MASARYKOVA UNIVERZITA Fakulta přírodovědecká Katedra biochemie
Struktura, vlastnosti a funkce flavoproteinů Bakalářská práce
Brno 2010 Aneta Wandrolová
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji tímto, ţe svou bakalářskou práci na téma Struktura, vlastnosti a funkce flavoproteinů jsem vypracovala samostatně pod vedením vedoucího bakalářské práce a za pouţití literatury, kterou jsem uvedla na konci práce v seznamu literatury.
V Brně 14. 5. 2010
………………………….. Aneta Wandrolová 2
PODĚKOVÁNÍ: Děkuji prof. RNDr. Igoru Kučerovi, DrSc. za vedení bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Vojtěchu Sedláčkovi, Ph.D. za pomoc při realizaci praktické části této práce.
3
OBSAH 1.
ÚVOD............................................................................................................................. 6
2.
TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................... 7 2.1.
Historie objevu flavinových kofaktorů a souvislost s vitamínem B2 .................. 7
2.2.
Flavoenzymy .......................................................................................................... 8
2.2.1.
Vyuţití ............................................................................................................. 8
2.2.2.
Zastoupení kofaktorů...................................................................................... 9
2.3.
Flavinové nukleotidy ............................................................................................. 9
2.3.1.
Spektroskopické vlastnosti flavinů .............................................................. 12
2.3.2.
Redoxní potenciály ....................................................................................... 13
2.3.3.
Fotochemické reakce .................................................................................... 15
2.4.
Příklady flavinových enzymů .............................................................................. 15
2.4.1.
Oxidoreduktasy ............................................................................................. 15
2.4.2.
Transferasy .................................................................................................... 17
2.4.3.
Hydrolasy ...................................................................................................... 17
2.4.4.
Lyasy ............................................................................................................. 17
2.4.5.
Isomerasy ...................................................................................................... 19
2.4.6.
Ligasy ............................................................................................................ 20
2.5.
Ferrireduktasa B ................................................................................................... 20
3.
CÍL PRÁCE ................................................................................................................. 21
4.
PRAKTICKÁ ČÁST ................................................................................................... 22 4.1.
Materiál a přístroje ............................................................................................... 22
4.1.1.
Přístroje a pomůcky ...................................................................................... 22
4.1.2
Chemikálie .................................................................................................... 22 4
4.1.3. 4.2.
Enzymy ......................................................................................................... 23
Způsob měření ...................................................................................................... 23
4.2.1.
Příprava vzorku............................................................................................. 23
4.2.2.
Měření redoxního potenciálu ....................................................................... 23
4.2.3.
Výpočty ......................................................................................................... 24
4.3.
Výsledky ............................................................................................................... 24
5.
DISKUZE ..................................................................................................................... 27
6.
SHRNUTÍ..................................................................................................................... 28
7.
SUMMARY ................................................................................................................. 29
POUŢITÁ LITERATURA ................................................................................................. 30
5
1. ÚVOD Flavoproteiny jsou hojně rozšířené bílkoviny, které mají jako prostetickou skupinu flavin. Flaviny jsou ţlutě zbarvené sloučeniny se základní strukturou 7,8 – dimethyl – 10 alkylisoalloxazin, které se účastní mnoha biochemických reakcí jako koenzymy a fotoreceptory. Ve většině flavoproteinů je flavinový kofaktor vázán pevně, ale nekovalentně. Umělé odštěpení a zpětná rekonstituce kofaktoru je důleţitou metodou studia struktury a funkce těchto sloţených proteinů. Běţné flavinové kofaktory jsou FMN a FAD, které in vivo vznikají z riboflavinu (vitamínu B2). Riboflavin je fosforylován na FMN působením riboflavinkinasy. FAD je pak vytvořen přenosem AMP z molekuly ATP na FMN pomocí FADsyntetasy. Redoxaktivní
isoalloxazin
flavinového kofaktoru
podléhá
jedno-
nebo
dvouelektronovým přeměnám. Tato vlastnost umoţňuje katalýzu mnoha biochemických reakcí, které mají nezastupitelnou úlohu v buněčné redoxní chemii. Během posledních šedesáti let bylo nalezeno velké mnoţství flavoproteinů a bylo určeno mnoho detailů o jejich katalytickém působení a struktuře. Flavoproteiny se uplatňují v mnoha biologických procesech a reakcích od redoxní katalýzy, emise světla aţ po opravy DNA. Jedno z moţných dělení je na oxidasy, dehydrogenasy, monooxygenasy, elektrontransferasy, disulfidreduktasy, synthasy a fotolyasy.
6
2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Historie objevu flavinových kofaktorů a souvislost s vitamínem B2 První zmínka o flavoproteinu ve vědecké literatuře se datuje do roku 1879. Jasně ţlutý pigment izolovaný z kravského mléka byl zpočátku nazván laktochrom, později jako riboflavin. V letech 1920 – 1930 byly izolované ţluté pigmenty s jasně nazelenalou fluorescencí z dalších různých zdrojů a podle toho pojmenovány např. laktoflavin, ovoflavin atd. [1]. Struktura riboflavinu byla objevena současně profesorem organické chemie P. Karrerem a známým německým organickým chemikem R. Kuhnem nezávisle na sobě v roce 1933. Jiţ dříve bylo publikováno, ţe vedle thiaminu (B1) se ve skupině vitamínu B nachází další termostabilní faktor B2. V roce 1933 upozornil Booher na ţlutozelenou fluorescenci a biologickou účinnost různých extraktů. R. Kuhn se svým kolektivem získali z vaječného bílku krystalickou substanci a současně Ellinger a Koshara získali totéţ z mléka a kvasnic. Současně bylo zjištěno, ţe je to derivát izoalloxazinu. Jméno riboflavin je odvozené od ribitylového postranního řetězce a ţlutě zbarvených konjugovaných systémů. Patent získala syntéza publikovaná Kuhnem v roce 1934 (IG Farben-Industrie). Warburg a Christan v roce 1932 izolovali tzv. „ţlutý ferment―. V tomto enzymu má modifikovaný riboflavin funkci koenzymu. Tento objev byl významný pro enzymologii, protoţe na něm byl demonstrován pojem koenzymu a apoenzymu [2]. První důkaz toho, ţe flavin slouţí jako koenzym, byl proveden v roce 1935. Hugo Theorell a jeho spolupracovníci zjistili, ţe ţlutě zbarvený protein v droţdí můţe být rozdělen na apoprotein a ţlutý pigment. Prostetickou skupinu ţlutého fermentu izoloval a identifikoval jako riboflavinfosfát. Dále zjistil, ţe riboflavin se účastní jako prekursor FMN kofaktoru v enzymové katalýze. Warburg a Christian izolovali v roce 1938 ze ţivočišného materiálu FAD. Dnes jsou známy stovky flavoproteinových enzymů a kaţdým rokem se nachází nové. Intenzivně se také studuje mechanismus působení těchto enzymů a jejich vliv na metabolismus [1,2].
7
2.2.
Flavoenzymy
2.2.1. Využití Flavoenzymy byly zpočátku studovány hlavně z hlediska struktury a mechanismu působení, postupně však je rozpoznáván i jejich význam pro průmyslové biokatalytické aplikace. Je to zejména díky jejich selektivitě a účinnosti. Nové poznatky oxidačních flavoenzymů vedou k jejich vyuţití ve farmaceutickém, chemickém a potravinářském průmyslu. Zapojují se v celé řadě biologických procesů (obr. 1) [3].
Obr 1. Biologické funkce flavoenzymů [3] Flavoenzymy tvoří skupinu enzymů, které ovládají buněčné dýchání a další fyziologické funkce organismu. Hlavní funkcí flavoenzymů je přenos vodíku z různých substrátů buď za účelem uvolnění energie, nebo metabolické přeměny. Nejčastěji fungují díky spojením s pyridinnukleotidovými koenzymy, u nichţ často určují stereospecifitu reakce. Jejich základním znakem je reverzibilita a nezávislost na aerobních a anaerobních podmínkách [2]. Obsahují jako kofaktor buď FMN nebo FAD, zpravidla nekovalentně vázáný na apoprotein. V některých flavoenzymech je ale isoalloxazinový kruh flavinu kovalentně vázán na zbytek His, Cys nebo Tyr polypeptidového řetězce. Nedávno bylo zjištěno, ţe flavin můţe být ukotven k apoproteinu dvěma kovalentními vazbami. Kovalentní připojení flavinu je výsledkem autokatalytického procesu. Můţe mít význam pro 8
stabilizaci aktivního místa a celé molekuly proteinu, zamezení ztrát kofaktoru oddisociováním, prevenci jeho modifikace a inaktivace, a nastavení jeho redoxního potenciálu [3]. Většina flavoenzymů provádí reakce s redoxními změnami. Zahrnují oxidace, redukce, monooxygenace, dioxygenace a elektronové přenosy Existuje ale i celá řada neobvyklých flavoenzymů, které katalyzují reakce s neredoxními změnami [4].
2.2.2. Zastoupení kofaktorů Z databáze [5] volně dostupné na internetu lze určit počet dosud známých flavoenzymů v jednotlivých třídách (Tab. 1). Z tabulky je patrné, ţe nejvíce enzymů, které mají flavinové kofaktory patří mezi oxidoreduktasy. Ostatní enzymové třídy flavinové kofaktory buď vůbec neobsahují, nebo je obsahuje jen malé mnoţství enzymů. Enzymová třída
Počet enzymů s kofaktorem
Počet enzymů s kofaktorem
FAD
FMN
oxidoreduktasy
270
106
transferasy
7
6
hydrolasy
1
0
lyasy
6
5
isomerasy
7
1
ligasy
0
1
Tabulka 1: Počty flavoenzymů s FAD a FMN kofaktorem [5]
2.3.
Flavinové nukleotidy Společným základem flavinových nukleotidů je isoalloxazinový skelet. Vitamín
B2 (riboflavin), který patří mezi nejjednodušší přírodní látky, tuto strukturu obsahuje. Od něj jsou odvozeny FAD a FMN [6]. Flavinadenindinukleotid (FAD) je v oxidované formě ţlutý a v redukované formě (po přijetí dvou atomů vodíku) bezbarvý. Vytváří prostetickou skupinu mnoha enzymů.
9
Obr. 2: FAD [7] Podobnou funkci zastává i flavinmononukleotid (FMN) [8].
Obr. 3: FMN [9] Většina flavoproteinů obsahuje jednu molekulu flavinu, buď FAD nebo FMN. Některé proteiny obsahují současně kofaktor FMN i FAD. Mezi nejlépe prostudované diflavinové enzymy patří například NADPH-cytochrom P450-reduktasa (EC 1.6.2.4), NO-synthasa
(EC
1.14.13.39),
methioninsynthasa
reduktasa
(EC
1.16.1.8),
sulfitreduktasa (EC 1.8.99.3) a glutamátsynthasa (EC 1.4.1.14). Dále existuje velké mnoţství enzymů, které kromě flavinů obsahují i jiné druhy kofaktorů. Například Xanthinoxidasa (EC 1.17.3.2) vedle flavinu váţe molybden a 2Fe-2S centra, trimethylamindehydrogenasa (1.5.8.2) obsahuje 4Fe-4S klastr a flavocytochromy hem [10].
10
Obr. 4: Syntéza FMN a FAD [11] Flavinové kofaktory jsou syntetizovány in vivo z riboflavinu enzymaticky nebo chemicky. Riboflavin je fosforylován na FMN působením riboflavinkinasy. FAD je pak vytvořeno převodem AMP z molekuly ATP na FMN pomocí FADsyntetasy [12].
11
2.3.1. Spektroskopické vlastnosti flavinů
Obr. 5: Oxidovaný a redukovaný isoalloxazinový skelet (jednoelektronová redukce vede k barevným formám semichinonu, R značí zbylou část koenzymu) [6] Redukce probíhá do dvou stupňů: v prvním po přijetí jednoho elektronu vzniká radikál semichinonu, který je relativně stabilní a ten se dále redukuje na leukoformu. Semichinon je v reverzibilní rovnováze s redukovanou i oxidovanou formou. [1] Radikály semichinonu mohou být zjištěny elektronovou spinovou rezonanční spektroskopií (charakteristické spektrum nebo podle paramagnetického chování v magnetickém poli). Díky této schopnosti můţe docházet k jedno- nebo dvouelektronové redukci, či ke spojení obou typů systémů. FMN + e- + H + ↔ FMNH● (semichinon) FMN + 2e- + H + ↔ FMNH2 Oxidované formy jsou ţluté. Absorpční spektrum plně oxidované formy flavinové dehydrogenasy je na obrázku 6. Absorpční maximum při redukci vymizí při 450 nm. Flavinové enzymy se dělí na oxidasy a dehydrogenasy. Reoxidací redukovaných flavinových oxidas kyslíkem vzniká peroxid vodíku nebo superoxidový 12
anionradikál ●O2-. Flavinové dehydrogenasy přenášejí elektrony na jiné akceptory, např. na ubichinon (koenzym Q) nebo hemové ţelezo.
Obr. 6: Absorpční spektrum oxidované formy flavinových dehydrogenás (po redukci vymizí maximum při 450 nm) [6] Redukované flavinové dehydrogenasy se dají reoxidovat umělými akceptory elektronů mezi které patří hexakyanoţelezitany nebo redukovaná barviva, např. methylenová modř, fenazinmethosulfát a 2,6 – dichlorfenolindofenol. Pokusy je nutné provádět za anaerobních podmínek, protoţe bezbarvá redukovaná barviva rychle reoxidují molekulárním kyslíkem. Jako příklad je uvedena reakce s methylenovou modří (E je vazba na apoenzym): E – FADH 2 + methylenová modř (modrá) ↔ E – FAD + leukomethylenová modř (bezbarvá) [6]
2.3.2. Redoxní potenciály Bylo objeveno mnoho redoxně aktivních proteinů, aniţ by byly známé jejich enzymatické funkce. Pro zjištění enzymatických funkcí musí být stanoven redoxní potenciál. To je moţné potenciometrickým nebo spektroelektrochemickým měřením. Protein můţe být redukován (nebo oxidován) buď chemicky, nebo elektrochemicky. Redoxně aktivní proteiny se skládají z elektrochemicky téměř neaktivního apoproteinu, ve kterém je vestavěn jeden nebo více kofaktorů. Poměrně často není přenos elektronů vůbec moţný, protoţe kofaktor je v apoproteinu zastíněn. Za tímto účelem se přidávají malé redoxně aktivní molekuly tzv. redoxní mediátory, které stanovují elektrochemické rovnováhy a jsou nezbytné pro stanovení redoxních potenciálů. 13
Během redoxní titrace je roztok, který obsahuje protein míchán v kyvetě za nepřítomnosti kyslíku. Přidáváním malého mnoţství redukčního nebo oxidačního činidla se mění redoxní potenciál. Nejčastěji se pouţívá dithioničitan (redukční činidlo) a hexakyanoţelezitan (oxidační činidlo). Redoxní proces je obvykle sledován UV/VIS absorpcí a vyhodnocují se spektra při vlnové délce, kdy je změna absorpce citlivá na poměr mezi oxidovanou a redukovanou formou proteinu. Je nutné vzít v úvahu ostatní sloţky směsi, protoţe absorpční spektra redoxních mediátorů se mohou měnit v závislosti na jejich redoxním stavu. Pro stanovení standardního redoxpotenciálu flavinu je nutné provést redoxní titrace v obou směrech (postupná redukce a reoxidace). Skutečnost, ţe v obou případech získáme stejné hodnoty, znamená, ţe podmínky rovnováhy byly dosaţeny. Ve vodném roztoku při neutrálním pH jsou volné flaviny stabilní pouze oxidované (chinon) nebo ve dvakrát zredukovaném stavu (hydrochinon, jednoduchý nebo dvojnásobně protonovaný). Důvodem je, ţe standardní potenciál pro redukci neutrálního flavosemichinonového radikálu na flavohydrochinon je pozitivnější neţ pro redukci flavochinonu na flavosemichinonový radikálový anion. Fotochemická redukce volných flavinů probíhá ozářením modrým světlem v přítomnosti EDTA. Ozařováním na singletový stav následuje rychlý nezářivý přechod k tripletovému stavu, který je tvořen ve vysokém kvantovém výnosu. Přenos elektronu z EDTA a následná protonace vede k vytvoření flavosemichinonového radikálu. Dva flavosemichinonové radikály podléhají rychlé disproporcionaci na oxidovaný a dvakrát redukovaný flavin. Doposud je tento mechanismus všeobecně přijímaný pro fotochemické redukce volných flavinů v roztoku. Spektroelektrochemické vyšetřování proteinů je důleţitou metodou pro studium jejich redoxních vlastností a objasnění proteinových cest elektronových přenosů. Proteiny mohou být redukovány a oxidovány chemickými, elektrochemickými a fotochemickými metodami. Především kdyţ jsou studovány flavoproteiny, tak jejich fotochemická redukce ozářením modrým světlem v přítomnosti EDTA můţe vést k formaci flavoproteinových semichinonových radikálů, které jinak nemohou být pozorovány [13].
14
2.3.3. Fotochemické reakce Fotochemie riboflavinu a jeho analogů byla studována od roku izolace vitamínu B2 a objevu jeho fotosenzitivního chování. Tyto studie vedly k rozšíření našich znalostí o biologických funkcích, degradaci cest, molekulárních interakcích, světlem buzených procesů a fotosenzitivních reakcí. Hlavní mezimolekulární
fotochemické
reakce
flavinů
fotoredukci, intramolekulární a
zahrnují
intramolekulární
mezimolekulární
fotoadici
a a
intramolekulární fotodealkylaci. Povaha a význam fotochemických reakcí riboflavinu a jeho analogů závisí na takových faktorech jako je polarita rozpouštědla, pH prostředí, druh pufru a koncentrace, iontová síla, komplexace a intenzita světla a jeho vlnová délka. Všechny tyto reakce vyţadují pouţití zvláštních analytických metod pro hodnocení kinetiky fotodegradace reakcí [14].
2.4.
Příklady flavinových enzymů
2.4.1. Oxidoreduktasy Oxidoreduktasy katalyzují intermolekulové oxidačně redukční přeměny. Je to jedna z nejpočetnějších tříd enzymů a všechny mají povahu sloţených bílkovin. Oxidoredukční děje se realizují buď přenosem atomů vodíku (transhydrogenasy nebo dehydrogenasy) nebo elektronů (transelektronasy), případně vestavěním atomu kyslíku do substrátu (oxygenasy). Dělí se na podtřídy podle funkčních skupin, které jsou donory H nebo elektronů [15]. Dále je popsána glukóza oxidasa a NADPH oxidasa. Glukóza oxidasa (EC 1.1.3.4) byla získána z různých druhů hub, především rodu Aspergillus a Penicillium, kde je nejčastěji pro výrobu pouţíván Aspergillus niger. Avšak glukóza oxidasa z rodu Penicillium vykazovala výhodnější kinetiku pro oxidaci glukózy neţ u Aspergillus niger. Molekulová hmotnost glukózy oxidasy je v okolí přibliţně 130 aţ 175 kDa [16]. Je to mikrobiální enzym, který patří do třídy oxidoreduktas a obsahuje FAD jako prostetickou skupinu [8]. FAD není vázán kovalentně a proto můţe být z holoproteinu po denaturaci odštěpen [17]. Katalyzuje oxidaci β-D-glukózy molekulárním kyslíkem (elektronový akceptor) na peroxid vodíku a δ-D-glukonolakton, který následně hydrolyzuje samovolně na kyselinu glukonovou [18].
15
Obr 7: Oxidace glukózy pomocí glukózy oxidasy [17] Enzym z Aspergillus niger je glykoprotein obsahující vázanou manosu který tvoří 10-16% jeho molekulové hmotnosti. Sacharidové části jsou O-glykosidicky vázané na protein. [18] Glukóza oxidasa je vysoce specifická pro β-anomer D-glukózy, zatímco α-anomer není vhodný substrát. Sníţená aktivita glukózy oxidasy byla dokázána při vyuţití 2–deoxy-D-glukózy, D-manosy a D-galaktosy jako substrátu. Mezi inhibitory glukózy oxidasy patří např. Ag+, Hg2+ , Cu2+, hydroxylamin, hydrazin, atd. Obsah aminokyselin ze dvou enzymů, bylo zjištěno, ţe glukóza oxidása z Aspergillus niger obsahuje více histidinu, argininu a tyrosinu a méně lysinu a fenylalaninu, neţ glukóza oxidasa z Penicillium amagasakiense. Optimální pH u Aspergillus niger je v rozmezí 3,5-6,5 [16]. Enzym NADPH (EC 1.6.3.1) oxidasa můţe obsahovat jak FMN, tak i FAD kofaktor. Její systematický název je NADPH oxygen oxidoreduktasa [5]. Tento enzym vedle NO-synthasy patří k hlavním enzymům, katalyzujícím vznik volných radikálů v buňkách. Volné radikály jsou atomy, molekuly či ionty schopné samostatné existence, které mají ve svém elektronovém obalu jeden nepárový elektron, eventuálně více nepárových elektronů. Jsou velmi reaktivní a mají omezenou dobu existence, protoţe se snaţí získat další elektron do stabilní konfigurace [19]. Tento enzym se nachází v profesionálních fagocytech (neutrofily, eozinofily, monocyty a makrofágy) v průběhu jejich vývoje. Redukovaná NADPH oxidasa katalyzuje výrobu superoxidu (O2-) z kyslíku a NADPH, podle následující reakce: NADPH + 2O2 → NADP+ + H+ + 2O2Oxidační činidla tvořené NADPH oxidasou zahrnují H2O2 , který je produkovaný dismutací superoxidu. 2O2- + 2H+ → O2 + H2O2
16
Malé mnoţství superoxidu je také vytvářeno enzymy, známými jako „NOX―. Tyto enzymy jsou široce rozšířené např. v endotelu, ledvinách a slezině, zřejmě za účelem signalizace. [20].
2.4.2. Transferasy Přenáší různé skupiny (-CH3, -NH2 , zbytek glukózy apod.) v aktivované formě z jejich donoru na akceptor. Je to početná skupina, která má povahu sloţených bílkovin. Zapojují se do řady biosyntetických dějů. Rozdělují se dle charakteru přenášených skupin [15]. Dále je popsána N-methylglutamát synthasa. N-metylglutamát synthasa (EC 2.1.1.21) patří mezi enzymy, u kterých se volné radikály
neuplatní
v redoxní
katalýze.
N-Metyluglutamát
synthása
katalyzuje
reverzibilní tvorbu N-methyl-L-glutamátu z metylaminu a L-glutamátu. Rod Pseudomonas indukuje enzym ve formě metylaminu jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Tento produkt je oxidován organismem za tvorby formaldehydu a regenerace glutamátu. Oxidací glutamátu na imin, která můţe uvolňovat amoniak hydrolyzuje na 2oxoglutarát v podobě glutarylového enzymového meziproduktu. Tento meziprodukt můţe příjmout metylamin k vytvoření metyliminu, který můţe být redukován FMN na produkt. Role flavinu v tomto enzymu je usnadnit nukleofilní substituci aminu s jiným aminem. Toho je dosaţeno dvouelektronovou redukcí substrátu
při výrobě
meziproduktu, která je více náchylná k nukleofilnímu ataku aminu. [4]
2.4.3. Hydrolasy Hydrolyticky štěpí vazby, které vznikají kondenzací, např. peptidové, glykosidové, esterové. Vesměs mají povahu jednoduchých bílkovin a dělí se dle typu štěpných vazeb [15]. Z databází vyplývá, ţe jediný enzym mezi hydrolázami je pyruvátdehydrogenasa
fosfatasa
(EC
3.1.3.43), která
katalyzuje
defosforylaci
podjednotky E1 savčího komplexu pyruvátdehydrogenasy [21].
2.4.4. Lyasy Katalyzují nehydrolytické štěpení a vznik vazeb C-O, C-C, C-N, atd. Odštěpují nebo vnášejí do substrátů malé molekuly (CO 2, H 2O, NH3 , atd.) bez dalších reaktantů. Vytváří málo početnou skupinu enzymu a mají povahu sloţených bílkovin. Rozdělují se 17
dle štěpených nebo syntetizovaných vazeb [15]. Dále je popsána chorismát synthasa a DNA fotolyasa. Chorismát synthasa (EC 4.2.3.5) katalyzuje přeměnu 5-enolpyruvylšikimát-3fosfátu na chorismát. Chorismát je meziprodukt při šikimátové dráze, která je zodpovědná za biosyntézu aromatických sloučenin, včetně aromatických aminokyselin, řady vitamínů a fenolických sloučenin. Tato dráha je přítomna u mikrobů a rostlin, ale ne u zvířat. Proto se pro enzymy této dráhy hledá uplatnění u antibiotik a herbicidů. Příkladem je glyofosát (nejprodávanější světový herbicid), který inhibuje 5enolpyruvylšikimát-3-fosfát. Chorismát synthasa u některých organismů (Neurospora crassa) je bifunkční a má další NADPH2: FMN oxidoreduktasovou aktivitu. Bylo dokázáno, ţe vazebná místa pro substrát a NADPH se překrývají, coţ znamená, ţe substrát se váţe v blízkosti isoalloxazinového kruhu flavinu. Enzymy z mnoha dalších organismů, včetně Escherichia coli, Thermatoga maritime, Plasmodium falciparum a Staphylococcus aureus, jsou monofunkční a vyţadují samostatné NADPH2: FMN oxidoreduktasy pro aktivity in vivo. Hlavní důkaz o roli flavinu při katalýze poskytlo pouţití substrátových a kofaktorových analogů. Ztráta aktivity při náhradě FMN 5-deazaderivátem svědčí o redoxní roli flavinu. Zvláště přesvědčivé bylo pozorování vytváření flavinového semichinonového radikálu se substrátovým analogem (6R)-fluor 5-enolpyruvylšikimát3-fosfátem. Nedávná studie zjistila, ţe produkt této reakce v přítomnosti dithinoničitanu je chorismát. DNA fotolyasa (EC 4.1.99.3) katalyzuje opravy thiaminových dimerů. Tyto cis, syn-cyklobutanové pyrimidinové dimery vznikají UV ozářením DNA a vedou k mutačním poškozením. DNA fotolyasa je součástí fotoreparačních systémů bakterií, rostlin a ţivočichů. Enzym ze všech zdrojů vyţaduje redukci FAD. Obsahuje antény, které sbírají světlo – buď pterin 5,10-metenyltetrahydrofolylpolyglutamát nebo 7,8didemetyl-8-hydroxy- 5-carba-5-deazariboflavin. Antény absorbují světlo o vlnových délkách 300 a 450 nm a excitační energie je převedena na aniontovou formu redukovaného FAD. V nepřítomnosti antény, je enzym aktivní, i kdyţ s niţší fotochemickou účinností. Nahrazením FAD s 1-deazaFAD nebo s 5-deazaFAD v přítomnosti antény vede k nízké enzymové aktivitě. Apoenzym je také 18
schopný fotolyasové činnosti v UV-dependentní reakci zahrnující tryptofanový zbytek (Trp277 v E. coli) [4].
2.4.5. Isomerasy Katalyzují vnitromolekulové přesuny atomů a jejich skupin. Je to poměrně početná skupina povahy jednoduchých bílkovin. Členění závisí na typu izomerie [15]. Jako příklad je zde uvedena UDP galaktopyranósa mutasa. UDPgalaktopyranósa mutasa (EC 5.4.99.9) katalyzuje reverzibilní přeměny αUDP - galaktopyranosových aţ α – UDP - galakto - 1,4 - furanózy s rovnováhou v poměru přibliţně 11:1 ve prospěch substrátu. Produkt reakce je prekurzor galaktofuranózového zbytku v buněčné stěně bakterií a parazitů, které zahrnují několik lidských
patogenů.
Přinejmenším
u
mykobakterií
je
enzym
nezbytný
pro
ţivotaschopnost. Protoţe tento enzym nebyl nalezen u lidí, jsou vyvíjena léčiva, která jej specificky inhibují. Byl navrţen neredoxní mechanismus pro anomerní štěpení C-O vazby. První krok zahrnuje nukleofilní odtrţení UDP od 4-hydroxy skupiny substrátu, buď nepřímo přes oxokarbeniový iontový meziprodukt, nebo přímo k výrobě bicyklo meziproduktu. V dalším kroku je vazba C1-O5 štěpena buď SN2 substitucí nukleofilem aktivního místa enzymu nebo cestou oxokarbeniového iontu. Nukleofilní atak anomerním uhlíkem UDP poté vytváří produkt. Poslední krystalové struktury enzymu E. coli spolu s výsledky místně řízené mutageneze ukazují, ţe substrát a flavin se váţí do stejné štěrbiny proteinu. Není jasné, zda se uplatňuje redoxní reakce flavinu. Dvouelektronová redukce substrátu redukovaným flavinovým kofaktorem se nezdá být pravděpodobná. Jednou z moţností by mohlo být, ţe odstranění skupiny UDP je usnadněno v jednoelektronové redukci substrátu redukovaným FAD kofaktorem, připomínajícím původní krok reakce chorismátové
synthasy. Elektron
by pak
mohl
flavin
vrátit
z
výsledného
oxokarbeniového radikálu ke generování oxokarbeniového iontu, coţ by mohlo vést k nukleofilnímu ataku na C-1 od O-4. Podobné přechodné přenosy elektronů by se mohly podílet na odstranění skupiny UDP v opačných reakcích [4].
19
2.4.6. Ligasy Díky jejich katalýze vznikají energeticky náročné vazby a současně látky, které se rozkládají a zároveň uvolňují energii, např. ATP. Je to poměrně málo početná skupina enzymů, které mají povahu sloţených bílkovin. Rozdělují se dle typu vytvářených
vazeb
[15].
Do
třídy
ligas
z flavoenzymů
patří
pouze
fosfopantotenoylcystein syntethasa (6.3.2.5), která katalyzuje vytváření (R) – 4´- fosfoN-pantotenoylcysteinu z 4´-fosfopantotenátu a z L-cysteinu. Tento enzym je zapojený v biosyntéze koenzymu A (CoA) [22].
2.5.
Ferrireduktasa B FerB byl původně objeven v ústavu biochemie PřF MU při charakterizaci
enzymů z cytoplazmatické frakce bakterie Paracoccus denitrificans, které katalyzují přenos elektronů z NADH na komplexy trojmocného ţeleza. Obsahuje nekovalentně vázaný FAD jako kofaktor a pouţívá NADH a NADPH jako donory elektronu k redukci široké řady sloučenin, např. chinony, ţelezité komplexy, chromát a různé benzo- a naftochinony. Protoţe strukturální studie vyţadují miligramové mnoţství funkčního a vysoce purifikovaného proteinu, byl gen ferB exprimován v Escherichia coli ve formě fúze s hexahistidinovou kotvou, která je umístěna na C-konci Jedná se o rekombinantní FerB (rFerB) [23], který byl pouţit v mé praktické části. V současnosti probíhající strukturní studie rFerB ukazují, ţe místo FAD obsahuje FMN; katalytické schopnosti ale nejsou narušeny (Sedláček a spol. nepublikované výsledky).
20
3. CÍL PRÁCE Cílem práce bylo experimentálně zjistit standardní redoxní potenciál flavinu, obsaţeném v rekombinantní ferrireduktase B pouţitím redoxní titrace v kombinaci s absorpční spektrofotometrií.
21
4. PRAKTICKÁ ČÁST 4.1.
Materiál a přístroje
4.1.1. Přístroje a pomůcky Spektrofotometr
(Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech)
pH metr
(Ultra Basic UB-10, Dennver)
ultrafiltrační zařízení Amicon
(Millipore, membrána YM-3)
ocelová kolonka
(PD-10, Pharmacia GE Healthcare)
magnetická míchačka
(P – lab)
Analytické váhy
(Pioneer)
křemenné kyvety mikropipety
4.1.2. Chemikálie Methylenová modř
Lachema
Benzylviologen
Lachema
HCl
Lachema
Tris
Duchefa
EDTA
Duchefa
Dithioničitan sodný
Lachema
Glukóza
Lachema
Xantin
Fluka
Argon
Messer Technogas
Dusík
Messer Technogas
22
4.1.3. Enzymy Enzym FerB rekombinantní katalasa
Fluka
glukóza oxidasa
Sigma Aldrich
xantinoxidasa z hovězího séra
Sigma Aldrich
4.2.
Způsob měření
4.2.1. Příprava vzorku Protein rFerB (v elučním pufru 50mM fosfát sodný, 300mM NaCl a 500mM imidazol, pH = 8,0) byl převeden na koloně PD-10 do pufru s nízkou iontovou silou, kterým byl Tris/HCl (pH 7,0). Kolona byla promyta 25 mM Tris/HCl pufru (pH 7,0). Poté byl nanesen protein, který byl následně eluován 25 mM Tris/HCl (pH 7,0). Protein byl zahuštěn na ultrafiltračním zařízení Amicon, aby absorbance flavinu v rFerB při 450 nm byla v rozsahu 0,8 – 1,0.
4.2.2. Měření redoxního potenciálu Měření bylo prováděno v křemenných kyvetách na UV/VIS spektrofotometru Ultraspec 2000. Reakční směs v objemu 0.5 ml obsahovala 0,692 mg/ml proteinu rFerB, 0,175μM methylenovou modř, 0,01 mM benzylviologen, 0,01 M glukózu, 0,5 mM EDTA, 25 μM xantin, 1300 U.ml -1 katalasy, 4,6 U.ml-1 1,075μM glukózu oxidasu. Před vlastním měřením byl z reakční směsi odstraněn kyslík argonem. Následně bylo zaznamenáno spektrum oxidované formy flavinového kofaktoru (FMN) v rFerB a indikátorové barvy (methylenová modř). Redoxní reakce byla nastartována přídavkem 1,68.10-3 U.ml-1 0,018μM xanthinoxidasy. Spektra postupně se redukujícího FMN a methylenové modři byly zaznamenávány po 5 minutových intervalech. Úplná redukce obou komponent byla zajištěna přídavkem 0,2 mM Na2S2O4 . Benzylviologen byl pouţit jako redoxní mediátor, aby se ve směsi rychleji ustavila oxidoredukční rovnováha. Glukóza, glukóza oxidasa a katalasa zde byly vyuţity k odstranění stop kyslíku. Kdyby se ve směsi nacházel kyslík, tak by O 2 přednostně přijímal elektrony díky jeho vyššímu redoxnímu potenciálu ve srovnání s indikační barvou i FMN. Navíc by xantinoxidasa katalyzovala jinou reakci. Komplex xantin/xantinoxidasa slouţil jako donor elektronů. 23
4.2.3. Výpočty Koncentrace oxidované formy byla vypočtena z Lambert-Beerova zákonu: A= ε×l×c Molární absorpční koeficient pro FMN byl při λ = 447 nm ε = 12500 l.mol -1.cm-1 a pro methylenovou modř byl při λ = 667 nm ε = 73529 l.mol -1.cm-1 . Koncentrace redukovaných forem byly vypočteny odečtením aktuálních koncentrací oxidovaných forem FMN, popř. methylenové modři v daném čase od koncentrací plně oxidovaných forem FMN, popř. methylenové modři. Pro výpočet oxidačně-redukčního potenciálu byla pouţita Nernst-Petersova rovnice pro (n = 2): E = Eo + 2,3 × (RT/nF) × log([ox]/[red])
4.3.
Výsledky Koncentrace pro plně oxidovanou formu FMN byla 8,08.10 -5 mol.l-1 a pro
methylenovou modř 8,337.10 -6 mol.l-1. Všechny vypočtené údaje jsou uvedeny v tabulkách 2 a 3. Počáteční koncentrace rFerB byla 0,692 mg/ml a methylenové modři 0,175 μM. Absorbance FMN
c oxidované formy [mol.l-1]
M. modř FMN
c redukované formy [mol.l -1]
M. modř
FMN
M. modř
1,003 0,484
8,024.10-5
6,582.10-6
5,6.10-7
1,754.10-6
0,978 0,425
7,824.10-5
5,78.10-6
2,56.10-6
2,557.10-6
0,858 0,132
6,864.10-5
1,795.10-6
1,216.10-5
6,542.10-6
0,828 0,151
6,624.10-5
2,054.10-6
1,456.10-5
6,283.10-6
0,824 0,111
6,592.10-5
1,51.10-6
1,488.10-5
6,827.10-6
0,807 0,159
6,456.10-5
2,162.10-6
1,624.10-5
6,174.10-6
0,73
5,84.10-5
1,36.10-6
2,24.10-5
6,977.10-6
0,1
Tabulka 2: Hodnoty absorbance a koncentrací oxidované a redukované formy FMN a methylenové modři.
24
log ([ox]/[red])
E (V)
FMN
M. modř
M. modř
2,156
0,574
0,028
1,485
0,354
0,021
0,752
-0,562
-0,006
0,658
-0,486
-0,003
0,646
-0,655
-0,008
0,599
-0,456
-0,002
0,416
-0,71
-0,01
Tabulka 3: Hodnoty log ([ox]/[red]) FMN a methylenové modři a aktuálního redoxního potenciálu methylenové modři v daném časovém intervalu. Údaje v tabulkách jsou uvedeny pro vlnovou délku λ = 447 nm pro FMN a λ = 667 nm pro methylenovou modř.
1,2 1
A
0,8 0,6
0,4 0,2
0 340
390
440
490
540
590
λ (nm) Obr. 8: Závislost absorbance na vlnové délce při redoxní titraci 25
640
690
740
Na grafu je nejvyšší spektrum plně oxidovaná forma FMN a methylenová modř, další spektra jsou snímána po 5 minutových intervalech. Reakční směs obsahovala 0,692 mg/ml rFerB, 0,175μM methylenovou modř, 0,01 mM benzylviologen, 0,01 M glukózu, 0,05 mM EDTA, 25 μM xantin, 1300 U.ml -1 katalasu, 4,6 U.ml-1 1,075μM glukózu oxidasu a 1,68.10-3 U.ml-1 0,018 μM xantioxidasu.
0,035
0,025
E(V)
0,015
0,005
-0,005
-0,015
0
0,5
1
1,5 log ([ox]/[red])
2
2,5
Obr. 9: Vztah mezi oxidačně redukčním potenciálem (odečteným pomocí methylenové modři) na log ([ox]/[red]) flavinu v enzymu rFerB. Rovnice přímky je E = 0,024 × log ([ox]/[red]) - 0,0203, z čehoţ vyplývá, ţe standardní redoxní potenciál FMN v proteinu rFerB je Eo = -0,0203 V. Redoxní potenciály methylenové modři a FMN se v rovnováze rovnají. Směrnice 0.024 V přibliţně odpovídá dvouelektronovému přenosu.
26
5.
DISKUZE Po provedení měření bylo zjištěno, ţe standardní redoxní potenciál FMN je E o =
-0,0203 V. V literatuře je uvedeno, ţe standardní redoxní potenciál E ○ volných flavinových nukleotidů při pH = 7 je -0,18 V, avšak závisí na bílkovině, na kterou je koenzym váţe. Standardní potenciál jednotlivých flavoproteinů je v rozmezí -0,6 aţ +0,2 V [6]. K dispozici není moc údajů pro redoxní potenciály flavinů v chinonreduktasách. Redoxní potenciál flavinu klasické diaforasy byl stanoven na -159 ± 3 mV.[24], coţ je hodnota zřetelně niţší, neţ bylo zjištěno v této práci u enzymu rFerB. Tento rozdíl můţe souviset se skutečností, ţe zatímco diaforasa katalyzuje výlučně dvouelektronové procesy [24], u rFerB byl pozorováno, ţe katalyzuje také jednoelektronové děje. Je tomu tak v případě redukce naftochinonů, jejichţ standardní redoxní potenciál je srovnatelný nebo menší neţ zde zjištěná hodnota pro flavin [25].
27
6.
SHRNUTÍ Flavoproteiny se uplatňují v mnoha biologických procesech a reakcích od
redoxní katalýzy, emise světla aţ po opravy DNA. V úvodní části práce jsou uvedeny příklady flavoenzymů, které ukazují rozmanitost katalyzovaných procesů. Kromě bílkovinné části obsahují flavoenzymy FMN nebo FAD kofaktor. Většina z nich katalyzuje oxidačně-redukční reakce. Byla provedena redoxní titrace rekombinantního enzymu NADH: chinon oxidoreduktasy (ferB) s vyuţitím redoxního indikátoru methylenové modři. Analýzou podle Nernstovy rovnice byla získána hodnota standanrdního redoxního potenciálu flavinového kofaktoru rovná -0,0203, tato hodnota byla vyšší neţ v případě savčího enzymu diaforasy.
28
7.
SUMMARY Flavoproteins can be used in a number of different biological processes and
reactions starting from redox catalysis, to light emissions and repair of DNA. In the introductory part of the thesis, examples of flavoenzymes are given, and they point towards diversity of catalyzed processes. Apart from protein parts, flavoenzymes contain FMN or FAD cofactors. Majority of these flavoenzymes catalyzes oxidationreduction reactions. Reduction titration of the recombinant enzyme NADH: quinone oxidoreductase (FerB) was conducted with use of methylene blue as redox indicator. In analysis according to Nernst equation, value of standard redox potential of flavin cofactor of 0,0203 was obtained and this value was higher than mammalian diaphorase.
29
POUŽITÁ LITERATURA 1 – Edwards, A. M. (2006) General properties of flavins, in: Silva, E., Edwards, A. M. (eds.) Flavins: photochemistry and photobiology, Rsc publishing, 1-11 s. 2 - Knobloch, E. (1986), Nové objevy ve skupině riboflavinu, pyridoxinu a vitamínu B12, in: Babjuk, J., Knobloch, E., Palát, K., Hartl, J., Opletalová, V. (eds.) Pokroky ve farmacii 6, Avicenum, 95-124 s. 3 - Joosten, V., Van Berkel, W. (2007), Flavoenzymes, Curr. Opin. Chem. Biol., 11, 195-202 s. 4 – Bornemann, S. (2002), Flavoenzymes that catalyse reactions with no net redox change, Nat. Prod. Rep., 19, 761-772 s. 5 - The Comprehensive Enzyme Information System [online], c.2010 Dostupný z WWW:
[cit. 2010-04-15] 6 – Šípal, Z., Anzebacher, P., Peč, P., Pospíšil, J., Růţička, I. (1992), Biochemie, SPN Praha, 148 – 151 s. 7
-
FAD
[online],
c.
2010,
[cit.
2010-3-23]
Dostupný
z WWW:
8 - Kodíček, M., Biochemické pojmy : výkladový slovník [online], c. 2007, [cit. 2010-0419], Dostupný z WWW: 9 - Flavin mononukleotide [online], c.2010, [cit. 2010-3-23] Dostupný z WWW: 10
-
Frébort,
I.
(2006),
Sledování
kinetiky
enzymových
reakcí
pomocí
spektrofotometrie, (návod do praktického cvičení), 1-4 s. dostupný z WWW: 11 - Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems [online], c. 2010, [cit. 2010-3-25]
Dostupný
z WWW:
12 – Joshi, M., (2007), Spectroscopic Studies on Flavoproteins, doktorská disertace, Technická univerzita Mnichov 30
13 – Nöll, G. (2008), Spectroscopic investigation of flavoproteins: Mechanistic differences between (electro)chemical and photochemical reduction and oxidation, J. Photochem. Photobiol. A, 200, 34-38 s. 14 – Ahmad, I., Vaid, F. H. M., Ahmed, S., Sheraz, M. A., Hasan, S. (2010), Advances in biochemical functions and the photochemistry of flavins and flavoproteins, Int. J. Chem. Anal. Sci., 1(2), 18-21 s. 15 – Vodráţka, Z. (2007), Biochemie, Academica, 123 s. 16 – Bankar, S. B., Bule, M. V., Singhal, R. S., Ananthanarayan, L. (2009), Glucose oxidase — An overview, Biotechnol. Adv., 27, 489-501 s. 17 - Enzyme – Glucose Oxidase [online], c. 2008, [cit. 2010-04-23], Dostupný z WWW: 18 – Leskovac, V., Trivić, S., Wohlfahrt, G., Kandrač, J., Peričin, D. (2005), Glucose oxidase from Aspergillus niger: the mechanism of action with molecular oxygen, quinones, and one-electron acceptors, Int. J. Biochem. Cell Biol., 37, 731-750 s. 19 – Racek, J., Holeček, V. (1999), Enzymy a volné radikály, Chem. Listy, 93, 774-780 s. 20 – Babior, B. M. (2004), NADPH oxidase, Cur. Opin. Immun., 16, 42-47 s. 21 – Teague, W. M., Pettit, F. H., Wu, T. L., Silberman, S. R., Reed, L. J. (1982), Purification and Properties of Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase from Bovine Heart and Kidney, Biochem., 21, 5585-5592 s. 22 – Strauss, E., Kinsland, C., Ge, Y., McLafferty, F. W., Begley, T. P. (2001), Phosphopantothenoylcysteine Synthetase from Escherichia coli, J. Biol. Chem., 17, 13513 – 13516 s. 23 – Tesařík, R., Sedláček, V., Plocková, J., Wimmerová, M., Turánek, J., Kučera, I., (2009),
Heterologous
expression
and
molecular
characterization
of
the
NAD(P)H:acceptor oxidoreductase (FerB) of Paracoccus denitrificans, Protein Expr. Purif., 68, 233-238 s. 24 – Tedeschi, G., Chen, S., Massey, V. (1995), DT-diaphorase, J. Biol. Chem., 270, 1198 – 1204 s.
31
25 – Sedláček, V., Van Spanning, R. J. M., Kučera, I. (2009), Characterization of the quinone reductase activity of the ferric reductase B protein from Paracoccus denitrificans, Arch Biochem. Biophys., 483, 29-36 s.
32
