OBSAH 1. ÚVOD SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL

OBSAH 1. ÚVOD.................................................................................................................................... 5 2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL .................................................... 8 2.1 FÁZOVÉ SEPARACE ................................................................................................................ 8 2.1.1 Klasické separační techniky .......................................................................................... 8 2.1.2 Extrakce do dvoufázových vodných systémů ............................................................. 15 2.2 MEMBRÁNOVÉ PROCESY ..................................................................................................... 21 2.3 CHROMATOGRAFICKÉ METODY ........................................................................................... 37 2.3.1 Teorie chromatografie ................................................................................................. 39 2.3.2 Plynová chromatografie............................................................................................... 47 2.3.3 Kapalinová chromatografie ......................................................................................... 49 2.3.4 Vysokoúčinná kapalinová kolonová chromatografie .................................................. 56 2.3.5 Instrumentace sloupcových chromatografických metod ............................................. 57 2.3.6 Detekce separovaných látek ........................................................................................ 63 2.3.7 Aplikace HPLC............................................................................................................ 66 2.3.8 Iontová chromatografie ............................................................................................... 67 2.3.9 Gelová permeační chromatografie............................................................................... 70 2.3.10 Chromatografie na měničích iontů ............................................................................ 83 2.3.11 Chromatofokusace ..................................................................................................... 95 2.3.12 Chromatografie s reversní fází .................................................................................. 99 2.4 METODY ZALOŽENÉ NA MOLEKULOVÉM ROZPOZNÁVÁNÍ.................................................. 102 2.4.1 Bioafinitní chromatografie ........................................................................................ 103 2.4.2 Nespecifická afinitní chromatografie ........................................................................ 118 2.4.3 Další separační techniky založené na molekulovém rozpoznávání .......................... 133 2.5 ELEKTROMIGRAČNÍ (ELEKTROFORETICKÉ) METODY ......................................................... 139 2.5.1 Volná elektroforéza ................................................................................................... 140 2.5.2 Zonová elektroforéza................................................................................................. 141 2.5.3 Izoelektrická fokusace (IEF) ..................................................................................... 150 2.5.4 Afinitní elektroforéza ................................................................................................ 152 2.5.5 Dvojrozměrná elektroforéza ...................................................................................... 153 2.5.6 Izolace separovaných látek z gelové matrice ............................................................ 154 2.5.7 Vizualizace separovaných látek ................................................................................ 156 2.5.8 Imunoelektroforéza.................................................................................................... 159 2.5.9 Kapilární elektroforéza.............................................................................................. 161 2.5.10 Způsoby provedení kapilární elektroforézy............................................................. 166 2.5.11 Aplikace elektroforézy v biochemii, biotechnologii a dalších oblastech................ 173 2.5.12 Analytické aplikace elektroforetických metod........................................................ 175 3. IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL ............................................................................ 179 3.1 ÚVOD ................................................................................................................................ 179 3.2 ZÁKLADNÍ IZOLAČNÍ KROKY ............................................................................................. 180 3.3 HOMOGENIZACE A SOLUBILIZACE MATERIÁLU .................................................................. 181 3.4 SEPARACE BUNĚK Z KULTIVAČNÍHO MEDIA ....................................................................... 181 3.5 DEZINTEGRACE BUNĚK ..................................................................................................... 182 3.5.1 Fyzikální způsoby dezintegrace ................................................................................ 183 3.5.2 Chemické způsoby dezintegrace ............................................................................... 186 3.5.3 Enzymové způsoby dezintegrace .............................................................................. 188 3.6 KONCENTRACE A OBOHACOVÁNÍ ROZTOKŮ ...................................................................... 189 3.7 ZAJIŠTĚNÍ STERILITY SUROVÝCH PREPARÁTŮ.................................................................... 191

3

3.8 PURIFIKACE BIOMAKROMOLEKUL ..................................................................................... 191 3.8.1 Strategie a taktika purifikace ..................................................................................... 192 3.8.2 Odsolování................................................................................................................. 196 3.8.3 Požadavky na čistotu preparátů ................................................................................. 198 3.8.4 Hodnocení účinnosti purifikace................................................................................. 199 3.9 KONCENTRACE IZOLOVANÝCH PREPARÁTŮ A JEJICH KONEČNÁ ÚPRAVA ........................... 200 3.10 KRITERIA ČISTOTY PREPARÁTŮ ....................................................................................... 201

4

1. ÚVOD Izolace chemických individuí ze směsi látek různého původu je jedním ze základních úkolů chemie. V přírodě, ale i po syntézách a chemických reakcích, se látky většinou vyskytují ve směsích. Pro studium vlastností je však třeba získat látky v čisté formě. Proto se chemik a biochemik velmi často setkává s nutností vyizolovat čistou látku ze složité směsi ev. rozdělit směs na jednotlivé složky. K tomu slouží různé separační techniky a izolační metody. Některé separační metody jsou známy již velmi dlouho. Je to např. sedimentace, čeření, extrakce, filtrace a krystalizace. Tyto klasické metody však zřídka postačí k dělení složitých směsí, v nichž se často vyskytují látky velmi podobných vlastností. Byly proto hledány nové směry v rozvíjení separačních metod, které se zaměřily zejména na - různé adsorpční vlastnosti produktů - nestejnou rozpustnost složek směsi ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách - rozdíly v rozpustnosti plynů v kapalině - rozdílnou iontovou pohyblivost - rozdílný elektrický náboj Vývoj biochemických separačních technik v posledních patnácti až dvaceti letech byl velmi rychlý. Nejvýraznější krok vpřed byl zaznamenán využitím přirozené biologické aktivity mezi biomakromolekulami a jejich komplementárními ligandy, jako jsou substráty, imuno-ligandy, hormony, nukleové kyseliny apod. Vysoce selektivní separační techniky umožnily nejen dosáhnout rychlejší a jednodušší purifikace, ale i zvolit takovou separační metodu, aby bylo dosaženo i dalších cílů. K takovým cílům může patřit snížení nákladnosti dělení, zvýšení výtěžnosti, snížená tvorba artefaktů jako jsou oligomery, agregáty s jinými bílkovinami a bílkoviny, které pozbyly terciární struktury. Jiný takový cíl může být získání látky dostatečně koncentrované a v roztoku takového složení, aby se dalo použít mrazové sublimace. Techniky separace makromolekul biologického původu se velmi liší od technik dělení nízkomolekulárních látek. Důvodů je několik: *Makromolekuly mají malou schopnost difuze, neodpařují se, ani snadno nekrystalují. Jejich dělení je proto obtížnější než dělení nízkomolekulárních látek.

5

*Použití adsorpčních materiálů pro jejich rozdělení je méně účinné, protože mají na svém povrchu mnoho vazebných míst. Jsou tedy obvykle adsorbovány velmi pevně a nepříliš specificky. Adsorpce bývá velmi často ireverzibilní, kromě velmi slabých adsorbentů. *Rozdělování mezi dvě fáze, vzhledem ke značné velikosti molekul a následkem toho k velkému počtu exponovaných skupin, bývá značně jednostranné, pokud obě fáze nemají velmi podobné fyzikálně-chemické vlastnosti. *U makromolekulárních látek s biologickou aktivitou je třeba počítat s jejich nestálostí, proto jsou předem vyloučeny metody, při nichž jsou látky vystaveny vysokým teplotám, organickým rozpouštědlům nebo silně lipofilním a silně adsorbujícím materiálům, které by mohly porušit terciární nebo kvarterní strukturu biomakromolekul. Metody, používané pro separaci biomakromolekul, můžeme rozdělit do dvou základních skupin. Jsou to: a) klasické metody, které většinou závisejí na fázové separaci b) moderní metody, ve většině případů využívající rozdílných rychlostí migrace látek v prostředí Intenzivní výzkum v oblasti přírodních látek, zejména v biochemických aplikacích, vyžaduje nejen dokonalou separaci, ale i identifikaci a stanovení jednotlivých optických izomerů. Ukazuje se totiž, že biologická aktivita, toxicita nebo např. terapeutické účinky jednotlivých optických izomerů se značně liší a jejich aplikace je proto závislá na možnosti jejich separace. V současné době máme k dispozici řadu účinných metod, které značně usnadňují přístup k purifikaci biomakromolekul. To ovšem neznamená, že metody, které můžeme označit jako klasické, jsou zastaralé a málo používané. Řada těchto metod je dosud velice často používaná, a to buď v kombinaci s moderními metodami, nebo jako levné a účinné metody při provozních izolacích, resp. při přípravě technických preparátů. Vlastní separační techniky ovšem nejsou jedinými metodami, se kterými se setkáme při izolaci biologicky aktivních látek z přírodního materiálu. Většina biomakromolekul jsou intracelulární látky, které je při izolaci nutno uvolnit z buňky. V tom případě je nezbytné zvětšit propustnost buněčné stěny, nebo membránu zcela rozbít, vyextrahovat buněčný obsah a oddělit extrakt od buněčných zbytků. Pokud jsou biomolekuly produkovány buňkami do mezibuněčných prostor, ev. v případě mikrobiálních buněk do kultivačního media, dezintegrace buněčné membrány sice odpadá, ale izolované látky zase je potřeba

6

zkoncentrovat. Po provedené separaci a purifikaci je obvykle nutno získaný preparát převést do vhodné formy a charakterizovat ho. Izolační a separační techniky se velice rychle vyvíjejí, objevují se stále nové účinnější metody, nebo metody, které při separaci využívají zcela nových principů. Proto předkládané skriptum nemůže zahrnovat všechny historické i dosud používané metody a zaměřuje se pouze na ty, které se v současné době používají nejčastěji. Ani ty však nemohou být probrány do všech podrobností. Doporučujeme všem, kteří se v budoucnu budou izolacemi zabývat, aby pro každou techniku vyhledali příslušnou literaturu. Mohou se setkat i s metodami, které v současné době ještě nejsou známy nebo nejsou dostatečně prostudovány. Toto skriptum slouží jako jakýsi úvod do separačních a izolačních technik a má být i určitým strategickým návodem, jak k izolacím přistupovat.

7

2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL 2.1 Fázové separace 2.1.1 Klasické separační techniky Klasické separační techniky jsou metody, které již po dlouhou dobu účinně pomáhají při dělení směsí biomakromolekul, zejména bílkovinných směsí a nukleových kyselin, a svůj význam mají dodnes. Při provozních purifikacích a při přípravě technických preparátů enzymů a bílkovin obecně se často používají jako jediné izolační metody. Při přípravě vysoce purifikovaných preparátů se obvykle uplatní v počátcích purifikace. Směsi biomakromolekul jsou vždy separovány postupně. V jednotlivých krocích se využívá různých fyzikálně-chemických vlastností separovaných molekul s cílem odstranit v průběhu izolace vybrané biomakromolekuly co nejvíce kontaminujících sloučenin, aby byla izolovaná látka získána v co nejčistším stavu. Charakteristickými vlastnostmi, které se využívají při izolaci biologicky aktivních látek, jsou rozpustnost, disociace, molekulová hmotnost, adsorpční vlastnosti a vazebná afinita k jiným biomolekulám.

Frakcionace biomakromolekul na základě rozdílů v rozpustnosti Známe čtyři hlavní faktory, které ovlivňují rozpustnost proteinů, ale i dalších biomolekul, a které proto mohou být použity pro frakcionaci. Je to obsah solí, obsah organických rozpouštědel, vliv pH a vliv teploty. Závislost rozpustnosti bílkovin na těchto faktorech je způsobena přítomností četných acidobazických skupin v molekule proteinu. Obsah solí. Rozpustnost všech bílkovin, ale i dalších biomolekul ve vodných roztocích je závislá na koncentraci rozpuštěných solí, která se vyjadřuje jako iontová síla I:

I = 0,5Σ ci zi2

8

(1)

ci = látková koncentrace iontu i zi = náboj iontu i Při nízkých koncentracích elektrolytu se zvyšováním koncentrace solí roste i rozpustnost bílkoviny až do určitého maxima. Po jeho překročení s rostoucí koncentrací solí rozpustnost bílkoviny klesá. Vzestup rozpustnosti bílkoviny při zvyšování koncentrace soli v oblasti nízkých koncentrací se nazývá vsolování. Různé bílkoviny se navzájem liší odezvou na přídavek soli. Vsolování se velice často používá pro frakcionaci globulinů, které jsou ve vodě prakticky nerozpustné a mohou tudíž být frakcionovaně rozpuštěny zvyšováním iontové síly roztoku. Snižování rozpustnosti většiny bílkovin při vysoké koncentraci solí v roztoku se běžně používá pro tzv. vysolování. Hlavní efekt při vysolování má anion přidané soli, přičemž bylo zjištěno, že polyvalentní anionty (fosforečnany, sírany) prokazují vyšší vysolovací účinek než monovalentní anionty (např. chloridy) (obr.2.1). Frakcionace síranem amonným je jednou z nejběžněji užívaných procedur v prvních fázích izolace, zejména pracujeme-li s velkými objemy. Sůl se přidává buď jako nasycený roztok nebo jako pevná látka. Přídavek soli v pevné fázi je výhodnější, neboť nedochází k výrazným objemovým změnám. Frakcionace se pak provádí za účinného míchání a přednostně v chlazených prostorách. Precipitovaná bílkovina se odstraňuje vždy při dosažení určitého stupně koncentrace dané soli, přičemž je zvykem vyjadřovat koncentraci soli jako procenta nasycení. Precipitované bílkovinné frakce jsou pak znovu rozpuštěny a musí být obvykle pro další purifikační procesy zbaveny solí (dialýza, ultrafiltrace apod.). V jednotlivých frakcích se pak zjišťuje přítomnost požadované bílkoviny či aktivita žádaného enzymu a frakce, které tuto aktivitu či bílkovinu obsahují, se spojí. Při experimentálním vsolování i vysolování je třeba věnovat péči tomu, aby sůl byla přidávána zvolna, neboť lokální nadměrné zvýšení koncentrace soli by mohlo vyvolat nežádoucí nevratnou precipitaci. Dále je třeba ponechat dostatek času k tomu, aby došlo k úplné precipitaci. Obvykle postačuje 20 - 30 min. za míchání, lepší však je ponechat precipitaci vyvíjet přes noc při teplotě 4 oC. Vysolování jistě nelze považovat za metodu, při níž by došlo k ostrému rozdělení separovaných biomolekul, nicméně je vhodná, jak již bylo řečeno, při práci s velkými objemy roztoků a její výhodou je, že většinou nemá nepříznivý vliv na biologickou aktivitu izolovaných biomolekul.

9

Přítomnost organických rozpouštědel. Proteiny i nukleové kyseliny mohou být separovány frakcionací s nepolárními vodou mísitelnými rozpouštědly jako je methanol, propanol a ethanol, používá se však i aceton a diethylether. Principem frakcionace je to, že změny dielektrické konstanty, způsobené organickým rozpouštědlem, mají různý efekt na rozpustnost různých biomakromolekul. Vzhledem k tomu, že bílkoviny mají v přítomnosti organických rozpouštědel tendenci denaturovat, je třeba omezit možnost denaturace na minimum prací při teplotách pod nulou (-5 oC). To je možné, protože přítomnost organického rozpouštědla snižuje bod tuhnutí roztoků. Při izolaci nukleových kyselin je nebezpečí denaturace organickými rozpouštědly minimální. Při precipitaci bílkovin organickými rozpouštědly je třeba počítat i s tím, že přítomnost solí ve vodném roztoku organického rozpouštědla zvyšuje rozpustnost bílkovin. Precipitace bílkovin a nukleových kyselin organickými rozpouštědly se obvykle provádí v rozmezí koncentrace rozpouštědla 0 - 80 %, po oddělení precipitátu je však nutno odstranit zbytky rozpouštědla, a to buď vakuovým sušením nebo dialýzou. Protože při mísení organického rozpouštědla s vodou není konečný objem aditivní, je třeba po odstranění precipitátu vždy změřit objem zbývající frakce.

Obr.2.1

Rozpustnost hemoglobinu v roztocích různých solí při proměnné iontové síle. Vzestupná část křivek odpovídá oblasti vsolování, sestupná vysolování

Metoda frakcionace s organickými rozpouštědly byla úspěšně použita např. při frakcionaci enzymů ze svalů, při izolaci α-amylasy ze slin a při frakcionaci bílkovin krevního sera.

10

Vliv pH. Rozpustnost bílkovin značně závisí na pH media; nejnižší je v izoelektrickém bodě. V některých případech dojde v izoelektrickém bodě ke spontánní precipitaci bílkoviny (např. kasein), častěji však je nutné po úpravě pH do izoelektrického bodu změnit ještě další faktor, např. koncentraci solí, teplotu, přidat organické rozpouštědlo apod., aby došlo k selektivnímu srážení bílkoviny. Malá změna pH může často mnohonásobně změnit poměr rozpustnosti přítomných bílkovin např. při vysolování (viz obr.2.2). Je třeba počítat i s tím, že některé bílkoviny jsou v izoelektrickém bodě nevratně denaturovány. Toho je možno využít při odstraňování nežádoucích bílkovin. Skutečnost, že bílkoviny se liší navzájem svými izoelektrickými body, se využívá při tzv. izoelektrickém srážení. Při něm se pH roztoku upraví na hodnotu izoelektrického bodu té bílkoviny, kterou chceme z roztoku izolovat. Její rozpustnost se tím podstatně sníží a její precipitace pak už není nesnadná. Postupnou úpravou pH se mohou z roztoku postupně vyloučit bílkoviny podle svých izoelektrických bodů. Vliv teploty. Jako pro většinu látek i pro biomakromolekuly platí, že jejich rozpustnost závisí na teplotě. Je proto třeba počítat s tím, že pro zajištění reprodukovatelnosti frakcionace je třeba dodržovat určitý teplotní režim.

Metody frakcionace založené na rozdílné stabilitě biomakromolekul Při frakcionaci biomakromolekul se dá využít i jejich rozdílné stability v určitém prostředí. Nejvýznamnějšími faktory, které ovlivňují stabilitu jsou teplota, pH a přítomnost iontů. Bílkoviny se navzájem značně liší tepelnou stabilitou. Zatímco některé bílkoviny denaturují již při teplotách okolo 25 oC, jiné snesou i var, aniž by došlo k jejich inaktivaci. Při purifikaci tepelně stabilní bílkoviny může být této vlastnosti využito k tepelné denaturaci kontaminujících proteinů. Nejčastěji se tepelná denaturace provádí v rozmezí 50-80 oC, někdy i za vyšších teplot. Vždy se však doporučuje pracovat za přítomnosti stabilizátoru izolované bílkoviny. Koagulované kontaminující bílkoviny je nutné co nejdříve odstranit, neboť je nebezpečí - i když málo pravděpodobné - jejich renaturace. Příkladem využití

11

denaturace pro odstranění kontaminantů může být purifikace α-amylasy z rostlinných a mikrobiálních zdrojů, kdy při teplotě 70 - 75 oC za přítomnosti Ca2+ jsou inaktivovány βamylasa

a

proteasy,

zatímco

aktivita

α-amylasy

zůstane

nedotčena.

Obdobně

alkoholdehydrogenasu z kvasinek je možno částečně purifikovat zahřátím na 55 oC, mikrobiální glukosaisomerasu zahřátím na 60

o

C a ribonukleasa dokonce snese bez

inaktivace teplotu 90 oC.

Obr.2.2

Rozpustnost β-laktglobulinu jako funkce pH při různých koncentracích NaCl

Je třeba si uvědomit, že při tepelné denaturaci kontaminujících biomakromolekul nelze laboratorně získané výsledky převádět beze zbytku do většího měřítka. Jestliže budeme ve vodní lázni např. 70 oC teplé zahřívat 5 ml vzorku, požadované teploty bude dosaženo

12

rychle; 2 l vzorku se budou zahřívat pomaleji a požadované teploty nemusí být dosaženo ani při skončení zahřívání. Druhým typem diferencované inaktivace bílkovin je využití extrémního pH. Základním předpokladem i v tomto případě zůstává odolnost požadované bílkoviny vůči použitému pH, takže opět dojde k vysrážení méně stabilních kontaminujících biomakromolekul. Ani v těchto případech nelze vyloučit renaturaci. Jako příklad lze i zde uvést izolaci ribonukleasy, kterou je možno extrahovat z pankreatu kyselinou sírovou v koncentraci 0,1 mol/l, aniž dojde k její inaktivaci. Při izolaci bílkovin nebo nukleových kyselin z přírodního materiálu se velice často setkáme s nutností odstranit nežádoucí bílkoviny z roztoku nukleových kyselin nebo naopak nežádoucí nukleové kyseliny z roztoku bílkovin. I při tom se využívá rozdílné stability jednotlivých biomakromolekul. Nukleové kyseliny se obvykle odstraňují z roztoku bílkovin vysrážením s kationaktivními detergenty. V posledních letech se též nukleové kyseliny odstraňují působením nukleas, což je metoda levná, efektivní a nenese sebou nebezpečí koprecipitace přítomných bílkovin. Bílkoviny se z roztoku nukleových kyselin odstraňují srážením

fenolem nebo směsí trichlormethanu a isopentylalkoholu, dále srážením s

guanidiniumchloridem nebo vysokou koncentrací solí. Bílkoviny je též možno rozložit peptidhydrolasami.

Purifikace biomakromolekul interakcí se specifickými srážedly Metody, které využívají interakce iontů těžkých kovů se specifickými skupinami bílkovinné molekuly, se používají v chemii bílkovin již dlouhou dobu. Např. je známo, že rtuťnaté ionty reagují specificky s merkapto skupinami, zinečnaté s imidazolem. Ionty železa, vápníku a barya jsou příkladem dalších ke srážení běžně používaných iontů kovů. Výsledkem interakcí proteinu s iontem kovu je změna v rozpustnosti bílkoviny a tu je pak možno využít při frakcionaci bílkoviny, zejména ve spojení s dalšími faktory jako je iontová síla, pH, organické rozpouštědlo. Tyto metody mají naději na úspěch zejména tehdy, pracuje-li se při pH vyšším než je izoelektrický bod požadované bílkoviny. Přesto je třeba pamatovat na to, že ionty těžkých kovů jsou enzymovými inhibitory, a je tedy nutno se vyvarovat práce s přebytkem těchto iontů v roztoku a po oddělení bílkoviny je co nejdříve odstranit.

13

Při frakcionaci bílkovin se používají i další srážecí činidla, např. trichloroctová kyselina a sulfosalicylová kyselina. Ty reagují pouze s proteiny, které jsou ve formě kationtu (tj. při pH nižším než je izoelektrický bod). Některé konjugované proteiny, zejména glykoproteiny, se srážejí těmito činidly velice obtížně, čehož se dá při frakcionaci vhodně využít. Z dalších specifických srážedel jmenujme alespoň kyselinu tannovou, která se užívá při purifikaci glukosaoxidasy, dále nukleové kyseliny, které mohou tvořit nerozpustné komplexy zejména s bazickými proteiny a řada dalších.

Precipitace bílkovin vysokomolekulárními polymery K frakcionaci bílkovin lze použít i vysokomolekulární ve vodě rozpustné polymery. Nejčastěji se používá polyethylenglykol o vyšší molekulové hmotnosti. Je netoxický, nehořlavý a nezpůsobuje denaturaci bílkovin, což ho předurčuje i k širokému průmyslovému využití.

Precipitace nukleových kyselin kationaktivními sloučeninami Nukleové kyseliny mohou být frakcionovány ev. odstraněny ze směsi bílkovin srážením s různými kationaktivními sloučeninami, jako je cetyltrimethylamoniumbromid, síran streptomycinu, síran protaminu, polyethylenimin, polylysin nebo chlorid manganatý.

Purifikace biomakromolekul pomocí adsorbentů Jednou z metod purifikace biomakromolekul je jejich adsorpce na povrch pevných látek, tj. diferencovaná schopnost biomakromolekul vázat se různě pevnými vazbami na povrch adsorbentu (tzv. afinita molekuly k adsorbentu). Nejčastěji používanými adsorbenty jsou oxid hlinitý (gel), fosforečnan vápenatý (gel), silikagel, aktivní uhlí apod. Adsorpční metoda se používala vsádkově již dávno před zavedením kolonových metod. Vsádková metoda má ovšem vedle výhod (jednoduchost provedení) i své nevýhody.

14

Hlavní nevýhodou je malá specifita většiny molekul k adsorbentu. Je proto třeba při izolaci určité biomolekuly přidat pouze takové množství adsorbentu, aby se navázala pouze biomolekula s největší afinitou (což by měla být požadovaná biomolekula) a ostatní látky zůstaly v roztoku. Naopak, má-li žádaná biomolekula nízkou afinitu k adsorbentu, přidá se adsorbentu takové množství, aby se adsorbovaly všechny sloučeniny až na požadovanou, která tudíž zůstane v roztoku. Mezi chováním biomakromolekul k jednotlivým adsorbentům jsou výrazné rozdíly a dosud se nepodařilo stanovit zásady, podle nichž se chování biomakromolekul vůči adsorbentu řídí. Výběr vhodného adsorbentu je proto vždy záležitostí empirickou. Afinita biomakromolekul k adsorbentu je ovlivňována různými faktory z prostředí, jako je pH, iontová síla a teplota. Obvykle není jednoduché předpovědět, v jakém směru se změna některého faktoru projeví. Např. zvýšení iontové síly v některých případech zvyšuje, v jiných snižuje schopnost biomakromolekuly vázat se na adsorbent. Eluce biomakromolekul z adsorbentu se nejčastěji uskutečňuje změnou pH nebo iontové síly, ev. specifickými adsorpčními činidly. Výraznou změnu v adsorpční technice znamenalo zavedení adsorpční chromatografie. Pro tuto techniku se nehodily dříve používané adsorpční materiály, které mají ve většině případu špatné průtokové vlastnosti a bylo proto nutno zavést jiné adsorpční materiály (Al2O3, bauxit apod.). Princip adsorpční chromatografie je velmi jednoduchý: směs látek se aplikuje na vrchol kolony adsorbentu a jednotlivé látky jsou postupně vymývány elučními činidly podle jejich afinity k adsorbentu. Tato technika tvoří jakýsi spojovací článek mezi klasickými a moderními purifikačními metodami.

Afinitní precipitace Afinitní precipitace, t.j. případ, kdy k dokonalé precipitaci biomakromolekul určitého typu přispívá vazba biomakromolekuly na afinitní ligand, bude popsána v kap.2.4.3. 2.1.2 Extrakce do dvoufázových vodných systémů Extrakce organickými rozpouštědly je dlouho známá a dobře propracovaná technika izolace molekul, hojně používaná v chemickém a farmaceutickém průmyslu. Většina

15

biomakromolekul je však v běžně používaných organických rozpouštědlech nerozpustná a často velice nestabilní, proto je nelze těmito činidly extrahovat. Dvoufázové systémy, které by bylo možno využít pro extrakci biomakromolekul, je však možno připravit i přídavkem dvou hydrofilních polymerů do vodného roztoku, nebo přídavkem jednoho polymeru do vodného roztoku vhodné soli. Při zachování vhodných koncentrací se vytvoří dvě nemísitelné fáze, v nichž voda bude podstatnou složkou, takže vzniklé prostředí bude příznivé pro biologicky aktivní makromolekuly nebo i buněčné organely. Nejčastěji používaným hydrofilním polymerem je polyethylenglykol o různé molekulové hmotnosti (asi od 1400 po 6000), druhým polymerem bývá dextran. Pokud druhý polymer nahradí soli, jsou to obvykle sodné nebo draselné fosforečnany, a to dihydrogenfosforečnan, hydrogenfosforečnan i fosforečnan. Fyzikálně-chemické vlastnosti vodných dvoufázových systémů vyjadřují fázové diagramy (viz obr.2.3). Jestliže se koncentrace jedné nebo obou složek přítomných ve vodném rozpouštědle budou pohybovat pod hranicí danou binodalou, vznikne homogenní roztok. Jestliže však koncentrace obou složek překročí tuto mezní hodnotu (danou binodálou), vytvoří se spontánně dvoufázový systém. Složení horní fáze bohaté polyethylenglykolem (bod T na diagramu) koresponduje se spodní fází určitého složení.

Obr.2.3

Fázový diagram systému polyethylengkykol - K2HPO4 při pH 7 a 20 oC

Rovnovážná koncentrace polyethylenglykolu (PEG) a soli ve spodní fázi je dána bodem B diagramu. Každá dvojice komponent dvoufázového systému, která leží na spojnici T a B, dá identický fázový systém, který se bude lišit pouze poměrem objemů horní a dolní fáze. Jestliže se pro vytvoření dvoufázového systému použije PEG o vyšší molekulové hmotnosti, binodala se posune směrem k počátku. Obdobný efekt bude mít i zvýšení teploty.

16

Příklad: 10% PEG o molekulové hmotnosti 4000, 13% KH2PO4 (pH7,7) a 77% vody vytvoří spontánně dvoufázový systém, jehož horní fáze obsahuje 24% PEG, 6% KH2PO4 a 70% vody, dolní fáze 17% KH2PO4, 1,3% PEG a 81% vody. Poměr objemu horní a dolní fáze je 0,8. Rozdělovací koeficient K udává váhový poměr extrahovaného biopolymeru v horní a dolní fázi. K = ch / cd

(2)

ch = koncentrace biopolymeru v horní fázi cd = koncentrace biopolymeru v dolní fázi Separace ve dvoufázovém systému je funkcí rozdělovacího koeficientu, ale též poměru objemů obou fází. Tuto skutečnost vyjadřuje tzv. separační faktor G. G = K (Vh /Vd )

(3)

V = objem horní a dolní fáze Hodnota rozdělovacího koeficientu je výsledkem nejrůznějších nevazebných interakcí separovaných molekul s prostředím. Proto je možné jeho hodnotu do jisté míry ovlivňovat. Protože se při rozdělování mezi dvě fáze uplatní zejména hydrofobní interakce a vodíkové nebo iontové vazby, je hodnota rozdělovacího koeficientu silně závislá především na hydrofilicitě a na náboji separovaných systémů. Proto ho nejvíce ovlivní faktory, které rozhodují o těchto vlastnostech. Jsou to především: - typ použitého polymeru - molekulová hmotnost a distribuce polymeru - vzdálenost bodů T a B na fázovém diagramu, neboli koncentrace jednotlivých komponent dvoufázového systému - typ použité soli - pH - teplota

17

Prvé dva uvedené faktory ovlivňují hydrofilicitu systému, ostatní náboj a elektrostatický potenciál. Z výše uvedeného plyne, že látky, které obsahují jak polární tak nepolární skupiny, např. proteiny, se mohou podle podmínek extrahovat jak do horní PEG fáze, tak do výrazně hydrofilní dolní fáze, zatímco hydrofilní sloučeniny, např. nukleové kyseliny, přecházejí častěji do fáze dolní. Vhodné podmínky pro tvorbu příznivého rozdělovacího koeficientu pro každou separovanou sloučeninu se musí nalézt experimentálně. Obvykle se postupuje tak, že z výše uvedených faktorů se mění relativní molekulová hmotnost polymeru, typ soli, pH a koncentrace jednotlivých složek směsi. Pro hledání vhodných experimentálních podmínek však neexistuje žádný pevný vzor. Cílem extrakce biomolekul do dvoufázového systému je shromáždit každou ze separovaných látek pouze do jedné fáze (což prakticky nelze stoprocentně splnit) a separované látky od sebe oddělit tak, aby v jedné z fází byl pouze jediný typ biomolekul. To znamená, že separujeme-li dvě látky, snažíme se dostat každou do jiné fáze. Separujeme-li látek více, snažíme se ze směsi oddělit jednu do jedné z fází a v dalších krocích pak pokračujeme se separací fáze, ve které se shromáždilo více typů biomolekul. Rozdělovací koeficient lze velice výrazně ovlivnit připojením specifického ligandu na polymerní část dvoufázového systému. Molekuly, které mají afinitu k ligandu se pak hromadí ve fázi obsahující ligand. Použití specifického ligandu je podrobněji popsáno v kapitole 2.4.1.

Aplikace dvoufázových systémů při izolaci biomolekul z biomasy Dvoufázové systémy je možno použít při extrakci buněčného obsahu z dezintegrovaných buněk ev. k extrakci biomolekul z libovolné biomasy. Úkolem prvého kroku extrakce do dvoufázového systému je kvantitativní oddělení buněčných zbytků (ev. jiných nerozpustných zbytků) od požadované biomolekuly. Výsledek záleží jednak na

18

rozdělovacím koeficientu, jednak na poměru horní a dolní fáze. K oddělení buněčných zbytků od separované biomolekuly je třeba podmínky upravit tak, aby buněčné zbytky přešly kvantitativně do opačné fáze než biomolekuly. Při izolaci bílkovin se buněčné zbytky převedou do dolní solné fáze a bílkoviny do horní PEG fáze. V případě nukleových kyselin by tomu bylo naopak, ovšem převést buněčné zbytky do horní fáze je v případě provozního měřítka méně příznivé. Proto se v provozní praxi využívá těchto systémů zejména pro izolace bílkovin. K převedení buněčných zbytků do dolní solné fáze se doporučuje použít dvoufázový systém, jehož složení odpovídá levé horní části příslušného fázového diagramu. Jestliže se do dvoufázového systému přidá větší podíl dezintegrované biomasy, což je samozřejmě z ekonomického hlediska výhodné, je nutné počítat při tvorbě dvoufázového systému s určitými změnami. Binodála bude posunuta směrem k počátku, poměr fázových objemů se posune směrem k hodnotě jedna a pravděpodobně se změní rozdělovací koeficient. Posun binodály směrem k počátku je vítaná změna, neboť umožňuje vytvářet dvoufázové systémy z méně koncentrovaných roztoků, které za normálních okolností leží pod binodálou a neumožňují proto vznik dvou fází. Ke změně rozdělovacího koeficientu dochází až tehdy, je-li přidáno do systému nejméně 20% biomasy. Maximum biomasy, které je možné do systému přidat je 50 - 60%. S rostoucím přídavkem biomasy stoupá viskozita systému a mění se rheologické vlastnosti disperse. Zkušenosti z extrakce bílkovin z dezintegrovaných buněk pomocí dvoufázových systémů lze shrnout do následujících bodů: - výtěžnost bílkoviny bývá vyšší než 90% - rozdělovací koeficient se pohybuje od 1 do 20 s průměrem vyšším než 3 - optimální přídavek biomasy na 1 kg systému je 200 - 350 g - současně s buněčnými zbytky se odstraní i část kontaminujících bílkovin či dalších látek - systém PEG-sůl vykazuje větší specifitu než systém PEG-dextran, zejména je-li použit nepurifikovaný dextran (což je v provozním měřítku běžné) Bílkovina, která se při první extrakci dostala do horní fáze, může být dále purifikována tzv. sekundární extrakcí. V tom případě je nutno obě fáze od sebe oddělit a k horní PEG fázi přidat vhodné množství soli, takže se vytvoří další dvoufázový systém. Celkové složení dvoufázového systému je vhodné při sekundární extrakci změnit, a to změnou koncentrace ev. typu přidané soli, změnou pH a někdy též přídavkem menšího množství polyethylenglykolu o jiné molekulové hmotnosti. Výsledkem sekundární extrakce

19

by mělo být odstranění kontaminujících bílkovin, ale též nukleových kyselin, polysacharidů, barevných látek apod. Nukleové kyseliny a polysacharidy vzhledem k svému hydrofilnímu charakteru přecházejí ochotně do dolní solné fáze, naproti tomu většina barevných látek má hydrofobní charakter a přejde proto do horní polyethylenglykolové fáze. Záleží proto hlavně na charakteru kontaminujících příměsí, které chceme odstranit, převedeme-li separovanou bílkovinu při sekundární extrakci do horní či dolní fáze. Jestliže upravíme podmínky tak, aby bílkovina znovu přešla do horní fáze, musíme zařadit ještě terciální extrakci, při níž je nutné uspořádat systém tak, aby izolovaná bílkovina přešla do dolní fáze. Po skončení extrakce je nutné z extraktu bílkoviny odstranit přítomné kontaminující sloučeniny, tedy i soli ev. PEG. Z provozního hlediska je odsolení podstatně jednodušší než odstraňování PEG. Terciární extrakce znamená vždy vyšší stupeň purifikace izolované bílkoviny, ale též snížení výtěžku a zvýšení celkových nákladů. Je proto, zejména v provozním měřítku, nutno uvážit, je-li výhodnější použít dva či tři extrakční stupně. Jak již bylo řečeno výše, bílkoviny, které byly v závěrečné fázi převedeny do dolní solné fáze, je nutno odsolit. Je možno použít libovolný způsob odsolení jak o tom pojednává podrobněji kapitola 3.8.2. Extrakci do dvoufázového systému lze s výhodou zařadit jako krok následující po srážení polyethylenglykolem (viz kap. 2.1.1). K odseparované polyethylenglykolové sraženině se přidá příslušné množství vody a soli tak, aby se vytvořil dvoufázový systém. Tím se odseparuje PEG od izolované bílkoviny. Některé bílkoviny se pevně váží na PEG. Tyto bílkoviny nelze uvedeným způsobem purifikovat. Závěrem lze říci, že extrakce dvoufázovým vodným systémem se ukázala být velice šetrnou, pružnou a efektivní metodou pro izolaci biologicky aktivních látek. V případě bílkovin je pak velice snadno převeditelná i do provozního měřítka.

20

2.2 Membránové procesy Membránové procesy jsou separační techniky, které využívají k separacím polopropustné membrány. Polopropustné membrány umožní průchod malých molekul, zatímco velké molekuly zůstanou nad membránou. Mezi membránové procesy řadíme dialýzu a elektrodialýzu, reverzní osmózu (hyperfiltraci), ultrafiltraci a mikrofiltraci.

Membránové filtry Polopropustné membrány jsou nejdůležitější složkou membránových procesů. Membrány se používají pro speciální případy filtrací již dlouhou dobu (např. pro klarifikace nebo sterilizace ve farmaceutickém průmyslu). Pro tyto účely se používají mikroporézní membrány; jsou to membrány s malými póry, u nichž je definována nejmenší velikost pórů. Průměr pórů se pohybuje od 0,025 μm až po několik mikrometrů. Jsou to obvykle rigidní filtry, tvořené různými polymerními materiály. Zadržují bakterie, koloidy a částice s průměrem větším než 0,1μm. Separace je založena výhradně na velikosti částic s tím, že k zadržení dojde buď na povrchu membrány nebo zachycením uvnitř pórů. V šedesátých letech se na trhu objevil nový typ membrán, tzv. ultrafiltrační membrány (obr.2.4 a obr.2.5). Tyto membrány mají póry řádově menší než mikroporézní membrány a většina z nich se skládá ze dvou odlišných vrstev: z velmi úzké horní vrstvy (0,1 - 1,5 μm silné) s póry o přesně definovaném průměru (0.4 - 40 nm), která je vlastní ultrafiltrační membránou, a z mnohem širší (asi 150 μm) spodní vrstvy s otevřenou houbovitou strukturou, která má převážně podpůrnou funkci. Každá částice, která projde horní vrstvou membrány, prochází pak spodní vrstvou volně a bez zadržení. Takto konstruované membrány se označují jako anizotropní membrány. Mají dvě hlavní výhody: *křehká ultrafiltrační vrstva je posílena silnou spodní podpůrnou vrstvou *vzhledem k tomu, že ultrafiltrační vrstva je velice úzká, nemohou se v ní zachycovat ev. krystalizovat procházející částice a velmi malé póry nedovolí procházet větším částicím, které by pak mohly zanášet spodní vrstvu; tím se vylučuje nebo alespoň omezuje zanášení pórů membrány malými částicemi, které způsobuje výrazné snížení průtočnosti membrány (tzv. fouling).

21

Mikroporézní membránový filtr Obr.2.4

Anizotropní ultrafiltrační membrána

Schematické znázornění mikroporézní a anizotropní membrány

Mikroporézní membrána Částice se zachytí na povrchu nebo ve struktuře membrány

Obr.2.5

Anizotropní membrána Vlastní membrána je téměř nepostřehnutelná vrstva na horním okraji

Mikroporézní a anizotropní ultrafiltrační membrána na snímku z elektronového mikroskopu

Prostup separované částice ultrafiltrační membránou je dán velikostí její molekuly resp. hodnotou její molekulové hmotnosti. Jsou konstruovány membrány umožňující průchod molekul v rozmezí molekulových hmotností 100 Daltonů (reverzní osmóza) až 1 000 000 Daltonů (ultrafiltrace). Membrány jsou kategorizovány podle molekulové hmotnosti molekul, které již neprojdou membránou. Taková molekulová hmotnost se označuje jako dělicí rozsah (častěji se používá anglický výraz cut off). Výrobci garantují, že 90 % molekul o molekulové hmotnosti rovnající se dělicímu rozsahu neprojde membránou. Průchod membránou může totiž být ovlivněn též tvarem a nábojem molekuly. Přesné určení dělicího rozsahu je komplikováno i tím, že 22

tisícinásobná změna molekulové hmotnosti znamená jen asi desetinásobnou změnu v průměru molekuly (bráno z hlediska ideálního, t.j. kulovitého tvaru molekuly), což v praxi znamená, že změní-li se dělicí rozsah membrány tisíckrát, změní se velikost pórů v membráně pouze desetkrát. Dělicí rozsah pro polynukleotidy (DNA, RNA) je definován odlišně, protože polynukleotidy mají při stejné molekulové hmotnosti ve srovnání s bílkovinami otevřenější terciární strukturu. Retence proto závisí především na počtu nukleotidů v polynukleotidovém řetězci. Dělicí rozsah pro nukleové kyseliny je minimální počet nukleotidů, které musí obsahovat jedno- nebo dvouvláknový řetězec, aby byl membránou zadržen z 90 %. Až donedávna byl převládajícím materiálem k výrobě ultrafiltračních membrán acetát celulózy. Ultrafiltrační membrány z acetátu celulózy sice vykazují dobré separační vlastnosti i průtokové charakteristiky, jejich nevýhodou však je nízká tepelná stabilita (jen 15 - 30 oC) a malá stabilita vůči pH (pH 3 - 6), což omezuje jejich čištění a sanitaci. Dnes jsou vedle celulosy k disposici polymerní materiály s výhodnějšími provozními vlastnostmi. Vyrábějí se membrány polysulfonové, polyvinylidendifluoridové a polyamidové. Nejčastěji se používají polysulfonové materiály, které mají výbornou chemickou kompatibilitu a jsou stálé v široké oblasti pH. Charakteristika membrán zahrnuje tyto údaje: a) Dělicí rozsah - pro ultrafiltraci

udává nejmenší molekulovou hmotnost, kterou je

membrána schopna zadržet (označuje se NMWL - nominal molecular weight limit - nebo též MWCO -molecular weight cut off). Pro nukleové kyseliny je to počet nukleotidů, který musí obsahovat fragment nukleové kyseliny, aby byl zadržen membránou (označuje se NCO). V případě reverzní osmózy udává dělicí rozsah procenta zadržení NaCl. b) Průtočnost membrány na vodu - objem vody procházející membránou při definované teplotě a tlaku za časovou jednotku. c) Rozsah povolených pracovních teplot, tlaků a pH. d) Odolnost membrán proti sanitárním prostředkům jako je peroxid vodíku, chlornan sodný, formaldehyd. Doporučený čisticí a sanitární postup. e) Odolnost membrán vůči organickým rozpouštědlům, uhlovodíkům, fenolům apod. f) Specifický výkon při zpracování definovaného produktu při určitém stupni zahuštění udává se jako specifický průtok permeátu při konstantní teplotě, tlaku a průtokové rychlosti na straně koncentrátu. g) Životnost membrán v trvalém provozu - bývá 1 - 2 roky.

23

Dialýza Dialýza je difuzní proces, při němž molekuly z roztoku na jedné straně membrány přecházejí do roztoku, který je na opačné straně membrány (tzv. dialyzát). Složky roztoku jsou navzájem separovány podle schopnosti prostoupit membránou, tedy podle velikosti molekuly. Hnací silou tohoto procesu je rozdíl koncentrací malých molekul na vnitřní a vnější straně membrány. Rychlost průchodu molekul membránou, tj. z původního roztoku do dialyzátu, je přímo úměrná koncentraci a nepřímo úměrná molekulové hmotnosti procházejících molekul. V okamžiku, kdy se koncentrace procházejících molekul na obou stranách membrány vyrovná, průchod membránou se zastaví. Dialýza slouží zejména k odstraňování malých molekul z roztoků makromolekul (např. k odsolování), proto póry v membráně musí být menší než jsou rozměry makromolekul. K dosažení co nejlepšího výsledku je vhodné uspořádat dialýzu tak, aby kapalina na vnější straně membrány proudila. Pak nemůže dojít k ustavení rovnováhy mezi vzorkem a dialyzátem, protože malé molekuly prošlé membránou jsou okamžitě odplavovány a odstraňování molekul z původního roztoku může pokračovat. Je však třeba mít na zřeteli, že některé biomolekuly, např. bílkoviny, jsou při velmi nízkých iontových silách málo stabilní, proto se doporučuje jako dialyzát použít místo pouhé vody tlumivý roztok o nízké iontové síle, jehož výhodou je i definované pH. V laboratorním měřítku se dialýza často provádí v membránových trubicích, které se po naplnění dialyzovaným roztokem na obou stranách uzavřou a vloží do nádoby s promývacím roztokem (dialyzátem) (viz obr.2.6). Promývacím roztokem je třeba míchat, aby nedocházelo ke zpomalování procesu v důsledku místního zvýšení koncentrace malých molekul v dialyzátu. Odstranění malých molekul z roztoku trvá několik hodin; v laboratořích se dialýza provádí obvykle přes noc. Protože molekuly rozpouštědla mají schopnost prostupovat membránu i v opačném směru, tj. z vnější strany na vnitřní, je při dialýze vždy třeba počítat s naředěním. V laboratoři může dialýza sloužit i k zvýšení koncentrace makromolekul v roztoku. Dialyzační trubice se obalí vhodným vysoušedlem, které nemůže proniknout přes membránu dovnitř. Voda difunduje z trubice ven a je absorbována vysoušedlem, takže dochází ke zvýšení koncentrace makromolekul uvnitř dialyzační trubice (viz kap.3.6).

24

Obr.2.6

Oddělení malých molekul pomocí dialýzy v dialyzační trubici

Elektrodialýza Při elektrodialýze je hnací silou procesu pohyb nabitých iontů v elektrickém poli. Účinkem stejnosměrného proudu jsou z roztoku odděleny molekuly nesoucí náboj, pouze však ty, které jsou schopny projít membránou. Molekuly, které nenesou náboj, se nepohybují, proto neprocházejí membránou i kdyby jim to jejich velikost dovolovala. Elektrody, v jejichž směru se nabité ionty pohybují, jsou umístěny na vnější straně membrány, takže ion musí při elektrokinetickém pohybu membránu překonat. Zařízení pro elektrodialýzu se skládá z dvou typů membrán s rozdílnou selektivitou vzhledem k propustnosti pro kationty a anionty. Kationaktivní iontově selektivní membrána je membrána, propustná pouze pro kationty, anionaktivní iontově selektivní membrána pouze pro anionty. V elektrodialyzéru, kde se elektrodialýza provádí, jsou oba typy membrán řazeny střídavě. Z hlediska hydrodynamického průtoku je uspořádání membránových dvojic paralelní, zatímco elektrické zapojení membránových dvojic je seriové. Membrány jsou odděleny membránovými separátory opatřenými tenkými průtokovými kanálky, které zajišťují turbulentní tok v prostoru mezi membránami, takže dialyzovaný roztok je intenzívně promícháván. Tím je zajištěno, že rychlost elektrodialýzy není omezována difuzí. Sestava

25

membrán je konstrukčně uspořádána v nosném rámu. Celkové uspořádání připomíná svým průtokovým systémem kalolis.

Obr.2.7

Schéma uspořádání anionaktivních a kationaktivních membrán při elektrodialýze

V zařízení pro elektrodialýzu rozlišujeme dva typy prostorů:

koncentrační a

zřeďovací (viz obr.2.7). V koncentračním prostoru se shromažďují ionty s opačným nábojem. Jejich vstup do tohoto prostoru ve směru migrace iontů ve stejnosměrném elektrickém poli souhlasí s propustností iontově selektivního páru membrán, tj. dvojice kationaktivní anionaktivní membrána. Další pohyb iontů z koncentračního prostoru je omezen toutéž dvojicí membrán. Kation pohybující se směrem ke katodě prošel kationaktivní membránou, jeho další pohyb je zastaven anionaktivní membránou nepropustnou pro kationty. Anion pohybující se směrem k anodě vstoupil do koncentračního prostoru přes anionaktivní membránu, ale jeho další pohyb ve směru stejnosměrného elektrického pole je zastaven kationaktivní membránou, propustnou pouze pro kationty. V koncentračním prostoru proto vzrůstá koncentrace iontů, které tam přicházejí ze sousedních zřeďovacích prostorů. Koncentrovaný roztok solí nebo jiných nízkomolekulárních látek nesoucích náboj se z koncentračních prostorů kontinuálně vymývá vodou. Likvidace roztoku z koncentračních prostorů může činit problémy z hlediska solnosti odpadních vod. Elektrodialýza se nejčastěji používá pro odsolování a deacidofikaci (odstraňování kyselin) roztoků. Jedním cyklem lze při elektrodialýze dosáhnout odsolení z 10 - 35 %. Pro vyšší stupeň odsolení musí odsolovaný roztok v elektrodialyzéru recirkulovat, a to pomocí čerpadla napojeného na recirkulační tank. Prakticky lze při použití elektrodialýzy dosáhnout odsolení až z 99 %. Spotřeba elektrické energie na odstranění 1 kg soli činí obvykle

26

0,8 - 1 kWh. Z hlediska spotřeby elektrické energie je výhodné roztoky před elektrodialýzou koncentrovat, aby se snížil jejich ohmický odpor. Zajímavé je srovnání energetických nákladů při odsolení do různého stupně, které jsou uvedeny v následující tabulce:

Odsolení % 50 75 90

Náklady 0,5 1,0 2,0

Znamená to, že vezmeme-li jako základ náklady na 75 % odsolení, náklady na 50 % odsolení jsou poloviční, náklady na 90 % odsolení dvojnásobné. Elektrodialýza má poměrně široké využití v praxi. Používá se např. k odsolování mořské vody, k purifikaci aminokyselin, při izolaci enzymů a v nedávné době se začala ve velkém měřítku aplikovat pro odsolování syrovátky pro účely kojenecké a dětské výživy.

Reverzní osmóza Reverzní osmóza (hyperfiltrace, RO) a ultrafiltrace (UF) jsou membránové procesy, které používají ultrafiltrační anizotropní membrány. Hnací silou obou těchto procesů je tlakový rozdíl na opačných stranách membrány. Roztok, který při reverzní osmóze a ultrafiltraci zůstane nad membránou, se nazývá retentát (též koncentrát); roztok, který projde na opačnou stranu membrány je permeát (nebo hyperfiltrát pro RO a ultrafiltrát pro UF). Při reverzní osmóze se používají membrány s velice malými póry (maximálně 0,4 nm), kterými procházejí pouze molekuly rozpouštědla. K průchodu rozpouštědla takto malými póry je ovšem třeba relativně vysokých tlaků (2,7 - 10,4 MPa), které jsou zajišťovány vysokotlakými čerpadly. Vysoký pracovní tlak vyplývá z nutnosti překonat osmotický tlak rozpuštěných složek v roztoku. Jestliže pro osmotický tlak uvažujeme v nejjednodušším případě platnost van't Hoffova zákona π = (RT / Mr) c

27

(4)

pak osmotický tlak π je přímo úměrný koncentraci rozpuštěné složky c a nepřímo úměrný molekulové hmotnosti Mr této složky. Při reverzní osmóze se od molekul rozpouštědla odseparují i malé molekuly a ionty, např. soli. Membrány pro reverzní osmózu jsou schopny zachytit 90 - 99 % rozpuštěných látek. Procento zadržení NaCl určuje dělicí rozsah membrány. Účinek reverzní osmózy je blízký odstraňování rozpouštědla odpařováním. Oba procesy bývají často srovnávány z hlediska ekonomiky: reverzní osmóza je ekonomičtější než odpařování jestliže má být dosaženo maximálně 20 - 30 % koncentrace sušiny. Při požadavku na vyšší zakoncentrování je ekonomičtější používat odparky. Reverzní osmóza však má oproti odpařování velkou výhodu v tom, že odstranění rozpouštědla probíhá při nízkých teplotách, které mohou být voleny tak, aby nepřesáhly hranici termostability izolovaných složek s biologickou aktivitou. Protože při vysokých tlacích dochází ke zvyšování teploty, doporučuje se zařadit do výrobní linky průtokový chladič. Reverzní osmóza může být za určitých okolností použita i k odsolení resp. odstranění nízkomolekulárních látek, a to tehdy, chceme-li připravit čisté rozpouštědlo. Např. odstraňování solí z mořské vody s cílem získat pitnou vodu může být uskutečněno reverzní osmózou. V tomto případě můžeme reverzní osmózu srovnávat s elektrodialýzou nebo s chromatografií na měničích iontů.

Ultrafiltrace Ultrafiltrace je další membránová metoda, která pracuje na obdobném principu jako reverzní osmóza. Hnací silou procesu, jak jsme již uvedli, je tlakový rozdíl na opačných stranách membrány. Na rozdíl od reverzní osmózy pracují ultrafiltrační zařízení při nižšm provozním tlaku (0,1 - 1 MPa), který je nižší než osmotický tlak. Velikost pórů v ultrafiltrační membráně se pohybuje od 1 do 40 nm, takže tyto membrány jsou propustné i pro nízkomolekulární látky, resp. pro látky s nižší molekulovou hmotností. Ultrafiltraci lze proto použít pro odstranění malých molekul (solí), ale i k částečné separaci ostatních molekul na základě jejich velikosti. Membrány pro ultrafiltraci se vyrábějí s různě velikými póry (vždy přesně definovanými), takže jsou propustné pro různě velké molekuly. Zadržení (retence) ultrafiltrační membránou závisí na poměru molekul, které prostoupí membránou a které jsou membránou zadrženy. Můžeme ji vyjádřit vztahem:

28

R = 1 - cp / cr

(5)

R = retenční koeficient cp = koncentrace molekul v roztoku, který prošel membránou (tzv. permeát) cr = koncentrace roztoku nad membránou (tzv. retentát) Protože membránou procházejí molekuly rozpouštědla, snižuje se objem roztoku nad membránou a koncentrace molekul, které nemohou membránou projít, se zvyšuje. U molekul, jejichž reteční koeficient je roven 1, tj. takových, které membránou vůbec neprocházejí, je koncentrační proces přímo úměrný snižování objemu nad membránou. Tzn. sníží-li se objem nad membránou na 50 % původního objemu, koncentrace zadržených molekul stoupne dvakrát. Jestliže však bude retence určité složky pouze 40 % (R = 0.4), pak dvojnásobné zvýšení koncentrace této složky bude vyžadovat snížení objemu o 82 %. Jestliže se R = 0 (volně průchozí materiál), pak koncentrace tohoto materiálu v permeátu i retentátu bude stejná. cf / c0 = R (V0 / Vf)

(6)

cf = konečná koncentrace složky nad membránou c0 = počáteční koncentrace složky V0 = počáteční objem vzorku Vf = konečný objem retentátu Je třeba upozornit, že vztah (6) platí jen v ideálním případě. Protože v praxi je třeba počítat s některými nepříznivými vlivy, o nichž bude pojednáno později, je situace v praxi vždy komplikovanější. Z výše uvedeného vztahu je zřejmé, že malé molekuly, které volně procházejí membránou, nemohou být z roztoku úplně odstraněny, ale jejich skutečný obsah se snižuje v poměru ke snížení objemu. Znamená to, že se snížením objemu např. o 90 % projde membránou i 90 % malých molekul, avšak jejich koncentrace v permeátu a retentátu bude stejná. Chceme-li provést další odsolení, musíme retentát naředit, čímž se sníží koncentrace v něm přítomných látek, ale současně se zvětší objem. Následným snížením objemu průchodem membránou pak opustí retentát další malé molekuly. Takto můžeme pokračovat až do požadované koncentrace malých molekul (solí) v retentátu. Tento opakovaný postup se označuje jako diafiltrace. 29

Diafiltrace je vzhledem k efektu procesu kombinací ultrafiltrace a dialýzy. Jde o zvláštní uspořádání ultrafiltrace, kdy při určitém stupni koncentrace se k retentátu přidá voda a pokračuje se v další koncentraci. Přídavek vody k retentátu s následnou ultrafiltrací umožňuje snížit koncentraci těch nízkomolekulárních složek roztoku, které procházejí membránou. Dosáhne se tím podobného efektu jako při dialýze s tím rozdílem, že se současně zvýší koncentrace vysokomolekulárních složek. Použití ultrafiltrace ev. diafiltrace umožňuje provádět více operací při izolaci biologicky aktivních látek. Jde především o odstraňování malých molekul z roztoku makromolekul (zejména odsolování), o odstraňování detergentů a kyselin, dále o výměnu pufrů. Pomocí ultrafiltrace je možno provádět částečnou separaci biomakromolekul, pokud se od sebe liší molekulovou hmotností, a je možno zvyšovat koncentraci makromolekul v roztoku (zahušťování). Ultrafiltrace se tak stává užitečným pomocníkem při izolaci bílkovin, enzymů, nukleových kyselin a při pochodech s těmito biomakromolekulami svázanými (např. PCR - polymerasová řetězová reakce).

Obr.2.8

Schema enzymového ultrafiltračního reaktoru 1 - cirkulační tank s náplní substrátu a enzymu 2 - ultrafiltrační zařízení

Ultrafiltrace se používá i k racionalizaci enzymově katalyzovaných reakcí. K tomu slouží tzv. ultrafiltrační enzymové reaktory (obr.2.8). Základem těchto reaktorů je vsádkově pracující ultrafiltrační zařízení, které je napojené na cirkulační tank. Do prostoru nad membránou se z cirkulačního tanku přetahuje roztok enzymu a substrátu, takže během ultrafiltrace probíhá též enzymová reakce. Produkty této reakce kontinuálně přecházejí do permeátu, čímž se současně posunuje reakční rovnováha ve prospěch tvorby produktů enzymové reakce. Retentát se po určité době vrací do cirkulačního tanku, kde se smísí s novou dávkou enzymu a substrátu a ultrafiltrace může pokračovat. Předpokladem použití

30

tohoto reaktoru však je, aby molekulová hmotnost substrátu byla nad dělicím rozsahem membrány a molekulová hmotnost produktu pod ním.

Mikrofiltrace Jako mikrofiltrace se označuje skupina poměrně nových technik, které pracují jak s mikroporézními membránami tak s membránami anizotropními a jsou upraveny na zpracování malých objemů. Mohou se používat k odsolování, zahušťování, částečné frakcionaci roztoků biomolekul, ale i k odstraňování

mikroorganismů s cílem sterilace

roztoků a k odstraňování buněčných fragmentů po dezintegraci buněk. Membrány obvykle tvoří dno plastových nádobek či kolonek, které jsou uzpůsobeny buď tak, aby se mohly vložit do odstředivky, nebo aby je bylo možno napojit na injekční stříkačku (obr.2.9 a obr.2.10). Do nádobky se umístí roztok určený k mikrofiltraci a částice, jejichž molekulová hmotnost leží pod dělicím rozsahem membrány, projdou membránou. V prvém případě dochází k průchodu membránou pod vlivem odstředivé síly, v druhém případě se tlak zvyšuje stlačováním pístu injekční stříkačky. Mikrofiltrace našla velkou oblibu a značné použití mezi pracovníky laboratoří, neboť umožňuje pracovat s minimálními objemy a s velmi malými ztrátami. Na trhu je značný výběr pomůcek s různými typy membrán, takže je možno vybrat typ, který vyhovuje cíli, jehož chceme mikrofiltrací dosáhnout.

Faktory limitující použití membránových procesů Membránové technologie se v posledních letech dočkaly zásadních pokroků, které umožnily jejich značné rozšíření, a to i do výrobní sféry. Přesto se dosud nepodařilo úplně odstranit některé jevy, které jejich použití omezují. Jsou to především koncentrační polarizace a již dříve zmíněné zanášení vnitřních pórů (fouling). Oba tyto jevy jsou závislé na povaze separovaných molekul, na charakteru použitých membrán a jejich umístění, na dynamice průtočného systému a na použitém tlaku.

31

Obr.2.9

Mikrofiltrační kolonka pro práci v centrifuze

Obr.2.10

Mikrofiltr spojený s injekční stříkačkou

Při ultrafiltraci je roztok pod tlakem nucen procházet membránou. Velké molekuly, které jsou při ultrafiltraci membránou zadrženy, se nad membránou koncentrují a mohou se na membráně usazovat a vytvářet gelovitou vrstvu. Tato vrstva pak působí jako druhý filtr, ovšem bez řízeného dělicího rozsahu. Tento jev je znám jako koncentrační polarizace (obr.2.11). V jeho důsledku klesá průtočnost membrány a mění se i dělicí rozsah v tom smyslu, že menší molekuly, které by podle původního dělicího rozsahu bez problémů prošly membránou, jsou zadrženy. Dělicí rozsah tedy rovněž nekontrolovatelně klesá. Protože se koncentrační polarizace do jisté míry projevuje u všech ultrafiltrací, nemůže separace ultrafiltrací zcela nahradit gelovou permeační chromatografii, která je rovněž založena na

32

separaci molekul na základě jejich velikosti. Ke spolehlivému oddělení dvou různě velkých molekul ultrafiltrací je nutné, aby molekulová hmotnost jedné byla pěti- až desetinásobkem druhé. Efekt koncentrační polarizace je možné minimalizovat zpětnou difuzí zadržených molekul z povrchu membrány. Nejčastěji se v laboratorních ultrafiltračních celách rozrušuje gelovitá vrstva nad membránou mícháním. Ultrafiltrační cela musí být konstruována tak, aby se míchadlo při svém pohybu lehce dotýkalo povrchu membrány avšak membránu neporušilo. Míchání mívá při snižování koncentrační polarizace v laboratorních ultrafiltračních celách dobré výsledky, avšak v provozním měřítku je naprosto nedostačující. Proto se zavádí jiný způsob rozrušování usazené vrstvy, a to filtrace za tangenciálního toku (TFF - tangencial flow filtration) (obr.2.12). Čerpadla ženou roztok do zařízení ve směru rovnoběžném s membránou a tlak nad membránou umožňuje průtok membránou v kolmém směru.

Obr.2.11

Koncentrační gradient během polarizace CB = koncentrace makromolekul v roztoku CG = koncentrace makromolekul v gelovité vrstvě B

Zatímco při koncentrační polarizaci se velké molekuly pouze hromadí na povrchu membrány a mohou být setřeny, při dalším jevu, kterým je zanášení membrány (fouling), se separované částice váží na membránu nebo jsou fyzikálně zachyceny v její porézní struktuře a nelze je pouhým průtokem odstranit. Zabránit tomuto zanášení lze pouze nastavením vhodných parametrů celého procesu ev. vyloučením takových systémů, které membránu nevratně znečišťují.

33

tvorba gelovité vrstvy

Obr.2.12

tangenciální tok umožňuje zpětnou difuzi usazené vrstvy

Koncentrační polarizace a její rozrušení tangenciálním tokem

Membránové procesy, které užívají anizotropní membrány, zejména reverzní osmóza a ultrafiltrace, jsou citlivé na přítomnost mechanických nečistot, které by filtry mechanicky zanášely a současně by znečišťovaly retentát. Zpracovávané roztoky proto nesmějí obsahovat částice větší než 200 μm. I voda, která se používá při diafiltraci, musí odpovídat těmto požadavkům. Proto je často nutné před ultrafiltraci nebo reverzní osmózu zařadit odstřeďování či filtraci.

Filtrační systémy pro membránové filtrace Membránové procesy se provádějí v různých zařízeních, která se liší podle typu membránového procesu, ale též podle toho, bude-li proces prováděn v laboratorním, poloprovozním či provozním měřítku. Nejjednodušší jsou laboratorní dialýzy, kdy se obvykle vystačí s dialyzační membránovou trubicí, vhodnou nádobou a míchadlem. Elektrodialyzéry, jak bylo uvedeno v části o elektrodialýze, jsou již zařízení komplikovanější. Využívají převážně plošné dialyzační membrány, v provozním měřítku obvykle uspořádaných do rámů. Klasické zařízení pro laboratorní ultrafiltraci, skládající se z míchané ultrafiltrační cely, míchadla a zařízení umožňující nastavit tlakové rozdíly na vnitřní a vnější straně membrány (obvykle napojení horní části cely - části nad membránou - na tlakovou lahev s dusíkem), rovněž používá plošné membrány, převážně však membrány anizotropní (viz obr.2.16a). Použití těchto membrán ve větším měřítku vyžaduje čerpadla umožňující tangenciální tok, aby se zmenšilo nebezpečí koncentrační polarizace.

34

Obr.2.13

Membrána ve formě dutého vlákna. Vlastní ultrafiltrační membrána je na vnitřním povrchu. Snímek z elektronové mikroskopie.

Novějším přístupem k ultrafiltracím, a to laboratorním, ale zejména poloprovozním a provozním, je použití membrán ve tvaru dutých vláken (hollow fibres). Jsou to cylindrická vlákna s vnitřním průměrem obvykle 0,5 - 1 mm, tvořená anizotropní nejčastěji polysulfonovou membránou, která je na vnitřní straně vlákna (obr.2.13). Při ultrafiltraci protéká roztok dutým vláknem, molekuly s hmotností pod dělicím rozsahem membrány projdou vláknem současně s permeátem a retentát s koncentrujícími se makromolekulami proudí dále vláknem.

35

Obr.2.14

Patrony s dutými vlákny v paralelním uspořádání

Dutá vlákna se umísťují do polymerních obvykle průhledných trubic a distribuují se ve formě "patron", které obsahují velké množství dutých vláken. Vlákna jsou v patronách umístěna buď rovnoběžně, nebo stočená do spirály (obr.2.14, 2.15 a 2.16b). Roztok se čerpá do patron pod tlakem, čímž je zajištěn tlakový rozdíl po opačných stranách membrány. Permeát se odvádí z mezivláknových prostor a retentát vytéká z patrony na konci dutých vláken. Ultrafiltrace v dutých vláknech má řadu výhod, hlavní však je ta, že tok retentátu membránovým vláknem minimalizuje usazování makromolekul a tedy i koncentrační polarizaci.

Obr.2.15

Konstrukce patron se spirálovitě uspořádanými dutými vlákny

36

Obr.2.16

Zařízení pro ultrafiltraci a) s plošnými filtry (laboratorní měřítko) b) s patronou s dutými vlákny

2.3 Chromatografické metody Chromatografické metody zaujímají jedno z nejvýznamnějších míst mezi moderními separačními technikami. Spolu s elektromigračními metodami totiž umožňují separaci velice složitých směsí a získávání jednotlivých složek směsi ve velice čistém až homogenním stavu. Některé separační metody byly známy již v dávných dobách, např. sedimentace, extrakce, srážení, krystalizace apod. Tyto klasické metody však nejsou dostačující k dělení složitých směsí látek značně podobných s jakými se setkáváme např. v přírodním materiálu (směsi biopolymerů, aminokyselin, peptidů, nukleotidů apod.). Na rozdíl od těchto klasických separačních technik, založených zejména na fázových separacích, je frakcionace látek při chromatografii dána rozdílnou pohyblivostí jednotlivých složek směsi.

37

Moderní chromatografické techniky slouží nejen k preparativním účelům, ale i k účelům analytickým. Prostřednictvím chromatografických technik je možno získat kvalitativní i kvantitativní informace, tzn. kromě určení složení směsi lze stanovit i koncentraci jednotlivých složek. Pro úplnou identifikaci je však nezbytné propojení s dalšími metodami analytické chemie např. hmotnostní spektrometrií, UV-VIS spektrometrií apod. Základním obecným principem všech chromatografických technik je nestejnoměrné rozdělování složek směsi mezi stacionární a mobilní fázi. Výsledkem je rozdílná rychlost migrace rozpuštěných látek. Chromatografické metody se liší podle principů, na jejichž základě k dělení látek dochází. Nejčastěji se setkáváme s dělením chromatografických technik podle charakteru fází na plynovou chromatografii (GC) a kapalinovou chromatografii (LC). Zatímco plynová chromatografie pracuje v systému plyn-pevná látka nebo častěji plyn-kapalina, kapalinová chromatografie pak v systému kapalina-kapalina (LLC) nebo pevná látka-kapalina (LSC). Přesné rozdělení chromatografických metod není vždy jednotné, neboť někdy se při separaci uplatňuje více mechanismů, jindy zase není podstata separačního procesu zcela objasněna. V tab.1 je uvedeno základní rozdělení chromatografických technik podle skupenství mobilní fáze a dále podle separačního mechanismu. Rozsah působnosti chromatografických metod je velmi široký a spolu s metodami elektroforetickými a dalšími separačními technikami prakticky pokrývají celou škálu velikosti částic od plynů až po živé buňky (viz Schema 1).

Schema 1

Přehled využití separačních technik

38

GC - plynová chromatografie, HPLC - vysokoúčinná kapalinová chromatografie, GPC - gelová chromatografie, IC - iontová chromatografie, ITP - izotachoforesa, EP - elektroforesa, FFF - frakcionace průtokem silového pole

Tabulka 1 Přehled nejdůležitějších chromatografických metod mobilní fáze

plyn

separační mechanismus síťový efekt adsorpce rozdělování síťový efekt adsorpce

kapalina

rozdělování chemisorpce specifické interakce biomolekul

metoda plynová chromatografie na molekulových sítech plynová adsorpční chromatografie plynová rozdělovací chromatografie gelová permeační chromatografie kapalinová adsorpční chromatografie kapalinová rozdělovací chromatografie iontová výměnná chromatografie afinitní chromatografie

užívaná zkratka GSC

GLC GPC LSC LLC IEC

2.3.1 Teorie chromatografie Podstatou chromatografického procesu je distribuce složek mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je označována jako mobilní a druhá jako stacionární. Zatímco fáze pohyblivá (plyn nebo kapalina) je označována jako mobilní fáze bez ohledu na skupenství, fáze nepohyblivá - stacionární - může mít v různých typech chromatografií velmi rozdílnou formu (např. částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry). Proto byl zaveden pojem sorbent a to pro jakoukoli formu stacionární fáze. Během chromatografického dělení dochází k opakovanému transportu složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní. Přitom se chromatografický systém natolik přiblíží rovnováze, že distribuci složky mezi dvě fáze lze popsat distribuční (rozdělovací) konstantou K, která vyjadřuje poměr koncentrace složky ve stacionární fázi (cs) ku koncentraci složky ve fázi mobilní (cm). K = cs / cm

39

(7)

Rychlost s jakou se daná složka pohybuje kolonou je dána právě rozdělovacím koeficientem K. Obr. 2.17 ukazuje, jakým mechanismem dochází k separaci směsi o třech složkách během LC chromatografie.

Obr. 2.17

Průběh separace třísložkové směsi při kapalinové chromatografii

Na kolonu je nanesena směs, obsahující tři složky. V důsledku průtoku rozpouštědla (mobilní fáze) kolonou se molekuly pohybují a jsou-li podmínky separace optimální budou se složky od sebe dělit, protože rychlost migrace složek je odlišná. Různý pohyb vyplývá z rovnovážného rozdělení molekul mezi stacionární a mobilní fázi. Doba, kterou molekula dané složky setrvá na povrchu sorbentu závisí na velikosti interakce mezi složkou a sorbentem a určuje pořadí v jakém složka vychází z kolony. Čím je interakce větší, tím složka později vychází - má větší retenční čas. Na výstupu z kolony pak složky vycházejí odděleně. Má-li mít složka dostatečný retenční čas, je třeba aby byla rozpustnost dané složky ve stacionární fázi podstatně vyšší než ve fázi mobilní. Přístroje na nichž se chromatografické separace provádějí se nazývají chromatografy (obr.2.18). Jejich důležitou součástí je detektor, který danou složku vycházející z kolony deteguje a signál přenáší na zapisovač. Jako výsledek pak získáme záznam chromatografie-

40

chromatogram

(obr.2.19).

Křivkám,

znázorňujícím

separované

chromatografické vlny, eluční pásy nebo slangově píky.

Obr.2.18

Základní vybavení pro kapalinovou chromatografii firmy LKB

Vzorek: Kolona: Průtok: Teplota: Detekce:

Hydrolyzát aminokyselin Pico-Tag (reverzní fáze) 1 ml/min 38°C 254 nm

41

složky,

říkáme

Obr.2.19

Ukázka chromatogramu. Dělení směsi aminokyselin chromatografií na reverzní fázi

V chromatografii jsou definovány určité pojmy a parametry, které je třeba znát. Základem chromatografického dělení je různá velikost interakce analyzovaných látek se stacionární fází v koloně. Látka, která za daných podmínek nemá ke stacionární fázi žádnou afinitu, je po celou dobu separace rozpuštěna v mobilní fázi a z kolony vyjde v čase tm - mrtvý retenční čas - od okamžiku nástřiku. Mrtvý retenční čas je tedy retenční čas složky, která není v koloně zadržována. Ostatní látky vycházejí z kolony s retenčními časy tr, delšími než je tm. Každému retenčnímu času přísluší i retenční (eluční) objem Vr. Mrtvému retenčnímu času odpovídá mrtvý retenční objem Vm, který je ve většině případů totožný s objemem mobilní fáze v koloně VM. Jako míra zpoždění látek - retence - zadržovaných stacionární fází kolony se používá faktor k, definovaný vztahy k = ns / nm

(8a)

k = (tr-tm) / tm

(8b)

tr = retenční čas složky tm = mrtvý retenční čas ns = látkové množství složky ve stacionární fázi nm = látkové množství složky v mobilní fázi Tato veličina se označuje jako kapacitní faktor (kapacitní poměr), což je poměr látkového množství dané složky ve stacionární (ns) a mobilní fázi (nm). Kapacitní poměr lze rovněž spočítat z chromatogramu a znamená

poměr doby, kterou průměrná molekula

separované látky stráví ve stacionární fázi, k době strávené ve fázi mobilní. Hodnotu kapacitního poměru lze ovlivnit výběrem mobilní fáze, případně i teplotou. Pro danou

42

kolonu, danou složku a za konstantních podmínek by však měl být kapacitní poměr konstantní. Kapacitní faktor lze definovat pomocí základních termodynamických parametrů chromatografie jako k = K (VS / VM)

(9)

K = rozdělovací koeficient dané složky VM = objem mobilní fáze v koloně VS = objem stacionární fáze v koloně Z této rovnice je patrné, že kapacitní faktor pro danou látku závisí především na povaze stacionární a mobilní fáze a jejich vzájemném poměru. Na rozdíl od tr nezávisí kapacitní faktor

na průtokové rychlosti eluentu ani na rozměrech kolony. Je to tedy

nejvhodnější veličina pro kvalitativní identifikaci elučních pásů v chromatografii. Chromatografické dělení probíhá na základě proudění kapaliny v koloně a proto i hydrodynamické parametry ovlivňují úspěšnost procesu. Z přímého stanovení resp. měření může být stanoven objemový průtok mobilní fáze. Tato veličina však není dostatečná jako charakteristika proudění a proto je určující veličinou lineární rychlost mobilní fáze. Ta je však místně proměnlivá. Průměrnou lineární rychlost mobilní fáze (u) v celé koloně o délce L je nejvýhodnější definovat pomocí tm jako: u = L / tm

(10)

L = délka kolony tm = mrtvý retenční čas Libovolná složka A, která je v koloně zadržována, postupuje kolonou lineární rychlostí uA uA = L / trA L = délka kolony trA = retenční čas složky A

43

(11)

Poměr lineárních rychlostí uA / u je označován jako retardační faktor RF a vyjadřuje pravděpodobnost, že molekula složky A se nachází v mobilní fázi. RF = uA /u = 1/(1+k)

(12)

Pokud bude molekula trvale v mobilní fázi bude RF→1, naopak jestliže molekula setrvá ve stacionární fázi RF→0. Při průchodu kolonou se separované látky nejen vzájemně oddělují, což je účelem, ale zárověň se i zřeďují, což je méně žádoucí. Rozšiřování (rozmývání) elučních pásů látek v koloně je způsobeno třemi vlivy - podélnou molekulární difúzí, rozdíly v místních průtokových rychlostech a odporem vůči převodu hmoty mezi mobilní a stacionární fází. Parametr, označovaný jako účinnost kolony, má vztah k velikosti tohoto rozšiřování; účinná kolona dává užší eluční pásy, tedy pásy s vyšší koncentrací dělené látky, než kolona neúčinná. Eluční křivka (pík), vyjadřující závislost koncentrace analyzované složky na délce migrační dráhy od začátku kolony a analogicky závislost na čase v určitém místě má v ideálním případě tvar Gaussovy křivky a proto se parametry Gaussova rozptýlení hodnot staly základem pro číselné vyjadřování účinnosti kolony. Kvantitativní míra účinnosti je pak vyjádřena jako H = (σt / tr )2 L = (w / tr)2 (L / 16)= (w1/2 / tr)2 (L / 5.54)

(13)

H = výškový ekvivalent teoretického patra σt = rozptyl tr = retenční čas w = šířka píku u základny (w = 4σ) L = délka kolony w1/2 = šířka píku v polovině výšky (w1/2 = 2.35σ) Tradičně se tato veličina označuje jako výškový ekvivalent teoretického patra (čím je H menší, tím je kolona účinnější). Celé koloně se pak připisuje účinnost pomocí tzv. počtu teoretických pater N, definovaného

44

N = L / H neboli N = 16 (tr / w)2 = 5.54 (tr / w1/2)2

(14)

Protože v chromatografické koloně ve skutečnosti žádná patra nejsou, je třeba veličiny N a H chápat jako konvencí dohodnutá kriteria pro rozšiřování píků. Veličiny, které byly zatím uvedeny, charakterizují pouze eluční pás jednotlivé látky. Aby bylo možno kvantitativně posuzovat dělení složek ze směsí, je třeba zavést další pojmy. Pro dvojici látek je to rozlišení Rs, což je vzdálenost středů elučních pásů, dělená průměrem šířek obou. Rozlišení je veličina bezrozměrná, větší hodnota Rs znamená lepší separaci a naopak. Rs = (tr2 - tr1 ) / 0.5 (w2 + w1)

(15)

tr2, tr1 = retenční časy složek 1 a 2 w2, w1 = šířky píku u základny Hodnota Rs = 1.5 znamená dokonalé rozlišení obou látek až k nulové linii, Rs = 1.0 je překrytí asi 2%. Obr.2.20 ukazuje separaci dvousložkové směsi jako funkci rozlišení.

Obr.2.20

Separace dvousložkové směsi vzhledem k hodnotě Rs

Pro dvojici látek se dále definuje tzv. selektivita neboli retenční poměr

45

α = k2 / k1

(16)

k1, k2 = kapacitní faktory pro složku 1 a 2 Rozlišení lze pak definovat pomocí základních chromatografických parametrů Rs = 1/4 [(α-1)/α] [K/(1+K)] √N ↓

↓

selektivita

(17)

↓ retence

účinnost kolony

kde K = (k1 + k2) / 2 N = počet teoretických pater α = selektivita Tato rovnice je důležitá, protože vyjadřuje rozlišení jako funkci tří činitelů, z nichž každý lze po dosažení optimálního výsledku ovlivnit celkem nezávisle na dalších dvou. Následující obrázek poskytuje shrnutí vzájemných vztahů všech důležitých veličin, se kterými se setkáváme v kapalinové chromatografii.

kapacitní faktor pro složku 1 separační faktor složek 1 a 2

k1 = (tr1-tm)/tm α1/2 = (tr2-tm)/(tr1-tm) = k2/k1

46

účinnost (počet teoretických pater) N = (tr3/σ)2 = 16(tr3/4σ)2 = 5.54(tr3/√5.54σ)2 = 4(tr3/2σ)2 rozlišení složek 1 a 2 Rs = (tr2-tr1)/0.5(w2+w1) = 1/4 [(α1/2-1)/α1/2] [K/(1+K)] √N Obr.2.21

Parametry kapalinové chromatografie a jejich vztah k základním veličinám

2.3.2 Plynová chromatografie Plynová chromatografie (GC) byla poprvé popsána okolo roku 1950. Stejně jako ostatní typy chromatografií, je i GC metodou separační, při níž se analyzovaná látka rozděluje mezi stacionární a mobilní fázi. Zatímco mobilní fází je vždy plyn, stacionární fázi tvoří nejčastěji kapalina, zakotvená na inertním nosiči. Analyzovaný vzorek je separován vždy v plynné fázi, tzn. všechny složky vzorku musí být definovaným způsobem vypařeny. GC je proto vhodná zejména pro separaci organických látek s bodem varu do 400 °C. GC lze použít i pro analýzu anorganických látek, které však musí splňovat podmínky těkavosti. Pro separaci biomakromolekul není tato metoda vhodná, proto se jí nebudeme podrobněji zabývat a uvedeme pouze základní údaje. Každý plynový chromatograf se skládá v podstatě ze šesti částí: zdroje nosného plynu a zařízení pro jeho regulaci, měření tlaku a zpracování dat zařízení pro dávkování vzorku separační kolony detektoru termostatu zařízení pro registraci signálu z detektoru a zpracování dat Zařízení pro plynovou chromatografii - plynový chromatograf - je znázorněno na obr.2.22.

47

Obr.2.22

Schematické znázornění zařízení pro plynovou chromatografii

Po aplikaci vzorku na kolonu se analyzovaná směs (složky nacházející se jako pára nebo plyn v mobilní fázi) zčásti rozpustí ve stacionární fázi. V ideálním případě jsou její složky eluovány mobilní fází (nosným plynem) s rozdílným retenčním časem. Signál z detektoru je pak po zesílení zaznamenáván registračním zařízením a vyhodnocován. Úkolem mobilní fáze v GC označované jako nosný plyn je transportovat složky vzorku kolonou. Jako mobilní fáze se využívají plyny, které jsou inertní jak k chromatografické náplni kolony, tak i k analyzovanému vzorku. Jedná se zejména o dusík, vodík a helium, při použití ionizačních detektorů s radioaktivním zářičem se jako mobilní fáze používá argon. Nezbytnou součástí každého plynového chromatografu je tzv. dávkovač. Je umístěn těsně u vstupu do kolony, protože musí splňovat následující podmínku: vzorek, zplyněný v malém prostoru, má být okamžitě převeden na kolonu. Aby bylo dosaženo účinné separace, musí být objem dávkovaného vzorku co nejmenší (pro plynné vzorky 0.001 - 1 ml, pro kapalné 0.1-1 µl). Teplota nástřikové komůrky by měla být vyšší, než je bod varu nejméně těkavé složky vzorku. Páry vzorku jsou pak dále nosným plynem přeneseny na kolonu. Podle způsobu konstrukce se dělí kolony na náplňové a kapilární. Kolony jsou vyráběny z různých materiálů (sklo, nerez, ocel), tvar kolony se volí podle typu chromatografu. Kolony mohou být rovné, ve tvaru U nebo šroubovice. V současné době se dává vzhledem k vyšší účinnosti přednost kolonám kapilárním (průměr 0.1 - 0.5 mm, délka 50-100 m). Rychlost pohybu dělených složek v koloně a tím i účinnost separace je závislá na teplotě analýzy, která je volena podle povahy separovaných látek a konstrukčních možností přístroje. Pro konstantní průběh analýzy je třeba zvolenou teplotu udržovat se značnou přesností (±0.1°C), což bývá u většiny moderních komerčních chromatografů zajištěno vhodným materiálem a konstrukcí přístroje. Výstup z kolony je napojen na detektor - zařízení, které převádí signál, vycházející z kolony na registrovatelnou formu (elektrickou veličinu). U plynové chromatografie se

48

používají např. plamenový ionizační detektor (FID), tepelně vodivostní detektor (TCD), detektor elektronového záchytu (ECD) a další. Koncovou jednotkou chromatografu je zařízení, které výstupní signál z detektoru zaznamenává (zapisovač) a vyhodnocuje. Vyhodnocení výsledků se v současné době většinou uskutečňuje pomocí počítačů s příslušným programovým vybavením. Plynová chromatografie je využívána v kvalitativní i kvantitativní analýze. Velmi používané je spojení plynové chromatografie s některou ze spektrálních metod či s hmotnostním spektrometrem, což rozšiřuje možnosti aplikace GC. Při studiu biologicky aktivních látek se GC neuplatňuje jako separační technika, ale při analýze a identifikaci produktů, vznikajících činností biomakromolekul (např. produkty enzymových reakcí apod.).

2.3.3 Kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie je jednou z těch separačních metod, které zaznamenaly největší rozvoj. Kolonová kapalinová chromatografie je současně nejstarší ze všech chromatografických technik (byla objevena již v roce 1906). Metodám kapalinové chromatografie je společné to, že mobilní fázi tvoří kapalina. Stacionární fází je sorbent, který je umístěn buď ve vrstvě (TLC a papírová chromatografie) anebo ve sloupci (kolonové uspořádání). Podle principu separace látek při kapalinové chromatografii rozlišujeme adsorpční chromatografii rozdělovací chromatografii chromatografii na měničích iontů (ionexová chromatografie) Adsorpční chromatografie je založena na různé schopnosti látek v roztoku adsorbovat se na povrch pevné fáze - adsorbentu. V důsledku rozdílné adsorpční afinity složek směsi k adsorbentu dochází k jejich rozdělení mezi stacionární a mobilní fázi a tím k chromatografické separaci. Je to tedy chromatografie v systému pevná látka - kapalina (LSC). 49

Při chromatografii na polárních adsorbentech je sorpce látek důsledkem rozdílných polárních sil, působících mezi povrchem adsorbentu a separovanou látkou a polárních sil, působících mezi povrchem adsorbentu a mobilní fází. Proti systému kapalina-kapalina s polární stacionární fází je hlavní rozdíl v tom, že interakcí se účastní povrch adsorbentu. Protože rozmístění adsorpčních center na povrchu adsorbentu je neměnné, závisejí interakce separovaných látek na geometrickém rozmístění jejich funkčních skupin. Proto je chromatografie v systému pevná látka-kapalina vhodnější pro separaci např. izomerů než systém kapalina-kapalina. Adsorpční chromatografie probíhá ve dvou stupních; v prvním stupni dochází k adsorpci látek na adsorbent podle jejich afinity k adsorbentu (látky s větší afinitou se zachytí dříve), ve druhém stupni je třeba látky z adsorbentu uvolnit - desorbovat - což se provádí buď pouze elucí (vymytím) nebo vytěsněním pomocí roztoku látky, která k danému adsorbentu vykazuje vyšší afinitu než látka navázaná. Z polárních adsorbentů se používají nejčastěji oxid hlinitý a silikagel, což je xerogel kyseliny křemičité, který má amorfní strukturu a pórovité částice. Na povrchu silikagelu se po aktivaci vyskytují 4 druhy aktivních center, na nichž dochází k adsorpci a desorpci. Strukturu povrchu silikagelu znázorňuje schematicky obr.2.23.

Obr.2.23

Struktura povrchu silikagelu a) volné hydroxylové (silanolové) skupiny b) vicinální hydroxylové (silanolové) skupiny c) hydroxylové (silanolové) skupiny, poutající vodu vodíkovými vazbami d) siloxanové skupiny vznikající při vysokých teplotách

50

Povrch silikagelu je slabě kyselý, proto více zadržuje bazické látky než kyselé a neutrální a může tak působit jejich chvostování. Tomu lze zabránit přídavkem slabé báze k mobilní fázi. Mezi metody adsorpční chromatografie bývá zařazována i afinitní chromatografie, o které vzhledem k jejímu mimořádnému významu bude pojednáno podrobněji ve zvláštní kapitole (kap.2.4). Rozdělovací chromatografie probíhá v systému 2 nemísitelných nebo omezeně mísitelných kapalných fází (LLC). Distribuce složek mezi tyto dvě fáze je určována rozdělovacími koeficienty jednotlivých separovaných složek. Vzhledem k tomu, že v průběhu rozdělovací chromatografie nedochází k vazbě rozpuštěných látek na některou z fází, jde o proces jednostupňový (odpadá nutnost eluce). Rozdělovací chromatografie je uspořádána tak, že jedna z kapalných fází je zakotvena na inertní pevný nosič a stává se tak fází stacionární, zatímco druhá fáze - mobilní - přes tuto přetéká. Látky ze separované směsi se rozpouštějí mezi obě fáze. Na pevný nosič se zakotvuje fáze, která má k nosiči vyšší afinitu (na hydrofilní nosič vodná fáze, na hydrofobní nosič nevodná fáze = chromatografie s reverzní fází). Nosič stacionární fáze nemá ovlivňovat rozdělovací rovnováhu, tzn., že nesmí mít adsorpční vlastnosti. Ve skutečnosti však není znám zcela inertní nosič a musí se počítat s konkurenčním vlivem adsorpce. Jako nosič stacionární fáze se nejčastěji volí silikagel nebo křemelina a jejich chemicky modifikované formy. Chromatografie v systému kapalina-kapalina má řadu praktických nevýhod a proto je tato technika vytlačena používáním kolon s různě chemicky vázanými stacionárními fázemi. Mezi rozdělovací chromatografie můžeme zařadit i tzv. chromatografii s vázanou fází. Na rozdíl od klasické chromatografie, kdy je stacionární fáze zakotvena na inertním nosiči prostřednictvím krátkodosažných sil, při chromatografii s vázanou fází se stacionární fáze na nosič naváže kovalentně. K tomu se používají specielně upravené nosiče (např. chemicky modifikovaný silikagel). Zvláštním případem rozdělovací chromatografie je i gelová chromatografie (kap. 2.3.9). Chromatografie na měničích iontů je chromatografie v systému kapalina-pevná látka (LSC), jejíž pevnou fází je iontoměnič. Principem chromatografie na měničích iontů je dělení

51

směsí na základě odlišnosti elektrostatických sil, jimiž se látka váže na ionex. Stejně jako u adsorpční chromatografie se jedná o dvoustupňový proces, neboť v první fázi se látky podle velikosti náboje zachytí na ionex a ve druhé fázi musí být z ionexu vytěsněny. Metody kapalinové chromatografie lze dále dělit na základě umístění pevné fáze na chromatografii sloupcovou a chromatografii v plošném uspořádání (na tenké vrstvě-TLC a papírová - PC). Chromatografie v plošném uspořádání spočívá v tom, že sorbent má podobu tenké vrstvy. V případě papírové chromatografie je sorbentem chromatografický papír, při TLC je sorbent rozprostřen v tenké vrstvě. Při TLC se chromatografický materiál rozestře v tenké vrstvě na desku z inertního materiálu (sklo, aluminiová folie atd.), na desku se nanese vzorek (obvykle spolu se standardy), deska se napojí na mobilní fázi, která pak přetéká přes fázi stacionární. Látka nanesená na nosič je rozpuštěna ve stacionární fázi. Jakmile se mobilní fáze při průtoku papírem či tenkou vrstvou dostane ke startu, část látky se rozpustí, ustaví se rovnováha a přenese se na nosiči o kousek dále, kde se opět ustaví rovnováha mezi stacionární a mobilní fází. Vlivem různě velkých distribučních konstant pro různé látky dojde i k jejich různé migraci na nosiči a tudíž k jejich rozdělení. Látky více rozpustné ve stacionární fázi se budou pohybovat pomaleji (menší RF), naopak látky s vyšší rozpustností ve fázi mobilní budou blíže čelu (vyšší RF). Budou-li mít látky v daném rozpouštědlovém systému stejnou distribuční konstantu, nerozdělí se a je třeba hledat jiný rozpouštědlový systém. V okamžiku, kdy čelo mobilní fáze dojde na okraj desky, deska se vyjme, vysuší a separované látky se na desce detegují. Nejčastěji se k tomu používá barevná reakce, specifická pro separované látky.

Obr.2.24

Schema uspořádání tenkovrstvé chromatografie

52

Složité směsi, které se během jedné chromatografie nerozdělí, je možné rozdělit dvojrozměrnou chromatografií (obr.2.26). Po proběhnutí chromatografie v jednom směru se vysušený chromatogram otočí o 90o a chromatografie se nechá opět proběhnout s použitím jiné soustavy rozpouštědel. Protože každá látka putuje v daném rozpouštědlovém systému jinak, dojde při použití různých soustav k výraznějšímu oddělení jednotlivých složek směsi. Chromatografie v plošném uspořádání se dnes již používá spíše jako prostředek kvalitativního stanovení, tzn. k identifikaci látek ve směsi.

Obr.2.25

Tenkovrstvá chromatografie rostlinných lipidů. Neutrální lipidy (A), monogalaktosyldiacylglycerol (B), sterolglykosid (C), fosfatidylethanolamin (D), digalaktosyldiacylglycerol + fosfatidylglycerol (E), fosfatidylcholin (F), sulfoguinovosyldiacylglycerol (G), fosfatidylinositol (H)

53

Obr. 2.26

Schematické znázornění dvojrozměrné chromatografie

Běžnějším uspořádáním při chromatografických separacích je uspořádání kolonové (sloupcové). Při tomto uspořádání je třeba mít vhodnou kolonu s náplní, zařízení pro regulaci toku, detekční zařízení a popř. jímač frakcí. Při chromatografii v kolonovém uspořádání má sorbent podobu sloupce. Po aplikaci vzorku na jeho horní část dochází vlivem toku mobilní fáze k pohybu jednotlivých složek kolonou a k jejich separaci. Na výstupu by pak měly jednotlivé složky z kolony vycházet již odděleně. Z hlediska provozního můžeme chromatografické metody dělit podle pracovního tlaku na chromatografii nízkotlakou, středotlakou (FPLC, asi do 3 MPa) a vysokotlakou (HPLC, 7-20 MPa). Podle použití lze rozdělit chromatografii na analytickou a preparativní. Liší se v požadavcích na instrumentaci, kvalitu a výběr stacionární i mobilní fáze. Také cíl se liší. Při preparaci směsi látek je obvykle snaha získat alespoň jednu z nich ve vysoké čistotě, při analýze jde spíše o dobrou separaci a kvantifikaci jednotlivých složek směsi. V obou případech však platí, že použití pouze jedné techniky může vést k nepravdivým výsledkům. Proto je nutné kombinovat více postupů. Je-li smyslem práce analýza mohou se zvolit ekonomicky náročnější podmínky, zejména kvalitnější stacionární a mobilní fáze. Při preparaci je nutno vzít v úvahu, že látky je nutno izolovat v rozumném výtěžku a složky mobilní fáze by měly být snadno odstranitelné. Preparativní kolony mají vyšší kapacitu, čímž je umožněno aplikovat větší objemy vzorku než na kolony analytické. Jestliže známe kapacitu pro analytickou kolonu, lze odhadnout kapacitu kolony preparativní. LC prep. = LC anal. . (ID prep. / ID anal.)2 . (Lprep./ Lanal.)

(18)

LC = kapacita kolony ID = vnitřní průměr kolony L = délka kolony Při převádění chromatografických postupů z laboratorního měřítka do preparativní provozní formy (tzv. scaling - up) je třeba brát v úvahu řadu faktorů, které úspěšnost a

54

aplikovatelnost daného postupu ve výrobním procesu mohou ovlivnit. Zatímco v případě laboratorních postupů jsou rozhodujícími kriterii výtěžek postupu a stupeň čistoty produktu, při rozšiřování pro výrobní účely nelze opomenout i další hlediska jako např. ekonomiku procesu, hygienu postupů, kontrolu prostředí apod. Převádění purifikačních postupů, vypracovaných v laboratoři do provozních podmínek však neznamená, že úměrně rozšíření dojde i ke zvýšení výtěžku procesu. Při práci ve velkém měřítku se začnou objevovat i další faktory, jejichž vliv je možno v laboratorních podmínkách zanedbat. Charakteristickým příkladem je snižování průtoku mobilní fáze v důsledku stlačování chromatografické náplně. Proto jsou kladeny speciální nároky zejména na výběr matrice resp. náplně kolony. Tradičně využívané náplně v laboratořích (agarosa, dextrany, celulosa) nemají dostatečnou rigiditu a proto při velkých průtocích mobilní fáze může docházet k porušení jejich struktury. Proto byly připraveny makroporezní prokřížené nosiče (Sepharose-CL, Sepharose Fast Flow atd.), určené pro práci ve větším měřítku, které jsou vzhledem k lepším hydrodynamickým vlastnostem vhodné pro vyšší průtoky a tím i pro práci v provozním měřítku. Náplň kolony musí být rovněž odolná vůči čistícím a sanitárním postupům, které jsou nezbytné pro zajištění bezpečnosti a hygieny provozu např. ve farmaceutickém průmyslu. Výše zmíněným nežádoucím účinkům se alespoň částečně předchází vhodně zvoleným uspořádáním kolon. V případě ionexové a afinitní chromatografie se uplatňují kolony krátké a široké, které jsou většinou řazeny nad sebou (tzv. patrové uspořádání). Naopak u gelové chromatografie, kde je pro úspěšnou separaci požadován dlouhý sloupec chromatografické náplně, se kolony řadí vedle sebe. Rovněž posloupnost purifikačních kroků se pro jednotlivá uspořádání liší. Např. při práci v laboratoři, kde se pracuje s malými objemy vzorků je běžnou praxí provést úvodní frakcionaci surového extraktu gelovou chromatografií. Jestliže se však pracuje s desítkami až stovkami litrů extraktu, je vhodnější začít proces ionexovou chromatografií, během které kromě částečné purifikace preparátu dochází i k redukci objemu vzorku. Převádění purifikačního postupu do provozu je určováno konečným využitím izolované látky. Ne vždy je třeba připravit absolutně homogenní preparát. V řadě případů (např. u diagnostických činidel) je dostačující pouhé odstranění interferujících aktivit. Naopak např. proteiny pro terapeutické účely musí být absolutně homogenní a nesmí obsahovat žádné nebílkovinné kontaminanty (např. polysacharidové povahy).

55

2.3.4 Vysokoúčinná kapalinová kolonová chromatografie I přes to, že kapalinová chromatografie je známa již od počátku tohoto století, teprve koncem šedesátých let došlo k značnému rozvoji této techniky v moderní, vysokoúčinné formě. Tak vznikly nové techniky: HPLC - vysokoúčinná (vysokotlaká) kapalinová chromatografie a FPLC - středotlaká kapalinová chromatografie. Vysoké účinnosti a rychlosti se dosahuje u těchto metod použitím kolon plněných náplněmi s velmi jemnými částicemi (3-15 μm) a poměrně vysokých průtoků mobilní fáze. Vypracování těchto metod bylo podmíněno vývojem nové vhodné přístrojové techniky, odolávající pracovním tlakům až 30-60 MPa. Toho bylo docíleno zejména použitím vysokotlakých čerpadel, kontinuálních detektorů, dávkovacích systémů, umožňujících dávkování vzorku bez přerušení toku mobilní fáze a dalších. Rovněž chromatografické materiály doznaly poměrně velkých změn. V současné době jsou analýzy již zcela nebo alespoň částečně automatizovány, k čemuž přispívá i použití integrátorů a počítačových systémů pro zpracování dat a vybavení chromatografů řídícími mikroprocesory, které umožňují předem zvolit pracovní podmínky a jejich změny během separačního procesu. Nemalou měrou se na vývoji vysokoúčinné kapalinové chromatografie podílelo zavedení chromatografického materiálu s chemicky vázanými fázemi, které umožňují vysoce selektivní separace. HPLC je typ kapalinové chromatografie, který umožňuje rychle a reprodukovatelně detegovat nepatrné množství látek za současného kvalitativního vyhodnocení. Zahrnuje soubor metod, založených na různých mechanismech separace. Společné všem těmto metodám je však použití kapalné mobilní fáze (proto kapalinová) a vysokotlaké techniky (proto vysokotlaká). Rovněž tyto metody lze dělit podle charakteru fází na chromatografii v systému kapalina- kapalina a kapalina- tuhá látka. Oproti klasickému provedení má HPLC řadu výhod: je rychlejší, účinnější, snadněji se automatizuje, výsledky lze snadno kvantifikovat, lze provádět seriové analýzy apod. Jednou z nejvýraznějších předností těchto technik je však zrychlení procesu.

56

2.3.5 Instrumentace sloupcových chromatografických metod Nejčastějším uspořádáním při chromatografických separacích je uspořádání kolonové (sloupcové). Vybavení pro tento typ chromatografie se velice liší podle typu chromatografie, kterou budeme provádět. Nejmenší nároky na vybavení klade nízkotlaká (gravitační) chromatografie (obr.2.27), naopak vždy nákladné je zařízení pro HPLC (obr.2.28.). V dnešní době každá průměrně vybavená laboratoř má k dispozici automatizovaná zařízení, která umožňují práci bez neustálé přítomnosti obsluhy. Nejmodernější přístroje tohoto typu jsou již plně řízeny počítačem a zaručují přesnou a rychlou práci.

Zařízení pro chromatografii obsahuje: rezervoár mobilní fáze dávkovač vzorku kolony s chromatografickým materiálem čerpadla popř. gradientový mixer detektor jímač frakcí výstup analyzovaných dat Kromě základních částí kapalinového chromatografu je možno použít řady doplňkových zařízení, jako jsou ochranné filtry a předkolony, zařízení pro odplynění mobilní fáze, dále je možno použít více detektorů apod.

57

Obr.2.27

Schema uspořádání kapalinové sloupcové chromatografie

Obr.2.28

Kapalinový chromatograf. (a) schema, (b) HPLC firmy Hewlett Packard 1- zásobník mobilní fáze, 2- vysokotlaké čerpadlo, 3- čidlo pro měření pracovního tlaku, 4- filtr, 5- průtočný tlumič pulsů, 6- zařízení pro nástřik vzorku, 7- chromatografická kolona, 8- termostat, 9- detektor, 10- zapisovač, 11- zařízení pro zpracování dat

Kapalinové chromatografy jsou koncipovány buď jako stavebnicové systémy, kde lze velice snadno jednotlivé části vyměňovat, nebo jako kompaktní jednotky. Stavebnicové

58

chromatografy se používají zejména ve výzkumné oblasti, pro vývoj nových metod; zařízení druhého typu se lépe hodí pro analýzy velkého množství vzorků, protože jsou méně náročné na obsluhu. V následující části budou podrobněji popsány jednotlivé části chromatografu. Jako zásobník mobilní fáze většinou postačí skleněná láhev, kde dochází k odplynění, filtraci a případné temperaci mobilní fáze. Před započetím chromatografie je nezbytné z mobilní fáze odstranit vzduch, který by rušil jak vlastní separaci tak i detekci. Existují v podstatě čtyři základní způsoby odplynění mobilní fáze: probublávání málo rozpustným plynem (N2, He), zahřátí, sonikace a vakuové odplynění. V krajním případě (zejména u nízkotlaké chromatografie) postačí několikaminutové odsávání vzduchu vývěvou. U nízkotlaké chromatografie se tok mobilní fáze uskutečňuje buď samospádem na základě rozdílu hydrostatického tlaku (pouze u gravitační chromatografie) nebo čerpadly. Jako čerpadla pro nízkotlakou chromatografii se používají čerpadla peristaltická, neboť tlakové pulsy, způsobené pístovým čerpadlem, by zhoršovaly průtočnost poměrně měkkých chromatografických materiálů. Náročnější jsou čerpadla pro středotlakou a vysokotlakou chromatografii, která musí především zajišťovat požadovaný konstantní tlak. Čerpadla mobilní fáze pro HPLC musí splňovat poměrně náročné požadavky. V první řadě musí být konstruována z materiálů odolných vůči korozi i při použití agresivních mobilních fází (např. pufry, organická rozpouštědla). Jsou proto zhotovována zejména z titanu a nerezové oceli. Použitelnost čerpadel, vyrobených pouze ze skla a teflonu je omezena tlakem 3-10 MPa. Čerpadla musí být schopna dodávat v podstatě libovolnou mobilní fázi v rozmezí tlaků cca 0-40 MPa při průtocích 0.1-10 ml/min. Vnitřní objem čerpadla musí být co nejmenší, aby bylo možno rychle vyměnit mobilní fázi. Vysokotlaká čerpadla lze dělit do dvou skupin na čerpadla pracující při konstantním tlaku nebo konstantním průtoku. V současné době se téměř výhradně používají čerpadla druhého typu. Z nich se pak nejvíce používají pístová čerpadla, v nichž se kapalina z malé pístní komory (20 - 400 μl) vytlačuje a nasává přes dva zpětné ventily, z nichž sací je spojen ze zásobníkem mobilní fáze a výtlačný s kolonou. Výhodou těchto čerpadel je možnost čerpání mobilní fáze bez přerušení. Nevýhodou je pak zejména vznik tlakových pulsů. Ty jsou alespoň částečně eliminovány buď zařazením tlumiče pulsů nebo zařazením většího počtu čerpacích bloků, pracujících v opačné fázi. Pístová čerpadla se dvěma či třemi hlavami se v současné době používají nejčastěji.

59

Ze zajištěním toku mobilní fáze souvisí i vytvoření vhodného gradientu. V nejjednodušším případě (lineární gradient pro nízkotlakou chromatografii) si lze gradientový mixer (obr.2.29) připravit i v laboratoři ze dvou navzájem propojených nádob stejného tvaru, z nichž jedna je naplněna startovním eluentem a druhá eluentem finálním. Z nádobky ze startovním eluentem se vede roztok na kolonu a jak roztok v této nádobce ubývá, doplňuje se podle zásady spojených nádob roztokem z nádobky druhé. Tak se plynule mění složení eluentu. V komerčně dodávaných systémech pro HPLC a FPLC je tvorba gradientu realizována prostřednictvím čerpadel. Zařízení pro tvorbu gradientu u HPLC lze rozdělit do dvou skupin. Buď dochází ke smíšení složek mobilní fáze před vstupem do vysokotlakého čerpadla. Druhou skupinu tvoří čerpadla, kdy každá složka mobilní fáze je dávkována vlastním čerpadlem do malé směšovací komůrky před kolonou. Tohoto způsobu se však vzhledem k ceně čerpadel využívá pouze pro tvorbu dvousložkového gradientu. K programování složení gradientu se dnes používá řídící jednotka, která je součástí většiny moderních kapalinových chromatografů.

Obr.2.29

Gradientový mixer

Zařízení pro dávkování a nástřik vzorku je nejjednodušší opět pro nízkotlakou chromatografii, kde se obvykle vystačí s injekční stříkačkou. Někdy se před kolonu zařazuje trojcestný kohout, který usnadní aplikaci vzorku. U středotlakých a vysokotlakých systémů se používá automatických dávkovačů, jimiž jsou přístroje vybaveny. Zejména u HPLC může zařízení pro dávkování vzorků na kolonu velice výrazně ovlivnit účinnost separačního procesu. Existují tři odlišné způsoby dávkování vzorku na kolonu: - Přímý nástřik vzorku na kolonu injekční stříkačkou přes septum bez přerušení toku mobilní fáze nebo bez použití septa, kdy je třeba průtok kolonou zastavit. Oba tyto způsoby však nepříznivě ovlivňují reprodukovatelnost nástřiku a proto se používají žřídka.

60

- Nástřik vzorku prostřednictvím ventilu se smyčkou bez přerušení toku mobilní fáze. Podle konstrukce dávkovačů lze dávkovat na kolonu buď pouze objem, který je dán vnitřním objemem smyčky dávkovače nebo je možno naplnit jenom část smyčky a tím měnit dávkovaný objem. - Dávkování vzorku pomocí automatických dávkovačů je vhodné zejména tam, kde se provádí seriové analýzy velkého množství vzorků. Dávkovač se skládá ze zásobníku s malými nádobkami se vzorky, které se před každým nástřikem posunou pod injekční stříkačku dávkovače. Obvykle lze naprogramovat počet nástřiků každého vzorku, objem nástřiku, dobu analýzy apod. U dávkovaných vzorků je třeba dbát na to, aby byly dokonale rozpuštěny, nejlépe v rozpouštědle stejného složení jako používaná mobilní fáze. Kolona s chromatografickým materiálem je jednou z nejdůležitějších částí zařízení. Kolony musí splňovat určité požadavky, důležitá je nejen náplň kolony a velikost částic chromatografického materiálu, ale i její rozměry. Kolony, používané při biochemických separacích jsou konstruovány ze skla nebo plastu tak, aby separované látky nepřicházely do styku s kovem. Spodní konec kolony je opatřen fritou, aby náplň kolony nevytékala ven. Kolona je ukončena připojením hadiček, kterými se eluát odvádí přes detektor do jímače frakcí (obr.2.30). Rozměry kolon pro nízkotlakou chromatografii se pohybují v rozmezích 0.6-6 cm vnitřního průměru a 50-200 cm délky. Zrnění sorbentů je poměrně hrubé 120-200 μm a to zejména proto, aby bylo dosaženo optimální rychlosti průtoku mobilní fáze. Rozměry kolon jsou voleny podle množství vzorku, jež má být podroben separaci. Větší rozměry kolony a hrubší zrnění sorbentu způsobují horší rozlišení a nižší účinnost. Chromatografické kolony pro účely HPLC se podle použití dělí na analytické, preparativní a mikrokolony. Analytické kolony jsou většinou vyrobeny z nerezavějící oceli a mají obvykle průměr okolo 4 mm při délkách 30, 100 a 250 mm, Tyto kolony jsou plněny porovitými náplněmi s částečkami o průměru 3-10 μm. Po mechanické stránce musí být kolony odolné vůči používaným tlakům, musí být inertní a mít hladký vnitřní povrch. Delších kolon s průměrem řádově v cm se používá v preparativní chromatografii, kde je cílem izolace rozdělených látek po předchozí separaci. Preparativní chromatografii lze provozovat, i když s jistými obtížemi, i na běžném analytickém zařízení. Mikrokolony (vnitřní průměr menší než 1 mm) mají rovněž své výhody jako např. malá spotřeba vzorku, mobilní fáze, sorbentu atd. Přesto se jejich použití příliš nerozšířilo, a

61

to zejména proto, že vyžadují specielní konstrukci celého zařízení a tím se ztrácí univerzálnost HPLC. Materiály pro plnění kolon jsou většinou založeny na anorganické matrici (silikagel) na níž mohou být chemicky vázané nebo zakotvené různé stacionární fáze. Speciální analytické kolony, tzv. sekcionované, jsou určeny pro analýzu složitých směsí látek. Je to systém kolon naplněných různými sorbenty, což umožňuje separaci na základě různých principů. Za zmínku stojí i použití tzv. radiálně popř. axiálně komprimovaných kolon v preparativní chromatografii. Jde o kolony, u nichž účinkem radiální resp. axiální komprese dochází k minimalizaci mrtvého prostoru mezi jednotlivými částicemi a tím i ke zvýšení účinnosti separace.

62

Obr.2.30

Chromatografické kolony a) schematické znázornění b) komerčně dodávané firmami

Eluát vytékající z kolony je veden přes detektor, který monitoruje jeho složení na zapisovač. Získaný signál z detektoru je po příslušné úpravě (zesílení nebo zeslabení) zaznamenán graficky. Tím se získá chromatografický záznam, který umožňuje kvalitativní a kvantitativní zhodnocení analyzované směsi. Do nedávna byl nejběžnějším záznamovým zařízením obyčejný zapisovač. Je-li záznam konečným výstupem, provádí se vyhodnocení chromatogramu manuálně. Pro přesnější a rychlejší vyhodnocení se používá integrátorů, které bývají spojeny s počítačem. Nevýhodou jednoúčelového integrátoru je, že není možno data uchovávat a porovnávat. Proto se pro sběr a vyhodnocování dat stále častěji využívá osobních počítačů s odpovídajícím programovým vybavením. V případě, že je třeba se vzorky dále pracovat, ať již z důvodů analytických nebo preparativních, je třeba jako koncovou jednotku zařadit jímač frakcí, který jímá odděleně jednotlivé frakce podle zadaných požadavků (např. objem frakce vyjádřený počtem kapek, čas apod). Získané frakce je většinou třeba podrobit dalším analýzám a proto mohou být napojovány on-line další analyzátory např. enzymové. Mezi další přídavná resp. pomocná zařízení, používaná ve většině přístrojů patří např. termostatovaný plášť, umožňující pracovat při předem zvolené konstantní teplotě. Další běžně používanou součástí systémů jsou malé ochranné předkolonky, plněné sorbentem stejného nebo podobného typu jako je náplň kolony. Úkolem je zachycovat nečistoty, které by mohly analytickou kolonu ucpávat nebo jinak znehodnocovat.

2.3.6 Detekce separovaných látek Detekční zařízení používaná v kapalinové chromatografii jsou nejrůznějšího druhu a jejich volba závisí na druhu separovaných látek. Detektory v chromatografii mají za úkol zaznamenat rozdíl mezi průchodem čisté mobilní fáze a mobilní fáze obsahující eluovanou složku.

63

Detektory se klasifikují podle časové závislosti odezvy na integrální a diferenciální. Integrální detektory poskytují odezvu úměrnou celkovému množství nebo koncentraci látky prošlé detektorem od začátku až do daného okamžiku (obr.2.31a), kdežto diferenciální detektory dávají odezvu odpovídající okamžité koncentraci nebo množství detegované složky v detektoru (obr.2.31b).

Obr.2.31

Chromatogram (a) integrální, (b) diferenciální

Další dělení detektorů na destruktivní a nedestruktivní bere v úvahu případnou změnu detegované látky během detekce. Třetí

způsob

klasifikace

rozeznává

detektory

koncentrační

a

hmotnostní.

Koncentrační detektory reagují na změnu hmotnostní koncentrace složky dc/dV nezávisle na přívodu složky do detektoru. Hmotnostní detektory naproti tomu reagují na změnu rychlosti přívodu detegované látky dm/dV do detektoru. V biochemických separacích se nejčastěji používají ty, které jsou založeny na měření absorpce v UV oblasti, refraktometrický detektor apod. Detektory používané dnes v HPLC jsou téměř výhradně detektory koncentrační. Je možno říci, že neexistuje universální detektor pro HPLC a různé typy detektorů se jednotlivým požadavkům pouze přibližují. V současné době je nejvíce využíván UV detektor ať už s pevnou nebo proměnnou vlnovou délkou. Jeho dalším vývojem vznikl detektor s diodovým polem (DAD), který každých 10 ms snímá celé UV spektrum. Výsledkem je tedy trojdimensionální chromatogram 64

(čas, absorbance, vlnová délka). Takto získaná data již umožňují identifikaci látek, k dispozici je jak retenční čas tak i UV spektrum. Refraktometrický (RI) detektor sice umožňuje detekci prakticky všech látek, vyznačuje

se

však

nižší

citlivostí

a

vyššími

mezemi

detekce

než

detektory

spektrofotometrické, fluorescenční či elektrochemické. RI detektor poskytuje odezvu úměrnou rozdílu indexů lomu eluátu v měrné cele a srovnávací kapaliny (čistá mobilní fáze) v cele referenční. Odezva detektoru je značně závislá na teplotě. Vodivostní detektor je po RI detektoru dalším nejčastěji používaným detektorem. Měří elektrickou vodivost eluátu vytékajícího z kolony mezi dvěma elektrodami v průtokové cele. Fluorescenční detektor je vysoce selektivní a citlivý a poskytuje odezvu pro látky vykazující fluorescenci. Detegovaná látka absorbuje ultrafialové excitační záření, jehož pohlcená energie se zčásti vyzáří ve formě fluorescenčního záření o vyšší vlnové délce než má záření excitační. Emitované záření dopadá na fotonásobič, který poskytuje proud úměrný toku emitovaného záření a koncentraci detegované látky. Ostatní typy detektorů jako např. elektrochemické a radiometrické se používají pro speciální aplikace. Velice významné je použití HPLC ve spojení s tzv. post-kolonovými detektory např. enzymovými, které jsou schopny ve složitých směsích bílkovin najít pouze požadovaný druh enzymu. V současné době je velice prosazováno, a pro moderní výzkum je nezbytné, spojení chromatografických technik s některou ze spektrálních metod. Důvodem je značné množství informací pro identifikaci složek, které poskytují právě spektrální metody. Jedná se např. o spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC/MS). Hmotnostní spektrometry napojené přímo na výstup z kolony umožňují snímat hmotnostní spektra separovaných látek během eluce, což je důležité pro strukturní analýzu a identifikaci látek ve složitých směsích. Přímé spojení LC/MS však naráží na značné technické potíže (mnohem větší než v případě GC/MS) a proto není tato technika dosud příliš rozšířena. Hlavním problémem je odstranění kapalného eluentu při zavádění do hmotnostního spektrometru, který pracuje za vysokého vakua (10-2-10-5 Pa). I přes to, že řada chromatografických firem se s touto překážkou již alespoň částečně vypořádala, většímu rozšíření této techniky v praxi brání poměrně vysoká cena zařízení.

65

Další systémy využívající spojení kapalinové chromatografie s jinými analytickými metodami jsou např. LC/NMR, LC/FTIR (infračervená spektroskopie), LC/UV-VIS. Každá z těchto metod má jistě své výhody i nevýhody, ale s rozvojem techniky i poznatků budou jistě odstraněny i problémy, zatím bránící jejich širšímu využití. 2.3.7 Aplikace HPLC Intenzivní výzkum v oblasti přírodních látek, zejména v biochemických aplikacích, vyžaduje nejen dokonalou separaci, ale i např. identifikaci a stanovení jednotlivých optických izomerů. Ukazuje se totiž, že biologická aktivita, toxicita nebo terapeutické účinky jednotlivých optických izomerů se značně liší a jejich aplikace je proto závislá na možnosti jejich separace. Na běžných stacionárních fázích používaných v HPLC je separace těchto látek nedokonalá nebo v krajním případě k rozdělení vůbec nedochází. Dříve bylo nutno racemát rozdělit chirálním činidlem, což bylo spojeno s řadou nevýhod. Proto byla zavedena chromatografická technika s využitím tzv. chirálních fází. Přítomností opticky aktivní látky ve stacionární nebo mobilní fázi dojde k interakci daného optického izomeru obsaženého ve vzorku a tím i ke zvýšení retence na koloně. Např. pro separaci D- a L-aminokyselin se přidává do nevodné mobilní fáze N-acetyl-L-valin. Chirální fáze se nejčastěji používají v analýze cukrů, aminokyselin, peptidů, řady léčiv přírodního i syntetického původu apod. HPLC nachází široké uplatnění také např. v analýze peptidů a bílkovin. Rozvoj metod HPLC analýzy umožnil i další rozvoj postupů sekvenčního odbourávání bílkovin a peptidů. Díky této metodě je možno snížit množství potřebného polypeptidového materiálu až pod hranici 10 pmol a automatizovat nejen odbourávací postupy, ale i jejich analytické vyhodnocování. HPLC a FPLC bílkovin má velký význam v potravinářské kontrole a výrobě. Především umožňuje rychlé analytické odlišení různých bílkovin. Tak jako se mohou lišit chromatografické profily sérových bílkovin u různě postižených pacientů, tak je možné také činit závěry o různých potravinářských bílkovinných produktech a procesech. Otevírá se např. možnost odlišit suroviny, meziprodukty a produkty podle původu, odhadnout jejich stáří, postihnout různé kontaminace apod. Velikou výhodou je o jeden až dva řády větší rychlost těchto analýz ve srovnání s klasickou kapalinovou chromatografií. Tato rychlost

66

umožňuje průběžnou kontrolu nejrůznějších fermentačních procesů při výrobě potravin. To dříve nebylo možné, protože se analyzovaly pouze hotové produkty. Spojení separace pomocí HPLC s post-kolonovými enzymovými detektory je výhodné při analýze izoenzymů pro lékařskou diagnostiku, neboť změny ve vzájemných poměrech izoenzymů indikují chorobné stavy. Možnost rychlé specifické detekce násobných forem enzymů má velký význam pro kontrolu kvality výrobních procesů a skladování. Je známo, že počáteční limitovanou proteolýzou řada enzymů neztrácí svou aktivitu, ale mění svou elektroforetickou nebo chromatografickou mobilitu. Další aplikace jsou umožněny spojením chromatografických technik se spektrálními metodami, které jsou popsány v kap.2.3.6.

2.3.8 Iontová chromatografie Využití kapalinové chromatografie pro dělení a stanovení anorganických iontů je známé již několik desítek let. Klasické metody dělení na měničích iontů však jsou pracné a časově náročné a proto se v analytické praxi příliš nerozšířily. Zlom ve využívání kapalinové chromatografie nastal, když se iontově výměnnou chromatografii podařilo převést do moderní instrumentální podoby. Jde tedy o iontově výměnnou chromatografii pomocí HPLC instrumentace. Pojem iontová chromatografie (Ion Chromatography, IC) v současné době zahrnuje techniky separace organických a anorganických iontů jako je chromatografie aniontů (obr.2.32a),

chromatografie

kationtů

(obr.2.32b),

chromatografie

iontových

párů,

chromatografie chelátů apod. Pro tuto metodu lze použít libovolného kapalinového chromatografu, potřebná je pouze specielní kolona pro iontovou chromatografii. Nutná je vhodná volba typu a koncentrace elučního činidla tak, aby při dané kapacitě kolony nebyla překročena hranice možné kompenzace nulové linie u použitého detektoru.

Detekce

67

Pro široké uplatnění kapalinové chromatografie byla nezbytná metoda kontinuální detekce rozdělených iontů za kolonou. Problémem v chromatografii iontů je, že je nutné detegovat ionty nikoliv samotné, ale ve směsi s ionty elučního činidla, které mají obvykle podobné vlastnosti. V současné době se používají specielní vodivostní detektory, které dodává řada firem buď samostatně nebo jako součást jednoúčelového iontového chromatografu. Kromě této metody, která je více méně neselektivní a tím použitelná pro většinu aniontů, lze v řadě případů s výhodou použít selektivních metod, které umožňují detekci pouze určité skupiny. Patří sem např. přímá fotometrická detekce v oblasti 210 nm, kdy lze stanovit např. bromidy, dusitany, dusičnany v přítomnosti rušivých přebytků ostatních iontů (chloridů, síranů, fosforečnanů). Dále je možno využít elektrochemickou detekci, případně metody specifické pro určité prvky (fosfor, síru apod.).

Sorbenty Kolony určené pro iontovou chromatografii, zejména pro chromatografii aniontů, jsou dodávány řadou firem. Jako matrice se používá buď silikagel nebo polymerní gely na bazi polystyrenu, případně akrylátů. Sorbenty na silikagelové matrici mají většinou vynikající účinnost, nevýhodou je však jejich omezená použitelnost při vyšším pH, nelze je tedy použít pro analýzu aniontů velmi slabých kyselin. Obecným problémem všech kolon pro iontovou chromatografii je jejich nízká životnost, kde zvláště u polymerních kolon může dojít k jejich rychlému znehodnocení. Jednou z častých příčin je zanesení kolony mikroorganismy. Je tedy nezbytně nutné používat pouze čerstvě filtrované roztoky, vhodné je rovněž používání předkolon, případně občasná sterilizace systému promytím zředěnou kyselinou dusičnou.

Aplikace

68

Mezi nejčastější aplikace patří stanovení anorganických iontů ve vodách a jiných materiálech. Zajímavou aplikací je stanovení stopových koncentrací chloridů v napájecích vodách parních okruhů elektráren. Důležité je i stanovení dusičnanů v poživatinách.

69

Obr.2.32

Iontová chromatografie. Stanovení některých (a) aniontů, (b) kationtů

2.3.9 Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie, též gelová chromatografie, gelová filtrace nebo chromatografie na principu molekulového síta, je metoda při které se separují molekuly podle velikosti a tvaru. Pomocí gelové chromatografie je možno separovat jakékoliv molekuly, lišící s svými rozměry, pokud se dobře rozpouštějí v některém rozpouštědle. Největší využití tato metodika nachází v analýze makromolekulárních látek a v biochemii. Jde o typ rozdělovací chromatografie v systému kapalina - kapalina, kde stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu (inertní polymerní nosič), čímž je zajištěna nemísitelnost s mobilní fází. Stejná kapalina pak tvoří mobilní fázi, tzn. kapalinu, protékající mezi částicemi. Částice gelu mají kulovitý tvar a obsahují póry o známé velikosti. Gel by neměl obsahovat žádné specificky ani nespecificky adsorbující skupiny nebo skupiny nesoucí náboj a měl by prokazovat různý stupeň prostupnosti k jednotlivým složkám mobilní fáze. Prostupnost částice gelem je závislá na velikosti prostupující molekuly, ale také na vnitřní architektuře gelu.

Princip gelové chromatografie (obr.2.34) Jestliže je nanesena na sloupec gelu směs látek o různé velikosti molekul, její pohyb gelem závisí na průtoku mobilní fáze a na Brownově pohybu, který vykonávají molekuly směsi a který odpovídá za jejich difuzi dovnitř a ven ze stacionární fáze. Separace složek směsi je tedy dána schopností separovaných molekul procházet póry stacionární fáze. Jednotlivé molekuly jsou zpomalovány úměrně své schopnosti prostupovat částicemi gelu. Současné představy předpokládají, že póry jsou poměrně nepravidelné a rozhodujícím kriteriem není objem pórů, ale dostupnost částí jednotlivých pórů (obr.2.33).

70

Obr.2.33

Omezená přístupnost nepravidelného póru

Molekuly, které jsou tak veliké, že neprojdou póry gelu, zůstávají v intersticiální kapalině a eluují se z gelu současně s touto kapalinou (tedy nejrychleji). Malé molekuly mohou difundovat do gelových částic. Uvnitř gelových částic neprobíhá výsledný průtok vůbec a pokud jsou molekuly uvnitř částic gelu, nejsou proudem kapaliny unášeny. Jakmile však difuzí proniknou vně, jsou opět neseny proudem kapaliny do jiné gelové částice. Difuzí do gelových částic a naopak pak molekuly postupují chromatografickou náplní, avšak nižší rychlostí než velké molekuly. Malé molekuly jsou tedy zpomalovány více než velké a jednotlivé složky směsi se uvolňují ze sloupce v pořadí klesající velikosti molekuly (nebo klesající relativní molekulové hmotnosti).

Obr.2.34

Schematické znázornění gelové filtrace. (a) Kulička gelu obsahuje gelovou matrici (silné vlnovky), která obklopuje vnitřní objem kapaliny. Malé molekuly (malé body) mohou volně procházet do vnitřního objemu kuliček, zatímco větší molekuly (větší plné body) 71

jsou

příliš velké na to, aby pronikaly do pórů gelu.(b) Vzorek směsi dělených látek proniká do sloupce gelu. (c) Menší molekuly pronikají do gelu a pohybují se tak sloupcem nosiče pomaleji než molekuly větší, které se do gelu nedostanou. (d) Větší a menší molekuly vycházejí z kolony a jsou jímány odděleně. (e) Diagram úplného chromatografického rozdělení dvou látek, z nichž ta větší je eluována jako první.

Gelová chromatografie se nejčastěji provádí v systému voda - voda. K tomu se používají hydrofilní gely, obvykle hydratovaný prokřížený dextran nebo polyakrylamid (obr.2.35).

Obr.2.35

(a) Prokřížený polyakrylamid (Bio Gel P), (b) prokřížený dextran (Sephadex)

Na hydrofilních gelech se frakcionují peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, bílkoviny, enzymy, nukleové kyseliny a viry. Byly však připraveny i gely, které umožňují provádět gelovou chromatografii v systémech organických rozpouštědel. Jsou to lipofilní materiály typu prokříženého polystyrenu, na nichž se separují zejména syntetické organické polymery. V současné době se vyrábějí i materiály, které tvoří gely ve vodném i nevodném prostředí a je tedy je možno použít pro oba výše uvedené typy gelové chromatografie. Jde obvykle o

72

hydrofilní matrice s hydrofobními řetězci, jako např. hydroxypropylether prokříženého dextranu apod. Materiály Pro gelovou chromatografii se používají tři typy gelů (obr.2.36).

Obr.2.36

Architektura gelů. (a) xerogel, (b) aerogel (silikagel), (c) aerogel (porezní sklo), (d) hybrid (agarosový gel), (e) hybrid (makroretikulární polystyren)

Xerogely jsou klasické gely, skládající se z lineárních řetězců, které jsou propojeny křížovými vazbami nebo fyzikálními interakcemi. Gel má tedy trojrozměrnou strukturu solvatovaných polymerních řetězců. K tvorbě gelu však dochází pouze v některých rozpouštědlech. Typickými představiteli jsou dextranové gely (Sephadexy), polyakrylamidové gely (Bio-Gel P), polystyreny (Bio-Beads S) a polyakrylomorfolinový gel (Enzacryl Gel). Aerogely vlastně nejsou gely v pravém slova smyslu. Skládají se z pevné (rigidní) matrice, obsahující póry, které jsou v suchém stavu naplněny vzduchem. Při naplnění kolony rozpouštědlo vytěsní vzduch z pórů gelu, přičemž vlastní matrice nebotná. Tento typ gelu je tvořen v libovolném rozpouštědle. Přestaviteli jsou např. porézní silica nebo porézní sklo.

73

Xerogely- aerogely jsou hybridy obou předchozích forem a mají tedy rysy obou skupin. Jejich polymerní matrice mívá semirigidní strukturu, která se pouze minimálně rozpouští při tvorbě gelu. Do této skupiny patří především agarosové gely (Sepharose, Gelarose), polystyreny s křížovými vazbami (Styragel). Xerogely tvořící polymery mají schopnost botnat až na mnohonásobek svého původního objemu. Jsou velmi měkké a stlačitelné a mohou se používat jen při malých průtokových rychlostech. Pro rychlé separace se lépe hodí aerogely s hybridy, které nejsou stlačitelné. Nevýhodou xerogelů je též jejich neprostupnost pro značně velké molekuly. To je dáno vzdáleností řetězců v solvatované matrici. U aerogelů a hybridů závisí prostupnost pouze na velikosti pórů.Výhodou xerogelů oproti druhé skupině je vysoký kapacitní poměr (poměr eluentu uvnitř gelových částic ku eluentu vně gelu), 2:1. U aerogelů a hybridů bývá tento poměr 1:1. V praxi znamená vyšší kapacitní poměr též vyšší účinnost kolony. Při zdvojení kapacitního poměru se pro danou separaci zkracuje délka sloupce 4x. Některé materiály pro gelovou chromatografii jsou uvedeny v tab.2 Tabulka 2 Materiály pro gelovou chromatografii

74

Charakteristické veličiny V gelové chromatografii se užívají pojmy odlišné od elučních charakteristik uváděných v teorii LC, a to proto, že pojem stacionární fáze může být chápán dvojím způsobem. Buď je jím myšlena pouze kapalina, zakotvená v gelových částicích, objem stacionární fáze je pak označován jako Vi, nebo je myšlen celý objem gelu označovaný jako Vs (obr.2.37).

Obr.2.37

Definice Vo, Vt a Vt -Vo

Gelová chromatografie je zvláštní typ rozdělovací chromatografie. Pro každou rozdělovací chromatografii, která se provádí bez eluce gradientem platí, že: K = (Ve - Vo) / Vs

(19)

K = rozdělovací koeficient látky vůči stacionární fázi Ve = eluční objem Vo = objem kapaliny v intersticiálním prostoru mezi částicemi gelu Vs = objem stacionární fáze Jestliže pokládáme za stacionární fázi celou gelovou fázi (gel plus zakotvená kapalina) pak platí vztah Vs = Vt - Vo Vt = celkový objem chromatografické kolony Vo = objem kapaliny v intersticiálním prostoru mezi částicemi gelu 75

(20)

Při gelové chromatografii je rozdělovací koeficient K určován především stérickými zábranami. Malé molekuly, které mohou pronikat do gelu, mají hodnoty K blízké 1, zatímco velké molekuly, které nemohou pronikat do gelových částic mají K=0. Tyto extrémní hodnoty odpovídají elučním objemům Vt, což je celkový objem chromatografické kolony a Vo. Větší eluční objemy než Vt pak naznačují přímou interakci mezi rozpuštěnou látkou a gelovou matricí. Takovou interakci lze pozorovat např. u aromatických sloučenin na dextranových gelech ve vhodných rozpouštědlech. K charakterizaci chování rozpuštěné látky se užívá těchto parametrů: Eluční objem - Ve - je primární proměnná veličina, která se dá vypočítat z elučního diagramu. Je to tedy objem mobilní fáze, který je třeba k přenesení určité molekuly chromatografickou náplní. Eluční objem je definován jako Ve = Vo + KD. Vi

(21)

kde KD je konstanta určité látky pro daný typ gelu a je nezávislá na délce gelového sloupce, závisí však na velikosti a tvaru gelu. Protože pro velké molekuly, které nemohou pronikat do gelu, je KD=1 platí tedy, že Ve = Vo + Vi . Pro srovnáváná různých chromatografických experimentů se užívá dvou relativních vyjádření elučního objemu, a to Ve/Vo a Ve/Vt . Tyto hodnoty nejsou závislé na objemu chromatografické kolony, avšak kolísají podle poměru plnidla. Převrácená hodnota výrazu Ve/Vo se nazývá retenční konstanta R. Pro vzorky o malých a středních objemech, které nedávají eluční křivku s prodlevou, je eluční objem roven objemu, který je eluován od okamžiku, kdy byla nanesena polovina vzorku, k maximu elučního vrcholu. Pro velké objemy nanášených vzorků, kdy se tvoří prodleva v eluční křivce, je eluční objem roven objemu mezi počátkem nanášení vzorku a inflexním bodem elučního vrcholu (obr.2.38).

76

Obr.2.38

Měření elučního objemu Ve

Protože eluční objem závisí na objemu chromatografické náplně a na poměru plnidla, není vhodným parametrem pro srovnání výsledků z různých chromatografických kolon. Rozdělovací koeficient - K. Podle toho jak definujeme stacionární fázi je pak K definován jako Kav = (Ve-Vo) / (Vt-Vo)

(22)

v případě, že za stacionární fázi pokládáme celkový objem gelové fáze nebo jako KD = (Ve-Vo) / Vi

(23)

kdy jako stacionární fáze je považována pouze kapalná složka gelové fáze o objemu Vi Hodnota rozdělovacího koeficientu se pohybuje od nuly (pro molekuly tak velké, že neprojdou do částic gelu) do jedné (pro molekuly schopné pronikat do gelu stejně snadno jako molekuly rozpouštědla). KD je přesnější pro malé molekuly (tj. s velkým Ve). V případě rozdělovacího koeficientu Kav závisí jeho maximální hodnota na typu gelu a ani pro velmi malé molekuly se nedosahuje hodnoty 1. Malé molekuly jsou proto hůře identifikovatelné. V případě, že hodnoty rozdělovacího koeficientu leží mimo interval 0-1, pak došlo k odchylkám od ideálního chování při gelové chromatografii. Znamená to, že separace byla ovlivněna jinými faktory než tvarem a velikostí molekuly. K odchylce od standartního chování může dojít i tehdy, jestliže je tvar molekul velmi odlišný od standardu.

77

Pro dobrou separační práci je třeba vybrat takový chromatografický materiál, na němž se hodnoty rozdělovacích koeficientů pro jednotlivé komponenty budou od sebe co nejvíce lišit. Na úspěšnost separace má vliv i volba vhodného gelu, kdy je třeba brát v úvahu tzv. frakcionační rozsah gelu. Je to rozmezí molekulových hmotností nebo velikosti molekul, v němž změna molekulové hmotnosti

nebo změna velikosti molekul způsobuje změnu v

elučním objemu. Pod frakcionačním rozmezím molekuly penetrují do gelu bez zábrany. To odpovídá elučnímu objemu blízkému Vt. Nad frakcionačním rozmezím jsou molekuly zcela vyloučeny v závislosti na elučním objemu Vo. Frakcionační rozsah gelu závisí na hustotě gelové matrice. Nejhustší gely mají frakcionační rozsah dosahující molekulové hmotnosti až asi 1000, kdežto gely pro frakcionaci při velmi vysokých molekulových hmotnostech (s velkými póry) mají frakcionační rozsahy blížící se molekulové hmotnosti několika milionů. Horní mez frakcionačního rozsahu se označuje jako mez vyloučení. Gely s úzkým frakcionačním rozsahem se hodí pro separace méně složitých směsí. Pro složitější směsi je třeba použít gely s širokým frakcionačním rozsahem. Zvláště v případě separace látek s blízkými hodnotami relativní molekulové hmotnosti je třeba pečlivě volit gel podle frakcionačního rozsahu. Volba nevhodného typu gelu vede k tomu, že se požadované látky eluují s elučními objemy blízkými vnějšímu objemu Vo nebo elučnímu objemu solí. V těchto oblastech je pak selektivita dělení obvykle neuspokojivá. Vzhledem k tomu, že se frakcionační rozsahy gelů vzájemně překrývají, může být obvykle pro separaci určité látky použito více typů gelů. V tom případě se doporučuje použít gel s nižší vylučovací mezí, protože požadované látky budou eluovány z kolony dříve. Kromě toho z gelů stejného chemického složení budou gely s nižší vylučovací mezí rigidnější, což umožní větší volnost při volbě průtokové rychlosti. Hlavním úkolem gelové chromatografie je dosáhnout dokonalé separace látek ze směsi. Dobrého rozlišení lze pak dosáhnout volbou vhodných experimentálních podmínek, tj. typem gelu, velikostí částic, rozměry sloupce gelu, objemem vzorku a průtokovou rychlostí. Stupeň rozlišení se posuzuje z velikosti rozlišovacího koeficientu Rs. Rs = vzdálenost mezi separovanými zonami / šířka zon

78

Obr.2.39

(a) Vztah rozdělovacího koeficientu a relativní molekulové hmotnosti globulárních bílkovin na různých typech Sephadexu. (b) Výběr gelu pro gelovou chromatografii podle frakcionačního rozsahu. Jde o dělení katalasy (Mr= 2,3.105) a fosfoglyceromutasy (Mr=6,4.104). Mr těchto enzymů leží mimo frakcionační rozsah gelů C a D, ale mohou být separovány na gelech A a B.

Maximálního rozlišení je dosahováno na dlouhých kolonách s nízkým průtokem, ovšem tento požadavek je v rozporu s požadavkem na krátké doby trvání pokusu. Mezi těmito požadavky je třeba volit určitý kompromis. Je třeba počítat i s tím, že při vyšším průtoku roste pracovní tlak, při němž se málo rigidní gely stlačují a průtoková rychlost začne klesat. Při gelové chromatografii tedy závisí oddělení látek jednak na rozdílu elučních objemů jednotlivých vrcholů na elučním diagramu, jednak na šířce jednotlivých vrcholů. Jak oddělení jednotlivých vrcholů navzájem, tak jejich šířka jsou úměrné délce sloupce gelu. Vzdálenost mezi jednotlivými vrcholy vzrůstá úměrně s délkou sloupce a šířka zon vzrůstá přibližně úměrně s druhou odmocninou délky sloupce. Proto rozlišovací schopnost vzrůstá přibližně úměrně s druhou odmocninou délky sloupce. Efektivní délku sloupce je možno 79

zvýšit recyklováním vzorku na téže koloně nebo užitím serie kolon. Pro dokonalé rozlišení je třeba použít delší kolony s menším průměrem. Pro analytické účely obvykle postačí objem náplně 50 ml nebo méně. Jestliže je však průměr sloupce velmi malý, je třeba počítat se vzlínáním kolem stěny kolony. Naopak při velkých průměrech dochází k velkému naředění separovaných látek. Šířku zon ovlivňuje velikost částic chromatografické náplně (obr.2.40).

Obr.2.40

Frakcionace směsi na různě zrněném materiálu. Dělení směsi cytidylová kyselina, cytidin a cytosin na Sephadexu G-25

Čím se použije jemněji zrněný gel, tím se dosáhne užších zon a tím i lepšího rozdělení. Je proto vhodné při chromatografii na jemně zrněných materiálech zkracovat délku sloupce. Limitujícím faktorem na těchto gelech však většinou bývá průtoková rychlost, která klesá s klesající velikostí zrna. Šířka zon klesá s klesající rychlostí průtoku, ovšem na úkor delší doby trvání pokusu. Při gelové chromatografii je rozhodující i objem aplikovaného vzorku. Pro zajištění dobré separace se doporučuje aplikovat objem vzorku, který činí asi 1-5% objemu chromatografické náplně. V některých případech je možno dávat vzorku více, aby se zabránilo přílišnému naředění separovaných komponent.

80

Obr.2.41

Eluční křivky pro různé objemy vzorku. Nejvýše umístěný diagram odpovídá aplikaci malého objemu vzorku, spodní největšímu možnému objemu vzorku, kdy ještě dojde k separaci. Střední diagram znázorňuje případ, kdy se objem vzorku rovná separačnímu objemu a k separaci již nedojde.

Jestliže se použije gelová chromatografie k odsolení nebo výměně pufrů, je možno aplikovat až 30% objemu náplně kolony. Jestliže vzorek zahustíme, aby stoupla koncentrace separovaných látek v aplikovaném objemu, limitujícím faktorem se stává viskozita (obr.2.42).

Obr.2.42

Vliv viskozity vzorku na separaci. S rostoucí viskozitou (eluční diagramy shora dolů) se výrazně zhoršuje separace

81

Složení eluentu při ideálním chování látek pro gelovou chromatografii nehraje roli. Dobrého chromatografického rozdělení se dosáhne i tehdy, použije-li se jako eluent i destilovaná voda. Eluce pufry o určitém pH a iontové síle se používá hlavně proto, aby separované látky byly eluovány v optimálním prostředí vzhledem k jejich stabilitě.

Aplikace gelové chromatografie Gelová chromatografie nachází uplatnění zejména jako separační metoda pro dělení látek ze směsi a při purifikacích. Kromě toho se využívá při odsolování roztoků biomakromolekul. Odsolování je třeba relizovat na hustých gelech, aby do gelu difundovaly pouze nízkomolekulární látky. Vzhledem ke schopnosti gelů frakcionovat látky podle velikosti molekul, je možno využít této techniky i pro orientační stanovení relativní molekulové hmotnosti, ovšem za předpokladu, že se současně chromatografují i látky o známé relativní molekulové hmotnosti nebo se za stejných podmínek připraví předem kalibrační křivka (obr.2.43).

Obr.2.43

Vynesení relativních elučních objemů proti logaritmu molekulových hmotností různých proteinů. Chromatografie byla provedena na Sephadexu G-200 při pH 7.5.

82

Gelová chromatografie se vžila jako standardní metoda v biochemii a analýze biomakromolekulárních látek. Příčiny toho, jsou: 1. Látky se dělí podle velikosti molekul nebo relativní molekulové hmotnosti. Je to jediná chromatografická metoda, která dělí podle této proměnné veličiny. 2. Gelová chromatografie se velmi dobře hodí pro separaci biomakromolekul, protože gely jsou fyzikálně-chemicky natolik podobné eluentu, že i velké molekuly mohou dosáhnout střední hodnoty distribučního koeficientu navzdory svému velkému povrchu a dají se tudíž chromatografovat bez použití gradientů. 3. Gelová chromatografie je šetrná separační metoda a dají se separovat i labilní látky, neboť interakce mezi gely a rozpuštěnými látkami jsou, ve většině případů tak malé, že se nedají ani postřehnout, což ovšem neplatí pro sterické zábrany. 4. Gelová chromatografie je téměř nezávislá na složení eluentu, teplotě atd., takže experimentální podmínky lze volit tak, aby byly přizpůsobeny spíše zkoumané látce než separační metodě. 5. Rozdělovací izothermy jsou lineární, takže dělení je nezávislé na koncentraci rozpuštěné látky a lze proto užít i vysokých koncentrací. Limitujícím faktorem je viskozita. 6. Chromatografické rozlišení látek, jehož lze dosáhnout, se mění podle pokusného uspořádání, avšak podobně jako u většiny chromatografických metod počet látek, které lze rozlišit, se pohybuje v rozmezí jednoho řádu. 7. Gelová chromatografie je snadno proveditelná a vyžaduje minimální přístrojové vybavení a pozornost pracovníka.

2.3.10 Chromatografie na měničích iontů Chromatografie na měničích iontů - ionexová chromatografie - je určena pro separaci látek nesoucích náboj. Základem je separace na základě nábojů, které nesou molekuly látek ve směsi. Vzhledem k tomu, že ionexové náplně jsou schopny separovat molekuly, které nesou jen nepatrně odlišné náboje, je ionexová chromatografie technika s vysokou rozlišovací schopností.

Princip ionexové chromatografie

83

Separace látek při ionexové chromatografii závisí na reversibilní adsorpci látky na ionex. Jednotlivé látky se váží na ionex pouze tehdy, jestliže nesou náboj opačný než je náboj ionexu. Proto se pro separaci různých směsí látek nehodí stejný ionex. Ionty se váží na ionex převážně elektrostatickými silami; van der Waalsovy síly a polární interakce, které se při vazbě iontu na ionex rovněž uplatní, bývají mnohem slabší, takže charakter procesu nezmění. Dělení látek při ionexové chromatografii proto probíhá hlavně podle nábojových vlastností separovaných látek. K separaci látek ze směsi dochází proto, že jednotlivé látky mají různou afinitu k ionexu, způsobenou rozdíly v nábojích. Rozdíly v nábojových vlastnostech jsou u biologických látek značné, proto je ionexová chromatografie schopna oddělit i dvě látky velmi podobných vlastností (např. dvě bílkoviny lišící se pouze v jedné aminokyselině). Látky se stejným nábojem jako je náboj ionexu a látky bez náboje procházejí kolonou bez zadržení (pokud se neuplatní jiné separační mechanismy), naopak látky nesoucí náboj opačný než je náboj funkčních skupin použitého ionexu se na náplň kolony váží. Síla vazby přitom závisí na velikosti rozdílu v nábojích mezi ionexem a danou látkou. Pevnost vazby sloučeniny na ionex může být regulována různými podmínkami (pH, iontová síla, kapacita ionexu).

Výběr ionexu pro separaci Ionex se skládá z nerozpustné matrice, na níž jsou kovalentně navázány skupiny nesoucí náboj. Tyto skupiny jsou ve spojení s pohyblivými ionty s opačným nábojem tzv. protiionty. Protiionty mohou být reversibilně zaměňovány za jiné stejně nabité ionty, aniž by došlo ke změně matrice. Ionexy se vyrábějí jak s kladně tak i se záporně nabitými skupinami. Kladně nabité ionexy mají negativní protiionty (anionty) schopné výměny, nazývají se proto anexy. Negativně nabité ionexy mají jako protiionty kationty a nazývají se katexy (viz obr.2.44). Základní charakter dodávají ionexu kovalentně vázané nabité skupiny. Druh tzv. funkční skupiny udává typ a sílu ionexu, jejich celkové množství a využitelnost určuje kapacitu ionexu. Tab.3 uvádí skupiny, které se nejčastěji používají k vazbě na matrici. Sulfoskupiny a kvarterní aminoskupiny se používají pro přípravu silných ionexů; fosfoskupina tvoří ionex střední síly, ostatní uvedené skupiny dávají slabé ionexy. Označení 84

slabé, střední a silné ionexy vyjadřuje stupeň disociace skupin v závislosti na pH. Zatímco silné ionexy jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH, disociace slabých ionexů je naopak na pH silně závislá. Slabé ionexy ztrácejí náboj při pH pod 6 resp. nad 9.

Obr.2.44

Schema anexu a katexu s výměnnými opačně nabitými ionty

Tabulka 3 Funkční skupiny užívané pro ionexy anexy aminoethyl (AE-) diethylaminoethyl (DEAE-) kvarterní aminoethyl (QAE-) katexy karboxymethyl (CM-) fosfo sulfopropyl (SP-)

funkční skupiny - OCH2CH2NH3+ - OCH2CH2N+H(CH2CH3)2 -OCH2CH2N+(C2H5)2CH(OH)CH3 - OCH2COO- PO4H2- CH2CH2CH2SO3-

Důležitý je i typ nerozpustné matrice, který se pro ionex použije. V současné době jsou nejčastěji používány následující typy: Ionexové pryskyřice (obr.2.45a) jsou tvořeny hustou sítí matric hydrofobních polymerů, které jsou do značné míry substituovány ionizovanými skupinami. Mají velkou kapacitu pro malé ionty. Vzhledem k vysokému stupni zesítění jsou "oka" v síti matrice malá, takže kapacita ionexových pryskyřic pro bílkoviny je nízká. Značně vysoká hustota náboje způsobuje velmi silnou vazbu. Hydrofobní matrice často bílkoviny denaturuje, proto výtěžky bývají nízké. Částice ionexu jsou tuhé a mají tvar kuliček, což umožňuje dobrý průtok ionexem. Ionexy, odvozené od celulosy (obr.2.45b) jsou tvořeny celulosou nebo modifikovanou celulosou, která je substituována nabitými skupinami. Jejich kapacita pro malé ionty je malá, protože stupeň substituce je nízký (jinak by se stala celulosa rozpustnou ve vodě). Přednost

85

celulosových ionexů před ionexovými pryskyřicemi spočívá v jejich hydrofilní matrici, která jen velmi zřídka bílkoviny denaturuje. Průtok celulosovými ionexy je zpravidla špatný, protože částice jsou nepravidelného tvaru a jsou měkké nebo fragilní. Na celulosových materiálech nelze separovat bílkoviny s celulolytickou aktivitou. Sephadexové ionexy jsou tvořeny dextranovými gely, které jsou substituovány nabitými skupinami. Tyto ionexy mají střední kapacitu pro malé ionty, protože zesítění polysacharidových řetězců umožnilo užít vyššího stupně substituce. Struktura ionexové matrice je otevřená. Hydrofilní sacharidová matrice většinou nedenaturuje labilní látky, jako např. proteiny a interakce jiného než iontového typu jsou velmi malé. Sephadexové ionexy mají střední průtokové vlastnosti, protože částice jsou sice měkké, mají však tvar kuliček. Vlastnosti některých dextranových iontoměničů uvádí tab.4.

Obr.2.45

Struktura některých ionexů (a) polystyrenová pryskyřice zesítěná divinylbenzenem, (b) celulosový nosič

86

87

Tabulka 5 Některé druhy ionexů

Žádný z uvedených ionexových materiálů však není universální a nehodí se pro všechny typy separací. Výběr vhodného ionexu závisí zejména na : stabilitě separovaných látek velikosti molekul separovaných látek specifických požadavcích pro jednotlivé aplikace Protože některé biologicky aktivní látky jsou amfolyty (nesou kladně i záporně nabité skupiny), mohou se za určitých okolností vázat na katex i anex. Vazba je reversibilní a je založena na elektrostatických interakcích. Náboj, který tyto látky např. bílkoviny nesou, je závislý na pH. V izoelektrickém bodě (pI) je celkový náboj látky nulový a proto se neváže ani na katex ani na anex. Při pH nižším než je izoelektrický bod nese látka kladný náboj a váže se na katex, při pH nad izoelektrickým bodem má záporný náboj a váže se tedy na anex (obr.2.46). Při práci s bílkovinnými roztoky je limitujícím faktorem stabilita separovaných látek za daných podmínek. Neznáme-li izoelektrický bod bílkovin, vycházíme z předpokladu, že většina bílkovin má pI v rozmezí pH 5-6 a je stabilní obvykle v rozmezí pH 6-9. Spolehlivější je samozřejmě, známe-li hodnotu pI pro danou bílkovinu. V současné době již není problém toto s pomocí některých technik (např. izolelektrická fokusace) zjistit. K tomu, aby se bílkovina na daný ionex navázala je třeba, aby rozdíl mezi pI bílkoviny a pH pufru, ve kterém je chromatografie prováděna, byl minimálně jedna jednotka pH.

88

Obr.2.46

Náboj bílkoviny jako funkce pH

Tzn. je-li izoelektrický bod bílkoviny např. 5,6, k vazbě na anex bude docházet při pH nad 6,6, zatímco při pH nižším než 4,6 se bílkovina bude vázat na katex. Při vlastním experimentu je třeba zvolit takové pH, při němž se naváže veškerá látka ze vzorku, které však není příliš vzdálené od pH, kdy ještě k vazbě nedochází. Jestliže se totiž zvolí pH příliš vzdálené, velice se znesnadní desorpce látky z ionexu. Výběr ionexu závisí i na velikosti separovaných molekul. Zatímco pro separaci malých molekul se dobře hodí ionexy na bázi pryskyřice, pro velké molekuly jsou vhodnější celulosové ionexy. Dextranové ionexy, které se vyrábějí různě zesítěné, je možno použít pro většinu typů molekul. Výběr ionexu se samozřejmě může řídit i jinými požadavky jako je např. průtoková rychlost, možnost opakovaného použití, ekonomické hledisko apod.

Faktory ovlivňující vazbu na ionex Pevnost vazby separované látky na ionex lze ovlivnit zejména volbou vhodných chromatografických podmínek. Nejvýznamnějšími faktory jsou náboj dělených látek (ten závisí na pH), iontová síla a kapacita ionexu. Vliv pH na velikost náboje byl již diskutován v části o výběru vhodného ionexu. Látky, separované pomocí ionexové chromatografie, mají charakter amfolytů. Jejich náboj se tedy mění s pH; při nízkém pH jsou nabity pozitivně, při vysokém pH negativně. Při určitém středním pH je výsledný náboj nulový (pro bílkoviny izolelektrický bod).

89

Vliv iontové síly je významný z hlediska volby startovního i elučního pufru. Jestliže množství iontů v roztoku vzrůstá, každý jednotlivý ion bude vázán méně pevně. To se dá vysvětlit jako následek zvýšené kompetice mezi různými ionty v roztoku, které se váží na nabité skupiny ionexu. Podrobnější analýza s využitím jiného fyzikálně-chemického modelu ukázala, že určujícím činitelem vazby je iontová síla. Iontová síla je dána vztahem I = 1/2 i ∑ ci zi2

(24)

kde se do součtu berou všechny druhy iontů v roztoku, ci jsou látkové koncentrace těchto různých iontů a zi jsou jejich náboje. Koncentrace, představují aktuální koncentrace, takže v roztocích tlumivých roztoků (pufrů) stupeň ionizace slabých elektrolytů je třeba vypočítat (vychází se jak ze změřených hodnot pH tak i z pKa nebo pKb). Pufry o předem zvolené iontové síle se však dají připravit na základě úvahy, že dva roztoky o téže iontové síle po vzájemném smíchání pořád dávají roztok o dané iontové síle za předpokladu, že při mísení roztoku neprobíhá žádná reakce. Třetím důležitým ukazatelem je kapacita ionexu. Ionexy mají určitou kapacitu a jestliže je látka v množství překračujícím kapacitu ionexu, její nadbytek se na ionex neváže. Kapacita ionexu je pro různé látky rozdílná: objemné molekuly nemohou dosáhnout všech nabitých skupin uvnitř ionexu, což vede ke snížení kapacity ionexu pro tyto molekuly. Kapacitu ionexu mohou ovlivnit i jiné typy vazby než jsou elektrostatické interakce.

Hlavní fáze ionexové chromatografie (viz obr.2.47) - ekvilibrace ionexu - navázání látek ze vzorku a vymytí nenavázaných složek - změna podmínek, která vede k selektivní desorpci - regenerace ionexu

90

Obr.2.47

Průběh ionexové chromatografie 1 ionex v rovnováze s protiionty 2 náhrada protiiontů nabitými skupinami ze separované směsi 3 ionty s malou afinitou k ionexu jsou desorbovány a nahrazeny protiionty z pufru 4 desorpce zbývajících iontů a jejich náhrada gradientovými ionty 5 náhrada gradientových iontů protiionty startovního pufru

Ekvilibrace ionexu Ekvilibrace ionexu se provádí startovním pufrem před tím, než je na kolonu aplikován vzorek. Výběru druhu pufru i pH je třeba věnovat značnou pozornost. Zdaleka ne všechny pufry jsou pro ionexovou chromatografii vhodné a to i v případě, že je splněna podmínka vhodného pH. Např. pufr, obsahující citrátové ionty se pro tento typ chromatografie nehodí, protože dochází ke snižování kapacity ionexu v důsledku vazby iontů na ionex. Iontová síla startovního tlumivého roztoku, který používáme při prvním stupni chromatografie by neměla být příliš nízká, protože ekvilibrace ionexu je obtížnější a zdlouhavá, zpomaluje se výměnná kinetika, čímž se zhoršuje chromatografické rozlišení. Dochází rovněž ke smršťování ionexu a tím se mění průtok kolonou. Obvykle se doporučuje iontová síla 0.05 - 0.1 mol/l.

Sorpce a desorpce Vlastní separační proces probíhá ve dvou oddělených fázích. V prvním kroku dochází k navázání látky, určené k separaci na ionex. Ve druhé fázi pak musí být navázané látky z kolony desorbovány. Ionexová chromatografie se obvykle provádí v kolonách. Je třeba vzít v úvahu, že rozměry kolony resp. rozměry chromatografického materiálu v koloně umístěného mají zásadní význam pro úspěšnost separačního procesu. Výšku kolony je třeba zvolit 91

takovou, aby látky ze směsi byly absorbovány v horní části kolony, nejméně však 1-2 cm od dolního okraje. Velice složité směsi je nutno dělit na delších sloupcích, pro laboratorní měřítko se však většinou vystačí se sloupci do 20 cm. Průměr sloupce závisí na tom, kolik ionexu je nutno do sloupce umístit (při předem zvolené výšce). Průměr sloupce tedy závisí na požadované kapacitě ionexové náplně. Kolony pro ionexovou chromatografii mají obvykle větší průměr a jsou krátké. Na kolonu aplikujeme vzorek, který by měl být rozpuštěn v ekvilibračním pufru, nebo alespoň by měl mít pH odpovídající zvolené hodnotě a nízkou iontovou sílu. Při ionexové chromatografii nezáleží na objemu aplikovaného vzorku, pouze na koncentraci separovaných látek ve vzorku. Jestliže totiž aplikujeme takové množství, že je přesažena kapacita kolony, část separovaných látek se nenaváže a vymyje se z kolony bez separace. Ideální je, obsahujeli vzorek takové množství dělených látek, které odpovídá asi 80-90% kapacity ionexu. Desorpce látek vázaných na ionexu se zpravidla provádí změnou složení eluentu. Mění se buď pH nebo iontová síla roztoku, výjimečně i oba tyto faktory. Tyto změny mohou být kontinuální nebo diskontinuální (obr.2.48). Diskontinuální změny často uvolňují několik látek najednou a ty jsou pak eluovány v ostrém vrcholu. Ostré vrcholy však ještě neznamenají vysoké chromatografické rozlišení. Tytéž látky mohou být eluovány v ostrých vrcholech, přičemž jeden široký vrchol má začátek před provedenou změnou složení eluentu a jeden vrchol se objeví po provedené změně. Kontinuální změna ve složení eluentu zpravidla dává lepší chromatografické rozlišení. V předběžných pokusech by se proto mělo používat kontinuálních gradientů. Gradienty pH (obr.2.49) mají tu výhodu, že nezpůsobují změnu objemu chromatografické náplně u silných ionexů. Gradienty iontové síly se naproti tomu dají snáze ovládat; se změnou poměru tlumičů se úměrně mění iontová síla, kdežto pH se nemění lineárně se změnou vzájemného poměru tlumivých roztoků. Aby se dosáhlo uvolnění látek z ionexu, iontová síla má být vždy volena ve vzestupném směru. pH gradienty by měly směřovat

k izoelektrickým bodům látek,

vázaných na ionexy. Pro anexy to znamená gradient směrem k nižším hodnotám pH, pro katexy směrem k vyššímu pH.

92

Obr.2.48

Kontinuální a diskontinuální gradientová eluce (gradient iontové síly) hovězího sera na QAE-Sephadexu A-50 1. vrchol v obou diagramech představuje IgG (imunoglobulin G), 4. vrchol na grafu A je serový albumin. Při diskontinuální eluci se eluuje albumin ve dvou vrcholech (4 a 5).

Obr.2.49

Eluce nelineárním gradientem (gradient pH) hemocyaninu na DEAE- Sepharose CL-6B

Jestliže se složení eluentu rychle mění (příkré gradienty), látky se budou vymývat s mnohem menším objemem eluentu, budou se však vymývat vzájemně blíže, takže rozlišení může být nižší. Jsou-li vlastnosti separovaných látek známy, lze gradienty utvářet tak, aby bylo dosaženo maximálního rozlišení a přitom rovnoměrného rozložení chromatografických vrcholů. V oblasti, kde se eluuje najednou několik látek, by měl být gradient mírný, kdežto

93

strmých gradientů by se mělo užít tam, kde se od sebe chromatografické vrcholy příliš vzdalují. Kontinuální gradienty tedy mohou mít tvar nejen lineární, ale i konkávní a konvexní (obr.2.50). Účelem je, aby při iontových silách, kdy se eluuje více látek, byl gradient méně strmý než v oblastech, kde je eluována jen jedna látka. Konvexní gradienty tedy zlepšují chromatografické rozlišení v konečných fázích gradientu, konkávní gradienty naopak v počátečních fázích.

Obr.2.50

Různé typy gradientů (a) lineární, (b) konkávní, (c) konvexní

Ve výjimečných případech lze provádět eluci startovním pufrem. Tento typ se nazývá izokratická eluce a je použitelný tehdy, jsou-li látky na kolonu vázány nepříliš pevně. Eluce však pak bývá dosti zdlouhavá. Chromatografické dělení je také ovlivňováno průtokovou rychlostí mobilní fáze. Nejčastěji se používá průtokových rychlostí okolo 5 cm/hod. Protože ionexy, používané při separaci biomolekul, mají částice poměrně měkké, dochází při příliš vysokém pracovním tlaku nad náplní ke zhušťování náplně a tím i ke snižování průtoku kolonou. Průtokovou rychlost je proto třeba udržovat tak nízkou, aby pracovní tlak byl mírně pod hranicí optima. V průběhu pokusu může rovněž gradient způsobit, že se ionexové částice svraští, přičemž se mění jejich vlastnosti. Jestliže přítok ke koloně je udržován pouze vlivem váhy sloupce přitékající mobilní fáze, bude se tedy průtok měnit. K udržení stálé průtokové rychlosti se proto používají ve většině případů pumpy.

94

Regenerace ionexu Po skončené eluci se obvykle provádí regenerace ionexu. V malých analytických pokusech je regenerace někdy neekonomická, protože množství ionexu v koloně je tak malé, že práce spojená s regenerací je nákladnější. Pracujeme-li však ve větším měřítku, je třeba regeneraci provést. Jestliže byly eluovány všechny látky, o něž máme zájem i ty které nepotřebujeme, provedeme regeneraci promytím startovním pufrem. Zda-li došlo k ekvilibraci již použitého ionexu zkontrolujeme tak, že změříme pH a vodivost ve vytékající kapalině. Jestliže však některé látky zůstanou zadrženy v koloně, je třeba je vymýt. Chcemeli tak učinit u látek navázaných silami iontové povahy, zvýšíme iontovou sílu. K odstranění látek, které na koloně vyprecipitovaly nebo jsou velmi pevně vázány, se dá použít 0.1 M NaOH, detergentů, které se na ionex neváží, nebo organických rozpouštědel, jako je např. ethanol. Regenerujeme-li tímto postupem, je třeba se přesvědčit, že ionexy byly upraveny do výchozího stavu. Všechny promývací postupy, uvedené výše, vyžadují, aby byl ionex z kolony předem vyprázdněn a po promytí ionexu kolona znovu naplněna.

2.3.11 Chromatofokusace Chromatofokusace je metoda separace bílkovin založená na rozdílném izoelektrickém bodě (IEP, pI) separovaných bílkovin. Jde o zvláštní typ ionexové chromatografie. Zásadní odlišnost chromatofokusace od ostatních ionexových metod spočívá v tom, že gradient pH je vytvářen přímo na koloně (obr.2.51). Jestliže tlumivý roztok o určitém pH protéká ionexovou kolonou, nastavenou na odlišné pH, vytváří se na koloně pH gradient. Jestliže se takový pH gradient užije k eluci proteinů, navázaných na ionex, proteiny se eluují v pořadí podle svých IEP. Během eluce se uplatní tzv. fokusační efekt, jehož výsledkem je zaostřování zon na koloně, koncentrace vzorku a v důsledku toho i vysoká rozlišovací schopnost. Obvykle se udává, že je možno oddělit bílkoviny, jejiž IEP se liší o více než 0.05 jednotek pH.

95

Náboj bílkoviny závisí na jejím izoelektrickém bodě a na pH prostředí (obr.2.52). Jestliže pH prostředí je nižší než IEP, bílkovina nese kladný náboj, nebude se vázat na sloupci anexu a bude se pohybovat v elučním tlumiči směrem dolů. Směrem dolů však na koloně roste pH. Proto se bílkovina bude pohybovat ve směru rostoucího pH. Jakmile se dostane do míst, kde okolní pH bude vyšší než její IEP, změní se její náboj a bílkovina se naváže na anex. Molekula zůstane navázaná do té doby, než klesající pH gradient postoupí na koloně tak daleko, že okolí navázané bílkoviny bude mít pH nižší než IEP. V tom okamžiku se vazba na anex zruší a bílkovina bude putovat kolonou opět až do míst s pH vyšším než je její IEP, kde se znovu naváže. Tento proces se opakuje tak dlouho, až bílkovina v izoelektrickém stavu vyteče z kolony (obr.2.53).

Obr.2.51

Tvorba gradientu (A) při ionexové chromatografii, (B) při chromatofokusaci

96

Obr.2.52

Chování bílkovinných molekul při chromatofokusaci pH roste na koloně směrem dolů (na obrázku zleva doprava). Při pH nad pI jsou bílkoviny záporně nabité a váží se na ionex, při pH pod pI jsou nabité kladně a na anex se neváží. Protein 1 má pI=7, protein 2 pI=8

Protože v izoelektrickém bodě nenese bílkovina žádný náboj, neváže se na ionex a postupuje kolonou bez zadržení. Jakmile dojde ke změně pH, bílkovina získá náboj, naváže se na ionex a přestane se pohybovat. Bílkoviny s různými izoelektrickými body než se naváží urazí na koloně s gradientem pH různé vzdálenosti. Tím dojde k jejich separaci a vytékají z kolony odděleně.

Obr.2.53

Tvorba pH gradientu (pH 9-6) na sloupci PBE 94 při eluci amfolytem Polybuffer 96

Během chromatografického procesu se vlivem vnitřního pH gradientu vytváří tzv. fokusační (zaostřovací efekt) efekt (obr.2.54).

97

Obr.2.54

Fokusační (zaostřovací) efekt chromatofokusace Molekuly v levé části obrázku se neváží na gel (pH < pI), proto se pohybují rychle až do okamžiku, kdy se dostanou do oblasti, kde pH > pI. Tam dostihnou ostatní ionty.

Molekuly, které by se zrychlily při svém postupu kolonou, by se dostaly do oblasti s vyšším pH, kde by zůstaly do okamžiku, kdy v jejich okolí klesne pH pod IEP, a tam by byly dostiženy ostatními molekulami se stejným IEP. Proto zony látek se stejným IEP jsou úzké a velmi ostré. Jestliže je na kolonu aplikován vzorek, pohybují se jeho jednotlivé složky směrem dolů s eluentem, až dosáhnou oblasti s pH vyšším než je jejich IEP. Poté se pohybují pomaleji až se eluují. Jestliže se před tím, než se začne první vzorek eluovat z kolony, přidá na kolonu druhý podíl vzorku, bude se pohybovat směrem dolů stejnou rychlostí jako eluent, až se setká s pomaleji se pohybujícím prvním podílem vzorku. Dále se pohybují oba podíly současně. V případě, že v druhém podílu je obsažena složka s nižším IEP než mají složky prvého podílu, druhý podíl může dokonce prvý předejít. Při separaci bílkovin chromatofokusací musíme rozhodnout, v jakém intervalu pH budeme pracovat. IEP bílkovin, které nás zajímají, by měly ležet přibližně ve středu tohoto intervalu. Ionex, na kterém budeme pracovat, ekvilibrujeme startovním tlumivým roztokem, jehož pH bude o něco vyšší než je horní hranice intervalu pH (asi o 0.4 pH jednotky). Eluční tlumivý roztok bude mít pH rovné spodnímu limitu pH gradientu. Vzorek se ekvilibruje elučním tlumičem (o nízkém pH) a nanese se na kolonu, která je pak promývána elučním tlumičem. Vzhledem k tomu, že kolona je ekvilibrována na vyšší pH než má eluční tlumič, automaticky se vytvoří sestupný pH gradient. V tom případě je třeba užít ionex, který má bazické skupiny, tedy anex. Jak prochází eluční tlumič kolonou, kyselé skupiny se zachycují na bazických skupinách anexu, takže pH roztoku, který opouští kolonu v počátečních fázích chromatografie, se blíží pH startovního tlumiče (horní hranice pH gradientu). Jak eluce pokračuje, pH na koloně se postupně snižuje, až v závěrečných fázích eluce je na celé koloně dosaženo rovnováhy s elučním tlumičem a pH vytékajícího roztoku je velmi blízké pH roztoku nad kolonou. V praxi se obvykle pracuje v intervalu maximálně tří jednotek pH. Jestliže je znám IEP vzorku, volíme interval pH tak, aby IEP požadované složky ležel v 1/3 -1/2 gradientu pH. Jestliže pracujeme s neznámým vzorkem, je nutno IEP zjistit experimentálně. Důležité je rovněž zvolit odpovídající množství ionexu pro separaci. Obvykle postačuje 20-30 ml ionexové fáze na separaci 1-200 mg bílkoviny na jednotku pH gradientu. 98

Ionex, stejně jako u každé ionexové chromatografie, musí být ekvilibrován startovním tlumičem (10-15ti násobek objemu kolony). Úspěšnost separace bílkovin u všech kolonových chromatografických technik závisí na šířce eluovaných zon a na jejich vzdálenosti. Šířka pásu bílkoviny při chromatofokusaci závisí na následujících faktorech: Náplň kolony. Je třeba používat ionex s vysokou tlumivou kapacitou, která se nemění v širokém rozmezí pH a rovněž tlumič se stálou pufrovací schopností v širokém rozmezí pH. Plnění kolony. Vzhledem k tomu, že při chromatofokusaci se vytvářejí velmi úzké zony separovaných bílkovin, každá nepravidelnost v plnění kolony má za následek výrazné zhoršení separace. Strmost pH gradientu. Pro optimální dělení bílkovin chromatofokusací se doporučuje pozvolný pH gradient. Toho lze dosáhnout použitím pufrů o nízké koncentraci, které dávají pouze jemné změny pH. Pak dojde k dobré separaci jednotlivých vrcholů. Pozvolný gradient má též za následek užší zony vzhledem k jednotkám pH. Nesmí se však zvolit příliš pozvolný gradient, neboť pak by šíře zon vzhledem k objemu byla značná a vzorek by se při eluci velmi ředil. Doporučuje se volit strmost gradientu takovou, aby objem eluentu byl asi 10-15ti násobkem objemu, který zaujímá ionex. Náboj ionexu. Rozdíl nábojů mezi ionexem a okolním mediem má za následek vytváření ostrých zon při chromatofokusaci. Proto je třeba udržovat iontovou sílu eluentu a jeho koncentraci na nízkých hodnotách.

2.3.12 Chromatografie s reversní fází Jak již bylo řečeno v úvodu, základem všech chromatografických metod je systém dvou nemísitelných fází, z nichž jedna je stacionární a druhá mobilní. Zatímco mobilní fází je vždy kapalina, stacionární fází může být buď kapalina zakotvená na inertním nosiči nebo tuhá látka. Většina chromatografických metod používá polární stacionární fázi, mobilní fáze může a nemusí být nepolární. V LLC systému je možno jako stacionární fázi zakotvit i nepolární kapalinu a mobilní fází je pak kapalina polární. Toto uspořádání se označuje jako chromatografie s reversní fází (RPC), vyžaduje však specielní nosiče, do nichž je možno

99

nepolární fázi zakotvit. V LSC systému se po dlouhou dobu toto uspořádání neuplatnilo, neboť nebyly k dispozici hydrofobní adsorbenty. Ke značnému rozvoji RPC došlo, když se začly používat chemicky vázané stacionární fáze a to polární i nepolární. Tento typ chromatografie se pak nazývá chromatografie s vázanou fází. Stacionární fáze chemicky vázané na nosiči mají výhody ve srovnání s kapalnými fyzikálně zakotvenými fázemi (nedochází k vymývání z kolony ani vlivem rozpouštění v mobilní fázi ani vlivem koroze při velkém průtoku atd.). Zatímco při běžné LLC se setkáváme s řadou omezení, chromatografie s vázanou fází většinu z nich odstraňuje. Jde především o to, že při LLC je stacionární fáze zakotvena na nosiči pouze slabými mechanickými silami a při vyšším průtoku mobilní fáze je nebezpečí, že bude strhávána s eluentem. Použití vyšších průtoků je proto vyloučeno. V systému kapalina-kapalina by se dále měly používat dvě zcela nemísitelné kapaliny, což je v praxi nereálné. Mobilní fáze musí být proto předem sycena stacionární fází, a to znamená zařazení dalšího kroku. Dále se musí pracovat v poměrně úzkém rozmezí rozdělovacích koeficientů a pokud se nepracuje s ternárními systémy, není možno zvyšovat eluční sílu mobilní fáze ani používat gradientovou eluci. Chromatografie s vázanou fází naproti tomu umožňuje jak použití vysokých průtoků, tak použití mobilní fáze s vysokou eluční silou, gradientovou eluci a dosti široké rozmezí rozdělovacích koeficientů. Příprava sorbentů s vázanými nepolárními stacionárními fázemi umožnila vznik kvalitativně nového chromatografického způsobu, a to chromatografie s vázanou reversní fází, která teprve umožnila dokonalé využití reversní chromatografie, což v podstatě znamená využití LLC pro separaci nepolárních látek. Hlavní výhodou chromatografie s vázanou reversní fází je však nesmírně jednoduché provedení; není třeba provádět dlouhou ekvilibraci stacionární fáze mobilní fází, gradienty se velmi snadno realizují a reprodukují a kolony dávají reprodukovatelné výsledky po dlouhou dobu bez zvláštních požadavků na skladování. Systémy s obrácenými fázemi se v současné době používají zejména v HPLC.

Mechanismus separace Mechanismus separace při použití nepolární chemicky vázané fáze není dosud zcela jasný. Jednou možností je dělení mezi dvě kapalné fáze (stacionární a mobilní), pak by se

100

jednalo o klasickou rozdělovací chromatografii. Druhou možností je vazba na nepolární adsorbent, takže RPC by byla klasickou adsorpční chromatografií, založenou na hydrofobních interakcích. Byla navržena ještě třetí možnost mechanismu separace: organický modifikátor mobilní fáze je přednostně adsorbován a vytváří se adsorbovaná vrstva na stacionární fázi, jejíž složení se liší od fáze mobilní. Dělení látek z roztoku se pak uskutečňuje mezi mobilní fází a novou "směsnou" stacionární fází. Modifikovaný silikagel (vázaná fáze) pak poskytne pouze povrch, který se obalí novou stacionární fází. Je však otázka, zda bude někdy vytvořena jednotná teorie na mechanismus chromatografie s reversní fází. Je totiž velice pravděpodobné, že mechanismus jednotný není, neboť vázané stacionární fáze jsou velice různorodé a pravděpodobně ovlivní mechanismus separace. Předpokládá se, že např. použijí-li se jako stacionární fáze polymerní fáze, pak se pravděpodobně uplatní rozdělování mezi dvě kapalné fáze. Při použití silikagelu modifikovaného vrstvou uhlíku půjde asi spíše o adsorpci na pevný povrch.

Stacionární fáze Jako chemicky vázané nepolární stacionární fáze se dnes nejčastěji používají grafitové nebo uhlíkem potažené silikagely, eventuálně též kopolymery styrenu a divinylbenzenu. Nejslabším rysem komerčně vyráběných stacionárních fází je jejich malá pH stabilita. Proto se začínají používat nové typy, např. bifunkční silany, které obsahují jedno vazebné místo na každém ze dvou atomů křemíku, nebo silany obsahující isopropylové skupiny na křemíkovém atomu silanů. Tyto skupiny pravděpodobně zajišťují stérickou ochranu Si-O-Si skupin před kyselou hydrolýzou a umožňují proto používání mobilní fáze s nízkým pH.

Mobilní fáze V systému s obrácenými fázemi se zvětšuje retence látek s rostoucí nepolární částí v jejich molekulách. Rovněž počet aromatických jader v molekulách zvyšuje jejich retenci, naopak přítomnost silně polárních skupin retenci snižuje (-NH2, -OH, -COOH ). Pokud je v molekule přítomno více polárních skupin a uhlovodíková část molekuly je malá (cukry,

101

nukleosidy, některé baze nukleových kyselin) může převažovat afinita těchto látek k H2O jako mobilní fázi nad hydrofobními interakcemi působícími vylučování organických látek z vodné fáze. Tyto látky mají eluční objem blízký nebo menší než VM (objem mobilní fáze v koloně). Uvedený jev lze někdy kompenzovat a tím zvýšit retenci silně polárních látek potlačením jejich disociace (úprava pH) nebo zvýšením iontové síly mobilní fáze. Selektivitu při RPC lze ovlivňovat volbou organické složky mobilní fáze a využitím jejich selektivních interakcí s chromatografovanými látkami. Ve většině případů aplikací chromatografie s vázanou reversní fází slouží jako mobilní fáze směs vody a organického rozpouštědla, nejčastěji methanolu, ethanolu, acetonitrilu nebo dioxanu. Eluční síla mobilní fáze roste s klesající polaritou organického rozpouštědla, tedy v obráceném pořadí než při chromatografii na polárních adsorbentech. Nejslabším eluentem je voda, zatímco již methanol je schopen uvolnit z vazby na sorbent všechny navázané molekuly. Nejčastěji se eluce provádí gradientem od vody směrem k methanolu, neboli gradientem koncentrace methanolu. Za silnější eluenty než methanol se považují (v pořadí stoupající síly) ethanol, acetonitril, dioxan a isopropanol. Chromatografie s reversní fází se nejčastěji uplatňuje pro analytické účely a to v uspořádání HPLC.

2.4 Metody založené na molekulovém rozpoznávání Příroda ovládla během evoluce nejen schopnost vytvářet a štěpit kovalentní vazby, ale dokázala využít k realizaci svých záměrů i vzájemnou interakci některých molekul. Řada látek v přírodě má schopnost specificky rozpoznat molekuly, s nimiž vytváří funkční dvojice. Říkáme, že tyto látky mají k sobě afinitu. Vzhledem k tomu, že alespoň jednou z interagujících molekul je biopolymer, označujeme tyto interakce jako biospecifické. Tak např. enzymové reakce jsou umožněny afinitou mezi enzymem a substrátem, ev. mezi enzymem a kofaktorem; imunitní system je založen na schopnosti rozpoznat antigen specifickou protilátkou; nukleové kyseliny se váží navzájem (párování bazí - základ genetického kódu) nebo s proteiny; řada malých molekul (mastné kyseliny, vitaminy a další)

102

jsou specificky transportovány proteiny. Vysoký stupeň specifity byl pozorován mezi hormonem a jeho receptorem. Biospecifických interakcí při rozpoznávání molekul ("biorecognition") se v nedávné minulosti začalo využívat v analytické chemii, ale i k izolaci biopolymerů z biologického materiálu. Později se pro výše zmíněné účely začaly studovat i některé syntetické sloučeniny, které mohou za určitých okolností nahradit jeden člen ve specifické dvojici. Vyvinuly se speciální metody, mezi nimiž nejvýznamnější roli hraje bioafinitní chromatografie. Jí a dalšími metodami, založenými na molekulovém rozpoznávání, se budeme v této kapitole zabývat.

2.4.1 Bioafinitní chromatografie Bioafinitní

chromatografie,

někdy

též

zvaná

bioselektivní

adsorpce,

je

chromatografická metoda založená na specifických a reversibilních interakcích mezi dvěma biologicky aktivními substancemi. Podstata bioafinitní chromatografie je celkem jednoduchá: využívá se výše naznačených tendencí dvou samostatných molekul vytvářet páry ev. jiným způsobem spolu interagovat. Každá biomolekula (enzym, nukleová kyselina apod.), kterou chceme separovat, má specifickou schopnost rozpoznat jinou, obvykle menší, molekulu, která se označuje jako bioligand nebo obecně ligand. Jestliže je bioligand imobilizován na inertním nosiči (obr.2.55) a protéká-li látka, kterou chceme separovat, kolonou, v níž je imobilizovaný bioligand umístěn, bude separovaná látka na koloně zadržována, neboť se vytvoří komplex biomolekula-bioligand (obr.2.56). Látky, které afinitu k bioligandu nemají, projdou kolonou bez zadržení. Imobilizovaný ligand tedy působí jako adsorbent se specifickou afinitou k látce v roztoku a afinitní chromatografii proto můžeme zařadit mezi adsorpční chromatografii.

Obr.2.55

Schema přípravy afinitního sorbentu 103

Obr.2.56

Adsorpce molekuly na imobilizovaný ligand

Obr.2.57

Eluce purifikovaných molekul

Navázaná biomolekula se pak uvolní z kolony specifickou či nespecifickou elucí (specificky např. volným ligandem nebo kompetující molekulou, nespecificky změnou podmínek - pH, iontové síly, teploty - tzv. deformujícími pufry), při níž komplex biomolekula-bioligand přestává být stabilní a biomolekula se desorbuje z kolony (viz obr.2.57). Tato metoda je velice efektivní, dochází k značnému přečištění separované molekuly. Interakce použité v adsorpčním procesu však musí být stejné nebo alespoň obdobné jako interakce probíhající v přírodě. Na tvorbě biospecifických komplexů se podílejí běžné molekulární síly a interakce, tzv. nekovalentní interakce, jako jsou iontové vazby, hydrofobní interakce, vodíkové můstky, van der Waalsovy síly, Londonovy dispersní síly, dipol-dipol interakce apod. Současné uplatnění několika těchto interakcí v komplementárním vazebném místě je základem vysoké specifity a účinnosti biospecifické vazby. Afinitní vztahy mezi biologickými molekulami jsou

104

regulovány různorodostí typů interakcí, které mezi molekulami existují a které jsou dány jejich prostorovým uspořádáním, nábojem, hydrofobicitou apod. Činnost biologických makromolekul in vivo je řízena malými změnami v jejich okolí. Proto je tvorba biospecifických komplexů velice citlivá na podmínky prostředí, a to nejen na pH a iontovou sílu, ale i na přítomnost kovových iontů, kofaktorů a dalších látek. Hlavní podmínkou bioafinitní chromatografie je tvorba specifického komplexu mezi biomolekulou, která má být separována (A), a bioligandem kovalentně vázaným na inertní nosič (L). k1

A + L ←→ AL k-1

KL = k-1/k1 = [A].[L]/[AL]

k1 a k

-1

(25)

jsou asociační a disociační konstanty výše uvedené rovnice, KL je rovnovážná

konstanta. Rovnovážná konstanta charakterizuje sílu afinity mezi ligandem (L) a molekulou (A). Ligand může být vazbou na pevný nosič modifikován, takže rovnovážná konstanta mezi vázaným bioligandem a biomolekulou nemusí být stejná jako v případě volného komplexu, kdy je rovnovážná konstanta stanovena v roztoku. Úspěch bioafinitní chromatografie spočívá do značné míry v tom, jak se podaří vytvořit pro tvorbu specifického komplexu podmínky analogické těm, které existují v přírodě. Důležitými faktory přitom jsou, vedle výběru vhodného ligandu, volba inertního nosiče a způsob imobilizace bioligandu, jinými slovy volba a příprava vhodného sorbentu pro bioafinitní chromatografii.

Inertní nosič Ideální inertní nosič pro bioafinitní chromatografii by měl splňovat řadu požadavků: - nerozpustnost - nulová adsorpční kapacita - dostatečná permeabilita a velký specifický povrch

105

- vysoká pevnost a vhodná forma částic - chemická reaktivita umožňující vazbu ligandu - chemická stabilita za podmínek požadovaných pro vazbu, desorpci a regeneraci - resistence k enzymovému a mikrobiálnímu napadení - hydrofilní charakter - ekonomicky únosná cena Nosič, splňující všechny tyto vlastnosti neexistuje, proto musíme vždy vycházet z kompromisu a volit takový nosič, který nejlépe vyhovuje podmínkám jednotlivého konkrétního případu. Požadavek nerozpustnosti nosiče je zásadní proto, aby se zabránilo ztrátám bioafinitního sorbentu, ale též proto, aby nedošlo ke kontaminaci izolované látky rozpuštěným nosičem. S čistotou separované látky souvisí i požadavek minimálních nespecifických sorpcí, které mohou způsobit, že na sorbent se váží i látky, které nemají afinitu k ligandu. Tyto nespecifické sopce mohou kromě toho též zvyšovat pevnost specifických vazeb, čímž se velice znesnadní eluce. Velikost specifického povrchu je hlavní faktor ovlivňující kapacitu biospecifického sorbentu. Proto je vhodné volit nosič s co největším povrchem a s dostatečnou porozitou. Pevnost a vhodný tvar částic jsou důležité pro dobrý průtok, zejména používáme-li při chromatografii vyšších tlaků. Chemická reaktivita, t.j. dostatečný počet reaktivních skupin, má zajistit možnost navázání ligandu na nosič. Vazba musí probíhat za podmínek, při nichž nedochází ke změně struktury nosiče ani ligandu. Pro vazbu ligandu nesmí být využity skupiny, které se účastní při tvorbě specifického komplexu biomolekula-bioligand. Naproti tomu, pro opakované použití biosorbentu je nezbytná jeho chemická a mechanická stabilita. Hydrofilní charakter nosiče je vyžadován kvůli zamezení nespecifických sorpcí, ale též pro snížení nebezpečí inaktivace separovaných biologicky aktivních molekul. Hydrofobní charakter nosiče zvyšuje nebezpečí hydrofobních interakcí, které mohou vést nejen k nespecifickým sorpcím, ale i k denaturaci separovaných makromolekul. Nejčastěji se jako nosiče pro bioafinitní chromatografii používají agarosa, speciálně upravené porézní sklo, dextranové gely, polyakrylamid a celulosa.V literatuře však můžeme najít celou řadu přírodních i syntetických materiálů, které byly použity jako afinitní nosiče. Každý z těchto nosičů má své výhody i nevýhody, žádný z nich není, jak jsme již uvedli, ideální.

106

Výhodou agarosy je otevřená struktura, která umožňuje průnik biopolymerů s vysokou molekulovou hmotností, nevýhodou je náchylnost k bakteriální kontaminaci. Nevýhodou celulosy

je vláknitý a nesourodý charakter celulosy, který brání pronikání

velkých molekul. Tato nevýhoda byla odstraněna u perlové celulosy, která má vysokou porozitu,

ale

i

dostatečnou

pevnost

a

dobré

průtokové

vlastnosti.

Výhodou

polyakrylamidových gelů je odolnost proti chemickému i mikrobiálnímu působení a obsah mnoha skupin pro připojení ligandu, nevýhodou však je malá porozita částic a zmenšování objemu při chemické modifikaci.

Ligandy Jako ligandy pro bioafinitní chromatografii jsou vhodné sloučeniny, které se separovanou molekulou tvoří biospecifické, pevné a reversibilní komplexy. Po chemické stránce to mohou být nejrůznější sloučeniny, kromě tří výše uvedených požadavků však musí splňovat další podmínku: musí obsahovat skupinu, kterou lze využít pro kovalentní vazbu na pevný nosič, aniž by tím bylo ovlivněno komplementární vazebné místo pro tvorbu specifického komplexu. Pro izolaci biomolekul jsou nejvhodnější ligandy, které s biomolekulou dávají komplexy s rovnovážnou konstantou ležící v oblasti 10-4 až 10-8 mol.dm-3. Takové komplexy jsou dostatečně pevné, avšak je možné je poměrně snadno desorbovat. Příliš labilní komplexy nezajistí dokonalou separaci, příliš pevné komplexy komplikují desorpci. Ligandy

mohou

být

jak

nízkomolekulární

tak

vysokomolekulární

látky.

Nízkomolekulární ligandy se vyznačují vyšší stabilitou a jednoznačně definovaným způsobem vazby pomocí definovaných funkčních skupin. Protože se jedná o malé molekuly, bývají často pro velké biomolekuly stéricky nedosažitelné, proto se mezi ně a nerozpustný nosič musí vložit oddalovací rameno (bude o něm pojednáno později), které však může být zdrojem nespecifických sorpcí. Vysokomolekulární ligandy (nejčastěji bílkoviny nebo nukleové kyseliny) mají rovněž některé nevýhody. V chromatografickém procesu může docházet k jejich denaturaci a tím i ke ztrátě jejich biologické aktivity. Na jejich vazbě na nerozpustný nosič se podílí více jejich funkčních skupin a proto způsob vazby lze jen obtížně přesně definovat.

107

Obecné ligandy Kromě specifických ligandů se při bioafinitní chromatografii uplatňují i tzv. obecné ligandy. Tyto ligandy interagují selektivně a reverzibilně s celou skupinou komplementárních biomolekul (například s nukloeproteiny, glykoproteiny, dehydrogenasami). Mají sice menší selektivitu než ligandy specifické, ale širší využitelnost. Široký rozsah hodnot rovnovážných konstant skupiny separovaných biomolekul (každá ze separovaných molekul má k ligandu jinou afinitu) umožňuje jejich oddělenou eluci s využitím gradientu iontové síly, pH, teploty, organických rozpouštědel, kompetitivních ligandů, alosterických efektorů, kofaktorů, stejným způsobem jako se provádí eluce u jiných typů LSC. Oficiální klasifikace obecných ligandů nebyla dosud provedena, ale řada autorů se pokouší o zařazení obecných ligandů do skupin podle toho, které biomolekuly s nimi interagují. Obecnými ligandy mohou být: - kofaktory enzymů: NAD, biotin, koenzym A a další kofaktory, které selektivně interagují s enzymy - lektiny (proteiny), které interagují specificky se sacharidy a s cukernou složkou glykoproteinů - receptorové proteiny, které specificky rozpoznají určité hormony: receptory steroidních hormonů, cAMP receptory, insulinové receptory, protilátkové receptory - proteiny, které rozpoznají nukleotidy nebo nukleové kyseliny, (ATP, AMP nebo DNA, RNA apod.) - substráty enzymových reakcí, které se mohou vázat s různou afinitou k celé řadě enzymů - inhibitory enzymových reakcí, které se rovněž váží s příslušnými enzymy Toto samozřejmě není úplný výčet možných obecných ligandů, kromě toho si ligand a separovaná molekula mohou v případě potřeby vyměnit role. Vezměme si jako příklad obecného ligandu kofaktory NAD a NADP. Jsou to kofaktory velkého počtu dehydrogenas, t.j. enzymů ze třídy oxidoreduktas. Většina dehydrogenas interaguje s NAD(P) prostřednictvím specielní oblasti na apoenzymu, která rozpozná adeninovou skupinu. Stejná oblast je u apoenzymů enzymů, které mají jako kofaktor ATP či AMP. NAD(P) může tedy v řadě případů interagovat s oběma typy enzymů. Každý z enzymů však má k vázanému kofaktoru jinou afinitu, takže je možné

108

prostřednictvím bioselektivní eluce je dokonale oddělit. Selektivní eluce se nejčastěji provádí roztokem NAD, často gradientem NAD. Bioselektivní eluci dehydrogenas z vázaného ligandu umožňuje tvorba pevných ternárních komplexů enzym-NAD-substrát, v nichž je NAD vázán pevněji než v binárních komplexech enzym-NAD (povinný mechanismus vazby v ternárním komplexu je v pořadí enzym, NAD, substrát). Binární komplex enzym-NADH, který vzniká v průběhu reakce, je pevnější než komplex enzym-NAD.

Oddalující rameno (spacer) V některých případech může být ligand navázán na nosič přímo. Velice často však, zejména je-li ligand nízkomolekulární látka s molekulovou hmotností nižší než 5000 a biomolekula látka vysokomolekulární, mohou vazbě biomolekuly na ligand bránit stérické překážky. V tom případě je nezbytné ligand oddálit od povrchu nosiče, aby se stal pro biomolekulu dosažitelný. To se děje prostřednictvím oddalujícího ramene (spaceru) (obr.2.58 a 2.59). Délka oddalujícího ramene a způsob jeho připojení na nosič jsou velice důležité faktory, které významně přispívají k úspěšnosti separace.

Obr.2.58

Význam distančního ramene (spaceru) a) bez spaceru b) se spacerem

Jako spacer slouží nejčastěji kratší lineární uhlíkaté řetězce. Na jednom konci musí mít spacer chemickou skupinu, kterou se váže k nosiči (např. primární amin), na druhém konci musí být skupina schopná vázat ligand. Skupina, na níž se váže ligand, se označuje jako terminální a je to buď karboxyl nebo primární amin. Spacer tedy bude sloučenina s pravděpodobným obecným vzorcem typu 109

H2N-(CH2 )n-X kde X je -COOH nebo -NH2

Obr.2.59

Bioafinitní chromatografie chymotrypsinu ma koloně Sepharosy A) ligand s distančním ramenem B) ligand bez ramene C) sorbent bez ligandu

Krátké rameno nemusí vždy úspěšně plnit funkce na něj kladené. Příliš dlouhé rameno může obsahovat hydrofobní zony, které mohou interagovat navzájem a tak způsobit ohnutí ramene a zkrácení jeho efektivní délky (obr.2.60 a 2.61).

Obr.2.60

Příliš krátké distanční rameno a distanční rameno správné délky

110

Obr.2.61

Příliš dlouhé distanční rameno, dochází k interakci uvnitř řetězce a) hydrofobní interakce b) tvorba vodíkových můstků

Hydrofobní zony mohou také způsobit vlivem hydrofobních interakcí nespecifické sorpce. Ještě větším nebezpečím u spacerů s velkými hydrofobními oblastmi je možnost jejich interakce s hydrofobními oblastmi proteinu tak, že hydrofobní aminokyselinové zbytky, které jsou uvnitř proteinu, se dostávají na povrch. Tím ovšem dojde k destabilizaci proteinu a v krajním případě až k jeho denaturaci. Dlouhá ramena mohou kromě toho obsahovat i sekvence, které mají schopnost působit jako iontoměniče a tak opět způsobovat nespecifické sorpce. Oba uvedené případy nespecifických sorpcí jsou obvykle silnější než biospecifické interakce, takže jsou bioafinitní vztahy zcela potlačeny. Proto se někdy používají distanční ramena, která mají hydrofilní charakter (obr. 2.62).

Obr.2.62

NAD jako ligand vázaný na nosič pomocí distančního ramene a) hydrofobního b) hydrofilního

Vazba ligandu na nosič Základní podmínkou pro tvorbu biospecifického komplexu je dobrá stérická přístupnost bioligandu. Dostatečná prostorová volnost závisí na porozitě použitého nosiče a na vzdálenosti ligandu od povrchu nosiče, aby stérické interference byly minimální. Stérické zábrany mohou rušit bioselektivní adsorpci zejména při použití nízkomolekulárních ligandů. Roli pak hraje nejen délka spaceru, ale též tvar povrchu nosiče. Vlivem nerovného povrchu

111

nosiče mohou být některé ligandy velmi dobře přístupné a jiné, připevněné na nosič stejným způsobem, stéricky nedostupné. Stérickými zábranami můžeme v mnoha případech vysvětlit nízkou saturaci molekul imobilizovaného ligandu izolovanou látkou i heterogenitu v afinitě imobilizovaných ligandů (obr.2.63).

Obr.2.63

Sterická nepřístupnost přebytečných ligandů

Pro přípravu homogenního bioafinitního sorbentu je proto nutné volit takové podmínky vazby ligandu na nosič, aby hustota navázaného ligandu byla dostatečně nízká a aby byl ligand vázán na dobře přístupných místech. Nízká hustota ligandu je žádoucí z důvodu zamezení nespecifických vazeb. Vysoká hustota vázaného ligandu totiž umožňuje vytvoření nespecifických vazeb mezi biomolekulami (zejména jde-li o makromolekuly) a sorbentem viz obr.2.65). Nespecifické vazby mohou být, stejně jako vazby specifické v komplementárním vazebném místě, typu elektrostatických nebo hydrofobních interakcí nebo jejich kombinací. Látky přítomné v mobilní fázi se mohou pomocí těchto nespecifických interakcí vázat k molekulám bioafinitního ligandu, ke spaceru i na povrch nosiče. Tyto nespecifické a často mnohonásobné vazby mohou být silnější než komplementární vazba mezi ligandem a biomolekulou. Jestliže se tyto nespecifické vazby uplatňují navíc ke specifické komplementární vazbě, zvyšují sílu vazby ve specifickém komplexu nebo mohou způsobit navázání biomolekuly na imobilizovaný bioligand v nesprávné orientaci. To má za následek desorpci téže biomolekuly v několika frakcích nebo potíže s desorpcí biomolekuly vůbec. Dobré výsledky může tudíž poskytnout pouze sorbent s nízkou koncentrací navázaného bioligandu. Za těchto podmínek je totiž pravděpodobné, že se biomolekula bude vázat na sorbent pouze prostřednictvím biospecifické vazby na imobilizovaný ligand, a to v poměru 1:1. Nebezpečí výskytu nespecifických vazeb je v tomto případě velmi malé.

112

Obr.2.64

Porovnání ideálního a nevhodného bioafinitního sorbentu a) ideální sorbent - může dojít pouze k biospecifické vazbě b) nevhodný sorbent - možnost řady dalších interakcí

Důležitou složkou bioafinitního sorbentu je i nosič, který by měl být inertní, aby nebyl zdrojem nespecifických sorpcí (obr.2.64). Ideální nosič však v praxi neexistuje.

113

Obr.2.65

Specifická a nespecifická sorpce molekul na sorbentu s nerovným povrchem

Adsorpční kapacita sorbentu Adsorpční kapacita sorbentu je mírou schopnosti vázat separované biomolekuly. Udává se v mg separované látky navázané na 1 ml afinitního sorbentu. Závisí především na tzv. stupni substituce nosiče ligandem, t.j. na množství ligandu imobilizovaného na nosiči a na jeho dostupnosti pro biomolekulu. Stupeň substituce se udává u nízkomolekulárních ligandů v μmol na 1 ml nosiče, u vysokomolekulárních ligandů v mg na 1 ml nosiče. Dostupnost ligandu pro separovanou molekulu je silně závislá na porozitě nosiče. Jsou-li jak ligand tak separované látka makromolekuly (mol. hmotnost ≥ 10 000), je porozita rozhodujícím faktorem, neboť látka, která má být separována, musí mít možnost volně procházet póry nosiče. Jestliže je separovanou molekulou nízkomolekulární sloučenina a pouze ligand je makromolekula, pak porozita nosiče musí být taková, aby byla umožněna imobilizace ligandu. V obou uvedených případech však zpravidla není pro imobilizaci nutno použít spacer. V případě, že ligandem je nízkomolekulární sloučenina (mol. hmotnost ≤ 5 000) a separovanou molekulou je makromolekula, porozita nosiče nemá zásadní důležitost, ale ligand musí být umístěn na spaceru, aby byl pro separovanou molekulu dostupný. Vzhledem k tomu, že v afinitních vztazích platí, že 1 molekula separované látky se váže na 1 molekulu imobilizovaného ligandu, má na adsorpční kapacitu sorbentu vliv i poměr molekulových hmotností separované molekuly a ligandu. Proto je třeba při posuzování žádoucího stupně substituce mít na zřeteli velikost ligandu, jeho specifitu a dále porozitu a povrch nosiče. Jestliže je ligand nízkomolekulární látka a separovaná látka je makromolekula, pak může být stupeň substituce velice nízký a přesto se dosáhne vysoké kapacity, a to díky poměru molekulových hmotností obou zúčastněných látek.

Sorpce a desorpce

114

Bioafinitní chromatografie jako jeden z typů adsorpční chromatografie je relativně jednoduchý dvoustupňový proces, sestávající z biospecifické adsorpce separované látky na bioafinitní sorbent a - po vymytí všech nespecificky vázaných látek - z desorpce (eluce) separované sloučeniny ze specifického komplexu. Podmínky sorpce jsou totožné s podmínkami optimálními pro tvorbu biospecifického komplexu: optimální pH, iontová síla, teplota, v případě potřeby i přítomnost kovových iontů, kofaktorů ev. dalších složek ve správné koncentraci. Jestliže vyšší iontová síla nebrání tvorbě komplexu, doporučuje se sorpci provádět při vyšší iontové síle, neboť se tím potlačí nespecifické elektrostatické interakce. Nespecifickým sorpcím může zabránit i přítomnost detergentů. Desorpce (uvolnění) separované látky z vazby na sorbent se provádí elucí, a to specificky nebo nespecificky. Při specifické eluci je separovaná látka desorbována z vazby na ligand roztokem jiné látky, která má afinitu k separované molekule nebo k ligandu. Je to kompetitivní proces, přičemž o vazbu na separované molekule může s imobilizovaným ligandem soutěžit například ligand volný, který však, aby měl možnost se prosadit, musí být ve vyšší koncentraci. To je také základní nedostatek jinak velmi efektivní a specifické eluce. Ligand, zejména jde-li o bioligand, je obvykle látka vzácná a tudíž drahá. Proto eluce roztoky o vyšší koncentraci těchto látek může být dosti nákladná a tak méně vhodná zejména pro provozní účely.

115

Obr.2.66

Schema zařízení na elektroeluci b-místo pro pufr, n.s.- nylonová síťka, a.g.-sorbent, e.c.-eluční komůrka, d.m.-dialyzační membána

Při nespecifické eluci je vazba mezi ligandem a separovanou látkou rozrušena tzv. deformujícími pufry, které mění strukturu ligandu nebo separované molekuly, takže vazebná centra již nejsou komplementární a komplex se rozpadne. Tohoto efektu je možno dosáhnout změnami pH, iontové síly nebo odstraněním iontů, které jsou nezbytné pro biologickou aktivitu. Podobný efekt docílíme i použitím chaotropních nebo disociačních látek (KSCN, močovina, guanin), které způsobí porušení rovnováhy mezi hydrofilními a hydrofobními složkami. Při tomto způsobu desorpce je však nutno mít na paměti, že sterická modifikace izolované látky nebo ligandu může vést ke ztrátě biologické aktivity způsobené jejich denaturací. Nespecifická eluce se provádí spojitým gradientem pouze tehdy, jestliže je ligand nespecifický a váže více než jednu separovanou látku. V případě, že je ligand specifický, je možno s výhodou eluovat nespojitým gradientem. Dalším možným způsobem desorpce je elektroeluce. Při elektroeluci se vloží na kolonu se separovanou směsí elektrické pole (v horní a dolní části kolony se umístí elektrody), a to tak aby látky z kolony putovaly shora dolů (viz obr.2.66). Znamená to, že v případě kladně nabitých látek na koloně bude v dolní čísti kolony katoda, v případě záporně nabitých látek (což je u bílkovin běžnější případ, neboť jsou stabilnější v mírně alkalickém prostředí) bude dole anoda. Eluce probíhá tak dlouho, až látky kolonu opustí a odděleně se jímají. V praxi se elektroeluce provádí v různě konstruovaných zařízeních, z nichž jedno je uvedeno na obr. 2.66.

Některé praktické aspekty bioafinitní chromatografie Množství použitého sorbentu a dimenze kolony jsou faktory, které při separaci bioafinitní chromatogtafií hrají významnou roli. Množství použitého sorbentu závisí na jeho adsorpční kapacitě. V laboratorních pokusech obvykle potřebujeme separovat, resp. navázat na kolonu 10-100 mg látek. K tomu je potřeba 10 - 200 ml sorbentu s navázaným nízkomolekulárním ligandem a 50 - 100 ml 116

sorbentu s vysokomolekulárním ligandem. O adsorpční kapacitě gelu pro každý konkrétní případ je nutno se přesvědčit experimentálně. Objem gelu by pak měl být stanoven tak, aby během separace bylo využito pouze 15 - 25 % jeho adsorpční kapacity. Požadovaná látka je pak eluována minimálním objemem eluentu. Jestliže je adsorpční kapacita gelu využita nad tuto hodnotu, stoupne sice produktivita, ale separovaná látka bude při eluci více naředěna. Při afinitní chromatografii dochází ke značné koncentraci separované látky, proto je možno vycházet i z velmi zředěných vzorků. Koncentraci vzorků však je nutno přizpůsobit průtokovou rychlost. Koncentrovanější vzorky se lépe adsorbují, proto je možné použít vyšších průtokových rychlostí. Limitujícím faktorem u koncentrovaných vzorků je viskozita roztoku, který je aplikován na kolonu, neboť vysoká viskozita velmi výrazně snižuje průchodnost kolony. Naopak při aplikaci velice zředěného vzorku se doporučuje nejen snížit průtokovou rychlost, ale průtok na několik minut úpně zastavit. V praxi se nejlepších výsledků dosáhne, jestliže koncenntrace separované látky je nižší než 20 mg/ml a průtoková rychlost 1 - 20 ml/hod.cm3. Při použití čerstvě připraveného afinitního sorbentu bývá někdy pozorováno, že s opakováním cyklů vzrůstají výtěžky separovaných látek. Příčinou je zřejmě jejich ireverzibilní vazba na sorbent v prvních cyklech. Pokud je sorbent chemicky i mechanicky stálý platí téměř obecné pravidlo, že čím více byl použit, tím lepší výsledky dává.

Imunoafinitní chromatografie Jedním z případů specifické bioafinitní chromatografie je chromatografie založená na interakci antigen - protilátka. Tento typ bioafinitní chromatografie dosáhl značného rozšíření a bývá označován jako imunoafinitní chromatografie, někdy též chromatografie na imunosorbentech. Imunosorbenty jsou nosiče (obvykle celulosa), na nichž je jako ligand imobilizována protilátka, tedy imunoglobulin. Protilátka tvoří velice pevné a specifické komplexy s antigeny, které mají být separovány. Metoda je velice specifická, při její realizaci však můžeme narazit na řadu potíží. Především imunosorbent, má-li být specifický, musí obsahovat ligand (protilátku), který bude homogenní (tedy naprosto čistá) bílkovina. Toho lze obvykle dosáhnout přečištěním protilátky bioafinitní chromatografií, tentokrát však je na nosič jako ligand umístěn antigen a

117

jeho pomocí se purifikuje protilátka. Komplex protilátka-antigen je však tak pevný, že eluce, při níž nedojde k denaturaci purifikované protilátky, je obtížná. Nicméně v posledních desetiletích byla vypracována řada metod, která tuto eluci umožňuje. Eluce bude diskutována ještě později. Imunoafinitní chromatografii je možno použít i pro separaci nízkomolekulárních látek, které nemají imunogenní vlastnosti, ale specificky reagují s protilátkami (tzv. hapteny). Mezi tuto skupinu patří látky jako mono- a oligosacharidy, hormony, různé alergeny. Protilátky proti haptenům se vytvářejí tehdy, jsou-li hapteny vázány na proteiny, avšak velmi často bývají znečištěny imunoglobuliny specifickými pro další hapteny či proteiny. Proto před imobilizací takovýchto ligandů je jejich purifikace bioafinitní chromatografií s haptenem jako ligandem naprosto nezbytná. Jak jsme se zmínili již výše, komplex antigen-protilátka je velice pevný a proto desorpce antigenu z imobilizované protilátky je možná jen za drastických podmínek. Protože protilátka je relativně stabilní, není uvolnění protilátky z vazby na imobilizovaný antigen takovým problémem. Lze ji desorbovat deformujícími pufry nebo roztokem s vysokým obsahem antigenu jako kompetujícího ligandu. Obtížnější bývá uvolnění antigenu z vazby na imobilizovanou protilátku. Pak se jako nejvhodnější metoda ukázala být elektroeluce, o níž jsme již informovali dříve. Jestliže separovanou látkou je hapten, nedělá eluce obvykle žádné obtíže, protože hapten je obvykle bez prostorového uspořádání a často i bez biologické aktivity, takže ani drastická eluce nemůže tuto látku znehodnotit.

2.4.2 Nespecifická afinitní chromatografie Za nespecifickou afinitní chromatografii lze považovat všechny případy, kdy použijeme obecný ligand. Jestliže však použitým obecným ligandem je látka, vyskytující se v organismech, např. některá z těch, o nichž bylo výše pojednáno, stále jde o bioafinitní chromatografii. Ukázalo se však, že partnerem při chromatografické separaci nemusí být nutně sloučeniny interagující navzájem v organismu, ale že jím mohou být i sloučeniny, které se v organismech vůbec nevyskytují a přesto mají určitou skupinovou specifitu vůči separovaným látkám, nebo dokonce mohou být považovány za obecné ligandy. Pak mluvíme

118

obecně o afinitní chromatografii a vzhledem k tomu, že specifita takových ligandů není nikdy absolutní, o nespecifické afinitní chromatografii. Syntetické ligandy, které je možno při afinitní chromatografii použít, mají schopnost jednoduchých nebo komplexních interakcí se separovanými látkami, které však nemají biospecifický charakter. Vesměs jde o látky organismu zcela cizí. Příčinou afinity může být stérická podobnost s některou v organismu se vyskytující látkou, ale řada případů má charakter fyzikálně-chemických interakcí.

Podle typu interakcí, které se při nespecifické afinitní chromatografii uplatní, řadíme metody do několika skupin. Patří sem: Chromatografie na sorbentech s vázanými barvivy (dye-binding) Chromatografie na sorbentech s kovy (metal-chelate) Chromatografie s přenosem náboje (charge-transfer) Chromatografie s kovalentní vazbou (kovalentní chromatografie) Chromatografie s heterobifunkčními afinitními ligandy Chromatografie s hydrofobní interakcí (hydrofobní chromatografie)

Chromatografie na sorbentech s vázanými barvivy Mezi látky, které mohou v určitém smyslu simulovat konformaci přirozených látek, patří různá barviva, zejména barviva triazinová, která simulují strukturu nukleotidů (obr.2.67). Tato barviva tedy mohou sloužit jako nespecifické obecné ligandy pro řadu enzymů, které mají nukleotidové kofaktory: pro dehydrogenasy s kofaktorem NAD a NADP a kinasy s ATP. Vzhledem k tomu, že v řadě případů je možné eluovat navázanou molekulu specificky s použitím příslušného volného kofaktoru, lze předpokládat, že barvivo působí jako kompetitivní efektor, který se váže do centra pro vazbu kofaktoru.

119

Obr.2.67

Struktura modrého antrachinonového barviva R = -SO3- Cibakron Blue F3G-A R = m,p -SO3- Procion Blue H-B

V některých případech však byly sorbovány i molekuly, které neměly vztak k nukleotidům a také je nebylo možno pomocí specifické eluce s nukleotidy desorbovat (např. sérové albuminy). V těch případech zřejmě dochází k vazbě na základě hydrofobních interakcí a takové typy vlastně patří do jiné skupiny nespecifické chromatografie, kterou je chromatografie s hydrofobní interakcí. Chromatografie s vázanými barvivy je výhodná z ekonomického hlediska. Syntetická barviva, která se používají jako ligandy, jsou resistentní vůči chemickým činidlům a enzymům, a dají se poměrně snadno imobilizovat za vzniku definované pevné vazby. Kromě toho jsou snadno dostupná, levná a dobře skladovatelná v suchém stavu, takže jsou stále k dispozici. Poskytují sorbenty s vysokou kapacitou, je možné opakované použití a umožňují práci s vysokými průtokovými rychlostmi. Toto vše je předurčuje jako ligandy výhodné pro použití ve velkém měřítku. Barevné ligandy Jako afinitní barviva se nejčastěji používají triazinová barviva. Skládají se z vlastní barevné složky, tzv. chromoforu (obr.2.68) a triazinového kruhu napojeného na chromofor přes -NH- skupinu. Na triazinovém kruhu je vázán jeden či více atomů chloru, z nichž některé jsou substituované (amino-, arylamino-, sulfoanilino-, alkoxyskupinou). Jako chromofory jsou nejčastěji v barvivech zastoupeny azoskupiny, antrachinon a ftalocyanin.

120

Obr.2.68

Struktura hlavních chromoforů v reaktivních barvivech

Nejčastěji jsou jako afinitní ligandy používána barviva Cibacron Blue F3GA, Blue Dextran (vlastně dextran s navázaným barvivem Cibacron Blue), Procion Blue H-B a Procion Red HE3B (obr.2.67). To ovšem zdaleka nejsou všechna barviva, která byla pro chromatografické účely testována. Podmínky sorpce a desorpce Úspěšnost interakce mezi imobilizovaným barvivem a separovanou molekulou je značně závislá na experimentálních podmínkách. Mezi ně, kromě podmínek pro sorpci a desorpci , jako jsou pH, iontová síla, teplota, průtoková rychlost, velikost a tvar kolony, patří i výběr vhodného nosiče, volba délky distančního raménka a stupeň substituce nosiče ligandem. Z různých nosičů (dextrany, celulosa, sklo, kopolymery agarosy a polyakrylamidu) se nejvíce osvědčila agarosa. Barevný ligand se na nosič váže substitucí atomu chloru v triazinovém kruhu za hydroxyskupinu nosiče. Stupeň substituce lze ovlivnit použitou teplotou a dobou reakce. Vhodný stupeň substituce musí být stanoven experimentálně. V žádném případě neznamená vysoký stupen substituce nosiče ligandem optimální kapacitu afinitního sorbentu. Experimentálně je nutno zjistit i pH vhodné pro sorpci a desorpci a iontovou sílu používaných roztoků. Nutnost použití distančního raménka závisí na charakteru separované látky, avšak v případě barevného ligandu musíme s distančním raménkem téměř vždy počítat. Jde spíše o to zvolit jeho optimální délku. Vazba biomolekuly na barevný ligand je ovlivněna jak objemem aplikovaného vzorku tak i jeho koncentrací. Větší objem vzorku obvykle zhoršuje vazbu, vysoká koncentrace separované látky snižuje purifikační efekt. Vazba enzymů na barevný ligand je také ovlivněna přítomností substrátů a kofaktorů, které mohou soutěžit ve vazbě s imobilizovaným ligandem. Tato okolnost však může být příznivá, protože některé barevné ligandy se mohou pevně vázat v aktivních centrech pro vazbu substrátu nebo kofaktoru separovaných enzymů (zejména dehydrogenas a kinas) a

121

mohou způsobit ztrátu biologické aktivity. Přítomnost kofaktoru ev. substrátu pevné vazbě ligandu zabrání. Afinita enzymů k barevnému ligandu bývá někdy podpořena přítomností bivalentních iontů. K desorpci navázané molekuly se používá gradient iontové síly nebo (méně často) pH, dále specifická eluce (obvykle nukleotidy) a elektroeluce. Při eluci gradientem solí je třeba mít na paměti, že vyšší koncentrace solí mohou vzhledem k posílení hydrofobních interakcí podpořit vazbu separované molekuly na imobilizovaný barevný ligand. K dosažení dobrých výsledků separace se doporučuje používat nízké průtokové rychlosti a vyšší kolony s malým poloměrem. Při separaci se na sorbentu nespecificky váží lipidy, lipoproteiny a další sloučeniny s hydrofobním charakterem přítomné ve vzorcích, které se však jen velice nesnadno desorbují a proto neznečišťují separované látky. Před dalším použitím kolony je však nutné je desorbovat. Toho se dosáhne promytím kolony 8M močovinou v 0,05 M NaOH před další ekvilibrací pufrem.

Chromatografie na sorbentech s kovy Přechodné kovy Fe, Cu, Co, Ni a další mohou koordinovat sloučeniny obsahující O, N a S, tedy též biomolekuly. Tyto sloučeniny mohou být separovány na sorbentech, které obsahují některý z přechodných kovů, neboť se budou s kovovým ligandem vázat. Chromatografický sorbent se připraví zabudováním kovu do matrice gelu či jiného nosiče přes spacer, kterým bývá iminooctová kyselina (obr.2.69), aminosalicylová kyselina, 8-hydroxychinolin, EDTA a další. Ten se naváže na nosič a na něj je koordinován kovový ion. Tím se zajistí, že nebude potlačena schopnost kovového iontu tvořit komplex se separovanou sloučeninou.

122

Obr.2.69

Sorbent pro chromatografii s vázaným kovem. Chelatační složkou je kyselina iminooctová

Navázané kovové ionty pak reverzibilně interagují s řadou bílkovin, a to prostřednictvím některých aminokyselin v nich obsažených, cysteinu, histidinu, tryptofanu, fenylalaninu. Chromatografie s kovovými ligandy se používá zejména pro separaci bílkovin. Na sorbentu s Cu jsou úspěšně separovány např. interferon, ribonukleasa, lysozym a albuminy, na sorbentu s Ni se separují opět interferon a ribonukleasa, na sorbentu s Co interferon. Případů popsaných v literatuře je ovšem mnohem více.

Chromatografie s přenosem náboje Některé aromatické sloučeniny spolu interagují za vzniku různě stabilních komplexů. Mechanismus interakce spočívá v přenosu nábojů resp. elektronů z donorové sloučeniny na sloučeninu akceptorovou (viz obr.2.70). Jestliže se donorová nebo akceptorová sloučenina naváže jako ligand na nosič, pak vzniklý sorbent je schopen separovat aromatické sloučeniny podle jejich schopnosti přijímat nebo odevzdávat elektrony. Při eluci pak je třeba brát v úvahu to, že se mezi molekulami budou uplatňovat i jiné interakce (hydrofobní, van der Waalsovy).

Obr.2.70

Interakce při chromatografii s přenosem náboje

123

Tohoto typu chromatografie se opět nejčastěji používá pro separaci bílkovin, přičemž se při vazbě uplatňují především boční řetězce bílkovin ochotné poskytovat elektrony. Jsou to řetězce, které obsahují indolové, imidazolové, p-hydroxyfenylové a guanidylové skupiny. Jako ligandy byly popsány: akriflavin, dinitrochlorbenzen, pentachlorfenol, dikyanochlor-p-benzochinon. Kovalentní chromatografie Kovalentní chromatografie je speciálním typem afinitní chromatografie, při níž se separovaná molekula kovalentně váže na afinitní sorbent. Vzniklá kovalentní vazba je snadno štěpitelná i za mírných podmínek, takže při desorpci biomolekul nedochází ke ztrátám nativní konformace a tedy ani ke ztrátám biologické aktivity. Afinitní sorbent se připraví imobilizací ligandu, který obsahuje thiolovou skupinu nebo rtuťnatý ion, takže při navázání separované molekuly vznikají disulfidové vazby nebo Hg-S vazby. Řada imobilizovaných thiolů byla testována jako sorbenty pro kovalentní chromatografii, ale pouze 3 z nich se běžně používají. Jsou to glutathion-agarosa, homocystein-aminoalkyl-agarosa

a

thiopropyl-agarosa

(viz.obr.2.71).

samozřejmě hraje roli nosiče, thiolové sloučeniny jsou ligandy.

124

Agarosa

zde

Obr.2.71

Agarosové nosiče s thiolovými ligandy

Glutathion obsahuje ionogenní skupiny, takže při jeho použití nelze vyloučit ani elektrochemické interakce, tedy efekt ionexu. Glutathion se kromě toho velice snadno uvolňuje z vazby na nosiči, zejména je-li eluce provedena merkaptoethanolem. To má dva důsledky: sorbent nelze opakovaně použít a uvolněný glutathion kontaminuje separované látky. Thiopropyl naproti tomu je neutrální molekula, více méně hydrofilní, takže je ideálném ligandem v případech, kdy by elektrostatické interakce nepříznivě interferovaly s chromatografickým procesem. Bez ohledu na použitý ligand je thiolový sorbent nutno vždy před vazbou separované molekuly aktivovat. Děje se tak navázáním 2-thiopyridinu nebo nitrothiobenzoové kyseliny za vzniku nesymetrického disulfidu. Smyslem této aktivace je připojit na ligand skupinu, která se ochotně odpojí a přenechá místo na ligandu thiolové skupině separované látky (obr. 2.73). Jako ligandy se používají i merkury-deriváty: p-amino-fenylmerkuryacetát, p-chlormerkurybenzoát, p-hydroxymerkurybenzoát a p-merkuryfenylamin (viz obr.2.74).

125

Obr.2.72

Schema přípravy aktivovaného sorbentu pro kovalentní chromatografii

Obr.2.73

Schema kovalentní chromatografie na sorbentu s thiolovým ligandem

Obr.2.74

Schema kovalentní chromatografie s rtuťnatým ligandem

Kovalentně vázaná molekula se eluuje buď redukcí disulfidové vazby nebo vytěsněním pufrem s jinou thiolovou molekulou (merkaptoethanolem, dithiothreitolem, cysteinem). Před elucí se však nejprve vymyjí všechny nespecificky navázané molekuly, to jest ty, které neobsahují sulfhydrylové skupiny. Kovalentní chromatografie byla popsána pro řadu proteinů a dalších molekul, které obsahují sulfhydrylové skupiny.

126

Chromatografie s heterobifunkčními afinitními ligandy Využití heterobifunkčních ligandů v afinitní chromatografii je jedna z novějších metod afinitní purifikace. Heterobifunkční ligand, tj. ligand, který obsahuje 2 vazebné skupiny, se v rozpustné formě přidá ke vzorku látek určených pro separaci. Po navázání specifické biomolekuly na ligand, při čemž se využije jedna z vazebných skupin, se vzniklý komplex separuje na koloně s nosičem, na který se naváže druhou vazebnou skupinou heterobifunkčního ligandu. Komplex ligand-biomolekula tedy bude vázán na nosiči, zatímco ostatní složky původního roztoku se vymyjí z kolony. Stupňovitou elucí se pak uvolní nejprve separovaná biomolekula a v druhé fázi pak ligand z vazby na nosič. Ligand je poté možno opakovaně použít.

Chromatografie s hydrofobní interakcí Chromatografie s hydrofobní interakci, "hydrofobní chromatografie", je dalším typem nespecifické afinitní chromatografie. Hydrofobní interakce nebyly původně při afinitní chromatografii vítaným jevem, neboť způsobovaly problémy (nespecifické sorpce). Teprve později byly rozpoznány možnosti, které tyto interakce při selektivní chromatografii poskytují. Molekuly, mezi nimi i makromolekuly, které mají hydrofobní skupiny buď na povrchu nebo zanořené v jakýchsi „kapsách“, se totiž mohou separovat na základě různě silných hydrofobních interakcí s chromatografickým sorbentem prostým nábojů a nesoucím hydrofobní skupiny. Povaha a původ hydrofobních interakcí byly po dlouhou dobu předmětem názorových rozdílů vědců, kteří se jejich podstatou zabývali. Je zřejmé, že hydrofobní interakce jsou silné pouze ve vodném prostředí. Předpokládá se, že hybnou silou při vytváření těchto nepolárních interakcí je především pozitivní změna entropie při uvolňování molekul rozpouštědla organizovaných kolem hydrofobních skupin, jakmile se tyto skupiny setkají s hydrofobním prostředím (viz obr. 2.75).

127

Obr.2.75

Schematické znázornění hydrofobní interakce

Z teoretického hlediska lze rozlišit „pravou“ a „nepravou“ hydrofobní chromatografii. Do prvé kategorie patří ty chromatografické separace, kdy sorbent obsahuje pouze hydrofobní ligandy a nenese žádný náboj (obr. 2.77). Nepravá hydrofobní chromatografie, zvaná též detergentová nebo amfifilní chromatografie, se provádí na sorbentech, na nichž jsou imobilizovány jak hydrofobní tak hydrofilní (nejčastěji ionogenní) skupiny (obr.2.79). Demonstrujme si využití hydrofobních interakcí při separaci makromolekul na bílkovinách. Globulární bílkoviny mají, jak známo, hydrofobní jádro, které zaručuje minimalizaci entropie v systému, a hydrofilní obal. V hydrofobním jádře však není zcela vyloučena přítomnost hydrofilních skupin, stejně tak se můžeme na povrchu setkat s hydrofobními oblastmi. Kromě toho existují na globuli určité trhliny či štěrbiny (např. aktivní centra na enzymech), které zasahují z povrchu až do hydrofobního jádra (obr. 2.76).

Obr.2.76

Schema struktuty proteinu

128

Obr.2.77

"Pravé" hydrofobní interakce

Obr.2.78

Vazba bílkoviny na hydrofobní povrch

Molekuly bílkoviny se tedy mohou vázat reverzibilně na hydrofobní ligandy. Zcela hydrofobní materiály, jakým je např. polystyren, však váží molekuly bílkoviny ireverzibilně a mohou způsobit i nevratnou denaturaci, neboť ve snaze minimalizovat entropii systému může dojít k úplnému odhalení hydrofobního jádra a tedy ke ztrátě nativní konformace bílkoviny (obr.2.78). Proto se jako hydrofobní sorbenty hodí spíše ty, které nemají zcela hydrofobní povrch, ale pouze hydrofobní zóny, které jsou navzájem odděleny zonami hydrofilními. Příklad takového sorbentu je na obr.2.79. Jde o epoxy-propyl-agarosu. Jestliže je na takový sorbent přivedena molekula, která nemá přístupné hydrofobní zony, na sorbent se nenaváže.

129

Obr.2.79

Amfifilní chromatografie na aminopropylagarose

Molekula s hydrofobními zonami se naváže, avšak díky slabým hydrofobním silám se nebude vázat příliš pevně. V některých případech půjde spíše jen o určité zpomalení hydrofobní molekuly. Sílu hydrofobních interakcí však je možno ovlivnit teplotou a iontovou silou. V případě amfifilní chromatografie sehraje roli náboj v okolí hydrofobních zon, neboť hydrofilní části sorbentu nesou nabité skupiny, které interagují s nábojem molekuly. Podle iontové síly roztoků pak můžeme volit, zda mají vyniknout hydrofobní či iontové interakce. Sorbenty pro hydrofobní chromatografii Sorbenty pro hydrofobní chromatografii se skládají z nosiče obvykle gelového charakteru a z ligandu, kterým je obvykle hydrofobní skupina (fenyl, oktyl, ale i další). Sorbenty musí mít: - dobré průtokové vlastnosti, nutné pro práci v kolonách - stálé vazby mezi ligandem a nosičem, aby nedocházelo k uvolňování ligandu - vysokou tepelnou stabilitu - vysokou chemickou stabilitu - pro pravou hydrofobní chromatografii nesmí nést žádné nabité skupiny Sorpce molekul na hydrofobní nosiče Síla interakce mezi separovanou molekulou a nosičem závisí jak na hydrofobicitě separované látky, tak na hydrofobicitě sorbentu, dále na interakcích s molekulami vody a mezi těmito molekulami navzájem. Při interakcích se uplatňuje jak dříve zmíněná exkluze vody z hydrofobních oblastí, tak van der Waalsovy síly a za přítomnosti aromatických sloučenin též π-π interakce. Lze tedy říci, že separace látek ve směsi záleží na dynamických rovnováhách mezi všemi hlavními složkami systému. Všechny další molekuly, které mohou vytvářet interakce stejnými mechanismy jako síly působící při separaci, budou nutně separovaný system ovlivňovat. Síla hydrofobních interakcí se zvyšuje s rostoucí iontovou silou. Je proto vhodné při vazbě molekuly na sorbent pracovat s roztoky o vysoké iontové síle (např. 4M NaCl). Je důležitá též chemická podstata iontů přítomných v roztoku. Ionty s vysokou vysolovací schopností (fosfáty, amonné ionty) jsou při zesilování hydrofobních interakcí zvlášť účinné.

130

Naopak chaotropní ionty, t.j. ty, které mají tendenci rozrušovat strukturu vody (thiokyanát, barnaté ionty), hydrofobní interakce zeslabují. S rostoucí teplotou roste síla hydrofobních interakcí. To vyplývá z rovnice pro Gibbsovu volnou energii: ΔG = ΔH - TΔS

(26)

Čím je vyšší teplotní koeficient, tím má výraz pro změnu enthropie větší hodnotu a tím menší je výsledná hodnota změny volné energie. Nejsilnějších hydrofobních interakcí lze dosáhnout při pH, které se rovná izoelektrickému bodu separované molekuly, neboť při tomto pH nenese náboj. S rostoucí vzdáleností od pI se hydrofobní interakce zmenšují. S rostoucím počtem molekul s hydrofobním charakterem v roztoku klesá síla hydrofobních interakcí vzhledem k jednotlivé molekule. Jde o kompetici mezi hydrofobními molekulami o vazbu na hydrofobní sorbent. O vazbu na sorbentu tak mohou se separovanými molekulami soutěžit např. detergenty. Snížením polarity použitého rozpouštědla klesne i síla hydrofobních interakcí. Přidání alifatických alkoholů k vodnému rozpouštědlu tedy způsobí oslabení hydrofobních vazeb. Sorpce separovaných molekul na sorbenty by tedy měla probíhat v prostředí s vysokou iontovou silou, při pH, které je blízké izoelektrickému bodu a při laboratorní teplotě (k zajištění stabilního teplotního režimu se doporučuje pracovat na termostatovaných kolonách). Tyto podmínky jsou ideální pro techniku, která má následovat např. po frakčním vysolování nebo po ionexové chromatografii, kde eluce byla provedena gradientem iontové síly, aniž by bylo nutné předřadit odsolení roztoků. Jedním z rozhodujících faktorů úspěšné sorpce je volba vhodného sorbentu, neboť molekuly se mohou chovat zcela rozdílně na různých nosičích, ale zejména za použití různých imobilizovaných ligandů (alifatické x aromatické apod.). Je nutné upozornit na to, že častěji než příliš slabá vazba dělá v případě hydrofobní chromatografie problémy vazba příliš silná, která může výrazně znesnadnit eluci a může vést až ke ztrátě biologické aktivity separovaného materiálu, resp. k jeho denaturaci.

131

Desorpce Při desorpci molekul z hydrofobního sorbentu musíme změnit podmínky tak, aby klesla síla hydrofobních interakcí. Tyto změny se dějí obvykle postupně, takže pracujeme s gradientovou elucí. Změny, které použijeme pro desorpci (které vedou k oslabení hydrofobních vazeb) jsou: - výměna iontu s vyšším vysolovacím efektem za iont s nižším vysolovacím efektem - snížení iontové síly elučního roztoku - snížení polarity eluentu přidáním alkoholu nebo ethylenglykolu - přidání detergentu do elučního roztoku - změnou pH elučního roztoku ve směru od izoelektrického bodu. (Tento způsob je méně obvyklý a zřídka se používá jako jediná změna.) - snížení teploty. Nelze použít jako jedinou změnu. Jestliže se k desorpci použijí detergenty, ty se budou adsorbovat na sorbent a před novým použitím bude kolonu nutno regenerovat. Při regeneraci se doporučuje promývat kolonu ethanolem a poté butanolem, které sníží polaritu systému a umožní odstranění detergentů. Pak je ovšem třeba kolonu dokonale promýt destilovanou vodou a ekvilibrovat startovním pufrem.

132

2.4.3 Další separační techniky založené na molekulovém rozpoznávání Specifických interakcí mezi ligandem a molekulou lze využít i při dalších separačních technikách, z nichž s mnohými jsme se již seznámili.

Afinitní dělení mezi dvě fáze Techniku rozdělování látek ze směsi mezi dvě navzájem nemísitelné fáze dvoufázového systému jsme si popsali v kapitole 2.2. Pro separaci biomolekul se používá systém

dvou

vodných

fází,

z

nichž

jedna

je

tvořena

vysokomolekulárním

polyethylenglykolem (PEG) a má spíše hydrofobní charakter, druhá je tvořena dextranem nebo solemi a má charakter hydrofilní. V těchto dvou fázích se jednotlivé biomolekuly extrahují podle rozdělovacího koeficientu K: K = c h / cd

(27)

c - koncentrace v horní a dolní fázi Jestliže se na jeden z použitých polymerů (polyethylenglykol nebo dextran) kovalentně naváže afinitní ligand, pak veškeré molekuly, které mají k tomuto ligandu afinitu, budou strženy do fáze, v níž se ligand nachází, takže se výrazně změní rozdělovací koeficient K příslušné molekuly. Jde-li o separaci bílkovin, je možno podmínky upravit tak, aby většina molekul měla tendenci přejít do hydrofilní fáze (dolní, solné) či naopak do hydrofobnější (horní s PEG) fáze. Ligand je pak navázán v opačné fázi, takže molekuly, které mají k ligandu afinitu, budou mnohonásobně purifikovány. Jako ligandy se v těchto případech používají zejména barviva, která jsou velmi levná a vždy k dispozici. Technika afinitního dělení mezi dvě fáze je pak ideální pro operace ve velkém měřítku. Může být vyvinuta v rychlou a efektivní metodu pro čištění enzymů, ale i dalších bílkovin. Proti afinitní chromatografii je tato metoda rychlejší, méně závisí na difuzi, vazebná kapacita na jednotku objemu je mnohem vyšší a může být použita v kontinuálním provedení. Nevýhodou bývá složitější regenerace modifikovaného rozpustného polymeru. Hlavní výhodou afinitního dělení mezi dvě fáze je fakt, že může být použito i pro separaci celých buněk a buněčných částic. 133

Afinitní ultrafiltrace Afinitní ultrafiltrace je technika, která zachovává výhody separace v homogenním systému, ale obchází problém návratu modifikovaného rozpustného polymeru. Afinitní sorbent přijde nad ultrafiltrační membránou do styku s roztokem látek, které mají být purifikovány a naváže ty, které k němu mají afinitu. Balastní látky, které se nenaváží na sorbent, projdou póry membrány, látka ve specifickém komplexu zůstává nad membránou. Po dokonalém vymytí a oddělení balastních látek se provede disociace afinitního komplexu a purifikovaná látka po uvolnění rovněž projde membránou. Tato metoda se provádí i ve velkokapacitních ultrafiltračních zařízeních, kde membrány tvoří stěny dutých vláken, jimiž recirkuluje roztok, obsahující afinitní sorbent smíchaný se separovanou směsí. Balastní látky, které projdou póry membrány, vstoupí do mezimembránových prostor, odkud jsou odtaženy. Po dokonalém oddělení zůstane v recirkulujícím proudu uvnitř vlákna pouze afinitní komplex. Ten je poté disociován na původní složky a žádaná látka rovněž projde membránou do mezimembránového prostoru, odkud je odtažena. Jediným omezením této metody je velký průměr pórů dosud používaných membrán, takže afinitní ligandy musí být navázány buď na vysokomolekulární látky (dextran) nebo na buňky.

Afinitní precipitace Tato metoda využívá afinitních interakcí molekuly s ligandem v roztoku a následné precipitace vzniklého komplexu. Jako srážecí prostředky se používají bifunkční ligandy, např. nukleotidy spojené distančním raménkem (hlavně bis-AMP a bis-NAD) a barevné ligandy, které se váží do aktivního místa enzymů a jiných biologicky aktivních bílkovin a tak nekovalentně prokříží molekuly bílkovin a způsobí jejich vysrážení. Obměnou srážecích metod je postup, při němž některé bílkoviny zůstanou v roztoku i za podmínek, kdy je již většina bílkovin precipitována, t.j. za vysoké koncentrace vysolovacího činidla. Jde zejména o případy, kdy se precipitace uskutečňuje syntetickými polymery, např. PEG (polyethylenglykol), na němž je navázán ligand, nejčastěji barvivo. Molekula a ligand spolu interagují a PEG, na němž je ligand navázán, obalí separovanou

134

molekulu a tak ji udrží v roztoku. Současně ji separuje od bílkovin, které s ligandem neinteragují a za daných podmínek tudíž precipitují. Bílkovinná molekula obalená „atmosférou“ PEG zůstává v roztoku i při koncentraci PEG 12,5%, a to i tehdy, pracujeme-li při nízkém pH, kdy většina bílkovin ztrácí náboj a je náchylnější k precipitaci. Při nízkém pH však roste i síla hydrofobních interakcí (bílkoviny nemají náboj), takže obecně roste nebezpečí nespecifických interakcí a klesá tedy selektivita metody. Afinitní srážení má velký význam pro čištění enzymů a dalších bílkovin v poloprovozním a provozním měřítku. Je to afinitní metoda a jako taková je vysoce selektivní. Dá se proto použít pro purifikaci určité bílkoviny i v surových směsích. Kromě toho je to rychlá metoda a PEG s navázaným ligandem se dá snadno regenerovat a znovu použít.

Bioselektivní (afinitní) eluce O bioselektivní eluci jsme se již zmiňovali, když jsme diskutovali desorpci separované molekuly z afinitního sorbentu. Afinitní eluce však nemusí být omezena pouze na použití afinitních sorbentů, ale je možno ji využívat i při jiných typech chromatografie. Volný ligand, který je v afinitním eluentu přítomen, vytvoří komplex s molekulou navázanou na sorbentu a vzniklý komplex se již na sorbent není schopen vázat. Dojde tedy k eluci separované molekuly. Jako příklad si můžeme uvést desorpci enzymu z ionexového sorbentu pomocí substrátu příslušného enzymu. Vzhledem k tomu, že pro tento účel se biospecifická eluce velice často využívá, bývá též nazývána substrátová eluce (obr. 2.81). Podobně je ovšem možno použít antigen pro eluci protilátky nebo protilátku pro afinitní eluci antigenu. Princip afinitní eluce z ionexového sorbentu pravděpodobně spočívá v tom, že komplex biomolekula-ligand má změněný náboj oproti původní sorbované molekule a nemůže se proto již na ionex vázat (obr. 2.80). V tom případě schopnost ligandu eluovat molekulu z vazby na sorbent bude záležet na dvou faktorech, a to na disociační konstantě komplexu biomolekula-ligand a na náboji ligandu. Dalším důvodem desorpce molekuly po vytvoření komplexu biomolekula-ligand, je konformační změna, která neumožní další vazbu na sorbent, a to i při vazbě na jiný než ionexový sorbent.

135

Zvláštním případem afinitní eluce je eluce při hydrofobní resp. amfifilní chromatografii. Jde zejména o chromatografii na sorbentech, kde ligand je vázán přes distanční rameno, které má jak hydrofobní oblasti, tak oblasti s ionizovanými skupinami (obr. 2.82). Takové sorbenty jsou někdy nazývány imfilyty (ionex + amfilyt). Při afinitní eluci volným ligandem se vytvoří komplex, který má v naprosté většině případů změněnou schopnost vazby na výše popsaný sorbent.

Obr.2.80

Bioselektivní eluce z ionexového sorbentu - změna náboje

Překvapivě však změny mohou být pro jednotlivé komplexy zcela opačného charakteru. V některých případech síla vazby vytvořením komplexu roste, v jiných naopak klesá. Jen velmi zřídka však zůstane síla vazby vytvořením komplexu nezměněna.

136

Bioselektivní eluce se může stát základem kvantitativního stanovení, jak je tomu v případě AMP (viz obr.2.83).

Obr.2.81

Bioselektivní eluce z ionexového sorbentu - substrátová eluce

Obr.2.82

Bioselektivní eluce při amfifilní chromatografii

137

Obr.2.83

Bioselektivní eluce jako základ stanovení AMP

Afinitní elektroforéza Afinitních vztahů, t.j. interakce mezi molekulou a ligandem, lze využít i při elektroforéze v gelu. Jestliže se ligand zachytí do struktury gelu, pak molekula, která se pohybuje v elektrickém poli a má afinitu k ligandu, se bude na ligand vázat a její pohyb se buď zcela zastaví nebo velmi výrazně zpomalí. O elektroforéze bude pojednáno v kapitole 2.5.

138

2.5 Elektromigrační (elektroforetické) metody Elektromigračními či elektroforetickými metodami nazýváme soubor technik, které využívají pohybu ionizovaných částic v elektrickém poli. Elektroforéza jako separační technika byla prvně použita Tiseliem, který s ní v r. 1937 rozdělil směs bílkovin. Později za tento objev obdržel Nobelovu cenu. Jestliže jsou látky nesoucí náboj rozpuštěny v elektrolytu a umístěny v elektrickém poli, začnou se pohybovat konstantní rychlostí úměrnou velikosti jejich nábojů, anionty k anodě a kationty ke katodě. Rychlost, kterou se ion v elektrickém poli pohybuje může být vyjádřena vztahem v = μeE

(28)

v = rychlost iontu μe = elektroforetická pohyblivost E = elektrické pole Částice jsou při průchodu okolním mediem vystaveny odporu sil vnitřního tření. Jejich mobilita je tedy výsledkem rovnováhy mezi silou, působící na ionty v elektrickém poli a silou vnitřního tření.

μe = síla elektrického pole FE / síla vnitřního tření FF FE = qE FF = -6πηrv

(29)

q = náboj iontu η = viskozita roztoku r = poloměr iontu v = rychlost iontu Ze vztahu (29) vyplývá, že síla vnitřního tření se mění s viskozitou prostředí. Proto se změnou teploty dojde ke změně této síly a tudíž i ke změně rychlosti pohybu částice. V průběhu elektroforézy dojde k ustavení rovnováhy, která je definována rovnováhou mezi silou elektrického pole a silou vnitřního tření. Při rovnováze budou mít obě síly stejnou hodnotu, ale opačného směru.

139

qE = 6πηrv

(30)

Mobilitu je pak možno pomocí fyzikálních parametrů definovat následovně

μe = q / 6πηr

(31)

Z této rovnice je jasné, že malé částice s velikým nábojem mají velkou mobilitu (pohyblivost), zatímco velké částice s malým nábojem mají mobilitu malou. Efektivní mobilita, t.j. mobilita, kterou skutečně při elektroforéze naměříme, bývá obvykla nižší než teoretická elektroforetická mobilita a je závislá na pH a použitém pufru. Úspěch separace látek ze směsi lze předpokládat jen tehdy, budou-li mít separované látky dostatečně odlišné efektivní elektroforetické pohyblivosti. Snaha po dosažení co nejlepší separace vedla k vypracování značného množství různých technik a jejich modifikací, které můžeme shrnout do 4 základních skupin: - elektroforéza s pohyblivým rozhraním neboli volná elektroforéza - elektroforéza na nosičích neboli zonová elektroforéza - rovnovážná elektroforéza reprezentovaná izoelektrickou fokusací - kapilární elektroforéza

2.5.1 Volná elektroforéza V klasické „volné“ technice se elektroforéza provádí ve vodných roztocích pufrů a částice putují směrem k elektrodě s opačnou polaritou rychlostmi, které jsou úměrné velikosti jejich náboje. Velikost náboje a použitý gradient napětí tedy určují rychlost migrace a vzájemnou separaci jednotlivých částic. Účinnost separace při volné elektroforéze je limitována tepelnou difuzí a konvekčními proudy v kapalině, které vznikají vlivem tepla, jež se vyvíjí při průchodu elektrického proudu. Vlivem difuze se snižuje ostrost zon a tím se snižuje výrazně i účinnost separace. Proto se elektroforéza často provádí v antikonvekčních mediích, jakými jsou např. polyakrylamidové nebo agarosové gely. Takové provedení elektroforézy označujeme jako elektroforézu na nosičích nebo zonovou elektroforézu.

140

2.5.2 Zonová elektroforéza Zonová elektroforéza je metoda, již je možno použít pro analytické i preparativní účely. Provádí se na nosičích, které jsou uspořádány do sloupce nebo rozprostřeny na ploše (sklo, hliníkové folie apod.). K preparativním účelům se nejčastěji používá uspořádání nosiče do sloupce, pak mluvíme o sloupcové elektroforéze, zatímco pro analytické účely je v současné době běžnější uspořádání plošné. Prvními použitými nosiči byly chromatografický (neklížený) papír, acetát celulosy, škrob, celulosa. V současné době se používají zejména gelové materiály, a to agarosový gel, škrobový gel a polyakrylamidový gel (obr.2.84). Elektroforetické nosiče musí být hydrofilní, nerozpustné ve vodě a měly by mít co nejméně adsorpčních schopností. Při použití gelových materiálů se při separaci látek ze směsi vedle elektroforetické pohyblivosti uplatňuje i separace na principu molekulárního síta. Molekuly jsou ve svém pohybu omezovány přítomným gelem a záleží na velikostí pórů v gelu jaká bude rychlost pohybu. Velké molekuly jsou zpomalovány více než molekuly malé. Proto se separace děje nejen na základě velikosti náboje, ale i na základě velikosti molekuly.

Obr.2.84

Struktura polyakrylamidového gelu

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu

141

Pravděpodobně nejčastěji používanou metodou je elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE). Ta se provádí, stejně jako elektroforéza na dalších gelech, ve speciálních aparátech, v nichž se nosič se vzorkem k separaci umístí mezi 2 elektrody, mezi nimiž prochází stejnosměrný proud. Tato celkem jednoduchá zařízení vyrábí řada světových firem. Experimentální uspořádání elektroforézy v polyakrylamidovém gelu je dvojího typu: - elektroforéza v trubičkách, vlastně sloupcové uspořádání, avšak ve velmi malých trubičkách (obr.2.85) - elektroforéza v plošném uspořádání, na destičkách s tenkou vrstvou gelu (obr.2.86). Elektroforéza v trubičkách je staršího data a dnes se používá již méně. Je však vhodná pro méně zkušené pracovníky, gely je možno bez problémů připravit v laboratoři bez speciálního vybavení a zařízení, v němž se provádí, je jednodušší a proto i levnější. Z těchto důvodů je stále ještě používána. Plošné uspořádání má oproti uspořádání v trubičkách několik výhod: - je citlivější - lze ho snadno densitometricky kvantifikovat - na jednu desku je možno nanést více vzorků, takže eventuální porovnání je snažší - po usušení je možno elektroforeogram skladovat

Obr.2.85

Schema přístroje pro sloupcovou elektroforézu

Na druhé straně však dosažení uspokojivých výsledků vyžaduje určitou zkušenost, příprava gelů je náročná a proto se často používají gely komerční, což ovšem znamená

142

finanční zátěž, přístroje pro tento typ provedení jsou dražší. V současné době se vyrábějí přístroje, které jsou upraveny na použití velmi malých destiček a tak zkracují dobu trvání pokusu, ale i výrazně šetří gelový materiál. Tyto přístroje ovšem musí být konstruovány tak, aby i na krátké vzdálenosti, která je k disposici, došlo k dokonalé separaci. Ušetřený gelový materiál však zvýšenou cenu těchto malých přístrojů více než kompenzuje. Plošná elektroforéza se provádí buď horizontálně, kdy je gelová deska umístěna v přístroji ve vodorovné poloze (obr.2.86), nebo vertikálně (deska je kolmo na podložku) (obr.2.87 a 2.88). Oba tyto způsoby mají své speciální použití.

Obr.2.86

Přístroj pro horizontální elektroforézu

Obr.2.87

Schema přístroje pro vertikální elektroforézu

143

Obr.2.88

Přístroj pro vertikální elektroforézu

Horizontální

elektroforéza

se

používá

zejména

pro

elektroforézu

v

polyakrylamidovém a agarosovém gelu, pro SDS-techniky, pro analytickou i preparativní elektrofokusaci, pro imunoelektroforézu, dvojrozměrné techniky, elektroblotting a stanovení titračních křivek. Všechny tyto techniky budou popsány v dalším textu. Vertikální elektroforéza se používá pro kontinuální a diskontinuální PAGE, pro elektroforézu v gradientovém gelu, elektroforézu ve velmi tenkých gelech určených pro autoradiografii, elektroforézu v agarosovém gelu a při dalších technikách. Jak jsme se zmínili již dříve, sloupcovou metodu je možno použít i pro preparativní účely. Přístroje, které jsou pro tyto účely vyráběny, jsou větší a ve většině případů mají možnost chlazení. Na sloupec či spíše prstenec gelu se nanese vzorek a elektroforéza se uspořádá tak, aby vzorek putoval shora dolů (t.j. u kladně nabitých látek bude dole katoda, u záporně nabitých anoda). Dolní část gelu zasahuje do žlábku, jimž kontinuálně protéká velice malou rychlostí eluent, nejčastěji pufr. Ten odvádí látky, které postoupily až na konec gelového prstence, do zkumavek na automatickém jímači frakcí. Tak se od sebe oddělí látky separované v oddělených zonách. Dobrých výsledků při tomto preparativním procesu však je možné dosáhnout pouze za podmínek, při nichž se v analytickém provedení na trubičkách od sebe zony vzdálí alespoň o 1 cm. Eluce zon se separovanou látkou je totiž problematická,

144

neboť při ní dochází vždy k určitému zdržení a nedostatečně vzdálené zony se tedy mohou v elučním žlábku opět smísit (obr. 2.89).

Obr.2.89

Přístroj pro preparativní gelovou elektroforézu s kontinuální elucí 1 a 2 jsou platinové elektrody, 3 a 4 horní a dolní elektrodový prostor, 5 sloupec gelu, 6 a 7 chladicí prostory, 8 skleněná membrána, 9 eluční komůrka A vlastní přístroj, B půdorys eluční komůrky

Své problémy však má i analytické provedení PAGE. Užití jednoduchých kontinuálních pufrovacích systémů s sebou nese nevýhodu v podobě vyššího stupně difuze a tento vliv je výrazný u menších, rychle putujících molekul. Aby se dosáhlo přiměřeného elektroforetického rozlišení těchto rychleji se pohybujících zon je nezbytné nanést velmi malý objem koncentrovaného vzorku na start jako velmi ostrý, úzký pruh. To není vždy jednoduché a vyžaduje to, vedle dostatečně koncentrovaného vzorku, i určitou zručnost.

145

K překonání tohoto problému byla zavedena technika diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém gelu, která používá 2 gely s různě velikými póry a několik pufrů s odlišným pH. Tzv. startovní nebo zaostřovací gel, který je v horní části a tedy přijde jako první do styku s dělenou směsí, má velké póry; separační gel, který je umístěn pod ním, je běžný gel používaný při zonové elektroforéze. V separačním gelu a ve spodní elektrodové nádobce se použije obvyklý pufr, zatímco pro přípravu startovního gelu a pro rozpuštění vzorku se použije pufr, jehož pH je asi o 2 jednotky nižší. Pufr umístěný v horní elektrodové nádobce obsahuje obvykle glycin, ev. jinou slabou kyselinu a jeho pH se upraví na pH blízké pufru v dolní nádobce. Při zapnutí proudu ionty z horní nádobky putují do startovního gelu, kde se setkají s pH, které je nižší než je jejich pK, proto ztratí náboj a nebudou se v elektrickém poli pohybovat. Aby byl udržen za těchto okolností v okruhu konstantní proud, dojde (podle Ohmova zákona) k místnímu zvýšení intenzity elektrického pole, což vede ke zrychlení pohybu makromolekul ve formě aniontů. V okamžiku, kdy anionty vstoupí do separačního gelu, jejich pohyb se zpomalí, neboť přijdou do prostředí, kde jsou i další ionty z pufru. Tento jev způsobí, že ionty makromolekul vstupují do separačního gelu v podobě velmi úzkých zón, které jsou seřazeny podle svých pohyblivostí mezi pohybující se ionty ze startovního gelu a ionty z horní nádržky. Takto získaná hustota zón při vstupu do separačního gelu značně zvyšuje stupeň rozlišení jednotlivých molekul. V separačním gelu se vedle elektroforetické pohyblivosti uplatní i princip molekulárního síta, což vede ještě k dokonalejší separaci. Diskontinuální (disková) elektroforéza se provádí jak v trubičkovém tak plošném uspořádání v přístrojích, které se používají pro ostatní typy zonové elektroforézy (obr.2.88).

Elektroforéza v gradientovém gelu Dalšího zlepšení separace lze dosáhnout použitím tzv. gradientových gelů. Tím se rozumějí gely, u nichž se s rostoucí vzdáleností od startu používá rostoucí koncentrace polyakrylamidu, takže u vytvořeného gelu se směrem od startu zmenšuje velikost pórů. Při postupu v gradientovém gelu se molekuly setkávají se stále větším odporem vůči svému pohybu až se jejich pohyb prakticky zastaví, neboť již nejsou schopny dále prostupovat gelem. Vzdálenost od startu, kterou může molekula urazit, závisí na její velikosti. Malé molekuly mohou houstnoucím gelem prostupovat déle než molekuly velké. Tímto způsobem

146

se dosáhne vyššího zaostření jednotlivých zón, obsahujících molekuly stejné velikosti. Hlavním separačním faktorem je tedy velikost molekuly a elektroforetický pohyb jen zprostředkuje pohyb molekul v elektrickém poli. Elektroforézu v gradientovém gelu je možno provádět jak v trubičkách, tak plošně. Protože příprava gradientových gelů není jednoduchá záležitost, dává se přednost komerčně připraveným gelům. Vzhledem k tomu, že komerčně jsou gradientové gely vyráběny pouze v plošném uspořádání (na destičkách), provádí se tento způsob elektroforézy ve většině případů plošně.

Obr.2.90

Elektroforeogram lidského sera získaný diskovou elektroforézou

Pulzní gelová elektroforéza Jestliže máme separovat směs nukleových kyselin, není často PAGE vhodnou metodou. Na polyakrylamidovém gelu je možno separovat jen malé nukleové kyseliny. 147

Nukleové kyseliny obsahující několik tisíc párů nukleotidů jsou již pro pohyb v polyakrylamidovém gelu příliš velké a musí se proto použít agarosový gel, a to takový, který obsahuje jen málo agarosy. Takové gely jsou velmi křehké. Avšak i gel s obsahem 0,1% agarosy, který je nejnižší možnou použitelnou koncentrací, je schopen separovat pouze molekuly neobsahující více než 100 000 párů bazí. Teprve nedávno vyvinutá pulzní gelová elektroforéza umožňuje separovat molekuly obsahující až 12 milionů párů bazí. Pulzní elektroforéza je založena na použití dvou (nebo i více) elektrických polí, která jsou alternativně aplikována v různých úhlech po přesně stanovené časové úseky. Při aktivaci prvního elektrického pole se separované molekuly srovnají do správného směru a začnou se pohybovat gelem. Přerušení tohoto elektrického pole a zařazení elektrického pole druhého přinutí molekuly změnit směr svého pohybu. Na náhlou změnu elektrického pole reagují dlouhé molekuly nukleových kyselin tak, že nejprve zorientují svůj dlouhý řetězec podél nového směru elektrického pole a pak teprve mohou putovat gelem od katody k anodě. Čas potřebný k přeorientování molekul nukleových kyselin stoupá s délkou jejich řetězce, proto kratší molekuly mohou putovat gelem výrazně rychleji než molekuly velké. Tím se dosáhne vyšší účinnosti dělení. Separace se děje převážně podle velikosti molekul. Používaný elektroforetický přístroj má dva nebo více párů elektrod rozmístěných okolo desky s agarosovým gelem. Na jednotlivé elektrodové páry jsou postupně přiváděny napěťové pulsy (0,1 - 1000s podle velikosti dělených molekul) (viz obr.2.91).

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) Při separaci bílkovin se PAGE dočkala velkého rozšíření v kombinaci s užitím anionaktivního detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS). SDS nese poměrně vysoký náboj a proto ve vazbě na bílkovinu vyrovnává nábojové rozdíly bílkovinných molekul a ty se pak pohybují v gelu jen podle velikosti. Všechny bílkoviny váží asi 1,4g SDS na 1 g bílkoviny a při tom unifikují i svou konformaci. Výsledné komplexy SDS - bílkovina pak mají stejnou hustotu povrchového náboje a zároveň se jejich konformace do té míry unifikuje, že relativní molekulová hmotnost bílkoviny odpovídá velikosti jejího komplexu s SDS. Mobilita komplexu SDS - bílkovina v polyakrylamidovém gelu je přímo úměrná logaritmu molekulové hmotnosti příslušné bílkoviny. Takto stanovené hodnoty relativní molekulové hmotnosti bílkoviny jsou všeobecně uznávány pro účely charakterizace bílkovinného

148

preparátu. Nevýhodou je, že vazbou SDS na bílkovinu ve většině případů dochází ke ztrátě biologické aktivity bílkoviny, takže např. enzymy již po proběhnutí elektroforézy není možné na základě aktivity prokázat.

Obr.2.91

Přístroj na pulsní gelovou elektroforézu

Hannigova kontinuální elektroforéza Jde o kontinuální beznosičovou průtokovou zonovou elektroforézu. Principem této metody je separace molekul v pohybujícím se elektrolytu, jehož směr pohybu je kolmý na směr elektrického pole. Výsledkem je pohyb molekul (nebo částic) vychylující se od směru toku nosného elektrolytu v závislosti na velikosti náboje, který nese (viz obr. 2.92). Pro pohyb částic při tomto typu elektroforézy platí jednoduchý vztah tg α = v / u

(32)

α = úhel vychýlení postupující zony od směru toku nosného elektrolytu v = rychlost elektroforetického pohybu u = rychlost toku nosného elektrolytu

Elektroforéza probíhá ve speciálním přístroji s elektroforetickou komorou, která má tvar ploché čtvercové nebo obdélníkové štěrbiny o rozměrech stran v desítkách centimetrů a výškou vrstvy 0,25 - 0,60 mm. Stabilizace zon je zajištěna laminárním prouděním a dostatečně tenkou vrstvou elektrolytu. Pro zachování konstatntní hodnoty úhlu α je třeba udržet konstantní podmínky separace v dlouhodobém režimu. Přístroj proto musí být

149

vybaven stabilizovaným zdrojem napětí nebo proudu, účinným thermoregulačním systémem a přesně pracujícími čerpadly pro kontinuální přívod vzorku a odvod separovaných složek do jímače frakcí. Metoda byla původně použita pro separaci nízkomolekulárních a vysokomolekulárních rozpustných látek, později se však ukázalo, že je velmi výhodná i pro separaci koloidů, subcelulárních částic a buněk, pokud ovšem nesou náboj. V tom případě však musí být elektroforetický přístroj konstruován tak, aby nedocházelo k rychlé sedimentaci částic na stěnách komory. Vyrábějí se proto dva typy přístrojů pro kontinuální beznosičovou elektroforézu, a to přístroje horizontální, které jsou vhodné pro separaci rozpustných látek a přístroje vertikální, určené pro separaci sedimentujících látek. Oba typy přístrojů jsou na výstupu z elektroforetické komory opatřeny vývody a čerpadly pro odběr frakcí. Hannigova elektroforéza má četné aplikace zejména v oblasti separace buněk a subcelulárních částic, ale používá se též pro separace biologických extraktů, peptidů a bílkovin.

Obr.2.92 směr

Schema komory přístroje pro Hannigovu kontinuální elektroforézu. Šipky naznačují toku nosného elektrolytu E, S je místo nástřiku vzorku. F1 až F4 složky vzorku

2.5.3 Izoelektrická fokusace (IEF) Izoelektrická fokusace je další z elektromigračních metod. Patří do kategorie rovnovážné elektroforézy. Od zonální elektroforézy, která se provádí za konstantního pH, se liší tím, že v mediu mezi elektrodami se díky přítomnosti nízkomolekulárních amfolytů vytváří gradient pH. Amfoterní molekula nesoucí náboj se pohybuje vlivem elektrického

150

proudu v gradientu pH až do okamžiku, kdy se dostane do oblasti pH shodné s jejím izoelektrickým bodem a její pohyb se zastaví. Pokud molekula z tohoto místa difunduje pryč, změní se vstupem do oblasti s jiným pH její výsledný náboj a elektroforetický pohyb ji vrátí zpět do místa jejího izoelektrického bodu. Každá molekula je tedy fokusována (zaostřena) do úzké zóny kolem svého izoelektrického bodu. Tímto způsobem je možno od sebe oddělit molekuly, jejichž izoelektrický bod se liší o 0,001 jednotky pH. Vznik gradientu pH je založen na elektrochemických reakcích, k nímž dochází na elektrodách: na anodě 6H2O → 4H3O+ + 4ena katodě 4H2O+ 4e- → 2H2 + 4OHPro tvorbu stabilních gradientů pH se používá směs nízkomolekulárních oligomerů obsahujících disociovatelné skupiny, zejména karboxylové skupiny a aminoskupiny, jejichž izoelektrické body se pohybují ve zvoleném rozmezí. V antikonvekčním mediu, jakým je polyakrylamidový nebo dextranový gel, se pod vlivem elektrického pole směs těchto polyamfolytů seřadí podle svých izoelektrických bodů tak, že nejkyselejší se shromáždí u anody a směrem ke katodě se rozmisťují amfolyty se stoupající bazicitou. Elektrolytické pochody probíhající u elektrod poskytují amfolytům vodíkové a hydroxylové protiionty. Výsledkem tohoto pochodu je vytvoření gradientu pH, v němž proběhne izoelektrická fokusace. pH gradient se často vytváří v denzitním gradientu sacharosy, který stabilizuje fokusované elektrolyty proti míchání s okolím. Interval pH, tvar vzniklého gradientu a vlastnosti gradientu jsou určeny počtem a vlastnostmi jednotlivých amfolytů. Protože se gradient vytváří fokusací složek amfolytů při jejich pI, musí mít amfolyty dostatečnou pufrovací kapacitu v oblasti svých pI, aby byl gradient jednoznačně určen i v přítomnosti amfoterních látek ze vzorku. Pufrovací kapacita amfiiontu však způsobí, že při dosažení jeho pI se vytvoří malá prodleva pH. Existuje-li v roztoku více amfoterních substancí s pufrovací kapacitou, které se od sebe budou lišit svými pI, vytvoří se gradient pH. Bude-li v roztoku amfolytických substancí s vhodně rozmístěnými izoelektrickými body a s tlumivými kapacitami dostatečné množství, vytvoří se kontinuální pH gradient bez prodlev, neboť jednotlivé prodlevy se budou navzájem překrývat. Úplné oddělení nízkomolekulárních látek, které se používají pro tvorbu amfolytových pufrovacích systemů(nazývaných amfolytové nosiče), v elektrickém poli není možné, neboť velice rychle difundují a zony jejich působení se překrývají. Tím se výrazně liší od vysokomolekulárních látek, které se nejčastěji izoelektrickou fokusací separují.

151

Izoelektrická fokusace se využívá převážně pro analytické účely, a to pro stanovení izoelektrického bodu separovaných látek, stanovení titračních křivek a k identifikaci jednotlivých složek separovaných směsí. Jsou však známa i jeho preparativní použití. Efektivní je i technika elektroforetické desorpce, která se uplatní zejména při práci s afinitními komplexy. K rozdělení těchto komplexů je často nutné používat poměrně drastické eluční metody, které mohou častečně zlikvidovat biologickou aktivitu separované sloučeniny. S podobným problémem se můžeme setkat i při uvolňování některých bílkovin z polyakrylamidového gelu po skončení elektroforézy. Elektroforetická desorpce, založená na IEF, uvolňuje velmi šetrně separované látky z pevných komplexů a odvádí je do míst jejich izoelektrického bodu. IEF je možno provádět dvojím způsobem: v trubičkách nebo plošně. Provedením IEF připomíná PAGE, liší se však principem dělení a použitými materiály. Obvykle však je možné pro PAGE i IEF používat stejná zařízení. IEF je možno provádět i volně, t.j. bez nosičů, např. v trubici, na jejichž obou koncích jsou umístěny elektrody. Po ustavení rovnováhy však je nutno separované látky od sebe rychle oddělit, aby po průchodu proudu nedošlo ke zpětnému promíchávání.

2.5.4 Afinitní elektroforéza Afinitní elektroforéza se provádí v gelu, do něhož byl zapolymerován nebo na nějž byl navázán afinitní ligand (barevný ligand, inhibitor enzymu apod.). Jestliže se v takovémto gelu provede elektroféza směsi, jejímž členem je molekula se specifitou vůči ligandu, tato molekula se buď úplně zastaví (v případě, že je dostatečné množství ligandu), nebo bude alespoň výrazně zpožděna a tak se spolehlivě oddělí od ostatních složek směsi. Porovnáním s kontrolním gelem bez imobilizovaného ligandu lze určit, který protein v analyzované směsi má pro daný ligand afinitu a zda čištěný preparát obsahuje vazebně inaktivní příměsi. Navíc ze stupně retardace (zpoždění) a koncentrace imobilizovaného ligandu lze stanovit disociační konstantu komplexu biomolekula-ligand. Pro kvalitativní účely lze vedle afinitní PAGE použít i afinitní IEF (izoelektrickou fokusaci).

152

Obr.2.93

Elektroforeogram DNA získaný pulsní gelovou elektroforézou

2.5.5 Dvojrozměrná elektroforéza Při separaci či analýze komplikovaných vzorků často nevystačíme pro dokonalou separaci s jednou z výše uvedených elektroforetických metod. Ke zlepšení separace je možno provádět prakticky libovolnou z popsaných elektroforetických metod postupně ve dvou navzájem kolmých směrech. Výhodné je, kombinují-li se při tom dvě principielně odlišné elektroforetické metody, např. v jednom směru izoelektrická fokusace, ve druhém směru SDS-elektroforéza. Ačkoliv existuje celá řada možností kombinace dvou metod či dvakrát

153

stejné metody v kolmých směrech, dvojrozměrná elektroforéza se nejčastěji provádí některým z dále uvedených způsobů: 1. PAGE v trubičce se kombinuje s PAGE na desce. Nejprve se nechá proběhnout PAGE v trubičce.

Gel

z

trubičky

se

pak

podélně

připolymeruje

k

připravené

desce

polyakrylamidového gelu a nechá se proběhnout elektroforéza v druhém směru po desce. 2. Kombinace PAGE a SDS-PAGE. Provádí se na desce. Po proběhnutí PAGE v jednom směru se deska otočí o 90o a v druhém směru se nechá proběhnout jako SDS-PAGE. Jde o kombinaci dvou principů: v jednom směru se látky separují podle náboje, ve druhém podle velikosti molekuly. 3.Kombinace IEF a SDS-PAGE. IEF se provede v trubičce, která se pak připolymeruje k připravené polyakrylamidové desce a nechá se proběhnout elektroforéza s SDS v kolmém směru. Jde tedy o kombinaci separace podle izoelektrického bodu a podle velikosti molekuly.

2.5.6 Izolace separovaných látek z gelové matrice Provádíme-li elektroforézu preparativně, tj. s cílem vyizolovat separované látky, musíme po rozdělení na gelové desce nebo sloupci látky z gelu uvolnit. Požadavek na uvolnění separované látky z gelu se může vyskytnout i při analytickém provedení gelové elektroforézy, má-li být separovaná látka dále analyzována. Desorpce z gelu je obdobný proces jako uvolňování látky z komplexu, např. při rozrušení vazby mezi ligandem a biomolekulou při afinitní chromatografii. Proto se používají i obdobné techniky. Pro eluci je možno využít difuze. Část gelu, na níž se vyskytuje požadovaná látka po separaci, se vyřízne a vloží do nádobky s vhodným pufrem. Za intenzivního míchání se látka desorbuje z gelu a uvolňuje do roztoku, roztok se separovanou látkou se pak oddělí centrifugací a zahustí. Tato metoda je sice jednoduchá, ale nezaručuje úplnou desorpci separované látky, resp. její výtěžky jsou velice nízké. Pro některé gely, např. pro PAG, se nehodí vůbec. Nejčastěji používanými technikami pro eluci separovaných látek z gelu jsou elektromigrační techniky. Je to zejména tzv. elektroeluce, popsaná v kapitole 2.4.1 (viz též obr.2.66) nebo elektroforetická desorpce, popsaná v kapitole 2.5.3. Elektroforetická desorpce 154

je založena na principu izoelektrické fokusace a oproti elektroeluci, která využívá prostý elektroforetický pohyb, má výhodu koncentrace látky v ostrých zonách (desorbované složky putují do míst svého izoelektrického bodu, tam se koncentrují a fokusují), které pak opouštějí sloupec či desku. Obě elektromigrační techniky lze použít pro eluci z gelu při plošném i sloupcovém uspořádání. V některých případech jsou konstruována zařízení, která umožňují spojení eluce s vlastní elektroforézou, takže eluční proces je kontinuální. Ty se používají zejména při preparativním sloupcovém uspořádání (kap.2.5.2 a obr. 2.89). Při plošných technikách je běžná diskontinuální eluce. Ta se provádí v nádobách s oddělenými elektrodovými prostory (obvykle ve vertikálním uspořádání), které jsou propojeny jednou nebo více trubičkami, jejichž dno tvoří frita. Na dolní části trubičky je pevně nasazen nástavec s membránou (nazývaný též dialyzační nástavec). Do trubičky nad fritu se umístí výřez gelu obsahující složku, která má být desorbována, a zalije se vhodným pufrem. Po aplikaci elektrického pole dojde k desorpci složky z gelu a k jejímu elektroforetickému pohybu v pufru. Elektrody je třeba zapojit tak, aby se eluovaná složka pohybovala směrem dolů (závisí na náboji složky). Frita brání průchodu gelu, ale umožní průchod eluovaných složek (i makromolekul), které se hromadí v prostoru mezi fritou a membránou. Membrána musí být volena tak, aby požadovaná složka zůstala nad membránou. V popsaném zařízení je možno současně eluovat několik odseparovaných látek, podle počtu trubiček, které se mezi elektrodové prostory umístí.

155

Obr. 2.94

Přístroj na preparativní gelovou elektroforézu s diskontinuální elucí 1 gelový sloupec, 2 dialyzační nástavec, 3 a 4 kapiláry, 5 a 6 elektrody, 7 čerpadlo, 8 UVmonitor

Zařízení uvedené na obr. 2.94 je pouze obměnou výše popsaného diskontinuálního zařízení. Je konstruováno tak, že mezi elektrodovými prostorami je pouze jediná trubička a do ní se vloží celý gel po separaci. Jednotlivé zony jsou pak podle výše uvedeného principu postupně eluovány.

2.5.7 Vizualizace separovaných látek Vzhledem k tomu, že většina látek, které separujeme, je bezbarvá, po proběhnutí elektroforetické metody musíme zařadit tzv. vizualizaci neboli zviditelnění příslušných složek směsi. Konečné rozlišení separovaných látek je na tomto kroku značně závislé. Nejčastěji jde o využití barevných reakcí. Technikám vizualizace pro jednotlivé látky byla věnována značná pozornost, nejpropracovanější jsou však pravděpodobně techniky vizualizace bílkovin. Pro vizualizaci bílkovin se nejčastěji používá adsorpce barviva - amidočerni, methylenové modři, Coomassie blue - na povrch bílkoviny. Gel se po skončené elektroforéze ponoří na několik minut do roztoku příslušného barviva a pak se několik hodin vypírá ve zředěné kys.octové (7 %). V místech, kde je barvivo pevně adsorbováno na bílkovinu, k odbarvení nedojde, z ostatních částí gelu je barvivo vymyto. Zony bílkovin budou tedy barevné na bezbarvém pozadí. Až 50x jsou citlivější metody vizualizace bílkovin založené na vyredukování stříbra z amoniakálního roztoku v těch místech na gelu, kde jsou fixovány bílkoviny.

156

Dalším prostředkem pro detekci bílkovin je barvivo fluoreskamin. Je to nefluoreskující molekula, která po reakci s primárními aminy (např. lysinem) dává produkt s vysokou fluorescencí v UV-světle.

Jsou-li separovány radioaktivně značené bílkoviny, používá se k detekci metody autoradiografické, která umožňuje detegovat i mikrokvanta bílkoviny. Autoradiografické obrazy vznikají účinkem záření radionuklidů na vrstvu fotografické emulze. Glykoproteiny, stejně jako další cukerné sloučeniny (i nebílkovinné) jsou obvykle detegovány tak, že cukerná složka je oxidována jodistanem a vzniklé aldehydické skupiny reagují s vhodným činidlem za vzniku zbarvení. K barvení cukerných složek se používají i další reakce známé z kvalitativního průkazu cukrů, např. fuchsinové činidlo, tetrazoliové soli apod. Zvláštním případem je vizualizace látek, které prokazují biologickou aktivitu. Bílkoviny s enzymovou aktivitou mohou být detegovány na základě enzymových reakcí za vzniku barevných produktů (rekce glukosy s glukosaoxidasou a peroxidasou), nebo naopak produktů, které ztrácejí schopnost dávat barevné reakce (škrob rozložený pomocí amylas ztrácí schopnost dávat barevnou jodoškrobovou reakci - zony obsahující amylasy jsou bezbarvé na temně modrém pozadí). Po skončené elektroforetické separaci se gel ponoří do roztoku, obsahujícího substrát reakce a další složky, které dávají s produktem barevné sloučeniny. V místech, kde je přítomna bílkovina s enzymovou aktivitou dojde k barevné reakci (nebo k odbarvení - amylasa). Vizualizaci na základě biologické aktivity nelze použít po SDS-PAGE, neboť dojde ke konformačním změnám bílkovin a ke ztrátě jejich biologické aktivity. DNA lze detegovat selektivním barvením tzv. interkalačními činidly. Jsou to sloučeniny obsahující aromatické kationty, např. ethidiumbromid, proflavin, akridinová oranž (obr.2.95). Tato barviva se váží interlakací (vmezeřením mezi páry bazí) na šroubovici DNA, kde pak v UV-světle intenzivně fluoreskují, respektive výrazně zvyšují existující

157

fluorescenci. Jednovláknové DNA a RNA také zvyšují fluorescenci ethidia, ne však tak silně jako dvouvláknová DNA.

Obr.2.95

Interkalační činidla pro vizualizaci DNA

Většina nukleových kyselin, ale i některé proteiny, jsou po skončené elektroforéze uzavřeny uvnitř gelové matrice a jejich přímé barvení je proto obtížné. Aby byly dosažitelné pro barviva nebo jiné specifické způsoby detekce, je výhodné je přemístit na membrány různých typů (nitrocelulosové, nylonové apod.), které nukleové kyseliny, eventuálně proteiny, váží, ale současně je zpřístupňují. Tyto techniky se označují jako přenosy, častěji se však používá anglického výrazu blotting. Southernův přenos (Southern blotting) slouží k identifikaci DNA se specifickým pořadím bazí. Po skončené elektroforéze se gel ponoří do roztoku NaOH, tím se DNA převede na jednovláknovou formu. Na gel se pak přiloží nitrocelulosová membrána a na ní dostatečné množství neklíženého papíru, který nasává vodu skrz nitrocelulosovou membránu. Tím se dostane membrána do styku s jednovláknovou DNA, již je schopna poměrně pevně vázat. DNA je pak umístěna na nitrocelulosové membráně v místech, kde se nacházela na gelu. Přenos na nitrocelulosovou membránu se efektivněji provádí elektroforeticky, tak, že gelová deska a membrána se umístí do elektrického pole. Pak jde o elektropřenos neboli elektroblotting. Po skončeném přenosu se membrána navlhčí tzv. nukleotidovou sondou, což je DNA či RNA komplementární k hledané DNA, která však musí být nějakým způsobem označena, a nechá se nějakou dobu hybridizovat. Značení je možné provést použitím radionuklidu s 32P (musí se vyvolat přiložením k fotografické desce), nebo připojením sondy

158

k enzymu, který vytvoří na povrchu určité DNA barevný nebo fluorescenční povlak. Takto může být identifikována DNA s požadovaným pořadím bazí. 1

Northern blotting (přenos) slouží k detekci specifické RNA. Využívá vazby RNA na

nitrocelulosovou membránu a její hybridizaci s radioaktivně značenými sondami v podobě komplementárních DNA nebo RNA. Western blotting, zvaný též imunoblotting, je používán pro detekci bílkovin. Směs proteinů je přenesena z gelu na nitrocelulosovou mebránu a jednotlivé proteiny se identifikují podle toho, jak se váží s příslušnými protilátkami. Na bílkovinu, kterou chceme identifikovat, se naváže značená protilátka. Protilátky mohou být značeny

125

I nebo enzymy.

Nejpoužívanější enzymy pro značení jsou alkalická fosfatasa a křenová peroxidasa. Identifikace příslušné bílkoviny je umožněna finální enzymovou reakcí, při které se z chromogenního substrátu uvolňuje barevná látka. V některých případech, kdy je vazba proteinu na nitrocelulosovou membránu příliš pevná, doporučuje se použít papír s (diazobenzyloxy)methoxylovými skupinami, reagujícími s koncovými aminoskupinami proteinů za vzniku kovalentní vazby.

2.5.8 Imunoelektroforéza Imunoelektroforéza je elektroforetická metoda, která využívá imunochemického principu, tedy specifické interakce antigenu s protilátkou za vzniku nerozpustného komplexu, k detekci separovaných látek. V prvé etapě se rozdělí směs antigenů elektroforeticky v agarovém gelu na jednotlivé frakce. Po skončení elektroforézy se nanese do žlábku podél rozdělených antigenů antisérum (polyvalentní protilátka) a nechá se proběhnout dvojitá imunodifuze. Obě složky, antigen i protilátka, při tom difundují do gelu a v místě, kde se setkají, vytvoří precipitační linii, která je konvexní směrem ke žlábku s protilátkou (viz obr. 2.96). Vzniklá precipitační linie se obarví některou z metod na detekci bílkovin, např. amidočerní. Pro imunoelektroforézu bylo vypracováno několik dalších technik, které využívají imunoelektroforetického principu. Jednou z nich je protisměrná imunoelektroforéza. Do gelu se vykrojí dvě rovnoběžné řady jamek o průměru 2-3 mm. Vzdálenost jamek v jedné řadě je 4-5 mm, vzdálenost obou řad je 6-10 mm. Do jedné řady se pipetují roztoky antigenu, do

159

druhé protilátka. Při elektroforéze migrují obě složky proti sobě a v zoně ekvivalence vytvoří precipitační linii. Protože elektroforéza probíhá v pufru při pH 8,6, pohybuje se protilátka směrem ke katodě. Metodu lze proto použít pouze pro průkaz antigenů s anodickou pohyblivostí a roztok antigenu je nutno umístit blíže ke katodě než protilátky. Elektroimunodifuze bývá nazývána též elektroimunoprecipitace nebo častěji „raketová technika“, neboť vzniklá precipitační linie má tvar rakety. Při této metodě se antisérum (protilátka) přimíchá při 50oC přímo do nosného gelu (agar nebo agarosa), ten se pravidelně rozestře na skleněnou destičku a nechá ztuhnout. Antigen se nanese do jamek vyhloubených v gelu. Po vložení desky do elektrického pole se antigen začne pohybovat. Podstatou metody je neustálé rozpouštění komplexu antigen-protilátka přebytkem putujícího antigenu, a to až do okamžiku, než je veškerý antigen vyvázán specifickou protilátkou v gelu. Precipitační linie tak dostane tvar rakety, jejíž plocha je úměrná koncentraci přítomného antigenu. Vzhledem k tomu, že rakety jsou obvykle úzké a dlouhé, lze jejich plochu aproximovat výškou, t.j. vzdáleností vrcholu od startu. Tuto metodu lze tedy využít i pro kvantitativní stanovení antigenu. Dvojrozměrná imunoelektroforéza je kombinací elektroforézy a elektroimunodifuze. Směs antigenů se nejprve rozdělí elektroforeticky v agarosovém nebo polyakrylamidovém gelu a vyřízne se pruh gelu tak, aby obsahoval separované antigeny. Tento pruh se položí na okraj čisté skleněné destičky, která se doplní agarosovým gelem obsahujícím protilátky. Pak se ve směru kolmém ke směru původnímu uskuteční druhá elektroforéza. Antigeny migrují do gelu s protilátkami a v zonách precipitace vytvářejí široké precipitační rakety nebo vrcholy (obr. 2.97).

1

Přenos sloužící k identifikaci DNA navrhl pan Southern (v překladu "Jižní"). K pojmenování dalších přenosů pak bylo využito slovní hříčky a byly nazvány "Nothern" (severní) a "Western" (západní). 160

Obr.2.96

Elektroforeogram imunoelektroforézy

Obr.2.97

Dvojrozměrná imunoelektroforéza

2.5.9 Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza, častěji nazývaná vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE), je elektroforetická metoda, která se provádí v kapiláře s vnitřním průměrem 25 - 75 μm a délkou 100 - 1000 mm. Oba konce kapiláry jsou ponořeny do elektrodových nádobek naplněných, stejně jako kapilára, nosným elektrolytem. Do nich jsou ponořeny platinové elektrody. Poblíž katodového konce kapiláry je umístěn detektor (obvykle UV). Vzdálenost od anodového konce kapiláry k detektoru se nazývá efektivní délka kapiláry. Vzorek pro separaci se aplikuje na anodovém konci kapiláry (viz obr.2.98). Vedle elektroforetických principů elektroforézy, t.j. pohyb molekul nesoucích náboj v elektrickém poli, se při separaci látek kapilární elektroforézou uplatní i elektroosmotický tok (EOF). Je to spontánní tok kapaliny v kapiláře v důsledku náboje na vnitřní straně kapiláry.

161

Obr.2.98

Kapilární elektroforéza

Ve vodném prostředí nese většina pevných povrchů záporné náboje. Je to výsledek ionizace povrchu, eventuálně adsorpce některých nabitých iontů na povrchu. Křemenné sklo obsahuje silanové skupiny (SiOH), které mohou v prostředí s pH vyšším než 4 existovat ve formě iontu (SiO-), takže v křemenných kapilárách pochází záporný náboj především z těchto skupin. Naopak u kapilár z inertního materiálu, např. z teflonu, jsou zdrojem povrchového náboje především adsorbované ionty. Protiionty (nejčastěji kationty) se shromažďují u povrchu kapiláry a vytvářejí dvojvrstvu. Potenciální rozdíl, který vzniká, se označuje jako zeta potenciál. Jestliže je kapilára umístěna v elektrickém poli, kationty, které tvoří dvojvrstvu, se začnou pohybovat směrem ke katodě. Protože jsou solvatované, strhnou s sebou veškerou kapalinu v kapiláře. Tak dojde v kapiláře k toku směrem ke katodě. Je to tak zvaný elektroosmotický tok (obr.2.99). Při opačném náboji na stěně kapiláry, který může být získán použitím odlišných materiálů ev. modifikacemi stěny kapiláry, o čemž bude pojednáno později, se EOF bude pohybovat opačně, tedy k anodě. Velikost elektroosmotického toku se vyjadřuje jako rychlost nebo jako mobilita (pohyblivost). Zatímco rychlost je závislá na velikosti elektrického pole, mobilita na něm nezávisí. Závisí však přímo na zeta potenciálu, který je dán velikostí náboje na stěně kapiláry. Vzhledem k tomu, že tento náboj je silně závislý na pH (jde v podstatě o disociaci silanových skupin), závisí na pH i elektroosmotický tok. Při vysokém pH jsou silanové skupiny převážně disociované, proto je elektroosmotický tok v tomto případě výrazně vyšší než při nízkém pH, kdy je většina silanových skupin protonována a nenese náboj. Rozdíly v mobilitě při změnách pH mohou být až řádové. v= μE

μ = (εξ/η)

v = rychlost elektroosmotického toku μ = mobilita ξ = zeta potenciál ε = dielektrická konstanta η = viskosita elektrolytu E = elektrické pole 162

(33)

EOF závisí i na iontové síle elektrolytu. Zvyšováním iontové síly elektrolytu dochází ke stlačování dvojvrstvy a klesá zeta potenciál. Redukuje se tudíž i elektroosmotický tok. Účinkem elektroosmotického toku dochází k pohybu prakticky všech iontů ev. molekul - bez ohledu na jejich náboj - ve stejném směru. Za normálních okolností, t.j. při negativním náboji na stěně kapiláry, se všechny molekuly a ionty při kapilární elektroforéze pohybují směrem ke katodě. To platí i o aniontech, neboť mobilita způsobená elektroosmotickým tokem značně převyšuje (až o řád) elektroforetickou mobilitu. Nejrychleji se pohybují kationty, neboť mobilita vlivem elektroosmotického toku i mobilita elektroforetická působí ve stejném směru. Neutrální molekuly se pohybují pouze účinkem elektroosmotického toku, takže nebudou separovány navzájem. U aniontů je pohyb ke katodě dán rozdílem obou mobilit, proto se v kapiláře pohybují nejpomaleji (obr.2.100). V některých případech je žádoucí elektroosmotický tok regulovat, neboť při příliš velké rychlosti EOF by mohlo dojít k eluci látek v roztoku ještě dříve, než dojde k jejich separaci. Regulace se dosahuje změnou náboje stěny kapiláry či změnou použitého pufru. Tyto zásahy však často mění vedle EOF též vlastnosti dělených látek, na nichž závisí jejich mobilita (např.disociace iontů). Optimální separace lze docílit pouze tehdy, jestliže zvolené podmínky jsou optimální jak pro velikost EOF tak pro mobilitu látek v dělené směsi. Způsobů jak regulovat velikost EOF je několik, např. už výše zmíněná změna pH či iontové síly použitého pufru, změna elektrického pole (jak vyplývá z výše uvedené rovnice). Náboj stěny kapiláry může být změněn použitím surfaktantů (viz obr. 2.101), které se prostřednictvím hydrofobních interakcí a iontových vazeb adsorbují na stěnu kapiláry. Neutrální hydrofilní polymery se mohou rovněž zachytit na stěnu kapiláry pomocí hydrofobních interakcí, její náboj však nemění, pouze ho "stíní" a tím dosáhnou snížení EOF. V současné době jsou činěny pokusy měnit EOF pomocí změn elektrického potenciálu na vnější stěně kapiláry. Toho se dosahuje vytvořením vrstvy na povrchu kapiláry, která může zcela změnit náboj na vnitřní stěně kapiláry a tím ovlivnit EOF.

163

Obr.2.99

Vznik elektroosmotického toku negativně nabitá stěna kapiláry hydratované kationty se shlukují v blízkosti povrchu kapiláry spontánní tok ve směru katody po zavedení elektrického pole

Obr.2.100

Separace různě nabitých iontů při kapilární elektroforéze

164

Čas, který potřebuje ion aby prošel od startu k detektoru, se nazývá migrační čas a je dán efektivní délkou kapiláry a rychlostí pohybu. Rychlost pohybu závisí na elektroforetické pohyblivosti jednotlivých molekul, na použitém elektrolytu a na použitém napětí, je však ovlivněna i tvarem a velikostí částic, koncentrací elektrolytu a jeho pH. Rychlost pohybu iontů v kapiláře je možno vypočítat z následující rovnice:

μa = 1/tE =IL/ tV

(34)

μa = μe + μEOF (mobilita) V = napětí I = efektivní délka kapiláry L = celková délka kapiláry t = migrační čas E = elektrické pole Účinnost separace jednotlivých molekul vzorku se vyjadřuje jako celkový počet teoretických pater (N), který je v ideálním případě možno vypočíst ze vzorce N = V/2D (I/L [μa + μEOT] ) = μe EI/2D

(35)

D = difusní koeficient I = efektivní délka kapiláry L = celková délka kapiláry ostatní symboly stejné jako u dříve uvedených vztahů Ze vztahu (35) je patrné, že aplikace vyššího napětí vede k vyšší separační účinnosti. Vyšší napětí však současně zvyšuje elektrický proud a tedy i teplotu, což může způsobit konvekční promíchávání či jiné nežádoucí procesy. Na velikost proudu má vliv i koncentrace elektrolytu a rozměry kapiláry. Například při prodlužování kapiláry nebo snížení jejího vnitřního průměru vzrůstá odolnost proti zvyšování napětí, takže velikost proudu i teplota se snižují. Účelem separačních technik je rozlišení jednotlivých látek ve směsi. Stupeň rozlišení je proto jedním z nejdůležitějších ukazatelů účinnosti dané separační techniky. Při HPCE je stupeň

rozlišení

určen

účinností,

nikoliv

selektivitou,

jak

je

tomu

u

většiny

chromatografických technik. Vzhledem k tomu, že zony, které se při HPCE vytvářejí, jsou

165

velice ostré, stačí k dokonalému rozlišení dvou látek již velice malý rozdíl v jejich mobilitě (menší než 0.05 %). Proti dokonalému rozlišení působí disperse. Stupeň rozlišení může být definován následovně: R = 2 (t2 - t1)/(w1 + w2) = (t2 - t1)/4σ w = 4σ

(36)

R = stupeň rozlišení t = migrační čas w = šířka nulové linie (baseline) σ = standardní odchylka

Se zřetelem k účinnosti procesu může být stupeň rozlišení definován i takto R = 1/4 (N1/2) (Δμ/μ)

(37)

Δμ = μ2 - μ1 μ = (μ1 + μ2)/2 Ideálního rozlišení by bylo dosaženo tehdy, kdyby mobilita μ a mobilita EOF si byly rovné v absolutní hodnotě, ale měly opačná znaménka. To znamená že by se ion pohyboval stejnou rychlostí jakou má EOF, ale opačným směrem. V tomto případě by se ovšem doba analýzy blížila nekonečnu. Z toho plyne, že se musí volit parametry procesu kompromisně tak, aby mezi stupněm rozlišení a dobou potřebnou k separaci existovala rovnováha.

2.5.10 Způsoby provedení kapilární elektroforézy Vzhledem k tomu, že kapiláry, v nichž se HPCE provádí, jsou antikonvekční, není nutno bránit tvorbě konvekčních proudů přítomností gelů, jako je tomu při běžné elektroforéze. Proto se velice často HPCE provádí jako volná elektroforéza. Nicméně kapilární elektroforézu je možno provádět i jinými způsoby, a to této metodě dodává značnou versatilitu, neboť separační mechanismy jednotlivých způsobů provedení se od sebe značně liší. V současné době nabízí HPCE tyto způsoby provedení:

166

- kapilární zonální elektroforéza (CZE) - micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) - kapilární gelová elektroforéza (CGE) - kapilární izoelektrická fokusace (CIF) - kapilární izotachoforéza (CITP)

Kapilární zonální elektroforéza Je to vlastně volná elektroforéza, t.j. nejjednodušší způsob kapilární elektroforézy. Provádí se v kapiláře naplněné pouze pufrem. Jak jsme uvedli již výše, je to nejčastěji používaný způsob kapilární elektroforézy. K separaci molekul dochází v zonách, které se pohybují různou rychlostí. Touto technikou je možno separovat anionty i kationty, pouze neutrální molekuly se všechny pohybují současně s EOF a nedojde proto k jejich rozdělení. Separační princip CZE je patrný z obr. 2.100 a 2.104. Selektivita CZE závisí na vlastnostech pufru, především na jeho pH a na aditivech, která se do pufru přidávají. Pracujeme-li s amfolyty, jako jsou např. peptidy, bílkoviny a aminokyseliny, pak pH pufru má zásadní význam pro průběh elektroforézy. Při pH pod izoelektrickým bodem bude mít molekula kladný náboj a bude se pohybovat směrem ke katodě rychleji než EOF. Nad izoelektrickým bodem bude mít náboj záporný a její elektroforetický pohyb bude proti směru EOF, výsledná mobilita proto bude za EOF. Vzhledem k chemické stabilitě křemenné kapiláry je možno pracovat v širokém rozmezí pH (2 - 12), limitujícím faktorem bývá spíše stabilita analytu. Z aditiv se nejčastěji používají surfaktanty, a to kationaktivní, anionaktivní i neionogenní. Jsou-li použity v koncentracích pod kritickou micelární koncentrací (t.j. při koncentraci, kdy surfaktanty netvoří micely) zvyšují rozpustnost málo rozpustných separovaných látek, ale modifikují též EOF. Adsorbují se totiž na stěnu kapiláry a podle svého náboje mohou zvyšovat, snižovat nebo úplně zlikvidovat EOF (viz obr.2.101). Použití koncentrací vyšších než je kritická micelární koncentrace, vede k výrazné změně mechanismu separace. Jde pak o způsob, který označujeme jako micelární elektrokinetickou chromatografii.

167

Obr.2.101

Eliminace a obrácení EOF prostřednictvím kationaktivních surfaktantů

Ke změně EOF mohou vést i modifikace kapilární stěny vázanými nebo adherovanými fázemi, jako jsou např. polyakrylamid nebo arylpentafluoridové skupiny. Deaktivace, k níž u takto potažených kapilár dochází, vede ke změně směru EOF nebo k jeho úplné likvidaci. Tak např. deaktivace polyakrylamidem nebo polyetylenglykolem způsobí likvidaci EOF, neboť dojde jak ke snížení efektivního náboje stěny kapiláry, tak ke zvýšení viskosity v okolí stěny. Deaktivace pomocí kationogenních skupin EOF obrací do protisměru. Deaktivace pomocí amfoterních molekul, jako jsou aminokyseliny nebo proteiny, má za následek reversibilitu EOF, podle toho, zda pH při elektroforéze je nad či pod jejich izoelektrickým bodem. Ze záznamu časového průběhu CZE, tzv. elektroforeogramu, může být získána kvalitativní i kvantitativní informace o složení separované směsi. Kvalita dané složky analytu je dána migračním časem odpovídajícího vrcholu, kvantita analytu je přímo úměrná ploše vrcholu.

Micelární elektrokinetická chromatografie Dalším

častým

způsobem

provedení

kapilární

elektroforézy

je

micelární

elektrokinetická chromatografie. Kombinuje v sobě principy jak elektroforézy, tak chromatografie. Je to metoda, která může být použita pro separaci látek nesoucích náboj, ale i látek elektroneutrálních. Základem procesu je použití surfaktantů jako aditiv do pufru, a to v koncentracích převyšujících kritickou micelární koncentraci (pro SDS asi 9 mmol/l). Při těchto

168

koncentracích začnou molekuly surfaktantu agregovat a vytváří se micely (obr.2.102). Micely mají sférický tvar: hydrofobní části molekuly surfaktantu směřují do centra, aby se vyhnuly kontaktu s hydrofilním pufrem, nabité části jsou naopak orientovány směrem k pufru. Podle náboje, který micely nesou, pohybují se buď ve směru nebo proti směru EOF. Jelikož však je EOF obvykle rychlejší než elektroforetický pohyb částic, výsledný pohyb bude vždy ve směru EOF. Micely při pohybu interagují s analyty rozpuštěnými v pufru, a to prostřednictvím hydrofobních a elektrostatických interakcí. Neutrální analyty, t.j. analyty, které nenesou náboj, jsou neseny pouze EOF. Jestliže se však dostanou do kontaktu s micelou, interagují s ní a jsou spolu s ní neseny kapilárou (obr.2.103). Čím je interakce silnější, tím déle zůstává analyt ve spojení s micelou a tím déle putuje současně s ní. Síla interakce analytu s micelou roste s hydrofobicitou molekuly analytu. Znamená to, že čím je molekula hydrofobnější, tím déle je její pohyb svázán s micelou a tím více se odlišuje její pohyb od EOF. Podle náboje micely dochází ke zvětšení či zmenšení její mobility. Princip separace neutrálních molekul při MEKC je tedy v podstatě chromatografický. Selektivita MEKC může být velice snadno změněna použitím odlišného surfaktantu pro tvorbu micel. Surfaktant totiž rozhoduje o velikosti micely, jejím náboji a tvaru. Kromě toho ovlivní selektivitu i iontová síla pufru, pH, teplota aditiva apod. Tyto otázky již byly podrobně rozebrány dříve.

Obr.2.102

Schema micel s kationty a s anionty

169

Obr.2.103

Separace při micelární elektrokinetické chromatografii

Kapilární gelová elektroforéza Naplnění kapiláry polymerem, který se uplatní jako molekulární síto, vede k separaci molekul na základě jejich velikosti. Je to princip, který již dobře známe z PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu). Jak nabité molekuly procházejí zesíťovaným polymerem, jsou postupně zpomalovány, velké molekuly více než malé. Takto mohou být od sebe odlišeny i makromolekuly, které se liší velikostí, ale mají uniformní náboj (bílkoviny ve vazbě s SDS, DNA apod.). Gely, které se používají při kapilární gelové elektroforéze, jsou několika typů a nesplňují vždy představu o tuhém gelu. Jsou to spíše jakási polymerní síta. Jsou buď prokřížené (bis-polyakrylamid), vázané vodíkovými vazbami (agarosa) nebo jde o lineární polymerní roztoky (polyakrylamid, methylcelulosa). Ačkoliv se tyto polymery radikálně liší svou strukturou, mechanismus separace je identický. Výhodou málo viskozních lineárních polymerů oproti prokříženým gelům je možnost používat je v širokém rozmezí koncentrací v souladu s velikostí molekuly analytu, ale též možnost jejich opakovaného použití (je možno jimi znovu naplnit kapiláru). Rovněž nebezpečí tvorby bublin je menší. V naprosté většině případů jsou používané gely libovolného typu plněny do kapilár s potaženými stěnami, aby se vyloučil EOF. Separace složek směsi pak nezávisí na EOF, ale pouze na elektroforetickém pohybu nabitých molekul gelovou matricí směrem k elektrodě s výše zmíněnými omezeními danými velikostí částic. Účinnost separace tedy ovlivní vedle elektroforetického pohybu též porosita použitého gelu, velikost separovaných molekul, poměr velikosti molekul a jejich náboje a fyzikální dimenze roztoku. Svou roli při separaci

170

hrají i faktory, které ovlivňují průběh CZE, jako je velikost napětí, délka a průměr kapiláry, pH a iontová síla elektrolytu. Jestliže mají separované molekuly velice blízkou molekulovou hmotnost, rozlišitelnost na základě velikosti molekuly je malá, ale je možno ji zvýšit přídavkem organických rozpouštědel, chaotropních sloučenin nebo micel do elektrolytu. Tato činidla totiž mění tvar, velikost a náboj separovaných molekul, takže mohou výrazně změnit i účinnost separace.

Kapilární izoelektrická fokusace Kapilární izoelektrická fokusace je technika, která k dělení využívá gradientu pH, ustaveného přímo v kapiláře a látky se pak dělí podle svých izoelektrických bodů. Jde tedy o princip, který jsme popisovali již při výkladu izoelektrické fokusace v gelu, zde se ještě připojuje provedení v kapiláře. Gradient v kapiláře se vytváří pomocí pufrů obsahujících amfolyty. Jsou to molekuly, které obsahují kyselé i bazické skupiny, které se v elektrickém poli budou pohybovat podle svého náboje. Bazické skupiny se budou hromadit u katody, kyselé u anody, mezi nimi budou migrovat ostatní nabité skupiny tak dlouho, až se dostanou do oblasti, kde pH se rovná jejich izoelektrickému bodu. Tam tyto molekuly ztratí náboj a přestanou se pohybovat. Kdyby se vlivem difuze dostaly do některé z okolních zon, získají opačný náboj, který je donutí putovat zpět do oblasti svého pI. Stejně nabité molekuly se proto hromadí v kapiláře v ostré zoně. Proto říkáme, že v průběhu CIEF dochází zaostřování, fokusaci. Po fokusační fázi se vytvoří rovnováha a kapilárou přestane procházet proud. To je známkou, že fokusace je ukončena. Vytvořené zony je však třeba uvést do pohybu, aby prošly detektorem ev. vytekly z kapiláry. Mobilizace se realizuje buď zvýšením tlaku v kapiláře nebo přídavkem soli do jednoho z rezervoárů. Při CIEF je třeba potlačit EOF, neboť ten by mohl zrychlit pohyb amfolytu kapilárou a eliminovat ho dříve, než by došlo k dovršení fokusačního efektu. K potlačení EOF je možno použít kovalentní modifikaci (potažení) stěny kapiláry. Tím se snižuje i eventuální adsorpce separovaných látek na stěnu kapiláry.

171

CIEF je vysoce účinná elektromigrační technika. Mohou se při ní separovat molekuly lišící se svými izoelektrickými body o 0,005 jednotek. Lze ji využít jak k separaci, tak k měření pI molekul přítomných ve směsi.

Kapilární izotachoforéza CIT je elektromigrační metoda, která umožňuje dělení podle efektivní pohyblivosti alternativně aniontů nebo kationtů. Nazývá se někdy metodou s pohyblivou hranicí (moving boundary). Mezi dvěma elektrolyty, vedoucím (leading) a koncovým (terminating) jsou seřazeny zony separovaných látek, které se všechny pohybují stejnou rychlostí (odtud název izotachoforéza). Chceme-li analyzovat anion, musíme pufr volit tak, aby vedoucí elektrolyt obsahoval anion s efektivní pohyblivostí vyšší než je pohyblivost kteréhokoliv aniontu ve směsi. Koncový anion (někdy zvaný též vlečkovací) naopak musí mít nejnižší efektivní pohyblivost ze všech přítomných iontů. Jakmile se vytvoří elektrické pole, anionty se začnou pohybovat k anodě. Protože vedoucí ion má největší mobilitu, pohybuje se nejrychleji a je v čele řady. Za ním se začnou řadit anionty s klesající mobilitou. Po dosažení rovnováhy se všechny anionty pohybují v oddělených zonách, ale všechny stejnou rychlostí. Rychlost pohybu je dána rychlostí vedoucího aniontu. K ustavení rovnovážného stavu může dojít tehdy, má-li elektrické pole v jednotlivých zonách různé hodnoty. Jelikož rychlost je součinem mobility a elektrického pole (v = μE), k udržení stejné rychlosti (při dané mobilitě) musí system v zonách s odlišnou mobilitou měnit hodnotu elektrického pole. To se děje automaticky. Zona s největší mobilitou má tedy nejmenší elektrické pole. Tento fakt způsobuje, že se mezi jednotlivými zonami vytváří velice ostré hranice, neboť ionty, které by se v důsledku difuze dostali do některé z okolních zon, změní okamžitě svou rychlost a vrátí se do své domovské zony. Tedy např. ion by předběhl svou vlastní zonu, dostal by se do zony s menším elektrickým polem, tím by se snížila jeho rychlost oproti ostatním iontům v dosažené zoně (má menší mobilitu) a ion by se vrátil zpět. Je to tak zvaný samozaostřovací efekt. Zostření zon při CIT můžeme dosáhnout ostrým zvýšením koncentrace vedoucího nebo koncového elektrolytu, jinými slovy přídavkem solí. Při CIT je totiž ve všech zonách stejná koncentrace iontů, určovaná vedoucím elektrolytem. Zony, které jsou méně (nebo

172

naopak více) koncentrované než je vedoucí elektrolyt, musí být zúženy (ev. rozšířeny), aby dosáhly požadované koncentrace. Jde o koncentrační efekt. Zvýšení koncentrace vedoucího elektrolytu tedy musí nutně vést k zakoncentrování ostatních zon a tedy k jejich zúžení. Z tohoto důvodu se někdy CIT využívá pro zkoncentrování roztoků před jejich separací pomocí CZE, MEKC nebo CGE.

2.5.11 Aplikace elektroforézy v biochemii, biotechnologii a dalších oblastech Aplikační možnosti elektroforetických metod jsou velmi široké. Zasahují od oblastí vysloveně teoretických až po technologické aplikace. V biochemii a biotechnologii je hlavní těžiště elektroforetických metod jak v analytických tak preparativních separacích bílkovin, enzymů a nukleových kyselin. O jejich použití při stanovení molekulové hmotnosti různých látek (zejména bílkovin), při stanovení izoelektrického bodu a sestrojení titračních křivek jsme se již zmínili dříve. Elektroforetické metody jsou uznávány jako jedno z kriterií hodnocení čistoty bílkovinných preparátů.

173

Obr.2.104

Principy různých způsobů provedení kapilární elektroforézy

Významné místo zaujímají elektroforetické metody při izolacích bílkovin, enzymů a nukleových kyselin, a to nejen pro vlastní separaci ale i jako prostředek eluce (tzv. elektroeluce). Naprosto nepostradatelné jsou tyto metody při genových manipulacích. V potravinářském výzkumu i praxi se setkáváme s řadou problémů, které je možné úspěšně řešit pomocí elektroforetických metod. Tak například lze pomocí separace spektra bílkovin ev. izoforem vybraného enzymu a porovnáním získaných výsledků s mapami standardů charakterizovat jednotlivé odrůdy a kultivary potravinářských surovin rostlinného původu (brambory, obiloviny apod.). Obdobným způsobem lze charakterizovat i suroviny živočišného původu, zde je však situace poněkud komplikovanější, protože jde většinou o velice složité směsi bílkovin. Tam, kde je morfologická taxonomie nepřístupná, je však možno tohoto způsobu (tzv. chemotaxonometrie) často velmi úspěšně využít. Takto se např. daří identifikovat různé typy filetizovaných ryb, ale lze rozlišit i druhy masa. Elektroforetické metody jsou velkým pomocníkem při určování vlivu technologie na vlastnosti bílkovin. Při technologických procesech může docházet k denaturacím, ale i ke štěpení peptidových řetězců. Tyto změny, které mohou mít zásadní význam pro kvalitu produktu, lze většinou elektroforeticky postihnout. Výsledky jsou zdrojem důležitých poznatků pro úpravu zpracovatelských postupů. Moderní elektroforetické postupy, zejména izotachoforéza a kapilární elektroforéza, umožňují stanovit různé nízkomolekulární sloučeniny, jako jsou cukry, organické kyseliny, různá barviva, ionty, peptidy, nukleotidy, antibiotika a další. To umožňuje sledovat složení potravin v průběhu technologického postupu a skladování, zejména osud biologicky

174

významných látek, ale též prokázat přídavek cizorodých proteinů nebo dalších látek do potravin. Dalším důležitým polem, kde se uplatní elektroforéza, je průkaz enzymů a isoenzymů v potravinářských surovinách a v potravinách po technologické úpravě. Pomocí elektroforetických metod však je možné určit i mikrobiální kontaminaci, a to na základě přítomnosti různých mikrobiálních produktů, které se činností mikroorganismů dostanou do potravin nebo do potravinářských surovin a které je možné pomocí elektroforézy identifikovat.

2.5.12 Analytické aplikace elektroforetických metod

Elektroforéza jako kriterium čistoty preparátu Při stanovení čistoty preparátu biologicky aktivních látek se důkaz homogenity provádí hromaděním negativních výsledků při snaze o detekci příměsí různými metodami. Elektroforéza na nosičích, zejména na polyakrylamidovém gelu, je jednou z obecně uznávaných metod, která nám může poskytnou informaci o čistotě preparátu. Je však třeba pamatovat na to, že za určitých podmínek mohou mít některé látky stejnou nebo velmi blízkou mobilitu a nepodaří se je proto od sebe rozlišit. Proto je vhodné vzorek podrobit různým elektroforetickým metodám, které od sebe separují látky podle rozdílných principů (izoelektrický bod, velikost molekuly, velikost náboje, imunoelektroforéza, dvojrozměrná elektroforéza). Musíme vzít v úvahu i to, že některé příměsi mohou být ve výrazně nižší koncentraci a nepodaří se je detegovat. Doporučuje se proto použít i různé metody vizualizace, neboť některé se výrazně liší citlivostí. I když elektroforetické metody jsou velice běžné a často používané pro ověření čistoty preparátu, v žádném případě nemohou být jediným kriteriem čistoty. Slouží však k zjištění homogenity preparátu na různých stupních izolačního postupu, k částečné fyzikálněchemické charakterizaci sloučenin (zejména bílkovin) a při srovnávacích studiích též k posouzení vlivu určitých experimentálních podmínek na studovaný systém.

175

Stanovení molekulové hmotnosti makromolekul Jak jsme již několikrát uvedli, velikost molekuly je jedním z faktorů, které ovlivňují mobilitu při elektroforéze. Je proto možno za určitých okolností použít elektroforetickou metodu pro stanovení relativní molekulové hmotnosti. Nejběžnějším způsobem stanovení relativní molekulové hmotnosti bílkovin je SDS-elektroforéza. Její princip jsme uvedli již dříve. Dodecylsulfát sodný unifikuje jak náboj tak tvar bílkovinné molekuly a mobilita bílkovin je za těchto okolností přímo úměrná molekulové hmotnosti. Přídavkem dithiotreitolu (merkaptoethanolu) je pak možno redukovat disulfidové můstky a stanovit molekulovou hmotnost bílkovinných podjednotek. Mobilitu bílkovinné molekuly ev. podjednotek je pak třeba porovnat s mobilitou molekul o známé molekulové hmotnosti, t.j. je třeba proměřit kalibrační křivku. Závislost molekulové hmotnosti na mobilitě je logaritmická, je proto třeba vynášet do grafu proti mobilitě (osa x) logaritmus molekulové hmotnosti (osa y). Molekulovou hmotnost bílkovin je však možno stanovit i pomocí elektroforézy v polyakrylamidových gelech různé koncentrace. Vycházíme z toho, že pohyblivost molekul při elektroforéze je závislá též na koncentraci použitého gelu (T). "Koncentraci gelu" můžeme vyjádřit vztahem T = 100 (a+b)/p

(38)

a,b = gramy akrylamidu resp. BIS-akrylamidu p = ml pufru (s ostatními komponentami netvořícími gel) Pohyblivost makroiontu je nepřímo úměrná střední velikosti pórů, jež je dána celkovou koncentrací gelu T. Pro tuto závislost navrhl Fergusson empirický vztah log UT = log UO - KR .T UT = relativní pohyblivost iontu v gelu o koncentraci T UO = "volná" pohyblivost (při nulové koncentraci gelu) KR = retardační koeficient T = celková koncentrace gelu

176

(39)

Retardační koeficient makroiontu lze stanovit na základě měření jeho relativní pohyblivosti v serii gelů o různé koncentraci T (viz obr.2.105). Relativní molekulovou hmotnost bílkoviny pak vypočteme z empirického vztahu KR = 2,43.10-2 + 5,53.10 -7x Mr

(40)

Číselné koeficienty v tomto vztahu byly určeny stanovením retardačního koeficientu KR pro serii makroiontů bílkovin o známé molekulové hmotnosti Mr . Pro stanovení molekulové hmotnosti touto metodou je třeba připravit sadu gelů o různé koncentraci, na všechny aplikovat měřený vzorek a po skončené elektroforéze změřit relativní pohyblivost vzorku v různě koncentrovaných gelech. Logaritmus relativní pohyblivosti se pak vynese do grafu proti koncentraci gelu T a koeficienty KR a log UO se vypočtou metodou lineární regrese. Molekulová hmotnost se pak vypočte z výše uvedeného empirického vztahu pro retardační koeficient.

Obr. 2.105 Závislost log UT na koncentraci gelu T

177

Stanovení izoelektrického bodu Izoelektrický bod je jednou z velice významných charakteristik amfoterních molekul. Separace

molekul

chromatograficky,

na tzv.

základě

odlišnosti

chromatofokusací,

izoelektrických nebo

bodů

izoelektrickou

je

možná

fokusací,

což

buď je

elektromigrační metoda. Pro stanovení izoelektrického bodu se však používá převážně izoektrická fokusace. Již dříve jsme vysvětlili, že při izoelektrické fokusaci se molekula pohybuje v gradientu pH mezi dvěma elektrodami až do okamžiku, kdy se dostane do oblasti pH rovné jejímu izoelektrickému bodu. V tomto bodě ztratí náboj a není již schopna se dále v elektrickém poli pohybovat. Identifikací pH, které je v místě skvrny bílkoviny, se současně zjistí hledané pI.

178

3. IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL 3.1 Úvod Při biochemickém výzkumu se studují buňky, jejich složení a procesy, které v nich probíhají. Proto vždy část biochemického výzkumu tvoří izolace experimentálního materiálu. Izolace biomakromolekul (proteiny, nukleové kyseliny) z přirozených materiálů je záležitost velice různorodá, vzhledem k různému původu a odlišnému charakteru jednotlivých makromolekul. Aby mohla být látka charakterizována, musí být v relativně čistém stavu a bez příměsí, které by mohly charakterizaci rušit či zkreslovat. Toto je však velice často nelehký úkol, protože normální buňka obsahuje tisíce různých látek, z nichž jsou si mnohé svými fyzikálními a chemickými vlastnostmi podobné. Velice častým úskalím při izolaci biolátek je skutečnost, že látka, která nás zajímá, může být také značně nestabilní a její množství v buňce je nepatrné. Převážnou část hmoty organismu tvoří proteiny, proto zejména jim bude věnována v této kapitole pozornost. Z hlediska izolace biomakromolekul je důležité, zda složka, která má být izolována je součástí buňky nebo zda je vylučována mimo buňku. V případě enzymů většinou platí, že enzymy, jejichž substráty jsou nízkomolekulární látky, bývají intracelulární, zatímco enzymy, katalyzující reakce biomakromolekul jsou obvykle extracelulární. Buněčná membrána je totiž pro makromolekuly nepropustná a proto makromolekulární substráty nemohou pronikat do buňky. Aby se tedy enzym dostal do styku se substrátem, musí se enzym vyskytovat v prostorách mimo buňku. Dalším důležitým faktorem je, z jakého materiálu má být biomolekula izolována: zda z živočišných tkání, rostlinných pletiv nebo mikrobiálních buněk. Protože použití rostlinného a živočišného materiálu k jakékoliv izolaci je většinou poměrně nákladné, v průmyslu se upřednostňuje příprava biomolekul z mikrobiálních zdrojů. I zde jsou typickým příkladem enzymy. Pro izolaci a částečně i charakterizaci nukleových kyselin se používají metody obdobné (byť často modifikované) jako při práci s proteiny. V praxi se velmi často setkáme s nutností oddělit od sebe proteiny a nukleové kyseliny, neboť se v buňce vyskytují společně.

179

Tato kapitola poskytuje základní strategii a přehled nejužívanějších technik pro izolaci, purifikaci a do jisté míry i charakterizaci bílkovinných preparátů a dalších druhů biologických molekul.

3.2 Základní izolační kroky Postup izolace biomakromolekul se skládá z několika víceméně samostatných na sebe navazujících kroků. Základní kroky při přípravě preparátů jsou: 1. Homogenizace a solubilizace materiálu. Při izolaci biomakromolekul z některých zdrojů (rostliny, živočišný materiál) je třeba experimentální materiál nejdříve homogenizovat. K tomu se používají zejména mechanické prostředky. Dále následuje solubilizace materiálu. 2. Separace buněk. Tento krok je společný při izolaci biomakromolekul z jakéhokoliv zdroje. Aby bylo možno dále požadovanou látku izolovat, je třeba oddělit buňky od ostatního media bez ohledu na to, se kterou složkou budeme dále pracovat. 3. Dezintegrace buněk. Při izolaci látky, obsažené v buňce (např. DNA, intracelulární enzymy) je nezbytné rozrušit (dezintegrovat) buněčnou stěnu buňky a získat tak vnitrobuněčný obsah pro další práci. 4. Odstranění buněčných zbytků. Po rozbití buněk se pro odstranění jejich zbytků nebo pro izolaci některých organel používá postupná centrifugace. Během tohoto kroku tedy dochází k odseparování buněčných zbytků (např. membrány), které by mohly další purifikační kroky znesnadňovat. Jakmile jsou proteiny i jiné makromolekuly uvolněny z ochranného prostředí buňky, musí se s nimi zacházet tak, aby nebyly novými podmínkami zničeny. 5. Koncentrace ev. snížení objemu. Použití moderních purifikačních postupů - chromatografií - ve většině případů předcházejí kroky vedoucí ke snížení objemu ev. koncentraci experimentálního materiálu. Tyto kroky jsou nezbytné zejména v případech, následuje-li purifikační postup, kdy záleží na množství aplikovaného vzorku (gelová, afinitní chromatografie). Rovněž např. při přípravě průmyslových enzymů, kdy výchozím materiálem je až několik litrů media, nelze tuto fázi izolačního postupu opomenout. 6. Purifikace. Vlastní purifikační postup se většinou skládá z několika na sebe navazujících chromatografických technik, během kterých dochází k odstranění balastních látek ať již nízkomolekulárních (cukry, lipidy) či vysokomolekulárních (bílkoviny, polysacharidy, nukleové kyseliny).

180

7. Konečné úpravy purifikovaného preparátu. Tato fáze zahrnuje např. metody koncentrační (ultrafiltrace, mrazová sublimace), které jsou prováděny z důvodu zvýšení koncentrace vyizolované látky v preparátu nebo s ohledem na její další skladování. Jsou známy případy, kdy např. enzym v lyofilizovaném stavu je stabilnější než při uchovávání v roztoku. 8. Charakterizace preparátu. V závěru každého izolačního a purifikačního postupu je třeba si ověřit, zda je vyizolovaná látka v požadovaném stupni čistoty, k čemuž slouží metody elektroforetické, analytické i chromatografické. Potřebný stupeň čistoty výsledných preparátů musí být posuzován komplexně. Vedle hlediska funkčního je třeba brát v úvahu i hledisko ekonomické.

3.3 Homogenizace a solubilizace materiálu Prvním krokem v izolaci bílkovin či jiných biologických molekul je nutnost převést tyto látky do roztoku. Ve výjimečných případech tento krok odpadá, protože izolované látky jsou již v roztoku obsaženy (např. proteiny krevního sera). Homogenizace experimentálního materiálu je nezbytná v případě izolace biomakromolekul z rostlinných a živočišných zdrojů. Zde se uplatňují zejména mechanické způsoby např. mixování, mletí, krájení apod. V nejjednodušších případech lze použít tření zmraženého materiálu v třecí misce. Volba postupu závisí na mechanických vlastnostech výchozího materiálu a na místě, kde je požadovaná látka uložena v buňce. Během tohoto kroku tedy dochází k převedení experimentálního materiálu do vhodného prostředí (např. pufr o daném pH apod.)

3.4 Separace buněk z kultivačního media Řada

biomolekul,

např.

mikrobiální

enzymy,

se

připravují

kultivací

vysokoprodukčních mikrobiálních kmenů. Po skončené kultivaci je třeba odseparovat mikrobiální buňky od kultivačního media. To je možno provést v zásadě dvěma způsoby: odstřeďováním nebo filtrací. Odstřeďování je běžnější při laboratorní práci, ovšem za předpokladu, že kultivační medium není příliš viskozní. Při použití rychloběžných centrifug

181

je třeba, aby se pracovalo v chlazeném prostoru, protože při vyšších otáčkách se uvolňuje teplo, které by mohlo částečně inaktivovat biologickou aktivitu separované látky a tím značně snížit výtěžnost procesu. Pro separaci mikroorganismů je rozhodující velikost buněk. V poloprovozním, čtvrtprovozním i průmyslovém měřítku, se častěji používá k separaci buněk od kultivačního media filtrace, kterou je možno provádět buď na tlakových nebo na vakuových filtrech. Filtrace je rovněž běžnější v případě, je-li zdrojem biomolekul plíseň. K separaci buněk se užívá též tzv. flokulace. Flokulace ať již přirozená nebo chemicky ovlivněná, je závislá na fyziologickém stavu buněk, na přítomnosti adsorpčních činidel a na pH. Chemicky se flokulace ovlivňuje přídavkem tzv. flokulačních činidel (látky na bázi polyethylenu, bentonity apod.) Flokulační činidla proces sedimentace značně zrychlují. Flokulace se může využít i pro odstranění zbývajících mikrobiálních buněk z buněčných extraktů, pak vlastně slouží jako náhrada sterilačního procesu.

3.5 Dezintegrace buněk Po odseparování buněk od media záleží další izolační postup na tom, má-li být izolována složka intracelulární nebo extracelulární. V případě intracelulární látky je třeba zařadit dezintegraci buňky. Dezintegrační metody dělíme na fyzikální, chemické a enzymové. Každý typ má své výhody i nevýhody; neexistuje universální metoda pro dokonalou dezintegraci všech typů buněk. Účinnost dezintegračního procesu závisí na mnoha faktorech např. na druhu dezintegrovaného materiálu, na podmínkách kultivace mikrobiálních buněk, na fázi růstu, na pH, na teplotě a na iontové síle suspendujícího prostředí a v neposlední řadě na době dezintegrace. Protože nejvíce problémů nastává při dezintegraci mikrobiálních buněk, bude následující kapitola věnována především této problematice. Při hledání nejvhodnějšího způsobu dezintegrace je nutno vzít v úvahu několik kriterií: snadnost dezintegrace buněk různými metodami stabilitu izolované látky (enzym, nukleové kyseliny) během každé metody snadnost separace izolované látky od zbytků buněčných stěn

182

dobu potřebnou k dezintegraci buněk a oddělení žádané složky ekonomiku procesu, včetně spolehlivosti zařízení a snadnosti operace Před vlastní dezintegrací se mikrobiální buňky po nakultivování a po úpravě kultivační kapaliny (zahřátí, úprava pH) odstředí nebo odfiltrují, promyjí vodou nebo tlumivým roztokem, aby se odstranily zbytky kultivačního media a po novém odstředění nebo filtraci je buněčná pasta připravena k dezintegraci.

3.5.1 Fyzikální způsoby dezintegrace

Mechanické drcení a mletí buněk s použitím abraziv Nejjednodušší provedení této techniky je tření buněk s vhodným abrazivním materiálem v třecí misce. Jako abrazivum lze použít křemenný písek, skelný prach, skleněné balotiny, oxid hlinitý apod. Byla rovněž vyvinuta celá řada mechanických zařízení, v nichž mezi rotorem a statorem, kde je vytvořena úzká mezera, dochází k dezintegraci mikrobiálních buněk za přítomnosti abraziv.

Dezintegrace buněk mícháním s malými částicemi Příkladem zařízení této kategorie je přístroj Dynomill. V podstatě se jedná o nádobu po okraj naplněnou směsí suspenze mikrobiálních buněk a balotin. Do nádoby je zasunuto diskové míchadlo, které se při dezintegraci otáčí. Dezintegrace je pak způsobena kombinací střižných sil, které vznikají jako následek gradientu rychlosti mezi jednotlivými proudnicemi, nárazy a valivou činností skleněných kuliček, které jsou uváděny do pohybu míchadlem. V jednoduchém zařízení pro dezintegraci malých množství mikrobiálních buněk (max 15 ml) je směs buněčné suspenze a balotin míchána v centrifugační skleněné kyvetě upraveným míchadlem. Jestliže jsou k mikrobiální suspenzi přidány balotiny, je možno v některých případech pro dezintegraci použít i vysokoobrátkový mixer.

183

Kromě výše zmíněných příkladů existuje celá řada dalších dezintegračních zařízení, jejichž volba záleží na typu dezintegrovaného materiálu.

Dezintegrace střižnými silami v tuhém stavu Nejstarším, avšak stále používaným zařízením v této kategorii je Hughesův lis. Mikrobiální pasta smíchaná s vhodným abrazivem nebo zmražená na teplotu -20 °C (v tomto případě působí jako abrazivum vzniklé ledové krystalky) je umístěna do válcové dutiny v předem vychlazeném ocelovém bloku. Do dutiny je nasazen přesně opracovaný kovový píst a hydraulickým lisem je aplikován tlak 150-230 MPa. Rozdrcené buňky jsou protlačovány úzkou obvodovou štěrbinou do zásobníku vyvrtaného v bloku. Dalším zařízením je X-lis. Zmražené buňky jsou dezintegrovány při průchodu malým otvorem ve dnu tlakové nádoby při tlaku až 600 MPa. Rozbití buněk je způsobeno střižnými silami, které jsou vyvolány průchodem zmrzlé buněčné pasty malým otvorem. Dezintegraci přitom napomáhají vytvořené ledové krystalky. Při nízkých teplotách a vysokých tlacích dochází rovněž k fázovým změnám ve struktuře ledu, které jsou doprovázeny změnou objemu, což rovněž napomáhá dezintegraci. Modifikací klasického X-lisu je zařízení pro dezintegraci živočišných tkání při izolaci subcelulárních částic. Aplikuje se nezmražený materiál, který je za tlaku 1.5-6 MPa protlačován obvodovou štěrbinou o proměnné velikosti.

Dezintegrace střižnými silami v kapalině Pro dezintegraci touto metodou je používáno zařízení, jehož základem je čerpadlo s nastavitelným ventilem a zúženým otvorem. Buňky v kapalném prostředí procházejí homogenizačním zařízením při tlaku až 56 MPa. Rozbití buněk je způsobeno třemi mechanismy, z nichž rozhodující úlohu má rychlé snížení operačního tlaku na hodnotu atmosférického tlaku. Toto zařízení může být využito třemi způsoby. Buněčná suspenze může být dezintegrována při jediném průchodu zařízením, nebo je možné produkt z odtoku vracet zpět k další dezintegraci tak dlouho, dokud není dosaženo žádaného stupně

184

dezintegrace, nebo se z odtoku vrací pouze část produktu jako recykl a druhá část stále odtéká k dalšímu zpracování.

Dezintegrace osmotickým šokem Dezintegrace tímto způsobem je vhodná především pro bakteriální buňky. Prakticky se postupuje tak, že buňky, zbavené kultivačního media se suspendují v tlumivém roztoku, obsahujícím dvacetiprocentní sacharosu a ponechají se v něm až do ustavení chemické rovnováhy, která se projeví ztrátou vnitrobuněčné vody. Po odstředění se buněčná pasta rychle rozmíchá ve vodě (4 °C). Náhlý vzrůst osmotického tlaku uvnitř buněk způsobí, že se poruší buněčný obal a dojde k uvolnění složek do roztoku. Jinou možností je smíšení centrifugovaných buněk se stejným objemem glycerolu o koncentraci 3 mol/l. Po pěti minutách je suspenze pipetou odkapávána do desetinásobného objemu tlumivého roztoku, který je mechanicky promícháván.

Dezintegrace ultrazvukem Působením ultrazvukových vln na kapaliny vzniká jev, známý jako kavitace. V kapalině se tvoří oblasti stlačení a zředění. V místech zředění vznikají dutiny určitých velikostí, které v oblasti stlačení opět zaniknou. Zánik dutin je pak doprovázen tlakovou vlnou, která se považuje za destrukční prvek využívaný u této metody. Některé bakterie (např. stafylokoky) jsou k působení ultrazvukových vln velmi rezistentní. Naproti tomu poměrně snadno rozrušitelné jsou např. gramnegativní bakterie.

Dezintegrace změnou tlaku plynu Metoda je založena na faktu, že v rovnováze je tlak plynu v roztoku totožný s vnějším tlakem. Pokud je na buněčnou suspenzi působeno plynem za vysokého tlaku, jeho značné množství se rozpustí v suspendujícím mediu a difunduje do buňky, dokud se neustaví rovnováha. Při náhlém poklesu vnějšího tlaku způsobuje vnitřní tlak destrukci buněk.

185

Dezintegrace střídavým zmražením a rozmražením Ochladí-li se buněčná suspenze pod teplotu tuhnutí kapalné fáze, uvolní se po následujícím roztátí dezintegrovaného materiálu určitý podíl buněčných bílkovin jako následek částečné dezintegrace buněk. Značnou roli zde hrají i intracelulární a extracelulární ledové krystalky, které buňku rozrušují. Vzhledem k mechanismu procesu je účinnost této metody omezená, často se používá zejména jako pomocná metoda při ostatních způsobech dezintegrace, pokud se však buněčná pasta určená k dezintegraci skladuje v zmraženém stavu.

Dezintegrace metodou prudkého ochlazení Prudké ochlazení z normální růstové teploty na teplotu asi 0 °C způsobuje ztrátu důležitých funkcí mikroorganismů, přičemž se uvolní do media některé látky např. ATP, aminokyseliny apod. Tato metoda nemá v praxi širší uplatnění.

Dezintegrace zahříváním Účinnost tohoto postupu není velká a proto ani její použití v praxi není příliš rozšířené. Mírného zvýšení teploty lze využít k indukci autolýzy buněk, zejména u psychrofilních bakterií. Nevýhodou této metody je možnost inaktivace izolovaných biologicky aktivních látek v důsledku denaturace účinkem zvýšené teploty. 3.5.2 Chemické způsoby dezintegrace

Dezintegrace v kyselém a zásaditém prostředí Tato metoda se s úspěchem používá pro dezintegraci mikrobiálních buněk. Např. použitím různě koncentrovaných roztoků NaOH byly extrahovány bílkoviny z nativních

186

buněk mikroorganismů. Kromě bílkovin však dochází i k extrakci značného množství nebílkovinných dusíkatých látek a různých barviv. Použitelnost tohoto dezintegračního postupu je dána stabilitou izolovaného materiálu právě v oblasti extrémních hodnot pH.

Dezintegrace použitím povrchově aktivních látek Interakce detergentů s buněčnou membránou nebyla dosud zcela přesně popsána. Předpokládá se však, že v důsleku vazby detergentu na membránu dochází k lýzi. Tenzidy, ať již anionaktivní, kationaktivní nebo neionogenní se při malé iontové síle tlumivého roztoku a vhodném pH spojují s lipoproteiny za vzniku micel. Lipoproteinové složky biologických membrán tak mohou být solubilizovány a membrány se stávají permeabilními. Ionogenní tenzidy (např. SDS) jsou reaktivnější a mohou způsobit disociaci lipoproteinů. Jejich účinek se může projevit denaturací a vysrážením bílkovin a v některých případech i hydrolýzou peptidových vazeb. Proto se ionogenní tenzidy příliš nehodí např. k extrakci enzymů. Pro extrakci membránově vázaných proteinů jsou široce používány neionogenní detergenty (Triton X-100, Tween) a zwitteriontové detergenty (CHAPS).

Dezintegrace použitím organických rozpouštědel Organická rozpouštědla mohou v mnoha případech účinně napomoci při dezintegraci mikrobiálních buněk a při izolaci složek, které jsou lokalizovány na membránách. Mezi nejvíce používané organické látky patří aceton, který se používá pro přípravu tzv. acetonové sušiny (acetonového prášku). Tento postup se dobře uplatňuje v případě, jsouli izolované bílkoviny (např. enzymy) lokalizovány právě na subcelulárních částicích (např. membrány). Při většině dezintegračních metod dojde k permeabilizaci buněčné membrány, avšak bílkoviny vázané na subcelulárních částicích se z této vazby neuvolní, neextrahují se do roztoku a tudíž bývají odstraněny z roztoku spolu s rozpustnými zbytky buněk. Použití acetonu však často vede k rozrušení vazby bílkoviny na částice a ta se pak může uvolnit do roztoku.

187

Dezintegrace acetonem a jinými nevodnými rozpouštědly je třeba provádět při velmi nízkých teplotách, aby se pokud možno zabránilo inaktivaci enzymu ev. jeho denaturaci. Přídavek organických rozpouštědel (toluen, diethyleter, chloroform) se používá často i při autolýze buněk. Výše uvedené látky způsobují nejen rozrušení cytoplasmatické membrány,

ale

zároveň

i

zabraňují

kontaminaci

lyzující

kultury

nežádoucími

mikroorganismy.

Dezintegrace použitím antibiotik Antibiotika používaná pro dezintegraci mikroorganismů mohou buď ovlivňovat permeabilitu cytoplasmatické membrány (tyrocidin, polymyxiny, nystatin) nebo mohou interferovat při biosyntéze buněčné stěny (penicilin). Oba tyto jevy pak mohou vést k destrukci buněk.

Dezintegrace použitím aminokyselin Řada gramnegativních bakterií může být působením např. glycinu konvertována na sferoplasty. Tento proces je silně ovlivňován teplotou, pH, koncentrací glycinu a samozřejmě životností buněk.

3.5.3 Enzymové způsoby dezintegrace

Dezintegrace lytickými enzymy Pro bakteriolýzu se běžně používá lysozym, který se komerčně vyrábí z vaječných bílků.

Tento

enzym

specificky

katalyzuje

hydrolýzu

β-1,4

glykosidické

vazby

mukopeptidových jednotek bakteriálních buněčných stěn. Konečné prasknutí buněčného

188

obalu závisí na osmotickém tlaku okolního media. Grampozitivní bakterie jsou vzhledem k vyššímu obsahu mukopeptidů k účinku lysozymu citlivější než gramnegativní buňky. V prostředí o vhodném osmotickém tlaku pak vznikají sferoplasty resp. protoplasty. Kromě lysozymu způsobuje bakteriolýzu celá řada dalších enzymů, převážně mikrobiálního původu. Např. při přípravě kvasinkových protoplastů se nejčastěji používá komplex enzymů ze žaludeční šťávy hlemýždě. Za pozornost stojí i zmínka o uplatnění imobilizovaných enzymů při dezintegraci mikrobiálních buněk. Je popsána např. imobilizace komplexu lytických enzymů na kolagenovou membránu.

Autolýza Autolýza je definována jako buněčná lýze, která není vyvolána zásahem exogenních činitelů. Opakem je pak heterolýza, která vyžaduje indukci fyzikálními, chemickými nebo biologickými činiteli. Protože však autolytické a heterolytické procesy nemohou být někdy přesně rozlišeny, je lépe definovat autolýzu buněk jako lýzi, způsobenou vlastními buněčnými enzymy. Je známo mnoho podmínek a faktorů, které indukují vznik autolytického procesu. Autolýza se většinou vyskytne, je-li náhle přerušen normální metabolismus buňky, autolýza může být indukována náhlým snížením teploty apod. Pouze malý počet dezintegračních metod, které zde byly popsány, lze použít pro dezintegraci v průmyslovém měřítku. Při výběru vhodného způsobu je nutno řídit se určitými kriterii. Obecně je možno říci, že přednost bude mít zařízení schopné kontinuálního provozu. Z výše popsaných metod jsou to zejména dezintegrace účinkem střižných sil v kapalině, dezintegrace změnou tlaku plynu, mícháním s malými částicemi a dezintegrace ultrazvukem.

3.6 Koncentrace a obohacování roztoků Extrakt, který byl získán po dezintegraci buněk (v případě intracelulárních enzymů, DNA apod.) nebo kultivační medium s extracelulárními enzymy musí být zahuštěny nebo

189

jiným způsobem zakoncentrovány. Zahušťování se provádí zejména vakuovým odpařováním anebo ultrafiltrací či hyperfiltrací. Při ultrafiltraci se kromě rozpouštědla částečně odstraní i nízkomolekulární látky. Hyperfiltrace (reverzní osmoza) se provádí na hustých membránách, které propouštějí pouze molekuly rozpouštědla. Proto při hyperfiltraci dojde pouze k zahuštění vzorku. Membránové procesy jsou dnes hojně využívány jak v průmyslu tak i v laboratorní praxi. Podrobně je o nich pojednáno v kap.2.2. Pro zahušťování vzorků, ovšem bez odsolení, jsou i další možnosti. Laboratorně se někdy voda ze vzorku odtahuje přes hustou membránu látkami, které vodu ochotně přijímají (např. dehydratované gely a řada komerčních preparátů na bázi polyethylenglykolu, bezvodého oxidu fosforečného, silikagelu aj.). Dáme-li roztok do dialyzační trubice, kterou obalíme některou z výše zmíněných bezvodých látek, bude ze vzorku přes membránu odtahována voda. Membrána zajistí, že z vnitřního prostoru je odtaženo pouze rozpouštědlo. Tento proces se dá pouze obtížně řídit, proto nelze na počátku zcela přesně odhadnout, do jakého stupně bude roztok zahuštěn a průběh odtahování vody se tedy musí kontrolovat. Voda se dá z roztoku částečně odstranit i vsádkovým přidáním dehydratovaného chromatografického gelu, který pro botnání využije rozpouštědlo z roztoku. Musí se použít gel s velice malými póry, aby nebyly zachyceny i látky s vyšší molekulovou hmotností. Volba vhodného gelu umožní současné odsolení. Zůstává však nebezpečí nespecifických sorpcí separovaných molekul na gel a možné ztráty při oddělování gelu. Známým a často používaným způsobem zahušťování je odpařování. V případě biologicky aktivních makromolekul se doporučuje odpařovat za sníženého tlaku, aby příliš vysokou teplotou nedošlo ke ztrátě biologické aktivity nebo k nevratné denaturaci makromolekuly. Je třeba počítat s tím, že odpařování je metoda energeticky náročná, proto se v provozních podmínkách musí hodnotit i z ekonomického hlediska. Pro odstranění vody se používá i lyofilizace (mrazová sublimace). Tato metoda, kdy se odstraní z roztoku veškeré rozpouštědlo, je k biomakromolekulám velice šetrná, ale též energeticky náročná. Proto vstupuje do izolačního procesu častěji až při finální úpravě vzorku. Další způsoby zvyšování koncentrace izolovaného materiálu jsou: srážení anorganickými solemi (tzv. vysolování) např. síranem amonným, srážení organickými rozpouštědly např. acetonem, ethanolem nebo úpravou pH do izoelektrického bodu (tzv. izoelektrické srážení) (viz kap.2.1.1). Některé adsorpční metody prováděné vsádkově a

190

vytřepávání do dvoufázového systému (viz kap.2.1.2) se aplikují spíše ve větším měřítku (průmysl).

3.7 Zajištění sterility surových preparátů Při volbě dalšího postupu zpracování enzymových preparátů je třeba uvážit k jakému účelu budou sloužit a tomu je třeba přizpůsobit i další kroky. Protože při jednoduchých izolačních postupech není zajištěno úplné odstranění zbytků mikrobiálních buněk, z nichž byla separovaná látka extrahována, je třeba provádět sterilaci, při níž se zbytky mikrobiálních buněk odstraní a tím je zabráněno nežádoucí kontaminaci připravovaného preparátu. Požadavky na čistotu technických preparátů stále stoupají, avšak i zde je třeba brát v úvahu ekonomické hledisko a pracovat se zřetelem na další aplikaci preparátu. Zatímco např. pro účely potravinářského průmyslu nesmí preparáty obsahovat žádné zbytky buněk, u enzymových preparátů pro přípravu pracích prostředků nejsou kriteria tak přísná. Příprava vysoce purifikovaných popř. čistých enzymů používaných např. v medicině či klinickém výzkumu je mnohem složitější a samozřejmě i ekonomicky náročnější. Při přípravě těchto preparátů je třeba o to více dbát na podmínky zajišťující resp. vylučující možnost jakékoliv kontaminace nežádoucími organismy. Sterilace se provádí ještě před započetím vlastního purifikačního procesu. Protože většinou není možno provést sterilaci vysokými teplotami (nebezpečí denaturace enzymů), používají se obvykle různá flokulační činidla. V některých případech se sterilace provádí ultrafiltrací tak, že se použijí membrány s póry, které zadrží bakteriální buňky a získaný preparát je tudíž sterilní (kap.2.2).

3.8 Purifikace biomakromolekul První dostatečně definovaný protein (rostlinná ureasa) byl popsán již v roce 1926. S rozvojem vědy a výzkumu však purifikační postupy používané v 1. pol. 20 st. značně zastaraly. Moderní separační techniky dnes dokáží odlišit celou řadu látek podobných vlastností ve vzorku, který by ještě před několika lety byl považován za čistý.

191

Postupy purifikace biomakromolekul se značně liší a získání velmi čistých preparátů obvykle vyžaduje složité a nákladné purifikační postupy. Jednotlivé separační (purifikační) kroky jsou založeny na využití fyzikálních a chemických vlastností biomakromolekul. Rozhodujícím faktorem v případě proteinů je jejich primární struktura. Pořadí aminokyselin v řetězci totiž určuje funkci a vlastnosti proteinu. Sekundární struktura t.j. spontánní vytvoření prostorové struktury určitých částí řetězce stejně tak jako terciární struktura (celkové prostorové uspořádání bílkovinné molekuly), odpovědná za biologickou aktivitu proteinu, hrají rovněž roli při volbě a úspěšnosti chromatografického kroku. V tab.6 je uveden vztah mezi vlastností purifikované biomakromolekuly a typem použité metody. Tabulka 6 Vztah mezi mechanismem separace a použitou metodou

separace na základě velikost náboj rozpustnost biologická aktivita izoelektrický bod

metoda gelová chromatografie, SDS-elektroforeza, gradientová elektroforeza chromatografie na měničích iontů, elektroforeza chromatografie s reverzní fází bioafinitní chromatografie chromatofokusace, izoelektrická fokusace

3.8.1 Strategie a taktika purifikace Základní strategií purifikačního postupu je postupná separace jednotlivých složek směsi. K oddělení izolované látky od ostatních tzv. balastních látek dochází postupně kombinací řady nezávislých kroků, založených na různých principech. Za tímto účelem se využívají zejména chromatografické techniky, jimiž jsme se podrobněji zabývali v předchozích kapitolách (kap.2.3). Příklad izolačního postupu intracelulárních enzymů ukazuje Schema 2. Jak již bylo několikrát zdůrazněno, existuje značná variabilita biomakromolekul a proto nelze přesně definovat purifikační postup, který by měl obecnou platnost. Ani v případě purifikace stejné látky např. stejného enzymu pocházejících z různých zdrojů nelze zvolit universální postup. 192

Teoreticky pořadí separačních kroků neovlivňuje stupeň purifikace. Jestliže některá metoda odstraňuje určitou kontaminantu, děje se tak bez ohledu na to, zda se použije této separační techniky na počátku nebo až na konci purifikačního postupu. V praxi je však pořadí separačních kroků velmi důležité. Metoda, která má velmi vysokou kapacitu, avšak nízkou výtěžnost, se musí použít v separačním pochodu na počátku, kdy množství materiálu, které se má zpracovat je velké, ale jeho cena je nízká. Má-li se naopak pracovat s malým množstvím materiálu, který je drahý, stávají se důležitými charakteristikami separačního procesu vysoká výtěžnost a schopnost rozlišení. Volíme-li pořadí separačních kroků, je rovněž důležité uvážit, zda jsou jednotlivé metody navzájem slučitelné. Např. iontová síla ve vzorku, získaného srážením síranem amonným, je vysoká a nedá se proto bezprostředně použít ionexová chromatografie nebo elektroforeza. Izolační a purifikační postup lze rozdělit do následujících fází: - použití klasických separačních technik pro přípravu hrubě přečištěných surových preparátů (srážení, dialýza) - použití tradičních chromatografických metod (ionexová chromatografie, gelová chromatografie) -

použití

vysoce

specifických

chromatografických

chromatografie, HPLC apod.)

193

technik

(afinitní,

imunoafinitní

194

Úkolem první fáze purifikačního postupu (někdy bývá označována jako fáze izolační) je příprava surového preparátu. K tomu se obvykle využívají postupy, založené na fázových separacích (viz. kap.2.1 a kap.2.2). Během těchto kroků dochází k velice malému přečištění preparátů, spíše se jedná o počáteční úpravy vzorku do vhodné formy (např. odseparování určité skupiny biomolekul, zmenšení objemu apod.) Během dalšího purifikačního postupu, kdy máme již k dispozici surový preparát, u kterého však lze předpokládat přítomnost velkého množství balastních látek, se aplikují chromatografické techniky, pracující na obecnějších principech. Příkladem je např. ionexová chromatografie, kdy rozhodujícím faktorem pro separaci je rozdíl nábojů mezi požadovanou složkou a náplní kolony. Výhodou tohoto postupu je i možnost aplikovat velké objemy vzorku, což má význam např. při izolaci extracelulárních enzymů, kdy výchozím materiálem může být i několik litrů media. Zejména v této fázi purifikace je třeba dbát na návaznost jednotlivých kroků. Existují určitá pravidla, vycházející ze zkušeností a principů jednotlivých metod, která se musí respektovat. Např. použití ionexové chromatografie předchází většinou odsolení vzorku, protože vysoká koncentrace solí znemožňuje vazbu izolované látky na ionex. Jiný případ nastává při aplikaci chromatografie s hydrofobní interakcí, kde naopak vyšší iontová síla zvyšuje pevnost vazby a je proto žádoucí. Jako další většinou následuje gelová chromatografie na vhodně zvolených gelech. Protože u tohoto typu chromatografie je jedním z limitujících faktorů objem aplikovaného vzorku, musí tomuto kroku předcházet koncentrační fáze např. ultrafiltrace, jejímž cílem je zmenšit objem vzorku na minimum. V závěrečných fázích purifikačního postupu se uplatňují již specifické typy chromatografií např. afinitní. Jelikož zde bývá většina kontaminujících složek ze vzorku již odstraněna, je možno využít i elektroforetické metody, prováděné v preparativním měřítku. Poté se používá opět gelová chromatografie, a to ze dvou důvodů. Složení vzorku musí být přizpůsobeno často tak, aby se získaných látek dalo dále využít. Soli, denaturační činidla a elektrolyty musí být odstraněny. Kromě toho gelová chromatografie odstraňuje artefakty vzniklé při purifikaci, jako jsou polymery bílkovin, denaturované látky apod. Pro purifikaci nukleových kyselin se většinou používají postupy stejné jako v případě proteinů např. gelová chromatografie, chromatografie na měničích iontů apod.. Obecně je možno říci, že s nukleovými kyselinami se zachází snadněji než s proteiny, protože jsou poměrně odolné vůči drsným podmínkám. Kromě univerzálních technik existuje však také mnoho postupů využitelných lépe pro nukleové kyseliny než pro proteiny nebo pouze pro ně.

195

Např. při chromatografickém čištění DNA se s úspěchem uplatňuje hydroxyapatit. Dvouvláknová DNA se totiž váže mnohem pevněji než jednovláknová DNA a ostatní molekuly. Při izolaci specifických nukleových kyselin (mRNA) je užitečná afinitní chromatografie s kovalentně navázanými úseky poly(U). V tomto případě dochází ke specifické interakci mezi sekvencí poly(A), kterou má na svém 3`-konci většina eukaryontních mRNA a již zmíněnou poly(U). Pro dělení DNA se nejčastěji využívá ultracentrifugace v rovnovážném hustotním gradientu v CsCl. Elektroforeza v PAA nebo agarosovém gelu rozdělí DNA hlavně podle velikosti. Výsledkem celého purifikačního postupu biomakromolekul by měl být preparát, jehož čistota odpovídá dalšímu využití. Při volbě purifikačního postupu je třeba brát v úvahu i řadu dalších faktorů jako např. ekonomiku procesu, možnost automatizace, dobu trvání apod. Výše uvedené pořadí technik by se nemělo brát jako doporučení, nýbrž spíše jako příklad, jak lze o pořadí separačních technik uvažovat.

3.8.2 Odsolování K odstranění nízkomolekulárních látek je možno využívat membránové procesy, a to dialýzu, elektrodialýzu a ultrafiltraci. Hyperfiltrace (reverzní osmóza) se pro odsolení použít nedá. Dialýza se velice často používá při laboratorní práci. Její výhodou je, že je velmi nenáročná pokud jde o potřebné vybavení. K laboratorní dialýze se dnes většinou používají dialyzační trubice, t.j. membrány ve tvaru trubice (střeva), které se vyrábějí z různých materiálů a o různém průměru. Jejich nevýhodou je, že nebývá vždy výrobcem deklarována velikost pórů, takže ne vždy je možno podle tohoto hlediska volit materiál. Membrány, které trubice tvoří, jsou určeny pro odstraňování nízkomolekulárních látek, především solí, a tomu odpovídá hustota membrány. Trubice se po naplnění vzorkem na obou stranách pevně zaváže, vloží se do nádoby s pufrem o nízké iontové síle, ev. do destilované vody a nechá se za míchání v chladu dialyzovat asi 24 hod. Není-li zařízena kontinuální výměna pufru, je třeba tento během dialýzy několikrát vyměnit, neboť celý proces je hnán koncentračním rozdílem na obou stranách membrány a jakmile dojde k ustavení rovnováhy, proces se zastaví.

196

Dialýza v žádném případě neslouží k zahuštění roztoku, ale naopak je třeba počítat s naředěním roztoku v dialyzační trubici. V poloprovozním nebo provozním měřítku se častěji využívá elektrodialýza, kdy se nepracuje v membránových trubicích, ale membrány jsou umístěny v rámech a řazeny do serií, jak je popsáno v kapitole o membránových procesech (kap.2.2). Ultrafiltrací dosáhneme jak odsolení tak zahuštění roztoků a při volbě vhodné membrány můžeme současně odstranit část balastních látek. Ultrafiltrační membrány se totiž vyrábějí s přesně definovanými póry různých velikostí, takže kromě nízkomolekulárních látek lze současně odstranit i vysokomolekulární látky, ovšem za předpokladu, že mají nižší molekulovou hmotnost než požadované látky, které se ze směsi izolují. Při ultrafiltraci procházejí nízkomolekulární látky, resp. látky, které jsou schopné projít póry v membráně (velikost pórů záleží na naší volbě) na opačnou stranu membrány, ovšem látková koncentrace procházejících látek v roztoku na obou stranách membrány zůstává nezměněna. Proto chceme-li snížit látkovou koncentraci solí v zahuštěném roztoku, musíme sáhnout k tzv. diafiltraci. Znamená to, že po snížení objemu roztoku nad membránou doplníme objem destilovanou vodou na původní hodnotu, čímž značně klesne látková koncentrace dosud přítomných látek s nižší molekulovou hmotností. Po opakovaném snížení objemu roztoku nad membránou můžeme celý proces opakovat, až odstraníme značné procento původně přítomných menších molekul. Jejich úplné odstranění ovšem není možné. Při ultrafiltraci tedy dojde k mnohonásobnému (až desetinásobnému) snížení objemu roztoku nad membránou, přičemž veškeré vysokomolekulární látky zůstávají nad membránou, takže jejich koncentrace se značně zvyšuje. Diafiltrací ovlivníme pouze snížení obsahu látek, které procházejí membránou, koncentrace vysokomolekulárních látek se opakovaným naředěním oproti prvnímu kroku nemění (je-li konečný objem nad membránou vždy stejný jako po prvním kroku). Pro laboratorní i poloprovozní či provozní ultrafiltraci je nezbytné speciální zařízení a vhodné filtry. Protože se pracuje s tlakovými rozdíly, musí být zajištěna odolnost materiálu vůči tlakovým změnám a nepropustnost, proto jsou tato zařízení obvykle dosti nákladná. K odsolení roztoků se může použít i gelová chromatografie na gelech s velice nízkou vylučovací mezí (Sephadex G-10, G-25), takže všechny molekuly s vyšší molekulovou hmotností budou procházet kolonou bez zdržení a zpomalí se pouze nízkomolekulární látky, které se od větších molekul dobře oddělí. K odsolování na gelech je možno použít kolony o velkém průměru a vysoké průtokové rychlosti. Jako eluent se obvykle používají pufry s

197

nízkou iontovou silou. Odstraňování solí ze vzorku gelovou chromatografií je úplnější než membránovými procesy. Dochází ale k mírnému naředění vzorku. Gelová chromatografie na gelech s nízkou vylučovací mezí se dobře hodí i pro výměnu pufrů, ve kterých jsou separované molekuly rozpuštěny.

3.8.3 Požadavky na čistotu preparátů Volba purifikačního postupu je určována dalším využitím konečného produktu. Požadovaný stupeň čistoty preparátu využívaného v průmyslu je většinou odlišný od stupně čistoty ultračistých laboratorních preparátů. Úkolem purifikačního postupu není zamezit ztrátám v průběhu izolace a purifikace, ale odstranit co nejvíce kontaminujících látek, aby výsledkem byl protein v co nejčistším stavu. Z hlediska čistoty lze rozlišit preparáty technické, purifikované a vysoce purifikované popř. čisté. Příprava technických preparátů je poměrně jednoduchá a obvykle vystačíme s nejběžnějšími izolačními postupy, jako je srážení organickými rozpouštědly nebo solemi, dialýza a izoelektrické srážení. Při přípravě technických enzymových preparátů bývá většinou cílem získat enzymový preparát v práškové formě. Toho lze dosáhnout použitím klasických izolačních postupů (např. metody fázové separace viz kap.2.1), kterými lze připravit preparáty omezené čistoty, ale s poměrně malými náklady. Protože tyto preparáty jsou využívány zejména v průmyslovém měřítku, kde jsou třeba poměrně velká množství, je ekonomické hledisko procesu velmi důležité. Je třeba tedy najít určitý kompromis mezi požadovanou čistotou preparátu a náklady na jeho přípravu. Příprava purifikovaných preparátů je mnohem složitější a kromě klasických izolačních technik je nutno použít specifické metody, založené na různé migraci. V této fázi postupu se používají purifikační postupy podle zásad, které byly probrány v kapitole o separačních technikách. Purifikované preparáty by měly být zbaveny většiny nežádoucích příměsí a proto i izolační postup bývá náročnější než je tomu u technických preparátů. Vysoce purifikované až homogenní preparáty se vyrábějí jen vzácně a jsou obvykle velice drahé. Tyto preparáty nacházejí uplatnění ve výzkumných oblastech, zejména v

198

klinické chemii, medicině apod. Pokud jde o enzymy, jsou to většinou enzymy intracelulární a jsou připravovány ve velmi malých množstvích. Při aplikaci jakékoliv nové purifikační metody je třeba průběžně kontrolovat čistotu získaného preparátu. K tomu se používá metoda tzv. postupné eliminace, což je proces, během kterého je všemi dostupnými metodami dokazováno, že daný vzorek obsahuje pouze jedinou látku. Zkušenost ukazuje, že v látce, která byla považována za čistou se použitím nové metody často prokáže přítomnost dalších příměsí.

3.8.4 Hodnocení účinnosti purifikace V praxi je třeba pro každý izolovaný preparát vyvinout speciální izolační a purifikační postup. Purifikace je vždy složitý proces, který vyžaduje vhodné technické zařízení, ale kromě toho i určité zkušenosti s prací s daným materiálem i s metodami vhodnými pro separaci biomakromolekul. Úspěšnost každého izolačního resp. purifikačního kroku je třeba nějakým způsobem hodnotit. V zásadě k tomu slouží 2 hlediska: výtěžnost ev. návratnost požadované sloučeniny v izolačním kroku stupeň přečištění V prvém případě se posuzuje k jakým ztrátám požadovaného materiálu došlo, ve druhém případě se sleduje, kolik se podařilo odstranit balastních látek. Celkem jednoduše se obě hlediska sledují, jedná-li se o látku s měřitelnou biologickou aktivitou, např. enzymovou. Výtěžnost enzymové aktivity se vypočítá z poklesu celkové enzymové aktivity v průběhu izolačního postupu nebo jednotlivých purifikačních kroků. Stupeň přečištění je poměr specifických enzymových aktivit po izolačním kroku a před ním. Zatímco celková enzymová aktivita v průběhu izolace klesá, specifická aktivita enzymového preparátu se zvyšuje. Aby bylo možno počítat bilanci procesu, je tedy třeba před i po každém purifikačním kroku znát enzymovou aktivitu, objem preparátu a obsah bílkovin.

199

3.9 Koncentrace izolovaných preparátů a jejich konečná úprava Při většině metod frakcionace, resp. purifikace biomakromolekul, dojde k značnému naředění roztoku separované látky. Proto po purifikaci velice často následuje zahuštění roztoků. Zřídka se k tomu účelu dá použít odpařování, při němž je nebezpečí inaktivace biologicky aktivní látky. Pokud je biomolekula dostatečně teplotně odolná, pak se může použít sušení ve sprayových sušárnách, kde styk izolovaného preparátu s horkým vzduchem je velmi krátký, proto ztráty biologické aktivity jsou malé a výtěžek se pohybuje okolo 90 %. Tímto způsobem se někdy upravují technické enzymové preparáty. Zcela běžným způsobem koncentrace s finální úpravou enzymových a jiných bílkovinných preparátů je mrazová sublimace (tzv. lyofilizace). Roztok enzymu je zmražen v tenké vrstvě a pak vystaven hlubokému vakuu. Přitom dojde k sublimaci vody a protein obvykle zůstává ve formě hygroskopického prášku. Před zmražením je nutno roztok bílkoviny zbavit zbytků organických rozpouštědel a většího množství solí. Většina bílkovin snáší mrazovou sublimaci velmi dobře. Jestliže přeci dojde k denaturaci, je to často vlivem změny pH, která může při lyofilizaci nastat. Koncentrace roztoků bílkovin a nukleových kyselin se může realizovat vysrážením vhodnou solí nebo organickým rozpouštědlem. Precipitovaná biomolekula je odseparována (např. centrifugací) a po resolubilizaci v malém objemu roztoku zbavena solí ev. organického rozpouštědla dialýzou. Tato metoda je vhodná proto, že nevyžaduje žádná speciální zařízení. Ke koncentraci roztoků purifikovaných biomolekul se dále používají metody již dříve popsané: ultrafiltrace, odvodnění a odsolení pomocí suchých gelotvorných materiálů (Sephadex, Biogel) s hustým prokřížením, zahuštěním vsádkovou adsorpcí na adsorpční nebo ionexový materiál. Z těchto metod se pouze ultrafiltrace dá použít ve větším měřítku. Ostatní způsoby mají význam pouze pro velmi malé objemy. Někdy jsou bílkoviny připravovány v krystalické formě. Různé proteiny se značně liší schopností krystalizace; některé krystalizují velmi snadno, jiné vůbec ne. Např. aldolasa z králičího svalu krystalizuje již z hrubého extraktu. Obvykle však je krystalizace až posledním krokem několikastupňového purifikačního procesu. Krystalizace bílkoviny se obvykle provádí z roztoku síranu amonného nasyceného těsně pod stupeň, při němž dochází k vysolení. Vlastní proces trvá několik dní až týdnů a roztok musí být udržován v chladu. Obdobně je možné provádět krystalizaci z roztoku organického rozpouštědla. Metody krystalizace jsou zcela empirické a musí být brány v

200

úvahu podmínky jako pH, teplota, koncentrace solí apod. Krystalizační procesy jsou zdlouhavé a vždy při nich dochází ke ztrátám biologické aktivity. Proto krystalizace izolační postup vždy velmi prodraží. Krystalická forma není zárukou čistoty bílkovinného preparátu. Některé amorfní preparáty mohou být čistší než preparáty krystalické. Např. myogen A, ačkoliv tvoří krásné bipyramidální krystaly, je značně znečištěn řadou dalších proteinů, z nichž některé mají jiné enzymové aktivity.

3.10 Kriteria čistoty preparátů U každého purifikovaného preparátu bychom měli znát stupeň čistoty. Již jsme si objasnili, že např. krystalická forma enzymového preparátu neznamená jeho úplnou homogenitu. Stejně tak zárukou homogenity není zisk jediného elučního vrcholu při užití libovolného způsobu chromatografie, včetně vysokoúčinné kapalinové chromatografie, protože v jediném vrcholu mohou být další bílkoviny se stejnými vlastnostmi. Všechny metody pro průkaz homogenity preparátu biomolekul jsou založeny na negativních výsledcích při snaze o detekci příměsí. Takže: čím více metodami neprokážeme žádné příměsi, tím si můžeme být jistější, že získaný preparát je homogenní. Negativní výsledky jedné jediné metody nám tuto jistotu nikdy neposkytnou. U enzymových preparátů testujeme vždy přítomnost kontaminujících enzymových aktivit. U mikrobiálních enzymů se velmi často vyskytují jako kontaminanty proteinasy, ale může být přítomna i řada dalších enzymů, které se během purifikačního procesu nepodařilo odstranit. Např. flavinové enzymy (glukosaoxidasa) mají jako běžný kontaminující enzym přítomnu katalasu, askorbátoxidasa peroxidasu apod. Jestliže se neprokáže žádná kontaminující enzymová aktivita, neznamená to, že preparát je zcela čistý, protože mohou být přítomny bílkoviny bez enzymových aktivit. Zatímco krystalizace sama není průkazem čistoty bílkoviny, nezměněná specifická aktivita při několikanásobné rekrystalizaci enzymového preparátu již jako průkaz obstojí. Dříve se k průkazu homogenity používalo měření rozpustnosti bílkoviny. Bylo sledováno množství rozpuštěné bílkoviny v závislosti na přídavku bílkoviny k roztoku. Jestliže se na grafu projeví ostrý přechod v místě, kde dojde k nasycení roztoku bílkovinou,

201

pak je přítomna pouze jedna bílkovina. Jestliže je přechod vzestupné fáze do nasyceného stavu pozvolný, svědčí to o přítomnosti více bílkovin (obr.2.106)

Obr.2.106 Závislost rozpustnosti bílkovin na přídavku k roztoku a) homogenní bílkovina, b) nehomogenní bílkovina Jedním z kriterií čistoty enzymového preparátu je analytická ultracentrifugace, která se provádí při 60 tis. otáčkách za minutu. Protein se usazuje a vytváří ostrou hranici mezi roztokem a rozpouštědlem. Jedné zóně (hranici) odpovídá vždy jediná komponenta. Výsledek se posuzuje fotometricky. Na obdobném principu je založena metoda centrifugace v gradientu hustoty. Gradient se vytváří sacharosou (5-20 %) v centrifugační zkumavce. Vzorek se umístí nad gradientem a odstřeďuje se při 40 tis. otáčkách za minutu asi 24 hodin. V průběhu centrifugace proteiny s odlišnou relativní molekulovou hmotností putují gradientem sacharosy odlišnou rychlostí; nejrychleji se pohybují nejtěžší bílkoviny. Po určité době se ustaví rovnováha a bílkoviny vytvoří frakce. Počet frakcí odpovídá počtu komponent směsi. Nejčastěji používanou metodou pro posouzení čistoty preparátu je elektroforéza na nosičích, dnes zejména elektroforéza na polyakrylamidovém gelu. Počet zón, které

se

vytvořily při průchodu stejnosměrného elektrického proudu na gelu, odpovídá počtu přítomných bílkovin nebo nukleových kyselin. Většina bílkovin je bezbarvá a je proto nutno zóny po proběhlé elektroforéze vizualizovat. Nejběžnější způsob je barvení amidočerní nebo Comassie-modří. Některé enzymy dávají barevné reakce, a to pak umožní specifickou detekci zóny enzymu přímo na nosiči. Pro zjištění čistoty enzymových preparátů se používají ještě další metody, z nichž můžeme jmenovat alespoň imunometody.

202

Zatímco při purifikaci bílkovinných preparátů zjišťujeme přítomnost kontaminujících proteinů, u nukleových kyselin je třeba odlišit DNA od RNA. K tomu slouží spektrofotometrické metody resp. stanovení poměru absorbancí při 260 nm a 230 nm. Při posuzování čistoty preparátů nukleových kyselin se rovněž uplatňují metody elektroforetické.

203

204