Výb r a identifikace genu pro p ípravu rekombinantního proteinu

Autor prezentace: Doc. Mgr. MUDr. Milan Raška, Ph.D.

Prokaryontní/eukaryontní geny

VýbČr a identifikace genu pro pĜípravu Ĝí rekombinantního p proteinu

PĜíprava mRNA plné délky RACE • Pokud je znám pouze fragment cDNA, mRNA • U eukaryontních mRNA • Na 5’ konci mRNA se nachází metylaþní þepiþka • Na 3’konci polyA • systém té gene RACE • kyselá pyrofosfatáza (TAP)

• Prokaryontní geny jsou bez intronu • Pro klonování není nutné pracovat s mRNA • Pokud je známa sekvence požadovaného genu možná PCR amplifikace genomické DNA g • Eukaryontní geny jsou mnohem složitČjší • Genomická DNA obsahuje introny a dlouhé 5’ a 3’ nepĜekládané oblasti • PĜi izolaci genu se nejþastČji pracuje s cDNA • PĜipravena reverzní transkripcí mRNA izolované z bunČk • Odpadá komplikované hledání a eliminace intronĤ • NetGene2 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).

PĜíprava mRNA plné délky RACE

Optimalizace kodonĤ


Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.

• Exprese cizorodých (virových) proteinĤ neþekanČ nízká • Transgenem kódovaná mRNA využívá tRNA s jinou frekvencí než hostitelská buĖka • DĤsledek - buĖka nemá dostatek nČkterých ý tRNA p pro translaci p proteinu • možnost optimalizace kodonĤ (codon optimization) • analýza pomoví www aplikací (in silico analýza) • k aa sekvenci se pĜiĜadí nová cDNA , aby pomČrné zastoupení tRNA odpovídalo hostitelské buĖce • cDNA lze pĜipravit • cílenou mutagenzou • pĜipravit sunteticky buć celou nebo þást • VýtČžek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho Ĝádu • Kodonová K d á optimalizace ti li mĤže Ĥž zefektivnit f kti it napĜíklad Ĝíkl d i DNA vakcinaci k i i


Izolace RNA


PĜíprava p a a na a izolaci o ac RNA RNase free podmínky - RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buĖkami roztoky (DEPC, ( C certifikované f chemikálie od dodavatelĤ) Ĥ) laboratorní materiál plast l t ((chloroform hl f -2h hod; d 0 0,1 1 – 0,02 0 02 % DEPC ddH2O – 2 h hod) d) (0.1 M NaOH, 1 mM EDTA - 2 hod; DEPC ddH2O – 2 hod) (certifikovaný plast plast, novČ otevĜené balení standardního plastu) sklo (mytí jako pro tkánČ, žíhání horkovzdušný sterilizátor 180°C, 8 h

Guanidinová Gua d o á metoda e oda izolace o ace totRNA o RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno jje denaturovat v p prvním kroku manipulace p s buĖkami Resuspendovat bb. v denaturaþním roztoku (10 ml/1g bunČk) guanidin thiocyanate 4M (efektivní denaturace proteinĤ, RNA solubilní) citrát sodný 25 mM pH7 N-lauroylsarcosine 0.5 % 2- ME 0.1 M tČsnČ pĜed použitím (1.8 ml) pĜidat CH3COONa na finální 100 mM pĜidat vodou saturovaný fenol (objem ekvivalentní objemu denat. roztoku) pĜidat CH-IAA (0,2 objemu fenolu) homogenizovat a inkubovat 15 min 0°C Kyselý F-Ch-IAA = DNA a proteiny v organické fázi

laboratorní pĜístroje (þistota (þistota, RNAzap, RNAzap chloroform)

centrifugace a pĜenos vodní fáze do nové zkumavky a další reextrakce

laboratorní pracovník (þistota, organizace práce, rukavice)

precipitace ekvivalentním objemem isopropanolu rozpuštČní pelety v DEPC DEPC-ddH ddH2O

Guanidinová Gua d o á metoda e oda izolace o ace totRNA o RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno jje denaturovat v p prvním kroku manipulace p s buĖkami SmČs všech komponent (kromČ chloroform-IAA) v jednom roztoku je základem mnoha komerþnČ dostupných kitĤ Isogen soge ((Nippon ppo Ge Gene) e) RNA-Stat 60 (Tel-Test) RNAzol B ((Cinna Scientific)) Tri-Pure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim) TRI Reagent (Molecular Research Center) TRIzol Reagent (Life Technologies)

SDS S S+p proteináza o e á a K - izolace o ace RNA Izolace cytoplasmatické RNA z tkáĖových kultur BuĖky v PBS centrifugovat Peletu resuspendovat v lyzaþním pufru , 0°C 50 mM Tris-Cl, pH 8.0 100 mM NaCl 5 mM MgCl2 0.5% (v/v) Nonidet P-40 (rozpouští bunČþnou membránu) pĜipravit pomocí DEPC-H2O Centrifugace a supernatant do nové zkumavky PĜid t SDS na fifinálních PĜidat ál í h 0 0,2 2 % ((w/v) / ) a zamíchat í h t (denaturace proteinĤ) PĜidat proteinázu K na fin. 0,1 mg/ml, 37°C, 15 min (digesce proteinĤ) PĜidat ekvivalentní objem P-Ch-IAA, P Ch IAA protĜepat, protĜepat centrifugace centrifugace, Když je interfáze objemná nahradit organ fázi Ch-IAA, protĜepat, centrifugovat Precipitace RNA z vodní fáze doplnČním na 0,3M 0 3M CH3COONa + 70% EtOH Resuspendovat RNA v DEPC-ddH2O uložit -70°C

LiCl C izolace o ace totRNA o z rostlinné os é tkánČ á Č

Izolace RNA pomocí anexové kolony RNeasy Aktivované silikagelové kolony umožĖují purifikaci RNA pomocí guanidinových pufrĤ s promČnnou koncentrací solí (Qiagen)

Izolace RNA z tkání s vysokým obsahem polysacharidĤ TkáĖ rozdrtit v tekutém dusíku


PĜidat lyzaþní pufr, (pH 8.2 pomocí HCl) 0°C 0 18 M Tris 0.18 0.09 M LiCl 4.5 mM EDTA 1% SDS PĜidat 1/3 objemu fenolu (ekvilibrovaného lyzaþním pufrem pĜed pĜidáním

SDS)

Homogenizovat, pĜidat ¼ objemu chloroformu, homogenizovat, 20 min, 50°C Centrifugace a pĜenos vodní fáze (obsahující RNA) do nové zkumavky Reextrakce F-Ch (až do vymizení interfáze) (3x), naposledy jen Ch (odstraní fenolu) PĜidat LiCl na finálních 2M a precipitovat RNA 12 hod, 4°C Promytí 2M LiCl, resuspendace v DEPC-H2O a reprecipitace v 2M LiCl Resuspendovat finální RNA peletu v DEPC-ddH2O

Izolace o ace NK po pomocí oc výmČnné ý Č é chromatografie c o a og a e na a anexu DEAE

RNA

Purifikace NK iontovČ výmČnnou chromatografií na anexu DEAE aktivovaný silikagel - vazba DNA ovlivnČna pH a koncentrace solí vazba promývání eluce


Purifikace NK iontovČ výmČnnou chromatografií na anexu

Izolace RNA savþí þí RNA (Qiagen) (Qi )

Izolace RNA pomocí silika silika-kolony kolony RNeasy VýtČžek totRNA (ȝg) max 100 ȝg

Zdroj Bb. kultura ((1 x 106 bb.)) NIH/3T3 HeLa COS-7 LMH Huh

10 15 35 12 15

Myš/potkan tkáĖ (10 mg) Embryo b yo ((13 3d dní)) Ledviny Játra Slezina Th Thymus Plíce

Kvasinkovité houby (1 x S cerevisiae S.

25 5 20–30 40–60 30–40 40 50 40–50 10–20

107

bb.) 25

f fungální ál í RNA

Uložení U o e RNA a p protekce o e ce p pĜi e enzymatické y a c é manipulaci Po izolaci je RNA rozpouštČna ve H2O

pĜi -20°C mĤže dojít k degradaci bČhem nČkolika hodin

formamid

vhodné pro dlouhodobé uložení (- 80°C)

pĜed reakcemi s enzymy nutno formamid Ĝedit na max. koncentraci 5%, jinak zvyšuje stringenci, (jakoby reakce probíhala pĜi vyšší teplotČ z pohledu hybridizaþních podmínek)

EtOH precipitát

pĜi -20 20°C C až -80 80°

pĜed použitím pĜidat CH3COONa (pH5,2) na finální koncentraci 0.3M, precipitovat peletu zpracovat jako obvykleykle

Rostliny (100 mg listĤ) Arabidopsis Maize Tomato Tobacco

35 25 65 60

Využití inhibitorĤ RNáz Placentarní inhibitor RNáz – pracovní koncentrace (25 ( to 50 U/ml) / )

PCR C metoda e oda izolace o ace a a amplifikace p ace DNA úseku Výchozí materiál

Amplifikaþní techniky Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.

pĜi izolaci DNA p

1. mRNA - reverzní transkripce 2. genomická DNA PCR amplifikace 1. pĜesná polymeráza proof reading 2 podmínky 2. d í k PCR reakce k se liší tteplotou l t extenze t a teplotou t l t hybridizace h b idi 3. celkovČ þasovČ nároþnČjší 4 pro další manipulaci je tĜeba vnést PCR produkt do vektoru 4.

PCR C návrh á p primerĤ eĤ

PCR návrh primerĤ http://www ncbi nlm nih gov/tools/primer-blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast


PCR návrh primerĤ http://www ncbi nlm nih gov/tools/primer-blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

PCR C metoda e oda izolace o ace a a amplifikace p ace DNA Základní á í vlastnosti DNA polymeráz á použitých ž ý pro amplifikaci f

MDA (multiple displacement amplification) DNA 1. genomická DNA pomocí fágové I29 DNA polymerázy 2. 1 z 106í107 chyb ve srovnání s Tag, 3’- 5’proofreading aktivita

MDA a amplifikace p ace DNA úse úseku u multiple displacement amplification

3. amplifikace úsekĤ 7 – 10 kb

Výchozí materiál

4. primery hexamery modifikované thiofosfátem na 3’konci

1. genomická DNA 2. randomizované primery

MDA - multiple displacement amplification DOP-PCR - degenerate oligonucleotide primed PCR

Práce áce s ge genovými o ý ap proteinovými o e o ý da databázemi abá e

Práce s g genovými ý a Autor prezentace: Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.

proteinovými databázemi







Transformace prokaryontních p y bunČk

Chemická transformace E. coli


• velmi efektivní • standardnČ používaná ve vČtšinČ laboratoĜí • nízké náklady na provedení • vyhĜívaná lázeĖ nebo kádínka s 42°C vodou je jediný pĜístroj •p pĜíprava p chemicky y kompetentních p bunČk •CaCl2 •RbCl •CCMB80 ((KOAc+CaCl2+MnCl2+MgCl g 2) • vlastní transformace spoþívá v pĜidání DNA ke kompetentním buĖkám • krátká inkubace - dochází k adhezi DNA na povrch bunČk • tepelný šok (42°C, 30-90 min) (DNA vstupuje do buĖky) • preinkubace bunČk v LB médiu (37°C, 1 hod) • vyoþkování na tuhé selekþní pĤdy

Elektroporace p E. coli • doþasná destabilizaci bunČþné membrány navozené elektrickým pulsem • možnost pĜipravit kompetentní bakterie pĜedem • bakteriální b kt iál í suspenze ve sterilní t il í vodČ dČ pĜi Ĝi teplotČ tání ledu p bakterií v 10% • uchování kompetentních vodném roztoku glycerolu pĜi -80°C. • podmínky elektroporace • elektrický puls pĜes elektroporaþní kyvetu s kompetentními buĖky a DNA Peleta z 25 ml bakteriální kultury O.D:600 = 0,3; 10 pg DNA; pĜedchlazené elektroporaþní kyvety 0,1 cm štČrbina; 25 PF; 1800 V; 200 . Transfekþní úþinnost dosahuje 3,6x108 transformovaných E. coli na 1 Pg DNA.

• koncentrace bunČk • množství DNA • velikost lik t elektroporaþní l kt þ í kyvety k t • elektrické napČtí •kapacita •pĜípadnČ odpor a prĤbČh pulsu

Metody transfekce savþích bunČk Chemické metody

Transfekce eukaryontních bunČk

•DEAE-dextran DEAE dextran •CaPO4 •Elektroporace •Nukleofekce •Liposomální transfekce •Gene G gun •Virové vektory


DEAE-dextran transfekce • • •

• • • • • • • •

kultivace bb. na Petriho miskách nasadit bb. na koncentr. 2.104bb/cm2 a kultivovat v kult. mediu tak, aby zaplnily 75% plochy misky pĜipravit transfekþní médium DDD (na 1 cm2 ~ 100ml DDD) DDD transfekþní médium: DMEM obsahující 2.5% FCSI 100 mM Chloroquine ( zásobní roztok 100mM) 1mg / ml DNA (rozpuštČná v TE objem maximálnČ 1% DDD) 100mg / ml DEAE-dextran (zásobní roztok 10 mg/ml v 1xPBS) zahĜát na 37°C složky pĜidávat za trvalého míchání v uvedeném poĜadí odsát médium z kultivaþních misek (jamek) okamžitČ nahradit DDD médiem a inkubovat 4 hod hod. a co 5 min míchat krouživým pohybem stanovit bunČþnost zahĜát 10% DMSO/PBS na 37°C odsát transfekþní médium pĜidat 2-3 objemy zahĜátého 10% DMSO/PBS inkubovat 2 – 10 min odsát DMSO/PBS a promýt 1xPBS (stejný objem jako 10% DMSO/PBS ) odsát a nahradit standardním množstvím complete medium obsahujícího10% FCSI kultivovat dle potĜeby

Elektroporace savþích bunČk • buĖky se pĜipravují bezprostĜednČ pĜed elektroporací • promýváním v elektroporaþním pufru 1. RPMI 1640 2. RPMI 1640, 10 mM dextróza, 0,1 mM dithiothreitol 3. 1 x PBS S 4. 15 mM HEPES pufr 5. elektroporaþní pufr 272 mM sacharóza, 7 mM fosfát sodný, pH H 7,4, 7 4 1 mM M MgCl M Cl2 6. pufr o složení 50 mM K2HPO4, 20 mM CH3CO2K, 20 mM KOH, pH 7,4 7 hypoosmolární elektroporaþní pufr 7.

CaPO4 transfekce savþích bunČk precipitát CaPO4 a DNA vzniká za pomalého míchání HEPES pufru s roztokem CaPO4 a DNA den pĜedem nasadit bb v exponenciální fázi rĤstu do 10 cm Petriho misek precipitace DNA EtOH a resuspendování pelety v ddH2O a pĜidat CaPO4 na finální 0.25mM • 500 P Pl 2xHeBS do 15 konické zkumavky y a ppĜidat DNA/CaPO4 ((10-50Pg) Pg) po p kapkách p

• •

HEPES-buffered saline (HeBS) roztok 16.4 g NaCl (0.28 M final) 11 9 g HEPES (0.05 11.9 (0 05 M final) 0.21 g Na2HPO4 (1.5 mM final) 800 ml H2O Titrovat na pH 7.05 pomocí 5 N NaOH PĜidat H2O do 1 litru Sterilizovat filtrací 0.45-um nitrocellulózový filtr Test transfekþní úþinnost Uložit -20 20°C C v 50-ml 50 ml aliquots • • • • •

zamíchat na vortexu precipitace 20 min za laboratorní teploty opatrnČ po kapkách pĜidat na kultury bunČk v Petriho miskách Inkubace 4 -16 hodin CO2 inkubátor odsát médium a pĜidat þerstvé médium

Nukleofekce bunČk


Nukleofekce bunČk

Nukleofekce bunČk

Lipoplexy p p y

Polyethyleniminy y y y

Liang et al, 2006; PNAS

Zanta et al, 1997; Bioconjugate Chemistry


Nanopartikule p lipidové p

Virové transfekþní systémy y y pro p produkci transgenu Efektivní infekce / transfekce pro urþité typy bunČk receptorový mechanismus infekce cílové buĖky • vakcínie • EBV • lentiviry • adenoviry • adenoasociované viry • SV40

Zuber et al, 2003; Angew. Chem. Int. Ed.

Virové transfekþní systémy y y pro p produkci transgenu Efektivita transfekce bunČk daná limitací velikosti inzertu – p sbalení DNA do virového ggenomu a omezení dáno schopností nikleokapsidy • SV40

6 kb

• retroviry

2,5 kb integrace do genomu buĖky (Int)

• adenoviry adeno ir

vstup st p do b buĖky Ėk prostĜednict prostĜednictvím ím C/AR (Non-Int) (Non Int)

• ssAAV

5 kb doba pro syntézu dsDNA nČkolik týdnĤ (Int)

• dsAAV

2.5 kb (1.2 kb)

okamžitý nástup exprese (Int)

• alfaviry

nejintenzivnČjší transientní exprese (Non-Int)

• vakcínie

20 kb (extranukleární)

Stabilita plasmidu a transgenu v buĖkách

Homologní g rekombinace,, episom, ATB selekce Episom - DNA element, který se mĤže replikovat nezávisle na replikaci chromozomu (stejnČ jako plasmid), nebo se mĤže integrovat do chromozomu a p spoleþnČ p s chromozomální DNA. Po opČtném p vystĜižení y zde se replikovat z chromozomu existuje jako cirkulární extrachromozomální DNA, která obsahuje i geny pocházející z chromozomu.


F faktor - fertility (nebo sex) faktor umožĖuje pĜenos genetického materiálu z jedné E. coli, která F faktor obsahuje (F+, samþí, dárcovská) do druhé, která F faktor neobsahuje (F-, samiþí, samiþí pĜíjemcovská) pĜi procesu zvaném konjugace konjugace. plasmid episom souþást bakteriálního chromosomu (Hfr - High freq. of recombination). F plasmid tak jak byl pĤvodnČ popsán má délku témČĜ 105 párĤ bází.

Antibiotická b o c á se selekce e ce p prokaryot o a yo Název Ampicillin

Pracovní ( / l) (mg/ml) 50 - 100

Chloramfenikol v metanolu

20

Gentamycin

15

Kanamycin

30

Tetracyklin v 70% etanolu

12

Mechanismus pĤsobení

Mechanismus rezistence

Baktericidní; zabíjí rostoucí E. coli, inhibuje syntézu stČny potlaþením tvorby pĜíþných p ý vazeb mezi ppeptidoglykany p gy y Bakteriostatický; inhibuje proteosyntézu interakcí s 50S podjednotkou ribozomu a inhibuje reakci peptidyltransferázy

E-laktamáza hydrolyzuje ampicillin dĜíve než se dostane do buĖky Chloramphenikol acetyltransferáza inaktivuje chloramphenikol

Baktericidní; inhibuje proteosyntézu Aminoglykosid acetyltransferáza a interakcí s L6 proteinem 50S podjednotky aminoglykosid nukleotydil transferáza rybozomu inaktivuje gentamicin; mutace v rplF brání vazbČ gentamicinu Baktericidní, inhibuje proteosyntézu, Aminoglykosid (neomycin) inhibuje translokaci a vyvolává poruchy fosfotransferáza, aminoglykosid þtení tripletĤ acetyltransferáza a aminoglykosid nukleotydil transferáza inaktivuje gentamicin a kanamycin Bakteriostatický; inhibuje proteosyntézu Aktivní eflux tetracyklinu z buĖky brání ve vazbČ aminoacyl tRNA na místo A ribozomu

F faktor, a o,Fp plasmid as d V praxi minimalizovaná verze geny zámČrnČ vnesené do F plasmidu (nebo F episomu) ori místo pro zahájení replikace rep gen kódující replikázu par segregaþní geny kódující jednotlivé podjednotky topoizomerázy IV a ccd (ccd stands for coupled cell division) geny vnášeny geny rezistence na antibiotikum, pomocí nČjž je plasmid udržován v následujících j g generacích a dále napĜíklad p g gen kódující j Ȧ fragment g EE galaktozidázy umožĖující D komplementaci. XL-1 Blue F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq ǻ(lacZ)M15]. F' = bakterie, potomek kmene, v nČmž do chromozomu integrovaný F faktor uvolnil i s nČkolika chromozomovými geny a dále je ve formČ episomu. [Geny získané z chromozomální DNA] þást transpozonu Tn10 - gen rezistence na tetracyklin proAB - Ȗ-glutamyl fosfát reduktáza a kináza - metabolismus prolinu represor laktózového l któ éh operonu lacI, l I gen kódující Ȧ fragment E-galaktozidázy ǻ(lacZ)M15.

Satelitní Sa e kolonie oo ep pĜi se selekci e c a ampicilinem pc e


Transientní/permanentní p transfekce bunČþná linie / efektivita transfekce / množství proteinu / kvalita proteinu

Systémy s transientní expresí transgenu • plazmidové vektory • att technologie klonování a pĜenosu DNA • virové vektory (vakcínie životnost bunČk jen 1-2 dny) Systémy y y s permanentní p expresí p transgenu g • plazmidové vektory • linearizované i i é vektory / cirkulární i á í vektory • S/MAR elementy

Transientní expresní p systémy y y Efektivita e v sys systémĤ é Ĥ je ovlivnČna ov v Č • dosažitelnou úþinností transfekce • poþtem kopií genu na buĖku • intenzitou exprese a proteosyntézy • screening expresních vektorĤ pĜed selekcí stabilnČ transfekovaných ý klonĤ • rychlý screening efektu mutací na funkci proteinu • izolace genu z cDNA knihovny - monitorováním aktivity produkovaného proteinu

• retrovirové vektory

Transientní expresní p systémy y y

Stabilní - p permanentní expresní p systémy

COS b buĖky Ėk z lledvin d i Af African i green monkey. k • selekce bunČk s integrací plazmidové DNA do genomu

• získány tranformací origin-defektivním SV40. • COS exprimují p j SV40 velký ý tumor ((T)) antigen g nezbytný y ýk zahájení replikace virové DNA na SV40 ori. • replikace mediovaná SV40 T antigenem mĤže amplifikovat plasmidy obsahující SV40 ori >100,000 v buĖce • vysoká úroveĖ exprese z transfekované DNA.

• nehomologní h l í rekombinace k bi • kotransfekce dvČma nezávislými plasmidy v buĖce ligovány a následnČ integrovány • když y kotransfekce nízká nutno ligovat g in vitro • þetnost integrace je u jednotlivých bb. linií individuální

Selekþní markery používané pro kultury savþích bb. linií -

Bicistronické p plasmidy y

permanentní expresní systémy dominantní selekce • G418 – Tn5 neomycin fosfotransferáza


• selekce 3 – 4 týdny • hygromycin - hygromycin fosfotransferáza • blasticidin – bls gen puromycin – puromycin fosfotransferáza • selekce bČhem nČkolika dnĤ recesivní selekce • eenzymy y y purinové pu ové a py pyrimidinové d ové b biosyntetické osy tet c é kaskády as ády • využitelné pro amplifikaci DNA transgenĤ

Amplifikace p transfekované DNA Selekþní marker

gen

Recesivní selekþní markry y pro permanentní expresní systémy DHFR, dihydrofolate reductase; CAD, carbamoyl-phosphate synthetase, aspartate transcarbamoylase, a dihydroorotase;

Adenosine, alanosine, and 2'deoxycoformycin

Adenosine deaminase

Adenine azaserine, Adenine, azaserine and coformycin

Adenylate deaminase

b-aspartyl hydroxamate or albizzin

Asparagine synthetase

PALA

Aspartate transcarbamolyase

Methotrexate

Dihydrofolate reductase

TK, thymidine kinase;

Methionine sulfoximine

Glutamine synthetase

ADA, adenosine deaminase;

Cadmium

Metallothionein

PNP, purine nucleoside kinase;

a-difluoromethylornithine

Ornithine decarboxylase

AK, adenosine kinase;

M lti l drugs Multiple d

P l P-glycoprotein t i 170

APRT adenosine APRT, d i phosphoribosyltransferae; h h ib l f

6-azauridine or pyrazofuran

UMP synthetase

Mycophenolic acid

Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase

HGPRT, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase;

Biosyntetická dráha purinĤ

SHMT, serine hydroxymethyl transferase; TS, thymidylate synthetase; methotrexát

IMPDH, inosine-monophosphate dehydrogenase. Abbreviations used for enzymes involved in salvage pathways:

XGPT, E. XGPT E coli li xanthine-guanine thi i phosphoribosyltransferase. Other abbreviations: FH, tetrahydrofolate; xyl A, 9-b-D-xylofuranosyl adenine


Recesivní selekþní markery yp pro permanentní expresní systémy

Recesivní selekþní markeryy p pro permanentní expresní systémy hostitelská buĖka musí být deficientní v selekþní vlastnosti

recesivní selekce • enzymy purinové a pyrimidinové biosyntetické kaskády • využitelné pro amplifikaci DNA transgenĤ

• deficientní bb. linie

vČtšinou jde o purinovou a pyrimidinovou biosynthetickou dráhu když je de novo syntéza purinĤ a pyrimidinĤ inhibována buĖky využívají alternativní dráhy (thymidin kináza, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferáza, adenine phosphoribosyltransferáza, adenosine kináza) ke pĜemČnČ nukleotidových prekurzorĤ buĖky deficientní v enzymech alternativních drah pĜežívají když za normálních podmínek = de novo syntéza kde je nezbytná dihydrofolate reduktáza a aspartát transkarbamyláza 1. když je de novo syntéza inhibována (methotrexate) buĖky deficientní v alternativní d. hynou; pokud chybČjící enzym alternativní dráhy je dodán spoleþnČ s transgenem = možná selekce 2. buĖky deficientní v de novo syntetické dráze mohou být selektovány za souþasného odedbrání nukleosidĤ = inhibice alternativní dráhy, pokud chybČjící enzym de novo dodán s transgenem

Amplifikace p transfekované DNA Selekce methotrexátem se používá k amplifikaci kotransfekovaného genu pro dihydrofolát reduktázu u CHO linie deficientní v DHFR (DG44)

Selekce nízkou koncentrací inhibitoru DHFR - metotrexátem po nČkolik mČsícĤ 9 - 12

OvČĜení exprese transgenu

OvČĜéní transkripce p transgenu g

Screenin exprese p 96 jjamkovýý formát Bio Dot


RT-PCR RT PCR

Pozitivita reakce není jednoznaþnČ prĤkazem pĜítomnosti proteinu

Screeningg exprese p mnohojamkový j ý formát Dot Blot

MBL

+

Env

Skrínování supernatantĤ Dot Blot Stem MASP collectins

TM Signal

CRD 63 aa secreted trimeric protein t i 470 aa

gp41

gp120


OvČĜení identityy p proteinu p pomocí Western blotování 10% SDS PAGE native / reducing Supernatants

Non-reducing L

S

L

S

transfected

Reducing L

S

L

of liver

gp120+MBL+His and

serum

were

separated on 10% SDS-PAGE, blotted

S

and probed with sera of the HIV-positive patients p

kD kDa

and

visualized

by y

chemiluminiscence of HRP-labeled anti human Ig Fc mAb. Predicted weight of amino-acid backbone of gp120+MBL is

250

64 6 kDa; pI=8,13. 64,6 pI=8 13

150 100 50 37

Reducing gp120 + MBL

Mock

gp120 +MBL

Mock

/

nonreducing

buffers differences possible oligomerization.

~


Základní pojmy p j y

Vybrané pojmy pro molekulární klonování kl á í

Operon - skupina genĤ nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripþní jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genĤ, které jsou transkribovány do polycistronické mRNA. Gen - základní, fyzická a funkþní jednotka dČdiþnosti. S k Strukturní í gen - úsek ú k DNA zapojený j ýd do produkce d k polypeptidového l id éh ĜĜetČzce. Č Urþuje strukturu proteinu a RNA molekuly ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich exprese. Ne-regulaþní gen. Operátor - oblast DNA, na kterou se váže specifický protein (represor), bránící iniciaci transkripce z pĜilehlého promotoru. Promotor - oblast DNA, na kterou se váže RNA polymeráza a transkripþní faktory zahajující transkripci mRNA.

Základní p pojmy j y

Cis trans test Cis-trans

Cis-trans komplementaþní test - párovací test sloužící k urþení zda dvČ rĤzné recesivní i í mutace t na opaþných þ ý h chromosomech h h di diploidního l id íh organismu i ((pozice i in i trans) se vzájemnČ kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují rĤzné geny, pokud ne, postihují stejný gen. Tento test se oznaþuje i jako test alelismu Cistron – (Benzer) nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci dvou trans mutací ve výše zmínČném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci komplementaci, jestliže tytéž mutace jsou na jednom chromosomu (v poloze in cis). Cistron je tedy sluþitelný s pojmem kódující þástí jednoho genu. Cis regulace - odpovídající cis poloze v cis-trans testu. Polycystronická mRNA - mRNA kódující více než jeden protein. VnitĜní místo nasedání ribozomĤ – místo mezi dvČma úsekyy mRNA kde mĤže dojít k sestavení ribozomu a iniciaci translace mimo 5’nepĜekládanou oblast

dvČ recesivní mutace ((a1,, a2)) pro diploidní, nebo þásteþnČ diploidní urþuje zda dvČ mutace jsou lokalizovány do stejní funkþní jednotky nebo genu

Základní p pojmy j y

Kohezivní a tupé p konce dsDNA

ýtecí rámec - transferové RNA (tRNA) nasedají na templátovou mRNA v pĜesnČ urþených pozicích podle principu komplementarity bází a pĜinášejí aminokyseliny k tvorbČ polypeptidového ĜetČzce ĜetČzce. Komplementarita bází - báze se spojují vždy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné dodržet pĜi navrhování pĜekryvných míst a kohezivních koncĤ DNA bČhem klonování.


GMO - geneticky modifikovaný organismus organismus. Vnesením cizorodé DNA jinou než pĜirozenou cestou (jako je infekce bakteriofágem þi virem, konjugací pĜirozených plasmidĤ a td.) Manipulace je definována zákony y a vyhláškami y ýeské republiky p y ((zákon 178/2001;; 185/2001;; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a naĜízeními Evropského parlamentu a Rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). Roþní hlášení

Základní p pojmy j y Nonsense suppression - potlaþení efektu STOP kodonĤ v dĤsledku pĜítomnosti abnormálních tRNA - vážou se na STOP triplet a pĜinášejí aminokyselinu - umožĖují další prĤbČh translace. - geny jsou uvedeny v genotypu bakterie (SupD, SupE) - vČtšina supresorových tRNA nasedá na STOP Amber (UAG) (UAG), Orche (UAA) (UAA).

Į komplementace p Į komplementace - je fenomén, kdy exprese dvou genĤ, z nichž jeden kóduje N’ terminální úsek E-galaktozidázy (‫ ܤ‬fragment) a druhý kóduje C’ terminální úsek E-galaktozidázy E galaktozidázy (Ȧ fragment), fragment) vede k vytvoĜení funkþního enzymu sestavením dvou polypeptidových podjednotek po jejich nezávislé translaci


Základní charakteristika E. coli

E coli v E. molekulárním kl klonování á í

Základní charakteristika rĤstu E. coli

• Gram negativní tyþka • Cirkulární chromozomem 3.106 párĤ bází • Roste na minimálním médiu obsahujícím • zdroj uhlíku (glukóza) • soli jako zdroj dusíku, fosforu f f a stopových kovĤ Ĥ • Na médiích obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidĤ, vitamíny atd. roste mnohem rychleji • Po P naoþkování þk á í iinokula k l d do obohacených b h ý h médií édií • úvodní lag fáze • exponenciální fáze log (zdvojovací þas 20 - 30 minut) • V log fázi setrvává dokud • nespotĜebuje veškeré živiny • nespotĜebuje kyslík • zplodiny metabolismu (kyseliny) nepĜesáhnou hranici inhibice rĤstu • nepatogenní linie E. coli K-12 je prekurzorem pro vČtšinu laboratorních kmenĤ • pĤvodnČ izolovaná v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v Kalifornii Kalifornii.

Základní charakteristika E. coli • Jsou popsány plasmidy dobĜe se replikující v E. coli • Plasmidy jsou schopny nést DNA inzerty od stovek po statisíce párĤ bází (bacmidy) • V E. coli probíhá Į komplementace • Je známa Ĝada antibiotik použitelných pro selekci E. coli (Ampicillin, ( Kanamycin, Chloramfenikol, Tetracyklin, Neomycin Zeocine) • DobĜe popsány metody transformace E. coli •chemická h i ká C CaCl Cl2, RbCl, RbCl CCMB80 (KOA (KOAc+CaCl +C Cl2+MnCl +M Cl2+MgCl +M Cl2) •elektroporace • Vyvinuty kity na izolaci plasmidové DNA z E. coli •

Kultivace E. coli •Minimální média •A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH4)2SO4; 4,5 g KH2PO4; 10,5 g K2HPO4; 0,5 0 5 g citrát sodný 2H2O; 1 mM MgSO4·7H2O; 0,2% 0 2% glycerol (nebo cukr). •Bohatá média •Luria nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 5 g kvasniþného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mN NaOH). •H H medium: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl •Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 2.5 g NaCl


•Obohacení nČkterými ý nutrienty y mĤže napĜíklad p usnadnit purifikci p nČkterých ý kontaminujících proteinĤ

Aseptické podmínky manipulace s živými organismy i

Desinfekce sterilizace Desinfekce, • Sterilizace laboratorního materiálu • horkovzdušná sterilizace 160°C, 2 hod • autoklávování t klá á í 120 – 136°C, 136°C 20 - 30 min i • chemická (70% alkohol, ostatní) a UV sterilizace povrchĤ • Sterilizace médií – filtrace 0,22 nebo 0,1 Pm • Manipulace s kultivaþními nádobami • uspoĜádání pracovní plochy • postup otevírání a zavírání kultivaþních nádob • zpĤsob pipetování • po doteku okolních povrchĤ pĜedpokládat pĜenos kontaminace

Expresní systémy


Vhodnost expresního p systému y podle velikosti rek. proteinu Velikost proteinu Povaha proteinu

E. coli

< 8 kDa Fúzní

+++

> 8 kDa Intracelulární t ace u á

+++

8-50 kDa Sekretované

++

kvasinky

hmyzí buĖky

savþí buĖky

Vhodnost expresního p systému y podle velikosti rek. proteinu Expresní systém

+++ ++

-

-

-

+

+

+

+

-

Jednoduchá, Hmyzí buĖky bez sializace

+

+

+

+

-

Savþí buĖky

+

+

+

+

+

+++ +++ +++

> 50 kDa Sekretované a povrchové

VýtČžek expresních systémĤ

Chybí Vysoce manosilované glykany g y y

Komplexní

Expresní systémy Produkt Koagulaþní faktory (VII, VIII, IX)

Protein sekretovaný [g/l biomasy] intracelulární rozpustný [g/l biomasy] intracelulární inkluze [g/l biomasy]

E. coli

< 0,5

kvasinky P. pastoris S.cerevisiae 0,2 ¹ 4

0,25

hmyzí buĖky

savþí buĖky

0,001 ¹ 0,5 0,001 ¹ 0,1

Calcitonin

05¹5 0,5

1¹4

0,001

Spoleþnost

Systém

Novo-Nordisk/Bayer/Centeon

BHK buĖky

Genetics Baxter/Centeon/Wyeth

CHO buĖky

Unigene

E. coli CHO buĖky

DNáza ((cystická y fobróza))

Roche

Erythropoetin

Janssen–Cilag/Amgen/Boehringer

CHO buĖky

Darbepoetin

Amgen

CHO buĖky

Folikuly stimulující hormon

0,5 ¹ 5 0,2 ¹ 12

Acetylace Acylace Ȗ-karboxylace

-

Kvasinky y

+++

Fosforylace

-

E. coli

+++

Posttranslaþní modifikace N-glykozylace O-glykozylace

Serono/Organon

CHO buĖky y

CHO buĖky

Luteinizaþní hormon

Serono

CHO buĖky

Gonadotropin

Serono

CHO buĖky

Glukagon

Novo Nordisk Novo-Nordisk

S cerevisiae S.

Glukocerebrosidáza (Gaucher nemoc)

Genzyme

RĤstové hormony (somatotropiny)

Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring

E. coli

S Serono

M ší linie Myší li i

1¹4

CHO buĖky

Serono/Bio-Technology Gener. Corp

CHO buĖky

Eutropin

LG Chemical

S. cerevisiae

Growth factors (GCSF, GMCSF)

Novartis/Essex/Amgen/Roche

E. coli

Platelet derived growth factor (PDGF)

Chugai Pharmaceuticals

CHO buĖky

Janssen-Cilag

S. cerevisiae

Expresní systémy Produkt

Spoleþnost

Systém

PDGF-agonista

ZymoGenetics

S cerevisiae S.

Hepatitis B vakcína

GlaxoSmithKline

S. cerevisiae

Rhein-Biotech

H. polymorpha

Hirudin

Aventis/Novartis

S cerevisiae S.

Insulin a muteiny

Aventis/Lilly/Berlin-Chemie

E. coli

Insulin


Bio-Technology General Corp

E. coli

N Novo-Nordisk N di k

S cerevisiae S. ii

Interferon alpha a muteins

Roche/Essex/Yamanouchi

E. coli

Interferon beta

Schering

E. coli

Biogen/Serono

CHO buĖky

Interferon gamma (mutein)

Amgen/Boehringer

E. coli

Interleukin 2

Chiron

E. coli

Oprelvekin (agonista IL-11)

Wyeth

ROMI 8866

OP-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt)

Curis/Striker

E. coli

TkáĖový aktivátor plasminogenu

Genentech/Roche/Boehringer

CHO buĖky

Aktivátor plasminogenu

Genentech/Roche/Boehringer

E. coli

Faktor kmenových bunČk (SCF)

Amgen

CHO buĖky

Tumor nekrosis faktor (TNF)

Boehringer

E. coli

Výhody E. E coli 1 používány pro klonování DNA i pro expresi 1.

Prokaryontní expresníí systémy té E coli E.

Nevýhody E. coli 1. rekombinantní proteiny nejsou dostateþnČ posttranslaþnČ modifikovány

2. dobrá znalost o jejich chování a kultivaþních podmínkách

1. N-glykosylace

3. krátký zdvojovací þas E. coli desítky minut

2. O-glykosylace

4. efektivní metody transformace

ý mĤstkĤ 3. tvorba disulfidických

5. rostou v tekutých i na tuhých pĤdách

4. štČpení prekurzorových proteinĤ specifickými proteázami

6. v normální atmosféĜe pĜi teplotách od 23°C do 37°C 7. nižší teplotyy umožĖujíj expresi toxických ý rekombinantních proteinĤ 8. výtČžek ý až 5 g proteinu p na 1 litr biomasy y

5 skládání proteinu 5. 2. þasto dochází ke shlukování do inkluzních tČlísek 3. nutno nČkdy použít denaturaþní podmínky izolace p y 4. nutno þasto refoldovat izolované proteiny 5. rekombinantní protein kontaminován endotoxinem


Endotoxin

Inkluzní tČlíska E. coli 1. V cytoplasmatickém nebo periplasmatickém prostoru 2. V savþích buĖkách vznikají z virových kapsidových proteinĤ 3. Nejsou ohraniþena membránou, velikost od 0,2 do 0,6 Pm P 4. TvoĜena nerozpustnými agregáty nesprávnČ složeného proteinu,, bez biologické p g aktivity y ((nČkdy y možno zvrátit)) 5. Ve fázovém kontrastu jako temná tČlíska 6. ýastým ý problémem pĜi expresi 1. transmembránových proteinĤ obratlovcĤ (ve 30% pĜípadĤ) 2. multiproteinových komplexĤ 3 i pĜi 3. Ĝi pouhé hé nadprodukci d d k i jijinak k rozpustných t ý h rek. k proteinĤ t i Ĥ 7. Možno využít pro efektivnČjší purifikaci proteinu

6 drah sekrece proteinĤ z E. coli • typ yp I závisí na ABC transporterech p ((ATP-binding g cassette)) • sekrece typu I je efektivní pro proteiny pod 200 aa • navozena signálem i ál (Hl (HlyA) A) pĜipojeným Ĝi j ý k C’ konci k i rek. k prot. t • typ II je závisí na SEC (SecB), SRP (signal recognition particle), nebo TAT (twin-arginin translocatioon) • zodpovČdná za kumulaci mnoha rekombinantních proteinĤ v periplasmatickém prostoru • zde þasto tvoĜí inkluzní tČlíska • v periplasm. prostoru jsou disulfid-izomerázy a foldázy • v periplasm. prostoru je ménČ proteáz, než v cytoplasmČ

Sekrece typ II v E. coli

Zvýšení ý výtČžku ý a þistoty y rekombinantního proteinu suplementací média GlcNAc

Zvýšení ý výtČžku ý a þistoty y rekombinantního proteinu suplementací GlcNAc

GFAT = L-glutamine-D-fructoseg 6-phosphate aminotransferase


Výhody ý y kvasinkvých ý expresních p systémĤ

Kvasinkové expresníí systémy té

1. Sacharomyces cerevisiae a Pichia pastoris 2 levné 2. l é oproti ti savþím þí expresním í systémĤm té Ĥ 3. dobrá znalost o jejich chování a kultivaþních podmínkách 4. oproti savþím systémĤm krátký zdvojovací þas 5 možno kultivovat do vysokých denzit suspenze 5. 6. známy efektivní sekretorní signály 7. rostou v tekutých pĤdách 8. v normální atmosféĜe pĜi teplotách od 23°C 23 C do 37°C 37 C 9. výtČžek až 4 - 12 g proteinu na 1 litr biomasy


Nevýhody kvasinkových expresních systémĤ

Struktura N-glykanĤ gy

1. proteiny obsahují pouze vysoce manozylované N-glykany • rekombinované linie p produkující j manosidázyy ((MI a MIIx)) a glykosidázy 2 N 2. N-oligosacharidy oligosacharidy neobsahují fukózu 3. oproti E. coli mnohem delší pĜíprava expresního systému 4. nutno selektovat a charakterizovat nČkolik expresních klonĤ pro výrazné rozdíly v expresi rekombinantního proteinu 5. variabilní podíl sekretovaného proteinu z celkového množství proteinĤ syntetizovaných buĖkou • S. cerevisiae max 1%, P. pastoris až 10%

Struktura O-glykanĤ gy

•Kvasinky zahajují O-glykosylaci v endoplasmatickém retikulu •pĜenos Ĝ manózových ó ý h zbytkĤ b tkĤ z dolichyl d li h l ffosfát fát D D-manózy ó na specifický ifi ký serin i nebo treonin •V této chvíli je již protein složen a lokální pomČry rozhodují o prĤbČhu Oglykosylace •IGF a IL-2 zásadní rozdíly v O-glykosylaci, hGM-CSF O-glykosylován jako savþí

Manosidázy pĜi tvorbČ N-glykanĤ N glykanĤ

Hmyzí bunČþné kultury pro bakulovirové ba u ov ové eexpresní p es systé systémy y


Bakulovirové expresníí systémy té

• TkáĖové kultury hmyzích bb. infikovaných rekombinantním bakulovirem s cílem exprese rekombinantního proteinu • Velmi výkonný ý ý expresní p systém y sp posttranslaþní modifikací exprimovaných proteinĤ blízkou savþím systémĤm • Snadný pĜenos DNA do nové kultury infekce • Snadný pĜevod adherentní kultury do suspenzních podmínek kultivace • NepĜítomnost endotoxinu, bezsérová média

Nevýhody hmyzích expresních systémĤ 1. Oproti E. coli mnohem delší pĜíprava expresního systému 2. NČkolikafázová p pĜíprava p rekombinantního bakuloviru 3. Nutnost titrovat rekombinantní bakulovirus, plakový esej 4 Kultivace 4. K li h hmyzích í hb bunČk Čk vyžaduje ž d j pravidelnou id l péþi éþi 5. Zavedení bakulovirového expresního systému je pro experimentální laboratoĜ finanþnČ nároþné 6. Do nedávna nedostupné p techniky y stabilní exprese p p proteinu , dne již vyĜešeno

Bakulovirové systémy y y


Schéma p pĜípravy p y rekombinantní bakulovirové DNA

BunČþné kultury pro bakulovirové systémy systé y Základní pravidla pro kultivaci hmyzích bb bb. linií shodná s pravidly pro TK R díl Rozdíly:

t l t 27 – 28°C teplota normální atmosféra kultivace v suspenzi za trvalého míchání (stĜižné ý minimalizoványy použitím p FBS, sílyy mohou být Pluronic, specielní média Sf-900 SFM) striktní p požadavek vysoké y životnosti >95% % maximální ĜedČní pĜi pasáži 1:3

PĜípravy rekombinantního bakuloviru ba u ov u

BunČþné kultury pro bakulovirové systémy systé y

Izolace rekombinantního bakuloviru - virionu Rekombinantní bakulovirová DNA je transfekována do hmyzích bunČk a ty produkují plnČ infekþní viriony

Produkce rekombinantních proteinĤ ST6GalNAcI ST6GalNAcII GalNAcT2 GalNAcT14

Plakový essej pro stanovení titru viru nutný pro úspČšnou infekci


BunČþné kultury pro bakulovirové systémy systé y Stabilní bakulovirový expresní systém pĜístup zcela odlišný od klasického bakulovirového systému

BunČþné kultury pro bakulovirové systémy systé y


Volba expresního systému

Savþí expresní systémy té

1. prĤkaz zapojení produktu transgenu a charakterizování produktu – transientní transfekce je dostateþná 2. produkce velkého množství preoteinu – vhodná stabilní koamplifikace p 3. produkce toxického proteinu virové expresní vektory vakcínie, alfaviry nebo inducibilní promotor (hsp, interferon ȕ, ionty tČžkých kovĤ, steroidy)

VýtČžnost ý jednotlivých j ý savþích expresních systémĤ

Využití rekombinantních proteinĤ v savþ savþích c expresních e p es c systé systémech ec CV1

SV40

• identifikace genu pro urþitý protein po skríningu cílových bunČk

COS

transfekce 1 Pg/ml

• produkce d k velkého lkéh množství ž t í normálnČ ál Č dostupného d t éh v omezeném é množství

3T3

retrovirus

CHO

transfekce 0.01-10 Pg/ml

• hledání á í fyziologických f i i ý následkĤ á Ĥ exprese urþitého þi é proteinu i

primáti i áti

vakcínie k í i

studium enzymatických drah

293T

transfekce Pg/ml

studium aktivaþních drah

In vitro

Pg/ml

studium regulace exprese

Baculo

Pg/ml

E. Coli

Pg/ml

• potvrzení efektu specifických mutací na funkci proteinu

1-10 Pg/ml 0 1 - 0.5 0.1 0 5 Pg/ml 1 Pg/ml / l

Exprese standard. a mutant. proteinĤ cDNA kihovny, mutantní proteiny PĜenos g genu do zvíĜat Permanentní a intenzivní exprese P d k ttoxických Produkce i ký h proteinĤ t i Ĥ Produkce lidských proteinĤ

Volba promotoru

Vektoryy pro p savþí expresní p systémy y y


Zheng et al, 2005; Molecular Therapy 12(3)

Vektoryy p pro savþí expresní p systémy y y

Vektory yp pro savþí expresní p systémy y y


Minicirklyy

Purifikace minicirklĤ

In vivo o místnČ st Č spec specifická c á rekombinace e o b ace

Když y exprese p nefunguje g j

Regulace exprese v buĖce tTA tetracyklinový transaktivátor – fúzní produkt d kt E. E coli li tetracyklinového t t kli éh represoru a

1. ovČĜení struktury vektoru restrikþní analýzou, sekvenování 2. ovČĜení transfekþní úþinnosti – stejný vektor jiný transgen - reporter 3. ovČĜení transkripce – Northern hybridizace 4. použití vektoru jiného typu konstrukce

VP16 HSV TetP - tetracyklinový promotor Tn10 pĜed minimalizovaným promotorem CMV (' +)

PĜítomnost tetracyklinu inhibuje vazbu tTA na TetP a tím inhibuje expresi

5 nutno zvážit 5. áži aberantní b í sestĜih Ĝih RNA 6 hledání neomutací 6.

transgenu z rekombinovaného pTet-Splice vektoru

Nukleární lokalizaþní signál SV40

Scaffold/matrix associated replicons


Dean et al. 1999 Biotech. Bioing.

Vlastnost 366 bp dlouhého úseku SV40 obsahujícího zaþátek replikace a þasný promotor (podobný efekt fragment obsahující 72 bp repeats) 1000 x množství DNA plasmidĤ v jádru

Scaffold/matrix associated replicons

Nezbytné vybavení TK laboratoĜe 1 OddČlená pracovní plocha - laminární box 1. 2. Humidifikovaný CO2 inkubátor 3. Kultivaþní a manipulaþní média 4. Vhodné kultivaþní a manipulaþní nádoby (jednopoužiĢový plast) 5 Vhodná kultivaþní média 5. 6. Inverzní mikroskop 7. Lednice, mrazící box (-20°C), hlubokomrazící box, tekutý dusík 8. Desinfekþní a sterilizaþní prostĜedky


Udržování TK bb. bb linie v kultuĜe

Aseptické podmínky TK

1 Aseptiþnost 1. A tiþ t práce á

• Ochrana O h bb bb. k kultury lt pĜed Ĝ d infekcí i f k í z prostĜedí tĜ dí a pracovníkĤ íkĤ

2. Vhodné kultivaþní médium

• Ochrana laboratorních pracovníkĤ pĜed infekcí z TK

3. Stanovení koncentrace a životnosti bb. v kultuĜe

• kontaminace inhibuje rĤst, zabíjí bb., zpĤsobuje inkonzistenci experimentálních výsledkĤ,

• tkáĖové kultury suspenzních bb. bb (konfluence) • tkáĖové kultury adherentních bb. (poþítání bb. v jednotkovém objemu) 4. Záznam údajĤ o kultuĜe datum pasáží, koncentrace bb, životnost ži 5. Uchování živých bb. pro další experimenty (zamražování)

• kontaminující mikroorganismy spotĜebovávají živiny z média,, p produkují j toxiny y 1. Separace TK laboratoĜe od ostatních laboratoĜí, boxy s laminárním proudČním (validace), pĜetlak, filtrace vzduchu 2. Ochranné pomĤcky: rukavice, plášĢ, štít 3. JednopoužiĢový plast, pipety, sterilizace médií, ošetĜení lab. skla pro TK

Prevence kontaminace TK • Hl Hlavníí zpĤsob Ĥ b prevence kontaminace k t i jje pravidelná id l á kontrola k t l kultur zamČĜená na • náhlé á é zmČny Č barvy média é i • pokles životnosti bunČk • zákal kultivaþního média

Prevence kontaminace TK ATB • Antibiotika A tibi tik brání b á í rĤstu Ĥ t kontaminujících k t i jí í h mikroorganismĤ ik i Ĥ • penicillin, streptomycin, amfotericin B Pracovní koncentrace antibiotik a antimykotik u savþích tkáĖových kultur ATB Penicillin

• kontrola pod mikoroskopem

St t Streptomycin i sulfate lf t

• analýza typu kontaminace

Kanamycin

• likvidace kontaminovaných kultur radČji než „léþba“

Fi ál í koncentrace Finální k 50-100 U/ml 50 100 mg/ml 50-100 / l 100 mg/ml

Gentam cin Gentamycin

50 mg/ml

Mycostatin

20 mg/ml

Amphotericin B

0 25 mg/ml 0.25

PĜi potĜebČ možno konzultovat s ATB centrem

Kultivaþní média pro TK

Kultivaþní média pro TK • Používat ou v ovČ ovČĜená e média éd nebo ebo p pĜedem ede nové ové typy ypy ovČĜit ovČ


1. 5%, 10%, nebo 20% (v/v) FBS, tepelnČ inaktivované (rĤstové faktory faktory, hormony hormony, MK) 2. 1% (v/v) nonesenciální aminokyseliny 3. 2 mM L-glutamin (zdroj dusíku, v Krebs. cyklu, syntéza NK, proteinĤ, aminocukrĤ) 4. 100 U/ml penicilin 5 100 ug/ml 5. / l streptomycin t t i sulfate lf t

• Použití médií je individuální • Definovaná média dostupná jako prášek, koncentrát, pracovní roztok • Obecná formulace kompletního média záleží na použitém základním médiu

skladovat v temnu , +4°C +4 C max 1 mČsíc uložit malý alikvot do CO2 inkubátoru - kontrola tepelná inaktivace komplementu 56°C, 30 min

Základní média pro TK • BME (Basal medium Eagle`s) Originální Eaglovo médium pro HeLa buĖky v kultuĜe obsahuje Earleyho balansovaný solný roztok

• MEM,, E-MEM ((Minimum essential medium)) Eaglem modifikované eho BME. Vyšší koncentrace AMK. Obsahují Earleyho balancovaný solný roztok, nebo Hanksúv solný roztok, obohacena o Ne-AMK. Ob h j 2 mM Obsahuje M L-Glutamin. L Gl t i

• DMEM (Dulbeccos modified Eagle`s medium) Dulbekova modifikace bazálního Eaglova média. Obsahuje 4x koncentraci aminokyselin a vitamínĤ. DvČ modifikace: high (4.5 g/l glukózy) a low (1.0 g/l glukózy). Dále obsahuje 4mM L-glutamin a 110 mg/l pyruvátu sodného.

• RPMI 1640 (Rosswell Park Memorial institute) 1966 Moor, je modifikací McCoy-ova basálního 5A média. PĜi pH>8 rĤžová barva a zákal - obsahuje fenolovou þerveĖ. Je to zpĤsobeno volnými bazickými AMK, které jsou ménČ rozpustné pĜi basickém pH. PĜi neutrálním pH je þiré a má barvu jako ostatní média (lotosový kvČt). Obsahuje 2mM L-Glutamin.

Základní média pro TK


OvČĜení identityy p proteinu p pomocí Western blotování 10% SDS PAGE native / reducing Supernatants

Non-reducing L

S

L

S

transfected

Reducing L

S

L

of liver

gp120+MBL+His and

serum

were

separated on 10% SDS-PAGE, blotted

S

and probed with sera of the HIV-positive patients p

kD kDa

and

visualized

by y

chemiluminiscence of HRP-labeled anti human Ig Fc mAb. Predicted weight of amino-acid backbone of gp120+MBL is

250

64 6 kDa; pI=8,13. 64,6 pI=8 13

150 100 50 37

Reducing gp120 + MBL

Mock

gp120 +MBL

Mock

/

nonreducing

buffers differences possible oligomerization.

~

Výb r a identifikace genu pro p ípravu rekombinantního proteinu

Recommend Documents