F TTAAAGTTAGTAGCAATGTGCC SF3B1_18R
Délka 24 23 20 21 25 25 25 20 23 25 24 23 22 23 22 22 25 22 20 21 22 22 22 20 22 25 22 24 22 22
Amplifikovaná oblast exon 1 exon 2 exon 3 exon 4 exon 5 exon 6 exon 7 exon 8 exon 9 exon 10-11 exon 12 exon 13-14 exon 14-15 exon 16-17 exon 18
Délka produktu 323 323 234 234 272 272 411 411 238 238 335 335 335 335 382 382 248 248 512 512 312 312 522 522 474 474 257 257 308 308
37
SF3B1_19F SF3B1_19R SF3B1_20-21F SF3B1_20-21R SF3B1_22F SF3B1_22R SF3B1_23F SF3B1_23R SF3B1_24F SF3B1_24R SF3B1_25F SF3B1_25R
GGTGGTTAGAAAAGGTTGACTC TAACAAAAACCTCCCAACTCC ATTGCTAAGTAAAAGGAAAGTG TTTGAAAATTGATACTGCTT CATGTTTTTAGAACTGAATTTGC ATTTTCCAATACCACAATGC ACAGCTTGTTGACCCATTTG TCACGATGTTCTAAAATGAAGGAAG AAGACCGCATCTTAAAGGAC TTCAGCACAAGTATCCCAGAAC TTGAAATAATGTAACCGTTC CAAGTTTAAGGTGTGAAGTAG
22 21 22 20 23 20 20 25 20 22 20 21
exon 19 exon 20-21 exon 22 exon 23 exon 24 exon 25
573 573 241 241 284 284 368 368 336 336 242 242
6.4.3 Přečištění produktu PCR Purifikací PCR produktu jsou odstraňovány zbylé primery a neinkorporované nukleotidy (dNTP). To je velmi důležité pro následnou sekvenční reakci, kde koncentrace nukleotidů musí být vybalancována vzhledem k ostatním složkám, především fluorescenčně značeným nukleotidům (ddNTP). Použité chemikálie produkt PCR Exo I (Exonuclease I); Thermo Scientific FastAP (Thermosensitive alkaline phosphatase); Thermo Scientific
Postup Na přečištění získaných produktů PCR byla použita směs Exo I a FastAP. V prvním kroku byly smíchány tyto chemikálie v poměru 1 : 2 (ExoI : FastAP) a následně bylo 1,5 µl této směsi přidáno k PCR produktu. Přečištění probíhalo v cycleru C1000 Touch® (Bio-Rad) za použití následujícího teplotního protokolu: 15 min - 37 °C; 15 min - 85 °C; ∞ min - 4 °C.
6.4.4 Sekvenační PCR Při Sangerově metodě je DNA ve formě produktu PCR, jehož sekvence má být stanovena, použita jako matrice pro syntézu komplementárních řetězců různé délky pomocí DNA polymerázy. Syntéza řetězce na matricové DNA je zahájena od místa, ke kterému je připojen sekvenační primer a ukončena v místě, v němž je do rostoucího řetězce 38
inkorporován
místo
normálního
deoxynukleotidtrifosfátu
(dNTP)
jeho
analog
dideoxynukleotidtrifosfát (ddNTP), který postrádá 3´-OH skupinu. ddNTP po začlenění do rostoucího řetězce DNA funguje jako terminátor syntézy DNA, neboť DNA polymeráza k němu nemůže v důsledku nepřítomnosti 3´-OH skupiny připojit další nukleotid. V současnosti jsou ddNTP fluorescenčně značeny a po proběhnutí polymerizační reakce jsou vytvořené produkty denaturovány a emise čtyř různých fluorescenčních barev laserově detekovány. Použité chemikálie přečištěný PCR produkt primery; Generi Biotech BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit; Applied Biosystems sterilní voda
Postup Sekvenační reakce byla připravená pomocí komerční sady BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit podle schématu uvedeném v Tab. VI. Tyto reakce byly připraveny ve dvou sadách – jedna s primerem F a druhá s primerem R, jejichž charakteristiky jsou uvedeny v Tab. V. Reakce probíhaly v cycleru C1000 Touch® (Bio-Rad) za podmínek uvedených v Tab. VII. Tabulka VI: Chemikálie a objemy použité na přípravu jedné sekvenační reakce Chemikálie TRRM (Termination Ready Reaction Mix) 5 x Sequencing Buffer 10 mM primer F/R daného exonu přečištěný PCR produkt sterilní voda
μl/1 reakci 2 1 0,5 2 doplněno do objemu 10 μl
Tabulka VII: Teplotní profil sekvenační reakce Cyklus č. 1
Počet opakování 1
2
24
3
1
Teplota (°C) 96 96 50 60 10 4
Čas (min) 1:00 0:30 0:15 4:00 10:00 ∞
39
6.4.5 Přečištění sekvenčního produktu Před vlastní analýzou na sekvenátoru musí být sekvenační produkt purifikován pro odstranění nežádoucích zbytků reakce. Použité chemikálie produkt sekvenační reakce Sephadex G-50 Superfine; GE Healthcare formamid; Applied Biosystems sterilní voda
Postup Pro přečistění produktů sekvenační reakce byla použita gelová chromatografie za použití Sephadexu. Sephadex ve formě prášku byl smíchán se sterilní vodou v množství 6 g/100 ml vody pro „nabobtnání“ gelu. Pro vytvoření homogenního gelu byla nutná doba bobtnání 3 hodiny za občasného promíchávání. Následně byla sestavena aparatura a gel hadovitě pipetován v množství 250 µl do příslušného počtu jamek desky, která byla zcentrifugována na centrifuze Rotanta 460R (Hettich Zentrifugen) po dobu 5 minut při 2340 RPM za laboratorní teploty. Z odpadní destičky byla vylita voda a celý postup byl zopakován. Deska s vytvořenou gelovou vrstvou byla následně přenesena na sběrnou sekvenační desku. Do středu gelové vrstvy bylo opatrně naneseno 10 µl sekvenačního produktu. Následovala centrifugace za stejných podmínek jako v předešlých krocích. K eluátu ve sběrné sekvenační desce byl poté přidán formamid v poměru 1 : 1 a přečištěný produkt sekvenační reakce byl uchovaný při -20 ºC.
6.4.6 Sekvenační analýza Sekvenační analýza byla provedena pracovníkem Centra molekulární biologie a genové terapie na automatickém sekvenátoru 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) pracujícím na principu Sangerova sekvenování. Vyhodnocení bylo provedeno pomocí programu Sequencing Analysis v5.4 (Applied Biosystems) a Geneious 4.8.2.
40
6.5 STANOVENÍ
PROTEINOVÉ
HLADINY
PROTEINU
SF3B1
POMOCÍ WESTERNOVÉHO PŘENOSU Westernový přenos, označovaný taktéž jako imunoblot či western blot, je metoda pro detekci specifických proteinů separovaných elektroforézou, což zároveň poskytuje informaci o velikosti stanovovaného proteinu. Proteiny izolované z tkáně nebo z buněk (proteinový lyzát) jsou nejprve rozděleny polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE), následně přeneseny z gelu na povrch membrány, kde jsou poté detekovány specifickými protilátkami. 6.5.1 Příprava vzorků pro Western Blotting 6.5.1.1 Příprava proteinového lyzátu Použité chemikálie médium RPMI-1640; Sigma-Aldrich lyzační pufr:
150 mM NaCl 1 % NP-40 50 mM Tris (pH = 8,0) 50 mM NaF 5 mM EDTA (pH = 8,0)
inhibitor proteáz; Sigma-Aldrich inhibitor fosfatáz; Sigma-Aldrich
Postup Proteinové lyzáty byly připravovány z buněčné linie RAJI a z buněk pacientů CLL. Zamražené buněčné suspenze, uchovávané v tekutém dusíku, byly nejprve rozmraženy – ampule byly rozpuštěny pod proudem studené vody a obsah byl přenesen do sterilní 10 ml zkumavky, do které bylo po kapkách přidáno 5 ml čistého studeného média RPMI-1640. Následně byla tato suspenze centrifugována při 1200 RPM po dobu 5 minut, bylo odsáto médium a pelet byl rozsuspendovaný v 5 ml média s 10% fetálním bovinním sérem (FBS). Buněčná suspenze byla přenesena do kultivační láhve a kultivována za standardních podmínek při 37 ºC v 5 % CO2. Takto připravené buněčné kultury byly zkontrolovány pod mikroskopem, přeneseny do 50 ml zkumavek a centrifugovány při 1200 RPM po dobu 10 min. Následně byl pelet přenesen do vychlazené 1,5 ml zkumavky a rozsuspendován v lyzační směsi, která byla připravena bezprostředně před použitím smícháním lyzačního pufru s inhibitory proteáz a fosfatáz přidanými v poměru 1 : 100. Lyzát byl inkubován 41
30 min na ledu při 4 ºC. A po této inkubaci byl lyzát centrifugován 30 min při 13 000 RPM a 4 ºC. Supernatant byl poté přenesen do čisté zkumavky a zamražen na -80 ºC.
6.5.1.2 Reakce podle Bradfordové U připravených proteinových lyzátů byla stanovena koncentrace proteinů metodou podle Bradfordové. Toto spektrofotometrické stanovení koncentrace je založeno na změně absorpčního spektra po vazbě bílkoviny na rozpustné barvivo. Nejčastěji používaným barvivem je trifenylmethanové barvivo Coomassie brilliant blue G250. Reakce probíhá v kyselém prostředí a absorpční spektrum se posouvá z absorpčního maxima barviva 480 nm na 595 nm. Absorbance měřená při 595 nm proti roztoku činidla je pak úměrná koncentraci proteinu. Použité chemikálie proteinový lyzát Bio-Rad Protein Assay; Bio-Rad redestilovaná voda (MilliQ) hovězí sérový albumin (BSA); MP Biomedicals Postup V prvním kroku bylo v 1,5 ml zkumavce smícháno 800 µl MilliQ vody s 200 µl roztoku Bio-Rad Protein Assay a 1 µl lyzátu. Tato směs byla promíchána a inkubována 10 min za laboratorní teploty. Následně bylo 150 µl směsi přeneseno do plastové UVkyvety, ve které probíhalo měření absorbance při vlnové délce 595 nm pomocí spektrofotometru Bio Photometer (Eppendorf). Výsledná hodnota absorbance byla vložena do vzorce pro výpočet koncentrace proteinů v lyzátu (c
), který je odvozen od
kalibrační křivky BSA.
6.5.2 SDS-PAGE
(elektroforéza
v
polyakrylamidovém
gelu
v
přítomnosti
dodecylsíranu sodného) Při SDS-PAGE dochází k elektroforetickému dělení proteinů na základě jejich pohyblivosti v gelu, která závisí především na délce polypeptidového řetězce a molekulární hmotnosti. SDS (dodecylsíran sodný) je anionický detergent, který svou vazbou na
42
proteiny rozvolní jejich strukturu a udělí jim negativní náboj úměrný molekulové hmotnosti. Rychlost pohybu proteinů pak závisí na jejich molekulové hmotnosti. Použité chemikálie proteinový lyzát destilovaná voda roztok akrylamidu s bisakrylamidem SDS (dodecylsíran sodný) APS (persulfát amonný) TEMED (N, N, N', N' -tetramethylethylendiamin) Tris pufr:
1 M … pH = 6,8 1,5 M … pH = 8,8
1x Tris-glycinový pufr: 5 mM Tris 50 mM glycin 0,1 % SDS 1x nanášecí SDS pufr: 50 mM Tris (pH = 6,8) 2 % SDS 0,1 % bromfenolová modř 10 % glycerol dithiothreitol do výsledné koncentrace 100 mM Prestained Protein Marker Broad Range; New England BioLabs
Postup Po sestavení aparatury byl v prvním kroce připraven gel o rozměrech 9 x 7 cm a tloušťce 1 mm dle následující tabulky (Tab. VIII). Připravené proteinové lyzáty byly rozpuštěny na ledě a smíchány s nanášecím pufrem SDS v poměru 1 : 1. Lyzáty byly denaturovány 3 min při teplotě 98 ºC a následně naneseny na gel do jednotlivých jamek o celkové koncentraci 50 µg proteinů. Spolu se vzorky byl nanesen i velikostní marker (Prestained Protein Marker Broad Range), který je barevně označen a má definované molekulární hmotnosti proteinů. Elektroforéza probíhala v 1x tris-glycinovém pufru pod napětím 60-70 V pro zaostřovací gel a 120-130 V pro rozdělovací gel. Celkový čas separace proteinů byl 2,5-3 hod.
43
Tabulka VIII: Rozpis množství chemikálií použitých pro přípravu 1 zaostřovacího/ 1 rozdělovacího gelu 5 % ZAOSTŘOVACÍ ČÁST (µl) destilovaná voda roztok 30 % akrylamidu s bisakrylamidem 1 M Tris pufr (pH= 6,8) 10 % SDS 10 % APS TEMED
1400 330 250 20 20 2
8 % ROZDĚLOVACÍ ČÁST (µl) destilovaná voda roztok 30 % akrylamidu s bisakrylamidem 1,5 M Tris pufr (pH= 8,8) 10 % SDS 10 % APS TEMED
4600 2700 2500 100 100 6
6.5.3 Western blotting Pro následnou reakci s protilátkami je nutné proteiny přeblotovat na membránu – nejčastěji na nitrocelulosovou, popř. na polyvinylidenfluoridovou membránu. Proteiny mohou být z gelu na povrch membrány přeblotovány několika způsoby, ale mezi nejběžnější patří elektroforetický přenos, který je jednoduchý, rychlý, efektivní a zachovává vysoké rozlišení separace proteinů z PAGE. Elektroforetický přenos může být dále rozdělen na (1) semi-dry blotting (polosuchý přenos), při kterém gely a membrány tvoří sendvič s filtračními papíry, které jsou v přímém kontaktu s deskovými plochy elektrod a mezi těmito vrstvami se nachází pouze omezené množství blotovacího pufru a (2) wet blotting (mokrý přenos), kdy gely a membrány jsou po celou dobu procesu ponořeny do blotovacího pufru. Záporně nabité proteiny jsou poté elektrickým proudem přeneseny z gelu směrem dolů na povrch membrány. Použité chemikálie blotovací pufr:
25 mM Tris 192 mM glycin 20 % methanol
PBS (fosfátový pufr): 1 l … 8 g NaCl 0,2 g KCl 2,3 g Na2HPO4·12H2O 0,24 g KH2PO4 doplněno do 1 l destilovanou vodou, autoklávováno 20 min při 120 °C 44
Ponceau S; Sigma-Aldrich
Postup Semi-dry blotting Po ukončení elektroforézy byla rozložena aparatura a gel přenesen do vaničky s čerstvě připraveným blotovacím pufrem, kde byl krátkou dobu gel ponořen. Pro přenos proteinů byla použita nitrocelulosová membrána (Trans-Blot Transfer Medium, 0,2 μm, Bio-Rad), na kterou byl následně gel opatrně přemístěn a vložen (na membráně) mezi dva hrubé filtrační papíry (Bio-Rad) namočené v blotovacím pufru. Tento sendvič byl poté umístěn mezi kovové elektrody přístroje (Trans-Blot® SD, Semi Dry Transfer Cell, BioRad). Přenos probíhal 1,5-2 hod při 250 mA v blotovacím pufru. Po skončení přenosu bylo přeblotování zkontrolováno barevnou reakcí s barvivem Ponceau S, které bylo následně z membrány vymyto fosfátovým pufrem, ve kterém byla membrána i nadále uchována při 4 ºC.
Wet blotting Počáteční postup přenosu byl obdobný jako u semi-dry blottingu – po proběhnutí elektroforézy byl gel chvíli ponechán v blotovacím pufru. Následně byl při této variantě skládán sendvič, který byl vložen do speciální kazety aparatury (Mini Trans-Blot® Cell, Bio-Rad). Sendvič byl složen následovně: porézní houbička, filtrační papír (Bio-Rad), gel, membrána (Trans-Blot Transfer Medium, 0,2 μm, Bio-Rad), filtrační papír (Bio-Rad), porézní houbička. Kazeta se sendvičem byla vložena do blotovací komůrky naplněné blotovacím pufrem, která byla po celou dobu přenosu chlazena ledem. Přenos probíhal za neustálého míchání 1,5-2 hod při 250 mA v blotovacím pufru. Po skončení přenosu byl postup stejný jako v případě semi-dry blottingu.
6.5.4 Imunodetekce proteinů Před detekcí specifickými protilátkami je nutné povrch membrány tzv. zablokovat pro ochranu proti nespecifickému navázání protilátky. Blokování nespecifických míst se nejčastěji provádí uložením membrány do zředěného roztoku nějakého proteinu – např. BSA či netučného suchého mléka v pufru. Proteiny BSA či mléčného kaseinu z roztoku mléka se naváží na všechna místa, kde dosud nedošlo k navázání proteinů při přenosu. Po přidání protilátky se již molekuly protilátky nemohou nespecificky navázat na prázdný 45
povrch membrány, ale musí specificky vyhledat svůj epitop na přeblotovaných antigenech. Blokování výrazně snižuje pozadí a odstraňuje falešnou pozitivitu. Po blokování je membrána přenesena do roztoku primární protilátky zředěné v pufrovaném roztoku (např. TBS či PBS) v přítomnosti BSA či mléčného kaseinu. Primární protilátky jsou citlivé a specifické detekční nástroje, které se váží přímo na protein zájmu. Po opláchnutí membrány pufrovaným roztokem detergentu je membrána přenesena do roztoku sekundární protilátky. Tyto protilátky jsou komerčně dodávané a jsou určeny proti celé škále primárních protilátek. Nejčastěji jsou to sekundární protilátky proti myším či králičím imunoglobulinům. Sekundární protilátky vázající primární protilátky jsou často konjugovány s
reportérovým
enzymem
(např. křenovou
peroxidasou či alkalickou
fosfatasou), který umožňuje vizualizaci. Použité chemikálie PBS (fosfátový pufr): 1 l … 8 g NaCl 0,2 g KCl 2,3 g Na2HPO4·12H2O 0,24 g KH2PO4 doplněno do 1 l destilovanou vodou, autoklávováno 20 min při 120 °C TBS:
1 l … 25 mM Tris 30 mM NaCl doplněno do 1 l destilovanou vodou, autoklávováno 20 min při 120 °C
odstředěné sušené mléko Tween ® 20 (polyethylen-sorbitol monolaurát); Sigma-Aldrich blokovací pufr:
5 % odstředěné sušené mléko – pro anti-α-tubulin a anti-βaktin 10 % odstředěné sušené mléko – pro anti-SAP155 0,1 % Tween rozpuštěno v PBS/TBS)
primární protilátky:
anti-SAP155, myší monoklonální; MBL – v textu dále označována jako anti-SAP155 I anti-SAP155, králičí polyklonální; Novus Biologicals – v textu dále označována jako anti-SAP155 II anti-ß-aktin, myší monoklonální; Abgent anti-α-tubulin, myší monoklonální; Exbio 46
sekundární protilátky:
RAM (králičí proti myší); DakoCytomation SWAR (prasečí proti králičí); DakoCytomation
Postup Po rozložení aparatury pro blotting byla na membráně vyblokována vazebná místa pro imunoglobuliny třepáním v blokovacím pufru po dobu 2 hod při pokojové teplotě. Po blokování byla membrána opláchnuta v PBS nebo TBS, přemístěna do misky potažené parafilmem a převrstvena 4 ml primární protilátky rozředěné v roztoku 1 % sušeného mléka a 0,1 % Tweenu 20 v PBS/TBS. Ředění protilátek bylo následující: anti-ß-aktin 1 : 1 000, anti-α-tubulin 1 : 500 a za účelem optimalizace protilátek anti-SAP155 byla použita koncentrační řada 1 : 500 - 1 : 1 000 pro anti-SAP155 I a 1 : 2 000 - 1 : 10 000 pro antiSAP155 II. Navázání protilátky anti-ß-aktin probíhalo O/N (kultivace přes noc) při 4 °C a navázání anti-α-tubulinu probíhalo 1,5 hod při pokojové teplotě. Za účelem optimalizace probíhalo navázání protilátek anti-SAP155 I i anti-SAP155 II 2 hod – O/N při pokojové teplotě nebo při 4 °C. Následně byla membrána opláchnuta 5 min v PBS/TBS, 3 × 5 min v blokovacím roztoku a znovu 5 min v PBS/TBS. Sekundární protilátky byly naneseny stejným způsobem při ředění 1 : 1 000 a jejich navázání probíhalo 1 hod při pokojové teplotě. Následně byla membrána promyta stejným způsobem jako primární protilátka, jen na místo blokovacího roztoku byl použitý PBS/TBS s 0,1 % Tweenem 20. Takto připravená protilátka byla umístěna na sklo a jemně osušena.
6.5.5 Detekce chemiluminiscence expozicí na fotografický film Nejčastějším způsobem vizualizace sekundární protilátky je chemiluminiscenční způsob, který je založen na přeměně chemiluminiscenčního substrátu na nestabilní produkt pomocí reportérového enzymu. Nestabilní produkt se stabilizuje vyzářením kvanta světla, jehož množství je úměrné množství reportérového enzymu, které je zase přímo úměrné množství studovaného proteinu detekovaného protilátkami. Uvolňované světlo je pak detekováno buď přiložením běžného rentgenového filmu (doba detekce závisí na intenzitě signálu a může se pohybovat v rozmezí 20 s až 10 min) anebo nověji použitím CCDkamer. Použité chemikálie chemiluminiscenční substrát Lumi-Light Western Blotting Substrate; Roche 47
Postup Na osušenou membránu na skle byla nanesena směs roztoků 1 a 2, které jsou součástí chemiluminiscenčního substrátu Lumi-Light Western Blotting Substrate, v poměru 1 : 1 v množství 3 ml. Reakce probíhala po dobu 5 min, poté byla membrána osušena a zafixována potravinářskou folií. Expozice probíhala v tmavé komoře na film určený pro chemiluminiscenční detekci (Roche). Doba expozice byla přizpůsobená intenzitě reakce, 30 až 120 s. Film byl vyvolán 2 min ve vývojce, opláchnut vodou a ponechán 2 min v ustalovači.
6.6 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ Srovnání mezi biologickými proměnnými bylo provedeno Fisherovým přímým exaktním testem a čas do první terapie (TTFT) byl analyzován pomocí KaplanMayerových křivek přežití. Křivky byly konstruovány v programu GraphPad.
48
7. V ÝSLEDKY 7.1 OPTIMALIZACE ZAVEDEN ÝCH METOD Ve své diplomové práci jsem navazovala na předešlý výzkum hot-spot exonů (14-16) genu SF3B1, který byl prováděn na našem pracovišti. Provedla jsem optimalizaci PCR reakce pro všech 25 exonů genu SF3B1 a optimalizovala jsem western blot pro dosud na našem pracovišti nezkoumaný protein SF3B1. Vstupními údaji pro optimalizace byla velikost genu SF3B1 – 43 kb, počet anotovaných exonů – 25, počet aminokyselin – 1304 a molekulová hmotnost proteinu – 150 kDa.
7.1.1 Optimalizace PCR reakce Cílem optimalizace PCR reakce byl jednotný teplotní protokol pro všechny exony genu SF3B1. Byly použity primery uvedené v Tab. V, jejichž teploty tání se pohybovaly v rozmezí 43 °C - 55 °C. Zvolené teploty nasedání primerů byly v rozmezí 50 - 60 °C. Ostatní podmínky PCR reakce byly zvoleny na základě podmínek doporučovaných výrobcem pro polymerázu HotStarTaq (Qiagen). Reakce byla provedena v celkovém objemu 10 μl a složení reakční směsi je uvedeno v Tab. IV. Po skončení reakce byla přítomnost produktu ověřena elektroforézou v 1,5 % agarózovém gelu. Za podmínek různých teplot nasedání primerů vznikalo v mnoha případech velmi malé množství produktu nebo produkt vůbec nevznikal (Obr 7, 8). Proto byly v konečném výstupu vyoptimalizovány tři teplotní profily PCR reakce pro různé skupiny exonů, které jsou uvedeny v Tab. IX, Tab. X a Tab. XI.
Obr. 7: Gelová agarozová elektroforéza pro ověření přítomnosti produktu při Tm = 50 °C
49
Obr. 8: Gelová agarozová elektroforéza pro ověření přítomnosti produktu při Tm = 60 °C
Tabulka IX: Teplotní profil PCR reakce pro exony 1-12, 21, 22, Cyklus č. 1 (denaturace)
Počet opakování 1
2 (elongace)
35
3 (terminace)
1
Teplota (°C) 94 94 50 72 72 4
Čas (min) 15:00 0:30 0:30 1:00 5:00 ∞
Tabulka X: Teplotní profil PCR reakce pro exony 13, 14, Cyklus č. 1 (denaturace)
Počet opakování 1
2 (elongace)
35
3 (terminace)
1
Teplota (°C) 94 94 52 72 72 4
Čas (min) 15:00 0:30 0:30 1:00 5:00 ∞
Tabulka XI: Teplotní profil PCR reakce pro exony 15-20, 23, 24, 25 Cyklus č. 1 (denaturace)
Počet opakování 1
2 (elongace)
35
3 (terminace)
1
Teplota (°C) 94 94 58 72 72 4
Čas (min) 15:00 0:30 0:30 1:00 5:00 ∞
50
7.1.2 Optimalizace westernového přenosu Finálním cílem optimalizace westernového přenosu pro protein SF3B1 bylo zjištění proteinové hladiny u pacientů s CLL. Prvotní testy jsem prováděla na buněčné linii RAJI, jejíž charakteristika je uvedena v kap. 6.1. Tyto testy sloužily pro optimalizaci samotného metodického postupu a vycházely z předchozích zkušeností pracovníků pracoviště. Z důvodu zmiňované velikosti proteinu SF3B1 (150 kDa) jsem pro připravovaný gel v SDSPAGE vybrala koncentraci akrylamidu 8 %. Po elektroforéze za standardních podmínek jsem využila oba postupy westernového přenosu (semi-dry přenos a „mokrý“ přenos), ze kterých jsem následně z důvodu obdobných výsledků a jednodušší proveditelnosti vybrala semi-dry přenos. Nejobtížnější z celého procesu byla optimalizace ředění a inkubace primárních protilátek anti-SAP155 od firem MBL a Novus Biologicals, která vycházela z doporučení výrobců protilátek. Protilátku anti-SAP155 I (firma MBL) jsem ředila v poměru 1 : 500 a 1 : 1 000 a inkubovala po dobu 2 h, 4 h nebo O/N za pokojové teploty nebo při 4 °C. Pro tuto protilátku jsem nakonec vybrala jako optimální variantu ředění 1 : 1 000 a inkubaci 4 h za pokojové teploty. Toto platilo pro buněčnou linii RAJI, nicméně pro optimální dosažení výsledků u vzorků CLL pacientů byla doba inkubace prodloužena na O/N při 4 °C. Protilátku anti-SAP155 II (firma Novus Biologicals) jsem ředila v poměru 1 : 2 000, 1 : 5 000 a 1 : 10 000 a inkubovala po dobu 4 h nebo O/N za pokojové teploty nebo při 4 °C. Pro tuto protilátku jsem vybrala konečné ředění 1 : 10 000 a inkubaci 4 h při pokojové teplotě při testech na linii RAJI. Následně byla také i v tomto případě u vzorků CLL pacientů doba inkubace prodloužena na O/N při 4 °C. Aplikace ostatních primárních protilátek (anti-ß-aktin a anti-α-tubulin), které sloužili jako interní kontrola proteinového lyzátu, a sekundárních protilátek pro vizualizaci byla na pracovišti již zavedena. Na následujícím Obr. 9 je pro ukázku zobrazen pracovní film optimalizace protilátky antiSAP155 I.
51
Obr. 9: Pracovní film optimalizace westernového přenosu za použití protilátky anti-SAP155 I
52
7.2 IDENTIFIKACE
MUTACÍ
POMOCÍ
SANGEROVA
SEKVENOVÁNÍ Výše uvedený optimalizovaný postup byl využit pro identifikaci mutací v genu SF3B1 na vzorcích DNA izolovaných z CLL buněk pacientů. Celkem bylo testováno 80 pacientů rozdělených do dvou sad. U 32 pacientů jsem provedla sekvenování celého genu SF3B1 (25 exonů). Na základě získaných výsledků jsem poté pokračovala již jen analýzou hotspot exonů (14-16) tohoto genu a to u 48 pacientů. V 6 případech se jednalo o další odběr nebo odběry (z jiného data) z původního souboru 32 pacientů, ve zbývajících 42 případech se jednalo o jiné CLL pacienty. U pacientů, u kterých byl sekvenován celý gen SF3B1, byla nalezena mutace ve 14 (44 %) z celkově 32 sekvenovaných pacientů. Z těchto 14 vzorků byly všechny mutace nalezeny pouze v hot-spot exonech genu SF3B1. 6 pacientů (43 %) neslo mutaci v exonu 14, u 6 pacientů (43 %) byla nalezena mutace v exonu 15 a zbývající 2 pacienti (14 %) měli mutaci v exonu 16. Všechny nalezené mutace se dle záznamu ze sekvenogramu vyskytovaly v heterozygotním stavu a s výjimkou jednoho pacienta byl pozorován poměr mezi mutovaným a nemutovaným peakem 1:1. V této práci jsem pro toto pozorování používala termín, že mutace představovala (příp. tvořila) 50 %. U pacienta 16 pak tvořila mutace s využitím popsaného systému pouze 15 %. Třináct mutací (93 %) z celkových 14 byly záměnové (missense) alterace, v jednom případě (pac. 28) se jednalo o krátkou inframe (bez změny čtecího rámce) deleci. U zbývajících 18 vzorků z celkově 32 (56 %) sekvenovaných vzorků žádná mutace nalezena nebyla. U 29 (90 %) z celkově 32 sekvenovaných vzorků byly nalezeny polymorfismy v exonech 3, 5, 10, 18, 23, 24. Tyto polymorfismy se vyskytovaly jak u pacientů s mutací, tak i bez ní. U zbývajících tří pacientů se polymorfismy nevyskytovaly. Z těchto tří pacientů nebyla u dvou vzorků (pac. 2, pac. 20) nalezena žádná abnormalita genu SF3B1 a u třetího pacienta (pac. 13) byla nalezena pouze mutace bez jakéhokoli polymorfismu. Celkový přehled výsledků sekvenování celého genu SF3B1 u 32 vzorků pacientů s CLL je shrnut v Tab. XII.
53
Tabulka XII: Celkový přehled získaných výsledků sekvenováním celého genu SF3B1 u 32 CLL pacientů
54
Na základě předešlých výsledků bylo dále sekvenováno 48 pacientů pouze v hot-spot exonech (14-16) genu SF3B1. U 6 pacientů (pac. 4, 10, 13, 16, 19 a 21), kterým byl také sekvenován celý gen SF3B1, byly testovány i další odběry, u kterých bylo potvrzeno 5 mutačních statusů. Výjimku tvořil 1 pacient (pac. 16), u kterého došlo k vyselektování mutace (odběr 16/2, 16/3). V tomto souboru pacientů bylo nalezeno 5 dalších pacientů (pac. 54, 60, 70, 72 a 80) s mutací v genu SF3B1. U ostatních pacientů z této kohorty byl nalezen wild-type stav genu SF3B1. V následující tabulce (Tab. XIII) jsou shrnuty potvrzené a nově nalezené mutační stavy této kohorty pacientů.
55
Tabulka XIII: Potvrzené a nově nalezené mutace u pacientů s CLL sekvenovaných v hotspot exonech genu SF3B1
Pozn.: nDNA (nenádorová DNA) izolovaná z T-lymfocytů pacienta. Byla použita pro zjištění, zda mutace v genu SF3B1 vznikla již ve společném progenitoru B- a
T-lymfocytů nebo až ve
zralé populaci CLL lymfocytů
U celkového počtu 80 pacientů bylo nalezeno 19 mutací (24 %). U žádného pacienta nebyla nalezena více než jedna mutace. Tyto mutace se vyskytovaly pouze v hot-spot exonech (14-16) genu SF3B1. V Grafu 1 je zobrazen procentuální počet mutací v jednotlivých exonech, přičemž v exonu 14 bylo nalezeno celkově 7 mutací (37 %), v exonu 15 bylo nalezeno 8 mutací (42 %) a v exonu 16 byly 4 mutace (21 %). V exonu 14 bylo nalezeno 5 typů missense mutací (p. Asn626Ser, p. Thr663Ile, p. Asn626Asp, p. His662Gln, p. Trp658Cys), v exonu 15 se vyskytoval pouze 1 typ mutace (prominentní hot-spot p. Lys700Glu) a v exonu 16 byl nalezen 1 typ missense mutace (p. Gly742Asp) a jedna in-frame delece (Met784_Lys785del). Počet a procentuální zastoupení jednotlivých mutací v hot-spot exonech genu SF3B1 jsou zobrazeny v Tab. XIV a Grafu 2.
56
Graf 1: Procentuální zastoupení všech nalezených mutací v jednotlivých exonech
Procentuální zastoupení všech nalezených mutací v jednotlivých exonech exon 16 21% exon 14 37% exon 14 exon 15 exon 16
exon 15 42%
Tabulka XIV: Typ, počet a procentuální zastoupení jednotlivých nalezených mutací Exon
14
15 16
Mutace Asn626Ser Thr663Ile Asn626Asp His662Gln Trp658Cys Lys700Glu Gly742Asp Met784_Lys785del
Počet 2 1 2 1 1 8 3 1
% 11 5 11 5 5 42 16 5
57
Graf 2: Procentuální zastoupení jednotlivých nalezených mutací
procentuální zastoupení (%)
Procentuální zastoupení jednotlivých nalezených mutací v exonech 14, 15, 16 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
název mutace
7.3 VYHODNOCENÍ
HLADINY
PROTEINU
SF3B1
POMOCÍ
WESTERNOVÉHO PŘENOSU U CLL PACIENTŮ Cílem této části práce bylo (a) stanovení možného funkčního dopadu identifikovaných mutací SF3B1 na hladinu proteinu a (b) ověření, zda u některých vzorků bez mutace nedochází k narušení proteinové hladiny. Hladina proteinu SF3B1 byla analyzována u vzorků 70 pacientů. Do tohoto souboru bylo zařazeno 23 vzorků, u kterých byla přítomna SF3B1 mutace a 47 vzorků bez mutace (wild-type). Jako kontrola pro westernový přenos sloužila linie RAJI, na které probíhala optimalizace této metody (viz výše) a která nesla standardní (dobře detekovatelný) protein SF3B1. Výsledky westernového přenosu sumarizují Obr. 10 a 11, na kterých jsou zobrazeny gely se vzorky pacientů a příslušné membrány. Viditelně snížená nebo dokonce nulová hladina proteinu SF3B1 nebyla patrná v žádném z testovaných CLL vzorků. U části vzorků (n=23) byl patrný jeden band (např. gel 1, dráha 7), zatímco u některých vzorků (n=49) byly pozorovány tyto bandy dva (např. gel 2, dráha 8). Nebyla pozorována žádná souvislost mezi těmito dvěma typy výstupů na western blotu a mutačními stavy pacientů. Pozorovaný dvojband zřejmě reprezentuje dvě isoformy proteinu SF3B1, které se nejspíše liší některou z posttranslačních modifikací (např. fosforylací).
58
SF3B1 β-aktin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Obr. 10: Výsledek westernového přenosu proteinu SF3B1 – gel 1. Dráha 1: proteinový velikostní marker+linie RAJI; 3: wt; 4: wt; 5: mut; 6: wt; 7:wt; 8: mut; 9: wt; 10: wt. Použitá protilátka anti-SAP155 II; doba expozice 2 min
SF3B1 β-aktin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Obr. 11: Výsledek westernového přenosu proteinu SF3B1 – gel 2. Dráha 1: linie RAJI; 2: proteinový velikostní marker; 3: wt; 4: wt; 5: mut; 6: wt; 7: mut; 8: mut; 9: wt; 10: mut. Použitá protilátka anti-SAP155 II; doba expozice 2 min
59
7.4 VYHODNOCENÍ
VÝSLEDKŮ
MUTAČNÍHO
SCREENINGU
VZHLEDEM K MOLEKULÁR NĚ CYTOGENETICKÝM DA TŮM PACIENTŮ 7.4.1 Vyhodnocení výsledků mutačního screeningu genu SF3B1 ve vztahu k ATM defektům a p53 mutacím Dalším cílem této práce bylo vyhodnocení celkových výsledků mutačního screeningu genu SF3B1 na pracovišti ve vztahu k ATM defektům a p53 mutacím. Použitá data týkající se ATM a p53 byla kompletována pro toto vyhodnocování pracovníky Centra molekulární biologie a genové terapie v rámci výzkumných aktivit. Použití všech dat ohledně mutací v genu SF3B1 vygenerovaných na pracovišti bylo logičtější variantou pro tento typ analýzy než použití pouhých dat z diplomové práce – vzhledem k potřebě co největšího souboru pacientů. Molekulárně cytogenetická data zahrnovala kompletní informace o obou alelách genů ATM a TP53. Na souboru 240 pacientů byla vyhodnocována asociace SF3B1 mutací s mutacemi v genu ATM, delecí oblasti 11q (ztráta jedné alely ATM), mutacemi v genu TP53 (z nichž většina byla doprovázena delecí druhé kopie; samotná delece 17p se v tomto souboru pacientů nevyskytovala) a rovněž byla vyhodnocována asociace s celkovou inaktivací dráhy ATM/TP53 – tedy mutacemi přítomnými buď v jednom, nebo ve druhém genu. Tento soubor pacientů obsahoval 50 pacientů s mutací v genu SF3B1 a 190 pacientů bez mutace. Ke statistickému zhodnocení výsledků byl použit Fisherův přímý exaktní test a asociace byly považovány za významné na hladině významnosti 5 %. Nejprve byla sledována asociace mezi mutacemi v genech SF3B1 a ATM. Mutace SF3B1 byla pozorována u 15 ze 46 pacientů nesoucích ATM mutaci, tj. u 33 %. Při hodnocení tohoto společného výskytu genových mutací byla zjištěna statistická významnost (P= 0,042). Celkově 240 pacientů
SF3B1-wt
SF3B1-mut
ATM-wt
159
35
ATM-mut
31
15
P= 0,042
60
Dále byl sledován a hodnocen společný výskyt genových mutací SF3B1 a delecí oblasti 11q. Tato delece byla uvažována jak s přítomností mutace ATM na druhé alele, tak i samostatně, tedy s druhou alelou wt. Mutace SF3B1 byly v této kohortě pozorovány u 22 pacientů z celkových 92 pacientů, tj. u 24 %, což z hlediska statistiky není významné (P = 0,41). Celkově 240 pacientů
SF3B1-wt
SF3B1-mut
Bez delece
120
28
11q-
70
22
P = 0,41
Při hodnocení společného výskytu mutací SF3B1 a obou typů defektů v genu ATM (tzn. mutace a/nebo delece 11q) nebyla zjištěna statistická významnost (P = 0,078). Ze statistického hlediska je zde vidět určitý trend, který je zapříčiněn výše zmíněnou asociací mezi SF3B1 mutacemi a ATM mutacemi. Celkově 240 pacientů
SF3B1-wt
SF3B1-mut
ATM-ok
112
22
78
28
ATM-defekt (mutace/delece)
P = 0,078
Společnému hodnocení byl podroben rovněž výskyt mutací SF3B1 a mutací v genu TP53. I v tomto případě nebyla zjištěna statistická významnost (P = 0,14), nicméně bylo v této kohortě pacientů pozorováno, že 16 z 50 pacientů s mutací v genu SF3B1 nese zároveň mutaci v TP53. Toto pozorování naznačuje, že trend ke společné akumulaci SF3B1 mutací a TP53 mutací v CLL buňkách existuje.
61
Celkově 240 pacientů
SF3B1-wt
SF3B1-mut
p53-wt
149
34
p53-mut
41
16
P = 0,14
V posledním případě hodnocení celkových výsledků mutačního screeningu genu SF3B1 jsem sledovala společný výskyt mutací SF3B1 s inaktivací dráhy ATM/p53, tedy s výskytem mutací v genu ATM a/nebo TP53. V této analýze byla zjištěna statisticky vysoce významná asociace (P = 0,006). Jinými slovy 60 % pacientů s SF3B1 mutací neslo zároveň i inaktivaci stěžejní pro-apoptotické dráhy. Celkově 240 pacientů
SF3B1-wt
SF3B1-mut
ATM/p53-ok
119
20
ATM mut a/nebo p53 mut
71
30
P = 0,006
7.4.2 Vyhodnocení výsledků mutačního screeningu genu SF3B1 ve vztahu k času do první terapie (TTFT) Výsledky mutačního screeningu genu SF3B1 byly dále využity pro stanovení času do první terapie u analyzovaných pacientů. Tak zvané Kaplan-Meierovy křivky přežití byly konstruovány z dat pro 41 pacientů. V této kohortě bylo 32 pacientů bez mutace a 9 pacientů s mutací v genu SF3B1. Záměrně byly v obou skupinách vynechány vzorky s jiným typem defektu s prokázaným dopadem na TTFT (ATM a TP53 aberace). Rovněž byl zohledněn mutační stav IGHV, který má také přímý dopad na tento parametr – byli analyzováni pouze pacienti s nemutovaným IGHV. Výsledky analýzy jsou patrné z Obr. X. Pacienti s mutací v genu SF3B1 měli významně zkrácený čas do první terapie ve srovnání s pacienty bez mutace (medián 18 vs. 38 měsíců; P=0,019).
62
Obr. X: Kaplan-Meierovy křivky přežití srovnávající pacienty s mutovaným a nemutovaným genem SF3B1
63
8. D ISKUSE V posledních několika letech prošel výzkum CLL prudkým rozvojem, který mimo jiné přispěl k objevu nových rekurentně mutovaných genů. Největším překvapením byla identifikace mutací v genu SF3B1 (sestřihový faktor 3 podjednotka 1). U CLL jsou mutace v SF3B1 detekovány u pacientů s pokročilejším stádiem a s nepříznivými prognostickými abnormalitami (Baliakas et al., 2014). Recentní studie Rossiho et al. (2013) prokázala jasný negativní dopad SF3B1 mutací na celkové přežití pacientů s CLL. V laboratoři Centra molekulární biologie a genové terapie FN Brno se započalo s analýzou genu SF3B1 asi rok před zahájením této diplomové práce. V souladu s publikovanými daty byly tehdy sekvenovány tři vybrané hot-spot exony a bylo zjištěno, že mutace jsou u pacientů ve FN Brno skutečně docela hojně přítomny (frekvence se pohybovala okolo 20 %). V tu dobu však ještě nebylo přesně známo, jaká je frekvence mutací mimo tato hojně mutovaná (hot-spot) místa. Proto bylo prvním cílem diplomové práce alespoň orientačně - na relativně malém souboru pacientů - tuto otázku osvětlit. Pro tuto část experimentální práce byla vybrána kohorta 32 pacientů s předchozí znalostí mutačního stavu genu SF3B1 ve vybraných hot-spot exonech. Dříve nalezené mutace (n=14) tak sloužily jako kontrola správnosti mutační analýzy v této diplomové práci. U celkového počtu 32 pacientů, u kterých byla provedena analýza celého genu SF3B1, tj. 25 exonů, bylo celkově nalezeno 14 mutací. Jednalo se ve všech případech o dříve nalezené mutace. Mimo hot-spot exony nebyla žádná mutace nalezena. U 29 pacientů byly nalezeny polymorfismy v exonech 3, 5, 10, 18, 23 a 24. Všechny sekvenční záměny polymorfismů
se
shodovali
s údaji
v databázi
dbSNP
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). U 13 pacientů ze 14 byla mutace nalezena v proporci, kdy se mutovaný a wt peak na sekvenogramu překrývaly. Dá se předpokládat, že se v těchto případech jednalo o heterozygotní mutaci v genu SF3B1 (na jedné alele) přítomnou ve všech buňkách pacienta. Tento předpoklad vychází z publikovaných dat, která ukazují, že v lokusu genu SF3B1 (oblast 2q33.1) se nevyskytují žádné abnormality narušující počet kopií, které by mohly poměr sekvenovaných alel vychýlit. U jednoho pacienta pak byla mutace nalezena v podstatně menší proporci – mutovaný peak tvořil jen asi 15 % a wt peak 85 %. V tomto případě (pac. 16) se tedy jednalo o zachycení mutace v počátečním stádiu selekce. Co se týče mutovaných pozic a konkrétních záměn, jednalo se ve 13 případech o známé mutace uvedené v mutační databázi COSMIC (Catalogue of somatic mutations in cancer, 64
http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Kromě toho byla také nalezena jedna nová mutace v exonu 14 (Trp658Cys), která nebyla dříve popsána. Dále byla vytvořena kohorta pacientů (n=48), u kterých již byly sekvenovány pouze hot-spot exony genu SF3B1. V 6 případech se jednalo o další odběr (z jiného data) pacientů vyšetřovaných na celý gen, 42 pacientů bylo analyzováno poprvé. Celkově byla nalezena mutace u 7 pacientů. V této skupině byl pro zajímavost sekvenován i jeden vzorek nenádorové DNA od pacienta s mutací v genu SF3B1. V nenádorové DNA však tato mutace nalezena nebyla, což potvrzuje, že vznikla až v populaci B-lymfocytů tvořících CLL. Zajímavý výsledek byl nalezen u pacienta 16, u kterého byla v předešlém experimentu nalezena mutace v 15 %, ale v pozdějším odběru tato mutace nalezena nebyla. Protože byl pacient mezi odběry léčen, dá se předpokládat, že byl mutovaný klon CLL buněk léčbou eliminován. Je zajímavé, že u tohoto pacienta se naopak po léčbě objevila mutace v genu TP53. Došlo tedy zřejmě k vytlačení buněk s SF3B1 mutací agresivnějším klonem s p53 dysfunkcí. Celkově bylo tedy pomocí sekvenování nalezeno 19 mutací u celkově 80 analyzovaných pacientů. Velmi zajímavým se jeví zjištění, že ani jedna z nalezených mutací nevedla k úplné eliminaci proteinu SF3B1 v CLL buňkách (celkem bylo nalezeno 18 záměnových mutací a jedna krátká in-frame delece nevedoucí k narušení čtecího rámce). Tento typ inaktivace genu resp. proteinu SF3B1 je velmi typický pro nádorová onemocnění včetně CLL (Wang et al., 2011; Rossi et al., 2013; Baliakas et al., 2014) a vyplývá zřejmě ze skutečnosti, že kompletní eliminace SF3B1 je pro buňku letální (Cazzola, 2013; Visconte et al., 2012). Nejčastěji se vyskytujícími mutacemi byla varianta Lys700Glu, která tvořila plných 42 % identifikovaných záměn a Gly642Asp (16 %), což odpovídá publikovaným výsledkům (Wan and Wu, 2013). Výstupy, které přinesla analýza hladiny proteinu SF3B1 pomocí westernového přenosu, byly v souladu s výše uvedeným náhledem na mutagenezi SF3B1. Hladina proteinu SF3B1 nebyla výrazně snížená u žádného ze 70 analyzovaných pacientů, což ukazuje, že mutace nevedou k eliminaci proteinu SF3B1. Přítomnost byť i mutovaného proteinu je tedy pro buňku nezbytná. Provedený mutační screening byl využit pro vyhodnocení potenciální asociace mezi přítomností SF3B1 mutací a defektů v genech ATM a TP53. Tyto geny jsou stěžejní pro patogenezi CLL a negativní dopad jejich inaktivace na prognózu pacienta byl opakovaně prokázán (Stilgenbauer and Zenz, 2010; Malcikova et al., 2009; Austen et al., 2007; Navrkalova et al., 2013). Studie vztahu SF3B1 mutací a defektů v genech ATM a TP53 byla prováděna na souboru 240 pacientů. Při zohlednění mutací jednotlivých genů byla 65
nalezena asociace mezi přítomností mutace SF3B1 a mutace ATM (P=0,042). SF3B1 mutace byla zaznamenána u 15 pacientů (33 %) pozitivně testovaných na mutaci v genu ATM. Dále bylo provedeno zhodnocení společného výskytu mutací SF3B1 a dalších chromozomových aberací s nepříznivým prognostickým významem: delece 11q, mutace/delece ATM a mutace p53. U žádné z těchto strukturních chromozomových aberací nebyla pozorována statisticky významná souvislost s výskytem mutací SF3B1. Nicméně ve vyšetřovaném souboru pacientů byla mutace v genu SF3B1 velmi silně asociována s inaktivací dráhy ATM/p53, tedy přítomností mutace buď v genu ATM a/nebo TP53 (P=0,006). Dvě třetiny pacientů s SF3B1 mutací (30/50) neslo defekt v jednom z těchto dvou genů. V tomto smyslu je zajímavá publikace, která vznikla ve spolupráci mezi pracovištěm Academic Medical Centre Amsterdam a našim pracovištěm (Te Raa et al., 2014). Tato práce ukazuje, že mutace v genu SF3B1 mají dopad na funkčnost dráhy p53. Pokud tomu tak skutečně je pak vyvstává otázka, proč se defekty v této dráze s SF3B1 mutacemi ko-selektují? Posledním výstupem diplomové práce byla analýza dopadu SF3B1 mutací na čas do první terapie u CLL pacientů. Pro tuto analýzu byly uvažovány následující typy vzorků: (a) od pacientů vyšetřených při diagnóze nebo maximálně do jednoho roku poté, (b) od pacientů nesoucích pouze SF3B1 mutaci (bez defektů ATM nebo TP53) a (c) od pacientů s nemutovaným stavem IGHV. Tato rigorózní analýza prokázala jasný dopad SF3B1 mutací na sledovaný parametr. Medián času do první terapie byl u mutovaných pacientů 18 měsíců a byl tak výrazně kratší než u skupiny wt (38 měsíců). Toto pozorování je v souladu s publikovanými fakty (Baliakas et al., 2014). Zajímavé bylo i srovnání s ostatními defekty sledovanými na pracovišti: samotná delece 11q vykazovala velmi podobné zkrácení TTFT (18 měsíců), zatímco mutace v genu ATM a TP53 měly dopad ještě prominentnější (10 a 12 měsíců). Výsledky poukazující na asociace mezi přítomností SF3B1 mutací a defekty v genech ATM a TP53 byly již zapracovány do manuskriptu připravovaného na pracovišti. Stejně tak budou součástí tohoto manuskriptu i data týkající se dopadu SF3B1 mutací na čas do první terapie.
66
9. Z ÁVĚRY SF3B1 (sestřihový faktor 3 podjednotka 1) je nově objevený rekurentně mutovaný gen, jehož inaktivace v patogenezi CLL nebyla dříve předpokládána. Jedním z cílů této diplomové práce bylo najít vhodné podmínky pro analýzu genu a proteinu SF3B1 u vzorků pacientů s CLL. Za tímto účelem byla provedena optimalizace PCR reakce pro amplifikaci jednotlivých exonů a optimalizace westernového přenosu. Tyto postupy byly následně využity pro analýzu mutací v genu SF3B1, která byla prováděna pomocí Sangerova sekvenování a pro analýzu proteinové hladiny proteinu SF3B1 westernovým přenosem. Mutační analýza byla prováděna na souboru 80 pacientů, u kterých bylo identifikováno 19 patologických sekvenčních změn. Tento mutační screening byl u části pacientů následně využit pro stanovení možného funkčního dopadu identifikovaných mutací SF3B1 na hladinu proteinu. Toto stanovení ukázalo, že mutace k eliminaci ani výraznému snížení proteinové hladiny nevedou. Dalším cílem bylo vyhodnotit celkové výsledky mutačního screeningu genu SF3B1 na pracovišti ve vztahu k molekulárně cytogenetickým datům pacientů. Při statistickém zhodnocení byla pozorována významná asociace mezi přítomností SF3B1 mutací a mutací v genu ATM (P= 0,042) a zejména pak mezi přítomností SF3B1 mutací a celkovou inaktivací dráhy ATM/p53 (mutace v genu ATM a/nebo TP53) (P= 0,006). Výskyt mutací SF3B1 byl hodnocen také ve vztahu k času do první terapie. U pacientů s mutací v genu SF3B1 byl prokázán významně zkrácený čas do první terapie ve srovnání s pacienty bez mutace (medián 18 vs. 38 měsíců; P=0,019) a tím u nich byla prokázána horší prognóza.
67
S EZNAM POUŽITÉ LITERATURY ADAM Z. 2004. Diagnostické a Léčebné Postupy U Maligních Chorob. 2. aktualiz. a dopl. vyd. Praha: Grada. ADAM Z., KREJČÍ M., VORLÍČEK J. 2008. Hematologie: Přehled Maligních Hematologických Nemocí. 2., dopl. a zcela přeprac. vyd. Praha: Grada. ADAM Z., VORLÍČEK J., KOPTÍKOVÁ J. 2003. Obecná Onkologie a Podpůrná Léčba. 1. vyd. Praha: Grada. AUSTEN B., POWELL J. E., ALVI A., EDWARDS I., HOOPER L., STARCZYNSKI J., TAYLOR A. M. R., FEGAN CH., MOSS P. AND STANKOVIC T. 2005. “Mutations in the ATM Gene Lead to Impaired Overall and Treatment-Free Survival That Is Independent of IGVH Mutation Status in Patients with B-CLL.” Blood 106 (9): 3175–82. AUSTEN B., SKOWRONSKA A., BAKER C., POWELL J. E., GARDINER A., OSCIER D., MAJID A. ET AL. 2007. “Mutation Status of the Residual ATM Allele Is an Important Determinant of the Cellular Response to Chemotherapy and Survival in Patients With Chronic Lymphocytic Leukemia Containing an 11q Deletion.” Journal of Clinical Oncology 25 (34): 5448–57. BALIAKAS P., HADZIDIMITRIOU A., SUTTON L.-A., ROSSI D., MINGA E., VILLAMOR N., LARRAYOZ M. ET AL. 2014. “Recurrent Mutations Refine Prognosis in Chronic Lymphocytic Leukemia.” Leukemia, June. BERTILACCIO M. T. S., SCIELZO C., MUZIO M. AND CALIGARIS-CAPPIO F. 2010. “An Overview of Chronic Lymphocytic Leukaemia Biology.” Best Practice & Research Clinical Haematology, Advances in Biology and Therapy of Chronic Lymphocytic Leukemia, 23 (1): 21–32. BINET J. L., AUQUIER A., DIGHIERO G., CHASTANG C., PIGUET H., GOASGUEN J., VAUGIER G. ET AL. 1981. “A New Prognostic Classification of Chronic Lymphocytic Leukemia Derived from a Multivariate Survival Analysis.” Cancer 48 (1): 198–206. BINET J. L., LEPOPRIER M., DIGHIERO G., CHARRON D., D’ATHIS P., VAUGIER G., BERAL H. M. ET AL. 1977. “A Clinical Staging System for Chronic Lymphocytic Leukemia: Prognostic Significance.” Cancer 40 (2): 855–64. BONNAL S., VIGEVANI L. AND VALCÁRCEL J. 2012. “The Spliceosome as a Target of Novel Antitumour Drugs.” Nature Reviews. Drug Discovery 11 (11): 847–59.
68
CALIN G. A., FERRACIN M., CIMMINO A., DI LEVA G., SHIMIZU M., WOJCIK S. E., IORIO M. V. ET AL. 2005. “A MicroRNA Signature Associated with Prognosis and Progression in Chronic Lymphocytic Leukemia.” New England Journal of Medicine 353 (17): 1793–1801. CASS D. M. AND BERGLUND J. A. 2006. “The SF3b155 N-Terminal Domain Is a Scaffold Important for Splicing.” Biochemistry 45 (33): 10092–101. CAZZOLA M. 2013. “Biologic and Clinical Significance of Somatic Mutations of SF3B1 in Myeloid and Lymphoid Neoplasms.” Edited by Marianna Rossi and Luca Malcovati. Blood 121 (2): 260. ČEŠKA R. 2010. Interna. Praha: Triton. DAMM F., NGUYEN-KHAC F., FONTENAY M. AND BERNARD O. A. 2012. “Spliceosome and Other Novel Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia and Myeloid Malignancies.” Leukemia 26 (9): 2027–31. DÖHNER H., STILGENBAUER S., BENNER A., LEUPOLT E., KRÖBER A., BULLINGER L., DÖHNER K., BENTZ M. AND LICHTER P. 2000. “Genomic Aberrations and Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia.” New England Journal of Medicine 343 (26): 1910–16. HANAHAN D. AND WEINBERG R. A. 2011. “Hallmarks of Cancer: The Next Generation.” Cell 144 (5): 646–74. FOÀ R., DEL GIUDICE I., GUARINI A., ROSSI D. AND GAIDANO G. 2013. “Clinical Implications of the Molecular Genetics of Chronic Lymphocytic Leukemia.” Haematologica 98 (5): 675–85. GOLAS M. M., SANDER B., WILL C. L., LÜHRMANN R. AND STARK H. 2003. “Molecular Architecture of the Multiprotein Splicing Factor SF3b.” Science 300 (5621): 980. GRIVENNIKOV, SERGEI I., FLORIAN R. GRETEN, AND MICHAEL KARIN. 2010. “Immunity, Inflammation, and Cancer.” Cell 140 (6): 883–99. HAHN CH. N. AND SCOTT H. S. 2011. “Spliceosome Mutations in Hematopoietic Malignancies.” Nature Genetics 44 (1): 9–10. Hallek M., Kuhn-Hallek I., Emmerich B. 2008. “Prognostic Factors in Chronic Lymphocytic Leukemia.” Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO 19 Suppl 4 (June): iv51–53. HAMBLIN T. J., DAVIS Z., GARDINER A., OSCIER D. G. AND STEVENSON F. K. 1999. “Unmutated Ig VH Genes Are Associated With a More Aggressive Form of Chronic Lymphocytic Leukemia.” Blood 94 (6): 1848–54. 69
HANAHAN D. AND WEINBERG R. A. 2000. “The Hallmarks of Cancer.” Cell 100 (1): 57–70. KEATING M. J., FLINN I., JAIN V., BINET J. L., HILLMEN P., BYRD J., ALBITAR M. ET AL. 2002. “Therapeutic Role of Alemtuzumab (Campath-1H) in Patients Who Have Failed Fludarabine: Results of a Large International Study.” Blood 99 (10): 3554–61. MALCIKOVA J., SMARDOVA J., ROCNOVA L., TICHY B., KUGLIK P., VRANOVA V., CEJKOVA S. ET AL. 2009. “Monoallelic and Biallelic Inactivation of TP53 Gene in Chronic Lymphocytic Leukemia: Selection, Impact on Survival, and Response to DNA Damage.” Blood 114 (26): 5307–14. MARTÍNEZ-TRILLOS A., QUESADA V., VILLAMOR N., PUENTE X. S., LÓPEZOTÍN C. AND CAMPO E. 2013. “Recurrent Gene Mutations in CLL.” In Advances in Chronic Lymphocytic Leukemia, edited by Sami Malek, 87–107. Advances in Experimental Medicine and Biology 792. Springer New York. MAYER J. 2002. Leukemie. 1. vyd. Praha: Grada. MRAZ M., POSPISILOVA S., MALINOVA K., SLAPAK I. AND MAYER J. 2009. “MicroRNAs in Chronic Lymphocytic Leukemia Pathogenesis and Disease Subtypes.” Leukemia & Lymphoma 50 (3): 506–9. NABHAN CH., PATTON D., GORDON L., RILEY M., KUZEL T., TALLMAN M. AND ROSEN S. 2004. “A Pilot Trial of Rituximab and Alemtuzumab Combination Therapy in Patients with Relapsed And/or Refractory Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).” Leukemia & Lymphoma 45 (11): 2269–73. NAVRKALOVAV., SEBEJOVA L., ZEMANOVA J., KMINKOVA J., KUBESOVA B., MALCIKOVA J., MRAZ M. ET AL. 2013. “ATM Mutations Uniformly Lead to ATM Dysfunction in Chronic Lymphocytic Leukemia: Application of Functional Test Using Doxorubicin.” Haematologica 98 (7): 1124–31. NUSSBAUM R. L., MCINNES R. R., WILLARD H. F. AND GOETZ P. 2004. Klinická Genetika: Thompson & Thompson: 6. Vydání. Vyd. 1. Praha: Triton. POSPÍŠILOVÁ Š., DVOŘÁKOVÁ D. AND MAYER J. 2013. Molekulární Hematologie. 1. vyd. Praha: Galén. POSPISILOVA S., GONZALEZ D., MALCIKOVA J., TRBUSEK M., ROSSI D., KATER A. P., CYMBALISTA F. ET AL. 2012. “ERIC Recommendations on TP53 Mutation Analysis in Chronic Lymphocytic.” Leukemia 26 (7): 1458–61. QUESADA V., CONDE L., VILLAMOR N., ORDÓÑEZ G. R., JARES P., BASSAGANYAS L., RAMSAY A. J. ET AL. 2011. “Exome Sequencing 70
Identifies Recurrent Mutations of the Splicing Factor SF3B1 Gene in Chronic Lymphocytic Leukemia.” Nature Genetics 44 (1): 47–52. RAI K. R., SAWITSKY A., CRONKITE E. P., CHANANA A. D., LEVY R. N. AND PASTERNACK B. S. 1975. “Clinical Staging of Chronic Lymphocytic Leukemia.” Blood 46 (2): 219–34. ROSSI D., CERRI M., DEAMBROGI C., SOZZI E., CRESTA S., RASI S., DE PAOLI L. ET AL. 2009. “The Prognostic Value of TP53 Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia Is Independent of Del17p13: Implications for Overall Survival and Chemorefractoriness.” Clinical Cancer Research 15 (3): 995–1004. ROSSI D., FANGAZIO M. AND GAIDANO G. 2012. “The Spectrum of Genetic Defects in Chronic Lymphocytic Leukemia.” Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases 4 (1). ROSSI D., RASI S., SPINA V., BRUSCAGGIN A., MONTI S., CIARDULLO C., DEAMBROGI C. ET AL. 2013. “Integrated Mutational and Cytogenetic Analysis Identifies New Prognostic Subgroups in Chronic Lymphocytic Leukemia.” Blood 121 (8): 1403–12. SEBEJOVA L., BORSKY M., JASKOVA Z., POTESIL D., NAVRKALOVA V., MALCIKOVA J., SRAMEK M. ET AL. 2014. “Distinct in Vitro Sensitivity of p53-Mutated and ATM-Mutated Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Ofatumumab and Rituximab.” Experimental Hematology 0 (0). Accessed September 9. STILGENBAUER S. AND ZENZ T. 2010. “Understanding and Managing Ultra HighRisk Chronic Lymphocytic Leukemia.” Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program 2010: 481–88. TE RAA G. D., DERKS I. A., NAVRKALOVA V., SKOWRONSKA A., MOERLAND P. D., VAN LAAR J., OLDREIVE C. ET AL. 2014. “The Impact of SF3B1 Mutations in CLL on the DNA-Damage Response.” Leukemia, November. TRBUSEK M. AND MALCIKOVA J. 2013. “TP53 Aberrations in Chronic Lymphocytic Leukemia.” In Advances in Chronic Lymphocytic Leukemia, edited by Sami Malek, 109–31. Advances in Experimental Medicine and Biology 792. Springer New York. VISCONTE V., ROGERS H. J., SINGH J., BARNARD J., BUPATHI M., TRAINA F., MCMAHON J. ET AL. 2012. “SF3B1 Haploinsufficiency Leads to Formation of Ring Sideroblasts in Myelodysplastic Syndromes.” Blood 120 (16): 3173–86. 71
VISCONTE V., MAKISHIMA H., MACIEJEWSKI J. P. AND TIU R. V. 2012. “Emerging Roles of the Spliceosomal Machinery in Myelodysplastic Syndromes and Other Hematological Disorders.” Leukemia (08876924) 26 (12): 2447–54. WANG L., LAWRENCE M. S., WAN Y., STOJANOV P., SOUGNEZ C., STEVENSON K., WERNER L. ET AL. 2011. “SF3B1 and Other Novel Cancer Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia.” New England Journal of Medicine 365 (26): 2497–2506. WAN Y. AND WU C. J. 2013. “SF3B1 Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia.” Blood 121 (23): 4627–34. WIERDA W. G., KIPPS T. J., MAYER J., STILGENBAUER S., WILLIAMS C. D., HELLMANN A., ROBAK T. ET AL. 2010. “Ofatumumab As Single-Agent CD20 Immunotherapy in Fludarabine-Refractory Chronic Lymphocytic Leukemia.” Journal of Clinical Oncology 28 (10): 1749–55. ZENZ T., MERTENS D., DÖHNER H. AND STILGENBAUER S. 2011. “Importance of Genetics in Chronic Lymphocytic Leukemia.” Blood Reviews 25 (3): 131–37.
72
