NMR biomakromolekul RCSB PDB. Progr. NMR

NMR biomakromolekul Typy biomakromolekul a možnosti studia pomocí NMR ●

●

●

●

proteiny a peptidy – rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul nukleové kyseliny (RNA, DNA) a oligonukleotidy – omezení malou rozmanitostí chemického složení polysacharidy a oligosacharidy – omezení malou rozmanitostí chemického složení

RCSB PDB

kombinace výše uvedených

RCSB PDB Progr. NMR

NMR Proteinů • • • • • • • • • •

α

ř

Stavba a struktura proteinů

Ala

Leu

Asp

Lys

Asn

Met

Arg

Phe

Cys

Pro

Glu

Ser

Gln

Gly

Thr

Trp

His

Ile

Tyr

Vznik peptidové vazby: + Ala1

+ Ala2

Ala1–Ala2

H2O

Val

Struktura proteinů

Struktura proteinů U proteinů rozlišujeme čtyři pojmy: primární, sekundární, terciární a kvartérní struktura. ●

Primární struktura udává pořadí aminokyselin v řetězci (sekvence). Píšeme vždy ve směru od N k C konci.

●

Sekundární struktura udává konformaci hlavního řetězce v určitém úseku. Nejčastějšími prvky pravidelné sekundární struktury jsou helikální a extendovaná struktura, které jsou stabilizovány sítí vodíkových vazeb.

helikální struktura (α-helix)

extendovaná struktura (β-sheet)

náhodné klubko (random coil)

●

Terciární struktura je prostorové uspořádání všech atomů proteinu.

●

Kvartérní struktura popisuje strukturu nadmolekulového uspořádání více proteinů.

Využívaná jádra v biomakromolekulách 1H

+ vysoké přirozené zastoupení + vysoká citlivost (1,00) − malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm)

13C

+ velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm) − nízké přirozené zastoupení (1,11 %) − nízká citlivost (1,76.10−4); po 100% isotopovém obohacení 1,59.10−2

15N

• střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm) − nízké přirozené zastoupení (0,37 %) − nízká citlivost (3,85.10−6); po 100% isotopovém obohacení 1,04.10−3

2H

• speciální účely

Zdroje Proteinů • Původní organismus • + přirozená forma včetně všech modifikací • - malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy, složitá izolace,…. • Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris) • + levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení • - možné problémy s modifikacemi postranních řetězců • Chemická syntéza • + velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny • - drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se správným sbalením proteinu • In-vitro translace • + vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení • - drahé, posttranslační modifikace

Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR ●

měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností prostředí

●

sledování průběhu biochemických dějů

●

vysoce selektivní odezva na úrovni atomů

Čím jsme omezeni: ●

velikost molekuly (ovlivnění T2) – do 10 kDa (≡10 kg mol−1) [< 70 AA] □

lze řešit přímo kombinací COSY, TOCSY a NOESY experimentů

– do 20 kDa [< 180 AA] □

nutné 100% isotopové obohacení

13

Ca

15

N

– do ~100 kDa □

100% isotopové obohacení 13C, 15N a částečné nebo úplné obohacení 2H (odstranění 1H jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13C)

– větší proteiny □

●

přístupný pouze hrubý „náhled“ na celkovou strukturu, sekundární struktura

koncentrace vzorku – alespoň 0,2 mM

●

dlouhodobá stabilita vzorku – několik týdnů

Vzorek proteinu pro NMR měření ●

nutno dosáhnout koncentrace proteinu alespoň 0,2– 0,5 mmol l−1 (obecně více = lépe) – používá se filtrace přes membrány s mikropóry (protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné rozpuštění

●

úprava pH pufrem (pH typicky 4–8) – vyšší pH by způsobilo rychlou výměnu amidických vodíků s molekulami vody a ztrátu signálů

●

přidání redukčních činidel (R–SH) – zabránění oxidace cysteinů a následného vysrážení vzorku

●

přidání 5–10 % D2O – referenční jádro pro spektrometr (lock)

roztok vzorku 250–300 µl

Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku

✓

obecné informace o molekule (primární struktura, S–S vazby,...)

naměření NMR spekter

výpočet souboru počátečních struktur

přiřazení signálů atomům v molekule

přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury

vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

1. publikované NMR spektrum proteinu ●

spektrum proteinu RNasy A, měřeno 40 MHz spektrometrem, 1957

Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G. (1957) J. Am. Chem. Soc. 79, 3289.

●

40 MHz CW spektrometr

První 1GHz NMR spektrometr ●

1H

instalován firmou Bruker v Centre de RMN à Très Hauts Champs, Lyon, France

NMR spektrum proteinu měřené tímto spektrometrem

Nutný krok – potlačení signálu vody ●

jako rozpouštědlo se používá H2O, ne D2O z těchto důvodů: – jde o fysiologické prostředí – při použití D2O by došlo k výměně amidických vodíků za deuterium

●

●

tím pádem je nutné potlačit dominantní signál H2O, protože její signál je 104– 105krát intensivnější než signály měřené látky spektrum proteinu bez potlačení H2O:

Potlačení signálu H2O – metoda presaturace π/2 selektivní CW-ozařování H2O během relaxační periody

1H

Δ

NMR spektrum proteinu po presaturaci vody

zbytkový signál H2O

Potlačení signálu H2O – metoda WATERGATE ●

spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole (π/2)

πy

x

(π/2)-y Δ

1

sel.

(π/2)-y sel.

Δ

H Gz 1H

NMR spektrum proteinu po WATERGATE

zbytkový signál H2O

excitační profil selektivního π/2 pulsu

Jednodimensionální 1H NMR spektrum proteinu charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1H signálů aminokyselin – kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kDa)

CH3

H aromatické HN peptidické HN postranní

O

H N

C R1 AA1

C H

R2

H N H

C

C O

AA2

H N

O

●

C R3 AA3

C

H alifatické

Hα

●

●

H ●

1H

spinové systémy (3J) jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami

1D 1H spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1H, 13C a 15N

Vícedimensionální NMR experimenty ●

rozlišení informací obsažených v 1D spektrech – korelace chemických posunů 1H –

13C

–

15N

– propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin – pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít isotopové obohacení

http://www.protein-nmr.org.uk

1H-15N ●

HSQC – „otisk palce“ proteinu

ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, … sbalený protein

nesbalený protein

(ppm)

15N (ppm)

15 N (ppm)

1H

1H

(ppm)


✓



✓





Interpretace NMR spekter – přiřazení resonancí přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule

●

postup:

1.přiřazení hlavního řetězce (HN, N, Hα, Cα, CO) 2.přiřazení postranních řetězců (především 1H a

●

H

R1

N H

C

C O

H N

C R3

C H

O C

C

H

N

CO

Cα

O

H N

R2

13C)

HN

O

●

je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu

α Cβ H

Hβ označení jednotlivých atomů v aminokyselině

Přiřazení resonancí – atomy hlavního řetězce ●

pro přiřazení 1H, 13C a 15N se používá soubor komplementárních třídimensionálních korelačních experimentů – přenos magnetizace pomocí skalárních inerakcí (1J, 2J) základní experimenty (je mnoho dalších kombinací):

C

H

H C

N

C

N H

C O

H C

O

C

H C

C H

N

H N H

CBCANH

C H

H N H

C

C

O

HN(CO)CA

HNCA H

C

C

C H

C

C O

H N

C

H C

C

H

C

H

O

O

N

H

C H

H

H

O

●

H N H

C H C

CBCA(CO)NH

modrá: jádra excitovaná i detekovaná zelená: jádra detekovaná vývojem magnetizace (chemického posunu) červená: jádra použitá pro přenos magnetizace, bez vývoje magnetizace

C O

Přiřazení resonancí – experimenty HNCA a HN(CO)CA 13Cγ 1H

O

15N

55 13C' 15 13Cα 1H

13Cβ

i−1

13Cγ

13Cβ

140 13Cα

15N

7

1H

35

90

55 13C'

11

<1

1H

O

HNCA – po excitaci HiN je magnetizace přenesena na Ni (1JHN,N) a dále současně na Ciα (1JN,Cα) a Cαi−1 (2JN,Cα) – vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα – každá H–N skupina dává dva signály o frekvencích {ω(HiN), ω(Ni), ω(Ciα)} a {ω(HiN), ω(Ni), ω(Cαi−1)}

i 13Cγ

HN(CO)CA – po excitaci HiN je magnetizace je přenesena na Ni (1JHN,N), dále na Ci−1 (1JN,C ) a na Ci−1α (1JC ,Cα) – vývoj chemických posunů nastává pro HN, N a Cα – každá H – N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω(HiN), ω(Ni), ω(Cαi−1)}

1H

13Cβ

O

1H

35 55 13C' 15

15N

13Cα 1H

13Cβ

i−1

13Cγ

13Cα

15N

7 90

140 55 13C'

11 <1

1H

O

i interakční konstanty J v Hz

Sekvenční propojení hlavního řetězce – HNCA a HN(CO)CA ●

2D řezy spektry HNCA a HN(CO)CA v rovině H–C na frekvencích jednotlivých amidických N HN(CO)CA

HNCA

HN(CO)CA

C N H

někdy chybí pík…

HNCA

HN(CO)CA

HNCA

HN(CO)CA

HNCA

Přiřazení signálů postranních řetězců ●

různé implementace experimentů TOCSY a COSY HC(CCO)NH-TOCSY

H(C)CH-COSY

H H

O

N

C' Cα

H

H

H Cγ

Cβ

H

C' O

Cβ H

H

Cα N

H

Cγ

H


✓



✓


✓




Interpretace NMR spekter – přiřazení strukturních parametrů NOE ≡ meziatomová vzdálenost skalární interakční konstanta ≡ dihedrální úhel

chemický posun ≡ chemické okolí residuální dipolární interakce ≡ vzájemná orientace vazeb vodíkové vazby ≡ detailní lokální struktura

Nukleární Overhauserův efekt (NOE) ●

přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace

●

rychlostní konstanta křížové relaxace mezi dvěma jádry 1H, σIS:

γH τc ω

rIS

... ... ... ...

gyromagnetická konstanta 1H korelační čas molekuly Larmorova frekvence vzdálenost interagujících jader

NOE je hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule. ●Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů. ●Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity. ●Např. (1,8–2,5) Å; (1,8–3,5) Å; (1,8–5) Å. ●

dosah interakce do 5–6 Å

H H

X-editované NOESY experimenty ●

excitace pouze 1H atomů vázaných na atomy 15N nebo 13C, přenos magnetizace vlivem NOE na blízké atomy 1H, detekce

1

H

řez 3D spektrem v rovině 1HN–1H na pozici 122 ppm v 15N doméně = signál Tyr66

1H N

Skalární interakce – zjištění dihedrálních úhlů ●

peptidová vazba tvoří rovinu definovanou atomy O–Cα–N–HN

●

vzájemná orientace dvou sousedních peptidových vazeb, a tedy i konformace páteře proteinu je určena dihedrálními úhly φaψ – φ (C

–N–Cα–C

)aψ

(N–Cα–C

Karplusova rovnice

●

– závislost velikosti interakce 3J na dihedrálním úhlu (θ) – konstanty A a B zjištěny pro různé kombinace interagujících jader problém: jedné hodnotě 3J mohou odpovídat až čtyři hodnoty dihedrálního úhlu

●

–N)

3J

H–N–Cα–H

10

8

N

H–N–Cα–CO

H–N–Cα–Cβ

6

C '

4 2

C

N

C '

0 [Hz]

-120 0 CO–N–Cα–H

60

120

θ [deg]

Chemický posun ●

chemický posun některých jader je charakteristicky závislý na sekundární struktuře

chemický posun

α-helix

přiřazení resonancí hlavního řetězce (Hα, Cα a C') výpočet indexů chemického posunu (CSI)

odhad sekundární struktury podle lokální hustoty CSI

δ(Hα)

klesá

roste

náhodné klubko

β-sheet

Histogram indexu chemického posunu jader Hα, Cα a C' −1 0 +1

sekvence proteinu C

N

helix I

helix II

helix III

helix IV

Residuální dipolární interakce (RDC) ●

přímá dipól–dipólová interakce dvou jader – v isotropním roztoku nedetekovatelná – pozorovatelná v neisotropním prostředí u molekul částečně orientovaných vůči magnetickému poli

●

tvorba neisotropního prostředí – kapalné krystaly [fosfolipidy, PEG, proteiny (virové částice, bakteriorhodopsin)], zmáčknutý polyakrylamidový gel – samotné vnější magnetické pole

●

●

příspěvek ke skalární interakci ⇒ snadná měřitelnost velikost interakce DIS závisí na orientaci vazby vůči směru B0

Θ

S I

rIS

Θ...úhel mezi vektorem I–S a B0

fosfolipidové bicely orientované v magnetickém poli

Vodíkové vazby ●

identifikace: – výměnné experimenty H ↔ D – teplotní závislosti chemických posunů

●

charakterizace: – měření skalární interakce (J) přes H-vazbu

●

stabilizace pravidelných sekundárních struktur vodíkovými vazbami


✓



✓


✓



✓


Přiřazení resonancí a) páteř b) postranní řetězce

Strukturní omezení z NMR parametrů vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a interresiduální) ✔

dihedrální úhly ze skalárních interakčních konstant ✔

relativní orientace vazeb z dipolárních kaplingů ✔

případně další omezení

✔

Identifikace prvků sekundární struktury

Výpočet trojrozměrné struktury molekulová mechanika + simulované žíhání

Výpočet struktury proteinu ●

molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)

použití všech dostupných experimentálních omezení, minimalizace celkové energie systému –simulované žíhání: molekula se ohřeje na vysokou teplotu (103 K) a nechá se postupně chladnout. Po každém ochlazení se vypočítá nová energie systému. Cílem je překonat lokální energetická minima a najít (nejlépe) to globální. –přidáme nové energetické členy pro experimentální omezení: čím bližší bude shoda vypočítané struktury s experimentálními údaji, tím nižší bude celková energie –například pro NOE: ●

energetická plocha v závislosti na dvou dihedrálních úhlech v disacharidu

V případě proteinu se jedná o plochu závislou na n proměnných (n je počet optimalizovaných souřadnich/úhlů).

Vypočítané struktury

●

obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi – Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur, které by se ovšem měly lišit jen nepatrně.

– Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu.

●

struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru

soubor struktur RMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti)

vybraná reprezentativní struktura

Interakce proteinu s ligandem • • • •

Protein-protein, protein-NK, protein-malá molekula, oligomerace Interaguje specificky? Kde interaguje? Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci)

• •

Farmaceutický průmysl Proteomické studie

• • • • • • •

Metody pro měření interakce pomocí NMR Sledování změn chemických posunů Intermolekulární NOE Transferred NOESY Mapování H-D chemické výměny NH skupin Mapování pomocí paramagnetické látky Sledování změny dynamiky proteinu

Změny chemických posunů • Titrace proteinu ligandem • Sledování změn chemických posunů skupin (nejčastěji HN) • Interakční povrch • Disociační konstanta

STD – Saturation transfer difference • • • • •

Interakce protein-malá molekula Ozáření proteinu a přenos magnetizace na ligand během interakce Přebytek ligandu Zjistíme, která část ligandu interaguje Odhad KD

STD – Saturation transfer difference

Transferred NOESY H r<5Å

H • Princip: •

H NOE

chemická výměna

r>5Å

H

informace o struktuře ligandu ve vázaném stavu je pomocí chemické výměny přenesena na ligand ve volném stavu, kde je detekována

• Uspořádání: „malý“ ligand, který je viditelný NMR spektroskopií a velký • Podmínka • Využití: • •

substrát (Mw > 40 kDa) neviditelný pro NMR

vhodná kinetika systému 10-8 > Kd > 10-3 M-1 - struktura ligandu - nepřímo struktura vazebného místa - způsob vazby

•Peptid antikolagulační kaskády •Inhibitor trombinu

Interakce fragmentu trombomodulinu s trombinem • 18 aminokyselin z vazebného místa trombomodulinu

NOESY spektrum fragmentu trombomodulinu za přítomnosti trombinu

NOESY spektrum samotného fragmentu trombomodulinu

Důležité NOE interakce dalekého dosahu ligandu TM52+5C v komplexu s thrombinem

Struktura komplexu thrombinu Complex between thrombin and TM52+5C a ligandu TM52+5C

Intermolekulární NOE • NOE efekt mezi dvěma molekulami • U složitějších systémů vhodné odfiltrovat intermolekulární NOE • Rozdílné izotopové značení • 13C filtrované 13C editované NOESY

13C

filtrované 13C editované NOESY

• Vychází z 13C editovaného NOESY • Obsahuje filtr, na NOE mezi 1H na 13C • Projeví se NOE jen mezi 1H na 13C a 1H na 12C

Neznačený ligand

protein (13C značený)

13C 13C


editované NOESY

13C


1H

1H

1H

Studium dynamického chování molekul ●

molekuly nejsou statické, pohybují se v různých časových škálách – různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují

●

funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě – regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace

●

vypočítaná struktura je někdy průměrem více konformerů – možnost charakterizace časové škály pohybů

– různé relaxační mechanismy postihují různé časové škály molekulárních pohybů lokální pohyby globální pohyby příklady jevů

pohyb N–H rotace CH3

ps

pohyb smyček

ns

relaxace R1, R2, het. NOE

metody studia

pohyb domén

μs

transport, katalýza, další biologické děje...

ms

s

relaxace R1ρ, CPMG analýza tvaru signálu saturation transfer, NOESY výměna H/D

>s

NMR biomakromolekul RCSB PDB. Progr. NMR

Recommend Documents