Identifikace proteinu (z gelu nebo z roztoku)

MC230P43 Hmotnostní detekce v separačních metodách, 2014

LC/MS a CE/MS v proteomické analýze OBSAH Příklad jednoduché analýzy Separční techniky MS techniky Identifikace proteinů Určení molekulové hmotnosti Analytická výzva

Mgr. Martin Hubálek, Ph.D. Ústav organické chemie a biochemie AVČR, v.v.i. [email protected]

1


Příklad jednoduché proteomické analýzy

Identifikace proteinu (z gelu nebo z roztoku)

• LC‐MS/MS analýza peptidové směsi (tryptického digestu) • Porovnání MS/MS spekter proti vybrané databázi

2


Přehled analýzy

3


Výsledek analýzy Score

% Cov Accession #

187.29 98.7

Name

Species

Peptides (95%)

sp|P20347|CPI1_SOLTU Cysteine protease Solanum 287 inhibitor 1 tuberosum

MKSINILSFLLLSSTLSLVAFARSFTSENPIVLPTTCHDDDNLVLPEVY DQDGNPLRIGERYIINNPLLGAGAVYLYNIGNLQCPNAVLQHMSIPQFL GEGTPVVFVRKSESDYGDVVRVMTVVYIKFFVKTTKLCVDQTVWKVNDE QLVVTGGKVGNENDIFKIMKTDLVTPGGSKYVYKLLHCPSHLGCKNIGG NFKNGYPRLVTVDDDKDFIPFVFIKA

4


Jednotlivé části analýzy analýza MS

separace Nano HPLC • Kolona: Aclaim PepMap • Rozměr: 75 um x 150 mm • Stacionární fáze: C18 • Velikost částic: 3um • Velikost pórů: 100A • Mobilní fáze: • A – Voda, 0,1% kys. mravenčí • B – Acetonitril, 0,1% kys. mravenčí • Průtok: 300 nl/min • Gradient:

• • • •

Nano ESI Hybridní MS přístroj TripleTOF Uspořádání: kvadrupol ‐ kolizní cela – TOF Akvizice dat: IDA (information dependent acquisition)

Identifikace proteinů • •

SW: Protein Pilot Databáze: proteiny Solanum tuberosum z databáze Uniprot

100 50 0 0

20

40

60

5


Separační systémy pro peptidy a proteiny Gelová Elektroforéza: 1D – SDS PAGE 2D – isoelektrická fokusace, SDS PAGE

HPLC: RP- na C18, gradient acetonitrilu a vody s přídavkem HCOOH nebo CH3COOH, většinou v nano- nebo mikro- měřítku SEC – gelová chromatografie IE – iontově výměnná na silném katexu (SCX kolony), gradient soli při pH~3 na slabám anexu (WAX) separační metody možno kombinovat ve 2D systémech buď on-line, nebo off-line

6


Kapilární elektroforéza chemicky modifikované kapiláry, kyselina octová v methanolu

Aplikace: • Characterizace glykosylovaných biofarmak • Analýza celých proteinů 7


Běžné rozhraní používající sheath liquid - LODs mezi 30 and 100 nM sheathless CE-MS - LODs in the low-nM range Haselberg, R., Ratnayake, C. K., de Jong, G. J., Somsen, G. W., J. Chromatogr. A 2010, 1217, 7605–7611.

Fig. 3 BPE obtained with sheath-liquid CE–MS of a mixture of insulin (1), carbonic anhydrase II (2), ribonuclease A (3) and lysozyme (4) (each 50 μg/mL) using the conventional ESI source and a sheath liquid of (A) 100 mM acetic acid (pH 3.1) and (B) isopro...

Fig. 5 (A) BPE obtained with sheathless CE–MS of a mixture of insulin (1), carbonic anhydrase II (2), ribonuclease A (3) and lysozyme (4) (each 5 μg/mL) using the nanoESI source. (B) Mass spectra obtained in the apices of peak 1–4. (C) Baseline signal and ...

8


MS analýza Iontové zdroje pro peptidy a proteiny MALDI: tvoří se hlavně jednou (výjimečně 2-3 x) nabité ionty. Matrice: kyselina a-hydroxyskořicová, kyselina sinapová, kyselina 2,5dihydroxybenzoová ESI, nanoESI: tvoří se vícenásobně nabité ionty, distribuce nábojových stavů závisí na pH

Hmotostní analzátory pro peptidy a proteiny Jednoduché TOF (ve spojení s MALDI) Hybridní analyzátory (dnes častější) QTOF, LIT Orbitrap, IT FTICR Důležitá disociace 9


Disociace vyvolaná srážkou - CID CID (Collision Induced Dissociation) - metoda fragmentace iontů (MS/MS technika) založená na srážkách iontů s neutrálními částicemi (helium nebo argon). Po srážce dochází k rychlému převedení translační energie na energii vibrační a k její rychlé distribuci po všech kovalentních vazbách. Dochází ke štěpení nejslabších vazeb (zejména peptidových vazeb).

Při CID fragmentaci peptidů vznikají zejména b a y ionty Modifikující funkční skupiny (posttranslačních modifikací) se většinou odštěpují a nelze je detekovat Nejběžnější typ fragmentace, na všech běžných typech přístrojů

10


Disociace vyvolaná srážkou - CID

Vznik iontů série b a y při CID.

Odštěpení modifikací při CID.

11


Disociace záchytem elektronu - ECD ECD (Electron Capture Dissociation) - metoda fragmentace iontů (MS/MS technika) založená na interakci vícenásobně nabitých iontů s nízkoenergetickými (termálními) elektrony v plynné fázi. Tvoří se ionty s lichým počtem elektronů, který díky přebytku energie fragmentují.

[M + 3H]3+ + e[M + 3H]2+•

[M + 3H]2+• [C+2H]1+ + [Z+H]1+• ion c

ion z

Při ECD fragmentaci peptidů vznikají zejména c a z ionty Nedochází ke štěpení modifikujících funkčních skupin (posttranslačních modifikací) Technicky lze uskutečnit pouze na FT ICR instrumentech 12


Disociace záchytem elektronu - ECD

Vznik iontů série c a z při ECD. Při reakci se tvoří hypervalentní radikály RNH3• , které dále disociují. 13


Disociace záchytem elektronu - ECD

14


Disociace přenosem elektronu - ETD ETD (Electron Transfer Dissociation) - metoda fragmentace iontů (MS/MS technika) založená na interakci vícenásobně nabitých iontů s radikál-anionty s dostatečně nízkou elektronovou afinitou, které slouží jako donor elektronů. Mechanismus fragmentace je obdobou ECD.

[M + 3H]3+ + A-• [M + 3H]2+•

[M 3H]2+• + A [C+2H]1+ + [Z+H]1+• ion c

ion z

Při ETD fragmentaci peptidů vznikají zejména c a z ionty Nedochází ke štěpení modifikujících funkčních skupin (posttranslačních modifikací) Technicky lze uskutečnit na iontových pastech, Q-TOFu 15


Disociace přenosem elektronu - ETD

ETD na lineární iontové pasti

16


Disociace přenosem elektronu - ETD

ETD reagenty:

fluoranthen

anthracen

azobenzen

2,2’-bichinolin

17


Multifotonová disociace infračerveným zářením - IRMPD IRMPD (InfraRed MultiPhoton Dissociation) - metoda fragmentace iontů (MS/MS technika) založená na interakci iontů s fotony infračerveného záření. Paprsek IR laseru vstupuje do prostoru ICR cely nebo iontové pasti. Ionty absorbují energii fotonů a jsou excitovány do vyšších vibračních stavů až dojde k fragmentaci vazeb, obdobně jako u CID. Spektra jsou podobná CID.



IRMPD

-na pastech není omezení v nízkých hmotách (pod 1/3 m/z prekurzoru) -vyšší účinnost oproti CID, výhoda u fosfopeptidů

CID

pro ICR, iontové pasti 18


Disociace za zdrojem - PSD PSD (Post Source Decay) - metoda založená na fragmentaci metastabilních iontů v driftovací trubici TOF analyzátorů s reflectronem. Během letu trubicí ionty prekurzoru fragmentují. Fragmenty mají stejnou rychlost jako prekurzor, ale různou kinetickou energii. V TOFu nemohou být rozlišeny (dopadají na detektor ve stejnou dobu), ale v reflektronu ano. Využívá se korelace mezi kinetickou energií fragmentů a jejich hmotností.

19


Identifikace proteinů pomocí MS

20

FraTu ACNvz.3 Q07-12111

1: TOF MS ES+ BPI 1.60e3

100 %

MS

718.8666.8

719.3

765.4

796.1

585.0

740.4

652.4 566.3

582.3

640.4

Smoothing and deisotoping

562.3 728.4

677.3281,721, 2

518.3562.3

637.9

0 16.00 Q07-12111

18.00

20.00

22.00

24.00

26.00

%

225.1 522.80

308.1 571.63

0

16.00 Q07-12111

18.00

20.00

100

120.1 171.2 451.74 589.36

22.00

24.00

16.00 Q07-12111

18.00

20.00

22.00

100 % 0

214.1 796.06

127.1 666.84 289.1 553.31

16.00

18.00

20.00

308.1 917.97

26.00

30.00

267.1 604.04

0

MSMS 3

32.00

373.2;861.47

24.00

26.00

308.1 129.1 201.1 571.11 617.88 668.31

22.00

28.00

308.1 573.31

612.3 129.1 214.1 581.83 579.32 597.30

187.1 187.1 625.80 681.34

%

MSMS 2

30.00

34.00

36.00

38.00 40.00 4: TOF MSMS ES+ BPI 1.32e3

133.1 607.82

100

MSMS 1

28.00

24.00

32.00

28.00

30.00 129.1 730.36

28.00

32.00 233.2 640.35

30.00

36.00

34.00

38.00 40.00 3: TOF MSMS ES+ BPI 475

1198.1 1135.8 1197.57 1135.60

36.00

38.00 40.00 2: TOF MSMS ES+ BPI 204.1 658

968.45 173.1;651.87

120.1 961.95

32.00

110.1 743.42

227.2 637.88

34.00

308.1 289.1 611.98 120.1 1184.6 1184.18 555.12 528.28

213.1 526.82

187.1 173.1 582.29 677.33

26.00

591.3 591.86

34.00

36.00

38.00

199.2 633.42

Time 40.00

FraTu ACN vz.3 Q07-12111 634 (28.609)

1: TOF MS ES+ 721

677.3281

100

677.8263 652.4147

MS

677.8474

%

677.8687

678.3564

FraTu ACNvz.3

1353.7137

Q07-12111 140 (28.750)

1354.7330 615.1773

740.3848 740.8834

555.1049

0 400

500

600

700

800

900

100

1000

1100

1200

1300

1400

1500

MSMS

173.1297

1355.7072 1188.5975 1105.0869 1189.5382 1356.7720

741.4045 881.2511

173.1404 m/z

Q07-12111 634 (28.609)

1: TOF MS ES+ 721

677.3281

100

%

FraTu ACNvz.3

201.1263

MS zoom in

677.8263 677.8474 677.8687

70.0332 1.0794 70.0671 8.1202 72.0876 11.3469 73.5504 2.1043 74.0656 3.1383 83.0607 2.1134 84.0828 25.2925 85.0589 1.0522 85.0898 3.0612 86.1002 48.8639 96.0747 4.1043 98.0287 3.1927 98.0612 2.2358 98.1019 5.9909 … 283.2370 2.1927 284.1254 11.0181 284.1629 37.8798 284.2126 9.7188 285.0384 4.7891 .. 1065.5466 3.1043 2:1105.6334 TOF MSMS 677.33ES+ 3.1474 381 1107.6312 4.1043 1163.6843 6.1043 1164.5432 1.0703 1164.6282 1.0181 1164.7012 1.0522 1165.6370 2.1043 1209.6985 3.1474

%

316.1614

462.2640 662.4057 530.2639

678.3564

777.3981 876.4710 990.5370

1153.5664

0 678.8868 673.3494 674.3748

676.3747

100

680.5109 681.4460

0 673

674

675

676

677

678

679

680

681

682

683

200

300

400

500

600

700

800

900

1000 1100 1200

m/z

21

m/z


Fragmentace iontů peptidů

Při fragmentaci dochází ke štěpení vazeb mezi aminokyselinami a vznikají iontové série označované písmeny. Štěpení peptidové vazby v hlavním řetězci odpovídají ionty typu (série) b a y, štěpením za peptidovou vazbou vznikají ionty typu (série) c a z.

Immoniové ionty usnadňují interpretaci – přímá informace o aminokyselině v sekvenci

22


MSMS scoring function The comparison of theoretical and experimental MS/MS spectra is performed by scoring function and the score (ideally complemented by p‐value) is used to recognize the correct peptide from the database. Reliable peptide identification can be then considered for protein identification. FraTu ACN vz.3

Q07-12111 140 (28.750) 100

2: TOF MSMS 677.33ES+ 381

173.1297

%

173.1404

201.1263

316.1614

462.2640 662.4057 530.2639

0

100

200

300

400

500

600

777.3981 876.4710 990.5370

700

800

900

1153.5664

1000 1100

1200

m/z

Match of an experimental spectrum with a peptide sequence •Intense peaks should match •As many as possible peaks should match •Series of contiguous matches

23


MS/MS sekvenování

V CID MS/MS spektrech se vyskytují série b a y iontů. Ionty v obou sériích se od sebe liší o zbytky (rezidua) aminokyselin. Součet b a y iontu mínus 1 dává molekulový adukt: b+y-1 = (M+H)+ 24


MS/MS sekvenování

25


Pokrytí sekvence, spolehlivost identifikace Pokrytí sekvence – část sekvence vyjádřená v procentech, která je podložena experimentálními daty (identifikovanými peptidy).

Větší množství identifikovaných peptidů = vyšší spolehlivost identifikace proteinu. Pokrytí sekvence u bottomup maximálně 40-90%.

26


enzymatické štěpení proteinů Vhodný enzym štěpí specificky za malým počtem aminokyselin. Trypsin – nejčastěji používaný, štěpí za Arg a Lys, poskytuje relativně krátké peptidy vhodné pro MS/MS. Bazické skupiny (kromě His) jsou na C-konci řetězce, což vede ke vzniku dobře interpretovatelných MS/MS spekter. Příklad: PPKAYEVRIVTKMVAVGICR

PPK + AYEVR + IVTK + MVAVGICR

Lys-C – specificky štěpí za Lys, produkuje delší peptidy než trypsin, obtížnější interpretace MS/MS spekter (Arg uvnitř řetězců). Glu-C – méně specifické štěpení v závislosti na pH za Glu nebo i za Asp, obtížnější interpretace MS/MS spekter (Arg, Lys uvnitř řetězců). Asp-N – štěpí na N-konci Asp Chymotrypsin – málo specifické štěpení za hydrofobními kyselinami, obtížnější interpretace MS/MS spekter (Arg, Lys uvnitř řetězců).

27


De novo sekvenování peptidů De novo sekvenování - způsob přímé interpretace MS/MS spekter peptidů. Hledají se ionty stejných sérií, které se vzájemně liší o zbytky aminokyselin. Ze spektra lze přímo odečíst sekvenci aminokyselin. Lze provádět „ručně“ nebo za pomoci softwaru.  výhodou je možnost identifikace peptidů a proteinů, které nejsou v databázích.

28


peptidové mapování Peptidové mapování (Peptide Mass Fingerprinting, PMF) - metoda identifikace proteinů založena na tom, že každý protein po specifickém štěpení poskytuje unikátní soubor peptidů. Protein se naštěpí na peptidy a změří se MS spektrum této směsi (nejčastěji MALDI, ale i ESI). Hmotnosti (m/z) iontů peptidů jsou pak srovnávány s teoretickými hodnotami vypočítanými z proteinových nebo DNA databází (štěpení “in silico”).

databáze

Identifikace 29


Top-down analýza proteinů

Top-down proteomika - Intaktní proteiny jsou ionizovány pomocí ESI (nanoESI) a zachyceny v ICR cele nebo iontové pasti spektrometru. Následuje fragmentace, nejčastěji metodou ECD nebo ETD. Vyžaduje instrument s velkou rozlišovací schopností.

Middle-down proteomika – proteiny jsou enzymaticky štěpeny na velké peptidy (5–20 kDa), které jsou dále sekvenovány metodami top-down.

30


Databáze proteinových sekvencí Existuje celá řada databází, některé poskytují celou řadu doplňujících informací o proteinech. UniProt Knowledgebase – kombinovaná databáze Swiss-Prot (anotovaná) proteinová sekvenční databáze s minimálními redundancemi) a TrEMBL (překlad nukleotidové sekvenční databáze EMBL). http://www.expasy.uniprot.org/

ExPASy Proteomics Server – portál věnovaný analýze proteinů, nástroje pro MS, odkazy, 2D SDS PAGE. http://www.expasy.org/

National Center for Biotechnology Information – portál veřejně přístupných databází s molekulárně-biologickými informacemi a softwarovými nástroji pro analýzu dat. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

31


Určení molekulové hmotnosti: MALDI

Při MALDI ionizaci se proteiny nabíjí malým počtem nábojů, většinou jedním nebo dvěma. S vyjímkou analyzátorů s velmi vysokým rozlišením nelze pozorovat oddělené izotopické píky, ale jen jejich obalovou křivku. Měříme tak průměrnou hmotnost.

32


Vliv solí na spektra peptidů a proteinů

Odsolení vzorku SPE na C18, C4 (ZipTip)

MALDI spektrum vzorku peptidu s vysokou koncentrací solí

Přítomnost solí ve vzorku se projeví tvorbou aduktů, nejčastěji s Na+, K+. Pokud analyt obsahuje kyselé funkční skupiny (karboxyl, fosfát apod.) může dojít k výměně kyselých protonů za tyto ionty. Spektra jsou komplikovaná, snižuje se odezva -> zasolené vzorky je nutno čistit (pro ESI bez HPLC, MALDI).

33


Určení molekulové hmotnosti: ESI a nanoESI

Biomolekuly (proteiny, oligonukleotidy ..) obsahují větší množství center (funkčních skupin), na kterých může dojít k ionizaci (protonizaci, kationizaci, deprotonizaci). V ESI a nanoESI spektrech poskytují tyto látky řadu píků, které odpovídají různým nábojovým stavům téže molekuly. 34


Určení molekulové hmotnosti: ESI a nanoESI = určení nábojového stavu (z) u některého iontu z izotopického klastru

z lze určit

ze vzdálenosti sousedních píků

Molekula o hmotnosti M se nabije z-krát protonem, pík iontu ve spektru je na mz:

M  zH   mz z

tj.

M  z (mz  H  )

Pro dva sousední píky ve spektru (j,k) platí: 



M  z j (m j  H )  ( z j  1)( mk  H )

mk  H  zj  mk  m j

zk 

mj  H  mk  m j

vzorce pro výpočet nábojového stavu dvou sousedních iontů ve spektru

35


Určení molekulové hmotnosti: počítačová dekonvoluce V praxi se využívá počítačových dekonvolučních algoritmů, které změřené ESI spektrum převedou na spektrum jednou nabitých iontů (tj. ve spektru po dekonvoluci je pouze ion [M+H]+.

naměřené spektrum

spektrum po dekonvoluci 36


Určení hmotnosti z ESI spektra - cvičení

jed taipana (Oxyuranus)

Jaká je mol. hmotnost peptidu?

mk  H  zj  mk  m j

zk 

mj  H  mk  m j

37


Určení hmotnosti z ESI spektra - cvičení

38


De-novo sekvenování – cvičení Jaká je sekvence peptidu?

! součet reziduí v sérii + 18 + 1 = (M+H)+ 39


De-novo sekvenování – cvičení

LGSEVYHNLK

(M=1158.603)

40


Nejen jeden protein • Analýza proteinů ve směsi s ostatními

41


Proteomika Proteomika je vědní obor, který se zabývá studiem proteinů, jejich struktury a funkcí. “Proteom” zahrnuje všechny proteiny (včetně modifikovaných), které jsou součástí daného organismu nebo systému v daný časový úsek. Složení proteomu je dynamické a závislé na okamžitém stavu organismu.

DNA

genomika

RNA

transkriptomika

proteiny

proteomika

metabolity

metabolomika

42


Proteomická analytická výzva 1. Komplexita – velké množství proteinů 2. Velký dynamický rozsah koncentrace proteinů • V celém v séru, v tkáních, v buňce

43


Komplexita proteomu Příklad: člověk

(Jensen O.N., Curr. Opin. Chem. Biol., 2004, 8, 33-41, PMID: 15036154).

44


Referenční interval pro 70 proteinových analytů v plasmě.

Anderson N L , and Anderson N G Mol Cell Proteomics 2002;1:845-867

45


Rozdíl 12 řádů

46


• Používané separační a analytické metody v proteomice (2‐D elektroforéza nebo LC/MS/MS) mají dynamický rozsah 102–104

Jak vyřešit?

47

100 90 80 70 60

Aclaim PepMap 75 um x 150 mm C18, 3um, 100A

50 40 30 20 10 0

48


15 cm, 125 min

25 cm, 125 min

25 cm, 185 min

49


XIC ‐ Extracted Ion Chromatogram (0.05 Da) m/z 850.511 m/z 945.49

15 cm, 125 min

25 cm, 125 min

0.331

0.249

0.383

0.327

25 cm, 185 min

0.545

0.475

šířka píku (50%)

50


15 cm, 125 min Spectra

33627

Proteins Distinct Detected Peptides

Spectra % Total Identified Spectra

1099 13459 23145

68.8

25 cm, 125 min Spectra

35509

Proteins Distinct Detected Peptides

Spectra % Total Identified Spectra

1330 14106 23965

67.5

25 cm, 185 min Proteins Spectra Detected

58009

Distinct Spectra % Total Peptides Identified Spectra

1650 20175 39848

68.7 51

25 cm, 125 min, 5% DMSO Proteins Spectra Detected

38113


1634 18236 26972

70.8

25 cm, 185 min, 5% DMSO Proteins Spectra Detected

63876


2066 23773 45251

70.8

52


• Používané separační a analytické metody v proteomice (2‐D elektroforéza nebo LC/MS/MS) mají dynamický rozsah 102–104

Jak vyřešit? • Frakcionace – vícedimensionální chromatografie • Obohacení skupin analytů – Afinitní chromatografie – protilátky – Chelatační chromatografie – Phospho – Lektiny – glykoproteiny

• Jiné MS metody ‐ Selected Reaction Monitoring (metoda s největším dynamickým rozsahem – 5řádů) 53

Identifikace proteinu (z gelu nebo z roztoku)

Recommend Documents