NMR biomakromolekul RCSB PDB. Progr. NMR

NMR biomakromolekul Typy biomakromolekul a možnosti studia pomocí NMR ●

●

●

●

proteiny a peptidy – rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul nukleové kyseliny (RNA, DNA) a oligonukleotidy – omezení malou rozmanitostí chemického složení polysacharidy a oligosacharidy – omezení malou rozmanitostí chemického složení

RCSB PDB

kombinace výše uvedených

RCSB PDB Progr. NMR

NMR Proteinů • • • • • • • • • •

Polymery α-aminokyselin, mnoho funkcí v organismu Katalytická - enzymy Strukturní a pohybové Signální Zásobní a transportní Obranné Pomocí NMR spektroskopie studujeme: Prostorové uspořádání Interakce s jinou molekulou Dynamika proteinu

Stavba a struktura proteinů

Ala

Leu

Asp

Lys

Asn

Met

Arg

Phe

Cys

Pro

Glu

Ser

Gln

Gly

Thr

Trp

His

Ile

Tyr

Vznik peptidové vazby: + Ala1

+ Ala2

Ala1–Ala2

H2O

Val

Struktura proteinů U proteinů rozlišujeme čtyři pojmy: primární, sekundární, terciární a kvartérní struktura. ●

Primární struktura udává pořadí aminokyselin v řetězci (sekvence). Píšeme vždy ve směru od N k C konci.

●

Sekundární struktura udává konformaci hlavního řetězce v určitém úseku. Nejčastějšími prvky pravidelné sekundární struktury jsou helikální a extendovaná struktura, které jsou stabilizovány sítí vodíkových vazeb.

helikální struktura (α-helix)

extendovaná struktura (β-sheet)

náhodné klubko (random coil)

●

Terciární struktura je prostorové uspořádání všech atomů proteinu.

●

Kvartérní struktura popisuje strukturu nadmolekulového uspořádání více proteinů.

Zdroje Proteinů • • • • • • • • • • • •

Původní organismus + přirozená forma včetně všech modifikací - malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy, složitá izolace,…. Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris) + levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení - možné problémy s modifikacemi postranních řetězců Chemická syntéza + velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny - drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se správným sbalením proteinu In-vitro translace + vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení - drahé, posttranslační modifikace

Využívaná jádra v biomakromolekulách 1H

+ vysoké přirozené zastoupení + vysoká citlivost (1,00) − malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm)

13C

+ velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm) − nízké přirozené zastoupení (1,11 %) − nízká citlivost (1,76.10−4); po 100% isotopovém obohacení 1,59.10−2

15N

• střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm) − nízké přirozené zastoupení (0,37 %) − nízká citlivost (3,85.10−6); po 100% isotopovém obohacení 1,04.10−3

2H

• speciální účely

Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR ●

měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností prostředí

●

sledování průběhu biochemických dějů

●

vysoce selektivní odezva na úrovni atomů

Čím jsme omezeni: ●

velikost molekuly (ovlivnění T2) – do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA] □

lze řešit přímo kombinací COSY, TOCSY a NOESY experimentů

– do 20 kDa [< 180 AA] □

nutné 100% isotopové obohacení

13C

a

15N

– do ~100 kDa □

100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)

– větší proteiny □

●

přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura

koncentrace vzorku – alespoň 0,2 mM

●

dlouhodobá stabilita vzorku – několik týdnů

Vzorek proteinu pro NMR měření ●

nutno dosáhnout koncentrace proteinu alespoň 0,2– 0,5 mmol l−1 (obecně více = lépe) – používá se filtrace přes membrány s mikropóry (protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné rozpuštění

●

úprava pH pufrem (pH typicky 4–8) – vyšší pH by způsobilo rychlou výměnu amidických vodíků s molekulami vody a ztrátu signálů

●

přidání redukčních činidel (R–SH) – zabránění oxidace cysteinů a následného vysrážení vzorku

●

přidání 5–10 % D2O – referenční jádro pro spektrometr (lock)

roztok vzorku 250–300 µl

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku

✓

obecné informace o molekule (primární struktura, S–S vazby,...)

naměření NMR spekter

výpočet souboru počátečních struktur

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury

vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

1. publikované NMR spektrum proteinu ●

spektrum proteinu RNasy A, měřeno 40 MHz spektrometrem, 1957

Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G. (1957) J. Am. Chem. Soc. 79, 3289.

●

40 MHz CW spektrometr

První 1GHz NMR spektrometr ●

1

instalován firmou Bruker v Centre de RMN à Très Hauts Champs, Lyon, France

H NMR spektrum proteinu měřené tímto spektrometrem

Nutný krok – potlačení signálu vody ●

jako rozpouštědlo se používá H2O, ne D2O z těchto důvodů: – jde o fysiologické prostředí – při použití D2O by došlo k výměně amidických vodíků za deuterium

●

●

tím pádem je nutné potlačit dominantní signál H2O, protože její signál je 104– 105krát intensivnější než signály měřené látky spektrum proteinu bez potlačení H2O:

Potlačení signálu H2O – metoda presaturace π/2 selektivní CW-ozařování H2O během relaxační periody

1H

Δ

NMR spektrum proteinu po presaturaci vody

zbytkový signál H2O

Potlačení signálu H2O – metoda WATERGATE ●

spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole (π/2)

πy

x

1

(π/2)-y Δ

sel.

(π/2)-y sel.

Δ

H Gz 1

H NMR spektrum proteinu po WATERGATE

zbytkový signál H2O

excitační profil selektivního π/2 pulsu

Jednodimensionální 1H NMR spektrum proteinu charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1H signálů aminokyselin – kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kDa)

CH3

H aromatické HN peptidické HN postranní

O

H N

C R1 AA1

C H

R2

H N H

C

C O

AA2

H N

O

●

C R3 AA3

C

H alifatické Hα

●

●

H ●

1H

spinové systémy (3J) jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami 1D 1H spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1H, 13C a 15N

Vícedimensionální NMR experimenty ●

rozlišení informací obsažených v 1D spektrech – korelace chemických posunů 1H – 13C – 15N – propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin – pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít isotopové obohacení

http://www.protein-nmr.org.uk

1H-15N ●

HSQC – „otisk palce“ proteinu

ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, … sbalený protein

rozložený protein

(ppm)

15N (ppm)

15N (ppm)

1H

1H

(ppm)

1H-15N ●

HSQC – „otisk palce“ proteinu

Sledování skládání proteinu – intrinsically disordered proteins Samotný peptid

Peptid po 2 dnech po přídavku interakčního partnera

N (ppm)

15

1H

(ppm)

1H

(ppm)

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku

✓

obecné informace o molekule (primární struktura, S–S vazby,...)

naměření NMR spekter

✓

výpočet souboru počátečních struktur

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury

vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

Interpretace NMR spekter – přiřazení resonancí přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule

●

postup: 1.přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO) 2.přiřazení postranních řetězců (především 1H a

HN

O

●

N

CO

13

C)

Cα α Cβ H

Hβ označení jednotlivých atomů v aminokyselině ●

Páteř proteinu

postranní řetězce

●

je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu

Přiřazení resonancí – atomy hlavního řetězce ●

pro přiřazení 1H, 13C a 15N se používá soubor komplementárních třídimensionálních korelačních experimentů – přenos magnetizace pomocí skalárních inerakcí (1J, 2J) základní experimenty (je mnoho dalších kombinací):

C

H

H C

N

C

N H

H

C O

H C

O C

H C

C H

N

H N H

CBCANH

C H

H N H

C

C O

HN(CO)CA

HNCA H

C

C

C H C

C O

H N

C

H C

C H

C

C H

O

O

N

H

H

H

O

●

H N H

C H C

CBCA(CO)NH

modrá: jádra excitovaná i detekovaná zelená: jádra detekovaná vývojem magnetizace (chemického posunu) červená: jádra použitá pro přenos magnetizace, bez vývoje magnetizace

C O

Přiřazení resonancí – experimenty HNCA a HN(CO)CA 13Cγ 1H

O

15N

55 13C' 15 13Cα 1H

13Cβ

i−1

13Cγ

13Cβ

140 13Cα

15N

7

1H

35

90

11 <1

1H

55 13C'

O

HNCA – po excitaci HiN je magnetizace přenesena na Ni (1JHN,N) a dále současně na Ciα (1JN,Cα) a Cαi−1 (2JN,Cα) – vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα – každá H–N skupina dává dva signály o frekvencích {ω(HiN), ω(Ni), ω(Ciα)} a {ω(HiN), ω(Ni), ω(Cαi−1)}

i 13Cγ

HN(CO)CA – po excitaci HiN je magnetizace je přenesena na Ni (1JHN,N), dále na Ci−1 (1JN,C) a na Ci−1α (1JC,Cα) – vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα – každá H – N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω(HiN), ω(Ni), ω(Cαi−1)}

1H

13Cβ

O

1H

35 55 13C' 15

15N

13Cα 1H

13Cβ

i−1

13Cγ

13Cα

15N

7 90

11

140 55 13C'

<1 1H

O

i interakční konstanty J v Hz

Sekvenční propojení hlavního řetězce – HNCA a HN(CO)CA ●

2D řezy spektry HNCA a HN(CO)CA v rovině H–C na frekvencích jednotlivých amidických N HN(CO)CA

HNCA

HN(CO)CA

C N H

někdy chybí pík…

HNCA

HN(CO)CA

HNCA

HN(CO)CA

HNCA

Přiřazení signálů postranních řetězců ●

různé implementace experimentů TOCSY a COSY HC(CCO)NH-TOCSY

H(C)CH-COSY

H H

O

N

C' Cα

H

H H Cγ

Cβ

H

C' O

Cβ H

H

Cα N

H

Cγ

H

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku

✓

obecné informace o molekule (primární struktura, S–S vazby,...)

naměření NMR spekter

✓

výpočet souboru počátečních struktur

✓

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury

vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

Interpretace NMR spekter – přiřazení strukturních parametrů NOE ≡ meziatomová vzdálenost skalární interakční konstanta ≡ dihedrální úhel chemický posun ≡ chemické okolí residuální dipolární interakce ≡ vzájemná orientace vazeb vodíkové vazby ≡ detailní lokální struktura

Nukleární Overhauserův efekt (NOE) ●

přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace

●

rychlostní konstanta křížové relaxace mezi dvěma jádry 1H, σIS:

γH τc ω

rIS

... ... ... ...

gyromagnetická konstanta 1H korelační čas molekuly Larmorova frekvence vzdálenost interagujících jader

NOE je hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule. ●Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů. ●Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity. ●Např. (1,8–2,5) Å; (1,8–3,5) Å; (1,8–5) Å. ●

dosah interakce do 5–6 Å

H H

X-editované NOESY experimenty ●

excitace pouze 1H atomů vázaných na atomy 15N nebo 13C, přenos magnetizace vlivem NOE na blízké atomy 1H, detekce

1

H

řez 3D spektrem v rovině 1HN–1H na pozici 122 ppm v 15N doméně = signál Tyr66

1

H

N

Skalární interakce – zjištění dihedrálních úhlů ●

peptidová vazba tvoří rovinu definovanou atomy O–Cα–N–HN

●

vzájemná orientace dvou sousedních peptidových vazeb, a tedy i konformace páteře proteinu je určena dihedrálními úhly φaψ – φ (C–N–Cα–C) a ψ (N–Cα–C–N)

Karplusova rovnice

●

– závislost velikosti interakce 3J na dihedrálním úhlu (θ) – konstanty A a B zjištěny pro různé kombinace interagujících jader problém: jedné hodnotě 3J mohou odpovídat až čtyři hodnoty dihedrálního úhlu

●

3

J

H–N–Cα–H

10 8

N

H–N–Cα–CO

H–N–Cα–Cβ

6

C '

4

C

2

N

C '

0 [Hz]

-120 0 CO–N–Cα–H

60

120

θ [deg]

Chemický posun ●

chemický posun některých jader je charakteristicky závislý na sekundární struktuře

chemický posun

α-helix

přiřazení resonancí hlavního řetězce (Hα, Cα a C') výpočet indexů chemického posunu (CSI)

odhad sekundární struktury podle lokální hustoty CSI

δ(Hα)

klesá

roste

náhodné klubko

β-sheet

Histogram indexu chemického posunu jader Hα, Cα a C' −1 0 +1 sekvence proteinu C

N

helix I

helix II

helix III

helix IV

Residuální dipolární interakce (RDC) ●

přímá dipól–dipólová interakce dvou jader – v isotropním roztoku nedetekovatelná – pozorovatelná v neisotropním prostředí u molekul částečně orientovaných vůči magnetickému poli

●

tvorba neisotropního prostředí – kapalné krystaly [fosfolipidy, PEG, proteiny (virové částice, bakteriorhodopsin)], zmáčknutý polyakrylamidový gel – samotné vnější magnetické pole

●

●

příspěvek ke skalární interakci ⇒ snadná měřitelnost velikost interakce DIS závisí na orientaci vazby vůči směru B0

Θ

S I

rIS

Θ...úhel mezi vektorem I–S a B0

fosfolipidové bicely orientované v magnetickém poli

Vodíkové vazby ●

identifikace: – výměnné experimenty H ↔ D – teplotní závislosti chemických posunů

●

●

charakterizace: – měření skalární interakce (J) přes H-vazbu

stabilizace pravidelných sekundárních struktur vodíkovými vazbami

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku

✓

obecné informace o molekule (primární struktura, S–S vazby,...)

naměření NMR spekter

✓

výpočet souboru počátečních struktur

✓

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury

✓

vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

Přiřazení resonancí a) páteř b) postranní řetězce

Strukturní omezení z NMR parametrů vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a interresiduální) ✔

dihedrální úhly ze skalárních interakčních konstant ✔

relativní orientace vazeb z dipolárních kaplingů ✔

případně další omezení

✔

Identifikace prvků sekundární struktury

Výpočet trojrozměrné struktury molekulová mechanika + simulované žíhání

Výpočet struktury proteinu ●

●

Přímý výpočet energie všech možných konformací proteinu je příliš výpočetně náročný molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice) energetická plocha v závislosti na dvou dihedrálních úhlech v disacharidu

V případě proteinu se jedná o plochu závislou na n proměnných (n je počet optimalizovaných souřadnic/úhlů).

Molekulová dynamika –použití všech dostupných experimentálních omezení, minimalizace celkové energie systému –simulované žíhání: molekula se ohřeje na vysokou teplotu (103 K) a nechá se postupně chladnout. Po každém ochlazení se vypočítá nová energie systému. Cílem je překonat lokální energetická minima a najít (nejlépe) to globální. –přidáme nové energetické členy pro experimentální omezení: čím bližší bude shoda vypočítané struktury s experimentálními údaji, tím nižší bude celková energie

Vypočítané struktury

●

obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi – Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur, které by se ovšem měly lišit jen nepatrně. – Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu.

●

struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru

soubor struktur RMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti)

vybraná reprezentativní struktura

Interakce proteinu s ligandem • • • •

Protein-protein, protein-NK, protein-malá molekula, oligomerace Interaguje specificky? Kde interaguje? Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci)

• •

Farmaceutický průmysl Proteomické studie

• • • • • • •

Metody pro měření interakce pomocí NMR Sledování změn chemických posunů Intermolekulární NOE Transferred NOESY Mapování H-D chemické výměny NH skupin Mapování pomocí paramagnetické látky Sledování změny dynamiky proteinu

Změny chemických posunů • • • •

Titrace proteinu ligandem Sledování změn chemických posunů skupin (nejčastěji HN) Interakční povrch Disociační konstanta

STD – Saturation transfer difference • • • • •

Interakce protein-malá molekula Ozáření proteinu a přenos magnetizace na ligand během interakce Přebytek ligandu Zjistíme, která část ligandu interaguje Odhad KD

STD-NMR princip

ligand

koff kon

ligand

protein

1H

NMR (off-resonance)

© Lukáš Vrzal

Excitace on-resonance

ligand protein

koff kon

ligand

Přenos magnetizace

ligand protein

koff kon

ligand

Přenos magnetizace

ligand protein

koff kon

ligand

Relaxace signálů proteinu

koff kon

ligand

protein

1H

NMR (off-resonance)

on-resonance

on-resonance

off-resonance

STD-NMR (diferenční spektrum)

93% 100% 91% 73%

1H

NMR

STD-NMR (difference spectrum)

STD – Saturation transfer difference

Intermolekulární NOE • NOE efekt mezi dvěma molekulami • U složitějších systémů vhodné odfiltrovat intermolekulární NOE • Rozdílné izotopové značení • 13C filtrované 13C editované NOESY

Studium dynamického chování molekul ●

molekuly nejsou statické, pohybují se v různých časových škálách – různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují

●

funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě – regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace

●

vypočítaná struktura je někdy průměrem více konformerů – možnost charakterizace časové škály pohybů – různé relaxační mechanismy postihují různé časové škály molekulárních pohybů lokální pohyby globální pohyby

příklady jevů

pohyb N–H rotace CH3

ps

pohyb smyček

ns

relaxace R1, R2, het. NOE

metody studia

pohyb domén

μs

transport, katalýza, další biologické děje...

ms

s

relaxace R1ρ, CPMG analýza tvaru signálu saturation transfer, NOESY výměna H/D

>s

Analýza směsí, kvantitativní NMR spektroskopie a využití NMR spektroskopie ve forenzní analýze

Analýza směsí a kvantitativní NMR ●

●

●

NMR spektrum čisté látky je lineární kombinací spekter jejích jednotlivých atomových skupin – navíc pozorujeme vzájemné interakce atomů/skupin NMR spektrum směsi látek je lineární kombinací spekter jednotlivých látek integrální intenzity NMR signálů ve spektru jsou přímo úměrné zastoupení jednotlivých měřených entit – u čisté látky integrály odpovídají počtu ekvivalentních jader ve skupině – u směsi integrály odpovídají molárnímu zastoupení složek

• Absolutní plocha píku v NMR spektroskopii je závislá na mnoha faktorech, není tedy možné měřit koncentraci absolutně

Požadavky na měření spekter pro kvantitativní NMR (qNMR) 90y

integrální intenzita NMR signálu, S k c B90 T ●

●

●

●

●

●

konstanta přístroje koncentrace vzorku (měřených jader) délka π/2-pulsu teplota

úplná relaxace všech spinů před začátkem měření (čekací perioda d1 = 5–10x T1)

90y

stejnoměrná excitace celého spektra (dostatečně tvrdé pulsy, dobrá kalibrace π/2-pulsů)

13C

zamezení změn intenzit signálů vlivem interakcí (DD-interakce–NOE, J-interakce); dekapling může být použit jen po dobu akvizice, jinak vypnutý

1H

dostatečný počet naměřených bodů (u starších přístrojů) dostatečný poměr signál/šum konstantní objem vzorku (nejlépe využití celé délky excitační a měřící cívky)

akvizice

d1

d1 ozařování

akvizice

dekapling

počet bodů

Zpracování a vyhodnocení spekter ●

●

pečlivé zpracování spekter (korekce fáze), výběr integrovaných signálů a integračních mezí – hlavní slabina kvantitativní NMR (lidský faktor), lze zlepšit praxí – pokud možno, volit dostatečně široké integrační meze

překryv signálů – dekonvoluce – integrace celé skupiny signálů

Zpracování a vyhodnocení spekter ●

●

při porovnávání integrálních intenzit je nutné uvažovat počty jader přispívajících k signálu koncentrační standardy – bez přidaného standardu o poměr intenzit signálů dvou látek měřených ve směsi odpovídá poměru jejich koncentrací o zjištění relativního zastoupení složek – vnější standard o zatavená kapilára s referenční látkou – vnitřní standard o referenční látka je rozpuštěna spolu se vzorkem

●

lze dosáhnout přesnosti stanovení přibližně 1 % (v oblasti 5–20 mM)

Analýza směsí na základě rozdílné pohyblivosti složek ●

Velké překryvy spekter měřených látek, přímé měření difuzního koeficientu

●

molekuly v roztoku vykonávají rotační a translační pohyb

●

translační pohyb (volná difuse) charakterizován difusním koeficientem, D – Stokesova-Einsteinova rovnice

k T η RH

Boltzmannova konstanta termodynamická teplota visozita rozpouštědla hydrodynamický poloměr molekuly – platí pro kulové částice (molekuly), lze ale využít pro odhad velikosti částic obecně – nepřímá úměra mezi velikostí (hmotností) molekuly a jejím difusním koeficientem ●

●

vliv velikosti difusního koeficientu (= velikosti) molekuly na intenzitu jejího NMR signálu lze sledovat po aplikaci gradientů magnetického pole – metoda spinového echa s pulsními gradienty magnetického pole (PGSE, pulse gradient spin echo) aplikace – rozlišení molekul ve směsi – oligomerizace molekul (proteiny) – výpočet translačního difusního koeficientu

Spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole, PGSE kódování molekul podle pozice v ose z

excitace

90

τ

y

vývoj, volná difuse

180 y

dekódování

akvizice

τ

1

H

δ

Δ

δ

g z

intenzita signálů:

D 3

D 2

D

z

1 D3 > D1 > D2

B = B0+ g zz koherentní magnetizace všech spinů

ztráta koherence vlivem gradientu magnetického pole v ose z

úbytek (kódované) magnetizace v jednotlivých zvrstvách vlivem difuse

obnovení koherence aplikací stejného gradientu po spinovém echu

měření série spekter za různých intenzit

gz

Analýza naměřených spekter – metoda DOSY ●

Diffusion Ordered SpectroscopY, DOSY – série PGSE spekter změřených s měnící se intenzitou gradientu gz – pro každý bod spektra se vypočítá difusní koeficient a bod se zobrazí v pseudo-2D spektru na příslušné pozici D

g z

4. 7

1. 3

10 −4

10 −5

10 −7

8

6

4 1H (ppm)

2

0

10 −8

D

−6

(cm2 s−1)

10

Inverzní laplaceova transformace

© Carlos Cobas, http://nmr-analysis.blogspot.com

7. (ppm) 9 1H

DOSY – náhradní sladidlo Canderel

M-A.Delsuc (2008) 23rd NMR Valtice

Překryv signálů vede k jejich špatnému rozlišení podle difusního koeficientu. K rozlišení je nutné pokročilejší zpracování.

LC-NMR

●

propojení kapalinové chromatografie (HPLC, GPC) a NMR spektroskopie – Vzorek směsi je nanesen na LC, kde je rozdělen na vhodné stacionární fázi. Jednotlivé frakce jsou pak kapilárou vedeny z výstupu LC přímo do měřící sondy NMR spektrometru. – speciální průtočná měřící sonda s malým aktivním objemem (60 μl), detekce μg množství látek – Je nutné potlačit signál rozpouštědla. Případně se po optimalizaci pro daný vzorek dá použít deuterované rozpouštědlo. – dvě možnosti měření spekter: během průtoku, nebo vždy po zastavení průtoku – měří se 1H spektra (především), která se zaznamenají v pseudo-2D formě

čas [min] 1H

[ppm]

LC-NMR – analýza oleje ze semínek černého rybízu kolona C8+C18; zapojení v serii; 0,5 ml/min CH3CN–CDCl3 90:10 (v/v); 1–28 min AQ = 1s; NS = 4; D1 = 0s

k. stearová

k. palmitová

k. olejová Jan Sýkora, ÚCHP, AV ČR, v.v.i.

k. linolová

k. γ-linolenová

k. α-linolenová

Průmyslové aplikace – obsah vody/oleje – NMR relaxometrie ●

●

●

●

●

Využívá výrazně odlišné doby relaxace/rychlosti difuze dvou látek ve směsi Není potřeba vysoké rozlišení – stačí levný spektrometr s trvalým magnetem Použitelné na veškeré potraviny s vlhkostí pod 15% Odečítá se z kalibrační křivky (uložená v paměti přístroje, pro různé systémy různá) emulze „olej ve vodě“ – Relaxační čas T2 volného oleje je mnohem kratší než T2 volné vody. Metoda mnohonásobného spinového echa (CPMG), – Po odečtení převažující dlouhorelaxující komponenty (H2O) se získá obsah oleje extrapolací křivky (b) do t = 0. Pro získání hmotnostního zlomku je ještě nutný kalibrační faktor.

Relaxometr fi. Bruker

Průmyslové aplikace – kvalita džusu ●

současné sledování mnoha ukazatelů

●

identifikace a kvantifikace – – – –

●

ověření země původu – viz SNIF-NMR

cukrů (glukosa, fruktosa, sacharosa…) kyselin (citronová, jablečná…) indikátorů rozkladu (ethanol, k. fumarová, mléčná) způsobu zpracování § phlorin (3,5-dihydroxyfenyl-β-Dglukopyranosid) obsažen v kůře, indikátor lisování celých pomerančů

z

y x

http://www.bruker-biospin.com

NMR spektroskopie jako nástroj forenzní analýzy ●

●

Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře) Hlavní využití: – Průkaz zakázané látky § Návykové látky § Často je nutné prokázat, že se jedná přesně o zakázanou látku (MS/IČ nestačí) § Problém „legálních drog“ (látky účinné, ale dosud nezakázané) – Průkaz falšování potravin § Ověření původu § Přítomnost zakázané/jiné než deklarované látky

Průkaz zakázaných látek ●

Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře)

●

Prokázání přítomnosti látky

●

Určení čistoty/nečistot, optické čistoty, zda se jedná o sůl §

Použití při vyšetřování původu látky

●

Klasické experimenty 1H,

13C,

●

Knihovny spekter známých látek

vícerozměrné experimenty, posunová činidla

Fencyklidin

Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR ●

●

sledování rozdílného izotopického zastoupení na jednotlivých místech molekuly Izotopické rozdělení závisí na původu příslušné molekuly. Např. D/H vody v Nantes (Francie) je 150 ppm, v Antarktidě 89 ppm. Je rozdíl např. v odpařování H2O a HDO.

V.SMOW = Vienna Standard Mean Ocean Water ●

SNIF-NMR: určení poměru D/H

●

odchylka isotopů (isotope deviation), δ

●

●

alternativní metoda: hmotnostní spektrometrie (v praxi se tak měří zastoupení 13C/12C) použití: ověření pravosti a původu potravin Materiály a obrázky laskavě poskytli J. Mazáč a P. Havelec z Celní laboratoře MF ČR.

Distribuce isotopů

13C

a

2H

v přírodě

Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR ●

Metoda schválena pro (H/D): – Ovocné šťávy § Obvykle před měřením jsou cukry fermentačně převedeny na ethanol § Jediná metoda pro průkaz cukru z C3 nebo C4 rostlin – Víno – Vanilin – Kyselina octová • V kombinaci s tequilly)

13C/12C

je možné odlišit i cukry z C4 od CAM rostlin (falšování

• Měření 2D spektra a integrace jednotlivých píků vůči standardu • Při zjišťování zastoupení

13C/12C

integrace satelitů okolo signálů v 1H spektru

• Alternativa – MS spektroskopie (hlavně 13C/12C), výhodnou NMR je zjištění poměrů v jednotlivých skupinách atomů - přesnější

Specific site Natural Isotope Fractionation – SNIF-NMR

• Příklad 2D spektra ethanolu • Při zjišťování zastoupení

13C/12C

integrace satelitů okolo signálů v 1H spektru