UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid Laboratorium voor Chemische Analyse Academiejaar 2012-‐2013
Ontwikkeling en validatie van een extractieprocedure en hoge resolutie Orbitrap massaspectrometrische methode voor de analyse van carotenoïden in tomaat
Jolien MYLLE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. dr. ir. Lynn Vanhaecke Co-‐promotor
Ir. Lieven Van Meulebroek
Commissarissen
Prof. dr. apr. S. De Saeger Dr. apr. J. Diana Di Mavungu
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Veterinaire Volksgezondheid en Voedselveiligheid Laboratorium voor Chemische Analyse Academiejaar 2012-‐2013
Ontwikkeling en validatie van een extractieprocedure en hoge resolutie Orbitrap massaspectrometrische methode voor de analyse van carotenoïden in tomaat
Jolien MYLLE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. dr. ir. Lynn Vanhaecke Co-‐promotor
Ir. Lieven Van Meulebroek
Commissarissen
Prof. dr. apr. S. De Saeger Dr. apr. J. Diana Di Mavungu
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 20 mei 2013
Promotor
Auteur
Prof. dr. ir. Lynn Vanhaecke
Jolien Mylle
WOORD VOORAF Van deze gelegenheid zou ik graag gebruik willen maken om een aantal mensen te bedanken zonder wie ik deze thesis nooit tot een goed eind had kunnen brengen. In de eerste plaats wil ik Prof. dr. ir. Lynn Vanhaecke bedanken om mij de mogelijkheid te geven deze thesis uit te voeren in het Laboratorium voor Chemische Analyse. Met nadruk wil ik ir. Lieven Van Meulebroek bedanken voor zijn uitstekende ondersteuning en begeleiding tijdens het onderzoek en het nalezen van mijn thesis. Zijn enthousiasme en optimisme zorgden eveneens voor een aangename samenwerking. Bedankt ook aan iedereen in het labo voor de hulp en advies, en natuurlijk ook voor de leuke sfeer. Tot slot wil ik ook mijn ouders, vriend en vriendinnen bedanken voor de emotionele steun tijdens het verwezenlijken van deze thesis.
SAMENVATTING Carotenoïden zijn belangrijke secundaire metabolieten die voornamelijk voorkomen in plantaardig materiaal. De inname van deze carotenoïden wordt geassocieerd met een verminderd risico op chronische aandoeningen, wat voornamelijk verklaard kan worden door de antioxidatieve eigenschappen van deze componenten. Vandaar ook dat carotenoïden veelvuldig worden bestudeerd om meer inzicht te verwerven omtrent hun specifieke werking, hun metabolisme en hun gehaltes in plantaardig materiaal. In deze masterthesis werd een extractie-‐ en detectiemethode ontwikkeld voor de analyse van carotenoïden in tomatenvruchten. Deze analytische methode onderscheidt zich voornamelijk door de mogelijkheid tot metabolome profilering waardoor informatie over honderden metabolieten, aanwezig in het plantextract, beschikbaar wordt. Bij de ontwikkeling van deze methode werden zowel carotenen als xanthofyllen beschouwd. De geoptimaliseerde extractieprocedure maakte gebruik van vloeistof-‐vloeistofextractie met methyl-‐tert-‐butylether/methanol (50:50, v/v) en 0,01% butylhydroxytolueen als extractiesolvent. De chromatografische scheiding van de carotenoïden werd gerealiseerd met een Acclaim C30 kolom met toepassing van een gradiëntprogramma dat gebruik maakte van ethylacetaat/methanol (1:1, v/v), ultrapuur water, acetonitrile, en 0,04 g L-‐1 ammoniumacetaat in methanol. Voor analyse van het tomatenextract werd een full-‐scan, hoge resolutie ExactiveTM Orbitrap-‐MS methode ontwikkeld en gevalideerd. Validatie gebeurde aan de hand van Beschikking 2002/657/EG van de Europese Commissie (Europese Gemeenschap, 2002) en toonde aan dat de ontwikkelde analytische methode een goede terugvinding heeft (80% -‐ 110%), lineair (R2 ≥ 0,99), herhaalbaar (RSD < 15%), reproduceerbaar (RSD < 20%) en specifiek is. Daarenboven werd de methode ook als gevoelig ervaren aangezien uitstekende detectie-‐ en kwantificatielimieten werden behaald (LOD van 0,0005 -‐ 0,0384 ng μL-‐1 en LOQ van 0,0015 -‐ 0,1275 ng μL-‐1). De ontwikkelde methode werd vervolgens aangewend om de evolutie van de carotenoïdengehaltes in functie van het ontwikkelingsstadia van de tomatenvrucht na te gaan. Daarnaast werd via het softwareprogramma ToxID een groene tomatenvrucht gescreend op de aanwezigheid van 50 carotenoïden waarbij 32 mogelijke componenten werden gedetecteerd. Deze toepassing toont aan dat de methode een totaalanalyse van de aanwezige carotenoïden in de vrucht toelaat. Hierdoor kan een beter inzicht verkregen worden in de werking, het metabolisme en de rol van carotenoïden in tomaat.
INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING ................................................................................................................... 1 1.1. CAROTENOÏDEN ........................................................................................................................................... 1 1.1.1. Functies in het lichaam ................................................................................................................. 1 1.1.2. Invloed op de gezondheid ............................................................................................................. 2 1.1.2.1. Kanker ........................................................................................................................................... 2 1.1.2.2. Cardiovasculaire aandoeningen ................................................................................................... 3 1.1.2.3. Aandoeningen van aan licht-‐blootgestelde weefsels ................................................................... 3 1.1.3. Absorptie en biologische beschikbaarheid .................................................................................... 4 1.1.4. Functionele eigenschappen .......................................................................................................... 4 1.1.5. Toepassing van carotenoïden ....................................................................................................... 4 1.2. CAROTENOÏDEN IN TOMAAT ....................................................................................................................... 5 1.2.1. Algemeen ..................................................................................................................................... 5 1.2.2. Carotenen en xanthofyllen ........................................................................................................... 5 1.2.2.1. Structuur ....................................................................................................................................... 5 1.2.2.2. Biosynthese .................................................................................................................................. 6 1.3. ANALYSE VAN CAROTENOÏDEN IN TOMAAT ................................................................................................ 8 1.3.1. Extractie van carotenoïden uit tomaat .......................................................................................... 8 1.3.2. Chromatografische scheiding van carotenoïden ............................................................................ 8 1.3.3. Reeds toegepaste methoden voor detectie van carotenoïden ....................................................... 8 1.3.3.1. Triple stage quadrupole massaspectrometrie (MS/MS) ............................................................... 9 n 1.3.3.2. Linear ion trap quadrupole massaspectrometrie (MS ) ............................................................. 10 1.3.3.3. Photodiode array detector (PDA) ............................................................................................... 11 n 1.3.3.4. Detectie van carotenoïden met een PDA-‐detector, MS/MS en MS .......................................... 11 1.3.4. Hoge resolutie Orbitrap massaspectrometrie .............................................................................. 12 1.3.4.1. Algemeen principe ...................................................................................................................... 12 1.3.4.2. Voordelen van Orbitrap massaspectrometrie ............................................................................ 13 1.3.5. Metabolomics ............................................................................................................................. 13
2. OBJECTIEVEN ............................................................................................................. 15 3. MATERIAAL EN METHODEN ....................................................................................... 16 3.1. MATERIAAL ................................................................................................................................................ 16 3.1.1. Algemeen ................................................................................................................................... 16 3.1.2. Reagentia en chemicaliën ........................................................................................................... 16 3.1.3. Oplossingen ................................................................................................................................ 17 3.2. METHODEN ................................................................................................................................................ 18 3.2.1. Analyse van carotenoïden, aanwezig in de tomatenvrucht ......................................................... 18 3.2.1.1. Extractieprocedure ..................................................................................................................... 18 3.2.1.2. Chromatografische instrumentatie ............................................................................................ 19 3.2.1.3. Massaspectrometrie en UV-‐VIS-‐spectrofotometrie ................................................................... 21 3.2.1.4. Validatie van de analyseprocedures ........................................................................................... 26 3.2.1.5. Kwantificatie van carotenoïden in tomaat ................................................................................. 29 3.2.2. Analyse van suikers, aanwezig in de tomatenvrucht ................................................................... 29 3.2.2.1. Extractieprocedure ..................................................................................................................... 29 3.2.2.2. Analyseprocedure ....................................................................................................................... 30 3.2.2.3. Kwantificatie van suikers in tomaat ............................................................................................ 30 3.2.3. Evolutie van de vruchtsamenstelling in functie van het ontwikkelingsstadium ............................ 31 3.2.4. Metabolome profilering van een groene tomatenvrucht ............................................................ 31
4. RESULTATEN .............................................................................................................. 32 4.1. ANALYSE VAN CAROTENOÏDEN IN TOMAAT .............................................................................................. 32 4.1.1. Extractieprocedure ..................................................................................................................... 32 4.1.2. Analyseprocedures ..................................................................................................................... 34 4.1.3. Validatie van de analyseprocedures ............................................................................................ 36 4.1.3.1. Lineariteit .................................................................................................................................... 37 4.1.3.2. Specificiteit ................................................................................................................................. 38 4.1.3.3. Herhaalbaarheid en intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid .................................................. 39 4.1.3.4. Terugvinding ............................................................................................................................... 40 4.1.3.5. LOD en LOQ ................................................................................................................................ 41 4.1.4. Evolutie van het carotenoïdegehalte in functie van het ontwikkelingsstadium ........................... 42 4.1.5. Metabolome profilering van een groene tomaat ........................................................................ 44 4.2. ANALYSE VAN SUIKERS IN TOMAAT ........................................................................................................... 44 4.2.1. Evolutie van het suikergehalte in functie van het ontwikkelingsstadium ..................................... 44
5. DISCUSSIE .................................................................................................................. 46 6. CONCLUSIE ................................................................................................................ 52 7. LITERATUURLIJST ....................................................................................................... 54 8. BIJLAGE ..................................................................................................................... 59
LIJST MET AFKORTINGEN Afkorting ACN
Betekenis Acetonitrile
AGC
Automatic gain control
APCI
Atmosferische druk chemische ionisatie (Atmospheric pressure chemical ionisation)
au
Arbitraire eenheden (Arbitrary units)
BHT
Butylhydroxytolueen
CAR
Carotenoïde
CRTISO
Carotenoïd isomerase
ELSD
Evaporative light scattering detection
ESI
Elektrospray ionisatie (Electrospray ionisation)
FWHM
Piekbreedte op halve hoogte (Full width half maximum)
GGPP
Geranylgeranylpyrofosfaat
HCD
High energy collision dissociation
HESI
Verwarmde elektrospray ionisatie (Heated electrospray ionisation)
HPLC
Hoge performantie vloeistofchromatografie (High performance liquid chromatography)
IPP
Isopentenyl pyrofosfaat
LDL
Lage-‐densiteit lipoproteïnen
LOD
Detectielimiet (Limit of detection)
LOQ
Kwantificatielimiet (Limit of quantification)
LTQ
Linear ion trap quadrupool
MeOH
Methanol
MgCO3
Magnesiumcarbonaat
MS
Massaspectrometer/massaspectrometrie
MS/MS
Tandem massaspectrometrie
n
Multiple massaspectrometrie
MS
MTBE
Methyl-‐tert-‐butylether
Afkorting
Betekenis
m/z
Massa/ladingsverhouding
ND
Niet gedetecteerd (Not detected)
NH4Ac
Ammoniumacetaat
PDA
Photodiode array
PDS
Phytoeen desaturase
PSY
Phytoeen synthase
ROO*
Peroxylradicaal
ROO-‐CAR*
Resonantie-‐gestabiliseerd, koolstof-‐gecentreerd radicaal
ROS
Reactieve zuurstof deeltjes (Reactive oxygen species)
RSD
Relatieve standaarddeviatie
SPE
Vaste fase extractie (Solid phase extraction)
TSQ
Triple stage quadropool
UHPLC
Ultra hoge performantie vloeistofchromatografie (Ultra high performance liquid chromatography)
ZDS
ζ-‐caroteen desaturase
βLCY
Lycopeen β-‐cyclase
βOHase
β-‐hydroxylase
εLCY
Lycopeen ε-‐cyclase
εOHase
ε-‐hydroxylase
3
CAR
Triplet geëxciteerd carotenoïde
1
O2
Singlet moleculaire zuurstof
3
O2
Zuurstof in de grondtoestand
1. INLEIDING 1.1.
CAROTENOÏDEN Carotenoïden zijn belangrijke secundaire metabolieten, die voornamelijk
gesynthetiseerd worden door planten en micro-‐organismen. Deze apolaire pigmenten zijn noodzakelijk voor de fotosynthese en vervullen een beschermende rol ten opzichte van potentiële foto-‐oxidatieve schade. Tevens dragen deze componenten bij tot de kleurvorming van onder meer vruchten en bloemen. Dier en mens zijn niet in staat deze componenten te synthetiseren, maar nemen ze wel op via de voeding (Stahl & Sies, 2003; Bartley & Scolnik, 1995). Tot op heden werden in de natuur reeds meer dan 600 verschillende carotenoïden geïdentificeerd, waarvan α-‐caroteen, β-‐caroteen, lycopeen, luteïne en zeaxanthine de bekendste zijn (Roldán-‐Gutiérrez & Luque de Castro, 2007). 1.1.1. Functies in het lichaam Carotenoïden zijn zeer interessant voor de mens aangezien ze in het lichaam een rol als antioxidant vervullen en bescherming bieden tegen tal van chronische ziekten. Bovendien zijn enkele carotenoïden belangrijke precursoren van vitamine A. Epidemiologische en klinische studies hebben aangetoond dat een verhoogde consumptie van voedingsmiddelen, rijk aan carotenoïden, geassocieerd wordt met een verlaagd risico op bepaalde chronische ziekten zoals kanker, cardiovasculaire en oftalmologische aandoeningen. De carotenoïden oefenen hun antioxidant-‐activiteit uit door het neutraliseren van singlet moleculaire zuurstof (1O2) en peroxylradicalen (Stahl & Sies, 2003). Dit zijn voorbeelden van zogenaamde reactieve zuurstofdeeltjes (ROS); vrije radicalen die zuurstof bevatten en verantwoordelijk zijn voor oxidatieve stress. Ze worden gegenereerd tijdens de normale metabolische activiteit waarbij ook de levensstijl een bepalende invloed heeft (Rao & Rao, 2007). Deze ROS kunnen reageren met lipiden, proteïnen en DNA, waarbij structurele schade wordt aangericht en chronische ziekten kunnen ontstaan (Tapiero et al., 2004). Singlet moleculaire zuurstof kan schade aanrichten aan DNA en lipidenperoxidatie veroorzaken, waarbij peroxylradicalen gegenereerd worden. Carotenoïden beschermen ons tegen singlet moleculaire zuurstof door de energie ervan te transfereren naar het
1
carotenoïde, waardoor zuurstof in de grondtoestand (3O2) verkregen wordt en een triplet geëxciteerd carotenoïde (3CAR*) ontstaat (reactievergelijking (1), Edge et al., 1999). Dit geëxciteerd carotenoïde kan terugkeren naar zijn grondtoestand door energie af te geven als warmte aan de omgeving. Bij dit fysisch proces blijft het carotenoïde intact en kan het hergebruikt worden (Edge et al., 1997; Stahl & Sies, 2003).
1
O2* + CAR à 3O2 + 3CAR*
(1)
Van de verscheidene radicalen die gevormd worden in het lichaam, reageren de carotenoïden het efficiëntst met de peroxylradicalen. Deze radicalen worden gevormd tijdens de lipidenperoxidatie en kunnen aanleiding geven tot schade aan membranen en lipoproteïnen. Carotenoïden (CAR) beschermen deze lipofiele compartimenten tegen oxidatieve schade door deactivatie van de peroxylradicalen (ROO*) (Edge et al., 1997; Stahl & Sies, 2003). Ze doen dit door adducten te vormen met het radicaal waarbij een resonantie-‐ gestabiliseerd koolstof-‐gecentreerd radicaal (ROO-‐CAR*) wordt gevormd (reactievergelijking (2), Edge et al., 1999).
CAR + ROO* à ROO-‐CAR*
(2)
Additie van een tweede peroxylradicaal (ROO*) aan het adduct zorgt voor de vorming van een niet-‐radicaal, stabiel product (reactievergelijking (3), Edge et al., 1997) (Kennedy & Liebler, 1992). ROO-‐CAR* + ROO* à niet-‐radicaal product
(3)
1.1.2. Invloed op de gezondheid 1.1.2.1.
Kanker
Een hoge inname van fruit en groenten, die rijk zijn aan carotenoïden, vermindert het risico op het ontstaan van borst-‐, prostaat-‐, colon-‐ en longkanker (Johnson, 2002; Tapiero et al., 2004). Eén van de mechanismen, die bijdragen tot de bescherming tegen kanker, betreft de provitamine A activiteit van sommige carotenoïden, wat een effect heeft op de cellulaire differentiatie en proliferatie van cellen. Daarnaast kan ook de antioxidant-‐activiteit bescherming bieden tegen schade, verricht door vrije radicalen, aan DNA en andere moleculen. Carotenoïden versterken bovendien de immuniteit tegen tumoren en verbeteren
2
de communicatie tussen cellen, wat de klonale expansie van initiërende kankercellen zou beperken (Johnson, 2002). Hoge dosissen β-‐caroteen hebben echter een stimulerende werking op de ontwikkeling van longkanker bij rokers. Hierbij oefent β-‐caroteen aldus een pro-‐oxidatieve activiteit uit in plaats van op te treden als antioxidant (Johnson, 2002). 1.1.2.2.
Cardiovasculaire aandoeningen
Oxidatie van de circulerende lage-‐densiteit lipoproteïnen (LDL), dewelke cholesterol transporteren in het bloed, tot geoxideerd LDL wordt verondersteld een belangrijke rol te spelen in de pathogenese van atherosclerose, wat kan leiden tot coronaire hartaandoeningen (Rao & Rao, 2007). Geoxideerd LDL wordt opgenomen door onder andere de macrofagen, welke hierdoor tot schuimcellen kunnen worden omgevormd. Accumulatie van deze schuimcellen in het subendotheliale deel van de bloedvaten duidt op een zich ontwikkelende atherosclerotische plaque. Door de aangroei van deze plaque ontstaat er vernauwing van de bloedvaten, terwijl het loskomen van een dergelijke plaque kan leiden tot de volledige verstopping van een bloedvat (Young & Woodside, 2001). Vooral lycopeen, dat getransporteerd wordt via LDL, speelt een belangrijke rol in de preventie van atherosclerose door de oxidatie van LDL tegen te gaan (Rao & Rao, 2007; Tapiero et al., 2004). 1.1.2.3.
Aandoeningen van aan licht-‐blootgestelde weefsels
Blootstelling aan licht kan leiden tot de vorming van ROS, die de structuur van cellen en weefsels kunnen aantasten en als dusdanig schade aan ogen en huid kunnen aanrichten (Stahl & Sies, 2003). Luteïne en zeaxanthine zijn verantwoordelijk voor de kleur van de macula lutea (of gele vlek) ter hoogte van de retina van het oog en vervullen er een beschermende rol. Met hun antioxidatieve werking en hun filterend vermogen van schadelijk blauw licht beschermen ze het oog tegen foto-‐oxidatieve schade. Andere carotenoïden, zoals lycopeen, α-‐caroteen en β-‐caroteen zijn niet aanwezig in de macula lutea (Stahl & Sies, 2003). Wanneer de huid blootgesteld wordt aan UV-‐licht kan er erythema optreden. β-‐ caroteen beschermt de huid tegen dergelijke foto-‐oxidatieve schade en zonnebrand (Stahl &
3
Sies, 2003). 1.1.3. Absorptie en biologische beschikbaarheid Carotenoïden worden geabsorbeerd door de mucosacellen van het gastro-‐intestinaal systeem via passieve diffusie nadat ze geïncorporeerd werden in micellen. Vervolgens worden ze ingesloten in chylomicronen en vrijgesteld in het lymfatisch systeem, waarna ze naar de lever getransporteerd worden. Ter hoogte van de lever worden ze geïncorporeerd in lipoproteïnen en vrijgesteld in de bloedbaan. Vanuit het bloed worden de carotenoïde structuren geabsorbeerd door verscheidene weefsels, en worden ze opgeslagen in voornamelijk het vetweefsel (Rao & Rao, 2007). Carotenoïden die een β-‐ionone ring bevatten kunnen in het lichaam opgezet worden naar vitamine A (Giovannucci, 1999). 1.1.4. Functionele eigenschappen Carotenoïden zijn zeer hydrofobe moleculen, waardoor ze weinig tot niet oplosbaar zijn in water en de neiging hebben om te accumuleren in lipofiele structuren, zoals membranen en lipoproteïnen. De meest voorkomende configuratie van de carotenoïden betreft de all-‐transvorm, waarbij de carotenoïden lineaire, rigide moleculen zijn. Cyclisatie aan het uiteinde van de ketens zorgt voor verkorting van de molecule. Door de aanwezigheid van de geconjugeerde dubbele bindingen zijn carotenoïden in staat licht te absorberen in het zichtbaar gebied met een golflengtegebied van 400 -‐ 500 nm. Deze eigenschappen van lichtabsorptie worden, binnen de analytische benadering, dan ook veelvuldig gebruikt voor de identificatie van carotenoïden. Carotenoïden zijn werkzaam als antioxidantia, en deze functie is grotendeels het gevolg van de aanwezigheid van die geconjugeerde dubbele bindingen (Britton, 1995). Daarnaast kunnen sommige carotenoïden omgezet worden naar vitamine A, zoals α-‐ en β-‐caroteen. Hiervoor is minstens de aanwezigheid van een β-‐ionone ring in de structuur vereist (Giovannucci, 1999). 1.1.5. Toepassing van carotenoïden Zoals reeds aangehaald wordt het risico op de ontwikkeling van diverse chronische ziekten gereduceerd door een sterke consumptie van groenten en fruit, waarbij voornamelijk de aanwezige antioxidantia verantwoordelijk zijn voor de waargenomen gunstige effecten. Vandaar dat carotenoïden, naast hun gebruik als voedingskleurstof en –
4
geurstof, veelvuldig worden aangewend in supplementen, farmaceutische preparaten en dierenvoeder (Rivera & Canela-‐Garayoa, 2012). Supplementatie met enkelvoudige antioxidantia blijkt echter geen voordelen op te leveren (Halvorsen et al., 2001). Een mogelijke verklaring stelt dat het beschermend effect van fruit en groenten veroorzaakt wordt door minder bekende antioxidanten of het gevolg is van de samenwerking van de talloze antioxidantia en eventueel andere componenten, zoals vitaminen en vezels, aanwezig in deze voedingsmiddelen. Aangezien fruit en groenten tot meer dan honderd verschillende antioxidantia kunnen bevatten, zou kennis omtrent de aanwezigheid en concentratie van de individuele antioxidantia uiterst waardevol zijn (Halvorsen et al., 2001; Frusciante et al., 2007). 1.2.
CAROTENOÏDEN IN TOMAAT
1.2.1. Algemeen De tomaat is een zeer populaire groente en wordt over de hele wereld rijkelijk geconsumeerd. Regelmatig tomaten eten zou de incidentie van chronische ziekten zoals kanker en hartziekten verlagen. Dit is vooral het gevolg van de aanwezigheid van verschillende antioxidantia, namelijk de carotenoïden, vitamine C, vitamine E en fenolische componenten zoals de flavonoïden. Ook de grote hoeveelheid voedingsvezels draagt bij tot de gunstige effecten op de gezondheid (Frusciante et al., 2007; Hanson et al., 2004). Hoewel diverse componenten met antioxidatieve eigenschappen in tomaat voorkomen, zijn deze gunstige gezondheidseffecten voornamelijk te danken aan de aanwezigheid van de carotenoïden. In rijpe tomaten is lycopeen in de hoogste concentratie aanwezig en draagt het bij tot de rode kleur. Daarnaast zijn nog andere carotenoïden aanwezig zoals phytoeen, phytoflueen, ζ-‐caroteen, γ-‐caroteen, α-‐caroteen, β-‐caroteen, neurosporeen, luteïne en zeaxanthine (Khachik et al., 2002). 1.2.2. Carotenen en xanthofyllen 1.2.2.1.
Structuur
De carotenoïden bezitten een poly-‐isoprenoïde structuur, bestaande uit 40 koolstofatomen, en bevatten allen een systeem van geconjugeerde dubbele bindingen. Sommige carotenoïden zijn lineair, terwijl andere één of meer cyclische β-‐ionone of ε-‐ ionone ringen bevatten. Deze ringen kunnen gesubstitueerd zijn met zuurstof bevattende
5
functionele groepen (DellaPenna & Pogson, 2006). Op basis van hun structuur worden de carotenoïden opgedeeld in twee groepen. Een eerste groep omvat de carotenen, die enkel uit koolstof-‐ en waterstofatomen zijn opgebouwd en waartoe onder meer α-‐caroteen, β-‐ caroteen en lycopeen behoren (Figuur 1.1). Bij de tweede groep, de xanthofyllen, bevatten de carotenoïden één of meer zuurstof bevattende functionele groepen. De voornaamste xanthofyllen zijn luteïne en zeaxanthine (Figuur 1.1) (Tapiere et al., 2004; DellaPenna & Pogson, 2006). Lycopeen is een lineair carotenoïde met 13 dubbele bindingen waarvan er 11 geconjugeerd zijn. β-‐caroteen en zeaxanthine dragen twee β-‐ionone ringen in hun structuur, terwijl α-‐caroteen en luteïne zowel een β-‐ionone als een ε-‐ionone ring bevatten. In het geval van luteïne en zeaxanthine zijn deze ringen evenwel gesubstitueerd met een hydroxylgroep (Figuur 1.1) (Tapiero et al., 2004). Door de aanwezigheid van de vele dubbele bindingen zijn verschillende configuraties mogelijk, aangezien elke dubbele binding in de cis-‐ of transconfiguratie kan voorkomen. De all-‐transconfiguratie is de meest voorkomende vorm in de natuur (Britton, 1995).
Figuur 1.1: Structuur van de carotenoïden lycopeen, β-‐caroteen, α-‐caroteen, luteïne en zeaxanthine (naar DellaPenna & Progson, 2006). 1.2.2.2.
Biosynthese
De biosynthese van de carotenoïden in tomaat (Figuur 1.2) start met de condensatie van vier C5 isopreen eenheden, namelijk isopentenyl pyrofosfaat (IPP), tot een C20 geranylgeranylpyrofosfaat (GGPP). Condensatie van twee GGPP moleculen geeft aanleiding tot de vorming van een eerste carotenoïde, namelijk phytoeen. Deze koppeling wordt gekatalyseerd door het enzym phytoeen synthase (PSY). Vervolgens worden geconjugeerde dubbele bindingen gevormd met behulp van twee enzymen, namelijk phytoeen desaturase
6
(PDS) en ζ-‐caroteen desaturase (ZDS). Na het invoeren van 4 dubbele bindingen wordt cis-‐ lycopeen verkregen. De omzetting naar all-‐trans-‐lycopeen gebeurt door het carotenoïd isomerase (CRTISO). Vanuit all-‐trans-‐lycopeen kunnen dan de andere carotenoïden gevormd worden door cyclisatie. Om α-‐caroteen en luteïne te vormen moet een β-‐ring en een ε-‐ring gevormd worden, om β-‐caroteen en zeaxanthine te vormen twee β-‐ringen. α-‐caroteen wordt gevormd uit lycopeen met behulp van de enzymen lycopeen β-‐cyclase (βLCY) en lycopeen ε-‐cyclase (εLCY). Hydroxylatie van de ringen door β-‐hydroxylase (βOHase) en ε-‐ hydroxylase (εOHase) geeft aanleiding tot het xanthofyl luteïne. β-‐caroteen wordt eveneens gevormd uit lycopeen waarbij het enzym lycopeen β-‐cyclase (βLCY) in staat voor het inbrengen van twee β-‐ringen in de structuur. Zeaxanthine wordt gevormd door hydroxylatie van deze ringen met behulp van het β-‐hydroxylase (βOHase) (Tanaka et al., 2008; DellaPenna & Progson, 2006).
Figuur 1.2: De biosynthese pathway van de belangrijkste carotenoïden (DellaPenna & Progson, 2006).
7
1.3.
ANALYSE VAN CAROTENOÏDEN IN TOMAAT
1.3.1. Extractie van carotenoïden uit tomaat Bij de extractie van carotenoïden uit tomaat is het belangrijk dat de carotenoïde structuren zo weinig mogelijk worden blootgesteld aan licht, zuurstof, hoge temperaturen en pro-‐oxidatieve metalen, aangezien hierdoor auto-‐oxidatie en isomerisatie kan optreden (Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006). Tijdens het extractieproces wordt vaak vloeistof-‐vloeistofextractie toegepast waarbij het aangewende extractiesolvent bestaat uit een polair en apolair solvent. Als organische solventen wordt daarbij vaak gebruik gemaakt van methanol, tetrahydrofuraan, diëthylether of chloroform (Oliver & Palou, 2000; Garrido Frenich et al., 2005). Om de carotenoïden te beschermen tegen oxidatie wordt meestal een synthetisch antioxidant, zoals butylhydroxytolueen (BHT), toegevoegd. In bepaalde gevallen wordt na deze extractie nog een vaste fase extractie (SPE) uitgevoerd voor verdere opzuivering van het extract (Maiani et al., 2009; Gómez-‐Romero et al., 2007). 1.3.2. Chromatografische scheiding van carotenoïden Voor de chromatografische scheiding van de carotenoïden, aanwezig in het bekomen extract, wordt voornamelijk voor hoge performantie vloeistof chromatografie (HPLC) geopteerd (Maiani et al., 2009; Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006; Rivera & Canela-‐Garayoa, 2012). Daarbij wordt vaak gebruik gemaakt van een omgekeerde fase kolom met een C18 of een C30 stationaire fase. C30 kolommen zijn speciaal ontwikkeld om hydrofobe,
lange
keten,
structuurgerelateerde
isomeren
te
scheiden
(http://www.ymc.co.jp/en/columns/ymc_carotenoid/). In vergelijking met C18 kolommen, zorgen ze voor een betere scheiding van zowel polaire als niet-‐polaire carotenoïden en geometrische isomeren (Maiani et al., 2009). Meer en meer wordt er ook gebruik gemaakt van ultra hoge performantie vloeistofchromatografie (UHPLC), dewelke zorgt voor een kortere analysetijd en/of een hogere chromatografische resolutie (Rivera & Canela-‐Garayoa, 2012). 1.3.3. Reeds toegepaste methoden voor detectie van carotenoïden De detectie van de verschillende carotenoïden in een staal kan uitgevoerd worden via massaspectrometrie (MS) of spectrofotometrie (Rivera & Canela-‐Garayoa, 2012). In het geval van MS worden de componenten eerst geïoniseerd waarbij gebruik gemaakt kan
8
worden van verschillende ionisatiebronnen zoals atmosferische druk chemische ionisatie (APCI), electrospray ionisatie (ESI) of verwarmde electrospray ionisatie (HESI). In het geval van de apolaire carotenoïde componenten wordt vaak geopteerd voor APCI-‐ionisatie (Figuur 1.3).
Figuur 1.3: Voorstelling van atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) (Thermo Scientific). APCI is een ionisatietechniek waarbij componenten geïoniseerd worden onder atmosferische druk. Het wordt vooral gebruikt voor de ionisatie van polaire en niet-‐polaire componenten met een gemiddeld moleculair gewicht en geeft aanleiding tot enkelvoudig geladen ionen. Bij het gebruik van deze ionisatiebron gaat het eluens, dat van de kolom komt, doorheen een verwarmde buis, waarbij er gasvormige moleculen ontstaan. Via een N2-‐stroom, die tevens voor extra verdamping zorgt, worden de dampmoleculen vervolgens naar de corona-‐ontladingsnaald gebracht. De verdampte mobiele fase wordt door geladen elektronen afkomstig van deze naald geïoniseerd en zorgt er via chemische reacties voor dat ook het analyt geïoniseerd wordt, waarna het gedetecteerd kan worden (de Hoffmann & Stroobant, 2007). 1.3.3.1.
Triple stage quadrupole massaspectrometrie (MS/MS)
Bij de triple stage quadrupool massaspectrometer komen na ionisatie de te detecteren componenten terecht in de triple quadrupool, dewelke bestaat uit drie compartimenten. Een quadrupool bestaat uit vier parallelle staven rond een centrale as (Figuur 1.4). Het eerste en laatste quadrupoolcompartiment vervullen een functie als massaspectrometer, het middelste compartiment doet dienst als collisiecel. In het eerste compartiment zal een ion al dan niet een stabiel traject volgen langs de centrale as, wat
9
afhankelijk is van het heersende frequentievoltage, de heersende gelijkstroom, en de massa/ladingsverhouding (m/z) van het betreffende ion. Door het frequentievoltage en de gelijkstroom te laten variëren kunnen bijgevolg ionen met een bepaalde m/z-‐waarde geselecteerd worden (Figuur 1.4). De geselecteerde ionen komen vervolgens in het tweede compartiment terecht, de collisiecel, waar fragmentatie optreedt. In het derde en laatste compartiment gebeurt de selectie van specifieke fragmentionen op basis van hun m/z-‐ waarde, zoals beschreven voor het eerste compartiment (de Hoffmann & Stroobant, 2007).
Figuur
1.4:
Voorstelling
van
één
quadrupool
massa-‐analysator
(http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-‐massspec.html) 1.3.3.2.
Linear ion trap quadrupole massaspectrometrie (MSn)
De linear ion trap quadrupole massaspectrometer bestaat uit vier parallelle hyperbolische staven. Aan het uiteinde van deze staven bevinden zich lenzen, die door middel van een bepaalde elektrisch potentiaal de ionen heen en weer laten bewegen in de quadrupool. Daarenboven maken de ionen ook oscillerende bewegingen langs de centrale as van de quadrupool waarbij de oscillatie bepaald wordt door het heersende frequentie-‐ voltage, de heersende gelijkspanning en de m/z-‐waarde van de ionen. De vier staven zijn in drie secties opgedeeld en twee van de centrale secties bevatten een opening waarlangs ionen de ion trap kunnen verlaten. Verschillende types van massaspectrometrie kunnen toegepast worden met deze analysator, zowel single-‐stage MS, MS2 en MSn. Bij MS2, waarvan in deze thesis gebruik gemaakt wordt, wordt eerst een bepaald voltage aangebracht zodat alle ionen, behalve deze met de gewenste m/z-‐waarde uit de ion trap gestoten worden via de openingen in de centrale secties. De geselecteerde ionen worden vervolgens gefragmenteerd en de
10
gevormde fragmentionen worden dan geselecteerd door graduele veranderingen aan te brengen in het voltage, waardoor ze de ion trap verlaten en naar de detector gaan in stijgende volgorde van m/z. Bij MSn gebeurt er na de eerste fragmentatie opnieuw een selectie en een fragmentatie, en dit wordt n-‐1 keer herhaald, waarna detectie optreedt (de Hoffmann & Stroobant, 2007). 1.3.3.3.
Photodiode array detector (PDA)
Bij gebruik van de PDA-‐detector wordt de aanwezigheid en de concentratie van een analyt in het extract bepaald aan de hand van het absorptiespectrum, dewelke wordt gemeten over een bepaald golflengtegebied. De detector, waarvan gebruik werd gemaakt in dit thesisonderzoek, bestaat uit een duale lichtbron, een optische bank en een fotodiode opstelling. De duale lichtbron bevat een deuteriumlamp en een tungsten-‐halogeenlamp voor de emissie van licht met golflengtes in respectievelijk het ultraviolette gebied (190-‐360 nm) en het zichtbare gebied (360-‐800 nm). In de optische bank wordt het licht, afkomstig van de deuteriumlamp en de tungsten-‐halogeenlamp, gecombineerd, waarna het doorheen de ‘flowcel’ gezonden wordt. Daar wordt het licht gedeeltelijk geabsorbeerd door het staal dat door de cel stroomt. Het licht dat de cel verlaat, wordt gedispergeerd door een diffractierooster en wordt opgevangen door de fotodiode array, waar de intensiteit van het licht bepaald wordt (Thermo Scientific, 2009). 1.3.3.4.
Detectie van carotenoïden met een PDA-‐detector, MS/MS en MSn
Bij de analyse van carotenoïden wordt vaak gebruik gemaakt van UV-‐VIS detectie, en dan vooral PDA-‐detectie aangezien deze eenvoudige methode snel en aanvaardbare resultaten oplevert. Aan de hand van het absorptiespectrum, waarbij de golflengte van de maximale absorptie van belang is, wordt de aanwezigheid van een component, die voordien geïdentificeerd werd via zijn retentietijd, bevestigd (Ortega et al., 2004; Van Meulebroek et al., 2012). Door de aanwezigheid van geconjugeerde dubbele bindingen zijn carotenoïden in staat licht te absorberen in het zichtbare gebied over het golflengtegebied van 400 tot 500 nm (Rivera & Canela-‐Garayoa, 2012). Aangezien verschillende carotenoïden echter vaak absorptie vertonen bij dezelfde golflengtes is een voorafgaande chromatografische scheiding vereist opdat geen interferentie zou optreden (Fang et al., 2003). Detectie via tandem (MS/MS) of multiple (MSn) massaspectrometrie levert echter meer betrouwbare resultaten
11
op en is een selectievere methode voor de identificatie van carotenoïden in een staal (Garrido Frenich et al., 2005; Fang et al., 2003). In het geval van PDA-‐detectie wordt immers enkel informatie over de chromoforen gebruikt voor identificatie, terwijl in het geval van MS/MS of MSn informatie over het moleculaire gewicht en de functionele groepen wordt aangewend (Roldán-‐Gutiérrez & Luque de Castro, 2007). Hierdoor kan bij het gebruik van MS/MS of MSn de identiteit van een carotenoïde met grotere zekerheid bepaald worden en kan een meer betrouwbare kwantitatieve analyse uitgevoerd worden (Garrido Frenich et al., 2005). Aangezien in het geval van MS/MS en MSn selectiviteit wordt gerealiseerd door opeenvolgende selectie van specifieke (fragment)ionen is een full-‐scan analyse niet mogelijk (Nielen et al., 2007). 1.3.4. Hoge resolutie Orbitrap massaspectrometrie 1.3.4.1.
Algemeen principe
Een van de meest recente ontwikkelingen in de Orbitrap technologie betreft de ExactiveTM MS, waarvan gebruikt gemaakt werd in dit thesisonderzoek (Figuur 1.5). Naast de Orbitrap-‐MS bestaan ook nog andere hoge resolutie massaspectrometers, zoals de Time-‐of-‐ Flight-‐MS, de Quadrupool Time-‐of-‐Flight-‐MS en de Quadrupool Orbitrap-‐MS. Vooraleer de eigenlijke massa-‐analyse met behulp van de Orbitrap ExactiveTM MS kan optreden, worden de componenten geïoniseerd onder atmosferische druk, met behulp van bijvoorbeeld APCI. Vervolgens worden de gevormde ionen gebundeld, waarna ze ‘gevangen’ worden in de C-‐ trap, een radiofrequentie-‐afhankelijke, gebogen quadrupool. Vanuit de C-‐trap worden ze in de Orbitrap analysator geïnjecteerd, waar ze elektrostatisch gevangen worden terwijl ze rond de centrale elektrode draaien en oscilleren langs de centrale as (Figuur 1.5) (Makarov & Scigelova, 2010). De frequentie waarmee de ionen oscilleren rond de centrale as is een maat voor hun m/z-‐waarde. Alle ionen met een overeenkomstige m/z-‐waarde bewegen in een coherente axiale oscillatie (Dass, 2007). Detectie gebeurt vervolgens op basis van de tijdsfrequenties van de axiale oscillaties, welke met behulp van de Fouriertransformatie omgezet kunnen worden naar een m/z-‐spectrum. Bij dit toestel is er eveneens mogelijkheid tot fragmentatie, het betreft evenwel een niet-‐selectieve fragmentatie, waarbij geen voorafgaande selectie van specifieke precursorionen gebeurt (Makarov & Scigelova, 2010).
12
Figuur 1.5: A. De schematische voorstelling van de Orbitrap ExativeTM massaspectrometer (naar Makarov & Scigelova, 2010). B. De voorstelling van de elektrostatische trap of Orbitrap waarbij de ionen rond de centrale elektrode draaien en oscilleren langs de centrale as of z-‐as (de Hoffmann & Stroobant, 2007). 1.3.4.2.
Voordelen van Orbitrap massaspectrometrie
De belangrijkste sterktes van de Orbitrap MS betreffen de hoge massaresolutie (tot 100 000 piekbreedte op halve hoogte (FWHM)), de hoge massa-‐accuraatheid (massa-‐ afwijkingen < 5 ppm) en het groot dynamisch bereik (> 103). Voornamelijk de hoge massaresolutie en massa-‐accuraatheid van de Orbitrap MS dragen bij tot de selectiviteit van de analyse, terwijl de selectiviteit bij de eerder vermelde massaspectrometers via fragmentatie werd gewaarborgd. Aangezien bijgevolg geen voorafgaande selectie van precursorionen vereist is, biedt Orbitrap MS de mogelijkheid tot de analyse van een als het ware oneindig aantal ionen (full-‐scan analyse). Dergelijke full-‐scan analyse biedt bijgevolg mogelijkheden met betrekking tot een metabolome benadering. Aangezien bij full-‐scan analyses informatie wordt verzameld over alle in het extract aanwezige ionen, bestaat eveneens de mogelijkheid tot een retrospectieve analyse waarbij voordien niet bekende componenten alsnog bekeken kunnen worden zonder opnieuw te moeten analyseren. Door zijn hoge gevoeligheid is deze massaspectrometer ook in staat zeer lage concentraties te detecteren (Hu et al., 2005; Nielen et al., 2007; Vanhaecke et al., 2009). 1.3.5. Metabolomics Carotenoïden spelen, zoals reeds aangehaald, een belangrijke rol in diverse biologische processen en hun antioxidatieve eigenschappen worden geassocieerd met een verlaagd risico op verscheidene chronische aandoeningen (Fraser & Bramley, 2006). Daarom
13
worden carotenoïden veelvuldig bestudeerd met als doel een verbeterd inzicht te krijgen in de rol, de werking en het metabolisme van deze secundaire metabolieten. Tot op heden is de kennis omtrent de carotenoïden immers nog ver van volledig. Binnen het geschetste kader kan een metabolome benadering een waardevolle bijdrage leveren bij het verder uitdiepen van deze kennis. Bij een dergelijke metabolome benadering worden immers honderden tot duizenden metabolieten, aanwezig in het betreffende plantmateriaal, beschouwd. Hierbij wordt aldus kennis verworven over de aanwezigheid en relatieve verhoudingen van talloze metabolieten. Op die manier bezitten metabolome profileringtechnieken het potentieel om het belang van bepaalde metabolieten met betrekking tot specifieke processen aan te tonen. Hierbij kan bijvoorbeeld de aanwezigheid van een carotenoïde structuur, aanwezig in de tomatenvrucht, gerelateerd worden aan waargenomen gunstige gezondheidseffecten of kan worden nagegaan welke carotenoïden sterk beïnvloed worden door toepassing van specifieke groeicondities. Via de ‘metabolomics’ wordt aldus een kwalitatieve en kwantitatieve studie van alle, in het beschouwde biologische systeem, aanwezige metabolieten gerealiseerd (Hanhineva & Aharoni, 2009). Via deze techniek kan de volledige samenstelling aan carotenoïden in de tomatenvrucht bepaald worden en kunnen verschillende karakteristieken zoals de nutritionele waarde, de kwaliteit en de smaak bestudeerd worden (de Vos et al., 2011).
14
2. OBJECTIEVEN In dit thesisonderzoek werd getracht een analytische methode te ontwikkelen, die een metabolome benadering van de in tomaat aanwezige carotenoïden toelaat. Dergelijke benadering kan immers bijdragen tot een verdere verdieping van de kennis omtrent deze componenten, die van essentieel belang zijn voor de mens aangezien ze een remmende invloed uitoefenen op de ontwikkeling van tal van chronische ziekten. In een eerste deel van dit onderzoek werd gestreefd naar de ontwikkeling van een generisch extractieprotocol, die de extractie van alle in de tomatenvrucht aanwezige carotenoïden toelaat. De voornaamste doelstellingen bij de ontwikkeling van dit protocol waren een laag solventgebruik en een snelle staalvoorbereiding. Een tweede deel van het onderzoek omvatte het realiseren van een chromatografische scheiding van de beschouwde carotenoïden. Ondanks dat een metabolome benadering werd nagestreefd, werd gedurende de ontwikkeling van de chromatografische en andere methoden het aantal beschouwde carotenoïden beperkt tot een aantal xanthofyllen (luteïne en zeaxanthine) en carotenen (α-‐ caroteen, β-‐caroteen en lycopeen). Het derde luik van dit thesisonderzoek betrof de ontwikkeling en optimalisatie van diverse detectiemethoden, namelijk een tandem en multiple MS detectiemethode, een UV-‐VIS detectiemethode en een full-‐scan, hoge resolutie Orbitrap-‐MS detectiemethode. Vervolgens werden de ontwikkelde extractie-‐ en detectiemethoden gevalideerd op basis van een protocol, opgesteld aan de hand van Beschikking 2002/657/EG van de Europese Commissie (Europese Gemeenschap, 2002). Tijdens een laatste fase van het onderzoek werd getracht de toepasbaarheid en de metabolome profileringsmogelijkheden van de ontwikkelde full-‐scan hoge resolutie Orbitrap-‐MS methode aan te tonen. Hiertoe werden enerzijds tomatenvruchten, die zich in een verschillend ontwikkelingsstadium bevonden, geanalyseerd. Daarenboven werden ook de suikergehaltes van deze vruchten bepaald. Aan de hand van de verzamelde data kon een beeld verkregen worden van de concentratieveranderingen van de carotenoïden en suikers gedurende de vruchtontwikkeling en -‐rijping. Anderzijds werd via het softwareprogramma ToxID een screening uitgevoerd naar de aanwezigheid van een groot aantal carotenoïden in de tomatenvrucht.
15
3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1.
MATERIAAL
3.1.1. Algemeen • Analytische balans (Mettler-‐Toledo AG, Scherzenbach, Zwitserland) • Centrifuge Sorvall® RC 5C Plus (Sorvall, Connecticut, USA) • Eppendorf buisjes van 1,5 mL (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) • Eppendorf centrifuge 5417C (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) • Filters 0,22 μm (Millex, Cork, Ierland) • Gyrovap evaporator (Howe, St. Louis, USA) • Neolus naalden en Syringe spuiten (Terumo, Leuven, België) • Pasteurpipetten (VWR International, Leuven, België) • Pipet 10-‐100 μL (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) • Pipet 100-‐1000 μL (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) • Plastic proefbuizen 15 mL (Meus Srl., Piove Di Sacco, Italië) • Plastic vials (Filterservice, Eupen, België) • Vortex (Labworld Yellowline IKA, Boutersem, België) • Warmwaterbad (GFL, Grossburgwedel, Duitsland) • Wenteltoestel (Werkplaats faculteit diergeneeskunde UGent, Merelbeke, België) • Scanvac CoolSafe vriesdroogtoestel (LaboGene, Lynge, Denemarken) • TurboVap L evaporator (Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA) 3.1.2. Reagentia en chemicaliën Standaarden carotenoïden •
All-‐trans-‐lycopeen (PhytoLab GmbH & Co., Vestenbergsgreuth, Duitsland)
•
All-‐trans-‐β-‐caroteen (Sigma-‐Aldrich, St. Louis, USA)
•
All-‐trans-‐α-‐caroteen (Wako Chemicals GmbH, Neuss, Duitsland)
•
All-‐trans-‐zeaxanthine (TRC Inc., Eching, Duitsland)
•
All-‐trans-‐luteïne (Extrasynthese, Genay, Frankrijk)
Interne standaard carotenoïden •
β-‐Apo-‐8’-‐carotenal (Sigma-‐Aldrich, St. Louis, USA)
Standaarden suikers
16
•
Fructose (Merck, Darmstadt, Duitsland)
•
Glucose (Merck, Darmstadt, Duitsland)
•
Sucrose (Merck, Darmstadt, Duitsland)
Solventen voor extractie en analyse •
Acetonitrile (ACN) (Fisher Scientific, Loughborough, UK)
•
Ammoniumacetaat (NH4Ac) (Merck, Darmstadt, Germany)
•
Azijnzuur (Merck, Darmstadt, Germany)
•
Butylhydroxytolueen (BHT) (SAFC Supply Solutions, St. Louis, USA)
•
Chloroform (Fisher Scientific, Loughborough, UK)
•
Diëthylether (VWR International, Leuven, België)
•
Ethanol (Merck, Darmstadt, Germany)
•
Ethylacetaat (Merck, Darmstadt, Germany)
•
Magnesiumcarbonaat (MgCO3) (Sigma-‐Aldrich, St. Louis, USA)
•
Methanol (MeOH) (Fisher Scientific, Loughborough, UK)
•
Methyl-‐tert-‐butylether (MTBE) (Merck, Darmstadt, Duitsland)
•
Mierenzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland)
•
Ultrapuur water (Waterzuiveringstoestel Arium® 611UV, VWR, Haasrode, België)
3.1.3. Oplossingen Analyse carotenoïden: extractiesolvent, stockoplossingen en werkstandaarden •
Extractiesolvent: MTBE/MeOH (50:50, v/v) + 0,01% BHT o Voor 100 mL oplossing: 0,01 g BHT afwegen o Voor 100 mL oplossing: 50 mL MTBE en 50 mL MeOH toevoegen
•
Oplosmiddel A: ACN/MeOH/chloroform (18:7,5:74,5, v/v/v) + 0,01% BHT o Voor 100 mL oplossing: 0,01 g BHT afwegen o Voor 100 mL oplossing: 18 mL ACN, 7,5 ml MeOH en 74,5 mL chloroform toevoegen
•
Oplosmiddel B: ethanol/ACN/MeOH/chloroform (70:18:7,5:4,5, v/v/v/v) + 0,01% BHT o Voor 100 mL oplossing: 0,01 g BHT afwegen o Voor 100 mL oplossing: 70 mL ethanol, 18 mL ACN, 7,5 mL MeOH en 4,5 mL chloroform toevoegen
17
•
Stockoplossing (1 mg mL-‐1) van de interne standaard (β-‐apo-‐8’-‐carotenal) (Karppi et al., 2008): 1 mg β-‐apo-‐8’-‐carotenal afwegen en oplossen in 1 mL oplosmiddel A. Hieruit werden verschillende verdunningen aangemaakt (100 ng μL-‐1, 10 ng μL-‐1) met behulp van MTBE/MeOH (50:50, v/v) en 0,01%BHT.
•
Stockoplossing van elk carotenoïde (luteïne, zeaxanthine, α-‐caroteen, β-‐caroteen en lycopeen) (1 mg mL-‐1) (Karppi et al., 2008): van elke carotenoïde standaard 1 mg afwegen en telkens oplossen in 1 mL oplosmiddel (oplosmiddel A voor α-‐caroteen, β-‐ caroteen en lycopeen; oplosmiddel B voor luteïne en zeaxanthine). Uit elke stockoplossing werden verschillende verdunningen aangemaakt (100 ng μL-‐1, 10 ng μL-‐1, 1 ng μL-‐1) met behulp van MTBE/MeOH (50:50, v/v) en 0,01% BHT.
Analyse suikers: stockoplossingen en werkstandaarden •
Oplosmiddel: ACN/ultrapuur water (75:25, v/v) o Voor 100 mL oplossing: 75 mL ACN mengen met 25 mL ultrapuur water
•
Standaardoplossingen (1 mg mL-‐1) o Fructose: 1 mg afwegen en oplossen in 1 mL oplosmiddel o Glucose: 1 mg afwegen en oplossen in 1 mL oplosmiddel o Sucrose: 1 mg afwegen en oplossen in 1 mL oplosmiddel
3.2.
METHODEN
3.2.1. Analyse van carotenoïden, aanwezig in de tomatenvrucht 3.2.1.1.
Extractieprocedure
Voor het kunnen nemen van een representatief staal werd de tomatenvrucht eerst versneden, gevriesdroogd, vervolgens gemalen met mortier en vijzel en tenslotte gezeefd. Van het bekomen tomatenpoeder (Figuur 3.1 A) werd 25,0 mg afgewogen in een 1,5 mL Eppendorf recipiënt, waarna 0,5 mg MgCO3 werd toegevoegd om de aanwezige organische zuren te neutraliseren (Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006). Vervolgens werd 20 μL van 10 ng μL-‐1 β-‐apo-‐8’-‐carotenal, de interne standaard, en 480 μL extractiesolvent (MeOH/MTBE, 1:1, v/v + 0,01% BHT) toegevoegd. Dit werd grondig gevortext, geroteerd gedurende 15 minuten aan 1200 x g en vervolgens 5 minuten gecentrifugeerd aan 11250 x g. Het supernatans (Figuur 3.1 B) werd afgepipetteerd en overgebracht in een Eppendorf buisje. Aan het overblijvende residu werd opnieuw 500 μL extractiesolvent toegevoegd, de
18
stalen werden opnieuw gevortext, 15 minuten geroteerd en 5 minuten gecentrifugeerd. Het supernatans werd afgepipetteerd, overgebracht in het reeds vermelde Eppendorf buisje en aldus toegevoegd aan het eerder verzamelde extract. Aan het gecombineerde extract werd vervolgens 500 μL ultrapuur water toegevoegd, waardoor na vortexen visueel twee fasen ontstonden (Figuur 3.1 C). De bovenste apolaire MTBE-‐fase, dewelke de carotenoïden bevatte, werd afgepipetteerd en overgebracht in vials voor analyse. A. B. C. Figuur 3.1: A. Een weergave van het gehomogeniseerd tomatenpoeder. B. Het tomatenpoeder na uitvoering van de eerste extractiefase. C. De visuele fasescheiding na toevoeging van ultrapuur water aan het verzamelde extract. 3.2.1.2.
Chromatografische instrumentatie
De TSQ-‐MS, gekoppeld aan de PDA detector, was uitgerust met een Thermo Accela UHPLC-‐systeem (Thermo Scientific, Leicestershire, VK), dewelke een Accela pomp en een Accela autosampler omvat. De Orbitrap ExactiveTM MS is eveneens uitgerust met een Thermo Accela UHPLC-‐systeem (Thermo Scientific, Leicestershire, VK), bestaande uit een Accela 1250 pompsysteem, gekoppeld aan een Accela autosampler. De LTQ-‐MS is uitgerust met een Finnigan Surveyor HPLC-‐systeem (Thermo Electron, San Jose, USA), welke een Finnigan Surveyor MS Pump Plus pompsysteem en een Finnigan Surveyor autosampler Plus bevat. De chromatografische scheiding van de carotenoïden werd gerealiseerd met behulp van een Acclaim C30 kolom (3 μm partikelgrootte, 150 mm x 4,6 mm interne diameter) (Dionex Corporation, Californië, USA). De kolomoventemperatuur werd voor de chromatografische toepassing in het geval van zowel de TSQ-‐PDA als de Orbitrap ExactiveTM op 22 °C ingesteld en voor de LTQ op 20 °C. Als mobiele fase werden vier solventen gebruikt: ultrapuur water, ethylacetaat/MeOH (50:50, v/v), 0,04 g L-‐1 NH4Ac in MeOH en ACN, het
19
debiet bedroeg 1000 μL min-‐1. De gradiënt werd voor elk toestel individueel geoptimaliseerd in functie van het gekoppelde (U)HPLC-‐pompsysteem en wordt weergegeven in Tabel 3.1 voor de TSQ-‐MS-‐PDA, in Tabel 3.2 voor de LTQ-‐MS en in Tabel 3.3 voor de Orbitrap ExactiveTM MS. Het injectievolume bedroeg telkens 10 μL. Tabel 3.1: Gradiënt voor de triple stage quadrupool massaspectrometer. Solvent A is ultrapuur water, solvent B is ethylacetaat/MeOH (50:50, v/v), solvent C is ACN en solvent D is 0,04 g L-‐1 NH4Ac in MeOH. Het debiet bedroeg 1000 μL min-‐1 en de kolomoventemperatuur 22°C. Tijd (min) 0,00 4,00 7,50 15,00 24,00 32,00 39,90 40,00 49,90 50,00 55,00
Solvent A Solvent B Solvent C Solvent D (%) (%) (%) (%) 0,5 2 13,5 84 0,5 2 13,5 84 0,5 17,5 13,5 68,5 0,5 35 13,5 51 0,5 35 13,5 51 0,5 60 5 34,5 0,5 90 0 9,5 0,5 99,5 0 0 0,5 99,5 0 0 0,5 2 13,5 84 0,5 2 13,5 84
Tabel 3.2: Gradiënt voor de linear ion trap quadrupool massaspectrometer. Solvent A is ultrapuur water, solvent B is ethylacetaat/MeOH (50:50, v/v), solvent C is ACN en solvent D is 0,04 g L-‐1 NH4Ac in MeOH. Het debiet bedroeg 1000 μL min-‐1 en de kolomoventemperatuur 20°C. Tijd (min) 0,00 4,00 7,50 15,00 24,00 25,00 27,00 27,10 40,00 49,90 50,00 55,00
Solvent A Solvent B Solvent C Solvent D (%) (%) (%) (%) 0,5 1 13,5 85 0,5 1 13,5 85 0,5 16 13,5 70,5 0,5 35 13,5 51 0,5 35 13,5 51 0,5 60 13,5 26 0,5 60 13,5 26 0,5 89,5 5 5 0,5 99,5 0 0 0,5 99,5 0 0 0,5 1 13,5 85 0,5 1 13,5 85 20
Tabel 3.3: Gradiënt voor de Orbitrap ExactiveTM massaspectrometer. Solvent A is ultrapuur water, solvent B is ethylacetaat/MeOH (50:50, v/v), solvent C is ACN en solvent D is 0,04 g L-‐1 NH4Ac in MeOH. Het debiet bedroeg 1000 μL min-‐1 en de kolomoventemperatuur 22°C. Tijd (min) 0,00 4,00 8,00 15,00 20,00 26,00 32,00 34,00 40,00 49,90 50,00 55,00
Solvent A (%) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Solvent B (%) 2 2 25 35 35 75 85 95 99,5 99,5 2 2
Solvent C (%) 13,5 13,5 32,5 22,5 22,5 17,5 7,5 0 0 0 13,5 13,5
Solvent D (%) 84 84 42 42 42 7 7 4,5 0 0 84 84
3.2.1.3.
Massaspectrometrie en UV-‐VIS-‐spectrofotometrie
Voor de detectie van carotenoïden in tomaatextract werden verschillende detectiemethoden gehanteerd. Tandem en multiple MS werd toegepast met behulp van respectievelijk de triple stage quadrupool MS (TSQ) en de linear ion trap quadrupool MS (LTQ). Detectie via hoge resolutie MS gebeurde met behulp van de Fourier Transform ExactiveTM Orbitrap MS. Naast MS-‐detectie werd eveneens UV-‐VIS detectie toegepast met behulp van een PDA detector. Aangezien in het geval van UV-‐VIS spectrofotometrie een niet-‐ destructief detectieprincipe wordt toegepast, kon de PDA-‐detector in serie gekoppeld worden aan de TSQ-‐MS. Triple stage quadrupool massaspectrometer (TSQ-‐MS) Voor de analyse van de carotenoïden met behulp van tandem MS werd gebruik gemaakt van de TSQ-‐MS (Thermo Fisher Scientific, San Jose, USA). Ionisatie van de componenten gebeurde via APCI in positieve ionisatiemodus. De geselecteerde bronposities, resulterend in een optimale ionisatie-‐efficiëntie voor het merendeel van de componenten, betroffen C, 0 en 1,5. De parameters gerelateerd aan de ionisatie werden geoptimaliseerd op basis van voornamelijk de piekoppervlakte, piekintensiteit en signaal-‐ruisverhouding (Tabel 3.4). De parameters voor fragmentatie van de carotenoïden werden eveneens
21
geoptimaliseerd en worden weergegeven in Tabel 3.5. Tabel 3.4: Geoptimaliseerde TSQ-‐MS parameters voor de ionisatie van de beschouwde carotenoïden. Parameter Capillaire temperatuur (°C) Verdampingstemperatuur (°C) Auxiliary gas debiet (aua) Sheath gas debiet (au) Ion sweep gas debiet (au) Ontladingsstroom (μA)
Waarde 250 370 5 40 2 5
a: arbitraire eenheden (arbitrary units)
Tabel 3.5: Geoptimaliseerde TSQ-‐MS parameters voor de fragmentatie van de beschouwde carotenoïden. Component β-‐Apo-‐8'-‐carotenal Luteïne Zeaxanthine α-‐caroteen, β-‐ caroteen, lycopeen
Precursorion (m/z) 417,045 417,045 417,045 417,045 551,062 551,062 551,062 551,062 569,056 569,056 569,056 569,056 569,056 569,056 569,056 569,056
Production (m/z) 91,044 95,045 105,034 118,996 91,001 105,051 119,042 145,039 90,919 105,056 107,115 118,969 90,919 105,056 107,115 118,969
Collisie-‐energie (eV) 45 26 36 32 60 49 34 31 60 52 31 42 60 52 31 42
537,195 537,195 537,195 537,195
118,956 123,002 132,993 194,673
45 34 32 44
22
Photodiode array detector (PDA) De detectie van de beschouwde carotenoïden via UV-‐VIS gebeurde met behulp van een PDA-‐detector (Thermo Fisher Scientific, San Jose, USA), gekoppeld aan de TSQ-‐MS. Na elutie van de kolom migreren de componenten rechtstreeks naar de PDA-‐detector en worden bijgevolg nog niet geïoniseerd. Het golflengtegebied waarover gescand werd bedroeg 400 – 500 nm. Het absorptiemaximum van elke component worden weergegeven in Tabel 3.6. Tabel 3.6: Het absorptiemaximum van de beschouwde carotenoïden. Component
Absorptiemaximum (nm)
β-‐Apo-‐8'-‐carotenal Luteïne Zeaxanthine α-‐caroteen β-‐caroteen Lycopeen
458 445 475 458 446 473
Linear ion trap quadrupool massaspectrometer (LTQ-‐MS) Multiple MS werd toegepast met behulp van de LTQ-‐MS (Thermo Fisher Scientific, San Jose, USA). Ionisatie van de componenten gebeurde via APCI waarbij de positieve ionisatiemodus werd ingesteld. De optimale bronposities betroffen C, 0 en 1,25. De parameters, gerelateerd aan de ionisatie, werden geoptimaliseerd op basis van voornamelijk de piekoppervlakte, piekintensiteit en signaal-‐ruisverhouding (Tabel 3.7). De parameters voor fragmentatie van de carotenoïden werden eveneens geoptimaliseerd en worden weergegeven in Tabel 3.8. Tabel 3.7: Geoptimaliseerde LTQ-‐MS parameters voor de ionisatie van de beschouwde carotenoïden. Parameter Capillaire temperatuur (°C) Verdampingstemperatuur (°C) Auxiliary gas debiet (aua) Sheath gas debiet (au) Ion sweep gas debiet (au) Ontladingsstroom (μA)
Waarde 150 300 5 20 2 5
a: arbitraire eenheden (arbitrary units)
23
Tabel 3.8: Geoptimaliseerde LTQ-‐MS parameters voor de fragmentatie van de beschouwde carotenoïden. Component β-‐Apo-‐8'-‐carotenal Luteïne Zeaxanthine α-‐caroteen, β-‐ caroteen, lycopeen
Precursorion Production (m/z) (m/z) 417,30 293,31 417,30 321,30 417,30 333,19 417,30 361,32 551,30 397,38 551,30 429,33 551,30 495,37 551,30 533,46 569,30 338,25 569,30 429,40 569,30 430,21 569,30 476,38 569,30 411,45 569,30 415,33 569,30 429,33 569,30 551,46 537,40 537,40 537,40 537,40
347,35 399,39 413,42 455,51
Collisie-‐energie (eV) 35 35 35 35 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
Fourier Transform ExactiveTM Orbitrap massaspectrometer Full-‐scan massaspectrometrische analyse werd uitgevoerd met de Fourier Transform ExactiveTM Orbitrap-‐MS (Thermo Fisher Scientific, San Jose, USA) (Figuur 3.2), uitgerust met een APCI ionisatiebron in positieve modus. De ionisatiebron werd ingesteld op diepte C, zijwaartse positie 0 en positie in het vlak 1,25. Dagelijkse kalibratie van het toestel werd uitgevoerd door infusie van een positief en negatief geladen kalibratiemengsel (Thermo Fisher Scientific, San Jose, USA). De parameters voor ionisatie werden geoptimaliseerd en ingesteld zoals weergegeven in Tabel 3.9.
24
Figuur 3.2: De Fourier Transform ExactiveTM Orbitrap massaspectrometer gebruikt voor de analyse van carotenoïden in tomaat. Tabel 3.9: Geoptimaliseerde Orbitrap ExactiveTM MS parameters voor ionisatie van de beschouwde carotenoïden.
Parameter Waarde Capillaire temperatuur (°C) 175 Verdampingstemperatuur (°C) 275 a Auxiliary gas debiet (au ) 5 Sheath gas debiet (au) 35 Ion sweep gas debiet (au) 1 Ontladingsstroom (μA) 5 a: arbitraire eenheden (arbitrary units)
De m/z scan range werd ingesteld van 100 tot 800 en de resolutie bedroeg 100 000 FWHM aan 1 Hz (1 scan per seconde). De ‘automatic gain control’ (AGC) werd ingesteld op ‘high dynamic range’ (5 x e6 ionen) en de maximale injectietijd bedroeg 50 ms. Er werd geen gebruik gemaakt van de HCD-‐cel. De gemeten en theoretische massa over lading (m/z) verhoudingen voor de beschouwde carotenoïden en de interne standaard, en de massa-‐ afwijking (in ppm) tussen de gemeten en theoretische m/z worden weergegeven in Tabel 3.10.
25
Tabel 3.10: Gemeten en theoretische massa over lading (m/z) verhoudingen voor de beschouwde carotenoïden en de interne standaard, en de massa-‐afwijking (in ppm) tussen de gemeten en de theoretische m/z. Component β-‐Apo-‐8'-‐carotenal Luteïne Zeaxanthine α-‐caroteen β-‐caroteen Lycopeen
Gemeten m/z Theoretische m/z 417, 31492 551,42382 569,43391 537,44488 537,44474 537,44486
417,31519 551,42474 569,43531 537,44548 537,44548 537,44548
Massa-‐ afwijking (ppm) -‐0,653 -‐1,674 -‐1,398 -‐1,113 0,180 -‐1,150
3.2.1.4.
Validatie van de analyseprocedures
Aangezien geen specifieke richtlijnen bestaan voor de validatie van methoden, geschikt voor de analyse van carotenoïden in plantaardig materiaal, werd Beschikking 2002/657/EG van de Europese Commissie (Europese Gemeenschap, 2002) als basis gebruikt voor het opstellen van een validatieprotocol. Daarbij was echter geen blanco referentiemateriaal beschikbaar en werd daarom geopteerd om groene tomatenvruchten te gebruiken als matrix voor validatie van de geoptimaliseerde extractieprocedure en de ontwikkelde detectiemethoden. Hiervoor werd het gevriesdroogde materiaal van diverse groene tomaten samengevoegd en gehomogeniseerd. Op die manier was voldoende, homogeen plantmateriaal voorhanden om de validatie te kunnen uitvoeren. Voor deze validatie werden vijf carotenoïden in beschouwing genomen, namelijk drie carotenen (α-‐caroteen, β-‐caroteen en lycopeen) en twee xanthofyllen (luteïne en zeaxanthine). De prestatiekenmerken die geëvalueerd werden, waren de lineariteit, specificiteit, herhaalbaarheid, intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid, terugvinding, detectie-‐ en kwantificatielimiet. Lineariteit Via de lineariteit kan aangetoond worden of er al dan niet een rechtlijnig verband bestaat tussen de respons en de concentratie van een bepaalde component binnen vastgelegde concentratiegrenzen. Om de lineariteit van de ontwikkelde methodes te evalueren werden kalibratiecurven opgesteld voor elk van de beschouwde carotenoïden.
26
Voor het opstellen van deze kalibratiecurven werden in deze studie telkens zes verschillende concentratieniveaus (Tabel 3.11) beschouwd. Hiervoor werd van elke carotenoïdestandaard telkens een gepaste hoeveelheid toegevoegd aan in totaal zes stalen, die aldus telkens 25 mg groen vruchtweefsel bevatten. Tabel 3.11: Concentraties van de carotenoïden en de interne standaard waarmee de standaardreeksen werden opgesteld, uitgedrukt in ng μL-‐1. Deze concentraties hebben betrekking op de finale concentraties zoals ze in het extract werden aangetroffen (exclusief de eventuele bijdrage vanwege het plantmateriaal zelf). α-‐caroteen β-‐caroteen 0,10 0,25 0,75 1,50 1,00 2,00 1,50 3,00 3,00 4,00 5,00 5,00
Lycopeen 0,10 0,75 1,00 1,50 3,00 5,00
Luteïne 0,50 2,00 2,50 3,50 5,00 7,50
Zeaxanthine β-‐Apo-‐8'-‐carotenal 0,50 1,00 1,00 1,00 2,00 1,00 2,50 1,00 5,00 1,00 7,50 1,00
Specificiteit Via de specificiteit wordt bepaald of de methode in staat is een onderscheid te maken tussen de te bepalen componenten en andere nauw verwante stoffen zodat een ondubbelzinnige detectie en kwantificatie gerealiseerd kan worden. Voor de evaluatie van de specificiteit werden 12 ‘blanco’ stalen geanalyseerd. Deze blanco stalen betreffen plantmateriaal dat niet werd aangerijkt met carotenoïdestandaarden. Deze stalen konden evenwel carotenoïden van endogene (van het plantmateriaal zelf) oorsprong bevatten Precisie (herhaalbaarheid en intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid) De herhaalbaarheid en intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid werden onderzocht om de precisie van de ontwikkelde methodes na te gaan. Precisie is een maat voor de overeenstemming tussen de verkregen resultaten van onafhankelijk van elkaar verrichte analyses onder vastgelegde omstandigheden. Om de herhaalbaarheid van de ontwikkelde methodes te bepalen, werden drie reeksen van zes stalen geanalyseerd. Daarbij werd, voor aanvang van de eigenlijke extractie, elke reeks stalen met een specifieke hoeveelheid van elke van de beschouwde carotenoïden aangerijkt. Op basis van de endogene concentraties, vastgesteld bij zowel rode en groene
27
tomaten, werd een standaard aanrijkingsniveau bepaald. Aan elke reeks werd vervolgens een bepaalde hoeveelheid van elke standaard toegevoegd met als doel het bekomen van een finale concentratie in het eindextractie van respectievelijk 0,5; 1 en 1,5 keer het standaard aanrijkingsniveau. De concentratieniveaus worden weergegeven in Tabel 3.12. Analyse werd uitgevoerd door eenzelfde persoon onder herhaalbare omstandigheden. De intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid werd eveneens nagegaan door drie reeksen van zes stalen van groene tomaat te beschouwen, waarbij dezelfde concentraties aan carotenoïden werden nagestreefd als deze vermeld bij de evaluatie van de herhaalbaarheid (Tabel 3.12). Deze stalen werden op andere dagen en door een andere persoon geanalyseerd dan die van de herhaalbaarheid. De evaluatie van de herhaalbaarheid en de intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid wordt uitgevoerd door de relatieve standaarddeviatie op de berekende concentraties (gecorrigeerd met de endogene concentraties) te bepalen. Tabel 3.12: Concentraties van de carotenoïden en de interne standaard voor het bepalen van de herhaalbaarheid en intra-‐laboratoriumreproduceerbaarheid, uitgedrukt in ng μL-‐1. Reeks 1
α-‐ caroteen 0,50
β-‐ caroteen 1,00
Lycopeen
Luteïne
Zeaxanthine
0,50
1,25
1,25
β-‐Apo-‐8'-‐ carotenal 1,00
Reeks 2
1,00
2,00
1,00
2,50
2,50
1,00
Reeks 3
1,50
3,00
1,50
3,75
3,75
1,00
Terugvinding De terugvinding is een parameter, die aangeeft welke fractie van het in het uitgangsmateriaal aanwezige analyt na extractie in het finale extract teruggevonden kan worden. Deze parameter wordt uitgedrukt als een percentage ten opzichte van de doelwaarde. Aangezien geen gecertificeerd referentiemateriaal beschikbaar was, werd de terugvinding bepaald door drie reeksen van zes stalen te gebruiken waarbij aan elke reeks een bepaalde hoeveelheid van elke carotenoïde standaard toegevoegd werd met als doel een finale concentratie van respectievelijk 0,5; 1 en 1,5 keer het standaard aanrijkingsniveau in het finale extract te bereiken (Tabel 3.12). De endogene carotenoïde concentraties vastgesteld bij zowel groene als rode tomaten werden gebruikt om het standaard
28
aanrijkingsniveau te bepalen. Detectie-‐ en kwantificatielimiet De detectielimiet (LOD) is de concentratie waarbij een analyt een signaal-‐ ruisverhouding van minimaal drie heeft en waarbij de aanwezigheid van een analyt vastgesteld kan worden. De kwantificatielimiet (LOQ) is de concentratie waarbij een analyt een signaal-‐ruisverhouding van minimaal tien heeft en correct gekwantificeerd kan worden. Voor bepaling van de LOD en LOQ-‐waarde werd gebruik gemaakt van de stalen, geanalyseerd voor bepaling van de kalibratiecurven. Hierbij werd de relatie tussen concentratie en signaal-‐ruisverhouding gebruikt om een inschatting te maken van de LOD en LOQ. Experimentele bepaling van de LOD en LOQ was immers niet steeds mogelijk doordat geen blanco referentiemateriaal beschikbaar was. 3.2.1.5.
Kwantificatie van carotenoïden in tomaat
De concentraties van de carotenoïden, aanwezig in tomatenvruchten, werden bepaald aan de hand van standaardcurven met β-‐apo-‐8’-‐carotenal als interne standaard. De gebruikte concentraties α-‐caroteen, β-‐caroteen, lycopeen, luteïne, zeaxanthine en β-‐apo-‐8’-‐ carotenal voor het opstellen van deze standaardcurven worden weergegeven in Tabel 3.11. Stalen van groene tomaat, waarvan het natuurlijk gehalte aan deze carotenoïden op voorhand bepaald werd, werden aangerijkt met deze concentratieniveaus. De standaardcurven geven het verband weer tussen de gekende carotenoïdeconcentraties en de piekoppervlakteverhouding. Deze verhouding betreft de piekoppervlakte van een carotenoïde ten opzichte van de piekoppervlakte van de interne standaard. 3.2.2. Analyse van suikers, aanwezig in de tomatenvrucht 3.2.2.1.
Extractieprocedure
De extractieprocedure die gebruikt werd voor de analyse van suikers in tomaat werd reeds eerder geoptimaliseerd en was gebaseerd op de extractieprocedures beschreven door Klann et al. (1996) en Stommel (1992). Voor de extractie van fructose, glucose en sucrose uit tomaat werd 100 mg tomatenpoeder afgewogen waaraan 4 mL ethanol werd toegevoegd. Na grondig vortexen werden de stalen gedurende 10 minuten in een warmwaterbad van 70 °C geplaatst en vervolgens 3 uur in een warmwaterbad van 45 °C. Vervolgens werden de
29
stalen gedurende 10 minuten gecentrifugeerd (5000 x g, 8 °C) en werd 1,5 mL van het supernatans, waarin de suikers zich bevinden, overgebracht in vials voor analyse. 3.2.2.2.
Analyseprocedure
Chromatografische scheiding van de verschillende componenten gebeurde met een Prevail Carbohydrate ES kolom (5 μm partikelgrootte, 250 x 4,6 mm interne diameter). Als mobiele fase werd gebruik gemaakt van ACN en ultrapuur water. Er werd gebruik gemaakt van een isocratisch systeem van 75% ACN en 25% ultrapuur water dat gedurende 25 minuten werd aangehouden. Het debiet bedroeg 750 μL min-‐1 en het injectievolume was 8 μL. Voor de analyse van de suikers werd gebruik gemaakt van de Alltech® 3300 Evaporative Light Scattering Detection (ELSD) (Grace, Illinois, USA), een detectiemethode waarbij drie verschillende stadia worden doorlopen. Het effluent, afkomstig van de kolom, komt terecht in de ‘nebulizer’, waar het gemengd wordt met stikstofgas om een aerosol te vormen van druppeltjes met uniforme grootte. De grootte van deze druppeltjes is afhankelijk van het gasdebiet en bepaalt eveneens de gevoeligheid van de detectie. Vervolgens worden de vluchtige moleculen verdampt ter hoogte van de ‘drifting tube’. De optimale temperatuur is afhankelijk van de samenstelling van de mobiele fase, het debiet van de mobiele fase en van de vluchtigheid van het staal. De damp van de mobiele fase transporteert vervolgens de niet-‐vluchtige componenten naar de optische cel. Hierin wordt licht, afkomstig van een laserlichtbron, door de niet-‐vluchtige componenten verstrooid. Het verstrooide licht wordt vervolgens gedetecteerd door een fotodiode, dewelke een signaal genereert dat proportioneel is met de massa van het beschouwde partikeltje (Grace Davison Discovery Sciences, 2009). De condities voor analyse waren een verdampingstemperatuur van 40 °C, een N2-‐ druk van 4 bar, een gasdebiet van 1,5 L min-‐1 en een gain van 4. 3.2.2.3.
Kwantificatie van suikers in tomaat
De concentraties van de suikers in het extract werden bepaald aan de hand van standaardcurven. Voor zowel fructose, glucose en sucrose werd een ijklijn opgesteld, waarvan de hoeveelheden (in μg) die op kolom werden gebracht weergegeven zijn in Tabel
30
3.13. De standaardcurve werd aangemaakt in ACN/ultrapuur water (75:25, v/v). Tabel 3.13: Hoeveelheden (in μg) fructose, glucose en sucrose, die op kolom werden gebracht voor het opstellen van de standaardcurven. Fructose (μg) Glucose (μg) 2,50 2,50 5,00 5,00 7,50 7,50 10,00 10,00 12,50 12,50 15,00 15,00 17,50 17,50 20,00 20,00
Sucrose (μg) 0,10ND 0,25 0,35 0,50 0,75 1,00 2,50 5,00
ND: niet gedetecteerd
3.2.3. Evolutie van de vruchtsamenstelling in functie van het ontwikkelingsstadium De evolutie van de carotenoïde-‐ en suikergehaltes in functie van het ontwikkelingsstadium werd geëvalueerd door analyse van telkens drie tomatenvruchten uit een verschillend ontwikkelingsstadium. Hierbij werden vijf ontwikkelingsstadia beschouwd, namelijk 22 – 30 dagen na anthesis, 31 – 39 dagen na anthesis, 40 – 48 dagen na anthesis, 49 – 57 dagen na anthesis en 58 of meer dagen na anthesis. De tomatenplanten waarvan de vruchten afkomstig waren, werden onder normale teeltcondities geteeld (Van Meulebroek et al., 2012), de oogst van de vruchten gebeurde op 13/12/2011. 3.2.4. Metabolome profilering van een groene tomatenvrucht De metabolome profilering van een groene tomatenvrucht werd gerealiseerd met het softwareprogramma ToxID (Thermo Fisher Scientific, San Jose, USA). Hiermee kan een screening naar een groot aantal carotenoïden gegenereerd worden op basis van de geïmplementeerde moleculaire formules. Bevestiging van de aanwezigheid van een component gebeurde op basis van minstens twee diagnostische ionen, namelijk het H+-‐ adduct en het overeenkomstig 13C isotopisch ion. Het isotopisch ion werd enkel aanzien als een diagnostisch ion wanneer het H+-‐ion ook gedetecteerd werd en de isotopische ratio’s voldeden aan de eisen van Beschikking 2002/657/EG van de Europese Commissie (Europese Gemeenschap, 2002). De geteste database bevatte 50 carotenoïden (De Rosso & Mercadante, 2007). Een minimum piekintensiteit van 1000 en een maximale massa-‐ afwijking van 5 ppm werden ingesteld.
31
4. RESULTATEN 4.1.
ANALYSE VAN CAROTENOÏDEN IN TOMAAT
4.1.1. Extractieprocedure De procedure voor extractie van de carotenoïden uit tomaat was bij aanvang van deze masterthesis reeds gedeeltelijk geoptimaliseerd. Deze optimalisatie werd uitgevoerd met behulp van een d-‐optimaal design. Deze techniek betreft een fractioneel factorieel design en laat toe om op een efficiënte wijze parameters te selecteren, die een bepalende invloed hebben op de extractie-‐efficiëntie. Selectie van diverse parameters en hun waarden gebeurde op basis van de literatuur (Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006; Hao et al., 2005; Lin & Chen, 2003; Lee et al., 2001) en toepassing van het d-‐optimaal design liet toe te stellen dat een hoeveelheid van 25 mg plantmateriaal, MTBE/MeOH (50:50, v/v) als extractiesolvent, 500 μL als extractievolume, een meervoudige extractie (twee extractiefasen) en de toevoeging van MgCO3 optimale parameters waren voor een efficiënte extractie van de beschouwde carotenoïden. In deze masterthesis werd een verdere optimalisatie van de gedeeltelijk ontwikkelde procedure nagestreefd. Daarbij werden aanpassingen doorgevoerd, die zich voornamelijk richtten op een verlaging van de detectielimieten en de opzuivering van het extract. Voor de optimalisatie van de extractieprocedure werd gebruik gemaakt van rode tomatenvruchten aangezien de vijf beschouwde carotenoïden allen van nature aanwezig waren. De procedure bij aanvang van deze optimalisatie is sterk gelijkaardig aan deze beschreven onder paragraaf 3.2.1.1: afwegen van 25 mg plantmateriaal, toevoegen van interne standaard en MgCO3, uitvoeren van een tweevoudige extractiefase. Het bekomen extract (± 1 mL) werd vervolgens nagenoeg drooggedampt in de TurboVap (40 °C, 10 min) en vervolgens heropgelost in 200 μL MTBE/MeOH (50:50, v/v). Analyse van deze stalen toonde aan dat het extract niet voldoende opgezuiverd was; vandaar dat er getracht werd het extract op te zuiveren door gebruik te maken van een Millex filter met een poriegrootte van 22 μm. Het verzamelde extract (± 1 mL) werd eerst gefiltreerd, dan pas ingedampt en vervolgens heropgelost in 200 μL MTBE/MeOH (50:50, v/v). Bij toepassing van de filter werd ook 300 μL MTBE gebruikt om het aandeel aan carotenoïden, eventueel geadsorbeerd aan de filter, tot een minimum te beperken. Analyse van deze stalen gaf echter geen verbetering van de
32
zuiverheid, wat werd aangegeven door de aanwezigheid van interferende pieken in het bekomen chromatogram. In een volgend experiment werd het extractiesolvent MTBE/MeOH (50:50, v/v) met 0,01% BHT vervangen door 100% MTBE met 0,01% BHT, met als doel de hoeveelheid polaire, potentieel interfererende componenten in het extract te beperken. Ook deze aanpassing leidde niet tot een verbeterde zuiverheid van het extract. In het volgende experiment werd terug gebruik gemaakt van MTBE/MeOH (50:50, v/v) met 0,01% BHT als extractiesolvent, waarbij opnieuw gestreefd werd naar een zuiverder extract door de polaire MeOH-‐fase te scheiden van de apolaire MTBE-‐fase. Hiertoe werd ultrapuur water toegevoegd aan het verzamelde extract, werd het staal gevortext en kon visueel een onderscheid gemaakt worden tussen de twee fasen (de polaire water-‐MeOH-‐fase en de apolaire MTBE-‐fase). De bovenste MTBE-‐fase werd verzameld in plastic vials voor analyse. Deze aanpassing leidde wel tot een aanzienlijk zuiverder extract aangezien een sterke reductie van interferende pieken werden waargenomen in de bekomen chromatogrammen. De zuiverheid werd eveneens beoordeeld aan de hand van de signaal-‐ruisverhoudingen; vergelijking van de verschillende extractiemethoden aan de hand van deze verhoudingen wordt gevisualiseerd in Figuur 4.1. Ook de piekoppervlakten van de verschillende componenten, geëxtraheerd met de verschillende extractiemethoden, werden met elkaar vergeleken (Figuur 4.2). 12000
S/N verhouding
10000
200 0 zeaxanthine
8000 6000 4000 2000 0
Carotenoïden
Figuur 4.1: Vergelijking van de verschillende extractiemethoden a.d.h.v. de signaal-‐ ruisverhoudingen van de beschouwde carotenoïden.
33
5000 2500000
0
Piekoppervlakte
zeaxanthine 2000000 1500000 1000000 500000 0
Carotenoïden
Figuur 4.2: Vergelijking van de verschillende extractiemethoden a.d.h.v. de piekoppervlakten van de beschouwde carotenoïden. Aangezien de initiële condities van de toegepaste chromatografische gradiënten voornamelijk gebruik maken van ACN en MeOH, werd het extract (bestaande uit hoofdzakelijk MTBE) eerst nog ingedampt tot ongeveer 50 μL in de gyrovap evaporator gedurende 5 minuten. Vervolgens werd het overblijvende extract heropgelost in een mengsel van ACN en MeOH (25:75, v/v) en gevortext. De chromatografische scheiding en de piekvorm van voornamelijk luteïne en zeaxanthine was hierdoor opmerkelijk beter dan wanneer het MTBE-‐extract werd geanalyseerd. Echter, voor lycopeen en β-‐caroteen werd afbraak vastgesteld aangezien lagere piekoppervlaktes en piekoppervlakteverhoudingen werden waargenomen. Voor lycopeen was de piekoppervlakteverhouding namelijk 75,7% lager, voor β-‐caroteen was deze verhouding 24,8% lager. De fase van indampen en heroplossen werd daarom niet toegepast. Chromatografische scheiding en verbetering van de piekvorm kon echter gerealiseerd worden door aanpassing van de chromatografische procedure. 4.1.2. Analyseprocedures Voor de verscheidene HPLC-‐systemen werden een aantal parameters geoptimaliseerd met als voornaamste prestatiecriteria de chromatografische resolutie, de piekvorm en de piekintensiteit.
34
Verschillende solventen en modificaties van solventen werden aangewend met als doel de chromatografische scheiding en ionisatie-‐efficiëntie te optimaliseren. Als mobiele fasen werden diëthylether en MeOH (Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006); ACN, ultrapuur water en ethylacetaat/MeOH (1:1, v/v) (Thermo Scientific, 2012; Rodriguez-‐Amaya & Kimura, 2004), en ACN, ultrapuur water, ethylacetaat/MeOH (1:1, v/v) en MeOH getest. De beste resultaten werden verkregen met de laatste vier solventen. Toevoeging van ammoniumacetaat, azijnzuur of mierenzuur aan één van de solventen zou volgens de literatuur zorgen voor een betere ionisatie-‐efficiëntie (Epler et al., 1993; Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006; Rivera & Canela-‐Garayoa, 2012; Hao et al., 2005). Na toevoeging van 0,04 g L-‐1 NH4Ac aan MeOH werd een hogere piekintensiteit en een betere scheiding van voornamelijk luteïne en zeaxanthine waargenomen. Vandaar dat verder gebruik werd gemaakt van ACN, ultrapuur water, ethylacetaat/MeOH (1:1, v/v) en 0,04 g L-‐1 NH4Ac in MeOH. Het gradiëntprogramma werd eveneens geoptimaliseerd met als doel het verhogen van de chromatografische resolutie van de verschillende componenten. Het optimale gradiëntprogramma bleek voor elk van de beschouwde pompsystemen verschillend te zijn (Tabel 3.1, Tabel 3.2, Tabel 3.3 in het deel Materiaal en Methoden). Een volgende parameter betrof de kolomoventemperatuur, die een belangrijke invloed heeft op de interactie tussen een analyt en de stationaire fase, en aldus op de chromatografische scheiding en elutiesnelheid. De optimale kolomoventemperatuur voor zowel de TSQ-‐MS-‐PDA als de Orbitrap ExactiveTM MS bleek 22 °C te zijn, voor de LTQ-‐MS bleek deze 20 °C te zijn. Voor de TSQ-‐PDA en Orbitrap ExactiveTM was een temperatuur van 20 °C ruim voldoende voor een optimale scheiding van luteïne en zeaxanthine (Figuur 4.3), er werd daarom een temperatuur tussen 20 en 25 °C geselecteerd. Ten slotte werden de parameters, gerelateerd aan de ionisatie, geoptimaliseerd op basis van de verkregen piekoppervlaktes, piekintensiteiten en signaal-‐ruisverhoudingen. Voor zowel de capillaire temperatuur, de verdampingstemperatuur, het sheath gas debiet en het auxiliary gas debiet werden verschillende waarden getest. Voor de TSQ-‐MS bleek een capillaire temperatuur van 250 °C, een verdampingstemperatuur van 370 °C, een sheath gas debiet van 40 au en een auxiliary gas debiet van 5 au optimaal. Voor de LTQ-‐MS was dit een
35
capillaire temperatuur van 150 °C, een verdampingstemperatuur van 300 °C, een sheath gas debiet van 20 au en een auxiliary gas debiet van 5 au en voor de Orbitrap ExactiveTM MS een capillaire temperatuur van 175 °C, een verdampingstemperatuur van 275 °C, een sheath gas debiet van 35 au en een auxiliary gas debiet van 5 au.
Figuur 4.3: Invloed van de kolomoventemperatuur (30 °C, 25 °C en 20 °C) op de chromatografische scheiding van luteïne en zeaxanthine, geanalyseerd met de TSQ-‐MS. 4.1.3. Validatie van de analyseprocedures Voor de validatie van de geoptimaliseerde extractieprocedure en analyseprocedures was geen blanco referentiemateriaal voorhanden en werd daarom geopteerd om gebruik te maken van groene tomaten. In groene tomaten werden immers lagere concentratieniveaus voor het merendeel van de beschouwde carotenoïden vastgesteld ten opzichte van roodrijpe tomaten. In groene tomaat zijn namelijk twee van de vijf beschouwde carotenoïden (lycopeen en α-‐caroteen) niet tot nauwelijks aanwezig, en is β-‐caroteen in lagere gehaltes aanwezig dan in rode tomaat. Luteïne en zeaxanthine daarentegen zijn echter wel in een hogere concentratie aanwezig in de groene tomatenvruchten. Zoals aangehaald in paragraaf 3.2.1.4 in het deel Materiaal en Methoden werden diverse prestatiecriteria geëvalueerd door het uitvoeren van een validatieprotocol, gebaseerd op Beschikking 2002/657/EG van de Europese Commissie (Europese Gemeenschap, 2002). Echter, in het geval van LTQ-‐MS detectie konden niet alle prestatiecriteria worden beoordeeld. De betreffende massaspectrometer was als enige gekoppeld aan een HPLC-‐systeem (de andere pompsystemen waren UHPLC-‐systemen, met de optie tot HPLC analyse) waardoor een relatief lage maximale druklimiet geldig was.
36
Aangezien de druk tijdens analyse deze druklimiet overschreed, konden niet alle beschikbare stalen geanalyseerd worden. De stalen, die echter wel werden geanalyseerd lieten evenwel toe om de lineariteit, specificiteit, detectielimiet en kwantificatielimiet te bepalen en te evalueren. 4.1.3.1.
Lineariteit
De
standaardcurven
geven
het
verband
weer
tussen
de
gekende
carotenoïdeconcentraties en de piekoppervlakteverhouding. Deze verhouding betreft de piekoppervlakte van een carotenoïde ten opzichte van de piekoppervlakte van de interne standaard. Uitdrukking van de lineariteit gebeurt aan de hand van de regressiecoëfficiënt R2. Deze bleek voor elke component op elk van de beschouwde analytische instrumenten groter te zijn dan 0,990 (Tabel 4.1). De standaardcurven van de verschillende componenten, geanalyseerd met de Orbitrap ExactiveTM MS, worden weergegeven in Figuur 4.4 en 4.5. Tabel 4.1: Regressiecoëfficiënt van de standaardcurven van elke component voor de diverse analytische instrumenten. R2
Luteïne Zeaxanthine β-‐caroteen Lycopeen α-‐caroteen
R2
R2
R2
TSQ-‐MS/MS 0,999
PDA 0,991
LTQ-‐MS2 0,996
Orbitrap ExactiveTM MS 0,995
0,993
0,995
0,992
0,993
0,991 0,999 0,993
0,998 0,994 0,997
0,995 0,991 0,996
0,995 0,993 0,992
1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Piekoppervlakteverhouding
Piekoppervlakteverhouding
y = 0,2076x R² = 0,9951
0
2
4
6
Concentrale luteïne in ng μL-‐1
8
0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0
y = 0,0047x R² = 0,9934
0
2
4
6
Concentrale zeaxanthine in ng μL-‐1
8
Figuur 4.4: Standaardcurven voor luteïne en zeaxanthine met β-‐Apo-‐8’-‐carotenal als interne standaard. Weergegeven concentraties hebben betrekking op het finale extract.
37
1,4 1,2
Piekoppervlakteverhouding
Piekoppervlakteverhouding
y = 0,2409x R² = 0,9924
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
2
4
6
Piekoppervlakteverhouding
Concentrale α-‐caroteen in ng μL-‐1
0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
y = 0,1437x R² = 0,9947
0
2
4
Concentrale β-‐caroteen in ng μL-‐1
6
2,5 2
y = 0,4230x R² = 0,9925
1,5 1 0,5 0 0
2
4
Concentrale lycopeen in ng μL-‐1
6
Figuur 4.5: Standaardcurven voor α-‐caroteen, β-‐caroteen en lycopeen met β-‐Apo-‐8’-‐ carotenal als interne standaard. Weergegeven concentraties hebben betrekking op het finale extract. 4.1.3.2.
Specificiteit
Aangezien geen echt blanco materiaal voorhanden was, werden niet aangerijkte stalen van groene tomaat gebruikt als ‘blanco’ materiaal. Voor de carotenoïden die gedetecteerd werden in het beschouwde plantmateriaal werd de specificiteit geëvalueerd aan de hand van de chromatogrammen van 12 ‘blanco’ stalen. Deze chromatogrammen toonden aan dat er geen significante matrix-‐interferentie optrad aangezien de signaal-‐ ruisverhoudingen minstens 3 waren. Voor de carotenoïden, die niet of nauwelijks gedetecteerd werden in het beschouwde plantmateriaal, werd een vergelijking gemaakt tussen de chromatogrammen van ‘blanco’ stalen en stalen aangerijkt met carotenoïde standaarden. De chromatogrammen van de aangerijkte stalen toonden een verhoging in piekoppervlakte-‐intensiteit ter hoogte van de specifieke retentietijd van de beschouwde componenten en hadden signaal-‐ruis verhoudingen van minstens 3. Tegelijk interfereerden
38
geen andere matrixsubstanties ter hoogte van deze specifieke retentietijden. Voor elk toestel werd van zowel een ‘blanco’ als een aangerijkt staal een chromatogram bijgevoegd in de bijlage (Bijlage 1-‐4). 4.1.3.3.
Herhaalbaarheid en intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid
Voor zowel de TSQ-‐MS, de TSQ-‐PDA als voor de Orbitrap ExactiveTM MS werden goede resultaten behaald op vlak van herhaalbaarheid (RSD < 15%) en intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid (RSD < 20%). De RSD van de verschillende componenten wordt weergegeven in Tabel 4.2 voor de TSQ-‐MS, in Tabel 4.3 voor de PDA-‐detector en in Tabel 4.4 voor de Orbitrap ExactiveTM MS. Tabel 4.2: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid per component voor de verschillende concentratiereeksen (Tabel 3.12) voor de TSQ-‐MS. RSD (%) RSD (%) RSD (%) concentratieniveau 1 concentratieniveau 2 concentratieniveau 3 Herh. Reprod. Herh. Reprod. Herh. Reprod. Luteïne 9,1 18,0 5,3 14,3 11,3 13,7 Zeaxanthine 12,1 11,9 9,6 15,3 9,9 14,7 α-‐caroteen 8,3 9,5 4,5 10,5 5,3 14,8 β-‐caroteen 11,7 13,2 7,2 9,7 12,4 14,5 Lycopeen 9,8 10,7 9,4 12,1 7,2 10,1 Tabel 4.3: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid per component voor de verschillende concentratiereeksen (Tabel 3.12) voor de PDA-‐detector. RSD (%) RSD (%) RSD (%) concentratieniveau 1 concentratieniveau 2 concentratieniveau 3 Herh. Reprod. Herh. Reprod. Herh. Reprod. Luteïne 11,5 12,7 5,3 14,4 12,6 14,5 Zeaxanthine 10,5 14,0 7,9 8,3 12,4 13,4 α-‐caroteen 5,8 7,4 8,2 7,3 5,9 8,3 β-‐caroteen 7,7 12,6 8,9 9,9 3,6 11,1 Lycopeen 4,8 9,6 2,4 7,9 5,5 7,9
39
Tabel 4.4: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid per component voor de verschillende concentratiereeksen (Tabel 3.12) voor de Orbitrap ExactiveTM MS. RSD (%) RSD (%) RSD (%) concentratieniveau 1 concentratieniveau 2 concentratieniveau 3 Herh. Reprod. Herh. Reprod. Herh. Reprod. Luteïne 8,7 8,6 8,0 9,8 11,7 13,9 Zeaxanthine 9,3 13,1 13,7 15,0 8,4 13,6 α-‐caroteen 7,2 7,9 10,5 7,0 8,3 7,6 β-‐caroteen 4,7 7,6 7,1 13,3 8,5 10,0 Lycopeen 2,4 9,9 3,2 3,4 7,0 8,4 4.1.3.4.
Terugvinding
Voor de berekening van de terugvinding werd voor elk van de betreffende stalen de concentraties van de verschillende carotenoïden berekend. Hiervoor werden de standaardcurven, opgesteld in paragraaf 4.1.3.1 aangewend. De berekende concentraties werden gecorrigeerd voor de eventueel aanwezige endogene carotenoïden. In Tabel 4.5, Tabel 4.6 en Tabel 4.7 wordt de terugvinding voor elk carotenoïde weergegeven, geanalyseerd met respectievelijk de TSQ-‐MS, de PDA-‐detector en de Orbitrap ExactiveTM MS. De vereiste waarden voor de terugvinding zijn afhankelijk van het beschouwde concentratieniveau en werden beschreven in Beschikking 2002/657/EG van de Europese Commissie (Europese Gemeenschap, 2002). De grenzen voor de terugvinding variëren tussen 70% -‐ 110% enerzijds of 80% -‐ 110% anderzijds. Aangezien de waarden voor de terugvinding zich voor alle componenten steeds tussen 80% en 110% situeren, kan gesteld worden dat een goede terugvinding werd behaald voor de verschillende detectietechnieken. Tabel 4.5: De terugvinding (%) per component voor de verschillende concentratieniveaus (Tabel 3.12), geanalyseerd met de TSQ-‐MS. Luteïne Zeaxanthine α-‐caroteen β-‐caroteen Lycopeen
conc. niveau 1 87,9 96,8 89,6 96,0 97,6
Terugvinding (%) conc. niveau 2 98,3 86,4 98,5 92,9 81,6
conc. niveau 3 83,3 96,5 106 95,1 97,8
40
Tabel 4.6: De terugvinding (%) per component voor de verschillende concentratieniveaus (Tabel 3.12), geanalyseerd met de PDA-‐detector. Luteïne Zeaxanthine α-‐caroteen β-‐caroteen Lycopeen
conc. niveau 1 87,4 95,5 94,7 98,2 101
Terugvinding (%) conc. niveau 2 conc. niveau 3 98,2 95,6 98,7 83,7 97,1 91,6 84,8 87,0 93,0 88,6
Tabel 4.7: De terugvinding (%) per component voor de verschillende concentratieniveaus (Tabel 3.12), geanalyseerd met de Orbitrap ExactiveTM MS. Luteïne Zeaxanthine α-‐caroteen β-‐caroteen Lycopeen 4.1.3.5.
conc. niveau 1 100 105 92,4 106 104
Terugvinding (%) conc. niveau 2 106 89,7 93,5 96,9 92,4
conc. niveau 3 110 88,9 84,1 101 89,8
LOD en LOQ
De bepaling van de LOD en LOQ werd gerealiseerd aan de hand van de relatie tussen de concentratie van een carotenoïde en de overeenkomstige signaal-‐ruisverhouding. De berekende waarden worden weergegeven in Tabel 4.8 voor de TSQ-‐MS en de PDA-‐detector en in Tabel 4.9 voor de LTQ-‐MS en de Orbitrap ExactiveTM MS. Tabel 4.8: Detectielimiet (LOD) en kwantificatielimiet (LOQ), uitgedrukt in ng μL-‐1, van de verschillende componenten, geanalyseerd met behulp van de TSQ-‐MS en de PDA-‐detector. TSQ-‐MS LOD (ng μL-‐1) LOQ (ng μL-‐1) Luteïne 0,0079 0,0264 Zeaxanthine 0,1715 0,5717 α-‐caroteen 0,0064 0,0213 β-‐caroteen 0,0036 0,0120 Lycopeen 0,0064 0,0213
PDA -‐1
LOD (ng μL ) 0,0280 0,6484 0,0443 0,0753 0,0305
LOQ (ng μL-‐1) 0,0934 2,1612 0,1476 0,2509 0,1017
41
Tabel 4.9: Detectielimiet (LOD) en kwantificatielimiet (LOQ), uitgedrukt in ng μL-‐1, van de verschillende componenten, geanalyseerd met behulp van de LTQ-‐MS en de ExactiveTM Orbitrap MS . LTQ-‐MS LOD (ng μL-‐1) LOQ (ng μL-‐1) Luteïne 0,0933 0,3110 Zeaxanthine 1,5640 5,2133 α-‐caroteen 0,0300 0,1000 β-‐caroteen 0,0500 0,1600 Lycopeen 0,0200 0,0500
Orbitrap MS LOD (ng μL-‐1) 0,0014 0,0384 0,0005 0,0008 0,0018
LOQ (ng μL-‐1) 0,0046 0,1275 0,0015 0,0027 0,0061
4.1.4. Evolutie van het carotenoïdegehalte in functie van het ontwikkelingsstadium Na de succesvolle validatie van de ontwikkelde ExactiveTM Orbitrap MS methode werd de praktische toepasbaarheid van de methode aangetoond. Hiertoe werden tomatenvruchten, die zich in verschillende ontwikkelingsstadia bevonden bij oogst, geanalyseerd. In totaal werden vijf ontwikkelingsstadia beschouwd, zoals beschreven in paragraaf 3.2.3. In het algemeen hadden de vruchten in de eerste twee stadia een groene kleur, in het derde stadium een groen-‐oranje kleur, in het vierde stadium een oranje kleur en in het laatste stadium waren de vruchten rood. Voor elk ontwikkelingsstadium werden drie vruchten geanalyseerd. De concentratie van de verschillende carotenoïden werd bepaald aan de hand van de standaardcurven, zoals opgesteld in paragraaf 3.2.1.5. Bij berekening van de concentraties op basis van het versgewicht werd ook rekening gehouden met het droge stof percentage van elke individuele vrucht. Dit percentage kon afgeleid worden door de massabepaling van het vruchtmateriaal voor en na het vriesdrogen. Het verloop van de concentratie van de verschillende carotenen gedurende de vruchtontwikkeling wordt weergegeven in Figuur 4.6. Zowel lycopeen en α-‐caroteen blijken een stijgend verloop te hebben, β-‐caroteen blijft min of meer constant, luteïne en zeaxanthine kennen een dalend verloop in concentratie.
42
0,7 Zeaxanthineconcentrale (mg per 100 g versgewicht)
Luteïneconcentrale (mg per 100 g versgewicht)
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
0 0
1
2
3
4
0
5
1
β-‐caroteenconcentrale (mg per 100 g versgewicht)
α-‐caroteenconcentrale (mg per 100 g versgewicht)
0,0014 0,0012 0,0010 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0,0000 1
2
3
4
5
4
0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
5
1
2
3
4
Ontwikkelingsstadium
Ontwikkelingsstadium Lycopeenconcentrale (mg per 100 g versgewicht)
3
Ontwikkelingsstadium
Ontwikkelingsstadium
0
2
5
0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0
1
2
3
4
Ontwikkelingsstadium
5
Figuur 4.6: Evolutie van de concentratie (mg per 100 g versgewicht) van de beschouwde carotenoïden in functie van het ontwikkelingsstadium met uitdrukking van de variatie aan de hand van de standaardfout (n = 3). Ontwikkelingsstadium 1 is 22 – 30 dagen na anthesis, ontwikkelingsstadium 2 is 31 – 39 dagen na anthesis, ontwikkelingsstadium 3 is 40 – 48 dagen na anthesis, ontwikkelingsstadium 4 is 49 – 57 dagen na anthesis en ontwikkelingsstadium 5 is 58 of meer dagen na anthesis.
43
4.1.5. Metabolome profilering van een groene tomaat Analyse met behulp van de Orbitrap ExactiveTM MS resulteerde in full-‐scan data, die de informatie over honderden tot duizenden metabolieten bezit. Met behulp van het softwareprogramma ToxID en het databestand, die de geïmplementeerde chemische formules bevat, kon echter een efficiënte screening naar carotenoïde componenten worden uitgevoerd. Het softwareprogramma screent hierbij op basis van geïmplementeerde moleculaire formules naar de overeenkomstige accurate massa’s (m/z) in het betreffende full-‐scan databestand. Deze ToxID screening werd uitgevoerd op het full-‐scan databestand, resulterend uit de analyse van een staal van een groene tomatenvrucht. Toepassing van ToxID op het staal van een groene tomaat leidde tot de waarneming van 32 componenten (Bijlage 5). 4.2.
ANALYSE VAN SUIKERS IN TOMAAT
4.2.1. Evolutie van het suikergehalte in functie van het ontwikkelingsstadium Net zoals voor de carotenoïden werd getracht een beeld te schetsen van de veranderingen in suikerconcentraties gedurende de ontwikkeling en rijping van tomatenvruchten. Hiervoor werden dezelfde tomatenvruchten gebruikt als deze bij de analyse van de carotenoïden in paragraaf 4.1.4. In Figuur 4.7 wordt het concentratieverloop van fructose, glucose en sucrose in functie van de verschillende ontwikkelingsstadia weergegeven. Fructose en glucose kennen een stijgend concentratieverloop tot en met het vierde groeistadium, waarna een concentratiedaling kan worden waargenomen. Voor sucrose wordt een gelijkaardig verloop vastgesteld, maar de verschillen in concentratie tussen de verschillende ontwikkelingsstadia zijn minder uitgesproken.
44
8,00
7,00
7,00
6,00
Glucoseconcentrale (mg g-‐1 versgewicht)
Fructoseconcentrale (mg g-‐1 versgewicht)
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
0
1
2
3
4
5
Ontwikkelingsstadium
0
1
2
3
4
Ontwikkelingsstadium
5
Sucroseconcentrale (mg g-‐1 versgewicht)
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
1
2
3
4
5
Ontwikkelingsstadium
Figuur 4.7: Evolutie van de suikerconcentraties (mg g-‐1 versgewicht) in functie van het ontwikkelingsstadium met uitdrukking van de variatie aan de hand van de standaardfout (n = 3). Ontwikkelingsstadium 1 is 22 – 30 dagen na anthesis, ontwikkelingsstadium 2 is 31 – 39 dagen na anthesis, ontwikkelingsstadium 3 is 40 – 48 na anthesis, ontwikkelingsstadium 4 is 49 – 57 dagen na anthesis en ontwikkelingsstadium 5 is 58 of meer dagen na anthesis.
45
5. DISCUSSIE Tijdens dit thesisonderzoek werd een vloeistof-‐vloeistofextractie en een Orbitrap-‐MS methode ontwikkeld en geoptimaliseerd, dewelke een metabolome benadering van de in de tomatenvrucht aanwezige carotenoïden toelaten. De ontwikkelde methode werd gevalideerd waarbij ook een vergelijkende studie werd uitgevoerd met een geoptimaliseerde tandem en multiple MS methode en een UV-‐VIS detectiemethode. In dit thesisonderzoek werd een extractieprocedure verder geoptimaliseerd met als voornaamste doel het verbeteren van de detectielimieten en het bekomen van een zuiverder extract. Hiertoe werd geopteerd voor het gebruik van een filter (22 μm poriegrootte). Nadat het extract gefiltreerd werd, werd de filter gespoeld met MTBE, om het eventuele aandeel aan carotenoïden geadsorbeerd aan de filter te beperken. Vervolgens werd het staal ingedampt en heropgelost in een kleiner volume. Aangezien geen zuiverder extract bekomen werd, werd getracht te voorkomen dat polaire componenten aanwezig waren in het extract. Hierbij werd enerzijds geopteerd om ultrapuur water toe te voegen aan het verzamelde extract en anderzijds om het extractiesolvent, bestaande uit MTBE/MeOH (1:1, v/v), te vervangen door 100 % MTBE. Het toevoegen van ultrapuur water veroorzaakte een visuele fasescheiding, met bovenaan de apolaire MTBE-‐fase, dewelke de carotenoïden bevatte. Aangezien MTBE een lagere dichtheid heeft dan MeOH en water, situeert de MTBE-‐fase zich bovenaan het extract. En aangezien het toevoegen van ultrapuur water bijdraagt tot hoge polariteitsverschillen (polariteitsindex van 9 voor water, 5,1 voor methanol en 2,5 voor MTBE) migreren alle carotenoïden naar de MTBE-‐fase. Het vervangen van het extractiesolvent gaf geen verbetering van de zuiverheid, het toevoegen van ultrapuur water zorgde echter wel voor een zuiverder extract. Er werden eveneens grotere piekoppervlakten waargenomen voor het grotendeel van de beschouwde carotenoïden. De geoptimaliseerde extractieprocedure resulteerde in een relatief eenvoudige en snelle extractie, waarbij weinig gelyofiliseerd tomatenpoeder en zeer lage solventhoeveelheden nodig waren. Deze lage solventhoeveelheden bieden voordelen op zowel economisch als ecologisch vlak. Het opstellen van deze extractieprocedure gebeurde op basis van de literatuur (Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006; Hao et al., 2005; Lin & Chen, 2003; Lee et al., 2001). Deze in de literatuur beschreven extractieprocedures
46
gebruiken echter veel meer plantmateriaal en vergen grote hoeveelheden solvent. Daarenboven worden ook vaak meer extractie-‐ en opzuiveringsstappen uitgevoerd waardoor de extractie meer tijd in beslag neemt. Aangezien de initiële condities van de toegepaste chromatografische gradiënten voornamelijk gebruik maken van ACN en MeOH, werd de MTBE-‐fase eerst nog ingedampt en vervolgens heropgelost in ACN/MeOH (25:75, v/v). Het oplosmiddel heeft namelijk een invloed op de interactie van de componenten met de mobiele en stationaire fase, wat een invloed kan hebben op de retentietijden en de piekvorm. Hierdoor was de chromatografische scheiding van luteïne en zeaxanthine beter dan wanneer het MTBE-‐ extract geanalyseerd werd. Echter, voor lycopeen en β-‐caroteen werd afbraak vastgesteld aangezien lagere piekoppervlaktes en piekoppervlakteverhoudingen werden waargenomen. Vandaar dat de fase van indampen en heroplossen niet toegepast werd. Deze afbraak zou verklaard kunnen worden door het feit dat carotenoïden gevoelig zijn aan thermische degradatie aangezien er een temperatuur van 30 °C heerste in de evaporator (Rodríguez-‐ Bernaldo de Quirós & Costa, 2006). Via verdere optimalisatie van de gradiënt kon echter een betere piekvorm en een voldoende chromatografische scheiding bekomen worden voor luteïne en zeaxanthine. Voor de verscheidene HPLC-‐systemen werden diverse paramaters geoptimaliseerd om voornamelijk een betere chromatografische scheiding, piekvorm en piekintensiteit te bekomen. Hiertoe werden in een eerste fase verschillende solventen aangewend met als voornaamste doel de chromatografische scheiding van zeaxanthine en luteïne te bekomen. Deze isomere structuren kennen immers een sterk gelijkaardige interactie ten opzichte van de stationaire fase van de kolom en kennen daardoor een nagenoeg identieke retentietijd. Eerst werd geopteerd voor diëthylether en MeOH als mobiele fase (Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006), maar luteïne en zeaxanthine konden onvoldoende chromatografisch gescheiden worden, ongeacht het ingestelde gradiëntprogramma. Bovendien werd voor de xanthofyllen geen mooie piekvorm waargenomen. Daarom werden andere solvent getest, namelijk ACN, ultrapuur water en ethylacetaat/MeOH (1:1, v/v) (Thermo Scientific, 2012; Rodriguez-‐Amaya & Kimura, 2004). Gebruik van deze solventen leidde tot een betere chromatografische scheiding en een mooiere piekvorm van luteïne en zeaxanthine. Door het gebruik van een vierde solvent, namelijk MeOH, werd echter een betere piekintensiteit
47
bereikt waardoor de mobiele fase voortaan bestond uit vier solventen. Met het oog op het verder verbeteren van de ionisatie-‐efficiëntie en aldus de detectielimieten werd de toevoeging van een aantal organische zuren aan de mobiele fase geëvalueerd. Voor de chromatografische analyse wordt in de literatuur vaak het gebruik van ammoniumacetaat, azijnzuur of mierenzuur beschreven. Deze treden op als H+-‐donor, en dragen zo bij tot een efficiëntere ionisatie (Epler et al., 1993; Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós & Costa, 2006; Rivera & Canela-‐Garayoa, 2012; Hao et al., 2005). Het toevoegen van mierenzuur en azijnzuur leidde echter niet tot een verhoogde ionisiatie-‐efficiëntie. Het toevoegen van 0,4 g L-‐1 NH4Ac aan MeOH zorgde voor lagere piekintensiteiten, maar na toevoeging van 0,04 g L-‐1 NH4Ac werden hogere piekintensiteiten en een betere scheiding van luteïne en zeaxanthine waargenomen. Ook de gradiënt werd geoptimaliseerd om een zo goed mogelijke scheiding van de verschillende componenten te bekomen. Deze gradiënt bleek afhankelijk te zijn van het gebruikte pompsysteem, en was bijgevolg verschillend voor elk toestel. De kolomoventemperatuur, die een belangrijke invloed heeft op de interactie tussen een analyt en de stationaire fase, werd geoptimaliseerd door verschillende temperaturen te testen op elk toestel en deze te selecteren, die een optimale scheiding van luteïne en zeaxanthine teweeg bracht. Voor de TSQ en de Orbitrap ExactiveTM werd vastgesteld dat een temperatuur van 22 °C tot een optimale chromatografische scheiding van luteïne en zeaxanthine leidde. In het geval van de LTQ werd besloten dat 20 °C een optimale temperatuur was voor de chromatografische resolutie van de betreffende xanthofyllen. Een belangrijk minpunt van de geoptimaliseerde chromatografische methoden was de lange analyseduur, namelijk 55 minuten. Dit kan verklaard worden door het gebruik van enerzijds een HPLC-‐kolom en anderzijds de toegepaste gradiënt, vereist voor de scheiding van de diverse isomere carotenoïde structuren. Het gebruik van UHPLC-‐kolommen kan leiden tot een verkorting van de analyseduur en biedt aldus een oplossing. Methoden waarbij een UHPLC-‐kolom gebruikt werd om carotenoïden in voedingsmatrices te analyseren, werden beschreven door Granada-‐Lorencio (2010), Rivera et al., (2011), Bohoyo-‐Gil & Dominguez-‐ Valhondo (2012), Rivera & Canela-‐Garayoa (2012) en Van Meulebroek et al. (2012). De voordelen, gerelateerd aan het gebruik van een UHPLC-‐kolom zijn een kortere analysetijd en een lager solventverbruik. Door de kortere analysetijd is er eveneens minder kans dat de carotenoïden afgebroken worden gedurende de analyse. Echter de beschreven chromatografische methoden, die gebruik maken van een UHPLC-‐kolom zijn niet altijd in
48
staat om de isomere structuren van alle carotenoïden te scheiden, wat vooral het geval is voor luteïne en zeaxanthine (Bohoyo-‐Gil & Dominguez-‐Valhondo, 2012). Scheiding van deze en eventueel andere carotenoïden vergt vaak een stationaire fase, die speciaal werd ontwikkeld om hydrofobe, lange keten, structuurgerelateerde isomeren te scheiden (de zogenaamde C30 kolommen) (http://www.ymc.co.jp/en/columns/ymc_carotenoid/). Deze kolommen zijn tot op heden enkel als HPLC-‐kolom beschikbaar. De lange analysetijd kan binnen de metabolome benadering echter ook voordelig zijn aangezien op die manier de kans op chromatografische scheiding van in het extract aanwezige carotenoïden, waarvoor de gradiënt niet specifiek werd geoptimaliseerd, maximaal is (Xu & Howard, 2012). Voor de geoptimaliseerde extractieprocedure en de verschillende geoptimaliseerde analysemethoden werden door middel van validatie een aantal prestatiecriteria geëvalueerd. Voor elke geoptimaliseerde analytische methode werden goede resultaten verkregen op vlak van lineariteit, aangezien de regressiecoëfficiënt steeds hoger dan 0,99 was. Ook op vlak van precisie (herhaalbaarheid en intra-‐laboratorium reproduceerbaarheid) werden goede resultaten waargenomen. Voor de LTQ-‐MS kon de precisie niet geëvalueerd worden, maar aangezien de relatieve standaarddeviaties voor alle andere methoden lager waren dan 15% voor de herhaalbaarheid en 20% voor de reproduceerbaarheid, kon er vanuit gegaan worden dat de geoptimaliseerde extractieprocedure voldoende herhaalbaar en reproduceerbaar is. Aangezien de signaal-‐ruisverhouding voor elke component, geanalyseerd met de verschillende geoptimaliseerde methoden, telkens groter was dan drie en er geen interfererende componenten met dezelfde retentietijd als de beschouwde carotenoïden voorkwamen, kon de specificiteit voor elke methode als positief beoordeeld worden. De specificiteit met de Orbitrap ExactiveTM MS methode was echter beter aangezien de signaal-‐ruisverhoudingen hoger lagen dan bij de andere methoden. Dit was te verwachten aangezien het een hoge resolutie massaspectrometer betreft en een massa-‐ accuraatheid van 2 ppm gegarandeerd werd. De terugvinding lag voor elke component met elke methode binnen de vooropgestelde grenzen (80% -‐ 110%). Vergelijking van de detectie-‐ en kwantificatielimieten met deze beschreven in de literatuur toont aan dat de LOD en LOQ, bepaald met de TSQ-‐MS, de TSQ-‐PDA en Orbitrap ExactiveTM MS, in overeenstemming of soms zelfs beter zijn dan de waarden beschreven door Hao et al. (2005), Ortega et al. (2004), Lin & Chen (2003), Sérino et al. (2009) en Bohoyo-‐Gil & Dominguez-‐Valhondo (2012). Voor de
49
LTQ-‐MS werden echter hogere LOD en LOQ waarden waargenomen dan deze beschreven door Hao et al. (2005). Wanneer we de geoptimaliseerde methoden met elkaar vergelijken, zijn de LOD en LOQ het laagst voor de Orbitrap ExactiveTM MS methode. Bij fragmentatie werd een zeer sterke daling van de piekintensiteit waargenomen, waardoor de methoden met fragmentatie bijgevolg minder gevoelig bleken (Watts et al., 1975). Aangezien betere resultaten werden behaald met de geoptimaliseerde Orbitrap ExactiveTM MS methode op het vlak van specificiteit en gevoeligheid ten opzichte van de andere detectietechnieken, kan gesteld worden dat deze hoge resolutie, full-‐scan massaspectrometrische methode uitermate geschikt is voor de bepaling van carotenoïden in tomatenvruchten. Daarenboven biedt de uitstekende specificiteit en gevoeligheid de beste mogelijkheden tot een succesvolle metabolome benadering. Na de succesvolle validatie van de ontwikkelde ExactiveTM Orbitrap MS methode werd de praktische toepasbaarheid van de methode aangetoond door tomatenvruchten uit vijf verschillende ontwikkelingsstadia te analyseren. Voor de xanthofyllen was er over het algemeen een daling te zien in concentratie naarmate de vruchten rijper waren, dit is in overeenstemming met wat beschreven werd door Fraser et al. (1994). Carotenen zouden volgens Fraser et al. (1994) toenemen naarmate de vrucht rijper wordt. Voor α-‐caroteen en lycopeen was dit inderdaad het geval. Voor β-‐caroteen werd dit ook enigszins waargenomen, hoewel dit niet zo duidelijk tot uiting kwam. De suikergehaltes in deze vruchten werden eveneens geanalyseerd met behulp van ELSD. Hierbij werd een stijging van fructose en glucose gedurende de rijping van groene naar oranje tomaat waargenomen, verdere rijping zorgde voor een daling in concentratie. Dit is in overeenstemming met wat beschreven werd door Davies & Kempton (1975). Voor sucrose, dat slechts in zeer lage concentraties aanwezig is in tomaat, wordt een gelijkaardig verloop vastgesteld als bij glucose en fructose, maar de verschillen in concentratie tussen de verschillende ontwikkelingsstadia zijn minder uitgesproken. Deze analyses hadden vooral tot doel de toepasbaarheid en mogelijkheden van de ontwikkelde methodes aan te tonen. Hierbij werden echter slechts een beperkt aantal vruchten geanalyseerd. De analyse van meer vruchten en eventueel meer beschouwde ontwikkelingsstadia kunnen mogelijk voor duidelijkere resultaten zorgen en een gedetailleerder beeld schetsen van de verandering in samenstelling gedurende vruchtontwikkeling.
50
Via het softwareprogramma ToxID kon een metabolome profilering gerealiseerd worden van een groene tomaat. Voor toepassing van dit softwareprogramma werd een databestand opgesteld waarbij 50 verschillende carotenoïden werden geïmplementeerd. Aangezien er heel wat isomere vormen bestaan werden in feite slechts 16 verschillende molecuulformules beschouwd. De opgestelde lijst is echter slechts een eerste aanzet en verre van volledig aangezien reeds honderden verschillende carotenoïden werden geïdentificeerd. Uiteindelijk werden aan de hand van de geïmplementeerde structuurformules 32 pieken gedetecteerd. Wanneer er echter meer pieken gedetecteerd werden dan mogelijke carotenoïde componenten kan dit erop wijzen dat de opgestelde lijst nog lang niet volledig is. Wanneer minder pieken werden waargenomen dan het aantal carotenoïden die opgespoord werden, kan dit erop wijzen dat bepaalde van deze carotenoïden niet of in te lage concentraties in het beschouwde extract aanwezig waren. Het voordeel van een dergelijke screening is dat informatie verkregen kan worden over de volledige carotenoïdensamenstelling van tomaat, wat uiterst interessant is aangezien de gezondheidsbevorderende effecten van deze componenten afhankelijk zijn van het geheel of de samenwerking ervan (Halvorsen et al., 2001). Anderzijds kan met een dergelijke efficiënte screening bepaald worden welke carotenoïden en in welke mate ze beïnvloed worden door de toepassing van specifieke teeltcondities. Hierbij vormt de belangrijkste doelstelling uiteraard het bepalen van condities, die bijdragen tot een maximaal carotenoïdengehalte in de tomatenvrucht (de Vos et al., 2011). Naast de relatie tussen carotenoïde in de vrucht en de implementatie van specifieke groeicondities kan het gebruik van dergelijke metabolome benadering zijn nut hebben bij het bepalen van de rol aan carotenoïden in waargenomen gezondheidseffecten. Aangezien nu informatie wordt aangeleverd over de totale samenstelling aan carotenoïden kunnen mogelijke relaties tussen consumptie van tomaten en gezondheidseffecten beter worden bepaald. Dit softwareprogramma biedt tevens de mogelijkheid tot een retrospectieve analyse waarbij voordien niet bekende componenten alsnog bekeken kunnen worden zonder opnieuw te moeten analyseren. In deze thesis werd door tijdsgebrek slechts gescreend op een klein aantal carotenoïden, waardoor slechts een fractie van de carotenoïden aanwezig in tomaat gedetecteerd werd.
51
6. CONCLUSIE Tijdens deze masterthesis werd een snelle en relatief eenvoudige extractieprocedure geoptimaliseerd en werd een full-‐scan, hoge resolutie Orbitrap-‐MS methode ontwikkeld voor de analyse van carotenoïden in tomaat. De ontwikkelde methode werd gevalideerd en geëvalueerd ten opzichte van geoptimaliseerde tandem MS, multiple MS en UV-‐VIS detectiemethodes. De reeds gedeeltelijk geoptimaliseerde extractieprocedure werd verder geoptimaliseerd en resulteerde in een snelle en eenvoudige methode waarbij lage hoeveelheden plantmateriaal en lage solventhoeveelheden nodig waren. Het lage solventverbruik levert voornamelijk voordelen op zowel economisch als ecologisch vlak. De lage hoeveelheid plantmateriaal leidt eveneens tot nieuwe onderzoeksmogelijkheden omdat vruchten nu ook in een vroeg ontwikkelingsstadium geanalyseerd kunnen worden, en makkelijker meerdere analyses (koolhydraten, fytohormonen, carotenoïden, etc.) op eenzelfde vrucht uitgevoerd kunnen worden. Optimalisatie van de verschillende analyseprocedures gebeurde voornamelijk door in te spelen op de instrumentele parameters en het gradiëntprogramma. De analysetijd was echter lang en vergde dus veel tijd en solvent. Voordeel van het gebruik van een HPLC-‐kolom is dat de kans op chromatografische scheiding van de aanwezige carotenoïden in het extract, waarvoor de gradiënt niet specifiek werd geoptimaliseerd, maximaal is, en dit is vooral interessant binnen de metabolome benadering. Ontwikkeling van een C30 UHPLC-‐kolom zou het probleem van de lange analysetijd en het hoge solventverbruik echter enigszins kunnen oplossen. Validatie gebeurde aan de hand van Beschikking 2002/657/EG van de Europese Commissie (Europese Gemeenschap, 2002) en toonde aan dat de ontwikkelde analytische methode een goede terugvinding kent (80% -‐ 110%), lineair (R2 ≥ 0,99), herhaalbaar (RSD < 15%), reproduceerbaar (RSD < 20%) en specifiek is. Grootste verschillen in vergelijking met de tandem en multiple MS en UV-‐VIS methoden werden waargenomen op vlak van detectie-‐ en kwantificatievermogen en selectiviteit. Aangezien een full-‐scan analyse gerealiseerd kan worden met een hoge gevoeligheid en selectiviteit is deze ontwikkelde Orbitrap ExactiveTM MS methode zeer geschikt voor de toepassing als carotenoïdenprofilering. De toepasbaarheid van de ontwikkelde methode werd aangetoond door analyse van
52
tomatenvruchten uit vijf verschillende ontwikkelingsstadia. Daarbij werd in het algemeen een daling in concentratie waargenomen voor de xanthofyllen (luteïne en zeaxanthine) en een stijging in concentratie voor de carotenen (α-‐caroteen, β-‐caroteen en lycopeen). Deze resultaten komen overeen met de vaststellingen van Fraser et al. (1994) en bevestigen dat de ontwikkelde methode voldoet voor de tijdens de validatie onderzochte prestatiecriteria. Via het softwareprogramma ToxID werd de tomatenvrucht gescreend op de aanwezigheid van 50 carotenoïden. Hierbij werd gebruik gemaakt van de data, bekomen bij analyse van het extract van een groene tomatenvrucht, en werden 32 mogelijk carotenoïde componenten gedetecteerd. Deze preliminaire test toont reeds aan dat de gewenste metabolome benadering realiseerbaar is door gebruik te maken van de in deze thesis ontwikkelde analytische methode. De mogelijkheid tot carotenoïdenprofilering van tomatenvruchten biedt heel wat toepassingsmogelijkheden in diverse vakgebieden. Algemeen kan gesteld worden dat het gebruik van de ontwikkelde analytische methode, gecombineerd met een efficiënte interpretatie en screening van de resulterende data een belangrijke bijdrage kan leveren in het verder uitdiepen van de kennis omtrent carotenoïden. Deze kennis kan zich enerzijds situeren op vlak van de tomatenteelt zelf waarbij groeicondities, optimaal voor hoge carotenoïdengehaltes in de tomatenvruchten, bepaald kunnen worden. Anderzijds kan de metabolome benadering ook bijdragen tot het ontrafelen van de specifieke rol en werking van carotenoïden met betrekking tot de gezondheid.
53
7. LITERATUURLIJST Astorg, P. (1997). Food carotenoids and cancer prevention: An overview of current research. Trends in Food Science & Technology, 8, 406-‐413. Bartley, G.E., Scolnik, P.A. (1995). Plant Carotenoids: Pigments for Photoprotection, Visual Attraction, and Human Health. The Plant Cell, 7, 1027-‐1038. Bohoyo-‐Gil, D., Dominguez-‐Valhondo, D. (2012). UHPLC as a suitable methodology for the analysis of carotenoids in food matrix. European Food Research Technology, 235, 1055-‐1061. Britton, G. (1995). Structure and properties of carotenoids in relation to function. The FASEB journal, 9 (15), 1551-‐1558. Dass, C. (2007). Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry. New Jersey, John Wiley & Sons. Davies, J.N. & Kempton, R.J. (1975). Changes in the individual sugars of tomato fruit during ripening. Journal of the Science of Food and Agriculture, 26, 1103-‐1110. De Hoffmann, E., Stroobant, V. (2007). Mass Spectrometry: Principles and Applications. John Wiley & Sons, Chichester. DellaPenna, D., Pogson, B.J. (2006). Vitamin Synthesis in Plants: Tocopherols and Carotenoids. Annual Review of Plant Biology, 57, 711-‐738. De Vos, R.C.H., Hall, R.D., Moing, A. (2011). Metabolomics of a model fruit: tomato. Annual Plant Reviews, 43, 109-‐155. Edge, R., McGarvey, D.J., Truscott, T.G. (1997). The carotenoids as anti-‐oxidants -‐ a review. Journal of Photochemistry and Photobiology, 41, 189-‐200. Epler, K.S., Ziegler, R.G., Craft, N.E. (1993). Liquid chromatographic method for the determination of carotenoids, retinoids and tocopherols in human serum and in food. Journal of Chromatography, 619, 37-‐48. Europese Gemeenschap (2002). Beschikking 2002/657/EG van de Commissie van 12 augustus 2002 ter uitvoering van Richtlijn 96/23/EG van de Raad wat de prestaties van analysemethoden en de interpretatie van resultaten betreft. Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen, L 221, 8-‐36. Fang, L., Pajkovic, N., Wang, Y., Gu, C., van Breemen, R.B. (2003). Quantitative Analysis of Lycopene Isomers in Human Plasma Using High-‐Performance Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 75 No. 4, 812-‐817.
54
Fraser et al., (1994). Carotenoid Biosynthesis during Tomato Fruit Development. Plant Physiology, 105, 405-‐ 413. Fraser, P.D., Bramley, P.M. (2006). Metabolic Profiling and Quantification of Carotenoids and Related Isoprenoids in Crop Plants. Biotechnology in Agriculture and Forestry, 57, 229-‐242. Frusciante, L., Carli, P., Ercolano, M.R., Pernice, R., DI Matteo, A., Fogliano, V., Pellegrini, N. (2007). Antioxidant nutritional quality of tomato. Molecular Nutrition & Food Research, 51, 609-‐617. Garrido Frenich, A., Hernandez Torres, M.E., Belmonte Vega, A., Martinez Vidal, J.L., Plaza Bolanos, P. (2005). Determination of Ascorbic Acid and Carotenoids in Food Commodities by Liquid Chromatography with Mass Spectrometry Detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53 No. 19, 7371-‐7376. Giovannucci, E. (1999). Tomatoes, Tomato-‐Based Products, Lycopene, and Cancer: Review of the Epidemiologic Literature. Journal of the National Cancer Institute, 91 No. 4, 317-‐331. Grace Davison Discovery Sciences, (2009). Product Manual Alltech® Model 3300 ELSD. Granado-‐Lorencio, F., Herrero-‐Barbudo, C., Blanco-‐Navarro, I., Pérez-‐Sacristan, B. (2010). Suitability of ultra-‐ high performance liquid chromatography for the determination of fat-‐soluble nutritional status (vitamins A, E, D, and individual carotenoids). Anal Bioanal Chem, 397, 1389-‐1393. Halvorsen, B.L., Holte, K., Myhrstad, M.C.W., Barikmo, I., Hvattum, E., Remberg, S.F., Wold, A., Haffner, K., Baugerød, H., Andersen, L.F., Moskaug, J.Ø., Jacobs, D.R., Blomhoff, R. (2002). A Systematic Screening of Total Antioxidants in Dietary Plants. The journal of Nutrition, 132, 461-‐471. Hanhineva, K., Aharoni, A. (2009). Metabolomics in Fruit Development. Molecular Techniques in Crop Improvement, 675-‐693. Hanson, P.M., Yang, R., Wu, J., Chen, J., Ledesma, D., Tsou, S.C.S., Lee, T. (2004). Variation for Antioxidant Activity and Antioxidants in Tomato. Journal of the American Society for Horticultural Science, 129 (5), 704-‐711. Hao, Z., Parker, B., Knapp, M., Yu, L.L. (2005). Simultaneous quantification of α-‐tocopherol and four major carotenoids in botanical materials by normal phase liquid chromatography-‐atmospheric pressure chemical ionizatioin-‐tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1094, 83-‐90. Hart, D.J., Scott, K.J. (1995). Development and evaluation of an HPLC method for the analysis of carotenoids in foods, and the measurement of the carotenoid content of vegetables and fruits commonly consumed in the UK. Food Chemistry, 54, 101-‐111. Hu, Q., Noll, R.J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M., Graham Cooks, R. (2005). The Orbitrap: a new mass spectrometer. Journal of Mass Spectrometry, 40, 430-‐443.
55
Johnson, E.J., PhD. (2002). The Role of Carotenoids in Human Health. Nutrition in Clinical Care, 5 No. 2, 56-‐65. Karppi, J., Nurmi, T., Olmedilla-‐Alonso, B., Granado-‐Lorencio, F., Nyyssönen, K. (2008). Simultaneous measurement of retinol, α-‐tocopherol and six carotenoids in human plasma by using an isocratic reversed-‐ phase HPLC method. Journal of chromatography B, 867, 226-‐232. Kennedy, T.A., Liebler, D.C. (1992). Peroxyl Radical Scavenging by β-‐Carotene in Lipid Bilayers. The Journal of Biological Chemistry, 267 No. 7, 4658-‐4663. Khachik, F., Carvalho, L., Bernstein, P.S., Muir, G.J., Zhao, D., Katz, N.B. (2002). Chemistry, Distribution, and Metabolism of Tomato Carotenoids and Their Impact on Human Health. Experimental Biology and Medicine, 227, 845-‐851. Lee, H.S., Castle, W.S., Coates, G.A. (2001). High-‐Performance liquid chromatography for the characterization of carotenoids in the new sweet orange (Earlygold) grown in Florida, USA. Journal of Chromatography A, 913, 371-‐377. Lin, C.H., Chen, B.H. (2003). Determination of carotenoids in tomato juice by liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1012 (1), 103-‐109. Maiani, G., Caston, M.J.P., Catasta, G., Toti, E., Cambrodon, I.G., Bysted, A., Granado-‐Lorencio, F., Olmedilla-‐ Alonso, B., Knuthsen, P., Valoti, M., Böhm, V., Mayer-‐Miebach, E., Behsnilian, D., Schlemmer, U. (2009). Carotenoids: Actual knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in humans. Molecular Nutrition & Food Research, 53, S194-‐S218. Makarov, A., Scigelova, M. (2010). Coupling liquid chromatography to Orbitrap mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1217, 3938-‐3945. Nielen, M.W.F., van Engelen, M.C., Zuiderent, R., Ramaker, R. (2007). Screening and confirmation criteria for hormone residue analysis using liquid chromatography accurate mass time-‐of-‐flight, Fourier transform ion cyclotron resonance and orbitrap mass spectrometry techniques. Analytica Chimica Acta, 586, 122-‐129. Oliver, J., Palou, A. (2000). Chromatographic determination of carotenoids in foods. Journal of Chromatography, 881, 543-‐555. Ortega, H., Coperias, J.L., Castilla, P., Gomez-‐Coronado, D., Lasuncion, M.A. (2004). Liquid chromatographic method for the simultaneous determination of different lipid-‐soluble antioxidants in human plasma and low-‐ density lipoproteins. Journal of Chromatography B, 803, 249-‐255. Rao, A.V., Rao, L.G. (2007). Carotenoids and human health. Pharmacological Research, 55, 207-‐216.
56
Rivera, S.M., Canela-‐Garayoa, R. (2012). Analytical tools for the analysis of carotenoids in diverse materials. Journal of Chromatography A, 1224, 1-‐10. Rivera, S., Vilaro, F., Canela, R. (2011). Determination of carotenoids by liquid chromatography/mass spectrometry: effect of several dopants. Anal Bioanal Chem, 400, 1339-‐1346. Rodriguez-‐Amaya, D.B. & Kimura, M. (2004). HarvestPlus Handbook for Carotenoid Analysis. HarvestPlus, Washington, DC. Rodríguez-‐Bernaldo de Quirós, A., Costa, S.H. (2006). Analysis of carotenoids in vegetable and plasma samples: A review. Journal of Food Composition and Analysis, 19, 97-‐111. Roldán-‐Gutiérrez, J., Luque de Castro, M.D. (2007). Lycopene: The need for better methods for characterization and determination. Trends in Analytical Chemistry, 26 No. 2, 163-‐170. Sérino, S., Gomez, L., Costagliola, G., Gautier, H. (2009). HPLC Assay of Tomato Carotenoids: Validation of a Rapid Microextraction Technique. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 8753-‐8760. Stahl, W., Sies, H. (2003). Antioxidant activity of carotenoids. Molecular Aspects of Medicine, 24, 345-‐351. Tanaka, Y., Sasaki, N., Ohmiya, A. (2008). Biosynthesis of plant pigments: anthocyanins, betalains and carotenoids. The Plant Journal, 54, 733-‐749. Tapiero, H., Townsend, D.M., Tew, K.D. (2004). The role of carotenoids in the prevention of human pathologies. Biomedicine & Pharmacotherapy, 58, 100-‐110. TM
Thermo Scientific (2012). Acclaim C30 Columns Product Manual. Thermo Scientific (2009). Accela PDA Detector Hardware Manual. Thermo Scientific. TSQ Quantum operators Course. Vanhaecke, L., Verheyden, K., Vanden Bussche, J., Schoutsen, F., De Brabander, H. (2009). UHPLC Coupled with Fourier Transform Orbitrap for Residue Analysis. LC-‐GC Europe, 20, 364-‐374. Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., De Swaef, T., Steppe, K., De Brabander, H. (2012). U-‐HPLC-‐MS/MS To Quantify Liposoluble Antioxidants in Red-‐Ripe Tomatoes, Grown under Different Salt Stress. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60, 566-‐573. Watts, C.D., Maxwell, J.R., Games, D.E., Rossiter, M. (1975). Analysis of carotenoids by field desorption mass spectrometry. Organic Mass Spectrometry, 10, 1102-‐1110. Young I.S., Woodside J.V. (2001). Antioxidants in health and disease. Journal of Clinical Pathology, 54, 176-‐186.
57
Zaman, Z., Fielden, P., Frost, P.G. (1993). Simultaneous Determination of Vitamins A and E and Carotenoids in Plasma by Reversed-‐Phase HPLC in Elderly and Younger Subjects. Clinical chemistry, 39 No. 11, 2229-‐2234. Xu, Z. & Howard, L. R. (2012). Analysis of Antioxidant-‐Rich Phytochemicals. John Wiley & Sons, Chichester. ELEKTRONISCHE PUBLICATIES http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-‐massspec.html (22/03/2013). http://www.ymc.co.jp/en/columns/ymc_carotenoid/ (03/04/2013).
58
8. BIJLAGE Bijlage 1.:
MS/MS chromatogrammen van zowel een ‘blanco’ als aangerijkt staal van groene tomaat (0,5 keer standaard aanrijkingsniveau (Tabel 3.12)).
Bijlage 2.:
PDA chromatogrammen van zowel een ‘blanco’ als aangerijkt staal van groene tomaat (0,5 keer standaard aanrijkingsniveau (Tabel 3.12)).
Bijlage 3.:
MSn chromatogrammen van zowel een ‘blanco’ als aangerijkt staal van groene tomaat (0,5 keer standaard aanrijkingsniveau (Tabel 3.12)).
Bijlage 4.:
Orbitrap hoge resolutie MS chromatogrammen van zowel een ‘blanco’ als aangerijkt staal van groene tomaat (0,5 keer standaard aanrijkingsniveau (Tabel 3.12)).
Bijlage 5.:
Overzicht van de carotenoïden die bij een massa-‐accuraatheid van 5 ppm en een minimum piekintensiteit van 1000 gedetecteerd konden worden in een staal van groene tomaat met behulp van de Orbitrap ExactiveTM MS en het softwareprogramma ToxID.
59
Bijlage 1. ‘Blanco’ staal
Aangerijkt staal
Bijlage 2. ‘Blanco’ staal
Aangerijkt staal
Bijlage 3. ‘Blanco’ staal
Aangerijkt staal
Bijlage 4. ‘Blanco’ staal
Aangerijkt staal
Bijlage 5. Moleculaire formule C40H56O2 C40H56O
Retentietijd (min) 6,18
Piekintensiteit + [M + H] 4 3,20 e
6,63 13,05 17,25 20,16
2,90 e 4 7,10 e 4 7,30 e 4 2,00 e
4
1,20 e 4 2,50 e 4 3,20 e 4 8,20 e
40,50 34,72 43,69 40,63
22,70
e4 1,10
e4 4,50
41,75
4
Piekintensiteit 13 + [C isotope + H] 4 1,30 e 4
4
Isotopische ratio (%) 41,24
15,03
4,90 e
2,00 e
40,34
31,99
e4 1,20
e4 5,20
41,98
C40H56 C40H56O4
4
38,64 29,27 35,17 31,40
8,30 e 4 5,50 e 4 3,20 e 4 2,50 e
3,30 e 4 2,20 e 4 1,30 e 4 1,00 e
40,22 38,90 41,81 41,82
3,73 4,29
2,10 e 4 7,20 e
42,32 41,25
3,19 5,08
4
9,10 e 4 3,00 e
6,60 e 4 6,40 e
4
2,70 e 4 2,70 e
40,63 41,33
4
4
4
Mogelijke componenten all-‐trans-‐luteïne, all-‐trans-‐ zeaxanthine, 13-‐cis-‐luteïne, 9-‐cis-‐luteïne, Di-‐cis-‐luteïne, 9-‐cis-‐zeaxanthine, 13-‐cis-‐zeaxanthine Lycopeen epoxide, Zeïnoxanthine, 5,6-‐epoxy-‐α-‐ caroteen, 5,6-‐epoxy-‐β-‐ caroteen, All-‐trans-‐α-‐ cryptoxanthine, All-‐trans-‐β-‐ cryptoxanthine, 5,8-‐epoxy-‐β-‐caroteen All-‐trans-‐lycopeen, All-‐trans-‐β-‐caroteen, Di-‐cis-‐α-‐caroteen, 15-‐cis-‐β-‐caroteen, 13-‐cis-‐β-‐caroteen, Di-‐cis-‐β-‐caroteen, All-‐trans-‐α-‐caroteen, 9-‐cis-‐α-‐caroteen, 9-‐cis-‐β-‐caroteen, Cis-‐δ-‐caroteen, All-‐trans-‐δ-‐caroteen, Cis-‐γ-‐caroteen, All-‐trans-‐γ-‐caroteen, 9-‐cis-‐lycopeen, 13-‐cis-‐α-‐caroteen, 11-‐cis-‐lycopeen All-‐trans-‐ neoxanthine, 9-‐cis-‐neoxanthine, All-‐trans-‐ violaxanthine, Cis-‐violaxanthine, Luteoxanthine
Moleculaire formule C40H65 C40H56O3 C40H52O2 C30H40O 40H54O C
Retentietijd (min) 13,42 42,43 39,43 42,97 39,84
Piekintensiteit + [M + H] 4 2,10 e 4 2,50 e 4 2,50 e 4 5,50 e 4 7,20 e
Piekintensiteit 13 + [C isotope + H] 4 8,20 e 4 1,00 e 4 9,90 e 4 2,30 e 4 3,00 e
Isotopische ratio (%) 39,87
4,86
e4 4,50
e4 1,80
39,90
6,18 5,69
1,10 e 4 7,10 e
4
4
4,40 e 4 2,60 e
41,67 39,49 42,34 41,72
38,87 36,40
Mogelijke componenten Phytoeen All-‐trans-‐capsanthine All-‐trans-‐ Antheraxanthine All-‐trans-‐ canthaxanthine
3,62 3,19
4 1,50 e 4 1,10 e
4 6,10 e 4 4,80 e
10,52
e 2,40
e 7,80
32,16
β-‐apo-‐8`-‐carotenal
6,19 8,75 9,10 5,42 7,53
e4 6,90 4 4,60 e 4 3,60 e 4 1,30 e 4 1,40 e
e4 3,00 4 1,90 e 4 1,50 e 4 5,40 e 4 6,00 e
43,33
All-‐trans-‐echinone
4
4
41,16 42,06
41,22 41,54 42,14 42,83
VERSLAG LEZINGEN 1. BIEDT HET KIWI-‐MODEL EEN OPLOSSING VOOR DE FINANCIËLE PROBLEMEN VAN DE SOCIALE ZEKERHEID? (Dirk Van Duppen, 20 februari 2013) Het kiwimodel werd opgesteld om de kosten van geneesmiddelen omlaag te krijgen. Het idee is afkomstig van Nieuw-‐Zeeland, waar geneesmiddelen dankzij dit model tien keer goedkoper zijn. Vanuit een wetenschappelijke behoefteanalyse worden de beste geneesmiddelen gekozen uit het geneesmiddelenaanbod op de markt. Vervolgens worden onderhandelingen gevoerd met verschillende farmaceutische firma’s om via openbare aanbestedingen de beste prijs te bekomen voor de beste geneesmiddelen. Het kiwimodel zorgt voor een prijsdaling van de geneesmiddelen, minder kosten voor de geneesmiddelenproducent en voor een kleiner aanbod waardoor het eenvoudiger wordt voor artsen, apothekers en patiënten. Dirk Van Duppen wil dit model om deze redenen dan ook gaan toepassen in België. Aangezien dit model zo’n grote invloed heeft op de prijs van geneesmiddelen in Nieuw-‐Zeeland, en sommige geneesmiddelen hier in België veel te duur zijn en er eveneens veel te veel soorten van eenzelfde geneesmiddel op de markt zijn, is dit model volgens mij zeer interessant om ook in België toe te passen. 2. REGISTRATION OF NEW VACCINS IN THE EU: NOT AN EASY TASK (Pieter Neels, 7 maart 2013) Het ‘Committee for Human Medicinal Products’ (CHMP) geeft advies aan de Europese Commissie (EC) over de benefit/risk verhouding van nieuwe geneesmiddelen maar eveneens van reeds bestaande geneesmiddelen. Het CHMP houdt zich eveneens bezig met vaccins. Vaccins zijn zeer belangrijk, aangezien elk jaar drie miljoen kinderen overleven omdat ze gevaccineerd werden. Er zijn al heel wat vaccins op de markt en de ontwikkeling van nieuwe vaccins wordt steeds moeilijker. Maar door de voortdurende vooruitgang in de wetenschap en de geneeskunde en door de ontwikkeling van de biotechnologie bestaat er nog steeds de mogelijkheid tot het ontwikkelen van nieuwe vaccins. Vaccins verschillen van andere geneesmiddelen omdat zij toegediend worden aan gezonde mensen, meestal aan zeer jonge kinderen, ze genezen niet maar voorkomen een ziekte en ze moeten een zeer hoge kwaliteit en veiligheid hebben. De impact van vaccins op de gehele wereldbevolking is enorm, ze zorgen namelijk voor een aanzienlijke reductie van de mortaliteit en een grote
groei van de populatie. Het bestaan van vaccins is volgens mij onmisbaar geworden, het zijn levensreddende geneesmiddelen en zonder deze geneesmiddelen zou het er in de wereld veel slechter aan toegaan. Het is goed dat men nog steeds verder onderzoek doet om nieuwe vaccins tot ontwikkeling te brengen, want zo kunnen er nog heel wat mensenlevens gespaard worden. 3. INNOVATING FOR A BETTER AND SUSTAINABLE HEALTHCARE (Rudi Pauwels, 21 maart 2013) Door de steeds betere levensomstandigheden en de vooruitgang in de geneeskunde, neemt de levensverwachting van de mens toe. Tegen 2020 zouden 1 op 5 mensen ouder worden dan 65 jaar, en aangezien mensen langer leven, zijn er meer ouderen in de populatie, die sneller en meer ziek worden, waardoor er dus meer zorg nodig is. Het probleem van voorgeschreven geneesmiddelen is dat deze door de genetische diversiteit in de bevolking slechts in 30 tot 70% van de gevallen werken. Aangezien we allen verschillen op moleculair niveau zou het interessant zijn om geneesmiddelen te gaan individualiseren. Een verhoogde rol, om de gezondheidszorg te verbeteren, wordt weggelegd voor biomerker metingen. Door een biomerker tijdig te detecteren, kunnen ziektes vroegtijdig voorspeld en eventueel voorkomen worden. Het ontwikkelen van dergelijke methodes om snel en efficiënt biomerkers te detecteren is het doel van Biocartis, opgericht door Rudi Pauwels. Ik vind het goed dat Biocartis methodes ontwikkelt om snel biomerkers te detecteren in het lichaam, want hierdoor kunnen ziektes sneller opgespoord worden en kunnen ze zo vlugger en efficiënter behandeld worden. 4. HOSPITAL ADMISSIONS RELATED TO MEDICATION: A PREVENTABLE HEALTH AND ECONOMIC BURDEN? (Patricia Van den Bemt, 28 maart 2013) Geneesmiddelen kunnen naast genezen, ook heel wat schade aanrichten, zowel door bepaalde eigenschappen van het geneesmiddel, maar ook door de manier waarop ze gebruikt worden. Ziekenhuisopnames door medicatiefouten kunnen voorkomen worden door bijvoorbeeld de dosis aan te passen, te controleren op interacties, contra-‐indicaties en therapietrouw. Opnames door ‘adverse drug reactions’ (ADR) daarentegen zijn niet te voorkomen. Er zijn heel wat ziekenhuisopnames gerelateerd aan medicatie, en bijna 50% ervan waren mogelijks te voorkomen. Er moeten dus maatregelen genomen worden om
deze opnames te voorkomen, en dit kan door medicatie te herzien. Uit studie is gebleken dat oudere, niet-‐therapietrouwe patiënten die minstens vijf geneesmiddelen gebruiken en aan minstens vijf aandoeningen lijden, voordeel halen uit multi-‐gedisciplineerde geneesmiddelenherziening. Het is goed dat er iets gedaan wordt aan te voorkomen ziekenhuisopnames gerelateerd aan het gebruik van medicatie. Medicatie wordt gegeven aan patiënten om zich beter te laten voelen, het is dus niet de bedoeling dat ze nog zieker worden en in het ziekenhuis belanden.
