Struktura a funkce biomakromolekul KBC/BPOL
7. Interakce DNA/RNA - protein Ivo Frébort
Interakce DNA/RNA - proteiny v buňce
Základní dogma molekulární biologie
Replikace DNA v E. coli
DNA polymerasa a replikace
Směr replikace 5' 3'
Enzym DNA polymerasa
E. coli – Pol I (928 aminokyselin, 109 kDa) monomer - funkce: opravy a spojování DNA
E. coli – Pol III (10 podjednotek) - funkce: vlastní replikace
Kruhový genom - jeden počátek replikace
DNA polymerasa u E. coli
Pol III
Pol I
DNA replikace u eukaryot
Mechanimus podobný E. coli, ale složitější
Lidská buňka: 6 mld bp, diploidní genom, 23 chromosomů
Počátky replikace: 1 na 3-300 kbp
DNA Pol a b – 4 podjednotky (replikace do 200 b), ne 3'-exonucleasa
DNA Pol g - mitochondrie
DNA Pol d – neomezená replikace, 3'exonucleasová aktivita, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), obdoba prokaryotní Pol III
DNA Pol e – vysoká účinnost replikace, neobsahuje PCNA
Replikace DNA u eukaryot
Základní dogma molekulární biologie
Transkripce u prokaryot
Transkripce u prokaryot
Jediná RNA polymerasa E.coli: RNA polymerasa (465 kDa): podjednotky 2 , 1 b, 1 b', 1 - b' se váže na DNA - b váže NTPs a interaguje s - rozpoznává sekvenci promoteru na DNA - je důležitá pro stabilitu struktury a interakci s regulačními proteiny
E. coli RNA polymerasa
Lac operon u E. coli
Negativní kontrola
Positivní kontrola
Vazba lac represoru na DNA
Catabolite Activator Protein (CAP)
Positivní kontrola lac operonu
CAP je dimer 2 x 22.5 kDa
N-konec váže cAMP; C-konec váže DNA
Vazba CAP-(cAMP)2 na DNA pomáhá vytvořit transkripční komplex
Vazba CAP a RNA Pol do oblasti lac promoteru
Vazba CAP-(cAMP)2 na DNA
Transkripce u eukaryot
RNA Pol I – transkripce rRNA genů RNA Pol II – transkripce mRNA RNA Pol III – transkripce převážně tRNA genů
Velké multimerní proteiny (500-700 kDa)
Obsahují 2 velké podjednotky podobné b a b' u E. coli RNA Pol – podobné katalytické místo
Interagují s promoterem prostřednictvím transkripčních faktorů
Transcripční faktory rozpoznávají a iniciují transkripci na specifických promoterech
Některé transkripční faktory (TFIIIA a TFIIIC) se vážou do sekvencí uvnitř kódující oblasti genu
Transkripční komplex u kvasinek
Strukturní motivy regulačních proteinů
Základním předpokladem kontaktu jsou interakce mezi residui proteinu a nukleovými bázemi na dvojšroubovici DNA
Většina kontaktů probíhá ve velkém zářezu DNA
80% regulačních proteinů lze zařadit do jedné z těchto skupin: helix-otočka-helix (HTH), zinkové prsty (Zn-finger) a leucinové zipy (bZIP)
Tyto proteiny obsahují doménu vázající se na DNA a kromě ní ještě většinou další doménu interagující s jinými proteiny
DNA – velký a malý zářez
-Helixy a DNA
Typickou vlastností proteinů interagujících s DNA je přítomnost -helikálních segmentů, které přesně zapadají do velkého zářezu ve struktuře B-formy DNA Průměr -helixu je 1.2 nm Velký zářez DNA je 1.2 nm široký a od 0.6 do 0.8 nm hluboký Proteiny jsou schopny rozpoznat specifická místa (sekvence) na DNA
Helix-otočka-helix proteiny
Jako první objeveny u prokaryot
E. coli catabolite activator protein (CAP)
Váží se jako dimery do symetrických míst na DNA
Obsahují dva -helixy oddělené b-otočkou
C-koncový helix zapadá do velkého zářezu DNA; N-koncový helix je stabilizován hydrofobní interakcí s C-koncovým helixem
Vazba Helix-Turn-Helix proteinu na DNA
Vazba CAP dimeru na DNA
Zn-Finger proteiny
Jako první objeven TFIIIA u žáby Xenopus laevis
Prokázány ve všech organismech
Třída C2H2: domény Cys-x2-Cys a His-x3-His oddělené 7-8 aminokyselinami - tvoří složené b-vlákno a -helix který zapadá do velkého zářezu DNA
Třída Cx: 2 domény, každá tvořená 4-6 Cys (ligandy Zn) a -helixem - jeden -helix rozpoznává specifické místo na DNA a druhý ho stabilizuje hydrofobní interakcí
Vazba Zn-finger proteinů na DNA
Cx
C2H2
Leucinové zipy
První objeven C/EBP z jádra buněk krysích jater
Prokázány u všech organismů
Charakteristické vlastnosti: sekvence 28-residuí s Leu v každé 7. pozici a "bazický region"
Amphiphatický - helix, dimer
Basický region rozpoznává specifickou sekvenci DNA , vytvořen párem - helixů, které obalují velký zářez na DNA
Leucinový zip – amphiphatický helix
Leucinový zip – schematická struktura dimeru
Vazba Leucinového zipu na DNA
