IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL Rozsah: 2/1 Zk/Z Vyučující: Ing. Petra Lipovová, PhD. Předmět navazuje na: Biochemie, Enzymologie Doporučená literatura: Dr. Ing. K. Bílková, Prof. Ing. B. Králová, CSc.: Izolace biomakromolekul, Vydavatelství VŠCHT, 1997
• • • • • • • • • • • • •
http://biomikro.vscht.cz/vyuka/?Predmet=ib Obsah předmětu: Úvod - zdroje enzymů, dezintegrace, membránové procesy Srážení, extrakce a centrifugace Biosenzory (2 x přednáška doc. Bílka) Základní rozdělení a instrumentace Gelová permeační chromatografie, Ionexová chromatografie Hydrofobní chromatografie a chromatografie na reversní Afinitní chromatogrefie Tenkovrstvá chromatografie, sledování průběhu chromatografie a stanovení koncentrace bílkovin Úvod do elektroforetických metod Typy elektroforetických metod Cvičení – navržení postupu přípravy rekombinantního proteinu, Cvičení – práce s programem protNLab Imobilizace enzymu a buněk
Úvod zdroje enzymů, dezintegrace, membránové procesy
Základní izolační kroky 1. výběr vhodného producenta 2. homogenizace a separace buněk 3. dezintegrace buněk 4. odstranění buněčných zbytků + koncentrování 5. purifikace
Zdroje enzymů • Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny Selekce optimálních producentů • maximální produkce enzymu • optimální vlastnosti enzymu • snadné získání producenta • snadnost purifikačního postupu • ...
Mikroorganismy Výhody:
Bakterie, kvasinky, plísně, řasy
lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru ...) selekce mutantů s požadovanými vlastnostmi thermofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou), psychrofilní organismy genetické inženýrství
Živočišné zdroje • Laboratorní zvířata – • Jateční zvířata – • Člověk –
myši, krysy, králíci
orgány, krev
tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin ; moč urokinasa ...)
• Bezobratlí -
hmyz, plži, mlži
Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách, Arabidopsis thaliana, tabák Nevýhoda: problematický růst za definovaných podmínek
Kde získat informace o možných zdrojích?
•ATCC (American Type Culture Collection) http://www.lgcpromochem-atcc.com/ •CCM (Czech Collection of Microorganisms) www.sci.muni.cz/ccm/ •FDA (Food and Drug Administration) (2001), Partial list of microorganisms and microbial-derived ingredients that are used in foods. www.cfsan.fda.gov/~dms/opa-micr.html •AMFEP (The Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products) www.amfep.org
Vaším úkolem je isolovat ureasu z Helicobacter pylori Ureasa (EC 3.5.1.5) (NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3
Helicobacter Pylori Urease drawn from PDB 1E9Z
http://www.madrimasd.org/blogs/microbiologia/wpcontent/blogs.dir/110/files/1431/o_helicobacter.jpg
ATCC (American Type Culture Collection) http://www.lgcpromochem-atcc.com/
Semínka Arabidopsis thaliana Plant Seed ATCC® Number:
75043™
Organism:
Arabidopsis thaliana Heinhold
Designation s:
S8-1-2A
Depositors:
D Dennis, Y Poirier, CR Somerville
Biosafety Le vel:
1
Permits/For ms:
In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location
Price:
Shipp ed:
£190.00; €285.00
dried, package of 25 seeds each order
Lidská hexokinasa
brain/CNS neuroblastoma cell line lung, small cell carcinoma leukocyte
Optimalizace kultivace •Teplota •Složení media •Aktivátor •Aerace
Optimalizace kultivace
Homogenizace a solubilizace materiálu Mechanicky: mletí (kulový mlýnek, masový strojek), mixování (výkonný mixer), krájení, třecí miska s pískem
Separace buněk • odstřeďování (6000 g, 10 min, 4°C) • filtrace
Distribuce enzymů • Intracelulární • V periplasmatickém prostoru • Extracelulární extracelulární
cytoplasma periplasma
BUŇKA
• Membránově vázané bílkoviny Membránové bílkoviny
interagující
elektrostaticky
hydrofobně
integrální
zanořené
transmembránové
Rostlinné a živočišné buňky Rostlinné buňky •rostlinné buňky mohou být větší •rostlinné buňky mají silnější a robusnější buněčnou stěnu tvořenou hlavně celulosou •rostlinné buňky se obtížně rozbíjejí •kultivované rostlinné buňky jsou méně robustní než buňky isolované z živých rostlin
Živočišné buňky •nemají buněčnou stěnu •jsou velmi křehké •kultivované živočišné buňky jsou velké několik mikronů •sférické nebo elipsoidní
Mikroorganismy Bakterie G-
G+
Kvasinky
Dezintegrace buněk
Způsoby
• fyzikální • chemické • enzymové
Fyzikální způsoby dezintegrace • Třecí miska + balotina, křemenný písek ... • Střídavé zmrazování a rozmrazování • X-press (protlačování zmražené zarážky suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)
píst
štěrbina
X-press
• Douncerův homogenizátor
• Mini-BeatBeater – pomocí balotin – různé rozměry
•French press - protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem (136 MPa)
•Ultrazvuk - intezita - nad 50 W/cm2 – kavitace G- bakterie k3
Snímek 27 k3
UZ - působením uz vln na kapaliny vzniká jev KAVITACE. V kapalině se tvoří oblasti stlačení a zředění. V místech zředění vznikají dutiny určitých velikostí, které v oblasti stlačení opět zaniknou. Zánik dutin je pak doprovázen tlakovou vlno, která se považuje za destrukční prvek využívaný u této metody. Kavitace je množina jevů spojená se vznikem, výskytem a působením dutin ( bublin ) v kapalině. Jestliže má ultrazvukové vlnění dostetečnou intezitu - nad 50 W/cm2 dochází ke vzniku kavitace, to jest ke vzniku a zániku množství malých bublinek v kapalině s frekvencí ultrazvukového vlnění. Tvorba a zánik těchto bublinek, způsobené rázy ultrazvukových vln jsou vlastní příčinou dějů v mnohých známých procesech jako je např. čištění povchů, dispergace, eroze povrchů a pod. V nejbližším okolí těchto bublinek dochází k pozoruhodnému uvolnění energie, lokální růst teploty spojený s tímto dejem se odhaduje až na 3000°C a tlaky v oblastech stovek MPa v nanosekundových časových úsecích. Kavitace je vlastně studeným varem v kapalině. Průvodním dějem akustických kavitačních dějů je sonoluminiscence. V důsledku kavitace dochází také ke kavitačnímu narušení konců vlnovodů a tím k jejich opotřebení a k postupnému snižování přeneseného výkonu. Dále je pro srovnání uvedeno kavitační narušení konce sonifikátoru z duralu a titanu a snímek tohoto narušení z elektronového scanovacího mikroskopu karasovp; 19.7.2005
Chemické způsoby dezintegrace • • • •
acetonová sušina -homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu osmotická lyse (erythrocyty)-suspenze v hypotonickém prostředí změna tlaku plynu přídavek org. rozpouštědla - toluen, diethyleter, chloroform - (toluen
extrahuje při 35 – 40 oC fosfolipidy buněčné stěny → osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)
Wikipedia
•přídavek kyseliny či zásady •přídavkem detergentů
CMC – kritická micelární koncentrace C – koncentrace detergentu
detergenty •neionogení •ionogení
•aniogenní
•katiogenní
•These images show a Streptococcus pyogenes cell experiencing lysis after exposure to the enzyme PlyC. (Credit: Daniel Nelson/UMD)
•amfoterní •Y-PER Reagent significantly disrupts yeast cell wall and plasma membrane. Cells of Saccharomyces cerevisiae stain DY150 after lysis with Y-PER Yeast Protein Extraction Reagent. Arrows indicate disruption of cell wall, resulting in cell lysis.
Detergent
CMC mM
MMW Da
koncentrace
Odstranění dialýzou
aplikace
SDS(dodecylsulfát sodný)
8,3
288,4
> 10 mg/mg prot.
denaturace proteinů, použití pro DNA, PAGE
DOC(deoxycholát sodný)
1-4
416,6
0,1-10 mg membr. lipidů
solubilizace membránových proteinů
N-lauroylsarkosin
7
488
0,1 -1,5 %
solubilizace membr. prot., příprava antigenů
4-5
337
0,1 – 1 %
???
rozpouští membrány, tvoří komplex s DNA, odstranění polysacharidů
0,2
647 n=10
1 – 5 mM
solubilizace proteinů
> 10 mg/mg membr. lipid;
imunobloty, ELISA
6,5-13 mM
solubilizace membránových proteinů
ANIOGENNÍ
KATIOGENNÍ CTAB (hexadecyltrimethyl amonium bromide)
NEIONOGENNÍ Triton X-100 [octylphenolpoly(ethylenglycoleth er)n]
Tween 20 [poly(oxyethylene)n
0,06
sorbitan-monolaurate]
AMFOTERNÍ CHAPS (3-[(3cholamidopropyl)dimethylammon io]-1-propanesulfonate)
4
614,9
Extrakce membránových proteinů • • • • • • •
sonikace chelátová činidla alkalické podmínky (pH 8 – 11) plus nízká iontová síla neionogenní detergenty (Triton X-114) částečně vodoumísitelná organická rozpouštědla (n-butanol) vysoká iontová síla (1M NaCl) fosfolipasy
Phase separation of chromaffin-granule membrane proteins Proteins from the Triton X-1 14 phase-separation procedure were analysed under reducing conditions on an 8-15% -polyacrylamide gel. Track 1, standard proteins. Track 2, complete chromaffin-granule membranes. Track 3, phospholipid-rich phase. Track 4, detergent-rich phase. Track 5, aqueous phase.
Odstranění detergentů vliv: •fyzikální vlastnosti detergentu •charakter proteinu (hydrofobní/hydrofilní) •složení pufru ionogenní
neionogenní
močovina, ionex gelová chromatografie Sephadex G-25 naředění vzorku → dialýza gelová chromatografie Sephadex G-200 afinitní chromatografie
Enzymové způsoby dezintegrace Bakterie • Lysozym
– nejčastěji z vaječných bílků, T4 fága
hydrolysa 1,4-β-glykosidické vazby mezi NAG a NAM u G- v kombinaci s chelatačním činidlem např. EDTA nebo polykationty, Tris pH 6,7-8,6 (4-10)
Kvasinky •zymolyasa, lytikasa – β-1,3-glukanasová aktivita
Rostlinné buňky •cellulasa, pektinasa
Jak vybrat správný postup dezintegrace? • • • • • • •
typ organismu předpokládaná stabilita proteinu lokalizace proteinu dostupné vybavení cena čas objem vzorku
sledování úspěšnosti dezintegrace
Inhibitory proteas
Inkluzní tělíska
Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), 524-530, 2000
Dva modely tvorby inkluzních tělísek
Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), 524-530, 2000
•inkluzní tělíska •(agregovaný protein) •Solubilizace
•Solubilizované, ale špatně sbalené proteiny
•změna prostědí
•Misfolded
•Refolded & native
•Re-aggregated
Izolace inklusních tělísek •resuspendace buněčné pelety v pufru s inhibitorem proteas, DTT (5mM) a lysozymem •přidat detergent (Triton X-100, DOC) + sonikace •přidat DNasu I •centrifugace 30 000 x g 30 min 4°C •opláchnout peletu pufrem s detergentem •rozpustit peletu (inkluzní tělíska) v pufru s 6M guanidin-HCl a 25 mM DTT •centrifugace 100 000 x g 10 min – důležitý krok •změřit koncentraci proteinů v supernatant
Stabilizace proteinů
•soli – stabilizují proteiny v roztoku Hofmeisterova řada (CH3)4N+ > NH4+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+ SO42- > Cl- > Br- > NO3- > ClO4- > SCN•proteiny – např.BSA •redukční činidla – β-merkaptoethanol (5-20 mM), DTT (0,5-1 mM) •osmolyty – polyalkoholy, mono- a polysacharidy, neutrální polymery 10 – 40 % aminokyseliny – nenabité (Gly, Ala) 20-500 mM polymery (PEG) 1-15 % zvyšuje viskozitu a tak zabraňuje agregaci
Membránové procesy - filtrace •rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti, definovaná velikost pórů = „cut off“ (µm, Da), gravitace, inertní plyn retentát
permeát
mikroporesní
anizotropní
Produkt
použití
polyvinylidenfluorid PVDF
nízká vazba proteinů
polyethersulfon PES
rychlý průtok a nízká vazba proteinů
estery cellulosy MCE
filtrace pufrů a částic
polykarbonáty
hladký povrch
nylon a síťovina
široká chemická kompatibilita, rozsahu 3 - 10 pH
skleněná a křemenná vlákna
hrubá filtrace, roztoky s vysokým počtem částic
teflon
hydrofobní,org.rozpouštědla, chemicky agresivní roztoky
PVDF 0,1 - 5 µm
estery cellulosy 0,025 - 8 µm
skleněná a křemenná vlákna 0,7 – 3 µm
nylon 0,22 - 180 µm
charakteristika membrán •dělící rozsah – NMWL, MWCO, NCO •průtočnost membrány •rozsah povolených pracovních teplot, tlaků a pH •odolnost membrán •životnost Membrane: Durapore Membrane Filters - PVDF (Polyvinylidene fluoride) Features: Low Protein Binding Specifications: Pore sizes:
0.1, 0.22, 0.45, 0.65, 5 µm
Color:
White
Surface:
Plain
Wettability:
Hydrophilic, hydrophobic
Thickness:
125 µm
Sterilization:
by autoclave (121°C at 1 bar), EO or gamma
Operating temperature:
85°C max.
Gravimetric extractables:
<0.5%
Protein binding capacity:
4 µg/cm²
Mikrofiltrace •separace koloidních a nerozpustných částic ( bakterie, barevné pigmenty, kvasinky) •0,05-10 µm •hnací silou - rozdíl tlaku •potřebný tlak - nízký
Ultrafiltrace •separace např. bílkovin, virů •frakcionace bílkovin •velikost pórů přibližně 3 nm do 0,1 µm •hnací sílou – rozdíl tlaků •tlak > 10 bar (145 psi, 1 MPa) N2
pojistný ventil míchadlo
membrána
retentát
permeát
Nanofiltrace •separace nízkomolekulárních látek •velikost pórů přibližně 1 nm do 10 nm ∼ 200 – 15000 g/mol •hnací sílou – rozdíl tlaků
Použití •odsolování potravin •odsolování syrovátky •zakoncentrovávání
Reverzní osmóza •separace nízkomolekulárních látek menší než 200 g/mol •hnací sílou – rozdíl tlaků
Mikrofiltrace
Ultrafiltrace
Nanofiltrace
Reverzní osmóza
zygota - Cryptosporidium
Jaký osmotický tlak vykazuje jednomolární roztok sacharosy při 25°C? (R=8,314 J·K-1·mol-1)
π = RT ∑ ci π = cRT= 1 . 8,314 . 298,15 = 2478,8 ??? kPa J / dm3 = N.m /dm3 = 103 N/m2 = Pa
* Roztok obsahující 0,5 g ribonukleasy v 0,1 dm3 0,2 M NaCl má při 298 K osmotický tlak 0,0097 atmosfér. Membrána je propustná pro všechny částice kromě bílkoviny; osmoticky tlak byl měřen proti 0,2 M NaCI Určete molární hmotnost ribonukleasy (R = 0,082 dm3. atm . mol-1. K-1).
π = RT ∑ ci
Dialýza - difuze nízkomolekulárních látek polopropustnou membránou
dialysa 100 ml 5 M NaCl proti 1 litru
Princip hemodialysy
•http://www.inmed.cz/index.php?page=princip_dialyzy
Elektrodialysa
vzorek
anionaktivní iontově selektivní membrána
kationaktivní iontově selektivní membrána
• • • • •
odsolování syrovátky odsolování mořské vody odstraňování nitrátů z pitné vody odstraňování kyselin z organických produktů odstranění kyselosti džusu
další způsoby odsolování a zahušťování:
•gelová chromatodrafie - Sephadex G-25, BioGel P-30 •vakuové odpařování •použití polyethylenglykolu •lyofilizace •precipitace •chromatografie na reversní fázi (C4) •ionexová chromatografie
