Struktura, funkce a význam proteinu BRCA1

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta

Bakalářská práce

Struktura, funkce a význam proteinu BRCA1 Jan Hojný

Školitel: MUDr. Zdeněk Kleibl, PhD. Konzultant: RNDr. Jan Brábek, PhD.

Praha 2010

Poděkování patří mému školiteli MUDr. Zdeňku Kleiblovi, PhD. za pomoc, cenné rady, ochotu a neskonalou trpělivost, které mi poskytl při psaní této práce. Dále bych chtěl poděkovat své mamce a kamarádovi Tomáši Zaydlarovi za kontroly textu a RNDr. Janu Brábkovi, PhD. za konzultace.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma: Struktura, funkce a význam proteinu BRCA1 vypracoval sám s použitím uvedené literatury a na základě konzultací se svým školitelem.

Jan Hojný Praha 2010

2

Abstrakt Studium příčinných faktorů vzniku dědičně podmíněné formy karcinomů prsu a ovarií vedlo k objevu genu Breast Cancer 1, (BRCA1). Produktem tohoto tumor supresorového genu je jaderný fosfoprotein sehrávající kritickou úlohu v opravě genomové DNA, čímž se podílí na kontrole genomové integrity. Úloha proteinu BRCA1 spočívá především ve správném sestavení reparačních komplexů, které se seskupují v místech dvouřetězcových zlomů DNA. Nadto protein BRCA1 přispívá i k regulaci kontrolních bodů buněčného cyklu a k regulaci genové exprese v důsledku poškození genomové DNA, díky čemuž sehrává jednu z klíčových rolí v celkové intracelulární odpovědi na genotoxické poškození. Ztráta této funkce vede k selhání DNA reparačních mechanizmů za současné tolerance genových alterací v takto poškozených buňkách. Stav této genomové nestability je základem maligní transformace a časným krokem vzniku zhoubného nádoru v buňkách s inaktivovaným proteinem BRCA1. Cílem této práce je shrnutí poznatků o struktuře, známých funkcích a významu proteinu BRCA1

především

z pohledu

nových

objevů,

které

se

týkají

tvorby

různých

multiproteinových komplexů, ve kterých protein BRCA1 hraje úlohu muliplatformního interakčního partnera, zásadního pro správnou funkci reparace DNA.

Klíčová slova: BRCA1, karcinom prsu, reparace DNA, dvojřetězcové zlomy v DNA, homologní rekombinace

3

Abstract Studies of factors contributed to the development of hereditary breast and ovary cancers lead to the discovery of Breast Cancer 1 gene (BRCA1). The protein product of this tumor suppressor gene is nuclear phosphoprotein that plays a critical role in DNA repair and it is required for genome integrity control. The BRCA1 protein is the key component for correct assembly of reparation complexes formed in sites of DNA double strand breaks. Furthermore, BRCA1 protein is implicated in regulation of cell cycle checkpoints and it is also involved in regulation of gene expression in response to DNA damage. These activities suggest that BRCA1 protein plays a crucial role in orchestration of intracellular response to genotoxic DNA damage. Loss of BRCA1 functions leads to the DNA-damage repair mechanisms failure resulting in genomic instability and a tolerance of genomic alterations in affected cells. The genomic instability is the initial step toward early malignant transformation of cells lacking BRCA1 proteins. The aim of this work is to summarize the information about structure, functions known and the importance of BRCA1 protein with respect to the current discoveries enabling elucidation of versatile BRCA1-containing multiprotein complexes in which BRCA1 protein acts as the multiplatform interacting partner essential for proper DNA repair processes.

Key words: BRCA1, Breast cancer, DNA repair, Double-strand DNA breaks, Homologous recombination

4

Obsah 1

Úvod .................................................................................................................................... 6

2

Lokalizace a struktura BRCA1 genu ................................................................................... 7

3

Struktura proteinu BRCA1 ................................................................................................. 8 3.1 RING finger doména ...................................................................................................... 8 3.2 BRCT domény a transkripci-aktivující doména (TAD) ............................................... 10 3.3 Nukleární lokalizační signály (NLSs) .......................................................................... 11 3.4 SCD (Serine-containing domain) ................................................................................. 12 3.5 DNA vazebná doména ................................................................................................. 12

4

Funkce proteinu ................................................................................................................ 13 4.1 Tvorba komplexů s proteinem BRCA1 ........................................................................ 13 4.1.1

BRCA1/BARD1 „Core complex“ ...................................................................... 14

4.1.2

BASC – BRCA1-associated genome surveillance complex .............................. 14

4.1.3

BRCA1 A komplex ............................................................................................ 15

4.1.4

BRCA1 B komplex ............................................................................................ 16

4.1.5

BRCA1 C komplex ............................................................................................ 16

4.1.6

BRCC komplex .................................................................................................. 16

4.2 Reparace DNA a úloha proteinu BRCA1 .................................................................... 17 4.2.1

Signalizace poškození DNA............................................................................... 17

4.2.1.1

ATM signální dráha .................................................................................... 18

4.2.1.2

ATR signální dráha ..................................................................................... 19

4.2.1.3

Fanconi anaemia / BRCA1 signální dráha .................................................. 19

4.2.2

Oprava DNA poškozené dvouřetězcovými zlomy ............................................. 20

4.2.3

DNA reparace asociovaná s transkripcí (TCR) .................................................. 22

4.3 Úloha BRCA1 při regulaci transkripce ........................................................................ 22 4.4 Podíl BRCA1 na regulaci buněčného cyklu a apoptózy .............................................. 24 5

Význam genu BRCA1 v onkologii .................................................................................... 26

6

Diskuze ............................................................................................................................. 28

7

Seznam zkratek ................................................................................................................. 30

8

Seznam použité literatury.................................................................................................. 32

5

1

Úvod

Karcinomy prsu a ovaria jsou jedny z nejzávažnějších nádorových onemocnění v populaci žen. Jejich incidence trvale roste a je nejvyšší především ve vysoce vyspělých zemích. Malou, ale z hlediska celkového dopadu onemocnění podstatnou, část případů karcinomů prsu a ovaria činí dědičné nádory, které postihují některé rodiny častým výskytem těchto onemocnění u osob v mladém věku. Nemalé úsilí bylo investováno do identifikace příčiny tohoto onemocnění koncem 20. století, které vyústilo v nalezení dvou hlavních predispozičních genů BRCA1 a BRCA2. Gen BRCA1 byl identifikován v roce 1994 prací několika skupin pod vedením Kingové a Mikiho (Miki et al., 1994). Charakterizace predispozičních genů umožnila zahájení nové éry diagnostiky a péče o vysoce rizikové nosiče mutací v populaci. Teoretický výzkum, který se od objevu genu BRCA1 soustředil na poznání funkcí jeho genového produktu, vedl k pochopení důležitosti proteinu BRCA1 v procesu reparace DNA (hlavně homologní rekombinací), signalizace tohoto poškození, ovlivňování transkripční aktivity proteinem BRCA1 a jeho úlohy v regulaci buněčného cyklu a apoptózy. Přes tyto pokroky však zbývá odpovědět na řadu otázek, které se týkají přesných molekulárních mechanizmů reparace DNA, které jsou kriticky závislé na funkci proteinu BRCA1.

6

2

Lokalizace a struktura BRCA1 genu

Prvotní lokalizace oblasti zodpovědné za vývoj časného karcinomu prsu (17q21) u žen byla provedena na začátku 90. let Hallem pod vedením Kingové (Hall et al., 1990). O čtyři roky později byla na základě pozičního klonování oblasti chromozomu 17q21 (dlouhé rameno 17. chromozomu v pruhu 21) identifikována DNA sekvence odpovídající genu BRCA1 (Obr. 1) a následně byla sekvenována oblast přiléhající k BRCA1 genu o velikosti 117 143 bp. Samotný gen BRCA1 (OMIM 13705) o velikosti 81,188 kb je tvořen 24 exony (22 kódujících, 2 nekódující), které obsahují 5,5 kb kódující sekvence (Miki et al., 1994; Smith et al., 1996). Délka jednotlivých exonů genu BRCA1 kolísá v širokém rozmezí; nejrozsáhlejším exonem, který zahrnuje více než 65% kódující sekvence, je exon 11. Intronové sekvence genu BRCA1 se vyznačují vysokým výskytem Alu repetic, které se společně s BRCA1 pseudogenem lokalizovaným před vlastním BRCA1 lokusem významně podílejí na zvýšené pravděpodobnosti vzniku BRCA1-intragenových přestaveb, které se vyskytují přibližně u 10% nosičů dědičných mutací v genu BRCA1 (Ticha et al., 2010).

Obrázek 1: Schematické znázornění lokalizace genu BRCA1 na dlouhém rameni chromozomu 17

Finální mRNA transkript divoké formy genu BRCA1 má velikosti 7,8 kb. Tento transkript byl nalezen v mnohých tkáních včetně varlete, brzlíku, prsu a vaječníků (Miki et al., 1994). Na základě tohoto zjištění bylo později dokázáno, že exprese BRCA1 je polyubikvitní. Kromě dominantní formy mRNA obsahující všech 24 exonů genu je možné tkáňově specificky detekovat různé alternativní sestřihové varianty. Jedna z hlavních je tzv. BRCA1 IRIS (inframe reading of BRCA1 intron 11 splice variant) obsahující sekvenci alternativních exonů (ElShamy a Livingston, 2004).

7

3

Struktura proteinu BRCA1

Translací wt mRNA transkriptu BRCA1 vzniká protein BRCA1 o velikosti 220 kD skládající se z 1863 aminokyselin. Tento, převážně jaderný, fosfoprotein zahrnuje několik funkčně významných strukturních oblastí (Obr. 2), které umožňují asociaci s rozsáhlou skupinou interagujících proteinů, vazbu na DNA a účast na přenosu signálu v signálních kaskádách. Strukturně nejvíce konzervativní úseky se nacházejí především na obou koncích proteinu BRCA1 v podobě RING finger domény a BRCT domén.

Obrázek 2: Schematický nákres BRCA1 proteinu s vyznačenou polohou RING finger a BRCT domén, nukleárními lokalizačními signály (NLS1,2), DNA-vázající doménou a doménou bohatou na přítomnost serinových zbytků (SCD) a transkripci-aktivující doménu (TAD).

3.1 RING finger doména Na N-konci BRCA1 proteinu (mezi aminokyselinou 24 – 65; Obr. 2) se nachází RING (really interesting new gene) finger doména s typickou Cys3-His-Cys4 strukturou, která umožňuje vazbu dvou kationtů Zn2+ (Obr. 3). RING finger doména je vysoce konzervativní proteinový motiv charakteristický pro jednu z podskupin E3 ubikvitinligáz – enzymů sloužících pro specifické rozpoznání a ubikvitinylaci intracelulárních proteinů. Mimo to je tato doména místem pro interakce s dalšími proteiny a pokud asociuje s proteinem taktéž obsahujícím RING finger doménu, je E3 ubikvitinligázová aktivita vzniklého komplexu významným způsobem zesílena (Miki et al., 1994; Lorick et al., 1999; Morris a Solomon, 2004).

8

Obrázek 3: Diagram struktury RING finger domény proteinu BRCA1. Červeně jsou vyznačené 3 αhelixy, zeleně 3 β-listy. Žlutě (Cys) a oranžově (His) jsou vyznačeny místa (Site I a II) pro vazbu kationtů Zn2+ (černě), stabilizujících strukturu RING finger domény. (Převzato z Brzovic et al., 2001)

Protein BRCA1 RING doménou asociuje s proteinem BARD1 (BRCA1-associated RING domain protein; Obr. 4) a vytváří tak stabilní heterokomplex se silnou E3 ubikvitinligázovou aktivitou. Ta je podstatná pro proces opravy poškozené DNA (Wu et al., 1996; Morris a Solomon, 2004). Protein BARD1 připomíná protein BRCA1 podobným doménovým uspořádáním (s RING finger doménou na C-konci a terminálně lokalizovaným BRCT na Ckonci).

Obrázek 4: Schéma BRCA1/BARD1 interakce RING doménami. Červeně jsou vyznačené α-helixy BRCA1, modře α-helixy BARD1, zeleně β-listy. Žlutě (Cys) a oranžově (His) jsou vyznačeny ligandy vazebných míst pro Zn2+, která jsou vyznačena černě. Vysokou stabilitu asociace BRCA1BARD1 zajišťuje uspořádání dvou α-helixů obou proteinů přiléhajících k oblasti obsahující Zn2+, které vytvářejí mohutný svazek ze čtyř alfahelixů. (Převzato z Brzovic et al., 2001)

9

V interakci s BRCA1 kompetuje s proteinem BARD1 protein BAP1 (BRCA1-associated protein 1), který je strukturně homologní C-koncovým ubikvitinhydrolázám (Jensen et al., 1998). S RING finger doménou BRCA1 interaguje i řada dalších proteinů, jako jsou regulátory buněčného cyklu - cykliny (D1, A, B1) s cyklin-dependentními kinázami (CDK1, CDK2, CDK4) či protein E2F4 - transkripční faktor z rodiny E2F (Wang et al., 1997). Zn2+-vázající aminokyselinové zbytky RING finger domény jsou kritické pro její stabilizaci a pro přenos ubikvitinu na substrát, čímž je označen. Jediná záměna nukleotidu v části genu, který kóduje tyto domény, způsobuje ztrátu ligázové aktivity komplexu. Odstraněním RING finger domény je inhibována schopnost BRCA1 proteinu modulovat opravu DNA v odpovědi na její poškození a apoptózu (Ruffner et al., 2001; Fan et al., 2001), což ukazuje na kritickou úlohu tohoto proteinového motivu ve funkci BRCA1 proteinu. Tyto in vitro studie podporuje i pozorování molekulárně genetických vyšetření u nosičů mutací v genu BRCA1. Tato vyšetření ukazují na fakt, že v oblasti RING domény se vyskytují i některé opakující se missense mutace, které mají prokazatelně patogenní účinky (např. častá záměna cysteinu 61 za glycin - p.C61G destabilizující RING doménu; Pohlreich et al., 2005).

3.2 BRCT domény a transkripci-aktivující doména (TAD) Analýza sekvence BRCA1 genu prokázala v oblasti C-konce kódující sekvence přítomnost tandemu repetitivních BRCT domén (BRCA1 C-terminus; Obr. 2). BRCT 1 byla lokalizována mezi aminokyselinami 1642 – 1736, BRCT 2 mezi 1756 – 1855 (Obr. 5).

Obrázek 5: Struktura BRCT domén BRCA1 proteinu získaná na základě krystalografických studií ukazuje obě BRCT domény BRCA1. Každá z domén obsahuje centrálně lokalizovaná jádra složená ze čtyř paralelně uspořádaných β-skládaných listů (zeleně) obklopeného třemi α-helixy (žlutě): Obě BRCT domény jsou spojeny pravděpodobně flexibilním linkerem (modře), který má důležitý podíl na stabilizaci celé struktury. (Převzato z Williams et al., 2001)

10

BRCT domény jsou konzervativní fosfoproteinové interakční moduly, které umožňující specifickou protein-proteinovou interakci, díky které vznikají homo- i heteromerní proteinové komplexy. BRCT domény se vyskytují u řady proteinů, jež regulují buněčný cyklus a jež se účastní odpovědi na poškození DNA (Koonin et al., 1996; Bork et al., 1997; Williams et al., 2001). Díky fosfoserin/threonin-vázajícím místům BRCT domény rozpoznávají BRCA1 substráty fosforylované ATM a ATR kinázami v signálních drahách odpovědi na poškození DNA, což umožňuje vznik různých reparačních komplexů (Manke et al., 2003). Na základě interakcí BRCT doménami asociuje BRCA1 s proteiny, jež regulují reparaci DNA. Těmito proteiny jsou BACH1 (BRCA1 associated C-terminal helicase), Abraxas (ABRA1), CtIP (C-terminal interacting protein) a dále pak RNA helikáza A (RHA), která je součástí holoenzymu polymerázy II a díky které tak BRCA1 společně s BARD1 dokáže regulovat genovou expresi (Chiba a Parvin, 2002; Yu a Chen, 2004; Greenberg et al., 2006; Wang et al., 2007; Wang a Elledge, 2007). Dalšími proteiny, které interagují s BRCA1 prostřednictvím BRCT domény, jsou 53BP1 (p53 binding protein 1), transkripční koaktivátor s histonacetylázovou aktivitou CBP/p300 (CREB binding protein/p300; Chai et al., 1999) a komplex proteinů BRCA2 (Breast cancer 2 alias FANCD1) a RAD51. C-terminální konec BRCA1 proteinu zahrnuje velkou acidickou doménu (Miki et al., 1994), která má ve kvasinkových a savčích buňkách funkci transkripčně aktivační domény (TAD) a ve které mimo jiné obě BRCT domény leží (Obr. 2). BRCA1 reguluje transkripci svou schopností vázat transkripční faktory na svou TAD. Těmito faktory jsou konkrétně TFIIF, TFIIE a TFIIH asociující s holoenzymem RNA polymerázy II (Scully et al., 1997a). Nejvyšší aktivity TAD dosahuje, pokud má všech posledních 304 aminokyselin (exony 16-24; aminokyseliny 1560-1863) BRCA1 proteinu. Částečnou transkripční aktivitu in vitro si však TAD dokáže uchovat i jen s posledními přibližně 100 aminokyselinami (exony 21-24; aminokyseliny 1760-1863) odpovídajícími BRCT2 doméně (Monteiro et al., 1996). Na druhé straně výsledky mutačních analýz genu BRCA1 ukazují, že C-koncová oblast proteinu má zásadní důležitost pro jeho funkci in vivo. Za patogenní se nepovažuje delece úseku pouze posledních 10 aminokyselin (Pohlreich et al. 2005).

3.3 Nukleární lokalizační signály (NLSs) Pozorováním intracelulární lokalizace různých druhů delečních mutantů genu BRCA1 v buňce imunofluorescenčními studiemi byla dokázána přítomnost nukleárního lokalizačního

11

signálu (NLS1; Obr. 2) v exonu 11. Druhý lokalizační signál, nalezený později opět na exonu 11 (NLS2; Obr. 2), je méně významný pro translokaci BRCA1 proteinu do buněčného jádra po syntéze na ribozomech (Chen et al., 1996; Thakur et al., 1997). Další studie (Fan et al., 2001), která experimentuje s bodovými mutacemi oblastí DNA kódujících tyto signály, ukazuje na schopnost proteinu lokalizovat se v jádře jen s jedním funkčním signálem. Studie Hubert et al. (2001) dokonce poukazuje na fakt, že se BRCA1 může translokovat do buněčného jádra i navzdory chybějícímu exonu 11 (BRCA1 ∆exon11), jenž právě oba nukleární lokalizační signály obsahuje. Tato zjištění naznačují přítomnost alternativního jaderného signálu lokalizovaného pravděpodobně někde uvnitř prvních 300 aminokyselin (shrnuto v (Rosen et al., 2003)), který nebyl dosud objeven.

3.4 SCD (Serine-containing domain) Mezi aminokyselinou 1280 – 1524 proteinu BRCA1 (Obr. 2) se vyskytuje oblast bohatá na přítomnost serinových zbytků, která hraje zásadní roli v aktivaci proteinu BRCA1. Fosforylace serinových zbytků SCD účinkem kináz ATM (Ataxia telangiectasia mutated) a ATR (Ataxia telangiectasia a RAD3-related) ovlivňuje vznik komplexů BRCA1 s dalšími reparačními proteiny a tím způsobuje aktivaci různých signálních drah v odpovědi na poškození DNA. Serinové zbytky v SCD reprezentují pro každou kinázu jedinečná i společná fosforylační místa, což sice ukazuje na určitou propojenost signálních drah, nicméně po fosforylaci různou kinázou BRCA1 protein moduluje různou odpověď. (shrnuto v (Venkitaraman, 2002); shrnuto v (Yarden a Papa, 2006); shrnuto v (Ouchi, 2006)).

3.5 DNA vazebná doména BRCA1 protein se dokáže velmi silně vázat do míst DNA rozvětvení, dvouřetězcových zlomů a na lineární úseky dlouhé alespoň 300-500 bází. Tato schopnost proteinu je dána přítomností DNA-vázající domény, kódované částí exonu 11 mezi aminokyselinami 452 – 1079 (Obr. 2). K interakci s DNA dochází při kolapsu replikační vidlice nebo v případě dvouřetězcových zlomů. Na takto poškozenou DNA se naváže pravděpodobně velké množství molekul BRCA1 proteinů, které zabraňují dalšímu poškozování DNA a dále modulují (a pravděpodobně i řídí) její následnou opravu (Paull et al., 2001).

12

4

Funkce proteinu

Protein BRCA1 se účastní především reparací dvouřetězcových zlomů genomové DNA. Mezi další funkce BRCA1 patří regulace transkripce, buněčného cyklu a apoptózy v odpovědi na poškození DNA. Inaktivace genu BRCA1 způsobuje zásadní selhání těchto dějů vedoucí k nádorové transformaci v postižených buňkách. Pokusné modely na myších s inaktivací BRCA1 (BRCA1-/-) ukazují, že protein BRCA1 je nezbytný pro normální embryogenezu a BRCA1-/- jedinci vykazují časnou embryonální letalitu s masivní indukcí apoptózy, defekty ve vývoji mezodermu a snížený proliferační potenciál (Hakem et al., 1996). Myší embryonální fibroblasty s delecí genu BRCA1 se vyznačují defektem G2-M kontrolního bodu buněčného cyklu a vykazují značné chromozomální aberace dokládající zásadní roli BRCA1 proteinu v udržení genomové integrity (Xu et al., 2001)

4.1 Tvorba komplexů s proteinem BRCA1 Základní funkcí BRCA1 proteinu je účast na DNA reparačních pochodech, kde BRCA1 vystupuje jako univerzální interakční partner reparačních proteinů zodpovědných za vlastní enzymatickou aktivitu v rámci oprav genomové DNA. BRCA1 je základem vzniku makrokomplexů jejichž složení podmiňuje výsledné funkce (Tab. 1). Tvorba těchto komplexů pravděpodobně závisí na aktivaci a aktuální dostupnosti adaptorových proteinů, které kompetují o vazbu s BRCA1 proteinem v oblasti BRCT domén (viz kapitola 3.2), kde se váží pomocí svých SPxF motivů (Abraxas v případě BRCA1 A komplexu, BACH1/BRIP1 u BRCA1 B komplexu a CtIP pro BRCA1 C komplex). (Wang et al., 2009) Tabulka 1: Přehled BRCA1 komplexů a jejich funkce v opravě DNA. (Upraveno dle Huyen et al., 2009) Název BRCA1/BARD1 „Core complex” BASC – BRCA1associated genome surveillance complex BRCA1 A

BRCA1 B BRCA1 C

BRCC

Funkce ubikvitinylace lokalizace, signalizace různých druhů poškození DNA, tvorba reparačního ohniska akumulace BRCA1 v místech DNA poškození, regulace kontrolního bodu mezi G2 a M fází buněčného cyklu replikace DNA, kontrola růstu během S fáze buněčného cyklu 5’ → 3’ vyříznutí DNA ve dvouřetězcových zlomech, regulace kontrolního bodu mezi G2 a M fází buněčného cyklu DNA oprava homologií rekombinací

13

Komponenty BRCA1, BARD1 – tvoří konstitutivní heterodimer BRCA1, ATM, BLM, RFC, MRE11/RAD50/NBS1, MSH2/MSH6 BRCA1, BARD1, Abraxas, RAP80, BRCC36, BRCC45, NBA1 BRCA1, BACH1 (alias BRIP1), TOPBP1 BRCA1, CtIP, MRE11/RAD50/NBS1 BRCA1, BARD1, BRCA2, PALB2, RAD51, BRCC36, BRCC45

4.1.1 BRCA1/BARD1 „Core complex“ E3 ubikvitinligázová aktivita proteinu BRCA1, zprostředkovaná přítomností RING finger domény (viz

kapitola

3.1),

je

několikanásobně zvýšena vzájemnou

interakcí

s

proteinem BARD1 (Obr. 4), se kterým vytváří BRCA1 stabilní heterodimer nazývaný též jako „Core complex“. E3 ubikvitinligázový komplex katalyzuje i) monoubikvitinylaci substrátu, která reguluje jeho intracelulární lokalizaci a aktivitu, nebo ii) polyubikvitinylaci, která je důležitá pro označení, translokaci a degradaci substrátu v proteazomech (přehled viz Hicke, 2001). Substrátem pro monoubikvitinylaci BRCA1/BARD1 komplexem jsou histony nukleosomu

a

histon

H2AX.

Kromě

toho

komplex

BRCA1/BARD1

katalyzuje

autopolyubikvitinylaci na četných místech obou proteinů, která významně zvyšuje E3 ubikvitinligázovou aktivitu komplexu (Mallery et al., 2002). Ubikvitinylace proteinů, jež se účastní DNA reparačních pochodů, je častý projev jejich aktivace (Morris a Solomon, 2004). Ubikvitinligázová aktivita BRCA1/BARD1 komplexu hraje důležitou roli v remodelaci chromatinu a v reakci na DNA poškození (Mallery et al., 2002). Výsledky nedávných prací ukazují na existenci ubikvitinyl-dependentní signální dráhy zapojené v odpovědi na poškození DNA (Kim et al., 2007).

4.1.2 BASC – BRCA1-associated genome surveillance complex BASC (BRCA1-associated genome surveillance complex) je rozsáhlý multiproteinový komplex,

který

se

účastní

signalizace

a

tvorby

reparačního

ohniska1.

Pomocí

imunoprecipitace a hmotnostní spekrometrie bylo prokázáno, že kromě proteinu BRCA1 tento komplex obsahuje kinázu ATM (viz kapitola 4.2.1.1), helikázu BLM (Bloom syndrom alias RECQL3

-

RECQ

protein-like

3;

viz

kapitola

4.2.2)

a

další

proteiny

jako

MRE11/RAD50/NBS1 (MRN) komplex, MSH2/MSH6 heterodimer (viz kapitola 4.2.3) a komplex RFC (DNA Replication factor C - OMIM 102579, což je součást DNA-dependentní polymerázy účastnící se DNA replikace, kde je potřebná pro koordinovanou syntézu obou řetězců;). Toto složení komplexu naznačuje, že BASC je důležitou součástí post-replikačních oprav DNA (Wang et al., 2000). Všechny zmíněné BRCA1-asociující proteiny mohou tvořit menší, stabilní komplexy s rozdílnou funkcí, nezávislou na BRCA1 proteinu. BRCA1 protein 1

Reparační ohnisko je makrokomplex proteinů asociovaných na základě protein-proteinových alterací, jehož funkcí je oprava dvouřetězcových zlomů DNA homologní rekombinací, způsobených různými druhy záření (γ, UV), oxidativním stresem a dalšími faktory. Tvorba reparačního ohniska je velmi komplikovaný proces, kterého se účastní obrovský počet proteinů modulovaných několika signálními drahami. Rozsah reparačního ohniska dosahuje několik stovek tisíců párů bází kolem oblasti dvouřetězcového zlomu.

14

moduluje funkce těchto komplexů pro specializované procesy opravy DNA. BASC komplex vystupuje jako senzor poškození DNA, neboť se může vázat na různé atypické DNA struktury (dvouřetězcové zlomy, chyby v párování bází a další). Toto napovídá, že BASC komplex má také důležitou úlohu v lokalizaci a signalizaci poškození DNA. Schopnost vytvářet BASC z různých proteinových komplexů je dynamický proces, který se mění během buněčného cyklu, a je závislý na koncentraci proteinu BRCA1. To dokazuje, že BRCA1 protein hraje hlavní roli ve formování BASC komplexu při organizaci odpovědí na různé typy poškození DNA a i v DNA reparačních procesech (Wang et al., 2000).

4.1.3 BRCA1 A komplex BRCA1 A komplex je komplex složený z BRCA1/BARD1 heterodimeru, RAP80 (Receptor-associated protein, 80-kD; OMIM 609433; protein obsahující tandem ubikvitinvázajících motivů, které hrají roli ve specifickém rozpoznávání míst poškození DNA), adaptorového proteinu Abraxas (OMIM 611143), jehož funkce je propojení RAP80 s BRCA1, BRCC36 (alias BRCC3 - BRCA1/BRCA2-containing complex subunit 36, protein s deubikvitinylační aktivitou; OMIM 300617) a BRCC45 (OMIM 610497; Wang et al., 2007). BRCA1 A komplex lokalizuje do míst DNA poškozené ionizačním zářením, kde má schopnost (zprostředkováno RAP80) se vázat na polyubikvitinylované histony. Komplex v místě poškození DNA umožňuje aktivaci E3 ubikvitinligázové aktivity BRCA1/BARD1 komplexu nebo deubikvitinylační aktivity BRCC36, a tak pravděpodobně reguluje ubikvitinylaci či deubikvitinylaci na základě signalizace poškozené DNA (Wang et al., 2009). Význam této biochemické aktivity na proces reparace není dosud znám. Nově byl popsán další protein komplexu - NBA1 (New component of the BRCA1 A komplex 1; OMIM 612766), který se specificky váže v místech poškození DNA a indukuje inhibici buněčného cyklu v G2 fázi. NBA1 obsahuje WRN doménu, která je protein-protein interakčním motivem, jenž by mohl být odpovědný za vstup dalších proteinů do BRCA1 A komplexu (helikáza WRN, nebo 26S proteazomu), a tím tento komplex lokalizovat do oblastí porušené DNA (Wang et al., 2009).

15

4.1.4 BRCA1 B komplex Replikace oblastí s poškozenou DNA často končí zastavením nebo zhroucením replikačního aparátu, a proto se během evoluce vyvinuly kontrolní body buněčného cyklu, které mají těmto situacím předcházet. Cantor et al. (2001) ukázal, že BRCA1 přímo interaguje s helikázou BACH1 během S fáze buněčného cyklu (viz kapitola 3.1). Dále bylo Greenbergem et al. (2006) zjištěno, že s BRCA1/BACH1 interaguje ještě TOPBP1 (Topoisomerase II-binding protein 1), který se přímo účastní DNA replikace a replikačního kontrolního bodu během S fáze buněčného cyklu. Tento komplex proteinů byl později nazván BRCA1 B komplexem. Interakce BACH1 a TOPBP1 během replikace DNA je nezbytná pro správnou funkci RPA (Replication protein A), který dočasně váže ssDNA opožďujícího řetězce na chromatin. Vše tak naznačuje faktu, že se BRCA1 B komplex svými interakcemi účastní přímé kontroly nad správným průběhem replikace a na detekci poškozené DNA, čímž udržuje během S fáze buněčného cyklu integritu genomu (shrnuto v (Huyen et al., 2009)).

4.1.5 BRCA1 C komplex BRCA1 C komplex, složený z CtIP (C-terminal interacting protein) a MRN komplexu (MRE11/RAD50/NBS1), je svou aktivitou zapojen v opravě dvouřetězcových zlomů, kde podporuje 5’ → 3’vystřižení částí DNA řetězců. Celý proces je detailněji popsán v kapitole 4.2.2. Úloha BRCA1 v tomto komplexu je modulovat svými interakcemi funkce a spojení MRN komplexu s CtIP, což zvyšuje exonukleázovou aktivitu potřebnou v procesu opravy DNA (shrnuto v (Huyen et al., 2009)).

4.1.6 BRCC komplex Jedním ze základních proteinů reparačního ohniska je DNA rekombinázový protein RAD51, hrající zásadní roli v opravě dvouřetězcových zlomů homologní rekombinací (popsáno v kapitole 4.2.2.). Tento protein je součásti tzv. BRCC komplexu, složeného z BRCA1/BARD1 heterodimeru, proteinů BRCA2, PALB2 (Partner and localizer of BRCA2, alias FANCN), BRCC36 a BRCC45 (Dong et al., 2003). Při skládání tohoto komplexu BRCA1 v místě mezi aminokyselinami 758-1064 interaguje s proteinem RAD51 (Scully et al., 1997b). Konkrétně BRCA1 kolokalizuje s komplexem RAD51/BRCA2/PALB2, kde svou interakcí aktivuje RAD51, díky čemuž se RAD51 může zapojit do procesu homologní

16

rekombinace (viz kapitola 4.2.2; Wong et al., 1997; Jin et al., 1997; Scully et al., 1997b). Mimoto BRCC36 a BRCC45 zvyšují E3 ubikvitinligázovou aktivitu BRCA1/BARD1/ BRCA2 komplexu.

4.2 Reparace DNA a úloha proteinu BRCA1 BRCA1 se účastní několika specializovaných opravných procesů DNA. Prvním a nejdůležitějším z nich je oprava dvouřetězcových zlomů DNA homologní rekombinací, dále se pak okrajově podílí na nehomologním procesu opravy těchto zlomů a částečně i na opravných procesech asociovaných s transkripcí.

4.2.1 Signalizace poškození DNA Na počátku odpovědi na poškození DNA dvouřetězcovými zlomy stojí senzorové proteiny, mezi které patří kinázy ATM (Ataxia-telengiectasia mutated) a ATR (ATM a RAD3-related protein). Tyto serin-threoninové kinázy patří do rodiny phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)related proteinů. V případě poškození DNA iniciují ATM a ATR kinázy vlastní signální kaskády vedoucí k aktivaci transmisních komponent signální kaskády (CHK1, CHK2) a následně výkonných proteinů (p53, BRCA1, RAD51), které zprostředkovávají výslednou odpověď na poškození DNA (Obr. 6; shrnuto v (Siloh 2001); Durocher a Jackson, 2001].

Obrázek 6: Schéma ATM a ATR signální dráhy s vybranými proteinovými interakcemi

17

Zatímco ATM působí iniciaci signalizace po poškození DNA ionizačním zářením (dvouřetězcové zlomy), ATR je aktivováno po poškození DNA UV zářením (jednořetězcové zlomy nebo DNA adukty) nebo aktivací ATM (Adams et al., 2006, Gatei et al., 2001).

4.2.1.1 ATM signální dráha ATM po autokatalytické aktivaci fosforyluje několik cílových proteinů (Tab. 2; Lee a Paul, 2005; shrnuto v (Stracker et al., 2004)). Po interakci s MRN komplexem ATM fosforyluje proteiny CHK2 a BRCA1. BRCA1 je zároveň fosforylována aktivovanou kinázou CHK2, která se tak podílí na zesilování signálu ATM (Obr. 6). Fosforylace BRCA1 proteinu v oblasti SCD (viz kapitola 3.4) zprostředkovaná ATM je podstatná pro správnou odpověď na poškození DNA ionizačním zářením. Takto aktivovaný protein BRCA1 má schopnost modulovat vznik reparačního ohniska interakcí s RAD51/BRCA2 komplexem, podílet se na koaktivaci transkripce řízené p53 proteinem a dalšími pochody se podílet na opravě DNA (Lee et al., 2000). Tabulka 2: Hlavní proteiny regulované aktivovanou ATM kinázou v iniciaci odpovědi na poškození genomové DNA Protein

Jeho funkce

CHK2

přenos a zesílení signálu z ATM na p53 a BRCA1, zástava buněčného cyklu inhibicí fosfatáz aktivujících cyklin-CDK komplexy (např. CDC25C)

p53

inhibice buněčného cyklu na základě p53-indukované exprese inhibitorů (např. waf1/cip1 p21 ), aktivace apoptózy (zvýšení exprese Bax)

BRCA1

asociace s p53, RAD51 a dalšími, což má za následek inhibici buněčného cyklu a iniciaci opravy poškozené DNA

H2AX

ovlivnění remodelace chromatinu, po jeho fosforylací signalizuje místo zlomu DNA

MDC1

signalizace DNA poškození v místě fosforylovaného H2AX (γH2AX) a následná iniciace polyubikvitinylace histonů, což má za následek translokaci reparačních proteinů do míst zlomu a tvorbu reparačního ohniska

NBS1

podílí se na signalizaci poškození DNA a iniciaci kontrolního bodu buněčného růstu

ATM také fosforyluje protein MDC1 a histon H2AX (fosforylovaný - γH2AX), které v počátku signální dráhy vedou k asociaci BRCA1, MRE11/NBS1/RAD50 komplexu, 53BP1 a CHK2 do míst poškození a tak k formování základu reparačního ohniska (Lou et al., 2003). MDC1 asociuje s BRCA1/BARD1 heterodimerem díky interakci mezi forkhead-associated (FHA) doménou MDC1 (fosfoproteinovému motivu umožňujícímu vytvářet proteinproteinové interakce) a BRCT doménami BRCA1/BARD1 a společně se translokují do míst poškození DNA (Lou et al., 2003). 18

4.2.1.2 ATR signální dráha Po autokatalytické aktivaci ATR fosforyluje velké množství proteinů. Jedním z nejdůležitějších je CHK1 kináza, která je, podobně jako CHK2, schopna inhibovat aktivitu fosfatáz aktivujících cyklin a tvorbu cyklin/CDK komplexů, a tak inhibovat přechod buněčného cyklu z G1 do S a z G2 do M fáze. CHK1 dále pozitivně reguluje expresi klíčového faktoru homologní rekombinace RAD51 (detailněji popsáno v kapitole 4.2.2; Obr. 6). ATR dále fosforyluje RAP80, který je součástí BRCA1 A komplexu (viz. kapitola 4.1.3), čímž se částečně podílí na správné funkci komplexu v místech poškození DNA. Po lokalizaci a aktivaci tohoto komplexu v místě DNA poškození začíná tvorba reparačního ohniska a oprava DNA (Scully et al., 1997c; Thomas et al., 1997; Adams et al., 2006).

4.2.1.3 Fanconi anaemia / BRCA1 signální dráha Fanconi anaemia (FA) je vzácný autozomální genetický syndrom, který je typický výskytem vrozených vad jako je porucha kostní dřeně a zvýšená citlivost na genotoxické látky (např. mytomycin C) a ionizační záření. Tento syndrom je způsoben alterací signální dráhy složené z proteinů FANCA, FANCC, FANCF, FANG a FANCD1 alias BRCA2 vytvářejících jaderný komplex zprostředkovávající aktivaci FANCD2 proteinu v odpovědi na poškození DNA. FANCD2 je fosforylován (na základě ATR signální dráhy a MRN komplexu; Obr. 7) a monoubikvitinylován komplexem FANC proteinů (Obr. 7), čímž je translokován do míst dvouřetězcového zlomu. Tam takto aktivovaný FANCD2 kolokalizuje s BRCA1, díky čemuž je podpořena tvorba a dokončení reparačního ohniska a následná oprava DNA (GarciaHiguera et al., 2001). Protein BRCA2 se částečně podílí na ubikvitinylaci FANCD2 v odpovědi na ionizující záření. Celý soubor FANC proteinů je pravděpodobně součástí reparačních ohnisek při jejím kompletování a aktivaci (Garcia-Higuera et al., 2001). Obrázek 7: Schéma aktivace FANCD2 proteinu při signalizaci poškození DNA

19

4.2.2 Oprava DNA poškozené dvouřetězcovými zlomy Dvouřetězcové zlomy (DSB – Double strand breaks) jsou jedny z nejvíce mutagenních DNA poškození v lidských buňkách. Jediný dvouřetězcový zlom může potencionálně vést ke ztrátě více než 100 miliónů párů bází (např. ztráta celého chromozomového ramene). Na druhé straně evoluční vývojové procesy využívají dvouřetězcových zlomů jako nástrojů ke zvýšení variability genomu. Příkladem jsou homologní rekombinace chromozomů během meiózy

nebo

programované

zlomy

vedoucí

k iniciaci

přeskupení

během

zrání

imunoglobulinových genů (shrnuto v (Helleday et al., 2007)). Opravy dvouřetězcových zlomů dělíme na homologní rekombinaci (HR – Homologous repair) a nehomologní opravu spojováním konců (NHEJ – Non-homologous end joining). Proces NHEJ je náchylný k chybám, protože liguje konce dvouřetězcových zlomů bez ohledu na jejich strukturní návaznost v genomu (Obr. 8). Reparace pomocí NHEJ je aktivní hlavně v mitoticky neaktivních buňkách a v průběhu G1 fáze buněčného cyklu. Oproti tomu HR je vysoce přesným procesem, který při opravách poškozené DNA využívá genetickou informaci sesterské chromatidy (Obr. 8). K HR dochází především během S a G2 fáze buněčného cyklu, kde se uplatňuje při závažných poškozeních DNA jako je reparace poškození při replikaci, kdy replikační vidlice narazí na jednořetězcový zlom (tzv. dvouřetězcový zlom s jedním koncem), nebo při poškození DNA více zlomy (shrnuto v (Helleday et al., 2007)). BRCA1 se zúčastňuje především opravy dvouřetězcových zlomů HR.

Obrázek 8: Schematický nákres znázorňující hlavní rozdíl mezi reparací dvouřetězcových zlomů v DNA procesem homologní rekombinace a NHEJ.

20

Z vysoké citlivosti buněk bez funkčního genu BRCA1 na radiační záření, které způsobuje dvouřetězcové zlomy, můžeme vyvodit, že proteiny BRCA1 hrají významnou roli při opravě těchto zlomů (shrnuto v (Karran, 2000)). Postupem času byly zjištěny mnohé úlohy BRCA1 při opravě DSB, přičemž jednou z nejdůležitějších je jeho úloha multiplatformového proteinu, který zprostředkovává interakce mezi proteiny nebo proteinovými komplexy. BRCA1 při iniciaci opravy DSB interaguje s RAD50, který tvoří ve dvouřetězcovém zlomu společně s MRE11 a NBS1 tzv. MRN komplex. Tento komplex působí jako součást ATM

signální

dráhy

(podporuje

exonukleázovou

aktivitu)

a

také

jako

základ

multiproteinového komplexu reparačních ohnisek (Zhong et al. 1999; Lee a Paull, 2005). MRN je také součástí BRCA1 C komplexu (viz kapitola 4.1.6), který podporuje aktivitu exonukleázy EXO I a helikázy BLM, které jsou potřebné pro správné 5’ → 3’ odstranění řetězců DNA v místech dvouřetězcového zlomu (Obr. 8; shrnuto v (Haber, 1998); shrnuto v (Huyen et al., 2009)). BRCA1 se specificky váže v místech rozvětvení DNA a interakcí s RAD50, kde poté tuto nukleolytickou aktivitu inhibuje, aby mohla začít následná oprava zlomu (Paull et al., 2001). BRCA1 v odpověď na vznik dvouřetězcového zlomu DNA asociuje s BRCA2/RAD51 komplexem, který se tak rozpadne, čímž se RAD51 aktivuje. RAD51 je ústředním proteinem v homologní rekombinaci. Váže se na ssDNA, která vznikne vystřižením komplementárního vlákna ve směru 5’ → 3’ (viz výše; Obr. 8), a pomocí asociujících proteinů (BRCA2, RAD52, RAD54 a dalších) formuje nukleoproteinová filamenta, která napomáhají vyhledání homologní sekvence v sesterské chromatidě. Ta slouží jako vzor pro nově vznikající DNA v místě poškození (Obr. 8; Yang et al., 2005; shrnuto v (Helleday et al., 2007)). BLM protein, jenž je součástí BASC (viz kapitola 4.1.2), má DNA helikázovou, DNAdependentní ATPázovou a 3’→5’ ssDNA translokační aktivitu (OMIM 604610). Svými funkcemi a asociací s BRCA1 se během replikace DNA chová jako senzor abnormálních dvouřetězcových struktur a při poškození DNA spolupracuje na její opravě homologní rekombinací (Wang et al., 2000). Další helikáza - BACH1 - kooperuje s BRCA1 a s TOPBP1 během S fáze, kde tak společně tvoří BRCA1 B komplex (viz kapitola 4.1.4). Přerušením spojení BRCA1 a BACH1 je oslabena DNA replikace a oprava, navíc je aktivován kontrolní bod inhibující buněčný cyklus v průběhu S fáze (Cantor et al., 2001).

21

4.2.3 DNA reparace asociovaná s transkripcí (TCR) Při replikaci může být replikační aparát RNA polymerázy II zastaven přítomností poškozené templátové ssDNA. Během evoluce se vyvinuly procesy opravy reparace asociované s transkripcí (transcription-coupled repair - TCR). Po detekci poškození následuje proces opravy, jenž se skládá ze zastavení transkripce remodelací holoenzymu RNA polymerázy II a zpřístupnění místa pro opravu poškozené DNA. Těchto procesů se účastní celá řada proteinů holoenzymu RNA polymerázy II, například TFIIH faktor a další (Gowen et al., 1998). BRCA1 se na TCR procesu podílí svými interakcemi s transkripčními faktory (THIIH a dalšími) a s proteiny MMR (multiple missmatch repair proteins), konkrétně MSH2, MSH3 a MSH6, které jsou v TCR zúčastněné (Gowen et al., 1998; Wang et al., 2001). BRCA1/BARD1 heterodimer svou interakcí přímo ovlivňuje aktivitu MSH2 proteinu a funguje také jako součást signalizační kaskády poškozené DNA, ve které hrají MSH proteiny ústřední roli (Wang et al., 2000). Výzkum Takimota et al. (2002) dokázal, že BRCA1 se interakcí s p53 podílí na aktivaci DDB2 proteinu (DNA damage binding protein 2). Tento protein společně s DDB1 tvoří heterokomplex, který se silně váže na chromatin v místech poškození DNA UV zářením, nebo také cisplatinou a vyvolává komplexní genomovou opravu včetně TCR. Ačkoliv je tento mechanizmus nezávislý na ATM signální dráze a ani není přímo závislý na BRCA1 proteinu, BRCA1 ho významně zesiluje (Takimoto et al., 2002; OMIM 600811).

4.3 Úloha BRCA1 při regulaci transkripce Po zjištění, že BRCA1 v savčích a kvasinkových buňkách obsahuje na C konci konzervativní acidickou doménu s transkripční aktivitou (viz. kapitola 3.2), vznikly názory, že BRCA1 protein hraje roli v regulaci transkripce (Monteiro et al., 1996). Anderson et al. (1998) následně prokázal, že i BRCT domény BRCA1 mohou zvyšovat aktivitu transkripce ovlivněním holoenzymového komplexu RNA polymerázy II, a to přes spojení s RNA helikázou A (RHA) a dalšími transkripčními faktory (viz kapitola 3.2). Později bylo zjištěno, že BRCA1 protein interaguje i přímo s jádrem RNA polymerázy II a to konkrétně s podjednotkami RPB2 a RPB10α (Schlegel et al., 2000). Následně byly objeveny i interakce BRCA1 proteinu s transkripčním koaktivátorem, histonacetyltrasferázovým proteinem CBP/p300 (viz. kapitola 3.2), se kterým protein BRCA1 22

interaguje C- i N-koncovými doménami. Tento koaktivátor zesiluje signál transkripční aktivity zprostředkovaný BRCA1 proteinem in vitro (Pao et al., 2000). BRCA1 protein N-koncovou části proteinu mezi aminokyselinou 304-394 interaguje s proteinem RB1 (Retinoblastoma protein 1; OMIM 180200) a prostřednictvím BRCT domény s C-koncem RB1-vázajících proteinů 4 a 7 (RBBP – Retinoblastoma-binding protein 4 a 7). RB1 je protein, který negativně ovlivňuje buněčný cyklus svojí schopností vázat E2F transkripční faktory a tím reprimovat transkripci genů potřebných pro vstup do S fáze buněčného cyklu. Dále RB1 dokáže ve spojení s RBBP proteiny, BRCA1 a histondeacetylázou inhibovat transkripci remodelací chromatinu (Yarden a Brody, 1999). BRCA1 protein však interaguje i přímo s proteiny HDAC1 a HDAC2 (HDAC – histone deacetylase). Tyto poznatky ukazují na důležitou regulační úlohu BRCA1 proteinu v inhibici transkripce deacetylací

histonů

způsobenou BRCA1 interakcí

s

mnoha komponenty histon-

deacetylázového komplexu (Yarden a Brody, 1999). Další úlohy transkripční regulace BRCT domén BRCA1 proteinu jsou ve vzájemném působení s CtIP (C-terminal Interacting Protein), který byl identifikován na základě své schopnosti vázat se na transkripční korepresor CtBP (C-terminal Binding Protein). CtIP je také součástí BRCA1 C komplexu (viz kapitola 4.1.5), který se podílí na HR. Funkce CtBP spočívá, kromě účasti na HR, v asociaci s vhodnými DNA-vazebnými transkripčními faktory a tím k represi transkripce (Yu et al., 1998). BRCA1 může také interagovat s BRG1 proteinem (alias BRM/SWI2-related gene 1), který je součástí SWI/SNF komplexu účastnícího se remodelace chromatinu. BRG1 svou ATPázovou aktivitou přímo ovlivňuje transkripční kontrolu modulací chromatinové struktury. Nabízí se tu teorie, že je tento komplex potřebný pro aktivaci genů, které se účastní signálních drah odpovědi na poškození DNA. Dále by mohl tento komplex hrát přímou roli v opravě DNA homologní rekombinací a to tím, že remodelací chromatinu umožňuje přístup reparačního komplexu k DNA (OMIM 603254; Bochar et al., 2000). Interakce BRCA1 s pozitivními či negativními regulátory (např. histonacetylázami, respektive histondeacetylázami) není v přímé kontradikci, ale ukazuje, že aktivace či represe transkripce regulované pomocí BRCA1 je pravděpodobně závislá na aktuální přítomnosti kofaktorů BRCA1 a umožňuje tak citlivé řízení BRCA1-regulované transkripce v závislosti na funkčním stavu buňky a přítomnosti genomových defektů, čímž přispívá k regulaci genomové integrity kontrolované proteinem BRCA1 (Pao et al., 2000).

23

4.4 Podíl

BRCA1

na

regulaci

buněčného

cyklu

a

apoptózy Regulace buněčného cyklu a apoptóza jsou spolu s opravou DNA a regulací transkripce další komplementární procesy, kterými se BRCA1 podílí na udržení geonomové integrity. V případě detekování poškozené DNA je buněčný cyklus zastaven a spustí se opravné procesy. Pokud jsou ale tato genomová poškození vyšší než schopnost jejich efektivní opravy, buňka iniciuje apoptózu, aby tak zabránila možné mutagenezi. Kromě interakcí již zmíněných v předchozím textu BRCA1 asociuje s transkripčními faktory, proteiny p53 a STAT1 (Signal Tranducer and Activator of Transcription 1), které aktivují expresi inhibitorů buněčného cyklu. Dále BRCA1 interaguje s proteinem RB1 (viz kapitola 4.3) a podílí se na řízení exprese genu GADD45, který je důležitý v regulací buněčného cyklu a indukci apoptózy. Na p53 se BRCA1 váže jak díky interakci mezi DNA vázající doménou proteinu p53 a Nkoncovou oblastí BRCA1 lokalizovaným mezi aminokyselinou 224 – 500 (Ouchi et al., 1998; Zhang et al., 1998), tak interakcí p53 s oblastí uvnitř druhé BRCT domény (aminokyselina 1760-1863) proteinu BRCA1 (Chai et al., 1999). Obě interakce stabilizují p53 protein a zesilují jeho transkripční aktivitu (Somasundaram et al., 1999). Interakcí s p53 BRCA1 ovlivňuje transaktivaci genu p21WAF1/CIP1 (cyklin-dependentního kinázového inhibitoru 1). Protein p21WAF1/CIP1 inhibuje aktivitu komplexů cyklin-dependentních kináz vedoucí k zastavení buněčného cyklu. Exprese genu GADD45 (Growth Arrest and DNA Damageinducible gene 45), který svým produktem přispívá k inhibici proliferace, zastavení buněčného cyklu nebo indukci apoptózy, je závislá na dvou mechanizmech. První z nich je pozitivní regulace exprese proteinem p53 aktivovaným ATM, CHK2 a BRCA1 (viz kapitola 4.2.1.1), další je na p53 nezávislá přímá aktivace GADD45 promotoru BRCA1 proteinem (Somasundaram et al., 1997; Harkin et al., 1999; OMIM 126335). BRCA1 za normálních podmínek negativně ovlivňuje expresi GADD45, kdy interaguje s transkripčním represorem ZBRK1 (Zinc finger and BRCA1-interacting protein with a KRAB domain 1), který se váže na specifickou sekvenci uvnitř intronu 3 GADD45 genu. Tato represorová funkce je uvolněna po poškození DNA díky fosforylaci BRCA1 účinkem kinázy ATM (viz kapitola 4.2.1.1), čímž je spuštěn GADD45 ovlivněný proces zastavení buněčného cyklu (Zheng et al., 2000). Vysoká koncentrace proteinu BRCA1 v buňce spouští nadměrnou expresi genu GADD45,

24

která vede k iniciaci apoptózy (Harkin et al. 1999). Zvýšená citlivost buňky k apoptóze může být také způsobena částečně BRCA1-indukovanou represí antiapoptického Bcl-2 (Fan et al., 1998). Tento protein tvoří heterodimer s proapoptickým proteinem Bax (Bcl-2 associated protein X). Při snížení poměru intracelulární koncentrace Bcl-2/Bax komplexu dochází k vyšší pohotovosti k indukci apoptózy v buňce a naopak zvýšení poměru tohoto proteinového komplexu vede k vyšší rezistenci k apoptóze. BRCA1 se účastní na kontroly buněčného růstu svou interakcí s proteinem STAT1. Společně ovlivňují transkripci podskupiny genů pro interferon γ (IFN-γ). Produkty těchto genů – cytokiny – indukují zastavení buněčného růstu (Ouchi et al., 2000). Protein BRCA1 svými rozsáhlými interakcemi ovlivňuje expresi řady genů, které se účastní kontroly buněčného cyklu nebo iniciace apoptózy způsobenou masivním poškozením DNA, a tak zastává nepřímou, ale přesto zásadní úlohu v regulaci těchto dějů.

25

5

Význam genu BRCA1 v onkologii

Selhání DNA-reparačních mechanizmů je jednou ze základních charakteristik buněk zhoubných nádorů, které se vyznačují vysokým stupněm genomové nestability. Do současné doby bylo charakterizováno několik set proteinů, které se účastní různých procesů reparace genomové DNA. Dědičné mutace mnohých z těchto proteinů jsou podkladem vzniku nádorových predispozičních syndromů. Gen BRCA1 je hlavním predispozičním faktorem vzniku dědičné formy karcinomu prsu a ovaria. Oba nádory se vyskytují převážnou většinou ve formě sporadického onemocnění. V 5 - 10% případů se však setkáváme s familiární formou, která vykazuje významně vyšší četnost nádorového onemocnění v postižených rodinách. Genetické analýzy pacientů z postižených rodin ukazují, že více než 50% těchto případů jsou osoby s dědičnou mutací v genu BRCA1 nebo BRCA22. Ostatní případy dědičných nádorových syndromů s častým výskytem karcinomu prsu jsou tvořeny méně častými mutacemi v dalších predispozičních vysoce penetrantních genech (např. PTEN, p53, NBS-1, ATM) a alteracemi nízkopenetrantních genů (shrnuto v (Rebbeck, 1999)). U více než 30% jednoznačně dědičných forem karcinomu prsu není doposud jasná genetická příčina onemocnění. Třebaže penetrance onemocnění u nosiče mutací v genu BRCA1 nedosahuje 100%, je riziko vzniku karcinomu prsu a ovaria u těchto osob výrazně zvýšené ve srovnání s normální populací (celoživotní riziko vzniku karcinomu prsu a ovaria dosahuje přibližně 80% a 35%). Nádory se tvoří ve výrazně nižším věku, než je tomu u sporadických forem onemocnění. Kromě toho jsou nosiči mutací v genu BRCA1 ohroženi i častějším výskytem dalších zhoubných nádorů (karcinomy tuby, kolorekta a prostaty; Bartoňková et al., 2003). Karcinomy prsu u nosičů mutací v genu BRCA1 (nikoliv však BRCA2) se vyznačují odlišnými histopatologickými formami ve srovnání se sporadickým onemocněním. Nádorové buňky často vykazují nepřítomnost exprese estrogenního a progesteronového receptoru a Her2/Neu receptoru (tzv. triple-negativní nádory). Analýza nádorových vzorků od nosičů mutací prokázala, že ve většině případů je druhá funkční alela inaktivována. Inaktivace může být způsobena delecí oblasti obsahující wt BRCA1 alelu, hypermetylací BRCA1 promotoru 2

Podíl alterací obou genů vykazuje rozdíly mezi různými populacemi ve světě. V naší populaci se mutace v genu BRCA1 podílejí na vice než 70% případů hereditárních nádorových syndromů karcinomu prsu a/nebo ovaria způsobených mutacemi genů BRCA1 a BRCA2 (Pohlreich et al. 2005).

26

nebo somatickou mutací v genu (Janatova et al., 2005). V nádorových buňkách nosičů mutací v genu BRCA1 tak vzniká stav, kdy dochází k úplnému výpadku funkce BRCA1 proteinu s výraznou funkční alterací procesu homologní rekombinace. Pochopení klíčového postavení BRCA1 proteinu v procesech reparace DNA umožnilo osvětlit stav genomové nestability v nádorových buňkách nosičů mutací a rovněž vedlo k zavedení specifické protinádorové léčby založené na aplikaci inhibitorů PARP (Poly(ADP-ribose) polymerase; OMIM 173870). Inhibice proteinu PARP způsobuje v nádorových buňkách s inaktivovaným BRCA1 proteinem a defektním procesem HR ztrátu i alternativních reparačních procesů (excizní reparace – BER), což způsobí rozsáhlou genomovou nestabilitu neslučitelnou s přežíváním nádorových buněk (Liang et al. 2009).

27

6

Diskuze

Od objevu genu BRCA1 uplynulo již více než 15 let, které byly zasvěceny systematickému bádání řady týmů o funkci proteinu BRCA1 a v průběhu kterých byla charakterizována rozsáhlá síť BRCA1-interagujících molekul. Na základě těchto poznatků se teprve nyní seznamujeme s komplexní funkcí tohoto proteinu a jeho důležitém postavením především v procesech reparace genomové DNA. Na protein BRCA1 tak v současnosti nazíráme nejen jako na hlavní predispoziční gen vzniku dědičné formy karcinomu prsu a ovaria, ale rovněž jako na základní pilíř DNA-reparačních dějů sloužících k udržení genomové integrity v buňce. Kromě poznání obecné struktury a funkce buněčných pochodů znamenají nové objevy funkce BRCA1 i další významný pokrok v poznání etiopatogeneze karcinomu prsu a dalších lidských zhoubných solidních nádorů, které umožňují vznik nových léčebných postupů, jako je například použití PARP inhibitorů v léčbě nádorů u nosičů mutací v genu BRCA1. V několika posledních letech byly popsány komplexy proteinů vznikající na podkladě asociace různých reparačních faktorů s proteinem BRCA1 (Wang et al., 2007; Wang et al., 2009). Charakterizace těchto proteinových komplexů umožnila první vhled do poznání molekulární podstaty úlohy proteinu BRCA1 v řízení homologní rekombinace při opravě dvouřetězcových zlomů DNA. Přes nesporný pokrok však zbývá řada nezodpovězených otázek. Mezi hlavní problémové body patří kvantitativní a časový pohled na proces tvorby reparačních ohnisek. V současnosti je známo, že tvorby reparačních ohnisek se účastní řada proteinů, které byly identifikovány různými metodami, a že velikost reparačních ohnisek dosahuje kolem 0,5 Mb v okolí dvouřetězcového zlomu. Jaký je však vzájemný poměr proteinů účastnících se reparace DNA a jaká je dynamika celého procesu? Výrazné spory existují už jen o mechanizmu počáteční signalizace DNA poškození a úloze senzorových molekul (ATM/ATR). Není rovněž přesně známo, ve kterém okamžiku jsou BRCA1 proteiny vázány do vznikajícího reparačního ohniska a jaké signály a modifikace reparačních proteinů (jestli fosforylace nebo mono-/poly-ubikvitinylace a jakými faktory) vedou ke vzniku jednotlivých komplexů BRCA1 proteinu. Velmi málo je také probádána otázka významu, vzniku a úlohy sestřihových variant genu BRCA1 in vitro a in vivo. Jedná se o projev aberantní aktivity sestřihového aparátu, nebo může tato aktivita za tkáňově specifických podmínek vést 28

k preferenčnímu vzniku určitých reparačních komplexů? Například „in frame“ delece exonu 17 – 19, která je nacházena u některých vzorků pacientů s vysokým rizikem vzniku karcinomu prsu, způsobuje výpadek první BRCT domény BRCA1 (Pohlreich et al., 2005). Výsledkem může být vznik proteinu, který má pravděpodobně porušenou schopnost tvorby (jen některých?) z BRCA1 A-C komplexů. Může však tento proces vznikat v mamární tkáni nenáhodně, jako regulační mechanizmus, který preferenčně umožňuje tvorbu některých z BRCA1-iniciovaných komplexů? V budoucí práci bych se rád zaměřil na řešení některých dílčích otázek, které by mohly přispět k detailnějšímu pochopení strukturních zákonitostí, vzniku reparačních komplexů a úlohy proteinu BRCA1 v tomto procesu, k čemuž předkládaná práce podává teoretický úvod.

29

7 Seznam zkratek 53BP1 ATM ABRA1 ATR BACH1 BAP1 BARD1 BASC BAX BCL2 BLM BRCA1/2 BRCC36/45 BRCT BRG1 BRIP1 CBP/p300 CDK1/2/4 CtBP CtIP DDB1/2 DSB E2F4 FANCA/C/F/G FANCD1/2 FHA GADD45 H2AX HDAC1/2 CHEK1/2 CHK1 IRIS JNK/SAPK MDC1 MMR MRE11 MRN MSH2/3/6 NBA1 NBS1/NBN

-

p53-binding protein 1 Ataxia-telangiectasia mutated Abraxas protein 1 Ataxia-telangiectasia and RAD3-related BRCA1-associated C-terminal helicase BRCA1 interacting protein BRCA1-associated RING domain 1 BRCA1 genome surveillance repair complex BCL asociated X protein B-cell leukemia 2 Bloom syndrome alias RECQL2 Breast cancer 1, Breast cancer 2 alias FANCD1 BRCA1/BRCA2-containing complex, subunit 36/45 BRCA1 C-terminal BRM/SWI2-related gene 1 BRCA1-interacting protein 1 CREB and p300 binding protein Cyclin-dependent kinase 1/2/4 C-terminal binding protein C-terminal interacting protein alias RBBP8 DNA damage binding protein 1/2 Double strand breaks E2F transcription factor 4 Fanconi anaemia complementation group A/C/F/G Fanconi anaemia complementation group D1/2 Fork head-associated Growth arrest- and DNA damage-inducible gene 45 Histon family member X Histon deacetylase 1/2 Cell cycle checkpoint kinase 1/2 gene Cell cycle checkpoint kinase 1/2 protein In-frame reading of BRCA1 intron 11 splice variant c-JUN N-terminal kinase/stress activated protein kinase Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 Multiple mismatch repair Meiotic recombination 11 MRE11/RAD50/NBS1 MutS e. coli homolog 2/3/6 New component of BRCA1 A complex 1 Nijmegen breackage syndrom gene 1/nibrin

30

NHEJ NLS1/2 p21waf1/CIP1

- Non-homologous end joining - Nuclear localization signal 1/2 - p21/ wildtype p53-activated fragment 1 / CDK-interacting protein 1

p53 PALB2 PARP PCNA RAP80 RB1 RBBP4/7/8 RFC RHA RING SCD STAT1 TAD TCR TFIIF/E/H ZBRK1

-

Tumor protein p53 Partner and localizer of BRCA2 alias FANCN Poly (ADP-ribose) polymerase Proliferating cell nuclear antigen Receptor-associated protein, 80-kD Retinoblastoma protein Retinoblastoma binding protein 4/7/8 Replication factor C RNA helicase A Realy interesting new gene Serine containing domain Signal transducer and activator of transcription 1; Transcription activation domain Transcription coupled repair Transcription factor F/E/H Zinc finger and brca1-interacting protein with a KRAB domain 1

31

8 Seznam použité literatury Adams KE, Medhurst AL, Dart DA, Lakin ND. Recruitment of ATR to sites of ionising radiation-induced DNA damage requires ATM and components of the MRN protein complex. Oncogene. 2006;25(28):3894-3904. Anderson SF, Schlegel BP, Nakajima T, Wolpin ES, Parvin JD. BRCA1 protein is linked to the RNA polymerase II holoenzyme complex via RNA helicase A. Nat Genet. 1998;19(3):254-256. Bartoňková H, Foretová L, Helmichová E, Kalábová R, Kleibl Z, Konopásek B, Krutílková V, Macháčková E, Novotný J, Petráková K, Petruželka L, Plevová P, Pohlreich P, Rob L, Skovajsová M, Veselý J, Žaloudík J. Doporučené zásady péče o nemocné s nádory prsu a vaječníků a zdravé osoby se zárodečnými mutacemi genů BRCA1 nebo BRCA2. Klin Onkol. 2003; 16(1):28-34. Bochar DA, Wang L, Beniya H, Kinev A, Xue Y, Lane WS, Wang W, Kashanchi F, Shiekhattar R. BRCA1 is associated with a human SWI/SNF-related complex: linking chromatin remodeling to breast cancer. Cell. 2000;102(2):257-265. Bork P, Hofmann K, Bucher P, Neuwald AF, Altschul SF, Koonin EV. A superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins. FASEB J. 1997;11(1):68-76. Brzovic PS, Rajagopal P, Hoyt DW, King MC, Klevit RE. Structure of a BRCA1-BARD1 heterodimeric RING-RING complex. Nat Struct Biol. 2001;8(10):833-837. Cantor SB, Bell DW, Ganesan S, Kass EM, Drapkin R, Grossman S, Wahrer DC, Sgroi DC, Lane WS, Haber DA, Livingston DM. BACH1, a novel helicase-like protein, interacts directly with BRCA1 and contributes to its DNA repair function. Cell. 2001;105(1):149160. Dong Y, Hakimi MA, Chen X, Kumaraswamy E, Cooch NS, Godwin AK, Shiekhattar R. Regulation of BRCC, a holoenzyme complex containing BRCA1 and BRCA2, by a signalosome-like subunit and its role in DNA repair. Mol Cell. 2003;12(5):1087-1099. Durocher D, Jackson SP. DNA-PK, ATM and ATR as sensors of DNA damage: variations on a theme? Curr Opin Cell Biol. 2001;13(2):225-231. Review. ElShamy WM, Livingston DM. Identification of BRCA1-IRIS, a BRCA1 locus product. Nat Cell Biol. 2004;6(10):954-967. Fan S, Wang JA, Yuan RQ, Ma YX, Meng Q, Erdos MR, Brody LC, Goldberg ID, Rosen EM. BRCA1 as a potential human prostate tumor suppressor: modulation of proliferation, damage responses and expression of cell regulatory proteins. Oncogene. 1998;16(23):3069-3082. Fan S, Yuan R, Ma YX, Meng Q, Goldberg ID, Rosen EM. Mutant BRCA1 genes antagonize phenotype of wild-type BRCA1. Oncogene. 2001;20(57):8215-8235. Gatei M, Zhou BB, Hobson K, Scott S, Young D, Khanna KK. Ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase and ATM and Rad3 related kinase mediate phosphorylation of Brca1 at

32

distinct and overlapping sites. In vivo assessment using phospho-specific antibodies. J Biol Chem. 2001;276(20):17276-17280. Garcia-Higuera I, Taniguchi T, Ganesan S, Meyn MS, Timmers C, Hejna J, Grompe M, D'Andrea AD. Interaction of the Fanconi anemia proteins and BRCA1 in a common pathway. Mol Cell. 2001;7(2):249-262. Gowen LC, Avrutskaya AV, Latour AM, Koller BH, Leadon SA. BRCA1 required for transcriptioncoupled repair of oxidative DNA damage. Science. 1998;281:1009–1012. Greenberg RA, Sobhian B, Pathania S, Cantor SB, Nakatani Y, Livingston DM. Multifactorial contributions to an acute DNA damage response by BRCA1/BARD1containing complexes. Genes Dev. 2006;20(1):34-46. Haber JE. The many interfaces of Mre11. Cell. 1998;95(5):583-586. Review. Hall JM, Lee MK, Newman B, Morrow JE, Anderson LA, Huey B, King MC. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21. Science. 1990;250(4988):1684-1689. Hakem R, de la Pompa JL, Sirard C, Mo R, Woo M, Hakem A, Wakeham A, Potter J, Reitmair A, Billia F, Firpo E, Hui CC, Roberts J, Rossant J, Mak TW. The tumor suppressor gene Brca1 is required for embryonic cellular proliferation in the mouse. Cell. 1996;85(7):1009-1023. Harkin DP, Bean JM, Miklos D, Song YH, Truong VB, Englert C, Christians FC, Ellisen LW, Maheswaran S, Oliner JD, Haber DA. Induction of GADD45 and JNK/SAPKdependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 1999;97(5):575586. Helleday T, Lo J, van Gent DC, Engelward BP. DNA double-strand break repair: from mechanistic understanding to cancer treatment. DNA Repair (Amst). 2007;6(7):923-935. Review. Hicke L. Protein regulation by monoubiquitin. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2(3):195-201. Review. Huber LJ, Yang TW, Sarkisian CJ, Master SR, Deng CX, Chodosh LA. Impaired DNA damage response in cells expressing an exon 11-deleted murine Brca1 variant that localizes to nuclear foci. Mol Cell Biol. 2001;21(12):4005-4015. Huen MS, Sy SM, Chen J. BRCA1 and its toolbox for the maintenance of genome integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(2):138-148. Review Chai YL, Cui J, Shao N, Shyam E, Reddy P, Rao VN. The second BRCT domain of BRCA1 proteins interacts with p53 and stimulates transcription from the p21WAF1/CIP1 promoter. Oncogene. 1999;18(1):263-268. Chen CF, Li S, Chen Y, Chen PL, Sharp ZD, Lee WH. The nuclear localization sequences of the BRCA1 protein interact with the importin-alpha subunit of the nuclear transport signal receptor. J Biol Chem. 1996;271(51):32863-32868. Chiba N, Parvin JD. The BRCA1 and BARD1 association with the RNA polymerase II holoenzyme. Cancer Res. 2002 Aug 1;62(15):4222-4228. Janatova M, Zikan M, Dundr P, Matous B, Pohlreich P. Novel somatic mutations in the BRCA1 gene in sporadic breast tumors. Hum Mutat. 2005;25(3):319.

33

Jin Y, Xu XL, Yang MC, Wei F, Ayi TC, Bowcock AM, Baer R. Cell cycle-dependent colocalization of BARD1 and BRCA1 proteins in discrete nuclear domains. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(22):12075-12080. Jensen DE, Proctor M, Marquis ST, Gardner HP, Ha SI, Chodosh LA, Ishov AM, Tommerup N, Vissing H, Sekido Y, Minna J, Borodovsky A, Schultz DC, Wilkinson KD, Maul GG, Barlev N, Berger SL, Prendergast GC, Rauscher FJ 3rd. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 1998;16(9):1097-1112. Karran P. DNA double strand break repair in mammalian cells. Curr Opin Genet Dev. 2000;10(2):144-150. Review. Koonin EV, Altschul SF, Bork P. BRCA1 protein products: Functional motifs. Nat Genet. 1996;13(3):266-268. Kim H., Chen J., Yu X. Ubiquitin-Binding Protein RAP80 Mediates BRCA1-Dependent DNA Damage Response. Science. 2007;316(5828):1202-1205. Lee JS, Collins KM, Brown AL, Lee CH, Chung JH. hCds1-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage response. Nature. 2000;404(6774):201-204. Lee JH, Paull TT. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50Nbs1 complex. Science. 2005;308(5721):551-554. Liang Y, Lin SY, Brunicardi FC, Goss J, Li K. DNA damage response pathways in tumor suppression and cancer treatment. World J Surg. 2009;33(4):661-666. Lorick KL, Jensen JP, Fang S, Ong AM, Hatakeyama S, Weissman AM. RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(20):11364-11369. Lou Z, Chini CC, Minter-Dykhouse K, Chen J. Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 regulates BRCA1 localization and phosphorylation in DNA damage checkpoint control. J Biol Chem. 2003;278(16):13599-13602. Mallery DL, Vandenberg CJ, Hiom K. Activation of the E3 ligase function of the BRCA1/BARD1 complex by polyubiquitin chains. EMBO J. 2002;21(24):6755-6762. Manke IA, Lowery DM, Nguyen A, Yaffe MB. BRCT repeats as phosphopeptide-binding modules involved in protein targeting. Science. 2003;302(5645):636-639. Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, Futreal PA, Harshman K, Tavtigian S, Liu Q, Cochran C, Bennett LM, Ding W, Bell R, Rosenthal J, et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science 1994;266(5182):66-71. Morris JR, Solomon E. BRCA1 : BARD1 induces the formation of conjugated ubiquitin structures, dependent on K6 of ubiquitin, in cells during DNA replication and repair. Hum Mol Genet. 2004;13(8):807-817. Monteiro AN, August A, Hanafusa H. Evidence for a transcriptional activation function of BRCA1 C-terminal region. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(24):13595-13599. Ouchi T, Monteiro AN, August A, Aaronson SA, Hanafusa H. BRCA1 regulates p53dependent gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(5):2302-2306. Ouchi T, Lee SW, Ouchi M, Aaronson SA, Horvath CM. Collaboration of signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and BRCA1 in differential regulation of IFNgamma target genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(10):5208-5213.

34

Ouchi T. BRCA1 phosphorylation: 2006;5(5):470-475. Review.

biological

consequences.

Cancer

Biol

Ther.

Pao GM, Janknecht R, Ruffner H, Hunter T, Verma IM. CBP/p300 interact with and function as transcriptional coactivators of BRCA1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(3):10201025. Paull TT, Cortez D, Bowers B, Elledge SJ, Gellert M. Direct DNA binding by Brca1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(11):6086-6091. Pohlreich P, Zikan M, Stribrna J, Kleibl Z, Janatova M, Kotlas J, Zidovska J, Novotny J, Petruzelka L, Szabo C, Matous B. High proportion of recurrent germline mutations in the BRCA1 gene in breast and ovarian cancer patients from the Prague area. Breast Cancer Res. 2005;7(5):R728-736. Rebbeck TR. Inherited genetic predisposition in breast cancer. A population-based perspective. Cancer. 1999;86(11 Suppl):2493-2501. Review. Rosen EM, Fan S, Pestell RG, Goldberg ID. BRCA1 gene in breast cancer. J Cell Physiol. 2003;196(1):19-41. Review. Ruffner H, Joazeiro CA, Hemmati D, Hunter T, Verma IM. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(9):51345139. Scully R, Anderson SF, Chao DM, WeiW, Ye L, Young RA, Livingston DM, Parvin JD. BRCA1 is a component of the RNA polymerase II holoenzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997a;94(11):5605–5610. Scully R, Chen J, Plug A, Xiao Y, Weaver D, Feunteun J, Ashley T, Livingston DM. Association of BRCA1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells. Cell. 1997b;88(2):265– 275. Scully R, Chen J, Ochs RL, Keegan K, Hoekstra M, Feunteun J, Livingston DM. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage. Cell. 1997c;90(3):425-435. Shiloh Y. ATM and ATR: networking cellular responses to DNA damage. Curr Opin Genet Dev. 2001;11(1):71-77. Review. Schlegel BP, Green VJ, Ladias JA, Parvin JD. BRCA1 interaction with RNA polymerase II reveals a role for hRPB2 and hRPB10alpha in activated transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(7):3148-3153. Smith TM, Lee MK, Szabo CI, Jerome N, McEuen M, Taylor M, Hood L, King MC. Complete genomic sequence and analysis of 117 kb of human DNA containing the gene BRCA1. Genome Res. 1996;6(11):1029-1049. Somasundaram K, Zhang H, Zeng YX, Houvras Y, Peng Y, Zhang H, Wu GS, Licht JD, Weber BL, El-Deiry WS. Arrest of the cell cycle by the tumour-suppressor BRCA1 requires the CDK-inhibitor p21WAF1/CiP1. Nature. 1997;389(6647):187-190. Somasundaram K, MacLachlan TK, Burns TF, Sgagias M, Cowan KH, Weber BL, el-Deiry WS. BRCA1 signals ARF-dependent stabilization and coactivation of p53. Oncogene. 1999;18(47):6605-6614.

35

Stracker TH, Theunissen JW, Morales M, Petrini JH. The Mre11 complex and the metabolism of chromosome breaks: the importance of communicating and holding things together. DNA Repair (Amst). 2004;3(8-9):845-854. Review. Takimoto R, MacLachlan TK, Dicker DT, Niitsu Y, Mori T, el-Deiry WS. BRCA1 transcriptionally regulates damaged DNA binding protein (DDB2) in the DNA repair response following UV-irradiation. Cancer Biol Ther. 2002;1(2):177-186. Ticha I, Kleibl Z, Stribrna J, Kotlas J, Zimovjanova M, Mateju M, Zikan M, Pohlreich P. Screening for genomic rearrangements in BRCA1 and BRCA2 genes in Czech high-risk breast/ovarian cancer patients: high proportion of population specific alterations in BRCA1 gene. Breast Cancer Res Treat. 2010 Thakur S, Zhang HB, Peng Y, Le H, Carroll B, Ward T, Yao J, Farid LM, Couch FJ, Wilson RB, Weber BL. Localization of BRCA1 and a splice variant identifies the nuclear localization signal. Mol Cell Biol. 1997;17(1):444-452. Thomas JE, Smith M, Tonkinson JL, Rubinfeld B, Polakis P. Induction of phosphorylation on BRCA1 during the cell cycle and after DNA damage. Cell Growth Differ. 1997;8(7):801-809. Venkitaraman AR. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2. Cell. 2002;108(2):171-182. Review. Wang H, Shao N, Ding QM, Cui J, Reddy ES, Rao VN. BRCA1 proteins are transported to the nucleus in the absence of serum and splice variants BRCA1a, BRCA1b are tyrosine phosphoproteins that associate with E2F, cyclins and cyclin dependent kinases. Oncogene. 1997;15(2):143-157. Wang Y, Cortez D, Yazdi P, Neff N, Elledge SJ, Qin J. BASC, a super complex of BRCA1associated proteins involved in the recognition and repair of aberrant DNA structures. Genes Dev. 2000;14(8):927-939. Wang Q, Zhang H, Guerrette S, Chen J, Mazurek A, Wilson T, Slupianek A, Skorski T, Fishel R, Greene MI. Adenosine nucleotide modulates the physical interaction between hMSH2 and BRCA1. Oncogene. 2001;20(34):4640-4649. Wang B, Elledge SJ. Ubc13/Rnf8 ubiquitin ligases control foci formation of the Rap80/Abraxas/Brca1/Brcc36 complex in response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(52):20759-20763. Wang B, Matsuoka S, Ballif BA, Zhang D, Smogorzewska A, Gygi SP, Elledge SJ. Abraxas and RAP80 form a BRCA1 protein complex required for the DNA damage response. Science. 2007;316(5828):1194-1198. Wang B, Hurov K, Hofmann K, Elledge SJ. NBA1, a new player in the BRCA1 A complex, is required for DNA damage resistance and checkpoint control. Genes Dev. 2009;23(6): 729-739. Williams RS, Green R, Glover JN. Crystal structure of the BRCT repeat region from the breast cancer-associated protein BRCA1. Nat Struct Biol. 2001;8(10):838-842. Wong AK, Pero R, Ormonde PA, Tavtigian SV, Bartel PL. RAD51 interacts with the evolutionarily conserved BRC motifs in the human breast cancer susceptibility gene brca2. J Biol Chem. 1997;272(51):31941-31944.

36

Wu LC, Wang ZW, Tsan JT, Spillman MA, Phung A, Xu XL, Yang MC, Hwang LY, Bowcock AM, Baer R. Identification of a RING protein that can interact in vivo with the BRCA1 gene product. Nat Genet. 1996;14(4):430-440. Xu X, Qiao W, Linke SP, Cao L, Li WM, Furth PA, Harris CC, Deng CX. Genetic interactions between tumor suppressors Brca1 and p53 in apoptosis, cell cycle and tumorigenesis. Nat Genet. 2001;28(3):266-271. Yang H, Li Q, Fan J, Holloman WK, Pavletich NP. The BRCA2 homologue Brh2 nucleates RAD51 filament formation at a dsDNA-ssDNA junction. Nature. 2005;433(7026):653657. Yarden RI, Brody LC. BRCA1 interacts with components of the histone deacetylase complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(9):4983-4988. Yarden RI, Papa MZ. BRCA1 at the crossroad of multiple cellular pathways: approaches for therapeutic interventions. Mol Cancer Ther. 2006;5(6):1396-1404. Review. Yu X, Wu LC, Bowcock AM, Aronheim A, Baer R. The C-terminal (BRCT) domains of BRCA1 interact in vivo with CtIP, a protein implicated in the CtBP pathway of transcriptional repression. J Biol Chem. 1998;273(39):25388-25392. Yu X, Chen J. DNA damage-induced cell cycle checkpoint control requires CtIP, a phosphorylation-dependent binding partner of BRCA1 C-terminal domains. Mol Cell Biol. 2004;24(21):9478-9486. Zhang H, Somasundaram K, Peng Y, Tian H, Zhang H, Bi D, Weber BL, El-Deiry WS. BRCA1 physically associates with p53 and stimulates its transcriptional activity. Oncogene. 1998;16(13):1713-1721. Zheng L, Pan H, Li S, Flesken-Nikitin A, Chen PL, Boyer TG, Lee WH. Sequence-specific transcriptional corepressor function for BRCA1 through a novel zinc finger protein, ZBRK1. Mol Cell. 2000;6(4):757-768. Zhong Q, Chen CF, Li S, Chen Y, Wang CC, Xiao J, Chen PL, Sharp ZD, Lee WH. Association of BRCA1 with the hRad50-hMre11-p95 complex and the DNA damage response. Science. 1999;285(5428):747-750. Pozn.: Barevně jsou označeny přehledové články. Internetové zdroje: Databáze OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

37