UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014-2015

DRIEDIMENSIONALE MORFOLOGIE VAN DE ANTENNALE KLIER BIJ DE PENAEUS VANNAMEI EN DE ONTWIKKELING VAN EEN KWANTIFICATIEMETHODE VOOR DE STUDIE VAN HET WHITE SPOT SYNDROME VIRUS

door

Gaëtan DE GRYSE

Promotor:

Prof. dr. Hans J. Nauwynck

Medepromotoren: Sebastiaan Theuns, dierenarts Thuong Van Khuong

Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef

© 2015 Gaëtan De Gryse

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014-2015

DRIEDIMENSIONALE MORFOLOGIE VAN DE ANTENNALE KLIER BIJ DE PENAEUS VANNAMEI EN DE ONTWIKKELING VAN EEN KWANTIFICATIEMETHODE VOOR DE STUDIE VAN HET WHITE SPOT SYNDROME VIRUS

door

Gaëtan DE GRYSE

Promotor:

Prof. dr. Hans J. Nauwynck

Medepromotoren: Sebastiaan Theuns, dierenarts Thuong Van Khuong

Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef

© 2015 Gaëtan De Gryse

VOORWOORD Tijdens het tot stand komen van deze masterproef zijn er heel wat mensen de revue gepasseerd die mij ergens hebben geholpen met het voltooien van dit werk en mij tot een bedanking nopen. Als eerste verdient uiteraard mijn promotor professor dr. Hans Nauwynck mijn dank, niet alleen omdat hij mij een project gaf waar hij zelf zeer hard in gelooft, maar ook omdat hij als een van de weinigen meedenkt met zijn studenten en eigen inbreng zeer hard op prijs stelt. Vervolgens hoort mijn in-extremis-co-promotor Sebastiaan ‘Bas’ Theuns te staan. Bas introduceerde mij in de wondere wereld van de qPCR (een zeer intrigerende techniek waarin ik mij graag zou willen verdiepen in de nabije toekomst) en stond telkenmale weer paraat met raad en daad, telkens ik weer een (van tijd tot tijd domme) vraag had. Vervolgens gebiedt de logica mij om mijn tweede co-promotor Thuong Van Khuong te bedanken. A very special thanks goes to João Dantas Lima for helping me with shrimp supply and for providing me with the tips and tricks I very much needed. I know you didn’t really had the time to help me but you did so anyway, I hope we will be able to continue helping each other in the future. Lowiese, ook jij heel hard bedankt met je hulp bij de qPCR. Bas, Lowiese, Inge, Isaura en Delphine Ytse: bedankt om mij te ‘adopteren’. And last but not least zoals beloofd: Sebastiaan ‘Bockie’ Van Bockstael om mij te leren hoe je foto’s van agarosegellen neemt en om mij bijna te helpen met PCR ;) Tijdens het maken van deze masterproef heb ik minstens evenveel tijd op virologie doorgebracht als op morfologie, waar prof. dr. P. Cornillie mij wegwijs maakte met de basis van het software programma AMIRA en mij vooral verblijdde met het terugvinden van de ‘verloren’ coupes. Nog mensen wie ik dank ben verschuldigd op morfologie: prof. dr. P. Simoens voor de enthousiaste discussie over het maken van corrosieve casts en de mogelijke functies van de antennale klier, maar vooral om mij te vertrouwen met de huissleutels waardoor ik ’s avonds laat en in het weekend (ook ‘s avonds laat) kon doorwerken in mijn donker kotje. Prof. dr. W. Van Den Broeck, dank voor de discussie over en de mogelijkheid tot het maken van een corrosieve cast. Nogmaals: uitstel maar geen afstel. Dhr. Bart De Pauw, bedankt om mij een protocol te bezorgen voor de SEM-staalvoorbereiding en tijd vrij te maken om mij te helpen met de SEM terwijl je het zeer druk had (en de SEM overduidelijk geen zin had om garnalen te fotograferen). Andere mensen die mijn dank verdienen zijn: Ir. Mathieu Wille, Jorg Desmyter en Tom Baelemans van het Artemia Reference Center, DA Kristof Hermans, dr. Mathias Corteel and dr. Grant Stentiford. Zoals zo vaak komen de mensen die het dichtst bij mij staan het laatst aan bod: Vooreerst bedankt aan mijn familie, vrienden en vriendin om mij te maken tot de mens die ik vandaag ben maar tegelijk wil ik mij tegenover hen verontschuldigen voor mijn afwezigheid het afgelopen jaar. Bedankt moeder en vader voor alle (logistieke en taalkundige) steun en het vele nalezen tot de laatste komma’s en liggende streepjes. Tenslotte wil ik graag Ameline bedanken voor haar geduld en liefde, en het nalezen van deze thesis met een onderwerp die haar “meug” niet is.

“Uit verse garnalen schiep God de Oostendenaren, uit het restant de overigen van ’t land” -Anoniem-

LIJST MET FREQUENT GEBRUIKTE AFKORTINGEN BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

Cq

Kwantificatiecyclus

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DNA

Deoxyribonucleïnezuur

DNase/RNase-vrij

Deoxyribonuclease/ribonuclease-vrij

HE

Hematoxyline-eosine

PBS

Fosfaatgebufferde zoutoplossing

(S)EM

(Scanning) elektronenmicroscoop

SID50

Shrimp infectious dose 50%

SPF

Specific pathogen free

ORF

Open reading frame

(q)PCR

(Quantitative) polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleïnezuur

UV

Ultraviolet

VP

Viraal proteïne

WSSV

White spot syndrome virus

INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING ............................................................................................................................................................................................................ 1 INLEIDING

................................................................................................................................................................................................................... 2

1. SITUERING EN BELANG ........................................................................................................................................................................................ 2 2. HET WHITE SPOT SYNDROME VIRUS................................................................................................................................................................. 4 2.1. GESCHIEDENIS EN VERSPREIDING ............................................................................................................................................................ 4 2.2. TAXONOMIE ..................................................................................................................................................................................................... 7 2.3. STRUCTUUR .................................................................................................................................................................................................... 7 2.4. GASTHEER-RANGE EN VECTOREN ........................................................................................................................................................... 10 2.5. PATHOGENESE, LATENTIE EN TRANSMISSIE ......................................................................................................................................... 10 3. ALGEMENE MORFOLOGIE VAN DE PENAEIDE GARNAAL ............................................................................................................................. 12 4. DE ANTENNALE KLIER ........................................................................................................................................................................................ 13 4.1. ALGEMENE OPBOUW ................................................................................................................................................................................... 13 4.2. COELOMOSAC .............................................................................................................................................................................................. 14 4.3. LABYRINT ....................................................................................................................................................................................................... 17 4.4. NEFROÏDALE TUBULUS ............................................................................................................................................................................... 18 4.5. URINAIRE BLAAS .......................................................................................................................................................................................... 18 4.6. FYSIOLOGIE .................................................................................................................................................................................................. 18 4.7. ANATOMIE VAN DE ANTENNALE KLIER .................................................................................................................................................... 19 DOELSTELLINGEN VAN DEZE THESIS ..................................................................................................................................................................... 21 MATERIAAL EN METHODEN ....................................................................................................................................................................................... 22 1. MORFOLOGIE VAN DE ANTENNALE KLIER BIJ DE P. VANNAMEI ................................................................................................................. 22 1.1. CREATIE VAN EEN 3D-BEELD OP BASIS VAN HISTOLOGISCHE COUPES MET AMIRA ...................................................................... 22 1.2. SCANNING ELECTRONENMICROSCOPISCHE OPNAME VAN DE NEFROPORIE ................................................................................. 25 2. DYNAMIEK VAN DE ANTENNALE KLIER TIJDENS DE ECDYSIS BIJ DE P. VANNAMEI ................................................................................ 28 3. OPTIMALISATIE VAN EEN REAL-TIME PCR VOOR DE KWANTIFICATIE VAN WSSV IN URINE .................................................................. 30 3.1. SELECTIE DOELWITGEN ............................................................................................................................................................................. 30 3.2. PRIMERDESIGN ............................................................................................................................................................................................ 31 3.3. HET TESTEN VAN DE PRIMERS OP DE LABOSTAMMEN ........................................................................................................................ 32 3.4. SYNTHESE STANDAARD-DNA .................................................................................................................................................................... 36 3.5. IN VITRO OPTIMALISATIE VAN DE QPCR-REACTIECONDITIES ............................................................................................................. 37 3.6. KWANTIFICATIE VAN WSSV-DNA IN URINE VAN P. VANNAMEI ............................................................................................................. 40 RESULTATEN ............................................................................................................................................................................................................... 42 1. MORFOLOGIE VAN DE ANTENNALE KLIER BIJ DE P. VANNAMEI ................................................................................................................. 42 1.1. ALGEMEEN OVERZICHT VAN DE ANTENNALE KLIER ............................................................................................................................. 42 1.2. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN DE ROSTRALE STRUCTUUR ............................................................................... 44 1.3. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN HET COMPACTE GLANDULAIRE DEEL VAN HET ORGAAN ............................. 45 1.4. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN DE VENTRALE BLAAS EN ZIJN UITLOPERS ...................................................... 48 1.5. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN DE LATERALE BLADEN EN HUN CAUDALE UITLOPERS ................................. 51 1.6. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN DE MEDIANE BLAAS ............................................................................................. 53 1.7. BESCHRIJVING VAN DE SPIEREN GEASSOCIEERD MET DE ANTENNALE KLIER............................................................................... 56 1.8. NEFROPORIËN .............................................................................................................................................................................................. 60 2. DYNAMIEK VAN DE ANTENNALE KLIER TIJDENS HET AFSCHUDDEN VAN HET EXOSKELET BIJ DE P. VANNAMEI ............................ 62 3. OPTIMALISATIE VAN EEN REAL-TIME PCR VOOR DE KWANTIFICATIE VAN WSSV IN URINE .................................................................. 63 3.1. PRIMERS VOOR HET SEQUENEREN VAN HET DNA-POLYMERASEGEN............................................................................................. 63 3.2. PRIMERSPECIFICATIE VOOR DE DETECTIE VAN WSSV VIA qPCR ....................................................................................................... 63 3.4. SYNTHESE VAN STANDAARD-DNA ............................................................................................................................................................ 67 3.5. IN VITRO OPTIMALISATIE VAN DE QPCR-REACTIECONDITIES ............................................................................................................. 67 3.6. EFFICIËNTIE VAN DE QPCR-REACTIE ....................................................................................................................................................... 68 3.7. KWANTIFICATIE VAN WSSV IN URINE ....................................................................................................................................................... 69 DISCUSSIE ................................................................................................................................................................................................................. 70 1. FUNCTIONELE ANATOMIE, MORFOLOGIE EN DYNAMIEK VAN DE ANTENNALE KLIER ............................................................................ 70 2. DE KWANTIFICATIE VAN WSSV IN URINE VAN P. VANNAMEI ....................................................................................................................... 76 REFERENTIELIJST ....................................................................................................................................................................................................... 77

SAMENVATTING Al een geruime tijd wordt de excretoire antennale klier bestudeerd bij rivierkreeften en krabben. Slechts een beperkt aantal onderzoeken zijn uitgevoerd naar de antennale klier bij penaeide garnalen. Penaeide garnalen zijn een economisch zeer belangrijk onderdeel van de wereldwijde aquacultuur. Sinds 1992, wordt de industrie echter geteisterd door massale productieverliezen, veroorzaakt door het White spot syndrome virus. Eén van de grote vraagstukken binnen het onderzoek naar het White spot syndrome virus, blijft het identificeren van de ingangspoort van het virus. Omdat de antennale klier een orgaan is die in direct contact staat met de buitenwereld, geen cuticulaire aflijning heeft en omdat er nog maar weinig onderzoek is verricht naar de mogelijke rol van deze structuur in de pathogenese van het White spot syndrome virus, wordt er in deze thesis beoogd, de (functionele) anatomie en morfologie van dit orgaan te exploreren. Via 3D-reconstructie en scanning elektronenmicroscopie werd de complexe organisatie van de antennale klier bij Penaeus vannamei bestudeerd, evenals de vele spieren die ermee geassocieerd blijken te zijn. Het blootleggen van deze structuur, legt de weg open naar verder virologisch onderzoek. Het orgaan bestaat uit twee bilaterale, compacte glandulaire gedeeltes, die rostraal verder lopen als de rostrale structuur en ventraal uitmonden in de ventrale blaas. Via een uitloper van de ventrale blaas wordt connectie gemaakt met het contralaterale deel. De structuur loopt verder naar caudaal om twee laterale bladen te vormen die caudale uitlopers bevatten, reikend tot en met de hepatopancreas. Rostraal van de maag komen de twee laterale bladen samen om de mediane blaas te vormen. Er werd geconcludeerd dat dit orgaan niet alleen een mogelijke ingangspoort voor White spot syndrome virus kan zijn, maar dat het mogelijk ook een rol kan spelen in het vervellingsproces en/of het kuismechanisme van de kieuwen bij P. vannamei. Daarom werd ook een poging gedaan om de dynamiek van de antennale klier te bestuderen tijdens de ecdysis (vervelling). Er werd ook een kwantitatieve PCR-methode geoptimaliseerd voor de detectie van WSSV in urine, gebaseerd op primers ontworpen voor het VP19-gen van het White spot syndrome virus. Een qPCRefficiëntie van 98% werd bekomen.

1

INLEIDING 1. SITUERING EN BELANG Voorspeld wordt, dat de wereldbevolking zal toenemen van 7,3 miljard in 2015 naar 9,3 miljard in 2050. Hierbij zal de Europese populatie evenwel inkrimpen, maar zijn het vooral de ontwikkelingslanden die enorm zullen toenemen in bevolkingsaantal (UN, 2013). Vandaag alleen al zijn er naar schatting 805 miljoen mensen chronisch ondervoed (FAO, 2014). Om een groeiende wereldbevolking te kunnen onderhouden, zal de voedselproductie enorm moeten toenemen. Daarvoor wordt nu vooral gekeken naar de landbouw, maar volgens het FAO (2008) is er minder dan 12% voor agricultuur bruikbare grond over. Verdubbeling van de bewerkbare grondoppervlakte is in principe mogelijk, maar zou gepaard gaan met een “massieve destructie van bossen en verlies aan biodiversiteit en koolstofsequestratiecapaciteit”. Daarbij komt dat de verwachte bevolkingsgroei een verdubbeling van de behoefte aan zoetwatervoorzieningen met zich meebrengt. Momenteel wordt al 70% van de beschikbare 3.800 km³ aan zoetwater gebruikt door de landbouw en 20% voor de industrie (FAO, 2012a). Inzetten op de verdere ontwikkeling van de mariene aquacultuur, lijkt een duurzame strategie om in de toekomst te kunnen voldoen aan de noden van de wereldbevolking op het gebied van voedselzekerheid.

Vandaag de dag is de aquacultuur reeds de snelst groeiende dierproductie-industrie ter wereld (Richard Waite, 2014). In 2009 was de totale productie met 7,5% gestegen tegenover 2008 (FAO, 2012a). In 2012, bedroeg de wereldwijde aquacultuurproductie van garnalen al 4,3 miljoen ton, met een totale waarde van € 17,96 miljoen, terwijl de productie in 2003 nog afklokte op 2 miljoen ton (€ 7,52 miljoen). Dit betekent dat de productie van garnalen op minder dan tien jaar tijd meer dan verdubbeld is. Ter vergelijking: de productie van zalm, forel en spiering in 2012 waren samen goed voor 3,2 miljoen ton ter waarde van € 14,05 miljoen (FAO, 2012b).

De garnalenkweek (en aquacultuur in het algemeen) is echter zeer kwetsbaar voor ziektes. De voedselvoorziening vanuit de globale Crustacea- en aquacultuurindustrie wordt hierdoor zwaar gelimiteerd (Stentiford et al., 2012). De productie in verschillende landen van Azië, Afrika en ZuidAmerika wordt dan ook regelmatig gekelderd door uitbraken van infectieuze agentia. Geschat wordt, dat 80% van de totale productieverliezen te wijten zijn aan infectieuze agentia, voornamelijk virale (60%) en bacteriële (20%). Zo werd in 2011 de Mozambikaanse garnalenproductie quasi volledig lamgelegd (FAO, 2012a; Flegel et al., 2008). De belangrijkste ziekteverwekkers bij garnalen zijn volgens het ‘Office International des Epizooties’ zijn: (i) Yellow head disease virus, (ii) Infectious hypodermal and haemotopoietic necrosis virus, (iii) Infectious myonecrosis virus, (iv) Hepatobacter penaei, (v) Taura syndrome virus en (vi) White spot syndrome virus (WSSV). Deze ziekten zijn allen aangifteplichtig (OIE, 2014). Van al deze virussen is het WSSV zonder meer het meest notoire en destructieve. Alle gekweekte penaeiden, plus de meeste andere Crustacea zijn gevoelig voor WSSV (Figuur 1). Het is de grootste oorzaak van verliezen in de globale garnalenproductie (Pradeep et al., 2012; Walker en Mohan, 2009).

2

a

b

c

d

Fig. 1 Enkele economisch belangrijke garnalen a) Penaeus vannamei (Anoniem, 2014), b) Penaeus monodon (Leike, 2011), c) Penaeus japonicus (Anoniem, 2015a), d) Crangon crangon (Anoniem, 2015b).

De vraag of onze wildpopulatie van Crustacea gevoelig is voor WSSV en wat het effect ervan zou kunnen zijn, eenmaal het in onze wateren terecht zou komen, maken van WSSV een prioriteit binnen de virologie. WSSV werd geregistreerd in de EC Directive 2006/88 als zijnde niet-exotisch en het virus werd al gerapporteerd in Europa. Case reports tonen aan dat WSSV ziekte en sterfte kan veroorzaken bij Europese temperaturen (Stentiford en Lightner, 2011). Meerdere susceptibiliteitsstudies bewezen de virulentie van WSSV bij inheemse soorten, onder andere de Nephrops norvegicus (Noorse kreeft) en de Crangon affinis (dicht verwant aan de grijze noordzeegarnaal, Crangon crangon) (Bateman et al., 2012; Gong et al., 2010). De waarde van de C. crangon visserij in de Noordzee alleen al, wordt op meer dan € 100 miljoen geschat (Figuur 1) (Verhaegen et al., 2012). De potentie om het inheemse Europese wildbestand te kelderen en de daaruit volgende impact op jobs, voedselvoorziening, ecologie en de economie is dus zeker iets waar rekening mee moet worden gehouden (Hill, 2002). De nood aan prospectieve studies omtrent deze potentiële dreiging, dringt zich op. Zeker gezien de opwarming van de aarde. De belangrijkste route van WSSV-transmissie is nog steeds een blinde vlek op de kaart van de WSSV-bestrijding. Pas als men deze ontdekt, kan het onderzoek naar het virus en de bestrijding ervan grote sprongen maken. De tot op heden beschreven inoculatieroutes zijn immers veelal artificieel of moeilijk beheersbaar in het onderzoek naar de effecten en bestrijding van WSSV. De huidige kennis betreffende de pathologie, pathogenese en eventuele virusinhibitie is bijna uitsluitend gebaseerd op studies waarbij het dier geïnfecteerd werd door middel van injectie, hetgeen geen natuurlijke infectieroute is (zie verder). Het is dus van primordiaal belang om op zoek te gaan naar de zwakke punten in de barrière(s) van garnalen (en Crustacea in het algemeen), waarvan het virus zou kunnen profiteren.

3

2. HET WHITE SPOT SYNDROME VIRUS 2.1. GESCHIEDENIS EN VERSPREIDING In 1992 stak in het noorden van Taiwan een nieuwe ziekte de kop op. Verschijning van witte vlekken op de cephalothorax en massale sterfte van Penaeus japonicus werden gerapporteerd. In 1993 werden dezelfde verschijnselen geobserveerd in Taiwanese kwekerijen van Penaeus monodon en Penaeus penicilatus, hetgeen grote verliezen veroorzaakte (Chou et al., 1995). Al snel slaagde de mysterieuze ziekte erin om de Oost-Chinese Zee over te steken en een ravage aan te richten in Chinese garnalenkwekerijen (Zhan et al., 1998). In maart 1993, via ingevoerde Chinese P. japonicus juvenielen, bereikte de ziekte - die ondertussen de naam white spot syndrome had gekregen - Japan (Nakano et al., 1994). Het was uit deze uitbraak, dat het oorzakelijke agens, het WSSV voor het eerst werd geïsoleerd en gevisualiseerd (Inouye et al., 1994). Ondertussen is besmetting met WSSV op reeds alle continenten en werelddelen gerapporteerd (APHIS-USDA, 2004; Calderón et al., 1999; Chou et al., 1995; Eissa et al., 2009; Stentiford en Lightner, 2011). In totaal zijn er vandaag 42 landen waar WSSV reeds werd gedetecteerd. Figuur 2, 3 en 4 geven de spreiding van WSSV over de globale wateren heen.

Fig. 2 Het spreiden van het White spot syndrome virus over de hele wereld van 1992 tot en met 1994 1992: Taiwan (Chou et al. 1995). 1993: China (Zhan et al., 1998), Japan (Nakano et al., 1994), Korea (Park et al., 1998), Vietnam (Khoa et al., 2001). 1994: Thailand (Lo, 1996), Indië (Wongteerasupaya et al., 1995), Bangladesh (Mazid en Banu, 2002).

Aan de hand van moleculaire epidemiologische studies van WSSV-isolaten, wordt echter de volgende migratieroute van het virus voorgesteld. Hiervoor baseerden de onderzoekers zich op genetische verschillen in het open reading frame (ORF) 14/15, tussen de verschillende WSSV-isolaten. Ze schoven Thailand naar voor als waarschijnlijke draaischijf van waaruit de rest van Zuidoost-Azië besmet werd. De TH-96-II-stam zou de ancestrale stam zijn van de WSSV-TH-stam (beiden uit Thailand). WSSV-TH zou vervolgens oorsprong gegeven hebben aan drie andere stammen: (i) de

4

WSSV-TW (Taiwan) die op zijn beurt geëvolueerd is tot de WSSV-CN (China), (ii) de WSSV-VN (Vietnam) en (iii) de twee Indiase stammen IN-05-I en IN-07-I (Pradeep et al., 2008).

De immense capaciteit van het virus om zich in een razend snel tempo te verspreiden naar andere landen hoeft geen verder betoog als men zich van het volgende bewust is; midden januari 1999 arriveerde WSSV in Centraal-Amerika waar het quasi simultaan Nicaragua, Honduras en Guatemala binnensloop (Walker en Mohan, 2009). Het duurde maar enkele maanden tot ook Panama in april 1999 tot de lijst van besmette landen mocht worden gerekend. In mei was Ecuador aan de beurt, gevolgd door Peru in augustus. Nog steeds in 1999 werd ook Colombia bereikt. In 2000 bezweken Costa Rica en Mexico. Mexico had wel degelijk getracht om WSSV buiten haar landsgrenzen te houden door het nemen van (beperkte en onvoldoende) preventieve maatregelen (de Graindorge en Griffith, 2000; Hill, 2002; Mialhe et al., 2013).

Fig. 3 Het spreiden van het White spot syndrome virus over de hele wereld van 1995 tot en met 2002 Bruin: zie Figuur 2. 1995: Griekenland (Stentiford en Lightner, 2011), Sri Lanka (Siriwardena, 2001), VSA (APHIS-USDA, 2004), Maleisië, Indonesië (Kasornchandra et al., 1998). 1996: Cambodja (Zwart et al., 2010). 1997: Italië, Turkije (Stentiford en Lightner, 2011). 1999: Honduras, Nicaragua, Guatemala (Hossain et al., 2001), Panama (Rosenberry, 1999), Ecuador (Calderón et al., 1999), Filipijnen (Magbanua et al., 2000), Colombia (OIE, 1999), Peru (Mialhe et al., 2013), Pakistan* (Bondad-Reantaso et al., 2001), Taipei** (OIE, 1999). 2000: Togo (OIE, 2000), Mexico (Bondad-Reantaso et al., 2001), Australië (East et al., 2004), Spanje (Stentiford en Lightner, 2011), Costa Rica (Vargas, 2001). 2002: Frankrijk, Iran (OIE, 2002), Myanmar (FAO/NACA, 2003). (*) Infectie met WSSV werd verdacht maar niet bevestigd. (**) Taipei werd niet weergegeven op de kaart wegens te klein.

Een snelle globale spreiding zoals weergegeven in Figuur 2, 3 en 4, is een rechtstreeks gevolg van de verschillende wijzen waarop het virus een land kan binnendringen. De intensieve handel van (post)juveniele garnalen zorgde voor een snelle spreiding van het virus binnen Zuidoost-Azië (Flegel, 2006; Zhan et al., 1998). Ook het importeren van ingevroren crustaceeën als voedsel voor andere gekweekte crustaceeën vormt een risico voor het binnenbrengen van WSSV in kweekbedrijven (East et al., 2004). Gekweekte garnalen kunnen ontsnappen uit de aquacultuurfaciliteiten en vluchten naar de

5

open zee, al dan niet via het afvalwater of door overstroming tijdens het regenseizoen. Indien de ontsnapte garnalen geïnfecteerd zijn met het virus, kunnen ze dit doorgeven aan de wildpopulatie crustaceeën. Zowel de wilde als de ontsnapte crustaceeën, kunnen dan door eigen beweging andere landen bereiken om daar de infectie verder te zetten. Wildpopulaties zouden ook besmet kunnen worden door het gebruik van ingevoerde, dode garnalen die aangewend worden in de sportvisserij als aas of via het afvalwater van voedselverwerkingsfabrieken. Er is ook beschreven dat garnalen kunnen worden opgenomen via het ballastwater van schepen en zo grotere afstanden kunnen afleggen (Flegel, 2002; Fuller et al., 2014; Lightner et al., 1997). Vaak gaan garnalenkwekers garnalen vangen uit de wildpopulatie voor de aanvulling van hun broedstock of als nieuw startmateriaal voor de kweek. Het virus kan zo het bedrijf invaderen en parallelle productielijnen gaan besmetten (Flegel, 2006). Toen Hsu et al. (1999) voor een studie P. monodon broedstock uit het wild gingen halen, was slechts 33% niet positief op WSSV. Voor de meest waarschijnlijke oorzaak van de WSSV-introductie in een Texaans bedrijf eind 1995, wordt er met de vinger gewezen naar een nabijgelegen voedselverwerkingsfabriek die ingevroren garnalen had ingevoerd afkomstig uit Azië (Lightner et al., 1997). Dit suggereert dat preventiemaatregelen zich niet enkel tot de aquacultuurindustrie mogen beperken om effectief te zijn. Eigenlijk mag er gesteld worden, dat ieder land dat een kust heeft en waarvan de inwoners diepvriesgarnalen kunnen betalen, WSSV heeft in de wildpopulatie (Corteel, M. persoonlijke communicatie).

Fig. 4 Het spreiden van het White spot syndrome virus over de hele wereld van 2003 tot en met 2011 Bruin: zie Figuur 2 en 3. 2003 : Argentinië (Martorelli et al., 2010), Hongkong* (OIE, 2003). 2004: El Salvador (OIE, 2004). 2005: Brazilië (APHISUSDA, 2005). 2009: Egypte (Eissa et al., 2009). 2010: Saoedi-Arabië, Madagaskar, Mozambique (Tang, 2013). 2011: Brunei Darussalam (OIE, 2011). (*) Hongkong werd niet weergegeven op de kaart wegens te klein.

6

2.2. TAXONOMIE Vanaf de eerste elektronenmicroscopische (EM) opname van het virus door Inouye et al. in 1994, bestond verwarring en discussie over de classificatie van het virus. Inouye en zijn medewerkers doopten het virus tijdelijk “Rod-shaped nuclear virus of Penaeus japonicus”. Het virus kreeg later nog veel verschillende benamingen toebedeeld (Tabel 1) (Escobedo-Bonilla et al., 2008).

Tabel 1. De verschillende namen gegeven aan het White spot syndrome virus

Naam Rod-shaped nuclear virus of Penaeus japonicus Third Penaeus monodon non-occluded baculovirus White spot syndrome baculovirus White spot baculovirus Systemic ectodermal and mesodermal baculovirus Hypodermal and haematopoietic necrosis baculovirus Penaeid rod-shaped DNA virus White spot syndrome virus

Afkorting

Referentie

RV-PJ PmNOB III WSSV WSBV SEMBV HHNBV PRDV WSSV

Inouye et al. (1994) Wang et al. (1995) Wang et al.(1995) Chou et al. (1995) Wongteerasupaya et al. (1995) Jie et al. (1995) Venegas et al. (2000) Lightner (1996)

Uiteindelijk werd een consensus bereikt waarbij de naam White spot syndrome virus werd aangenomen (Escobedo-Bonilla et al., 2008; Lightner, 1996). Door de morfologie (zie verder) van het virus, dacht aanvankelijk vrijwel iedereen dat het tot de familie van de Baculoviridae hoorde (zie tabel 1). Maar een genoomanalyse wees uit dat WSSV een virus is uit een voorheen nog onbekend genus. Vandaag de dag is WSSV nog steeds de enigste vertegenwoordiger van het genus Whispovirus, familie Nimaviridae. Het behoort niet tot een orde of subfamillie (ICTV, 2012; Van Hulten en Vlak, 2002).

2.3. STRUCTUUR Een intact virion met envelope is tussen 70 en 157 nm breed en 270 tot 420 nm lang (Tabel 2). Het virion is cilindrisch tot ellipsoïde en wanneer een negatieve kleuring wordt bekeken onder de EM, kan een filamenteus aanhangsel (270-310 nm x 30 nm) worden geobserveerd, waardoor het virus gelijkenissen vertoont met een spermatozoïde (Figuur 5) (Durand et al., 1996; Wongteerasupaya et al., 1995). Dit aanhangsel dat even groot is als de rest van het virion, diende als inspiratie bij het kiezen van een naam voor de familie (“nima”: Latijn voor "draad”). De functie of samenstelling is echter nog niet ontrafeld (Dantas-Lima, 2013). Op de plaats waar de ‘staart’ (welke in feite een extensie van de envelope is) overgaat in de rest van de envelope, is een plugachtige structuur aanwezig (Figuur 5A) (Tsai et al., 2006). De EM-opnames tonen dat de envelope 6-8 nm dik is en uit een trilaminaire lipidemembraan bestaat. Eén elektronendense laag wordt beiderzijds omgeven door een elektronentransparante (Figuur 5B) (Durand et al., 1997; Inouye et al., 1994; Kasornchandra et al., 1998).

7

Tabel 2. Overzicht van de gerapporteerde afmetingen van het White spot syndrome virus

Intact virion* (nm)

NC(+) (nm)

NC(-) (nm)

NC(±) (nm)

Land van oorsprong

L

B

L

B

L

B

L

B

330

87

220

70

-

-

-

-

Taiwan1

330

120

275

85

-

-

-

-

China²

350-375

150-157

325

120

395

83

+70

- 37

China³

275

83

-

-

-

-

-

-

Japan4

275

83

216

54

-

-

-

-

Japan²

375

167

290

75

-

-

-

-

Korea5

276

121

201

89

302

73

+101

-16

Thailand6

250-380

70-150

-

-

330-350

58-67

-

-

Thailand7

300-420

110-140

-

-

300-420

70-95

-

-

Thailand8

275

120

236

85

-

-

-

-

Thailand²

266

112

-

-

420

68

-

-

Indië9

320

80-100

182-250

60-80

-

-

-

-

Indië10

270

110

260

80

-

-

-

-

Indië²

320

120

260

80

-

-

-

-

Indonesië²

275

120

230

85

-

-

-

-

Maleisië²

NC(+): nucleokapsied omgeven door envelope, NC(-): nucleokapsied niet omgeven door envelope, NC(±): verschil in afmeting van het naakte nucleokapsied (+ is groter en - is kleiner). L: Lengte, B: Breedte. Laagste waarde, hoogste waarde. Referenties: (1) (Chou et al., 1995). (2) (Kasornchandra et al., 1998). (3) (Zhan et al., 1998). (4) (Inouye et al., 1994). (5) (Park et al., 1998). (6) (Wongteerasupaya et al., 1995). (7) (Wang et al., 1995). (8) (Durand et al., 1996). (9) (Hameed et al., 1998). (10) (Rajendran et al., 1999). (*) Bij de bepaling van de afmetingen van het intacte virion, werd geen rekening gehouden met het filamenteus aanhangsel.

Onder de envelope ligt het nucleokapsied. Het heeft de vorm van een langgerekte ellipsoïde. Wanneer het nucleokapsied nog niet omgeven is door de envelope tijdens de replicatiecyclus of wanneer de envelope is geruptureerd, neemt het nucleokapsied de vorm aan van een cilinder, wordt de structuur langer en minder breed (Tabel 2). Deze veranderingen in vorm en lengte wijzen erop, dat het nucleokapsied onder spanning in de envelope is geassembleerd (Escobedo-Bonilla et al., 2008; Hameed et al., 1998; Wongteerasupaya et al., 1995; Zhan et al., 1998). Het verschil in lengte van nucleokapsieden wordt zelden gerapporteerd, maar het lijkt erop dat ook dit aan hevige variatie onderhevig is. Een naakte nucleokapsied zal in de meeste gevallen zodanig uitzetten, dat ze langer wordt dan het intacte virion (Tabel 2 en Figuur 5E). Gedegradeerde nucleokapsieden hebben een gezwollen en gearceerd voorkomen en lijken gerelaxeerd in vergelijking met de hoger beschreven cilindrische vorm van het nucleokapsied. (Durand et al., 1996; Durand et al., 1997). Zichtbaar op nucleokapsieden is het gebande patroon. Dit uitzicht wordt verkregen door een opstapeling van ringvormige structuren bestaande uit virale proteïnen (VP) 664 (Figuur 5D & 5E) (Tsai et al., 2006). De wand van het nucleokapsied is 6 nm dik (Hameed et al., 1998; Kasornchandra et al., 1998). De kern van het nucleokapsied is zeer elektronendens en bevat het DNA-bindend proteïne VP15 en het DNA zelf.

8

Fig. 5 Structuur van het White spot syndrome virus 5A Compleet, intact virion (Computer enhanced). Ex: filamenteuze extensie, Env: envelope. P: Plugachtige structuur. 5B EM-opname van een intact virion. NC: nucleokapsied. 5C EM-opname van een intact virion met een erratische implantatie van de filamenteuze extensie (EEx). 5D EM-opname van een naakt nucleokapsied. Het verschil in vorm met het nucleokapsied in Figuur 2B is duidelijk. Het gebande patroon is hier ook duidelijk zichtbaar. Witte pijl: ringvormig proteïne-structuur. 5E EM-opname. Hier is duidelijk te zien dat de naakte nucleokapsieden (witte pijlen) een grotere lengte bezitten dan de intacte virions (zwarte pijlen). Naar Tsai et al. (2006) (5A), Wongteerasupaya et al. (1995) (5B), Durand et al. (1997) (5C), Leu et al. (2005) (5D & 5E).

9

Tussen de envelope en het nucleokapsied ligt een derde structuur; het zogenaamde tegument. Het is een partieel permeabele laag, waar VP664 met zijn knop-domein doorsteekt. Het hoofdproteïne van het tegument is het VP26. Het VP26 is bovendien ook aanwezig op de buitenzijde van het tegument, waar het interdigiteert met de uitstekende VP664-domeinen. Een dergelijke structuur zorgt waarschijnlijk voor de flexibiliteit van het nucleokapsied die nodig is om het nucleokapsied in de envelope te krijgen. VP26 lost op in hoge zoutconcentraties, waardoor het nucleokapsied een meer rigide, cilindrische vorm zal aannemen (Tsai et al., 2006).

2.4. GASTHEER-RANGE EN VECTOREN Alle Decapoda zouden gevoelig zijn voor infectie met WSSV en daartoe behoren ook Europese species, zoals de N. norvegicus, Homarus gammarus, Cancer pagarus en zelfs onze grijze noordzeegarnaal de C. crangon (Bateman et al., 2012; Pradeep et al., 2012; Stentiford et al., 2009). Ook andere crustaceeën (zowel zout- als zoetwater) zoals onder andere Artemia sp., Artemia fransciscana, Polychaeta, Copepoda (allen belangrijk als voedselbron voor de aquacultuur van zowel garnalen, krabben, kreeften als vissen) en de Squilla mantis (Eng: mantis shrimp) zijn gevoelig voor het virus. Zelfs bij bepaalde insecten(larven) werd WSSV teruggevonden (Desrina et al., 2013; Pradeep et al., 2012). Voor een uitgebreide opsomming van alle gevoelige species: zie de reviews van EscobedoBonilla et al. (2008) en Pradeep et al. (2012). Niet alle gevoelige species tonen symptomen of sterven wanneer het virus zich in het lichaam van de gastheer bevindt of repliceert.

2.5. PATHOGENESE, LATENTIE EN TRANSMISSIE Twee tot zeven dagen na het verschijnen van de eerste symptomen bij de eerste garnaal, wordt een mortaliteit van 100% gezien. Geïnfecteerde garnalen worden lethargisch en de aanhangsels verkleuren rood tot roze, ze verliezen hun eetlust en de cuticula begint los te komen. In de meeste gevallen, verschijnen er witte vlekken door calciumafzetting (diameter van 0,5 mm tot 1 cm) aan de binnenzijde van de carapax. Eén à twee dagen voor er mortaliteit optreedt, verzamelen de garnalen zich aan de rand van de kweekvijver (Chang et al., 1996; Chou et al., 1995; Kasornchandra et al., 1998; Kou et al., 1998; Lightner, 1996; Lo et al., 1996). Het virus kan latent aanwezig zijn in asymptomatische en zelfs specific pathogen free (SPF) garnalen. Bij garnalen waarbij conventionele PCR geen positief resultaat opleverde, kon een DNA-microarray drie ORFs blootleggen die sterk tot expressie kwamen (ORF 151, 366 en 427) terwijl structurele genen zoals VP28, VP24 en VP15 relatief weinig tot expressie kwamen. Bij PCR-positieve garnalen was de situatie omgekeerd (Khadijah et al., 2003). Later kon daar nog het ORF 89 en het ORF 403 aan toegevoegd worden (He en Kwang, 2008; Hossain et al., 2004). Het ORF 427 bindt met een voorheen onbekend serine/threonine proteïne fosfatase en het ORF 403 codeert voor een E3 ubiquitine ligase (He en Kwang, 2008; Lu en Kwang, 2004). ORF 89 gaat zijn eigen promotor

10

onderdrukken, alsook het WSSV-thymidine-thymidylaat kinase en proteïne kinases genen op het transcriptioneel niveau (Hossain et al., 2004). De spreiding van land naar land en van kwekerij naar kwekerij, werd eerder besproken (zie hoger). Hoe het virus zich van garnaal naar garnaal spreidt is nog niet helemaal duidelijk. Er zijn verschillende wijzen beschreven waarop een garnaal zich kan besmetten met WSSV.

Een eerste methode waarop een garnaal zich kan besmetten, is door het opeten van eerder aan WSSV gestorven dieren, aangetoond door Chang et al. (1996): de eerste geïnfecteerde cellen 16 uur post-infectie waren de cellen van de maag, hepatopancreas, kieuwen en de cuticulaire epidermis. Zes uur later waren ook de antennale klier, het hart, de darm, het hematopoïetisch weefsel en het lymfoïd orgaan geïnfecteerd. Enkele uren later werden werd er virus in het oog, het zenuwstelsel en het spierweefsel teruggevonden. Enkel (en alle) mesodermale en ectodermale cellen van voorgenoemde organen zijn gevoelig voor het virus. Ook door ingestie van andere door WSSV geïnfecteerde dieren (vectoren) kan het WSSV de garnalen binnendringen, zoals gedemonstreerd met Brachionus rotiferen (Zhang et al., 2006).

Tevens wordt verticale transmissie gezien (Lo et al., 1997). WSSV werd teruggevonden in testes, ovaria, folliculaire cellen, oögonia en oöcyten (Lo et al., 1997). Hoewel Lo et al. (1997) en Debanath et al. (2014) geen WSSV konden aantonen in eieren met PCR, vonden de laatste wel een negatieve invloed van WSSV-positieve P. monodon moederdieren op hun mature eieren; van alle mature eieren gelegd door geïnfecteerde moederdieren, kipten er minder uit dan van de eieren gelegd door WSSVnegatieve soortgenoten. Hsu et al. (1999) rapporteerde dat maar enkele procenten van zwaar geïnfecteerde dieren in staat waren om te paaien (Eng: spawning), terwijl licht geïnfecteerde dieren dezelfde paairatio kunnen voorleggen als WSSV-negatieve. Bovendien testten alle eieren van de zwaar geïnfecteerde groep positief na een éénstaps-PCR, terwijl via dezelfde detectiemethode maar één ei van de 17 licht geïnfecteerde moederdieren, positief testte. Wanneer er op de eieren van de licht geïnfecteerde dieren een tweestaps-PCR werd toegepast, werden er slechts twee positief bevonden op WSSV. Na het paaien, werden 6 (op 17) van de licht geïnfecteerde moederdieren, zwaar geïnfecteerd en werden er vier (op 15) van de initieel WSSV-negatieve garnalen, licht geïnfecteerd en één zwaar geïnfecteerd. Het is dus duidelijk dat paaien latent aanwezig virus kan reactiveren. Dit komt, doordat tijdens en na het paaien, het actieve signaal-transductie-en-activator-van-transcriptie-proteïne (STAT, door fosforylatie) van de garnaal in sterke mate toeneemt (Lin et al., 2012). Activatie van het STAT is belangrijk voor de transcriptie van het immediate-early gen ie-1 van WSSV, dat op zijn beurt de virale replicatiecascade in werking doet treden (Liu et al., 2005; Liu et al., 2007).

Ook via het water kunnen dieren worden geïnfecteerd, zij het door experimenteel WSSV-partikels te introduceren in het water (Chou et al., 1998; Supamattaya et al., 1998) of door cohabitatie met geïnfecteerde soortgenoten door direct en/of indirect contact (Flegel et al., 1997; Tuyen et al., 2014). De exacte ingangspoort van het virus blijft evenwel niet gekend. Corteel et al. (2009) leverden het bewijs dat P. vannamei garnalen gevoeliger waren voor infectie door immersie nadat ze juist hadden verveld.

11

Er werd ook gevonden dat wonden een infectie met WSSV faciliteren. De mortaliteit en morbiditeit bleven echter ver beneden de 100%. De publicatie toonde wel duidelijk aan dat de cuticula een barrière is die moet worden doorbroken of omzeild door WSSV om in de gastheer te kunnen geraken. Er bestaan slechts twee structuren in de garnaal die zowel in directe verbinding met de buitenwereld staan, als een lumen bezitten die niet beschermd wordt door een cuticula of een andere chitine-bevattende beschermlaag, namelijk de tegumentale klieren (Juberthie-Jupeau en Crouau, 1977) en de antennale klier. Beiden hebben bovendien een link met de vervellingscyclus (Ahearn et al., 2004; Namvongsakool et al., 2015) en zijn geassocieerd met WSSV-infectie: de antennale klier als doelwitorgaan (Momoyama et al., 1994) en de tegumentale klieren met hun rol in de vorming van de witte vlekken (Wang et al., 1999). Omwille van deze eigenschappen en de onopgehelderde structuur van de antennale klier bij de P. vannamei, zal dit orgaan onderdeel uitmaken van deze thesis.

3. ALGEMENE MORFOLOGIE VAN DE PENAEIDE GARNAAL Om de morfologie en anatomie van de antennale klier beter te kunnen situeren, wordt eerst een overzicht gegeven van de algemene anatomie van de penaeide garnaal. De externe morfologie van de garnaal wordt weergegeven in Figuur 6. De garnaal bestaat grosso modo uit twee delen: (i) de cephalothorax die bijna alle organen bevat en (ii) het abdomen, dat hoofdzakelijk bestaat uit spierweefsel. Twee paar antennulae zijn aanwezig op de eerste segmenten (styloceriet) van de cephalothorax. Op het lidmaat van het tweede segment is een lange antenne ingeplant (ook wel het tweede paar antennen genoemd) (Chan, 1998; Felgenhaur, 1992).

Fig. 6 Algemene, externe morfologie van de Penaeus vannamei A: rostrum B: carapax A+B: cephalothorax, C: lichaamslengte, D: abdomen, E: antennulae, F: styloceriet, G: scaphoceriet, H: endopodiet van de antenna, I: flagellum van de antenna, J: maxillipoda, K: pereiopodae, L: pleiopodae, M: uropoda, N: exopodiet van de uropodiet, O: endopodiet, P: telson, Q: dorsale kam. Naar Chan (1998).

12

De opening van de antennale klier (de nefroporie) is gesitueerd ter hoogte van het proximale segment van de antenna, dat wordt aangeduid als de coxipodiet of coxiceriet (Figuur 7). Deze vormt een rigide articulatie met het basipodiet of basiceriet. Protopodiet is een term die soms gebruikt wordt om deze eerste twee segmenten aan te duiden. Op het basiceriet zijn zowel de endopodiet (mediaal) als het exopodiet (lateraal) ingeplant. De antennale exopodiet is ook gekend als het scaphoceriet of de antennale schaal. De endopodiet kan men van proximaal naar caudaal onderverdelen in het ischioceriet, meroceriet en carpoceriet. Het terminale flagellum tenslotte, is annulair gesegmenteerd. De plaats waar het lumen van de cephalothorax overgaat in dat van de coxipodiet, wordt aangeduid als het foramen van de antenna (Stachowitsch, 1992; Young, 1959).

Fig. 7 De aanhangsels van het tweede segment van de Penaeus vannamei: het tweede paar antennen of antennae Links: ventraal zicht en rechts lateraal zicht. A: coxipodiet of coxiceriet B: basipodiet of basiceriet C: ischioceriet, D: meroceriet, E: carpoceriet, F: flagellum, G scaphoceriet of exopodiet van de antenna, NP: nefroporie, A+B+C+D+E: pediculum van de antenna, A+B: protopodiet van de antenna, C+D+E: endopodiet van de antenna.

4. DE ANTENNALE KLIER 4.1. ALGEMENE OPBOUW De bilateraal aangelegde antennale klier is samen met de maxillaire klier het primaire excretieorgaan bij Crustacea. Beiden komen niet samen voor. Het is ook bekend als de antennaire klier, groene klier of renale klier. In het algemeen bestaat de antennale klier van Crustacea uit drie onderdelen: (i) de coelomosac, (ii) een efferente ductus en (iii) een terminale ductus die uitmondt in een nefroporie (Freire et al., 2008; Icely en Nott, 1979; Young, 1959). De coelomosac is een terminale blindzak en zou een overblijfsel zijn van het coeloom. Dit alles maakt van de antennale klier een gesegmenteerd coelomoduct-orgaan. De verschillende segmenten van de klier zouden tijdens de embryogenese ontstaan uit twee groepen van antennale mesodermcellen. De ene groep cellen zal de coelomosac vormen, terwijl de andere groep oorsprong geeft aan de efferente ductus. Over de mesodermale oorsprong van de efferente ductus, bestaat enige discussie in de literatuur. Sommige onderzoekers

13

denken dat de efferente ductus ectodermaal weefsel is (Goodrich 1946), anderen denken dat ze inderdaad van mesodermale oorsprong is zoals hoger beschreven (zie Anderson 1973 en Freire et al. 2008). De terminale ductus is ectodermaal van oorsprong (Anderson, 1973; Fingerman, 1991; Holliday en Miller, 1984). Ondanks de gelijkenissen bestaan er toch verschillen in de structuren van de antennale klieren tussen de verschillende soorten crustaceeën. Bij de Decapoda is de efferente ductus geëvolueerd tot een labyrint dat distaal uitmondt in een urinaire blaas, dat overeenkomt met de terminale ductus. Deze verschillende segmenten vormen samen een single nephronachtige structuur dat in vele aspecten gelijkt op de verschillende onderdelen van een vertebrate nier (Al-Mohsen, 2009; Beams et al., 1956; Behnke et al., 1990; Buranajitpirom et al., 2010; Felgenhaur, 1992; Fingerman, 1991; Fuller et al., 1989; Johnson, 1980; Khodabandeh et al., 2005a; Lin et al., 2000; Nakamura en Nishigaki, 1991; Nakamura en Nakashima, 1992; Peterson en Loizzi, 1974a; Roldan en Shivers, 1987; Vogt, 2002; Wheatly et al., 2004; Xiaoyun et al., 2003; Xugang et al., 2013). De similariteiten tussen de excretieorganen van Decapoda en zoogdieren gaan zelfs zover dat in 1941 een soort van nierstenen beschreven werd in de coelomosac van de rivierkreeft Cambarus clarkii (Maluf, 1941). De nefroporie situeert zich ter hoogte van het coxipodiet van de antennae; vandaar de naam ‘antennale klier’ (Nakamura en Nishigaki, 1991; Young, 1959). Hieronder zal de (ultra)structuur, morfologie en anatomie van de verschillende onderdelen van de antennale klier bij Decapoda worden beschreven en zal kort de functionele rol worden aangekaart. Voor een uitgebreide review over de structuur-functie relatie van de antennale klieren, wordt verwezen naar de review van Freire et al. 2008.

4.2. COELOMOSAC De coelomosac is de plaats waar de ultrafiltratie plaatsvindt (Behnke et al., 1990; Felgenhaur, 1992; Holliday en Miller, 1984; Johnson, 1980; Nakamura en Nishigaki, 1991; Nakamura en Nakashima, 1992; Peterson en Loizzi, 1974b; Schmidt-Nielsen et al., 1968; Vogt, 2002; Xiaoyun et al., 2003). Hoe de coelomosac gevoed wordt met hemolymfe, is niet volledig duidelijk. Meestal wordt de coelomosac omgeven door hemolymfe sinussen die gevoed worden door arteriae (Al-Mohsen, 2009; Khodabandeh et al., 2005a; Panikkar, 1941; Schaffner en Rodewald, 1978; Schmidt-Nielsen et al., 1968; Tikær Andersen en Baatrup, 1988; Tsai en Lin, 2014; Ueno en Inoue, 1996; Vogt, 2002). Andere onderzoekers maken gewag van bloedvaten die in direct contact staan met de basaalmembraan van de coelomosaccellen (Holliday en Miller, 1984; Xiaoyun et al., 2003). Nog anderen rapporteren dat de coelomosac van de P. japonicus vrij in de hemocoel ligt (Nakamura en Nishigaki, 1991s). De coelomosac vertoont een grote similariteit met de glomerulaire lichamen die we kunnen terugvinden in de vertebrate nier.

De (ultra)structuur van de coelomosac lijkt redelijk constant te zijn over de verschillende Crustacea heen. Het epitheel van de coelomosac is éénlagig (in sommige publicaties pseudomeerlagig), bestaande uit podocyten die morfologisch zeer sterk lijken op de podocyten van het Bowmankapsel. Tussen de podocyten zijn er intercellulaire kanalen zichtbaar die continu lijken open te staan, terwijl ze

14

toch met elkaar in connectie staan door desmosome-like junctions. Tight junctions zijn niet aanwezig. Doorheen deze kanalen, loopt het ultrafiltraat naar het lumen van de coelomosac toe. Aan de basale zijde van de podocyt, staat de cel in nauw contact met de basaalmembraan door middel van cytoplasmatische cytopodia (Al-Mohsen, 2009; Buranajitpirom et al., 2010; Fingerman, 1991; Freire et al., 2008; Khodabandeh et al., 2005a; Peterson en Loizzi, 1974a; Schaffner en Rodewald, 1978; Schmidt-Nielsen et al., 1968; Tikær Andersen en Baatrup, 1988; Tsai en Lin, 2014; Ueno en Inoue, 1996; Ueno et al., 1997; Xugang et al., 2013). Ongeveer 50-100 nm bovenop deze basaalmembraan (die gewoonlijk in direct contact staat met de hemolymfe, arteriële wand of hemolymfe sinussen) en tussen de basale cytopodia, ligt een dunne membraan; het sleufdiafragma (Schaffner en Rodewald, 1978; Vogt, 2002). Het diafragma dient als een secondaire filtratiebarrière die macromoleculen die doorheen de basaalmembraan zijn geraakt, tegenhoudt. De diameter van de poriën van het sleufdiafragma wordt op 5-6 nm geschat. Een zeldzame keer kunnen meerdere sleufdiafragma’s boven elkaar voorkomen. De lamina densa is de zone tussen het diafragma en de basaalmembraan en bevat een relatief groot aantal macromoleculen (Schaffner en Rodewald, 1978). Het apicale deel van de podocyt bevat dense lichamen, mitochondria, golgicomplexen, (pinocytotische en endocytotische) vesikels, vacuolen, endosomen, ribosomen, een ruw endoplasmatisch reticulum en een grote kern met een duidelijke nucleolus (Figuur 8) (Khodabandeh et al., 2005a; Peterson en Loizzi, 1974a; Tsai en Lin, 2014; Ueno en Inoue, 1996).

Fig. 8 Ultrastructuur van de coelomosac Pc: podocyt, bM basaalmembraan, H: hemolymfe, CL: coelomosaclumen, CP: cytopodia, ICK: intercellulaire kannalen, SD: sleufdiafragma, V: fagocytotische vesikels, G: golgi-apparaat, E: endosomen, N: nuclei, n: nucleoli, DL: dens lichaam, B: blebbing, GL: gevormd lichaam, Hc: hemocyt. De rode pijl geeft de vloeistofstroom weer vanuit de hemolymfe naar het coelomosaclumen. De dense lichamen worden door de cellen geëxcreteerd door een proces dat ‘blebbing’ wordt genaamd. Het geheel wordt afgeknepen (*) en is nu onderdeel van de urine.

Terwijl het ultrafiltraat de intercellulaire kanalen passeert, wordt het gemodificeerd door pinocytose. Hiervan zijn de vele pinocytotische vesikels langsheen de laterale celmembraan en de aanwezigheid

15

van een coated pit het bewijs. Deze vesikels zullen fusioneren met de dense lichamen of coalesceren tot vacuolen (Peterson en Loizzi, 1974a; Ueno en Inoue, 1996). Proteïnen kunnen worden gereabsorbeerd vanuit het coelomosaclumen door endocytose. Ook deze vesikels zullen versmelten met de dense lichamen, waarin digestie van de inhoud plaatsvindt (Kirschner en Wagner, 1965). Na+/K+ATPasen zijn basaal aanwezig ter hoogte van de cytopodia. In het apicale celgedeelte zijn V-type H+ATPasen, Na+/K+/2Cl--cotransporters en Na+/H+-uitwisselaars terug te vinden in de membraan van de endosomen (Tsai en Lin, 2014). Podocyten zijn aldus in staat om verschillende substanties zoals ionen (ionaire huishouding), metaalpartikels (detoxificatie functie), (macro)moleculen en proteïnen op te nemen en in sommige gevallen ook te metaboliseren (Doughtie en Rao, 1984; Holliday en Miller, 1984; Riegel, 1970; Roldan en Shivers, 1987; Schmidt-Nielsen et al., 1968; Ueno en Inoue, 1996; Ueno et al., 1997). Macrosecretie via een proces ‘blebbing’ (Figuur 8) genaamd, resulteert in zogenaamde ‘gevormde lichamen’ (Eng: formed bodies) in het coelomosaclumen (Khodabandeh et al., 2005a; Riegel, 1966a; Riegel, 1966b; Ueno en Inoue, 1996; White en Walker, 1981). Ze bevatten acide proteasen, peptiden en aminozuren. Waarschijnlijk zijn deze gevormde lichamen dus uitgestoten dense lichamen na versmelting met de vesikels. Ze worden aangetroffen op twee plaatsen in de antennale klier: in het lumen van de coelomosac en in dat van het labyrint. Enkel de gevormde lichamen aanwezig in het labyrintlumen zijn osmotisch actief; naarmate de gevormde lichamen van proximaal in de antennale klier naar distaal migreren, worden ze minder dens en zwellen ze om finaal te barsten. De hypothese luidt, dat wanneer de lichamen zich nog in het lumen van de coelomosac bevinden, ze nog grote, onverteerde macromoleculen bevatten die structureel gebonden zijn. Eenmaal ze arriveren in het lumen van het labyrint, waar de pH lager is, wordt het pH-afhankelijke protease actief en breekt het gevormde lichaampje zijn inhoud af. De digestieproducten zijn osmotisch actief en gaan water aantrekken uit de omgeving, wat de oorzaak is van het zwellen en barsten. Ook is het mogelijk dat hydrolyseprocessen in de lichamen bijdragen tot de influx van water. Door de influx van water in de gevormde lichamen, wordt het omringende medium meer geconcentreerd. Dit zou kunnen bijdragen tot de modificatie van het filtraat in het labyrint. Dit door enerzijds het aantrekken van water naar het lumen vanuit de hemolymfe en anderzijds het creëren van een concentratiegradiënt, waardoor bepaalde deeltjes het lumen verlaten (Riegel, 1966a; Riegel, 1966b; Riegel, 1970). Het lumen van de coelomosac loopt over in dat van het labyrint (Al-Mohsen, 2009; Icely en Nott, 1979; Khodabandeh et al., 2005a; Maluf, 1941; Nakamura en Nishigaki, 1991; Panikkar, 1941). Bij sommige soorten wordt ter hoogte van de overgang tussen coelomosac en labyrint een klep of een klepapparaat gevonden (Icely en Nott, 1979; White en Walker, 1981). Bij de Macrobrachium rosenbergii is er een muur van bindweefsel tussen de coelomosac en het labyrint (Al-Mohsen, 2009). In tegenstelling tot andere soorten, ligt de coelomosac van de semiterrestrische krab Ocypode stimpsoni en de penaeide garnalen omsloten door het labyrint (Buranajitpirom et al., 2010; Tsai en Lin, 2014; Xugang et al., 2013).

16

4.3. LABYRINT Zoals hoger reeds vermeld, is de efferente ductus bij de Decapoda omgevormd tot een netwerk van anastomoserende tubuli met het uitzicht van een labyrint (Peterson en Loizzi, 1973). Het labyrint kan worden onderverdeeld in twee delen; labyrint I en II (Al-Mohsen, 2009; Khodabandeh et al., 2005a; Peterson en Loizzi, 1973; Peterson en Loizzi, 1974a). Lichtmicroscopisch uit dat zich in een donkere (labyrint I) en een iets lichtere (labyrint II) zone. De ruimtes tussen de tubuli, evenals de lumina van het labyrint I, zijn nauwer dan deze van labyrint II (Al-Mohsen, 2009). Beide epithelia hebben een apicale borstelzoom van microvilli, wat wijst op een reabsorptieve functie. Basale cytoplasmatische invaginaties komen ook in beide types labyrint voor. (Al-Mohsen, 2009; Beams et al., 1956; Khodabandeh et al., 2005b; Peterson en Loizzi, 1974a; Vogt en Quinitio, 1994). Ultrastructureel lijkt er veel diversiteit te zijn tussen de verschillende publicaties.

Peterson en Loizzi (1973) categoriseerden de labyrint-I-epitheelcellen bij de rivierkreeft Procambarus blandingii als columnair met basale nuclei en labyrint-II-cellen ook als columnair, maar minder hoog en met een centraal gelegen nucleus. Beiden bevatten ze basale invaginaties, dunne intercellulaire kanalen, cel-cel adhesies en apicale microvilli. Enkel in de labyrint-I-cellen zijn de microvilli geassocieerd met mitochondria. Labyrint-II-cellen hadden meer ruw endoplasmatisch reticulum, lysosoomachtige lichamen, endocytotische vesikels en grotere vacuoles, maar minder glycogeen en glad endoplasmatisch reticulum. Het labyrint I zou voornamelijk verantwoordelijk zijn voor een isotone, transepitheliaal vloeistoftransport vanuit de urine terug naar de hemolymfe, terwijl type II voornamelijk instaat voor de reabsorptie van proteïnen. Enkel in labyrinttype-I-cellen werden apicale extrusies waargenomen (blebs), wat volgens de auteurs kan wijzen op secretie van residuele lichamen na digestie van geëndocyteerd materiaal of ook op “cellulaire verwondingen”.

Bij de H. gammarus zijn er twee celtypes te bespeuren in het labyrint I. Columnaire cellen met apicale nuclei, gedilateerde intercellulaire ruimtes, onregelmatige basale cytoplasmatische invaginaties geassocieerd met mitochondria, een irreguliere microvilli zoom en cytoplasmatische extrusies (blebs) gevuld met vacuoles en dense lichamen worden gezien. Het tweede celtype van het labyrint I is kubisch met een centraal gelegen kern. Apicaal zijn gezwollen mitochondria aanwezig in associatie met de microvilli. Deze mitochondria werden eveneens apicaal teruggevonden in grote globulaire vesikels samen met vacuoles. Ook hier zijn basale cytoplasmatische invaginaties aanwezig, maar in tegenstelling tot het andere celtype van het labyrint I, zijn de invaginaties regelmatig en bovendien geassocieerd met ronde mitochondria, glycogeen globules en lysosoomachtige lichamen. Deze drie zijn bovendien consistent in intiem contact met elkaar. Waar de columnaire type-I-cellen intercellulaire ruimtes hebben, bevatten de kubische cellen veel zonulae adherens en tight junctions. Het labyrint II bestaat maar uit één celtype dat columnair is met een helder cytoplasma. De basale cytoplasmatische invaginaties zijn kort en geassocieerd met normale mitochondria, vesikels en grote vacuoles die fijne deeltjes bevatten. Apicaal is de borstelzoom te vinden en ook cytoplasmatische extrusies (blebs). Deze extrusies bevatten heldere vacuoles, normale mitochondria, lysosoomachtige lichamen en kleine vesikels (Khodabandeh et al., 2005b).

17

De blebs zoals gezien in het labyrint van de H. gamarus en de P. blandingii, komen eveneens voor in het labyrint van de P. monodon, gehouden aan een saliniteit die vijf maal lager is dan normaal (Buranajitpirom et al., 2010).

Een aantal auteurs spreken maar over één soort celtype in het labyrint: (hoog)columnaire cellen met cytoplasmatische invaginaties en een apicale microvilli borstelzoom (Fuller et al., 1989; Vogt en Quinitio, 1994; Xiaoyun et al., 2003; Xugang et al., 2013). Ook Al-Mohsen, die in 2009 bij de M. rosenbergii lichtmicroscopisch een onderscheid kon maken tussen het labyrint I en II, beschreef EM maar één soort celtype. Johnson rapporteerde in 1980 dat het epitheel van het labyrint bij de Callinectes wijzigt naargelang zijn fysiologische status. De cellen zijn cuboïdaal tot laag columnair met centrale of apicaal gelegen nuclei, wanneer ze zich in een niet secretoire status bevinden. Zijn ze in een secretoire toestand, dan zijn de cellen hoogcolumnair met veel vacuoles in het apicale cytoplasma, verlies van microvilli en naar basaal weggedrukte nuclei.

4.4. NEFROÏDALE TUBULUS Een (geconvolueerde) structuur die gelegen is na het labyrint en vóór de urinaire blaas, wordt enkel gevonden bij organismen die zich in een zoetwaterige omgeving bevinden, zoals de Astacus astacus, Callinectes sapidus, M. rosenbergii, Procambarus clarkii, C. clarkii en de Astacus leptodactylus (AlMohsen, 2009; Holliday en Miller, 1984; Johnson, 1980; Khodabandeh et al., 2005a; Maluf, 1941; Peterson en Loizzi, 1974a; Schmidt-Nielsen et al., 1968; Vogt, 2002; Wheatly et al., 2004). De structuur lijkt dan ook een aanpassing te zijn aan het leven in zoetwater. Het speelt vooral een rol in de reabsorptie van water en calcium (Wheatly et al., 2004).

4.5. URINAIRE BLAAS Na het labyrint of (indien van toepassing) de nefroïdale tubulus, komt de urine aan in de urinaire blaas. De hoofdfunctie van deze structuur is opslag en retentie van de urine. De cellen van de blaas zijn onderverdeeld in twee lagen: een basale laag met daarboven een epitheel dat columnair of afgevlakt is met korte microvilli. Deze conformatie zou de blaas een grotere flexibiliteit geven (Al-Mohsen, 2009; Khodabandeh et al., 2005b; Vogt, 2002).

4.6. FYSIOLOGIE Hier en daar werd per structuur reeds kort aangehaald wat hun respectievelijke functie was, maar om een helder idee te krijgen, wordt hieronder een kort overzicht gegeven.

18

De rol van de antennale klier is hoofdzakelijk osmoregulatie en dus volumeregeling van de hemolymfe (Al-Mohsen, 2009; Xugang et al., 2013). Bij species die leven in een zoetwaterig milieu, wordt hyposmotische urine geproduceerd in tegenstelling tot zoutwaterspecies die isosmotische urine produceren (Castille en Lawrence, 1981b; Riegel, 1963). Onderzoek uitgevoerd door Lin et al. in 2000 toonden aan dat P. monodon minder urine produceren in functie van een stijgende saliniteit en dat de antennale klier betrokken is bij de regulatie van magnesium, kalium en natrium. Wanneer het zeewater een hogere saliniteit heeft, produceren de penaeiden hyposmotische urine. Is de saliniteit laag, dan wordt er hyperosmotische urine geproduceerd (Castille en Lawrence, 1981a; Castille en Lawrence, 1981b).

De hemolymfe wordt door de basaalmembraan en het sleufdiafragma gestuwd door de druk die ontwikkeld wordt in de arterie, hemolymfe sinus of hemocoel (Holliday en Miller, 1984; Khodabandeh et al., 2005b; Wheatly et al., 2004). Wanneer de hemolymfe tussen de podocyten heen, door de intercellulaire kanaaltjes stroomt, vindt al een eerste modificatie van het ultrafiltraat plaats. De podocyten zijn in staat om substanties zoals proteïnen, (macro)moleculen en (metalen) partikels op te nemen en indien nodig te metaboliseren (Buranajitpirom et al., 2010; Vogt en Quinitio, 1994; Xiaoyun et al., 2003). Ter hoogte van de cytopodia vindt bovendien ionair transport plaats. Zo komen de podocyten waarschijnlijk zelf aan hun eigen nutritiënten en spelen ze een rol in detoxificatie en ionaire huishouding (Khodabandeh et al., 2005b; Peterson en Loizzi, 1974b; Xiaoyun et al., 2003). Vanuit het lumen van de coelomosac, stroomt de urine naar het lumen van het labyrint. De belangrijkste functie van het labyrint heeft niet alleen te maken met de reabsorptie van substanties (zoals ionen, proteïnen) uit de urine en resorptie van water, maar ook met eliminatie van afvalproducten (Jie et al., 1995; Vogt, 2002).

De regulatie van de osmolariteit, ionaire samenstelling en volume van de hemolymfe zijn zeer belangrijke processen tijdens en rond het moment van vervellen (Henry en Wheatly, 1992). In tegenstelling tot zijn analoog orgaan bij de zoogdieren (de nier), is de antennal gland niet het belangrijkste orgaan dat instaat voor de stikstof-excretie, maar wel de kieuwen (Freire et al., 2008).

4.7. ANATOMIE VAN DE ANTENNALE KLIER De anatomie van de antennale klier is slecht beschreven bij de penaeide garnalen. De oudst vindbare beschrijving van de antennale klier bij penaeide garnalen is van de hand van Young (1959). Hij beschrijft een compacte glandulaire structuur, gelegen in de basis van de antenne. Het orgaan reikt tot aan het carpoceriet en via een korte ductus mondt deze uit in een opening gelegen op het mediale deel van de coxipodiet. Hij identificeerde structuren onder en boven het supra-oesofagiale ganglion (de hersenen) na injectie van kleurstoffen in een Penaeus setiferus.

Xugang et al. (2013) beschrijven de structuur bij de P. vannamei macroscopisch als “een boonvormig lichaam van een ondertone kleur, in vorm enigszins als een van de vruchten van de paardenboon”

19

gelegen aan de basis van de antenna. In contradictie met andere studies over de antennale klier bij mariene Decapoda, delen zij het orgaan onder in een coelomosac, een labyrint en een nefroïdale tubulus. De coelomosac zou centraal in het orgaan liggen en het grootste volume innemen. Rond de centrale coelomosac ligt het labyrint. Het labyrint zou de hele antennale klier omsluiten. Het nefroïdale kanaal tenslotte, is gelegen op de top van de klier. Ook bij de P. monodon wordt het centrale gedeelte van het orgaan ingenomen door de coelomosac. De coelomosac is rondom omgeven door één laag van labyrinttubuli. Labyrint-I-cellen werden gezien in de perifere zone van de structuur, terwijl labyrint-IIcellen distaal van de coelomosac zijn gelegen (Buranajitpirom et al., 2010).

Twee Japanse studies tenslotte, maakten in 1991 en 1992 een kleimodel van de antennale klier van de P. japonicus door de randen van de klier te traceren op histologische coupes (Figuur 9). Deze studie beschreef dat de coelomosac uit drie zakken bestaat. De mediane zak bevatte centraal het labyrint. Uit de mediale zijde van de mediane zak, ontspruit de transversale zak. Die connecteert de beide helften van de antennale klier, juist caudaal van de hersenen en gaat deze ventraal bedekken met een hersenlob. De transversale zak, loopt naar caudaal samen om een mediane lob te vormen langsheen de middellijn van de garnaal. De mediane lob invadeert ventraal het labrum en dorsaal vormt het een korte epigastrische lobus. Het centrale gedeelte van de mediane lob divergeert juist rostraal van de oesofagus om lateraal de maag te bedekken. Dit gedeelte is volgens de auteurs, de hoofdplaats voor ultrafiltratie. Uitlopers van deze mediane lobus reiken tot aan de hepatopancreas. Uit de laterale zijde van de mediane zak, komt een korte laterale zak (Nakamura en Nishigaki, 1991; Nakamura en Nakashima, 1992).

Fig. 9 De anatomie van de antennale klier bij Penaeus japonicus MCS: Mediane coelomosac, TCS: transversale coelomosac, LCS: laterale coelomosac, BL: hersenlob, ML: mediane lob, EGL: epigastrische lob, LGL: laterale gastrische lob, UB: Urinaire blaas. (Nakamura en Nakashima, 1992).

20

DOELSTELLINGEN VAN DEZE THESIS

Uit de inleiding blijkt dat het WSSV een zeer belangrijke oorzaak is van productieverliezen in de aquacultuur van Crustacea, garnalen in het bijzonder. Om een efficiënte bestrijdingsstrategie te kunnen ontwikkelen, moet de pathogenese van het virus eerst volledig gekend zijn. Het is nog steeds niet geweten via welke route WSSV de Crustacea kan binnendringen. De cuticula werd eerder geïdentificeerd als een zeer efficiënte barrière tegen infecties. Er bestaan maar een klein aantal plaatsen waar de garnaal niet beschermd is van de buitenwereld door een cuticulaire aflijning, namelijk de tegumentale en antennale klieren. Deze structuren kunnen bijgevolg een potentiële intredepoort vormen voor WSSV. De anatomie, morfologie en functie van de antennale klier bij penaeide garnalen zijn echter nog niet voldoende gekend. Daardoor is het doel van deze thesis om hierover verdere duidelijkheid te scheppen door het toepassen van verschillende technieken zoals een 3D-weefselreconstructie, lichtmicroscopische analyse van histologische coupes en scanning elektronenmicroscopie. Speciale aandacht zal daarbij worden gegeven aan mogelijke functies geassocieerd met de structurele opbouw en de geschiktheid van de antennale klier als intredeplaats voor WSSV. Een tweede probleem bij het onderzoek naar WSSV vormt het gebrek aan degelijke basistechnieken om virusreplicatie te bestuderen. Tot op heden wordt er nog zeer frequent gebruik gemaakt van in vivo inoculaties van garnalen om WSSV te titreren in klinische stalen. Er werd daarom gekozen om in deze thesis ook een snellere, diervriendelijke en gevoeligere real-time PCR (qPCR) test te ontwikkelen. Een probleem daarbij is de potentiële inhibitorische invloed van garnalenurine op real-time PCR-prestaties, zoals ook beschreven werd bij Mammalia. Daarom werden ook twee extractiemethodes voor WSSV in urine vergeleken op hun geschiktheid in het gebruik bij qPCR. Met behulp van deze kennis en technologieën zullen we op korte termijn betere inzichten kunnen verkrijgen in de pathogenese van WSSV. Op middellange termijn zullen deze inzichten bijdragen tot het ontwikkelen van preventieve middelen tegenover WSSV, zodat de economische schade in de aquacultuur zal afnemen.

21

MATERIAAL EN METHODEN 1. MORFOLOGIE VAN DE ANTENNALE KLIER BIJ DE P. VANNAMEI 1.1. CREATIE VAN EEN 3D-BEELD OP BASIS VAN HISTOLOGISCHE COUPES MET AMIRA 1.1.1. Dieren De gebruikte proefdieren in dit experiment zijn SPF-garnalen (P. vannamei) die werden geïmporteerd uit Nederland en opgegroeid zijn in het Laboratorium voor Aquacultuur en Artemia Referentie Centrum (ARC, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent, België) in een recirculatiesysteem, waar ze drie weken tweemaal daags gevoederd werden met Artemia nauplii. Nadien werd overgeschakeld op commercieel pelletvoer (A2 monodon high performance shrimp feed, INVE Aquaculture SA, België) dat tweemaal per dag aan de garnalen werd gegeven. Twaalf van deze garnalen met een gewicht van 8-12 g, werden overgebracht naar het Laboratorium voor Virologie (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, België).

1.1.2. Experimentele omstandigheden Onmiddellijk na aankomst werden de garnalen individueel gehuisvest in doorzichtige PVC-tanks van 10 l bij een omgevingstemperatuur van 28°C. Het water dat gebruikt werd voor deze proef is artificieel zeewater (Instant Ocean, Aquarium Systems, Sarrebourg, Frankrijk) aan een zoutconcentratie van 35 g/l. Iedere tank is voorzien van een individueel aëratiesysteem en is bovenaan afgesloten met een doorzichtig PVC-deksel om evaporatie van het water te voorkomen. Tweemaal per dag krijgen de garnalen 3 pellets artificieel voeder per tank. In deze omstandigheden kregen de dieren twee dagen de kans om te acclimatiseren aan de nieuwe omgevingsomstandigheden en om te kunnen recupereren van eventuele stress door het transport.

1.1.3. Bepaling van het vervellingsstadium Om de garnalen te beoordelen op hun vervellingsstadium, werden de garnalen één voor één uit het water gelicht om hun uropoda te bestuderen onder een geïnverteerde microscoop (100-200x). De garnalen werden geselecteerd op basis van hun stadia in de vervellingscyclus volgens Robertson et al. (1987) en Corteel et al. (2012b). Zes garnalen die zich in het C-stadium bevonden, werden geselecteerd voor histologische sectie om een 3D-structuur te reconstrueren.

22

1.1.4. Staalvoorbereiding De zes garnalen die zich in het C-stadium van de vervelling bevonden, werden verdoofd en geïmmobiliseerd door ze 2 minuten op ijs te leggen (-20°C). De cephalothorax werd gescheiden van de staart met behulp van een scalpel. De hemocoel werd hierbij niet aangesneden of geopend. De cephalothoraxen werden geïnjecteerd met 1 ml Bouin fixatief (75 ml gesatureerd picrinezuur, 25 ml paraformaldehyde (40%) en 5 ml ijsazijn) om de moeilijke penetratie van het exoskelet te omzeilen. Vervolgens werden de specimen in hetzelfde fixatief ondergedompeld gedurende 12 uren bij 37°C op een zwenker. Daarna werden de garnalen overnacht gewassen in een 70% ethanol oplossing. Bij de volgende stap werden de cephalothoraxen ontwaterd in opklimmende reeksen alcohol, geklaard in xyleen met een STP 420D Tissue Processor (Microm, Prosan Merelbeke, Belgium) en ingebed in paraffine op een EC 350-2 inbeddingscenter (Microm, Prosan Merelbeke, Belgium). Tien µm dikke coupes werden gesneden met behulp van een rotormicrotoom HM360 met waterbad (Microm, Prosan Merelbeke, Belgium) en opgevangen op gelatine gecoate glaasjes. Na drogen werden de coupes gekleurd met een klassieke hematoxyline en eosine (HE-kleuring). Na kleuring werden de coupes beschermd door het aanbrengen van een dekglaasje en monteervloeistof (DPX, Sigma-Aldrich, St. Louis, VSA).

1.1.5. Beeldacquisitie en data input De coupes werden geëvalueerd met een Olympus BX50 microscoop (Aartselaar, België). Van de voor 3D-reconstructie geschikte coupes, werden er seriële digitale opnames gemaakt met een vergroting van 20x op standaardresolutie via de Cell F-software (Olympus, Aartselaar, België). Alle opnames werden bewaard onder .JPEG-formaat. Een .txt-bestand volgens het AMIRA Stacked Slices formaat werd aangemaakt dat een oplijsting bevat van alle bestandsnamen van de .JPEG-afbeeldingen samen met hun relatieve afstand ten opzichte van de eerste .JPEG-afbeelding (gebaseerd op de dikte van de coupes, in dit geval 10 µm) en de pixelgrootte van iedere coupe. Dit .txt-bestand werd samen met de digitale opnames van de coupes ingeladen in AMIRA® (versie 5.6 en later 6.0, FEI Visualization Sciences Group Europe, Mérignac, Frankrijk) als een stacked slices file format.

1.1.6. Beeldverwerking en analyse 1.1.6.1. Alignering van de coupes Eerst werden de opeenvolgende coupes automatisch gealigneerd in de AlignSlices module, gebruikmakende van de least square method. Waar nodig werden nadien manuele aanpassingen gedaan (tussen coupes waar de automatische alignering steken liet vallen). Indien de alignering met de volgende coupe onvoldoende mogelijk was, werd de coupes gealigneerd met de dichtstbijzijnde coupe

23

die wel voldoende resultaat kon geven. Eens gealigneerd, werden de coupes geresampled in een AMIRA mesh file formaat. Via de Castfield-module werd het groene kanaal van de RGBkleurenopnames geselecteerd om een grijswaardenbeeld te creëren, een noodzakelijke tussenstap om op basis van het grijswaardenhistogram en voxelwaarden, aan de volgende stap van segmentatie te kunnen beginnen. HE-kleuringen zijn overwegend rozerood tot paars. Omdat groen en rozerood plus paars tegenover elkaar gesitueerd zijn in het kleurenspectrum (rode & paarse tinten kennen nauwelijks een groene component, en zullen dus met een “groenfilter” donker aftekenen tegenover een heldere achtergrond), werd groen gekozen als referentiekanaal om het contrast te verhogen.

1.1.6.2. Segmenteren van de coupes Door het verschil in grijswaarde tussen de voxels (samentrekking tussen volume en pixel), kunnen de verschillende structuren op de 2D-coupes gevisualiseerd worden. Op elke coupe konden manueel voxels geselecteerd en toegewezen worden aan een label (= segmenteren). Verschillende labels werden aangemaakt voor verschillende structuren. Om een onderscheid te kunnen maken werd aan de verschillende labels een andere kleur toegewezen. De verschillende 2D-labels worden serieel uitgezet om samen een 3D-beeld te genereren. Om voxels te selecteren, werd gebruik gemaakt van verschillende segmentatietools. Een eerste tool die gebruikt werd om structuren te labelen, is de lasso tool. Hiermee kan een structuur manueel overtrokken worden, telkens in een gesloten pad. Dit kon met de vrije hand gebeuren of indien gewenst kon de autotrace optie worden gebruikt. Indien deze laatste optie geactiveerd was, dan kon automatisch de aflijning van contrasterende elementen getraceerd worden. Met de threshold tool werden alle voxels geselecteerd waarvan de grijswaarden gelegen zijn binnen een bepaald interval. Indien de 3D-optie aan is, wordt dit toegepast op alle coupes. In het andere geval worden enkel voxels geselecteerd op 1 coupe. Een gelijkaardige functie is de magic wand tool: met deze functie kunnen alle aaneengesloten voxels waarvan de grijswaarde binnen een aangegeven interval is gelegen, rond het aangeduide punt geselecteerd worden. Dit kan zowel per coupe apart als voor alle coupes. Met de draw limit line optie, kon de zone waarbinnen geselecteerd werd, afgebakend worden. De brush tool werd gebruikt om de gewenste voxels te selecteren door ze te ‘overschilderen’. De selectieoppervlakte kon worden aangepast in grootte en vorm (een cirkel of een vierkant). Met de pick & move tool konden eerder gecreëerde labels geselecteerd en verplaatst of verwijderd worden. De blow tool kan worden vergeleken met een ballon die wordt opgeblazen in een gesloten ruimtelijke structuur. Indien hard genoeg wordt geblazen, zal de ballon de vorm aannemen van de ruimtelijke figuur. De blow tool werkt gelijkaardig, maar dan in een 2D-context; wanneer op een voxel geklikt werd en vervolgens, zonder de muisknop los te laten, gesleept werd, verschijnt er een cirkel. Hoe verder weg van de oorspronkelijke voxel gesleept wordt, hoe groter de cirkel wordt. De cirkel wordt groter, tot de cirkel voxels tegenkomt die een veel hogere grijswaarde bezitten. Hoe groot dit verschil moet/mag zijn, kan worden ingesteld. Coupes waarop de structuur afwijkend was van de twee aansluitende coupes, werden niet aangeduid. Om de continuïteit te behouden werden door de computer labels gegenereerd via de interpolatiefunctie op basis van de twee aansluitende coupes. Zo verminderde de resolutie volgens de Z-as niet. Verschillende structuren werden aangeduid met een andere kleur.

24

1.1.6.3. 3D-reconstructie Via de SurfaceGen-module (Generate surface) werd het oppervlak en onderlinge topografie van alle gelabelde structuren driedimensionaal gereconstrueerd. Constrained smoothing werd toegepast om het oppervlak gladder te maken zonder data (gelabelde voxels) te verliezen. Voor het oppervlak, dat opgebouwd werd via een rooster van aaneengesloten driehoeken, werd de Minimal Edge Length (minimale verhouding tussen de langste en de kortste zijde van elk individueel driehoekje) ingesteld op 0,4 om de complexiteit ervan te reduceren. Het oppervlak werd nadien in de Surfaceview-module genormaliseerd op de knooppunten (Vertex normals) om

een gaver oppervlak, zonder zichtbare

driehoeken, te verkrijgen.

1.2. SCANNING ELECTRONENMICROSCOPISCHE OPNAME VAN DE NEFROPORIE 1.2.1. Dieren Zes SPF P. vannamei garnalen werden bij aankomst in het Labo voor Virologie (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, België) individueel gehuisvest in doorzichtige PVC-aquaria. De garnalen werden gehouden bij een constante temperatuur van 28°C, aan een saliniteit van 35 ppt met continue aëratie. Ze werden 2-3% van hun lichaamsgewicht gevoederd met commercieel CreveTec grower 2 (extruded pellets van 2,0 x 4 mm, CreveTec BVBA, Nederland). Voor de herkomst van de dieren wordt verwezen naar hoger.

1.2.2. Staalbereiding De dieren werden 24 uur na aankomst geëuthanaseerd door de zuurstoftoevoer af te sluiten. Zo wordt de externe morfologie het beste behouden. Eenmaal gestorven, werden de garnalen ontdaan van hun spierige abdomen en werden de mandibulae, maxillae en pereiopoda verwijderd. Ook de bovenliggende mandibulaire palpae werden verwijderd om de vermeende locus van de nefroporie vrij te dissecteren. Het overblijvend weefsel werd overgebracht in 50 ml Falcon tubes, gevuld met formol gedurende 4 dagen bij 4°C.

Drie garnalen werden uitgekozen voor verder gebruik op basis van de beste bewaring. Omdat een post fixatie stap met osmium tetroxide geen echte meerwaarde zou betekenen (de nefroporiën zijn op het exoskelet gelegen) en gezien de relatief grote volumina die zou moeten gebruikt worden, gepaard gaan met een hogere kostprijs, werd beslist om deze stap niet uit te voeren.

Dehydratatie werd uitgevoerd door het staal te wassen in verschillende oplossingen van ultrapuur water, ethanol en aceton. Eerst werd de formol verwijderd en werden de stalen afgedept met

25

absorberend papier om zoveel mogelijk formol te verwijderen. Bij de volgende stap werd drie keer 10 minuten lang gewassen in ultrapuur water. Daarna werd achtereenvolgens gewassen in 50% ethanol, 70% ethanol, 94% ethanol, 50% aceton/50% ethanol (94%), 70% aceton/30% ethanol (94%) en 50% aceton/10% ethanol (94%), telkens gedurende 30 minuten. Een laatste wasstap gebeurde overnacht in 100% aceton.

Om alle vloeistoffen uit de preparaten te verwijderen, werd de techniek van het kritisch punt drogen toegepast. Hierbij wordt alle aceton geleidelijk aan vervangen door vloeibaar CO2, dat vervolgens omgezet wordt in gasvormige CO2, zonder daarbij de verdampingslijn te passeren, zodat een zo min mogelijke wijziging ontstaat van het weefsel. Eerst worden de preparaten in de drukkamer gelaten, die daarop gevuld wordt met 100% aceton zodat de stalen volledig ondergedompeld zijn. De drukkamer wordt gekoeld tot 10°C, waarna vloeibaar CO2 in de drukkamer wordt gebracht. Er wordt 15 minuten lang gemengd. Tijdens de volgende stap wordt een deel van de vloeistof afgelaten tot het vloeistofpeil de onderste rand van het venster, aanwezig in de drukkamer, heeft bereikt. De drukkamer wordt opnieuw gevuld met vloeibaar CO2 en het proces wordt 5 keer herhaald totdat er enkel nog vloeibaar CO2 in de kamer overblijft. Vervolgens wordt de kamer opnieuw gevuld met vloeibaar CO2 en verwarmd tot 40°C. Hierdoor wordt het kritische punt van CO2 overschreden en zal een CO2-gas ontstaan. Dit gas wordt afgelaten. Om de druk in de drukkamer zo constant mogelijk te laten zakken, gebeurt dit zo langzaam mogelijk. Wanneer de druk in de drukkamer gelijk is aan de atmosferische druk, wordt de verwarming afgezet en worden de gedroogde preparaten uit het toestel gehaald. Uiteindelijk werden twee garnalen aan dit proces onderworpen.

De volgende stap in het proces is sputteren. Hierbij worden metaalpartikeltjes met een hoog atoomnummer (in dit geval platina: Pt, atoomnummer 78) afgeschoten op het oppervlak van het preparaat. De preparaten worden aldus bedekt met een mantel van platinapartikeltjes. De partikels hebben een hoge densiteit, waardoor de elektronen die afgeschoten worden door de kathode van de SEM, erop afketsen en gedetecteerd worden. Indien deze coating stap zou worden overgeslagen, zou het merendeel van de elektronen dwars doorheen het preparaat vliegen en zou er geen beeld worden gecreëerd. Vooraleer de preparaten in de glazen container van de JFC 1300 Auto Fine Coater (Jeol Ltd., Zaventem, België) worden gebracht, worden ze eerst gemonteerd op een preparaathouder, door het aanbrengen van dubbelzijdige tape. De container wordt goed afgesloten en er wordt een bijnavacuüm gecreëerd. Eens een druk van 0,5 mb is bekomen, wordt een elektrisch veld aangelegd, zodat de platinapartikels afgeschoten worden uit een platinaplaat, gelokaliseerd in het deksel van de container. De houders met preparaat worden uit het toestel gehaald en in de SEM gebracht.

1.2.3. Scanning elektronenmicroscopie Voor het maken van scanning elektronenmicroscopische beelden, werd gebruik gemaakt van de Jeol JSM 5600 LV scanning elektronenmicroscoop (Jeol Ltd., Zaventem, België) van de Vakgroep

26

Morfologie (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, België). De stalen werden op het houdertje van de SEM geplaatst en in het apparaat gebracht. Het lumen van de elektronenmicroscoop werd eerst vacuüm gezogen vooraleer een spanningsveld gecreëerd werd, zodat de elektronen van de kathode afgeschoten werden op het oppervlak van het preparaat. De verstrooide en afgeketste elektronen werden opgevangen door een ladinggekoppelde toestel camera, die een beeld doorstuurt naar de monitor van de PC. Door te combineren met de positie van het preparaat volgens de X-,Y- en Z-as, alsook met de mogelijkheid tot kantelen en draaien, contrastverhoging, helderheidsverhoging/-verlaging, konden gedetailleerde beelden gemaakt worden van het preparaatoppervlak.

27

2. DYNAMIEK VAN DE ANTENNALE KLIER TIJDENS DE ECDYSIS BIJ DE P. VANNAMEI 2.1. DIEREN Tien SPF P. vannamei garnalen werden bij aankomst in het Laboratorium voor Virologie (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, België) individueel gehuisvest in doorzichtige tanks en de kans gelaten om te acclimatiseren aan 28°C gedurende twee dagen. De tanks werden gevuld met artificieel zeewater (Instant Ocean, Aquarium Systems, Sarrebourg, Frankrijk) aan 35 ppt. Ze werden twee maal daags 2-3% van hun lichaamsgewicht gevoederd met commercieel CreveTec grower 2 (extruded pellets van 2,0 x 4 mm, CreveTec BVBA, Nederland). Voor de herkomst van de dieren wordt verwezen naar hoger.

2.2. BEREIDING VAN DE KLEURSTOFFEN De kleurstoffen werden geselecteerd op basis van hun capaciteit om vetten te kleuren, zodat ze de celmembranen van de epitheelcellen van de antennale klier zouden aankleuren. P. vannamei garnalen zijn doorzichtig maar hebben een grijs gele schijn. Lichte kleurstoffen, alsook gele, oranje en grijze werden daarom vermeden. De hepatopancreas kan in sommige gevallen een groenachtige kleur hebben, waardoor groen ook vermeden werd. Donkere (blauwe) kleurstoffen kregen dus de voorkeur. Indien gekend was dat een kleurstof zeer toxisch is, werd deze niet geselecteerd voor in vivo kleuring van de antennale klier. De concentraties zijn gebaseerd op het advies van de producent, vermeerderd met 101 om op de onvermijdelijke verdunning door resterende urine in de antennale klier te anticiperen.

Volgende kleurstoffen werden gekozen en aangemaakt: (i) 1 mg lycopeen (90%) verdund in 5 ml maïsolie, werd gekozen wegens de lipofiliteit, de felrode kleur, het algemeen gebruik en de oorsprong van de substantie. Lycopeen wordt gewonnen uit tomaten en wordt veelvuldig verkocht als hoofdbestanddeel in voedselsupplementen (Islamian en Mehrali, 2015). Lycopeen wordt daaruit volgend beschouwd als hebbende een laag risico op toxiciteit. (ii) 0,04 g pinacyanol chloride in 10 ml ultrapuur water, (iii) 1 g Nijl blauw A (Sigma-Aldrich, St. Louis, VSA) in 10 ml ultrapuur water, (iv) 0,5 g Solvent blauw 59 (98%, Sigma-Aldrich, St. Louis, VSA) in 10 ml maïsolie, (v) 0,14 g methyleen blauw (Sigma-Aldrich, St. Louis, VSA) in 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Methyleen blauw wordt in de in vivo diagnostiek van (humane) maagkanker gebruikt, door het aankleuren van celmembranen van gastrocyten die niet langer bedekt zijn door mucus (Fukuta et al., 2013).

2.3. INBRENGEN VAN DE KLEURSTOF IN DE ANTENNALE KLIER De garnalen werden uit hun PVC-tanks gevist en 2 minuten aan -72°C geplaatst om ze te immobiliseren en in een poging om de spieren te verdoven die de doorstroming van de kleurstoffen

28

dieper in de antennale klier zou kunnen verhinderen (zie 3D-model van de antennale klier). Daarna werd de garnaal onder een vergrootglas gebracht. De uitsteeksels en aanhangsels die in de weg zaten, werden verplaatst opdat een goed zicht werd verkregen op de nefroporie. Het flexibele gedeelte van een 26 Gauge Surflo®-W I.V.-katheter (Terumo Europe N.V., Leuven, België) werd ingebracht doorheen de nefroporie in het begingedeelte van de antennale klier (Figuur 10). Zoveel mogelijk urine werd verwijderd uit de klier, door gebruik te maken van de capillaire eigenschappen van het katheterlumen. Van zodra er geen urine (meer) kon worden onttrokken uit de garnaal, werd een 1 ml spuit (Terumo Europe N.V., Leuven, België) met kleurstof aan de katheter gekoppeld. De kleurstof werd geïnjecteerd in de antennale klier onder minimale druk om rupturen te vermijden. Na afloop werd de katheter verwijderd en werd de garnaal terug in zijn respectievelijke PVC-tank geplaatst voor observatie.

Fig. 10 Demonstratie van antennale katheterisatie met een 26 Gauge-katheter. Hier uitgevoerd op een in formol bewaard specimen.

29

3. OPTIMALISATIE VAN EEN REAL-TIME PCR VOOR DE KWANTIFICATIE VAN WSSV IN URINE 3.1. SELECTIE DOELWITGEN Drie genen werden onderzocht naar hun geschiktheid om als targetsequentie te dienen voor de ontwikkeling van primers voor real-time PCR: (i) het DNA-polymerasegen omwille van zijn waarschijnlijke geconserveerdheid, (ii) het viraal proteïne 28 (VP28) omdat er veel gekende sequenties van zijn en (iii) het viraal proteïne 19 (VP19). De ‘Nucleotide database’ van de ‘National Center for Biotechnology Information’ (Genbank), werd afgezocht naar alle gekende sequenties van de potentiële doelwitsequenties. De DNA-sequenties werden geëxporteerd als .FASTA-bestanden.

Er werd gezocht op volgende zoekterm voor VP19: “VP19 AND White spot syndrome virus”. Deze query leverde 25 VP19-sequenties op.

De zoekterm ”VP28 AND White spot syndrome virus” werd gebruikt om VP28-sequenties te verkrijgen. Zo werden 71 VP28-sequenties verkregen.

Om de DNA-polymerasesequenties te verkrijgen werd gezocht op “DNA polymerase AND White spot syndrome virus”. Vijf DNA-polymerasesequenties werden zo verkregen. Omdat dit aan de lage kant was, werden er ook 5 complete WSSV-sequenties genomen. Om nog meer sequenties te kunnen terugvinden, werd met de Basic Local Alignment Search Tool nucleotide (BLASTn) tool op zoek gegaan naar meer sequenties. Dit leverde 1 resultaat op.

Alle hoger vernoemde sequenties (behalve 8 synthetisch geconstrueerde klonen van VP28) werden geëxporteerd als een .FASTA-bestand naar MEGA 6.06 (Tamura et al., 2007). In de aligneringsmodus werden voor VP19, VP28 en DNA-polymerase alle sequenties gealigneerd, gebruikmakende van de ClustalW tool. De meeste VP19-sequenties waren 366 bp lang, de meeste VP28-sequenties waren 651 bp lang, en de meeste DNA-polymerasen 759 bp. Vervolgens werd het stopcodon van ieder gen geïdentificeerd (ATG) en werden de sequenties getrimd om enkel het coderende gen te behouden. Geconserveerde gebieden binnen de sequenties werden gebruikt als doelwitgen voor primerdesign. Voor het DNA-polymerase werd wegens het lage aantal beschikbare sequenties beslist om het DNApolymerasegen van de twee labostammen (WSSV-Thai-1 en WSSV-Viet) te sequeneren. Gebruikmakende van de complete WSSV-sequenties, werd een forward primer gezocht in een gebied van 100 nucleotiden voor (links van) de DNA-polymerasesequentie. Voor de reverse primer werd een gebied van 100 nucleotiden na (rechts van) de DNA-polymerasesequentie gebruikt.

30

3.2. PRIMERDESIGN Bij de zoektocht naar primers voor VP19, werd het sequentiegebied tussen de twee insertiemutaties ingegeven in de main module van het online primerdesign tool Primer3Plus (Untergasser et al., 2012). Voor VP28 werd een referentiesequentie gezocht om in te voeren in Primer3Plus. Hiervoor werd voor “Shrimp white spot syndrome virus VP28 envelope protein gene complete cds” (Accessienummer EF194079.1) gekozen. Deze volledige sequentie werd ingevoerd in de main module van Primer3Plus en de niet geconserveerde gebieden werden uitgesloten als potentieel gebied om primers uit te kiezen. Ook de twee flankerende regio’s van het DNA-polymerasegen werden elk afzonderlijk ingegeven in Primer3Plus. De forward primer en de reverse primer komen niet van éénzelfde flankerende regio. Criteria werden ingegeven om de primers optimaal te maken (Tabel 3). Tabel 3. Criteria voor het online primerdesign tool Primer3Plus

Criterium

Minimum

Optimum/absolute waarde

Maximum

Primerlengte

16 bp

20 bp

30 bp

Smelttemperatuur primers

60°C

65°C

70°C

-

-

2,00°C

GC% van de primers

30

50

80

Amplicon lengte

80 bp

-

150 bp

Zelfcomplementariteit

-

-

3 nucleotiden

3’-zelfcomplementariteit

-

-

2 nucleotiden

Poly-X

-

-

3

Na+-concentratie

-

50 mM

-

Mg2+-concentratie

-

3 mM

-

GC clamp

-

0

-

Verschil in smelttemperatuur

De gegenereerde primers voor het DNA-polymerase, VP19, VP28 en voor de sequentiebepaling van het DNA-polymerase werden met behulp van de online webmodule OligoAnalyzer van Integrated DNA Technologies (Leuven, België), gecontroleerd op hun geschiktheid als primer voor qPCR (PCR in geval van het DNA-polymerase). Primers die weinig kans hadden om homodimeren te vormen, werden gecontroleerd op specificiteit door de primers te ‘blasten’ met de BLASTn van Genbank via het Megablast algoritme. Primerparen die alle relevante WSSV-sequenties konden herkennen en bovendien goede matching vertoonden met WSSV-sequenties, werden goedgekeurd. Primers die voor meer dan 80% ononderbroken overeenkomen (80% identiteit) met een niet gewenste sequentie, werden genegeerd, tenzij de E-waarde kleiner was dan 1.

31

Specifieke primerparen werden vervolgens bij hun respectievelijke doelwitsequenties in MEGA 6.06 gebracht als extra controle, om na te gaan of alle beschikbare sequenties konden worden herkend. Een extra controle van de primers werd uitgevoerd met het online programma OligoCalc (Kibbe, 2007). Geschikte primers werden besteld bij Integrated DNA Technologies (Leuven, België).

3.3. HET TESTEN VAN DE PRIMERS OP DE LABOSTAMMEN 3.3.1.

WSSV-stammen

De WSSV-Thai-1- en WSSV-Viet-stam, zijn afkomstig uit stocks gehouden in het Laboratorium voor Virologie (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, België). De stocks worden bewaard in een diepvriezer aan -72°C. De WSSV-Thai-1-stam vindt zijn oorsprong in Thailand, waar die in 1996 geïsoleerd werd uit natuurlijk geïnfecteerde P. monodon. Na een enkele passage in rivierkreeften (Pacifastacus leniusculus), waarvan de kieuwen werden gehomogeniseerd en verdund in 10-1 PBS (pH 4,7), werd het opgestuurd door Jiravanichpaisal en Söderhall, Universiteit van Uppsala, Zweden. Het homogenaat werd in het Labo voor Virologie (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, België) intramusculair ingebracht tussen het derde en het vierde abdominale segment van P. monodon. Hemolymfe werd verzameld van gestorven garnalen (indirecte immunofluorescentie werd gebruikt om WSSV-infectie te bevestigen). De WSSV-Viet-stam is afkomstig van het ‘Research Institute for Aquaculture no. 2’, Ho Chi Minh stad, Vietnam (2003). In het Laboratorium voor Virologie (Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, België) werden verschillende passages uitgevoerd in SPF P. vannamei, waaruit de stock werd geïsoleerd. De shrimp infectious dose 50% endpoint (SID50/ml) voor de WSSV-Thai-1 stock werd bepaald op 106.6 SID50/ml en op 105.8 SID50/ml voor de WSSV-Viet stock (Corteel et al., 2009).

3.3.2. DNA-extractie uit stock Voor de extractie van het virale DNA werd gekozen voor QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Californië, VSA). Deze levert volgens Tang-Nelson en Lightner (2001) de hoogste DNA-winst op. Alle centrifugatiestappen gebeurden aan kamertemperatuur (15°C-25°C) met de microcentrifugette 4244 (ALC, Bio-Rad Laboratories N.V., Temse, België). Alle nodige stappen om contaminatie te voorkomen, werden genomen. Het startmateriaal werd ontdooid op kamertemperatuur en dooreen gemengd met de micropipet. Voor het protocol werd gebruik gemaakt van 3 buffers: buffers AW1 en AW2 werden eerst opgelost in ethanol van 96-100% volgens de instructies op de fles. Buffer AL werd geïncubeerd bij 56°C om mogelijke precipitaten op te lossen. Buffer AE tenslotte werd ook geacclimatiseerd aan kamertemperatuur. Twintig µl proteïnase K werd op de bodem van een 1,5 ml eppendorf gepipetteerd. 200 µl startmateriaal werd toegevoegd aan het eppendorf, daarbij werd 200 µl buffer AL toegevoegd. Het geheel werd gedurende 15 seconden gemengd door middel van een pulse-vortex. De eppendorf werd geïncubeerd in een warmwaterbad aan 56°C gedurende 10 minuten. Om druppels te verwijderen van de binnenkant van het deksel, werd de eppendorf gecentrifugeerd tot de centrifuge 5000 tpm

32

bereikte. Vervolgens werd 230 µl ethanol (96-100%) toegevoegd aan het staal en wederom met de pulse-vortex gemixt en kort gecentrifugeerd zoals hoger beschreven. Het mengsel werd na centrifugeren voorzichtig overgebracht naar een QIAamp Mini spin column (in een 2 ml verzameltube), zonder de rand nat te maken. Het geheel werd aan 6000 x g (8000 tpm) gedurende 1 minuut gecentrifugeerd en daarna werd de QIAamp Mini spin column uit de verzameltube gehaald en in een nieuwe, steriele 2 ml verzameltube gebracht. De oude verzameltube met het filtraat werd weggegooid. 500 µl buffer AW1 werd toegevoegd aan de QIAamp Mini Spin column, opnieuw zonder de randen te bevochtigen en gecentrifugeerd aan 6000 x g (8000 tpm) gedurende 1 minuut. Weer werd de QIAamp Mini spin column overgebracht naar een nieuwe, steriele 2 ml verzameltube en werd de oude weggegooid. Buffer AW2 werd aan een hoeveelheid van 500 µl gepipetteerd in de QIAamp Mini spin column en gedurende 3 minuten gecentrifugeerd aan 9000 x g (13.000 tpm). De QIAamp Mini spin column werd voor een derde en laatste keer in een nieuwe, steriele 2 ml verzameltube gebracht en de oude werd weggegooid. Onmiddellijk daarna werd het geheel gedurende 1 minuut gecentrifugeerd aan 9000 x g (13.000 tpm). Daarna werd de QIAamp Mini spin column overgebracht naar een nieuwe, steriele 1,5 ml eppendorf en de oude verzameltube met het filtraat werd weggegooid. De QIAamp Mini Spin column en 200 µl buffer AE werd erin gebracht. Eén minuut lang werd alles aan kamertemperatuur geïncubeerd vooraleer 1 minuut gecentrifugeerd werd aan 6000 x g (8000 tpm). Het geëlueerde DNA bevond zich nu in de eppendorf en werd nogmaals over de QIAamp Mini Spin column gebracht dat daarna in de zelfde eppendorf terug gebracht werd en nogmaals gecentrifugeerd aan 6000 x g (8000 tpm), 1 minuut lang. Deze laatste stap werd uitgevoerd om de DNA-opbrengst te verhogen. Het gewonnen DNA werd in AE buffer bewaard bij een temperatuur van -20°C. De kwaliteit van de DNAextractie werd bepaald door het meten van de optische densiteit met de Nanodrop2000 (Thermo Scientific, Delaware, VSA). Eén druppel AE buffer werd aangebracht op het oog om te kalibreren. Daarna werd per staal, 1 µl staal op het oog gebracht dat na bepaling van de optische densiteit en vóór het aanbrengen van het volgende staal gekuist werd.

3.3.3. Polymerase Chain Reaction De bestelde primers werden geleverd door Integrated DNA Technologies (Leuven, België) in gelyofiliseerde vorm. De primer-bevattende-tubes werden eerst kort gecentrifugeerd alvorens DNase/RNase-vrij water (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, VSA) toe te voegen om een concentratie van 100 µM te krijgen. Het geheel werd kort gemengd met de pulse-vortex en kort gecentrifugeerd. Deze primerstock werd bewaard aan -20°C. Tien µl van de 100 µM oplossing werd aangelengd met DNase/RNase-vrij water tot aan 100 µl om een concentratie van 10 µM te bekomen. Vervolgens werden ze gealiquoteerd in volumes van 25 µl en bewaard bij -20°C.

Voor de sequentiebepaling van het DNA-polymerasegen werd een mastermix aangemaakt met per reactie: 5 µl 5x Herculase reactiebuffer (Agilent Technologies, Santa Clara, VSA), 0,25 µl dNTP mix, 0,625 µl Herculase II DNA-polymerase (Agilent Technologies, Santa Clara, VSA), 0,625 µl forward primer (0,025 µM) en 0,625 µl reverse primer (0,025 µM) en 15,875 µl DNase/RNase-vrij water; totaal

33

23 µl. De mastermix werd bij 2 µl WSSV-Thai-1, 2 µl WSSV-Viet, 2 µl DNase/RNase-vrij water (negatieve controlestaal) gebracht, zodat een totaal reactievolume van 25 µl per staal bereikt werd. De programmatie van de T100 ThermalCycler (Bio-Rad Laboratories N.V., Temse, België), wordt weergegeven in Tabel 4.

Tabel 4. Programmatie van de T100 ThermalCycler

# cycli

t(°C)

Duur v/d cyclus

1

95

2min

95

20s

50

20s

Activatie enzyme Denaturatie annealing

30

extensie

72

30s

Terminale elongatie

1

72

3min

Bewaren

/

4°C

/

Omwille van verschillende negatieve PCR-reacties, werd ook de verdunning van de primers gecontroleerd door gebruik te maken van de Nanodrop2000 (Thermo Scientific, Delaware, VSA). Ook werden de reactiecondities aangepast.

Voor het testen van de gevonden primerparen, werd een ander protocol toegepast. Een mastermix werd aangemaakt: 5 µl OneTAQ Standaard reactiebuffer (New England Biolabs inc., Massachusetts, VSA) 0,5 µl dNTP-mix (0,2 µM), 0,5 µl forward primer, 0,2 µl reverse primer, 0,125 µl OneTAQ DNApolymerase (New England Biolabs inc., Massachusetts, VSA) en 16,375 µl DNase/RNase-vrij water. 23 µl mastermix werd bij 2 µl geëxtraheerd WSSV-Thai-1-DNA gebracht in een PCR-reactietube gebracht. Hetzelfde gebeurde met 2 µl geëxtraheerd WSSV-Viet-DNA en 2 µl DNase/RNase-vrij water als controle. De drie reactietubes werden kort gecentrifugeerd met de Spectrafuge mini-centrifuge (Labnet international inc., New York, VSA) aan 3600 tpm. Vervolgens werden ze in de T100 ThermalCycler (BioRad Laboratories N.V., Temse, België) gebracht en werden de reactiecondities ingesteld (Tabel 5). Tabel 5. Programmatie van T100 ThermalCycler

# cycli Activatie enzyme

1

Denaturatie annealing

35

extensie

t(°C)

Duur v/d cyclus

94

30 s

94

20 s

55

20 s

68

1 min

Terminale elongatie

1

68

5 min

Bewaren

/

4°C

/

3.3.4. Controle na PCR: gelelektroforese Voor de preparatie van de matrixgel (1,5%) werd 1,5 g agarosepoeder afgewogen en opgelost in 100 ml 1% TAE buffer (5 ml tris, acetaat, ethyleendiaminetetra-acetaat + 450 ml water). Het mengsel werd

34

in de microgolfoven opgewarmd tot wanneer een transparante vloeistof werd verkregen. Het mengsel werd eerst wat tijd gelaten om af te koelen (tot 55°C), voordat een 5 mm laag in de mal werd gegoten om het plastic niet te breken. Onmiddellijk na het ingieten werd een kam met brede tanden in de vloeistof geplaatst tot op een diepte van 3 mm. Er werd vervolgens gewacht tot de agarose gepolymeriseerd was, door het te laten rusten op kamertemperatuur (± 30 seconden). Eens de gel droog was, werd de kam uit de gel gehaald. De gel werd dan in het MUPID ONE elektroforesetoestel (Advance Company ltd., Japan) gebracht dat gevuld was met TAE buffer. Van elk staal werd 5 µl genomen en werd er 1 µl 6X ladingsbuffer (0,25% bromofenol blauw, 0,25% xyleencyanol FF, 40 g/100 ml sucrose) toegevoegd. Van links naar rechts werden volgende stalen in de uitsparingen van de gel aangebracht: O’GeneRuler Low Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, VSA), negatieve controle, WSSVThai-1, WSSV-Viet, smartladder (Eurogentec, Seraing, België) en opnieuw O’GeneRuler Low Range DNA Ladder. Het MUPID ONE elektroforese toestel werd 10 minuten aan 50 V gelopen, gevolgd door 30 minuten aan 100 V. Om de DNA-fragmenten te kunnen visualiseren, werd de gel na afloop van de elektroforese 20 minuten geïncubeerd in een ethidiumbromidebad. De bandjes werden zichtbaar gemaakt door de gel onder een UV-licht te brengen. Daarna werd de gel gefotografeerd met de GelDoc 1000 (Bio-Rad Laboratories N.V., Temse, België).

3.3.5. Opzuivering van het geamplificeerde DNA uit het PCR-product Het DNA werd geëxtraheerd uit het PCR-product met behulp van het PCR and Gel Clean-up kit (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland). Het protocol werd licht gewijzigd en is hier uitgeschreven. Per PCR- product werd 21 µl genomen en aangelengd met 79 µl DNase/RNase-vrij water. Daarbij werd 200 µl buffer NTI aan toegevoegd. Een NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column werd in een 2 ml eppendorf geplaatst. Van het PCR-product met buffer NTI, werd 300 µl in de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column overgebracht. Vervolgens werd 30 seconden aan 11.000 x g gecentrifugeerd. Hierdoor kon het DNA binden aan de silicamembraan in de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column en passeerde de rest van de vloeistof samen met de buffer NTI doorheen de membraan naar de 2 ml eppendorf. Deze vloeistof werd weggegoten, waarna de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column terug in de 2 ml eppendorf werd geplaatst. De silicamembraan werd gewassen door 700 µl buffer NT3 in de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column te brengen en nogmaals 30 seconden aan 11.000 x g te spinnen. Weer werd de vloeistof die in de 2 ml eppendorf was gecentrifugeerd, verwijderd en werd NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column hier opnieuw ingeplaatst. Deze laatste stap werd herhaald om de overdracht van chaotropische zouten te minimaliseren. Tijdens de volgende stap, werd de silicamembraan gedroogd door ze opnieuw te centrifugeren aan 11.000 x g, ditmaal 1 minuut lang. De resulterende vloeistof in het 2 ml eppendorf werd wederom verwijderd. De NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column werd in een nieuwe 1,5 ml eppendorf overgebracht en 20 µl buffer NE werd toegevoegd aan de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column. Het geheel werd één minuut geïncubeerd aan kamertemperatuur, waarna het 1 minuut lang werd gecentrifugeerd aan 11.000 x g. De 1,5 ml eppendorf bevatte het geëlueerde DNA en werd bewaard aan -70°C. De opgezuiverde DNAfragmenten werden opgestuurd voor sequenering.

35

3.4. SYNTHESE STANDAARD-DNA Met behulp van een gewone PCR werd uit het WSSV-Thai-1 extract WSSV-DNA vermeerderd. Meer bepaald het stukje genetische code dat gelegen is op het VP19-gen, vanaf het gebied dat overeenkomt met de forward en tot en met de code waar de reverse primer op bindt. Hiervoor werd per reactie 46 µl mastermix aangemaakt, gebruikmakende van 10 µl OneTAQ Standaard reactiebuffer (New England Biolabs Inc., Massachusetts, VSA), 1 µl dNTPmix (0,2 µM), 1 µl WSSV_VP19Fw primer (0,2 µM), 1 µl WSSV_VP19Rv primer, 0,25 µl OneTAQ DNA-polymerase (New England Biolabs Inc., Massachusetts, VSA) en 32,75 µl DNase/RNase-vrij water. In drie PCR-reactietubes werd 46 µl van deze mastermix gebracht. Aan twee van die drie werd tevens 4 µl geëxtraheerd WSSV-Thai-1 DNA aangebracht. De overblijvende PCR-reactietube diende als negatieve controle en er werd 4 µl DNase/RNase-vrij water aan toegevoegd. De stalen werden in de T100 Thermal Cycler PCR (Bio-Rad Laboratories N.V., Temse, België) gebracht en de reactiecondities werden ingesteld (Tabel 5). Na de PCR werden de stalen op een 1,5% agarosegel gebracht zoals hoger beschreven met als enig verschil, dat er twee laantjes per PCR-tube werden geladen en in plaats van 5 µl, 25 µl per laantje (plus 5 µl ladingsbuffer), zodat het volledige PCR-product door de gel werd gelopen, zo kan een zuiverder DNA-mengsel worden bekomen.

De bandjes werden bekeken onder UV-licht en de bandjes met de gewenste grootte werden uitgesneden. Het DNA werd uit de gel geëxtraheerd met behulp van de Gel and PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland). De uitgesneden agarosegel werd in een 1,5 ml eppendorf gebracht en gewogen. Voor iedere 100 mg aan gel werd 200 µl buffer NTI toegevoegd. Het geheel werd 10 minuten geïncubeerd in een warmwaterbad aan 50°C. Het mengsel werd iedere 3 minuten kort gemengd met de vortex totdat alle gel opgelost was. De vloeistof werd overgepipetteerd (tot 700 µl) in een NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column die vooraf in een nieuwe 2 ml opvangtube werd geplaatst. Tijdens een centrifugeerstap van 30 seconden aan 11.000 x g werd het DNA aan de silicamembraan gebonden. Vervolgens werd de doorgevloeide vloeistof uit de 2 ml opvangtube verwijderd. Op de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column werd 700 µl wasbuffer NT over de membraan gebracht en 30 seconden gecentrifugeerd aan 11.000 x g. Ook hier werd het doorgevloeide materiaal verwijderd. Deze stap werd nog eens overgedaan om de overdracht van chaotropische zouten te minimaliseren omdat deze zouden kunnen interfereren met de qPCR-reactie. De silicamembraan werd gedroogd door 1 minuut lang aan 11.000 x g te centrifugeren. Voor de elutiestap werd de NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Column overgebracht in een nieuwe 1,5 ml eppendorf en het geheel werd nogmaals 1 minuut aan 11.000 x g gecentrifugeerd na toevoeging van 20 µl buffer NE en 1 minuut incuberen aan de kamertemperatuur. Het geëlueerde DNA werd onderworpen aan een spectrofotometrie met de Nanodrop2000 (Thermo Scientific, Delaware, VSA) ter controle, gealiquoteerd in volumes van 12 µl en ingevroren bij -70°C. Voor aanvang van iedere ondervermelde qPCR-reactie, diende een verdunningsreeks te worden aangemaakt van het bekomen standaard-DNA om met een gekend aantal kopijen van het VP19-DNA te kunnen toevoegen in het reactieagens. Na ontdooien werden twee metingen uitgevoerd op de Nanodrop2000 (Thermo Scientific, Delaware, VSA). De gemiddelde DNA-concentratie (ng/µl) werd

36

samen met de sequentie van het amplicon ingevoerd in de online DNA copy calculator van EndMemo (Denver, VSA) om het aantal DNA-kopijen te berekenen. Vertrekkende van dit getal werd vervolgens een verdunningsreeks gemaakt van 10X DNA kopijen/µl in DNase/RNase-vrij water.

3.5. IN VITRO OPTIMALISATIE VAN DE QPCR-REACTIECONDITIES 3.5.1. Bepalen van de optimale combinatie van primerconcentratie en annealingtemperatuur Er werd op zoek gegaan naar een goede annealingtemperatuur en een goede verhouding en concentratie van beide primers. Dit werd gedaan door standaard-DNA (106 en 102) met een mastermix, dat een willekeurig gekozen primerconcentratie bevatte, te testen bij verschillende temperaturen. De temperatuur die daaruit kwam, werd gebruikt om verschillende mastermixen met verschillende concentraties aan primers te testen. Dit gaf een indicatie dat er bij 58°C en 60°C minder variatie was tussen de replicaties, dat het standaard-DNA vroeger werd gedetecteerd en minder primerdimeren werden gevormd. Ook bleek dat als de concentratie aan forward primer lager was dan deze van de reverse primer, minder primerdimeren werden gevormd en het standaard-DNA vroeger werd gedetecteerd. Omdat Primerdesign (Southampton, Verenigd Koninkrijk) de gebruikte Precision 2x qPCR MasterMix niet langer produceert, werd gebruikmakende van deze gegevens, opzoek gegaan naar de optimale combinatie van temperatuur en primerconcentratie met de nieuwe PrecisionPLUS 2x qPCR MasterMix (Primerdesign, Southampton, Verenigd Koninkrijk). Vier mastermixen werden aangemaakt met telkens een verschillende concentratie van voorwaartse primer en achterwaartse primer (Tabel 6). Tabel 6. Samenstelling per reactie van de 4 aangemaakte mastermixen

Mastermix A (50/200) B (50/100) C (50/50) D (100/50)

PrecisionPLUS 2x qPCR MasterMix

Forward primer

Reverse primer

DNase/RNasevrij water

10 µl 10 µl 10 µl 10 µl

0,1 µl (50 mM) 0,1 µl (50 mM) 0,1 µl (50 mM) 0,2 µl (100 mM)

0,4 µl (200 mM) 0,2 µl (100 mM) 0,1 µl (50 mM) 0,1 µl(50 mM)

6,5 µl 6,7 µl 6,8 µl 6,7 µl

Voor de aanmaak van de verschillende mastermixen werd gebruik gemaakt van PrecisionPLUS 2x qPCR MasterMix (PrimerDesign Ltd., Southampton, Verenigd Koninkrijk). Dit is een commerciële premix van nucleotiden, een Taq polymerase, een MgCl2 bevattende reactiebuffer en een inerte blauwe kleurstof om het pipetteren te vergemakkelijken. Het bevat de SYBRgreen-kleurstof die dubbelstrengig DNA bindt. Het DNA-SYBRgreen-complex zal groen licht uitzenden wanneer het geëxciteerd wordt met blauw licht. Naarmate meerdere dubbelstrengige DNA-moleculen worden gevormd door de voortschrijdende PCR-reactie, zal meer licht uitgezonden worden. De passieve kleurstof ROX (6Carboxyl-X-Rhodamine) is ook aanwezig in de commerciële pre-mix als een interne referentie om variatie tussen de wells, die niet veroorzaakt werd door een PCR-reactie, te normaliseren. Per well werd

37

17 µl van de respectievelijke mastermix aangebracht in een 96-wellplaat (BrightWhite real-time PCR plastic, PrimerDesign ltd., Southampton, Verenigd Koninkrijk) en werd 3 µl van het standaard-DNA (102 kopijen) aangebracht. In geval van de negatieve controle werd 3 µl DNase/RNase-vrij water toegevoegd (Tabel 7). Tabel 7. Plaatverdeling voor de in vitro optimalisatie van de qPCR-reactiecondities

Mastermix

54°C

56°C

58°C

60°C

62°C

A (50/200)

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

B (100/50)

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

C (50/50)

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

D (50/100)

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

10²

A (50/200)

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

B (100/50)

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

C (50/50)

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

D (50/100)

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

NC

102: standaard-DNA, NC: negatieve controle (water).

De plaat werd afgedekt met een optische afdekfilm (BrightWhite real-time PCR plastic, PrimerDesign ltd., Southampton, Verenigd Koninkrijk) vooraleer ze ingebracht werd in de StepOnePlus qPCRmachine (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, VSA). Eerst zal het toestel de 96-well plaat opwarmen bij 95,0°C gedurende 2 minuten zodat het dubbelstrengig DNA zal denatureren en het Taq polymerase geactiveerd wordt. Hierna, zal het toestel 40 cycli doorlopen van achtereenvolgens 95°C gedurende twee seconden (denaturatie) en 60 seconden bij 5 verschillende annealingtemperaturen: 54,0°C; 56,0°C; 58,0°C; 60,0°C en 62,0°C door het toepassen van de Veriflex Heatblock functie. Zo kon achteraf de optimale combinatie bepaald worden. Op het einde van iedere cyclus, wordt de lichtintensiteit gemeten. Hoe meer kopijen er aanwezig waren in het originele reactievolume, hoe vroeger dit signaal zal worden opgevangen. Nadat alle cyclussen zijn afgelopen, wordt ook nog een smeltcurve samengesteld. Hiervoor zal het toestel na de laatste annealingstap de temperatuur traag laten stijgen tot 95°C. Doordat de temperatuur stijgt, zullen de dubbelstrengige DNAfragmenten denatureren en hun fluorescentiesignaal zal wegvallen. Het qPCR-apparaat zal deze verschillen in fluorescentie detecteren en omzetten in een smeltcurve. De zogenaamde smelttemperatuur wordt vooral beïnvloed door de lengte van het DNA-fragment en door het percentage aan G’s en C’s. Hoe langer het DNA-fragment en hoe meer G’s of C’s het bevat, hoe hoger de temperatuur moet zijn om het dubbelstrengig DNA te denatureren. Door het bepalen van deze smelttemperatuur, kan de specificiteit van de amplificatie worden bepaald. Hoger beschreven reactiecondities werden toegepast via de StepOnePlus software (V2.2.2.). De baseline werd automatisch bepaald in tegenstelling tot de threshold, die manueel op de exponentiële fase van de amplificatiecurve wordt gezet.

38

3.5.2. Efficiëntie van de qPCR Om de amplificatie-efficiëntie en de kwantificatielimiet te bepalen, werd met de eerder bepaalde optimale annealingtemperatuur en optimale primerconcentratie een standaardcurve opgesteld. Er werd een mastermix aangemaakt (zie hoger) en verdeeld over 24 wellen voor een lineaire dynamische range van 106 kopijen/µl tot en met 100 kopijen/µl en een negatieve controle met telkens drie replicaties (Tabel 8). Tabel 8. Plaatverdeling voor het bepalen van de qPCR-efficiëntie

106

106

106

105

105

105

104

104

104

103

103

103

102

102

102

101

101

101

100

100

100

NC

NC

NC

10X: standaard-DNA-verdunning, NC: negatieve controle.

De 96-wellplaat (BrightWhite real-time PCR plastic, PrimerDesign ltd., Southampton, Verenigd Koninkrijk) werd afgedekt en het protocol gaat verder zoals beschreven voor de bepaling van een optimale combinatie van primerconcentratie en annealingtemperatuur. In additie werd er aan de software gevraagd om een standaardcurve te berekenen.

De log van elke standaard-DNA-concentratie (X-as), wordt geplot tegen de kwantificatiecyclus (Cq) waarde voor deze concentratie (Y-as). Van de resulterende standaardcurve, kunnen verscheidene reactieparameters

worden

afgeleid.

Een

eerste

parameter

is

de

richtingscoëfficiënt.

De

richtingscoëfficiënt van de standaardcurve kan worden gebruikt om de efficiëntie van de qPCR-reactie te berekenen. De efficiëntie wordt berekend volgens de formule ‘10(-1/richtingscoëfficiënt) -1’. Een efficiëntie van 100% komt overeen met een richtingscoëfficiënt van -3,32 en betekent dat de templates gedurende de exponentiële fase verdubbelen na iedere cyclus. Idealiter ligt de efficiëntie tussen de 90% en de 110%, corresponderend met een richtingscoëfficiënt van respectievelijk -3,58 en -3,10. Een volgende parameter is de correlatiecoëfficiënt R² en is een maat voor de herhaalbaarheid van de standaard-DNAreplicaties. Een ideale correlatiecoëfficiënt is gelijk aan 1. De Y-asafsnede tenslotte correspondeert met de verwachte Cq-waarde bij de laagste DNA-concentratie genoteerd op de X-as die statistisch relevante amplificatie geeft. Met andere woorden: de Y-afsnede is de theoretische detectielimiet.

39

3.6. KWANTIFICATIE VAN WSSV-DNA IN URINE VAN P. VANNAMEI 3.6.1. Huisvesting van de proefdieren De oorsprong van de virusstock en proefdieren werd hoger reeds beschreven. Twee glazen bakken van 50 l en al het gebruikte materiaal, werden voor de start van het experiment grondig gereinigd. Een eerste reiniging was mechanisch, een tweede met detergenten en voor de derde reiniging werd alles ondergedompeld in water met hypochloriet. In deze oplossing, werd alles 24 uur geweekt. Na verwijdering van de hypochloriet, werd alles nog eens afgespoeld met WSSV-vrij water, waarna alles gedroogd werd aan kamertemperatuur. Elke bak bezit een continu werkende live filter pomp en een continu aëratiesysteem. De pomp is opgebouwd uit drie lagen: de onderste laag bevat 2 mechanische filters met grote poriëngrootte, de middelste laag heeft één filter met kleine poriëngrootte en de bovenste laag bestaat uit losse plastieken cilindertjes waar bacteriële kolonisatie op mogelijk is. De bakken werden eerst gevuld met water van 27 g/l saliniteit en de 30 garnalen werden willekeurig in twee groepen verdeeld over de twee tanks. Iedere dag werd het water voor 10% ververst met 35 g/l artificieel zeewater (Instant Ocean, Aquarium Systems, Sarrebourg, Frankrijk) zodat de saliniteit van het water gradueel werd opgedreven tot 35 g/l om salinteitsschokken te vermijden.

3.6.2. Verzamelen van urine De urine werd geëxtraheerd door op dezelfde wijze te werk te gaan als wanneer getracht werd om kleurstof in de antennale klier te brengen. De in de katheter opgeklommen urine, werd met een steriele 1ml spuit (Terumo Europe N.V., Leuven, België) in een aparte 1,5 ml eppendorf gebracht. Zo werd vermeden dat (in geval van penetratie van de antennale klier) eventuele hemolymfe alle urine onbruikbaar zou maken door zijn klonterende eigenschappen. Dit vormde bijgevolg een extra controle opdat de bekomen vloeistof wel degelijk zuivere urine was. De bekomen urine werd overgebracht in steriele 1,5 ml eppendorfs en onmiddellijk op ijs gezet. Na het nemen van de urine, werden alle stalen gepoold en daarna gealiquoteerd in volumes van 120 µl. De gepoolde urine werd bewaard aan -20°C.

3.6.3. Staalbereiding en kwantificatie Van de WSSV-Thai-1 stock (106,6 SID50), werd een 104 SID50 verdunning aangemaakt in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Uit de gepoolde urine, werd 120 µl genomen en 480 µl DMEM aan toegevoegd. Hiervan werd 297 µl genomen en samengevoegd bij 33 µl 104 virusstockverdunning zodat een eigenlijke SID50 van 103 in het startmateriaal (=C) werd bekomen. Verschillende controlestalen werden ingevoegd: (i) 140 µl van de urine in DMEM (=A), (ii) 140 µl van 10 U heparine/ml in DMEM (=B), (iii) 127 µl van 10 U heparine/ml in DMEM + 13 µl 104 SID50 virusstock (=D), (iv) 127 µl DMEM + 13 µl 104 SID50 virusstock (=E) en tenslotte (v) 140 µl DMEM als extractiecontrole(=EC). Met deze stalen, werden twee extractiemethoden vergeleken: de DNA Mini Kit (140 µl staal + 60 µl PBS, Qiagen,

40

Californië, VSA) en de Viral RNA Mini Kit (140 µl staal, Qiagen, Californië, VSA). Heparine werd ingesloten in dit experiment, omdat het een gekende inhibitor is van qPCR-reacties.

Het DNA Mini Kit extractieprotocol werd hier hoger beschreven. De enige wijziging hierop is, dat in plaats van 200 µl startmateriaal, 140 µl werd gebruikt en aangelengd tot de vereiste 200 µl om evenveel virus aan de start van beide extractiemethoden te brengen. Het Viral RNA Mini Kit protocol (Qiagen, Californië, VSA), verliep als volgt: 140 µl startmateriaal werd in een 1,5 ml centrifugeertube gepipetteerd. 560 µl AVL buffer werd daaraan toegevoegd, gevolgd door 15 seconden lang vortexen. Daarna werd er 10 minuten geïncubeerd aan kamertemperatuur. Na kort te centrifugeren, werd 560 µl ethanol (96%) toegevoegd, eveneens gevolgd door 15 seconden vortexen en een korte centrifugatiestap. 560 µl van de oplossing werd getransfereerd naar een QIAamp Mini column die vooraf in een 2 ml centrifugeertube werd gebracht. Daaropvolgend werd 1 minuut gecentrifugeerd aan 6000 x g, waarna de doorgevloeide vloeistof werd verwijderd samen met de centrifugeertube. De QIAamp Mini column werd in een nieuwe 2 ml centrifugeertube gebracht. Nogmaals werd 560 µl ethanol (96%) in de QIAamp Mini column aangebracht en de procedure werd vanaf deze stap herhaald. 500 µl buffer AW1 werd op de QIAamp Mini column gepipetteerd gevolgd door 1 minuut aan 6000 x g te centrifugeren. De oude 2 ml centrifugetube werd verwijderd en vervangen door een nieuwe 2 ml centrifugetube. Bij de volgende stap werd 500 µl buffer AW2 toegevoegd aan de QIAamp Mini column en 30 minuten gecentrifugeerd met een snelheid van 20.000 x g. Om alle buffer AW2 te verwijderen, werd er na het vervangen van de 2 ml centrifugetube, een extra centrifugatiestap uitgevoerd (20.000 x g, 1 minuut lang). De QIAamp Mini column werd tenslotte overgebracht in een nieuwe 1,5 ml centrifugeertube. 80 µl AVE buffer werd op de QIAamp Mini column gebracht gevolgd door 1 minuut incubatie aan kamertemperatuur. Een laatste centrifugestap werd uitgevoerd gedurende 1 minuut aan 6000 x g.

Een mastermix werd aangemaakt, gebruikmakende van de optimale primerconcentratie zoals eerder bepaald, 17 µl mastermix werd per well geladen waarbij 3 µl van het respectievelijke staal werd toegevoegd (Tabel 9). Er werd ook een standaardcurveberekening aan toegevoegd zoals eerder beschreven. Voor de reactiecondities wordt verwezen naar hoger. Tabel 9. Plaatverdeling voor de vergelijking van extractiemethode op urine

106

106

106

-

A

A

-

A

A

105

105

105

-

B

B

-

B

B

104

104

104

-

C

C

-

C

C

103

103

103

-

D

D

-

D

D

102

102

102

-

E

E

-

E

E

101

101

101

-

EC

EC

-

EC

EC

100

100

100

-

-

-

-

-

-

NC

NC

NC

-

-

-

-

-

-

Standaard curve (per µl)

Viral RNA Mini Kit

DNA Mini Kit

A: urine + DMEM, B: heparine + DMEM, C: urine + DMEM + WSSV, D: heparine + DMEM + WSSV, E: DMEM + WSSV, EC: extractiecontrole (DMEM), NC: negatieve controle (water).

41

RESULTATEN 1. MORFOLOGIE VAN DE ANTENNALE KLIER BIJ DE P. VANNAMEI 1.1. ALGEMEEN OVERZICHT VAN DE ANTENNALE KLIER Figuur 11 & 12 geven een overzicht weer van de 3D-reconstructie van de antennale klier. De antennale klier begint rostraal in de garnaal ter hoogte van de basipodiet en coxipodiet van de antennae en het styloceriet van de antennulae (begin niet weergegeven op 3D-beeld). Bijna de volledige hemocoel is rostraal ingenomen door het rostrale deel van de structuur. De antennale klier zal de hersenen rostraal, dorsaal, lateraal, ventraal en caudaal omsluiten en loopt verder naar caudaal waar het overgaat in het compacte glandulaire gedeelte. Het compacte gedeelte is bilateraal aanwezig en mondt uit in een ventraal gelegen blaas die rostraal eindigt in de nefroporie. Deze ventrale blaas is eveneens gelegen in de coxipodiet van de tweede antenne. Een caudale uitloper van de ventrale blaas, zal verbinding maken met het contralaterale orgaan: de pre-oesofagiale connectie. Caudaal daarvan, geeft de uitloper van de ventrale blaas oorsprong aan het laterale blad. Het laterale blad bedekt de laterale zijde van de maag volledig. Communicaties tussen de twee helften, komt vier keer voor: (i) juist rostraal van de oesofagus (pre-oesofagiale connectie), (ii) juist caudaal van de oesofagus (postoesofagiale connectie), (iii) vlak voor de hepatopancreas (pre-hepatopancreale connectie) en (iv) onrechtstreeks via de mediane blaas. Het laterale blad zendt caudale uitlopers die ophouden lateraal van de hepatopancreas. De mediane blaas is gelegen rostraal en dorsaal van het meest rostrale deel van de maag. De meest caudale structuren van de antennale klier, zijn de caudale uitlopers die tot lateraal van de hepatopancreas reiken (Figuur 11 & 12). Over de gehele antennale klier, werd lichtmicroscopisch nergens sporen gevonden van een cuticula.

CD Vb

H

RS

UVb

CU

LB

DL

HP

M DL UVb

LB

CU

Vb CD

Fig. 11 3D-reconstructie van de antennale klier, dorsaal zicht. RS: rostrale structuur, CD: compact deel, Vb: ventrale blaas, UVb: uitloper van de ventrale blaas, CU: caudale uitlopers van het laterale blad LB: lateraal blad, DL: dorsale lob van de mediane blaas, H: hersenen, M: maag, HP: hepatopancreas, de zwarte pijl wijst naar rostraal.

42

DL

M

RS H

LB CD OD

POC

CU

MT

MA

UVb n Vb

HP

ME PHC

PrOC

O

Fig. 12 3D-reconstructie van de antennale klier, lateraal zicht. RS: rostrale structuur, CD: compact gedeelte, Vb: ventrale blaas, UVb: uitloper van de ventrale blaas, PrOC: pre-oesofagiale connectie, LB: lateraal blad, CU: caudale uitlopers van het laterale blad, DL: dorsale lobus van de mediane blaas, POC: post-oesofagiale connectie, PHC: pre-hepatopancreale connectie, H: hersenen, n: nervus, O: oesofagus, M: maag, HP: hepatopancreas, OD: oesofagiale dilatoren, MT: maxillaire tensor, MA: mandibulaire aductor, ME: mandibulaire endosterniet. De zwarte pijl wijst in rostrale richting.

43

1.2. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN DE ROSTRALE STRUCTUUR De rostrale structuur van de antennale klier is een kluwen van anastomoserende tubuli die vrij in de hemocoel gelegen zijn en dus baden in de hemolymfe (begin niet weergegeven op 3D-beeld). Ze beginnen in de basipodiet en coxipodiet van de eerste en het tweede paar antennen en gaan meer naar caudaal de hersenen volledig omsluiten (Figuur 13). Meer naar caudaal toe, worden de tubuli talrijker en gaan ze een groot deel van de hemocoel innemen. De structuur is opgebouwd uit éénlagig kubisch epitheel met grote ronde kernen en een roze gekleurd cytoplasma. Een opvallend feit is de relatie van de tubuli van de rostrale structuur met de arteriën. De tubuli houden consequent een bepaalde afstand van de meeste arteriën. Eén uitzondering hierop is te zien juist voor het protocephalon, bilateraal van de hersenen. Daar gaat één laag tubuli van de rostrale structuur de arterie kort omsluiten (Figuur 14). Op deze plaats zijn de cellen iets donkerder gekleurd dan op andere plaatsen van de rostrale structuur.

A aA

aA H

B RS C

Fig. 13 Doorsnede doorheen het rostrale deel van de antennale klier A: rostraal deel van het protocephalon, B: coxipodiet van de tweede antenne, C: ischioceriet van de tweede antenne, H: hersenen, RS: rostrale structuur, aA: antennale arterie. HE-kleuring (vergroting 10 x).

RS

RS aA

Fig. 14 Associatie van de rostrale structuur van de antennale klier met bloedvat RS: rostrale structuur, aA: antennale arterie. HE-kleuring (vergroting 200 x).

44

1.3. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN HET COMPACTE GLANDULAIRE DEEL VAN HET ORGAAN De rostrale structuur loopt bilateraal samen in een compacte, langgerekte structuur. Deze is gelegen op de overgang van cephalothorax naar de coxipodiet van de antennae. Centraal in de structuur zijn donkerdere tubuli zichtbaar. Ze bestaan uit één cellaag met grote, ronde, onregelmatige kernen met weinig cytoplasma en veel vacuoles. Dit komt overeen met de coelomosacpodocyten, zoals beschreven door Buranajitpirom et al. (2010) en Xugang et al. (2013). Het lumen van de coelomosac bestaat uit grote ruimtes omringd door kleinere koepelvormige coelomosacstructuren. De coelomosackoepels worden op hun beurt overkoepeld door sinussen, afgelijnd door afgeplat epitheel (Figuur 15 & 16). De grote luminale ruimtes van de coelomosac gaan samenvloeien in 1 groot, verticaal gericht, centraal lumen met een epitheel dat geleidelijk aan overgaat in dat van het labyrint. Dit centraal lumen, ligt ongeveer ter hoogte van de plaats waar de ventrale blaas, het compacte glandulaire deel van de antennale klier binnendringt. Het centrale lumen staat echter niet in directe verbinding met de ventrale blaas, maar gaat naar caudaal toe opsplitsen in kleinere kanalen die uitmonden in het labyrint. Het compacte deel van de antennale klier wordt gepenetreerd door de antennale arterie, die beperkte vertakkingen uitstuurt doorheen het compacte deel. De grote arterietakken worden nog omringd door dens bindweefsel.

L

L HR S

S

S

C C

HR

L

S

S

S S HR

L

L

Fig. 15 Compacte deel van de antennale klier C: Coelomosac, L: Labyrint, HR: hemolymfe ruimte, S: sinus. HE-kleuring (vergroting 200 x).

Het labyrint ligt rondom de centraal gelegen coelomosac. Het bestaat uit sterk anastomoserende tubuli met een éénlagig kubisch epitheel. Tussen de labyrinttubuli zijn eveneens hemolymfe ruimtes zichtbaar. Soms is een borstelzoom te observeren aan de apicale celwand. De kernen van het epitheel zijn regelmatig rond en kleiner dan dat van de coelomosac. Het cytoplasma heeft een lichtere kleur dan

45

dat van de coelomosac (Figuur 15 & 16). Aan de ventrale zijde van de compacte structuur gaan de tubuli van het labyrint uitmonden in de ventrale blaas, daar waar die de compacte structuur penetreert. Bij de rechter antennale klier, werd rostraal van deze uitmonding een andere verbinding van labyrinttubuli met de blaas gezien (Figuur 16).

HC

L L

HR

S

C

L

S

HC

S

Vb HR L L

Fig. 16 Verbinding van het labyrint met de ventrale blaas C: coelomosac, L: labyrint, Vb: ventrale blaas, HR: hemolymfe ruimte, S: hemolymfe sinus, HC: hemocoel. HE-kleuring (vergroting 100 x).

Het labyrint loopt verder door naar caudaal, waar de tubuli minder talrijk worden en het labyrint in zijn geheel dunner en ook kleiner (Figuur 17 & 18). Het labyrint blijft tegen de ventrale blaas liggen, maar de lumina van de twee structuren maken geen contact met elkaar. De compacte structuur eindigt caudaal in een driehoek, ter hoogte van het meest rostrale lumen van de maag. Het labyrint loopt ook door naar rostraal, waar ze verbinding maakt met de rostrale structuur en ook zal uitmonden in de ventrale blaas.

* *

Fig. 17 3D-reconstructie van het compact deel van de antennale klier, lateraal zicht. *: verbinding met ventrale blaas, zwarte pijl: craniaal.

46

Aan de mediale zijde van het labyrint, loopt een kleine, longitudinale spier. De spier ontspringt uit de binnenzijde van het exoskelet, daar waar de coxipodiet van de antennae uit de cephalothorax ontspringt. Ze loopt naar ventromediaal en gaat in het begin van haar verloop, het compacte gedeelte dorsaal penetreren. Daarna loopt ze mediaal van het compacte gedeelte, waar ze op het einde verbinding zal maken met de wand van de ventrale blaasuitloper (Figuur 18).

L

L

L L

C

C L

L C L

L aA L

aA

aA

L

L

L CL

L

C

L

C

aA

aA

aA

CL L

L

L L

L

Vb

lgs L L Labyrint

L

Vb Vb

lgs

Fig. 18 Verloop van het compacte glandulaire deel van rostraal naar caudaal C: coelomosac, L: labyrint, Vb: ventrale blaas, aA: antennale arterie, CL: centraal lumen van de coelomosac, lgs: spier geassocieerd met het labyrint, UVb: uitloper van de ventrale blaas, Exo: exoskelet, Endo: endoskelet. HE-kleuring (vergroting 10 x).

47

1.4. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN DE VENTRALE BLAAS EN ZIJN UITLOPERS De ventrale blaas is bilateraal aangelegd en maakt langs weerszijden connectie met de buitenwereld via de nefroporiën. Deze zijn op een mediale protuberantie van de antennale coxipodiet gesitueerd (Figuur 19a & 21). Net proximaal van de opening loopt een nauwe ductus naar caudaal toe, parallel met de lichaams-as. Eerst loopt ze nog in de basis van de protuberantia (Figuur 19b), maar vrijwel onmiddellijk caudaal daarvan is de terminale ductus gelegen in de hemocoel (Figuur 19c). Het lumen van deze terminale ductus heeft distaal de vorm van een mandarijnpartje dat met de concave zijde naar dorsaal is gericht (Figuur 19c). Geleidelijk aan verandert dit lumen naar proximaal toe in een afgeronde, gelijkzijdige driehoek met de basis naar ventromediaal gericht. Inmiddels is de basis van de driehoek zodanig breed geworden, dat men hier over een blaasachtige structuur kan spreken; de ventrale blaas (Figuur 19d). Verder naar caudaal wordt het lumen stilaan wijder en gaat de top van de driehoek elongeren om connectie te maken met het labyrint. (Figuur 19e).

a

b

e

c

d

f

Fig. 19 Verloop van de terminale ductus van rostraal naar caudaal a: nefroporie, b & c: terminale ductus, d: begin ventrale blaas, e: connectie labyrint met ventrale blaas, f: ventrale blaas met uitloper. NP: nefroporie, PT: protuberantie, BP: basis protuberantie, Exo: exoskelet, TD: terminale ductus, Vb: ventrale blaas, VVb: vertakkingen ventrale blaas, UVb: Uitloper ventrale blaas, C: coelomosac, CL: centraal lumen coelomosac, L: labyrint. HE-kleuring (vergroting 10 x).

48

Wanneer men de structuur verder volgt naar caudaal, neemt het lumen een komma-vorm aan, wordt de top breder en migreert het verder naar dorsomediaal. Ongeveer ter hoogte van de plaats waar de coxipodiet zijn oorsprong vindt, loopt er uit het dak van de blaas een uitstulping naar mediaal toe (Figuur 19f). Deze uitloper reikt tot net onder de nervus, waarna het verder naar dorsaal toeloopt. Deze uitloper zal connectie maken met zijn contralaterale structuur en oorsprong geven aan de basis van het laterale blad (zie verder).

De ventrale blaas is afgelijnd door meerdere cellagen: het bezit een éénlagig, afgeplat epitheel waarvan de kernen in het lumen uitpuilen. Daaronder is er een lamina muscularis op te merken boven een losmazig bindweefsel. Een serosa sluit de cellaag basaal af (Figuur 20). Deze conformatie kan enkel gezien worden in de meest ventrorostrale wand van de ventrale blaas. Op andere plaatsen bestaat de blaaswand uit twee afgeplatte cellagen met wat losmazig bindweefsel eronder. Het cytoplasma is soms zeer beperkt en dan puilen de nuclei zeer sterk uit in het lumen. Rond het verloop van de ventrale blaas, en dan vooral ter hoogte van zijn ventrale basis en apicale uitloper, kunnen vertakkingen worden opgemerkt (Figuur 19d, e & f).

1*

Vb 2

1

3 4 HC

Fig. 20 Ventrale blaaswand van de antennale klier Vb: lumen ventrale blaas, HC: hemocoel, 1: epitheliale cellaag, 1*: microvilli, 2: gladde spierlaag, 3: losmazig bindweefsel, 4: lamina serosa. HE-kleuring (vergroting 400 x).

49

UVb

*

Vb

TD NP

Fig. 21 3D-reconstructie van de ventrale blaas van de antennale klier, mediaal, NP: nefroporie, TD: terminale ductus, Vb: ventrale blaas, UVb: uitloper ventrale blaas, *: verbinding met labyrint, zwarte pijl: rostraal.

De uitloper zal verder naar caudaal toelopen en geleidelijk aan zal ze minder lang, maar wel breder worden tot een min of meer trapeziumachtig lumen (op doorsnede) wordt bereikt. De basis van deze trapezium ligt loodrecht op de hoogte-as van de garnaal. Deze configuratie wordt bereikt net voor het meest caudale deel van het labyrint ophoudt. Naarmate de ductus meer naar caudaal toeloopt, zal de mediale zijde meer opschuiven naar mediaal toe, zodat net voor de oesofagus, de twee helften zich voor een eerste maal met elkaar verbinden: de pre-oesofagiale connectie. Niet veel verder naar caudaal zal deze korte ductus ook oorsprong geven aan het laterale blad. De pre-oesofagiale connectie staat met een balkvormige ductus in communicatie met de mediane blaas (Figuur 22). Meer naar caudaal toe wordt de eerste connectie doorbroken door de oesofagus.

GMA

MB LB

CG D M

UVb PrOC Vb

Vb NP

Fig. 22. 3D-reconstructie van de antennale klier, rostraal aanzicht. NP: nefroporie, Vb: ventrale blaas, UVb: uitloper ventrale blaas, CG: compact gedeelte, PrOC: pre-oesofagiale connectie, D: ductus, MB: mediane blaas, LB: lateraal blad, M: maag, GMA: gastrische molen attractor.

50

1.5. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN DE LATERALE BLADEN EN HUN CAUDALE UITLOPERS

DL

LB

DL

M

M PA

LB

PA O

CU n

PrOC

HP

O

OD PrOC

PHC

POC

a

b

Fig. 23 3D-reconstructie van de laterale bladen van de antennale klier, rostraal zicht (a) en lateraal zicht (b). LB: lateraal blad, CU: caudale uitlopers, DL: dorsale lob van de mediane blaas, PrOC: pre-oesofagiale connectie, POC: postoesofagiale connectie, PHC: pre-hepatopancreale connectie, O: oesofagus, M: maag, HP: hepatopancreas, PA: protocephalon attractor, OD: oesofagiale dilatoren, n: nervus (peri-oesofagiale ring), dikke zwarte pijl: rostraal.

Zoals eerder beschreven, gaan de twee laterale bladen de oesofagus en de maag lateraal bedekken (Figuur 23). Het lumen van dit segment is dun en langgerekt en het epitheel hecht vast aan de protocephalon attractorspier en de maag. Hier heeft het laterale blad slechts 1 afgeplatte cellaag (Figuur 24). Soms is zelfs een kleine laag spierweefsel zichtbaar tussen het laterale blad en het aangrenzend weefsel (Figuur 25). De top van het laterale blad komt boven de maag en de laterale spier te liggen, daar is de structuur los en bevat ze twee cellagen: een ééncellige epitheliale laag en één musculaire cellaag (Figuur 24 & 26).

DL

LB

P M

PA

PA

CU PA

n PrOC

PA

a

b

Fig. 24 a) rostraal deel van het laterale blad van de antennale klier, b) caudale uitlopers van het laterale blad LB: lateraal blad, PrOC: pre-oesofagiale connectie, DL: dorsale lobus van de mediane blaas, CU: caudale uitlopers van het laterale blad, M: maag, PA: protocephalon attractor, P: pylorus, n: nervus. HE-kleuring (vergroting 10 x).

51

M 1

3

1 Vb

PA

2

Fig. 25 Lateraal blad van de antennale klier 1: epitheellaag van het laterale blad van de antennale klier, 2: spierlaag tussen antennale klier en protocephalon attractor, 3: spierlaag tussen maag en antennale klier, LB: lateraal blad, PA: protocephalon attractor, M: maag. HE-kleuring (vergroting 200 x).

HC LB 1

2

HC

Fig. 26 Vrije top van het laterale blad van de antennale klier 1: epitheliale cellaag van de top van het laterale blad, 2: gladde spierlaag onder het epitheel van het laterale blad, LB: lumen van het laterale blad, HC: hemocoel. HE-kleuring (Vergroting 400 x).

Geleidelijk aan zal het laterale blad afnemen in hoogte naar caudaal toe en eindigen in een ductus, waarvan beide zijden aanvankelijk mediaan naast elkaar gelegen zijn. Daar zijn ze dorsaal begrenst door de pylorusmaag en ventraal door spierweefsel of exoskelet. Net voor de hepatopancreas zullen de twee helften een laatste keer communiceren, voor ze uit elkaar divergeren om de hepatopancreas te omgeven en daar te eindigen. Dit zijn de meest caudaal gelegen structuren van de antennale klier (Figuur 27).

52

HP

P PHC

BLB POC

M

O CU BLB PrOC

Fig. 27 3D-reconstructie van het laterale blad van de antennale klier met zijn caudale uitlopers, ventraal zicht. O: oesofagus, BLB: basis lateraal blad, CU: caudale uitloper van het lateraal blad, PrOC: pre-oesofagiale connectie, POC: post-oesofagiale connectie, PHC: pre-hepatopancreale connectie, M: maag, P: pylorus van de maag, HP: hepatopancreas. De zwarte pijl wijst naar rostraal.

Rostraal van de pre-oesofagiale connectie, zullen de basissen van de laterale bladen opschuiven naar dorsaal en mediaal toe, zodat de peri-oesofagiale zenuwring kan passeren. De structuur wordt onderbroken door de gastrische molen attractor, die de maag verbindt met het exoskelet (zie verder). Het onderste deel zal verbinding maken met een steeds wijder wordende ductus die vertrekt uit de eerste connectie (zie hoger en verder). Het bovenste gedeelte zal rostrodorsaal van de maag verbinding maken met de dorsale lobus van de mediane blaas (zie verder).

1.6. GEDETAILLEERD VERLOOP EN HISTOLOGIE VAN DE MEDIANE BLAAS De mediane blaas bestaat uit twee lobi: (i) een ventrale lobus en een (ii) dorsale lobus die gescheiden worden door de anteriore gastrische molen attractorspieren, die ook het laterale blad onderbreken (Figuur 22 & 28). Het lumen van de dorsale lobus is groter dan dat van de ventrale lobus. De dorsale lobus staat dorsaal van de maag nog even in contact met de top van de laterale bladen. Wat opvalt is de asymmetrie van dit laatste feit. Het rechter laterale blad staat in dit geval over een grotere lengte in contact met de laterale zijde van de dorsale lobus dan het linker laterale blad, dat maar over enkele coupes contact maakt (Figuur 12). Nadat de verbinding tussen de dorsale lobus en de laterale bladen naar caudaal toe ophoudt, loopt de dorsale lobus nog verder naar caudaal toe (Figuur 28).

53

54

DL

VL

Fig. 28 3D-reconstructie van de mediane blaas van de

antennale

klier,

rostrocaudaal-oblique

zicht.

DL: dorsale lobus, VL: ventrale lobus, driehoek: snijvlak met laterale blad. Vierkant: snijvlak met de ductus.

De ventrale lobus ontstaat uit de ductus die afkomstig is van de pre-oesofagiale connectie. Deze ductus loopt van het midden van de pre-oesofagiale connectie naar rostrodorsaal, terwijl zijn lumen geleidelijk aan wijder wordt. Op een bepaald punt zal deze ductus versmelten met het onderste deel van de twee laterale bladen, zoals beschreven op het einde van de vorige paragraaf, waarna ze samen oorsprong geven aan de ventrale lobus (Figuur 29).

LB LB D

UVb

PrOC Vb

NP

Vb

Fig. 29 Partiële 3D-reconstructie van de antennale klier, rostraal zicht waarop de mediane blaas is weggenomen. NP: nefroporie, Vb: ventrale blaas, UVb: uitloper ventrale blaas, PrOC: pre-oesofagiale connectie, D: ductus, LB: lateraal blad, Driehoek: snijvlak met ventrale lobus.

55

De cellulaire opbouw van de mediane blaas is gelijkaardig aan dat van de ventrale. Het bezit een afgeplatte epitheellaag met spierachtig weefsel daaronder. De spierige laag is op sommige plaatsen dikker dan die van de ventrale blaas (Figuur 30).

HC 2 1 DL Fig. 30 Cellulaire opbouw van de dorsale lobus van de mediane blaas van de antennale klier 1: epitheel van de dorsale lobus. 2: spierige laag, DL: lumen van de dorsale lobus, HC: hemocoel. HE-kleuring (vergroting 400 x).

De mediane blaas is hoofdzakelijk rostraal van de maag gelegen. Het meest rostrale punt van de mediane blaas ligt nog meer rostraal dan dat van de ventrale blaas.

1.7. BESCHRIJVING VAN DE SPIEREN GEASSOCIEERD MET DE ANTENNALE KLIER Over het verloop van de antennale klier zijn er hier en daar enkele associaties met spieren, waarvan sommige al eerder werden besproken. CD

RS sa HC

HC

CA

CD HC CA

sa

Vb

Vb SA

NP a

CA

sa

SA

SA b

c

Fig. 31 De ventrale blaas met zijn omringende spieren, van rostraal a) naar caudaal c). SA: grote scaphoceriet abductor, sa: kleine scaphoceriet abductor, CA: adductor van de coxipodiet, Vb: ventrale blaas, CD: compact deel van de atennale klier, HC: hemocoel, NP: Nefroporie. HE-kleuring (vergroting 10 x).

Rond de ventrale blaas zijn op doorsnede 3 spieren gepositioneerd (Figuur 31 & 32). De grote ventrale spier is de grote scaphoceriet abductorspier en loopt eerst lateraal doorheen de coxipodiet van de antenne, om naar caudaal toe over de ventrale zijde van de basis te lopen. Ter hoogte van de nefroporie ontspringt uit deze spier, de kleine scaphoceriet abductor (Figuur 31a). Deze spier zal later lateraal van de ventrale blaas komen te liggen (Figuur 31b & c). Op ongeveer dezelfde plaats ontstaat de coxipodiet adductorspier die mediaal van de blaas komt te liggen (Figuur 31). De coxipodiet adductor

56

eindigt aan het exoskelet, caudaal van de ventrale blaas (Figuur 32a). Net caudaal van deze aanhechting, gaat de kleine scaphoceriet abductorspier ook aan het exoskelet op dezelfde hoogte gaan vasthechten en eindigen (Figuur 32b). De grote scaphoceriet abductorspier gaat eveneens op deze plaats eindigen maar dan ventraal aan het exoskelet (Figuur 32b). Dit trio van spieren omringt dus als het ware de ventrale blaas.

CD

UVb

UVb

CA

sa

sa

SA

SA a

b

Fig. 32 Aanhechtingsplaatsen van de blaasomringende spieren SA: grote scaphoceriet abductor, sa: kleine scaphoceriet abductor, CA: coxipodiet adductor, CD: compact deel van de antennale klier, UVb: uitloper van de ventrale blaas. HE-kleuring (vergroting 10 x).

Zoals eerder beschreven, wordt de mediane blaas in twee lobi verdeeld door de twee anteriore gastrische molen attractorspieren die uit het rostrale deel van de maag komen en naar rostraal lopen. De ventrale lobus is rostraal en ventraal gelegen tussen de epistomale stator spieren die de ventrale zijde van de cephalothorax verbinden met de dorsale zijde. Zowel de ventrale als de dorsale lobus zijn gepositioneerd tussen de twee longitudinale protocephalon attractorspieren (Figuur 33 & 34). De dorsale lobus wordt dorsaal bedekt door twee posteriore protocephalon levator spieren (Figuur 34).

DL

ES

GMA

PA

VL M

Fig. 33 3D-reconstructie van de mediane blaas van de antennale klier, rostrocaudaal-oblique aanzicht. DL: dorsale lobus, VL: ventrale lobus, M: maag, GMA: gastrische molen attractor, ES: epistomale stator spier, PA: protocephalon attractor.

57

C

ES DL GMA MB PA

VL

A PA

CD

CD CA

sa

sa

CA

B

Vb Vb

SA

SA

Fig. 34 Overzicht van de mediane blaas en de ventrale blaas van de antennale klier met hun omringende spieren SA: grote scaphoceriet abductor, sa: kleine scaphoceriet abductor, CA: coxipodiet adductor, PA: protocephalon attractor, GMA: gastrische molen attractor, ES: epistomale stator, Vb: ventrale blaas, CD: compact deel, MB: mediane blaas, VL: ventrale lobus, DL: dorsale lobus, A: cephalothoracale holte, B: Coxipodiet holte, C: rostrale ruimte. HE-kleuring (vergroting 10 x).

Ook het laterale blad is omgeven door spieren; eerder werd al vermeld dat de structuur vastzit aan de grote, laterale, protocephalon attractorspier en aan de mediale zijde aan het spijsverteringsstelsel. De basis van het laterale blad wordt in zijn craniale deel even omringd door 2 bilaterale spieren, die ventraal aan het exoskelet vastzitten en naar de oesofagus toelopen. Het laterale blad wordt hierdoor even gescheiden van zijn basis. Waarschijnlijk zijn dit de dilatoren van de oesofagus. Iets verder naar caudaal, gebeurt hetzelfde, maar nu wordt enkel de basis van het laterale blad gescheiden van zijn ander deel, zonder dat er een spier ventraal de basis omgeeft (Figuur 35 & 36). Na de oesofagus gaat het laterale blad geleidelijk aan of abrupt afnemen in hoogte en zo overgaan in de caudale uitlopers van het laterale blad. Op deze plaats gaat de maxillaire tensor de caudale uitlopers lateroventraal gaan omgeven. Ze ontspringen uit de mandibulaire endosterniet en gaan dorsaal aanhechten aan het dak van de cephalothorax, mediaal van de grote laterale spieren (Figuur 35 & 36). De maxillaire tensor zal zich met haar top tussen het laterale blad en de laterale spier gaan wringen zodat deze twee structuren van elkaar worden gescheiden. Wanneer de maxillaire tensor caudaal ophoudt, zijn de caudale uitlopers van het laterale blad ingebed in bindweefsel. Onmiddellijk caudaal van de maxillaire tensor gaat de mandibulaire adductor min of meer hetzelfde doen: ze ontspringt op het caudale deel van de mandibulaire endosterniet en meer naar caudaal toe zal de basis van de maxillaire tensor blijven vasthechten op een verticale uitloper daarvan (Figuur 35 & 36). De top van de spier zal zich een weg klieven tussen de caudale uitloper en het bindweefsel.

58

Tussen deze mandibulaire adductor en de maxillaire tensor, zijn er twee oblique spiertjes die uit de ventrale zijde van het maagdarmstelsel komen en naar de mandibulaire endosterniet lopen. Deze spiertjes lopen verschillend ten opzichte van elkaar. De linker oblique spier ontspringt op dezelfde hoogte en juist mediaal van de linker maxillaire tensor. Daarentegen, gaat de rechter oblique spier ontspringen ter hoogte van de plaats waar de rechter maxillaire tensor insertie gaat ophouden (Figuur 35). Zowel de mandibulaire adductor, als de maxillaire tensor zijn mediaal van de protocephalon attractor gelegen.

OD HP OD MA

BLB

MT OS

O

MA

POC

CU

MT M BLB

OD

OD

Fig. 35 3D-reconstructie van de caudale uitlopers van de laterale bladen met hun geassocieerde spieren, ventraal zicht. BLB: basis van de laterale bladen, CU: caudale uitlopers, OD: oesofagiale dilatoren, MT: maxillaire tensor, MA: mandibulaire adductor, OS: oblique spier, POC: post-oesofagiale connectie, O: oesofagus, M: maag, HP: hepatopancreas. De zwarte pijl wijst in rostrale richting.

M LB

OD

CU MT

MA

BLB

n

ME

HP

O Fig. 37 3D-reconstructie van de laterale bladen van de antennale klier, Lateraal zicht. BLB: basis van de laterale bladen, CU: caudale uitloper, OD: oesofagiale dilatoren, MT: maxillaire tensor, MA: mandibulaire adductor, ME: mandibulaire endosterniet, O: oesofagus, M: maag, HP: hepatopancreas, n: nervus (peri-oesofagiale ring). De dikke zwarte pijl wijst in rostrale richting.

59

1.8. NEFROPORIËN

De nefroporie is op de mediale zijde van het coxipodiet van de tweede antenne gelegen (Figuur 37).

D C

B A Fig. 37 SEM-opname van het proximale deel van de rechter antenna, ventraal zicht. Rechtsonder in beeld is de nefroporie zichtbaar op een half bolvormige uitstulping (pijlhoofd). A: coxipodiet, B: basipodiet, C: ischioceriet, D: meroceriet. De witte pijl wijst in rostrale richting.

Fig. 38 SEM-opname van de nefroporie aan de basis van de tweede antenne Hier is een concave, verticale opening van de nefroporie te zien.

60

Opnames met de SEM tonen dat de opening van de nefroporie een concave, verticale spleet is. Ze is gelegen in een krater op de mediale zijde van een half bolvormige protuberantia van het coxopodiet. De krater waarop de opening is gelegen, is naar caudaal gericht. De bodem van de krater die rostraal gelegen is van de spleetvormige opening, ligt iets onder de caudale zijde gepositioneerd (Figuur 38 en 39).

Fig. 39 SEM-opname van de nefroporie Hier is te zien dat de caudale zijde iets boven de rostrale zijde is gelegen.

A 61

2. DYNAMIEK VAN DE ANTENNALE KLIER TIJDENS HET AFSCHUDDEN VAN HET EXOSKELET BIJ DE P. VANNAMEI Bij het aspireren voor het inbrengen van de kleurstof, werd gemiddeld slechts 25 µl bekomen. Daarentegen kon iets meer kleurstof worden geïnjecteerd: 0,1 ml. Onmiddellijk na injectie, was de kleurstof zichtbaar ter hoogte van de laterale blaas van de antennale klier, maar niet verder. Het contrast tussen de kleurstof en de rest van de garnaal was voldoende en de kleurstof kon gemakkelijk waargenomen worden doorheen het water en de PVC-tank. Toen op 15 minuten na injectie gecontroleerd werd of de kleurstof zich had verspreid in de antennale klier, was geen kleurstof meer te zien in geen enkele garnaal. De in vivo situatie van de antennale klier kon dus niet worden geobserveerd, laat staan zijn dynamiek tijdens de vervelling. Een gebrek aan voldoende proefdiermateriaal, waarvan de nefroporiën groot genoeg waren voor succesvolle insertie van een 26G-katheter, verhinderden verdere pogingen tot het in vivo kleuren van de antennale klier.

62

3. OPTIMALISATIE VAN EEN REAL-TIME PCR VOOR DE KWANTIFICATIE VAN WSSV IN URINE 3.1. PRIMERS VOOR HET SEQUENEREN VAN HET DNA-POLYMERASEGEN De flankerende primers voor sequentiebepaling van het DNA-polymerasegen, die uit het selectieproces kwamen, zijn de volgende (Tabel 10). Tabel 10. Primerspecificaties voor de DNA-polymerase flankerende sequentie

Voorwaartse primer

Achterwaartse primer

WSSV_PolFw

WSSV_PolRv

AACAGTGCCCTCAAGTGATT

CACCTCTTCTATCTGCCCTTTC

Lengte

20 bp

22 bp

smelttemperatuur

63°C

62,8°C

Naam sequentie

GC-inhoud maximum delta G

45,0%

50,0%

-36.37 kcal/mol

-40,16 kcal/mol

Gebruikmakende van het PCR-protocol beschreven in ‘Materiaal en methoden’, kon geen replicatie worden bereikt, ook niet indien de annealingtemperatuur werd verlaagd naar 45°C en het aantal cycli verhoogd tot 40. Ook het gebruik van OneTAQ Polymerase (protocol beschreven bij ‘Het testen van de primers op de labostammen’) en een temperatuursgradiënt bracht geen soelaas. In de nucleotide database

van

NCBI

werd

een

open

reading

frame

(ORF

4427,

accessienummer:

AF402996.1_cds_AAK96178.1_1) gevonden dat half overlapte met de DNA-polymerasesequenties. Omwille hiervan en het feit dat de PCR geen resultaat opleverde na pogingen met twee verschillende polymerasen en onder verschillende reactie condities, werd beslist om de DNA-polymerasesequentie niet verder te gebruiken als doelwitsequentie voor primerdesign.

3.2. PRIMERSPECIFICATIE VOOR DE DETECTIE VAN WSSV VIA qPCR Voor het VP28 werd zonder succes gezocht naar primers die voldeden aan de vooropgestelde parameters. Voor het VP19 daarentegen, werd wel een primerpaar gevonden dat voldeed aan de selectiecriteria (Tabel 11). Tabel 11. Primerspecificaties voor de detectie van WSSV via qPCR

Voorwaartse primer Naam

Achterwaartse primer

WSSV_VP19Fw

WSSV_VP19Rv

ATTGGTATCCTCGTCCTGGC

GTTATCGTTGGCAGTGTCGTC

Lengte

20 bp

21 bp

smelttemperatuur

60,5°C

61,2°C

55%

52,4%

-39.4 kcal/mol

-38.65 kcal/mol

sequentie

GC-inhoud maximum delta G

Gebaseerd op de sequenties in Genbank, amplificeren deze primers een fragment van 111 bp.

63

Tijdens het selectieproces, werd de capaciteit van de primers om dimeren te vormen, mee in consideratie genomen (Tabel 12). Tabel 12. Mogelijke dimeervorming door de VP19-primers

WSSV_VP19Fw homodimeren

WSSV_VP19Rv homodimeren

heterodimeren

64

Uit Tabel 12, blijkt dat geen enkele dimeer een delta G onder de -3,61°C heeft en dat de kans op dimeervorming dus laag is. Er blijken ook relatief weinig dimeren mogelijk die trapsgewijs aan elkaar kunnen binden. Primers die dergelijke dimeren vormen, kunnen de exacte kwantificatie bemoeilijken en zullen tijdens de smeltcurve-analyse opgemerkt worden als aspecifieke signalen.

Ook de specificiteit van de primers werd onderzocht (Figuur 40 & 41).

Fig. 40 Primerspecificiteit van de voorwaartse primer WSSV_VP19Fw Paarse links zijn de vier volledig gekende WSSV-sequenties. Screenshot van Genbank.

Fig. 41 Primerspecificiteit van de achterwaartse primer WSSV_VP19Rv Paarse links zijn de vier volledig gekende WSSV-sequenties. Screenshot van Genbank.

65

Beide primers blijken alle gekende VP19- en volledige WSSV-sequenties te kunnen herkennen met een hoge waarschijnlijkheid. Ook blijken er geen aspecifieke reacties met niet-WSSV-genen mogelijk (gebaseerd op alle, tot nog toe in Genbank gekende, sequenties).

3.3. TESTEN VAN DE GEVONDEN PRIMERPAREN OP WSSV-THAI-1 EN WSSV-VIET

Na PCR was er telkens 1 bandje zichtbaar in de laan waar het WSSV-Thai-1- of WSSV-Viet-staal werd ingebracht. De fragmenten liggen op dezelfde hoogte, tussen de 100 bp en 150 bp. Dit komt overeen met de verwachte lengte van 111 bp. Dit indiceert, dat de WSSV_VP19Fw primer en de WSSV_VP19Rv primer geschikt zijn voor de detectie van WSSV met een conventionele PCR-reactie. En dus kunnen binden op het VP19-doelwitgen. De negatieve controle was negatief, enkel de primers waren zichtbaar (Figuur 42).

5

Fig. 42 Agarosegel onder UV na incubatie met ethidiumbromide 1: negatieve controle, 2: WSSV-Thai-1, 3: WSSV-Viet, 4: Smartladder, 5: O’GeneRuler Low Range DNA Ladder.

De amplicons werden geïsoleerd en opgestuurd voor sequenering. De sequenties bleken voor 100% overeen te komen met de Genbank VP19-sequentie gelegen tussen de twee primers.

66

3.4. SYNTHESE VAN STANDAARD-DNA Voor de synthese van standaard-DNA werd WSSV-Thai-1 gekozen omdat deze een virulentere stam is dan de WSSV-Viet (Corteel et al., 2012a).

1

2

3

4

5

6

7

Fig. 43 Agarosegel onder UV-belichting na incubatie in ethidiumbromide 1: smartladder, 2, 3, 4 en 5: WSSVThai-1, 6 en 7: negatieve controle.

Amplificatie genereerde één specifiek fragment per laan waarin WSSV-Thai-1 stock werd gebruikt (Figuur 43). Na opzuivering van de amplicons uit de agarosegel, werd de DNA-concentratie bepaald met spectrofotometrie (Nanodrop2000). De eluaten bevatten gemiddeld 28,6 ng/µl (corresponderend met 2,5.1011) en werden gealiquoteerd in volumes van 12 µl om te bewaren bij -70°C.

3.5.

IN VITRO OPTIMALISATIE VAN DE QPCR-REACTIECONDITIES

De resultaten van het optimalisatieprotocol zijn in overeenstemming met de resultaten bereikt met de optimalisatieprocedure waarbij de oude Precision 2X qPCR mastermix werd gebruikt (Tabel 13). Bij mastermixen waarbij een hogere (D) of gelijke (C) concentratie aan voorwaartse primer dan aan achterwaartse primer werd toegevoegd, blijkt dat de Cq-waarden het hoogst zijn. Om een voldoende lage detectielimiet te bereiken, dient de Cq-waarde zo laag mogelijk te zijn. Bij lagere Cq-waarden, wordt immers een hogere sensitiviteit bereikt en is er minder verwarring mogelijk met eventuele primerdimeren waarvan de smelttemperatuur gelijk is aan dat van het gewenste amplicon. Indien er meer achterwaartse dan voorwaartse primer in het reactievolume aanwezig is, worden de laagste Cqwaarden bereikt (A & B). De allerlaagste Cq-waarde werd geobserveerd voor mastermix A bij 58°C.

67

Voor mogelijke dimeervorming moet er gekeken worden naar de negatieve controles, omdat dimeervorming vlugger zal optreden wanneer er geen competitie is met standaard-DNA, waarvoor de primers een hogere affiniteit hebben. Voor alle temperaturen, werd er bij de negatieve controle voor mastermix C, amplificatie gedetecteerd. De corresponderende smeltcurves waren quasi gelijk aan dat van het standaard-DNA, wat wijst op kruiscontaminatie tijdens het laden van de 96-wellplaten (BrightWhite). In ieder geval zijn deze observaties niet relevant, vermits mastermix C de hoogste Cqwaarden opleverde. Ook bij mastermix A en D werd er amplificatie gedetecteerd. Analyse van de smelttemperaturen (77,07°C respectievelijk 77,45°C) wijst op dimeervorming (smelttemperatuur van het standaard-DNA: 81,4°C). Bij de combinatie van mastermix A met 58°C, werd daarentegen geen dimeervorming gedetecteerd, waardoor deze combinatie als de meest optimale werd beschouwd.

Tabel 13. Gemiddelde Cq-waarden voor de geteste combinaties van mastermix met annealingtemperatuur

Annealingtemperatuur (°C)

54,0

56,0

58,0

60,0

62,0

Mastermix (voorwaartse primer/achterwaartse primer)

A (50 mM/200 mM)

25,22

24,85

24,59

24,67

24,77

B (50 mM/100 mM)

25,90

25,27

25,02

24,75

24,93

C (50 mM/50 mM)

26,56

25,71

25,71

25,34

25,30

met 10² standaard-DNA-kopijen

D (100 mM/50 mM)

26,41

25,36

25,03

25,23

25,08

Mastermix (voorwaartse primer/achterwaartse primer)

A (50 mM/200 mM)

38,6*

-

-

37,65*

-

B (50 mM/100 mM)

-

-

-

-

-

C (50 mM/50 mM)

33,37

31,65

31,42

30,45

32,48

met water

D (100 mM/50 mM)

-

37,7*

-

36,71*

-

Groen: beste combinatie, geel: geschikte combinatie, rood: ongeschikte combinatie, *: aspecifiek signaal (dimeren).

3.6.

EFFICIËNTIE VAN DE QPCR-REACTIE a

b

c

Fig. 44 Real-time PCR-grafieken a) Amplificatiecurve over een dynamsche range van 7log10 tot 1log10 WSSV-DNA-kopijen per reactie, b) smeltcurve en c) standaardcurve.

68

Het hoogste aantal WSSV-standaard-DNA-kopijen (3.106) werd gedetecteerd na gemiddeld 10,84 cycli (=Cq-waarde). De richtingscoëfficiënt werd bepaald op -3,369, wat overeenstemt met een efficiëntie van 98,064%. De correlatiecoëficiënt R² is gelijk aan 1 en 33,572 is de verwachte Cq-waarde voor een staal waar 1 kopij inzit (Y-asafsnede). Een gemiddelde smelttemperatuur van 81,3489°C werd bekomen voor het VP19-amplicon (Figuur 44). Er werd bovendien geen dimeervorming gevonden, noch in de stalen met het standaard-DNA, noch in de negatieve controles. Er werd geen dimeervorming opgemerkt in de negatieve controles. Een herhaling van het experiment met de WSSV-Viet-stam, leverde gelijkwaardige resultaten op (Figuur 44).

3.7.

KWANTIFICATIE VAN WSSV IN URINE

Wanneer WSSV in DMEM werd verdund, bleek er geen relevant verschil te zijn tussen de twee extractiemethoden (Tabel 14). De aanwezigheid van heparine blijkt zowel op de extractie met de DNA Mini Kit als met de Viral RNA Mini Kit een negatieve invloed te hebben op het aantal gedetecteerde kopijen. De inhiberende invloed van heparine wordt wel beter geneutraliseerd indien er gewerkt wordt met de DNA Mini Kit. Wanneer WSSV uit het urinestaal werd geëxtraheerd met de DNA Mini Kit, blijkt dat de urine geen inhiberend effect uitoefent op het aantal gedetecteerde kopijen, terwijl dit duidelijk wel het geval is indien geëxtraheerd werd met de Viral RNA Mini Kit. Tabel 14. Aantal gedetecteerde kopijen WSSV in de Viral RNA Mini extractiekit versus de DNA Mini extractiekit

# kopijen gedetecteerd na extractie met Staal

Viral RNA Mini Kit

DNA Mini Kit

10³ SID50 WSSV + DMEM

25.664,59

31.775,5

7614,76

37.885,52

-

8590,04

10³ SID50 WSSV + Urine + DMEM 10³ SID50 WSSV + Heparine + DMEM

69

DISCUSSIE 1. FUNCTIONELE ANATOMIE, MORFOLOGIE EN DYNAMIEK VAN DE ANTENNALE KLIER In het onderzoeksgedeelte van de masterproef, werd de morfologie van de antennale klier bestudeerd. Hieruit kan worden geconcludeerd, dat de antennale klier van de P. vannamei, uit een coelomosac, een labyrint en een urinaire blaas bestaat. De 3D-reconstructie onthult echter een veel complexere structuur van de antennale klier in P. vannamei dan tot nog toe beschreven was bij de penaeide garnalen (Buranajitpirom et al., 2010; Xugang et al., 2013; Young, 1959). Het orgaan reikt met de rostrale structuur in de antennale basipodiet en het styloceriet tot aan de caudale uitlopers van het laterale blad, lateraal van de hepatopancreas. Het laterale blad en de daaruit vertakkende structuren zoals de mediane blaas en de caudale uitlopers, zijn het resultaat van een caudale voortzetting van de ventrale blaas. Deze caudaal van de antennen gelegen structuren, werden eerder min of meer beschreven door Nakamura en Nishigaki (1991) en Nakamura en Nakashima (1992). Zij bestempelden deze caudale onderdelen van de antennale klier verkeerdelijk als coelomosac; de afgeplatte, meerlagige cellulaire structuur van deze structuren strookt niet met dat van functioneel (filtrerend) epitheel. Bovendien werd in de huidige studie gevonden dat de cellaag van de laterale bladen langs weerszijden vastzitten; lateraal aan de lange protocephalon attractorspieren en mediaal aan de maag. Ook een groot deel van de caudale uitlopers zijn ingebed in bindweefsel. Een dergelijke conformatie maakt filtratie onmogelijk.

C aA

S CL CK NP

L

C

C

C

CD

CV

Vb

L

L

Fig. 45 Schematische schets van de vloeistofstroom doorheen het compacte, glandulaire gedeelte van de antennale klier aA: antennale arterie, CD: compact gedeelte,

S:

hemolymfe

coelomosackoepel,

CL:

sinus, centraal

HC:

hemocoel,

C:

coelomosaclumen,

coelomosac, CV:

CK:

Coelomosac

verzamelbuis, L: labyrint, Vb: ventrale blaas, NP: nefroporie.

In de studie van Xugang et al. (2013) en Buranajitpirom et al. (2010), werd de coelomosac teruggevonden in het midden van de antennale klier, omgeven door tubuli van het labyrint. In de huidige studie kon voor het compact, glandulair gedeelte dezelfde onderverdeling worden gezien. Op basis van

70

de aangetroffen histologie, kan volgend hypothetisch model naar voor worden geschoven: vertakkingen van de antennale arterie penetreren het compacte gedeelte en voorzien de hemolymfe voor ultrafiltratie. De kleinste arteriën gaan uitmonden in sinussen. Deze sinussen omgeven de coelomosackoepels (Figuur 45). Deze situatie komt overeen met deze beschreven bij de meeste Crustacea (Al-Mohsen, 2009; Khodabandeh et al., 2005a; Panikkar, 1941; Schaffner en Rodewald, 1978; Schmidt-Nielsen et al., 1968; Tikær Andersen en Baatrup, 1988; Tsai en Lin, 2014; Ueno en Inoue, 1996; Vogt, 2002). De coelomosac staat dus niet in direct contact met de arteriële wand (Holliday en Miller, 1984; Xiaoyun et al., 2003). De coelomosackoepels omgeven een centraal coelomosaclumen. Verschillende van deze structuren zullen samenvloeien in één grote verzamelbuis, die overgaat in het labyrint. Een onderscheid binnen het labyrint zoals een labyrint I en II (Al-Mohsen, 2009; Khodabandeh et al., 2005b) werd hier niet teruggevonden. De overkoepelende sinussen gaan aan de top van een coelomosackoepel aanhechten en hebben een afgeplat epitheel aan de zijde tegenover dat van de coelomosacepitheel (Figuur 45).

Het epitheel van de rostrale structuur, is zeer gelijkaardig aan dat van het labyrint. De lumina van beide structuren maken bovendien verbinding met elkaar. Het is dus zeer goed mogelijk dat de rostrale structuur onderdeel uitmaakt van het labyrint, of er minstens een extensie van is. De ligging van deze rostrale structuur, waarvan de tubuli rondom omgeven zijn door de hemolymfe kan functioneel zijn in de zin van oppervlaktevergroting. Het labyrint is de belangrijkste plaats waar ionenuitwisseling plaatsvindt (Khodabandeh et al., 2005b; Khodabandeh et al., 2005c; Tsai en Lin, 2014). Een oppervlaktevergroting zoals hier het geval is bij de rostrale structuur, zou de garnaal toelaten om zeer snel het volume van de hemolymfe te regelen, wat uitermate belangrijk is tijdens het ecdysisproces zoals aangetoond door Henry en Wheatly (1992). Een studie waarbij aanwezigheid en lokalisatie van ionenpompen worden nagegaan zoals eerder bij de A. leptodactylus (Khodabandeh et al., 2005b; Khodabandeh et al., 2005c; Tsai en Lin, 2014) en de O. stimpsoni of eventueel een studie van de cellulaire structuur met TEM zou de rostrale structuur verder kunnen categoriseren als labyrint of als een aparte structuur.

De resultaten tonen ook voor het eerst een potentieel belangrijke verhouding tussen de antennale klier enerzijds, en de spieren van de cephalothorax en antennae anderzijds. Vooreerst zijn er de scaphoceriet abductoren die samen met de adductor van de antennale coxipodiet de ventrale blaas gaan omgeven. Wanneer de scaphoceriet abductoren contraheren, zullen ze (uitgaande van een volumetrische contractie) de blaas leegdrukken waardoor evacuatie van de urine plaatsvindt doorheen de nefroporie. Volgens Young (1959) is de functie van scaphoceriet abductie ongekend. Scaphoceriet abductie zou slechts occasioneel voorkomen en dit slechts gedurende enkele ogenblikken. Nog steeds volgens Young (1959), zou het lateraal bewegen van de scaphocerieten bij aquarium-garnalen geassocieerd gaan met “de verzorging van de hoofdappendices en een plotse flush uit de kieuwkamer”. Op de SEMbeelden is er een verticale nefroporie te zien. De opening is licht concaaf en blijkt gelegen te zijn op een mediale krater van de antennale coxipodiet protuberantie. De krater is naar caudaal toe gericht. Dit wijkt af van de rechte verticale opening gelegen op een discoïde protuberantie, zoals geobserveerd door Nakamura en Nishigaki (1991) bij de P. japonicus. Een krachtige abductie van de scaphocerieten zou

71

door de geobserveerde oriëntering van de protuberantie resulteren in een krachtige urinestroom in de richting van de kieuwen. De kieuwen zijn bedekt door een laterale, bladvormige uitstulping van de carapax die de kieuwen gaan bedekken (en de kieuwkamer gaan vormen). Enerzijds levert dit bescherming op tegen pathogenen en verwondingen, maar anderzijds vormt deze structuur een val voor sedimenten (Bauer, 1979). Epipodieten en exopodieten die de kieuwen reinigen en een milde waterstroom genereren doorheen de kieuwkamer, zijn fel gereduceerd bij de penaeiden. Ze worden daarom geholpen in hun functie door de branchiostegnieten. Deze structuren voldoen echter niet om bacteriële en ciliare overgroei tegen te gaan (Bauer, 1998; Bauer, 1999). Naast een rol in de excretie, het metabolisme, de volumeregulatie en detoxificatie van de hemolymfe, zou de antennale klier dus kunnen bijdragen in het onderhoud van de kieuwen door mechanische reiniging. Op basis van de gevonden morfologie en anatomie van de ventrale blaas, de nefroporie en de scaphoceriet abductoren, zou abductie van de scaphocerieten gepaard gaan met urinelozing richting de kieuwkamers. Indien dit krachtig genoeg gebeurt, kan de antennale klier een additionele rol vervullen door de kieuwkamer mechanisch te reinigingen. De reinigende functie van de urine, zou zelfs meer dan enkel mechanisch kunnen zijn. Daarom zou het ook opportuun zijn om de urine van garnalen te onderzoeken op antiseptische of antimicrobiële eigenschappen.

Spieren rond de nefroporie zelf werden niet aangetroffen. Wel werd er met de SEM geobserveerd dat het caudale deel van de krater over het rostrale deel ligt. Mogelijks is deze conformatie een elastische afsluiting van de nefroporie. Enkel een hoge druk, zoals gecreëerd door de werking van de scaphoceriet abductoren, zou de nefroporie dan kunnen openen.

Wanneer naast de abductoren van de scaphoceriet, de adductor van de antennale coxipodiet ook contraheert, zal de terminale ductus dicht gedrukt worden. De overblijvende richtingen die de urine dan zou kunnen opgaan is enerzijds de anterograde richting, terug het labyrint in. Anderzijds zijn de openingen naar het labyrint zodanig klein, dat quasi alle vloeistof naar het laterale blad zal vloeien. Vanuit het laterale blad kan dan vloeistof stromen naar de mediane blaas en de caudale uitlopers. De vloeistofstroom uit het laterale blad naar deze structuren zou versterkt kunnen worden door pompende bewegingen vanuit de protocephalon attractorspieren, waaraan het laterale blad is vastgehecht. De protocephalon attractor, de maxillaire tensor, de mandibulaire adductor en de twee oblique spieren zouden door gecoördineerde pompbewegingen de vloeistof naar achter in de caudale uitlopers kunnen stuwen. De mediane blaas is onderverdeeld in een dorsale en ventrale lobus. De ventrale lobus kan leeggedrukt worden door contractie van de protocephalon attractor, waarop de inhoud alleen nog maar naar de dorsale lobus kan vloeien. De anteriore gastrische molen attractor en de epistomale stator (die ook de cephalothorax zal samentrekken) zijn in staat om de dorsale lobus rostraal dicht te duwen. Een gezamenlijke actie van dit trio zal aldus resulteren in een (dorso)caudale uitzetting van de dorsale lobus. De aanwezigheid van een spierweefsellaag in de wand van de mediane blaas, wijst op een dynamische structuur (Simoens, persoonlijke communicatie). Een dorsocaudale uitzetting van de dorsale lobus, blijkt dus ook histologisch gezien plausibel.

72

Een samenspel van de spieren rond de antennale klier, met een dorsocaudale uitzetting van de dorsale lobus tot gevolg, kan aldus resulteren in een enorme en plotse drukontwikkeling op het caudodorsale gedeelte van de carapax (die de cephalothorax omgeeft). Op deze plaats is de carapax verbonden met het exoskelet van het eerste abdominale segment door een dun en breekbaar vlies. Wanneer men kijkt naar het vervellingsproces bij de Decapoda, kan er worden opgemerkt dat de plaats waar het exoskelet zal breken, het meest caudodorsale deel van de cephalothorax is, net ter hoogte van het vlies. Door de druk op dit vlies lokaal te verhogen, zou de antennale klier een meer directe rol kunnen spelen bij de ecdysis dan enkel osmoregulatie. Om het vlies te laten breken, is directe druk van de dorsale lobus op het vlies niet noodzakelijk. Een dorsaalwaarts gerichte druk van de dorsale lobus op het dak van de carapax, is in principe voldoende (Figuur 46).

AS

Cx DL M VL

Vb

LB

HP CU

O

Fig. 46 Schets van de antennale klier en de vermeende dorsocaudale uitrekking van de dorsale lob tijdens de ecdysis Vb: ventrale blaas, LB: lateraal blad, CU: caudale uitlopers van het laterale blad, VL: ventrale lob van de mediane blaas, DL: dorsale lob van de mediane blaas, O: oesofagus, M: maag, HP: hepatopancreas, Cx: carapax, AS: eerste abdominale segment, pijlhoofd: plaats waar het exoskelet breekt.

Deze hypothese wordt versterkt door de (andere) functies van de spieren. De protocephalon attractorspieren hangen vast aan apodemen, die uit het dak van het protocephalon projecteren. Contractie van de protocephalon attractoren resulteert in het naar beneden trekken van het antennulaire protocephalon zoals ook vastgesteld door Grobben (1917). Enkele basale segmenten van de protocephalon attractor hechten vast aan de oogsteel en contractie resulteert in een snelle abductie van de ogen (Young, 1959). Bij observatie van vervellende Decapoda, kan worden opgemerkt dat de garnaal zijn scaphocerieten naar lateraal houdt (wat wijst op een blijvende druk van de scaphoceriet abductoren op de ventrale blaas). Op geregelde tijdstippen gaan de scaphocerieten langzaam een beetje naar beneden, gevolgd door een harde en korte neerwaartse beweging van de antennulae die de scaphocerieten mee naar onder duwen. Deze beweging wordt onmiddellijk gevolgd door een terugkeer

73

van de scaphocerieten en antennulae naar de originele positie en wordt een aantal keer herhaald totdat het vlies breekt en het oude exoskelet loskomt (Figuur 46). Deze bewegingen komen overeen met de actie van de protocephalon attractoren. Er kan ook gezien worden dat de ogen kort naar lateraal snokken, wat eveneens kan toegeschreven worden aan de protocephalon attractoren.

Verder moeten er nog een aantal kanttekeningen geplaatst worden rond de theorie over de rol van de antennale klier tijdens het vervellen. Voor een mechanisme waarbij urine gepompt wordt naar caudale structuren is er een relatief groot volume aan urine nodig. Meerdere hypothesen kunnen hier een antwoord op vinden. Het kan zijn dat de ventrale blaas en de caudale structuren (mediane blaas en lateraal blad) in de intermolt een bepaalde hoeveelheid urine bevatten. Eventueel kan de antennale klier in de aanloop naar het vervellingsproces, grotere hoeveelheden urine produceren, die dan worden opgeslagen in de mediane blaas, het laterale blad en zijn caudale uitlopers. Zodoende zal de structuur gespannen staan, maar nog niet uitgerokken worden. De resulterende druk op het maagdarmstelsel zou de verklaring kunnen zijn waarom garnalen ophouden met eten voor ze vervellen. Wanneer het moment van vervellen aangebroken is, zal de opgespaarde inhoud van de antennale klier naar de dorsale lobus gestuwd worden en deze naar caudaal doen uitrekken. Een andere mogelijkheid is, dat er water uit de omgeving wordt opgezogen in de antennale klier. Evolutionair gezien, lijkt deze laatste optie weinig geschikt; indien de garnaal effectief water vanuit de buitenwereld in zich brengt, is het risico op infectie met om het even welke kiem groot. De aanzuiging zou dan gebeuren door spieren die analoog werken aan de ademhalingsspieren bij hogere dieren. Toch lijkt deze theorie van aanzuiging de moeite waard om verder te onderzoeken.

Een mediane blaas met een ruim volume en opsplitsing in twee lobi zoals hier werd teruggevonden, werd nog niet eerder beschreven. Nakamura en Nakashima (1992) kwamen het dichtst met hun beschrijving van de mediane lobus van de transversale coelomosac dat niets anders is dan een dunne, longitudinale structuur, rostraal gelegen van de maag. Ook beschrijven zij een kleine epigastrische lob die overeenkomt met de dorsale lobus van de mediane blaas. Bij de selectie van hun proefdiermateriaal, kozen zij echter voor P. japonicus larvae van ongeveer 0,7 g, wat een vergelijking met de post-larvae bemoeilijkt. Het zou kunnen dat de situatie beschreven bij de P. japonicus larvae, een immature vorm is van wat hier gezien wordt bij de post-larvae.

Het vraagstuk rond de structuur van de antennale klier en zijn vermeende rol in de ecdysis, verdient verder onderzoek. Een simpele observationele studie van Decapoda rond het moment van vervellen (waarbij speciaal gelet wordt op de beweging van de gelede aanhangsels) zou al veel kunnen uitklaren. Men zou eveneens de structuur kunnen bepalen van de antennale klier op verschillende stadia van de vervellingscyclus, daarbij gebruikmakende van technieken zoals micro-computertomografie. Ook bij andere Decapoda zoals onder meer de H. americanus , M. rosenbergii (Al-Mohsen, 2009) en de A. astacus is de antennale klier beschreven als een compact orgaantje gelegen aan de basis van de antenne (Al-Mohsen, 2009; Behnke et al., 1990; Khodabandeh et al., 2005a). Ook bij deze dieren gaat het exoskelet als eerste gaan ruptureren ter hoogte van de overgang van de cephalothorax naar het

74

abdomen (eigen observatie). Onderzoek gebruikmakende van seriële beelden doorheen de cephalothorax van deze dieren zoals in dit onderzoek en dat van Nakamura en Nishigaki (1991) en Nakamura en Nakashima (1992) (in plaats van dissectiemethoden om de antennale klier te bestuderen) zouden potentieel gelijkaardige structuren kunnen blootleggen en de theorie rond het vervellen al dan niet bevestigen. Daarnaast zou het nuttig zijn om de beschreven structuur te bevestigen met andere 3D-technieken zoals het maken van een micro-computertomografie of een corrosieve microvasculaire cast.

Het experiment waarbij onsuccesvol getracht werd om een in vivo kleuring van de antennale klier te maken om de dynamiek te bestuderen tijdens de ecdysis moet zeker worden herhaald. Indien we de in vivo situatie kunnen vastleggen op film, zouden we een zeer accuraat idee kunnen vormen van wat er zich precies voltrekt tijdens de vervelling. Het experiment leerde ons in ieder geval, dat de P. vannamei zeer goed in staat is om snel vloeistof te evacueren uit zijn excretiestelsel.

Eerder werd aangetoond dat penaeide garnalen gevoeliger zijn voor WSSV-infectie in de periode rond de ecdysis (Corteel et al., 2009). Dit kan worden verklaard doordat de nieuwe cuticula nog zacht is en daardoor gemakkelijker penetreerbaar is. Ook werd immunosuppressie aangetoond tijdens deze periode (Liu et al., 2004). Een andere mogelijkheid kan zijn dat de nieuwe cuticula ter hoogte van de nefroporiën nog onvoldoende de opening naar de antennale klieren afsluit. Het omgevende water met eventuele WSSV-partikels zou dan gemakkelijker in de antennale klier kunnen vloeien, waardoor infectie plaatsvindt. Op vele plaatsen is de structuur éénlagig, met onmiddellijk daarachter de hemolymfe. Nergens werd een cuticula gezien die het lumen van de antennale klier kan beschermen tegen invaderende pathogenen. De uitgebreide spreiding van de antennale klier doorheen de cephalothorax, zoals in deze studie gevonden, kan een verklaring zijn voor het snelle spreiden van het virus naar alle organen. Het zou interessant zijn om een infectiestudie uit te voeren waarbij garnalen geïnfecteerd worden door katheterisatie van de antennale klier. Het in cultuur brengen van de coelomosac-, labyrintof andere antennale kliercellen, kan nuttig zijn om de intredemechanismen van WSSV te identificeren en om te onderzoeken welke celtypes er al dan niet vatbaar zijn voor WSSV-intrede. Daarnaast zou het ook interessant zijn om de rol van de antennale klier als excretie-orgaan van WSSV te bestuderen.

Tenslotte kan worden gesteld dat, gezien de uitgebreide en complexe structuur van het orgaan, “het antennale complex” een meer passende naam is voor de structuur dan “de antennale klier”.

75

2. DE KWANTIFICATIE VAN WSSV IN URINE VAN P. VANNAMEI De anatomie en morfologie van de antennale klier bij P. vannamei, leert ons, dat het orgaan een veelbelovende kandidaat is om de intredepoort van WSSV te vormen. In het tweede deel van deze thesis, werd een hulpmiddel geoptimaliseerd voor verder onderzoek hieromtrent. Er werd een qPCRmethode geoptimaliseerd waarbij primers werden gezocht op 3 doelwitgenen: (i) het DNApolymerasegen, (ii) het VP28-gen en (iii) het VP19-gen. De sequentiebepaling van het DNApolymerasegen in een poging om meer sequenties te kunnen includeren in het onderzoek, faalde. Verschillende PCR’s met andere programmaties, concentraties en componenten leverden geen resultaat op. Het feit dat een ORF werd gevonden dat het DNA-polymerasegen gedeeltelijk overlapte, doet de vraag reizen of de huidige sequenties die te vinden zijn in Genbank, wel accuraat zijn. Sowieso zou het opportuun zijn om meerdere WSSV-stammen volledig te sequeneren en subsequent te analyseren. De DNA-polymerasesequenties die in Genbank te vinden waren, zijn overigens zeer geconserveerd. Ook het VP28 was relatief geconserveerd, maar primers die voldeden aan de criteria voor gebruik bij qPCR en bovendien specifiek genoeg waren om enkel WSSV te detecteren, waren niet te vinden. VP19 leverde daarentegen direct resultaat op. Het qPCR-protocol met 50 mM voorwaartse primer en 200 mM achterwaartse primer bleek het vroegst WSSV-standaard-DNA te detecteren bij een annealingtemperatuur van 58°C. Met een efficiëntie van 98%, een kwantificatielimiet van 3.101 WSSVkopijen per reactie, werd een zeer bruikbare methode ontwikkeld voor onderzoek naar WSSV, dat de tijdrovende in vivo titraties op garnalen kan vervangen.

Omdat de urine van zoogdieren een gekende inhibitor is van qPCR-reacties, werd het effect van urine afkomstig van P. vannamei op qPCR na verschillende extractiemethoden onderzocht. Hieruit bleek duidelijk dat de urine geen negatief effect heeft op het aantal gedetecteerde WSSV-kopijen wanneer geëxtraheerd werd met de DNA Min Kit (Qiagen, Californië, VSA). De Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Californië, VSA), bleek minder geschikt om WSSV-DNA te extraheren uit urine.

De ontwikkeling van een methode om WSSV-genomen te kwantificeren, laat toe om de dynamiek van een infectie te onderzoeken, zowel in vivo studies als in vitro. De gevoeligheid van de ontwikkelde methode die in staat is om WSSV-DNA te kwantificeren tot en met 30 kopijen/reactie, laat onderzoek naar de latentie van WSSV toe. Samen met het vinden van een geschikte extractiemethode voor urinestalen, is de basis gelegd voor het bestuderen van WSSV in de antennale klier. Het is de geknipte methode om de rol van de antennale klier als potentiële intredepoort of excretie-orgaan van WSSV te bestuderen. Deze bevindingen zullen het onderzoek naar WSSV in een stroomversnelling leiden.

76

REFERENTIELIJST

Ahearn, G. A., Mandal, P. K. en Mandal, A. (2004). Calcium regulation in crustaceans during the molt cycle: a review and update. Comperative Biochemestry, Part A: Molecular & Integrative Physiology 137(2) 247-57. Al-Mohsen, I. (2009). Macrobrachium rosenbergii (de Man 1879): the antennal gland and the role of pheromones in mating behaviour. Doctoraatsthesis, Institute of Aquaculture, University of stirling, P. 60-120. Anderson, D. T. (1973). Crustaceans. In: Embryology and Phylogeny in Annelids and Arthropods. D. T. Anderson (editor). Pergamon. p. 263-364. Anoniem (2014). 33g Penaeus vannamei rearing in Thailand. Internetreferentie: http://www.vannamei101.com/photo.htm (geconsulteerd op 3 mei 2015). Anoniem (2015a), Decapodos Un Mundo En Diez Patas. Internetreferentie: http://decapodos.infored.mx/photo_302885_Penaeus-japonicus--.html (geconsulteerd op 3 mei 2015). Anoniem (2015b), Fish species of the Tagus Estuary: Camarão-mouro, Common Shrimp (Crangon Crangon). Internetreferentie: https://www.pinterest.com/pin/512143788844945385/ (geconsulteerd op 3 mei 2015). APHIS-USDA (2004). Impact worksheet White spot disease in United States. APHIS-USDA, Natural Resources Research: Fort Collins, CO Center. APHIS-USDA (2005). Impact worksheet White spot disease in Brazil. APHIS-USDA, Natural Resources Research: Fort Collins, CO Center. Bateman, K. S., Tew, I., French, C., Hicks, R. J., Martin, P., Munro, J. en Stentiford, G. D. (2012). Susceptibility to infection and pathogenicity of White Spot Disease (WSD) in non-model crustacean host taxa from temperate regions. Journal of Invertebrate Pathology 110(3) 340-351. Bauer, R. T. (1979). Antifouling Adaptations of Marine Shrimp (Decapoda, Caridea) - Gill Cleaning Mechanisms and Grooming of Brooded Embryos. Zoological Journal of the Linnean Society 65(4) 281-303. Bauer, R. T. (1998). Gill-cleaning mechanisms of the crayfish Procambarus clarkii (Astacidea : Cambaridae): experimental testing of setobranch function. Invertebrate Biology 117(2) 129-143. Bauer, R. T. (1999). Gill-cleaning mechanisms of a dendrobranchiate shrimp, Rimapenaeus similis (Decapoda, Penaeidae): Description and experimental testing of function. Journal of Morphology 242(2) 125-139. Beams, H. W., Anderson, E. en Press, N. (1956). Light and Electron Microscope Studies on the Cells of the Distal Portion of the Crayfish Nephron Tubule. Cytologia 21(1) 50-57. Behnke, R. D., Wong, R. K., Huse, S. M., Reshkin, S. J. en Ahearn, G. A. (1990). Proline Transport by Brush-Border Membrane-Vesicles of Lobster Antennal Glands. American Journal of Physiology 258(2) F311-F320. Bondad-Reantaso, M. G., Mcgladdery, S. E., East, I. en Subasinghe, R. P. (2001). Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. Rome, Italy. p. 37. Buranajitpirom, D., Asuvapongpatana, S., Weerachatyanukul, W., Wongprasert, K., Namwong, W., Poltana, P. en Withyachumnarnkul, B. (2010). Adaptation of the black tiger shrimp, Penaeus monodon, to different salinities through an excretory function of the antennal gland. Cell Tissue Res 340(3) 481-489. Calderón, J., Bayot, B., Zurita, G., Betancourt, I., Panchana, F. en Graindorge, V. A. d. (1999). Monitoreo del virus de la mancha blanca en Ecuador. V Congreso ecuatoriano acuicultura enfocando losretos del 2000. Guayaquil, Ecuador. p. 84. Castille, F. L. en Lawrence, A. L. (1981a). A Comparison of the Capabilities of Juvenile and Adult Penaeus-Setiferus and Penaeus-Stylirostris to Regulate the Osmotic, Sodium, and Chloride Concentrations in the Hemolymph. Comparative Biochemistry and Physiology a-Physiology 68(4) 677-680. Castille, F. L. en Lawrence, A. L. (1981b). A Comparison of the Osmotic, Sodium, and Chloride Concentrations between the Urine and Hemolymph of Penaeus-Setiferus (L) and PenaeusStylirostris Stimpson. Comparative Biochemistry and Physiology a-Physiology 70(4) 525-528. Chan, T. Y. (1998). Shrimps and Prawns. In: FAO species identification guide for fishery purposes. The living marine resources of the Western Central Pacific. Volume 2. Cephalopods, crustaceans,

77

holothurians and sharks. K. E. Carpenter and V. H. Niem (editor). Food and Agricultural Organization, Rome. p. 687-1396. Chang, P. S., Lo, C. F., Wang, Y. C. en Kou, G. H. (1996). Identification of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimp Penaeus monodon by in situ hybridization. Diseases of Aquatic Organisms 27(2) 131-139. Chou, H. Y., Huang, C. Y., Wang, C. H., Chiang, H. C. en Lo, C. F. (1995). Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of Aquatic Organisms 23 165–173. Chou, H. Y., Huang, C. Y., Lo, C. F. en Kou, G. H. (1998). Studies on transmission of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) in Penaeus monodon and P. japonicus via waterborne contact and oral ingestion. Aquaculture 164(1-4) 263-276. Corteel, M., Dantas-Lima, J. J., Wille, M., Alday-Sanz, V., Pensaert, M. B., Sorgeloos, P. en Nauwynck, H. J. (2009). Molt stage and cuticle damage influence white spot syndrome virus immersion infection in penaeid shrimp. Veterinary Microbiology 137(3-4) 209-216. Corteel, M., Dantas-Lima, J. J., Tuan, V. V., Thuong, K. V., Wille, M., Alday-Sanz, V., Pensaert, M. B., Sorgeloos, P. en Nauwynck, H. J. (2012a). Susceptibility of juvenile Macrobrachium rosenbergii to different doses of high and low virulence strains of white spot syndrome virus (WSSV). Diseases of Aquatic Organisms 100(3) 211-218. Corteel, M., Dantas-Lima, J. J., Wille, M., Alday-Sanz, V., Pensaert, M. B., Sorgeloos, P. en Nauwynck, H. J. (2012b). Moult cycle of laboratory-raised Penaeus (Litopenaeus) vannamei and P. monodon. Aquaculture International 20(1) 13-18. Dantas-Lima, J. J. (2013). Development of Techniques to Culture Shrimp Haemocytes and Purify White Spot Syndrome Virus (WSSV) in order to Study WSSV-Haemocyte Interactions. Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent, p. 7-74. de Graindorge, V. A. en Griffith, D. R. W. (2000). Disease Management Protocols and Semi-Intensive Shrimp Farming In Ecuador. Global Aquaculture Advocat 3(2) 17-19. Debnath, P., Karim, M. en Belton, B. (2014). Comparative study of the reproductive performance and White Spot Syndrome Virus (WSSV) status of black tiger shrimp (Penaeus monodon) collected from the Bay of Bengal. Aquaculture 424 71-77. Desrina, Verreth, J. A. J., Prayitno, S. B., Rombout, J. H. W. M., Vlak, J. M. en Verdegem, M. C. J. (2013). Replication of white spot syndrome virus (WSSV) in the polychaete Dendronereis spp. Journal of Invertebrate Pathology 114(1) 7-10. Doughtie, D. G. en Rao, K. R. (1984). Histopathological and Ultrastructural-Changes in the Antennal Gland, Midgut, Hepatopancreas, and Gill of Grass Shrimp Following Exposure to Hexavalent Chromium. Journal of Invertebrate Pathology 43(1) 89-108. Durand, S., Lightner, D. V., Nunan, L. M., Redman, R. M., Mari, J. en Bonami, J. R. (1996). Application of gene probes as diagnostic tools for White Spot Baculovirus (WSBV) of penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms 27(1) 59-66. Durand, S., Lightner, D. V., Redman, R. M. en Bonami, J. R. (1997). Ultrastructure and morphogenesis of White Spot Syndrome Baculovirus (WSSV). Diseases of Aquatic Organisms 29(3) 205-211. East, I. J., Black, P. F., McColl, K. A., Hodgson, R. A. J. en Bernoth, E. M. (2004). Survey for the presence of White Spot Syndrome virus in Australian crustaceans. Australian Veterinary Journal 82(4) 236240. Eissa, I., Badran, A., Diab, A., Saker, S. en Ahmed, A. (2009). Diagnosis of white spot syndrome virus (wssv) among shrimp for the first time in Egypt. Suez Canal Veterinary Medicine Journal 14(1) 85100. Escobedo-Bonilla, C. M., Alday-Sanz, V., Wille, M., Sorgeloos, P., Pensaert, M. B. en Nauwynck, H. J. (2008). A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus. Journal of Fish Diseases 31(1) 1-18. FAO (2008). hunger on the rise Soaring prices add 75 million people to global hunger rolls. briefing paper. Rome, Food and Agriculture Organization. FAO (2012a). The state of world fisheries and aquaculture 2012. Rome, Food and Agriculture Organization, p. 209. FAO (2012b). Yearbook of Fishery Statistics: World aquaculture production by species groups. Rome, Food and Agriculture Organization. FAO (2014). The state of food insecurity in the world. Rome, Food and Agriculture Organization, p. 57. FAO/NACA (2003). Myanmar Aquaculture and Inland Fisheries. Thailand, Food and Agriculture Organization, p. 60.

78

Felgenhaur, B. (1992). Decapod Internal Anatomy. In: Microscopic anatomy of invertebrates: Decapod Crustacea. W. H. Frederick and E. R. Edward (editor). Wiley-Liss, Inc., New York. p. 7-43. Fingerman, M. (1991). Glands and Secretion. In: Microscopic anatomy of invertebrates: Decapod Crustacea. W. H. Frederick and E. R. Edward (editor). Wiley-Liss, Inc., New York. p. 345-394. Flegel, T. W., Boonyaratpalin, S. en Wuthyachumnarnkul, B. (1997). Current status of research on yellow-head virus and white-spot virus in Thailand. In: Diseases in Asian aquaculture III. T. W. Flegel and I. H. MacRae (editor). Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines. p. 285296. Flegel, T. W. (2002). Marine shipping could ballast water and hull fouling be a fomite for disease transmission? Conference on World Aquaculture T. W. A. Society. Beijing, The World Aquaculture Society. p. 226. Flegel, T. W. (2006). The Special Danger of Viral Pathogens in Shrimp Translocated for Aquaculture. Science Asia 32 215-221. Flegel, T. W., Lightner, D. V., Lo, C. F. en Owens, L. (2008). Shrimp Disease Control: Past, Present and Future. In: Diseases in Asian Aquaculture. M. G. M. Bondad-Reantaso, C.V., M. Crumlish and R. P. Subasinghe (editor). Asian Fisheries Society, Manila, Philippines. p. 355-378. Freire, C. A., Onken, H. en McNamara, J. C. (2008). A structure–function analysis of ion transport in crustacean gills and excretory organs. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 151(3) 272-304. Fukuta, N., Ida, K., Kato, T., Uedo, N., Ando, T., Watanabe, H., Shimbo, T. en Study Group for Investigating Endoscopic Diagnosis of Gastric Intestinal, M. (2013). Endoscopic diagnosis of gastric intestinal metaplasia: a prospective multicenter study. Dig Endosc 25(5) 526-34. Fuller, E. G., Highison, G. J., Brown, F. en Bayer, C. (1989). Ultrastructure of the crayfish antennal gland revealed by scanning and transmission electron microscopy combined with ultrasonic microdissection. Journal of Morphology 200(1) 9-15. Fuller, P. L., Knott, D. M., Kingsley-Smith, P. R., Morris, J. A., Buckel, C. A., Hunter, M. E. en Hartman, L. D. (2014). Invasion of Asian tiger shrimp, Penaeus monodon Fabricius, 1798, in the western north Atlantic and Gulf of Mexico. Aquatic Invasions 9(1) 59-70. Gong, S. J., Kim, Y. J., Choi, M. R. en Kim, S. K. (2010). Experimental Infection for the Neutralization of White Spot Syndrome Virus (WSSV) in Wild Captured Sand Shrimp, Crangon affinis. Journal of Life Sciences 20(9) 1294-1298. Grobben, K. (1917). Der Schalenschließmuskel der dekapoden Crustaceen, zugleich ein Beitrag zur Kenntnis ihrer Kopfmuskulatur. p. 43. Hameed, A. S., Anilkumar, M., Raj, M. L. S. en Jayaraman, K. (1998). Studies on the pathogenicity of systemic ectodermal and mesodermal baculovirus and its detection in shrimp by immunological methods. Aquaculture 160(1-2) 31-45. He, F. en Kwang, J. (2008). Identification and characterization of a new E3 ubiquitin ligase in white spot syndrome virus involved in virus latency. Virology Journal 5 151. Henry, R. P. en Wheatly, M. G. (1992). Interaction of Respiration, Ion Regulation, and Acid-BaseBalance in the Everyday Life of Aquatic Crustaceans. American Zoologist 32(3) 407-416. Hill, B. (2002). National and international impacts of white spot disease of shrimp. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 22(2) 58-65. Holliday, C. W. en Miller, D. S. (1984). Cellular Mechanisms of Organic Anion Transport in Crustacean Renal Tissue. American Zoologist 24(1) 275-284. Hossain, M. S., Chakraborty, A., Joseph, B., Otta, S. K., Karunasagar, I. en Karunasagar, I. (2001). Detection of new hosts for white spot syndrome virus of shrimp using nested polymerase chain reaction. Aquaculture 198(1–2) 1-11. Hossain, M. S., Khadijah, S. en Kwang, J. (2004). Characterization of ORF89 - a latency-related gene of white spot syndrome virus. Virology 325(1) 106-15. Hsu, H. C., Lo, C. F., Lin, S. C., Liu, K. F., Peng, S. E., Chang, Y. S., Chen, L. L., Liu, W. J. en Kou, G. H. (1999). Studies on effective PCR screening strategies for white spot syndrome virus (WSSV) detection in Penaeus monodon brooders. Diseases of Aquatic Organisms 39(1) 13-19. Icely, J. D. en Nott, J. A. (1979). The general morphology and fine structure of the antennary gland of Corophium volutator (Amphipoda: Crustacea). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 59(03) 745-755. ICTV (2012). Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses A. M. Q. King, M. J. Adams, E. B. Carstens and E. J. Lefkowitz. San Diego, USA.

79

Inouye, K., Miwa, S., Oseko, N., Nakano, H., Kimura, T., Momoyama, K. en Hiraoka, M. (1994). Mass mortalities of cultured kuruma shrimp penaeus-japonicus in japan in 1993 - electron-microscopic evidence of the causative virus. Fish Pathology 29(2) 149-158. Islamian, J. P. en Mehrali, H. (2015). Lycopene as A Carotenoid Provides Radioprotectant and Antioxidant Effects by Quenching Radiation-Induced Free Radical Singlet Oxygen: An Overview. Cell Journal 16(4) 386-391. Jie, H., Xiaoling, S., Jia, Y. en Conghai, Y. (1995). Baculoviral hypodermal and hematopoietic necrosisstudy on the pathogen and pathology of the explosive epidemic disease of shrimp. Marine fisheries 16(1) 1-10. Johnson, P. T. (1980). Histology of the blue crab, Callintectes sapidus- A model for the decapoda. Praege publishers, New York, USA, p. 440. Juberthie-Jupeau, L. en Crouau, Y. (1977). The Tegumental Glands of a Troglobitic Crustacean. International Journal of Speteology 9 309-319. Kasornchandra, J., Boonyaratpalin, S. en Itami, T. (1998). Detection of white-spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Asia: Microscopic observation and polymerase chain reaction. Aquaculture 164(1–4) 243-251. Khadijah, S., Neo, S. Y., Hossain, M. S., Miller, L. D., Mathavan, S. en Kwang, J. (2003). Identification of white spot syndrome virus latency-related genes in specific-pathogen-free shrimps by use of a microarray. J Virol 77(18) 10162-7. Khoa, L. V., Hao, N. V. en Huong, L. T. L. (2001). Vietnam: National Review on Management Strategies for Major Diseases in Shrimp Aquaculture. In: Thematic Review on Management Strategies for Major Diseases in Shrimp Aquaculture. Subasinghe R., Arthur R., Phillips M.J., Reantaso M. (Editors). Proceedings of a Workshop held in Cebu, Philippines. p. 60. Khodabandeh, S., Charmantier, G., Blasco, C., Grousset, E. en Charmantier-Daures, M. (2005a). Ontogeny of the antennal glands in the crayfish Astacus leptodactylus (Crustacea, Decapoda): anatomical and cell differentiation. Cell and Tissue Research 319(1) 153-165. Khodabandeh, S., Charmantier, G. en Charmantier-Daures, M. (2005b). Ultrastructural studies and Na+,K+-ATPase immunolocalization in the antennal urinary glands of the lobster Homarus gammarus (Crustacea, Decapoda). J Histochem Cytochem 53(10) 1203-14. Khodabandeh, S., Kutnik, M., Aujoulat, F., Charmantier, G. en Charmantier-Daures, M. (2005c). Ontogeny of the antennal glands in the crayfish Astacus leptodactylus (Crustacea, Decapoda): immunolocalization of Na+,K+-ATPase. Cell Tissue Res 319(1) 167-74. Kibbe, W. A. (2007). OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research 35(2) 44-46. Kirschner, L. B. en Wagner, S. (1965). The Site and Permeability of the Filtration Locus in the Crayfish Antennal Gland. Journal of Experimental Biology 43 385-395. Kou, G. H., Peng, S. E., Y.L., C. en Lo, C. F. (1998). Tissue distribution of white spot syndrome virus (WSSV) in shrimp and crabs. Advances in Shrimp Biotechnology. Proceedings to the Special Session on Shrimp Biotechnology , 5th Asian Fisheries Forum, p. 296. Leike (2011), Everyone Gets a Little Blue at Christmas. Internetreferentie: http://www.shrimpnews.com/FreeNewsFolder/FreeNewsBackIssues/2010BackIssues/FreeNewsD ecember201024.html (geconsulteerd op 3 mei 2015). Leu, J. H., Tsai, J. M., Wang, H. C., Wang, A. H. J., Wang, C. H., Kou, G. H. en Lo, C. F. (2005). The unique stacked rings in the nucleocapsid of the white spot syndrome virus virion are formed by the major structural protein VP664, the largest viral structural protein ever found. Journal of Virology 79(1) 140-149. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana, USA, p. 114. Lightner, D. V., Redman, R. M., Poulos, B. T., Nunan, L. M., Mari, J. L. en Hasson, K. W. (1997). Risk of spread of penaeid shrimp viruses in the Americas by the international movement of live and frozen shrimp. Rev Sci Tech 16(1) 146-60. Lin, S.-C., Liou, C.-H. en Cheng, J.-H. (2000). The role of the antennal glands in ion and body volume regulation of cannulated Penaeus monodon reared in various salinity conditions. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 127(2) 121-129. Lin, S. J., Hsia, H. L., Liu, W. J., Huang, J. Y., Liu, K. F., Chen, W. Y., Yeh, Y. C., Huang, Y. T., Lo, C. F., Kou, G. H. en Wang, H. C. (2012). Spawning stress triggers WSSV replication in brooders via the activation of shrimp STAT. Dev Comp Immunol 38(1) 128-35.

80

Liu, C. H., Yeh, S. T., Cheng, S. Y. en Chen, J. C. (2004). The immune response of the white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio infection in relation with the moult cycle. Fish Shellfish Immunol 16(2) 151-61. Liu, W. J., Chang, Y. S., Wang, C. H., Kou, G. H. en Lo, C. F. (2005). Microarray and RT-PCR screening for white spot syndrome virus immediate-early genes in cycloheximide-treated shrimp. Virology 334(2) 327-41. Liu, W. J., Chang, Y. S., Wang, A. H., Kou, G. H. en Lo, C. F. (2007). White spot syndrome virus annexes a shrimp STAT to enhance expression of the immediate-early gene ie1. J Virol 81(3) 1461-71. Lo, C. F. (1996). White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods Diseases of Aquatic Organisms 27 215-225. Lo, C. F., Leu, J. H., Ho, C. H., Chen, C. H., Peng, S. E., Chen, Y. T., Chou, C. M., Yeh, P. Y., Huang, C. J., Chou, H. Y., Wang, C. H. en Kou, G. H. (1996). Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction. Diseases of Aquatic Organisms 25(1-2) 133-141. Lo, C. F., Ho, C. H., Chen, C. H., Liu, K. F., Chiu, Y. L., Yeh, P. Y., Peng, S. E., Hsu, H. C., Liu, H. C., Chang, C. F., Su, M. S., Wang, C. H. en Kou, G. H. (1997). Detection and tissue tropism of white spot syndrome baculovirus (WSBV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproductive organs. Diseases of Aquatic Organisms 30(1) 53-72. Lu, L. en Kwang, J. (2004). Identification of a novel shrimp protein phosphatase and its association with latency-related ORF427 of white spot syndrome virus. FEBS Lett 577(1-2) 141-146. Magbanua, F. O., Karlo T., N., Veronica, P. M., Catalino G., A., Florian O., d. l. P. a., Rolando O., M., Juan D., A., E. Cesar B., N. J., Philip C., L. en Lourdes, M.-T. (2000). White spot syndrome virus (WSSV) in cultured Penaeus monodon in the Philippines. Diseases of Aquatic Organisms 42(1) 77-82. Maluf, N. S. R. (1941). Micturition in the Crayfish and Further Observations on the Anatomy of the Nephron of This Animal. Biological Bulletin 81(1) 134-148. Martorelli, S. R., Overstreet, R. M. en Alvillar, J. A. J. (2010). First report of viral pathogens WSSV and IHHNV in Argentine crustaceans. University of Nebraska. 86 (1): 117-131. Mazid, M. en Banu, A. (2002). An overview of the social and economic impact and management of fish and shrimpdisease in Bangladesh, with an emphasis on small-scale aquaculture. In: Primary Aquatic Animal Health Care in Rural, Small-Scale Aquaculture Development (ed. by J.R. Arthur, M.J. Phillips, R.P. Subasinghe, M. Bondad-Reantaso & I.H. Macrae), FAO Fisheries Technical Paper 406, FAO, Rome, Italy. p. 21–25. Mialhe, F., Gunnell, Y. en Mering, C. (2013). The impacts of shrimp farming on land use, employment and migration in Tumbes, northern Peru. Ocean & Coastal Management 73(0) 1-12. Momoyama, K., Hiraoka, M., Nakano, H., Koube, H., Inouye, K. en Oseko, N. (1994). Mass Mortalities of Cultured Kuruma Shrimp, Penaeus japonicus, in Japan in 1993 : Histopathological Study. Fish Pathology 29(2) 141-148. Nakamura, K. en Nishigaki, Y. (1991). Structure of Antennal Gland in Kuruma Prawn Penaeus-Japonicus. Nippon Suisan Gakkaishi 57(10) 1859-1863. Nakamura, K. en Nakashima, N. (1992). Structure of Antennal Gland Coelomasac in the Kuruma Prawn. Nippon Suisan Gakkaishi 58(8) 1551-1551. Nakano, H., Koube, H., Umezawa, S., Momoyama, K., Hiraoka, M., Inouye, K. en Oseko, N. (1994). Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, penaeus-japonicus, in japan in 1993 - epizootiological survey and infection trials. Fish Pathology 29(2) 135-139. Namvongsakool, P., Asuvapongpatana, S., Senapin, S., Weerachatyanukul, W., Treerattrakool, S. en Withyachumnarnkul, B. (2015). A novel localization of molt-inhibiting hormone in the tegumental glands of shrimp Penaeus monodon and its possible role in shrimp molting. Aquaculture 438 129137. OIE (1999). OIE Online Database Handistatus II White spot disease. Internetreferentie: http://web.oie.int/hs2/sit_mald_cont.asp?c_mald=182&c_cont=6&annee=1999 (geconsulteerd op 3 februari 2015). OIE (2000). OIE Online Database Handistatus II White spot disease. Internetreferentie: http://web.oie.int/hs2/sit_mald_cont.asp?c_mald=182&c_cont=6&annee=2000 (geconsulteerd op 3 februari 2015). OIE (2002). OIE Online Database Handistatus II White spot Disease. Internetreferentie: http://web.oie.int/hs2/sit_mald_cont.asp?c_mald=182&c_cont=6&annee=2002 (geconsulteerd op 3 februari 2015).

81

OIE (2003). OIE Online Database Handistatus II. Multiannual Animal Disease Status. Hong Kong (P.R. China)/White spot disease. Internetreferentie: http://web.oie.int/hs2/sit_pays_mald_pl.asp?c_pays=82&c_mald=182 (geconsulteerd op 3 februari 2015. OIE (2004). OIE Online Database. Handistatus II. Multiannual Animal Disease Status. El Salvador/White spot disease. Internetreferentie: http://web.oie.int/hs2/sit_pays_mald_pl.asp?c_pays=170&c_mald=182 (geconsulteerd op 3 februari 2015). OIE (2011). Immediate notification report. Report reference: , Ref OIE: 10629, Report Date: 25/05/2011, Country: Brunei Darussalam. OIE (2014). Aquatic Animal Health Code. OIE. p. 324. Panikkar, N. K. ( 1941). Osmoregulation in some palaemonid prawns. Journal of Marine Biology Association 25 317 – 59. Park, H., Lee, Y. S., Lee, S. en Y.Lee (1998). An infectious viral disease of penaeid shrimp newly found in Korea. Diseases of Aquatic Organisms 34 71-75. Peterson, D. R. en Loizzi, R. F. (1973). Regional cytology and cytochemistry of the crayfish kidney tubule. J Morphol 141(2) 133-45. Peterson, D. R. en Loizzi, R. F. (1974a). Ultrastructure of the crayfish kidney—coelomosac, labyrinth, nephridial canal. Journal of Morphology 142(3) 241-263. Peterson, D. R. en Loizzi, R. F. (1974b). Biochemical and cytochemical investigations of (Na+-K+)-ATPase in the crayfish kidney. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology 49(4) 763-773. Pradeep, B., Shekar, M., Karunasagar, I. en Karunasagar, I. (2008). Characterization of variable genomic regions of Indian white spot syndrome virus. Virology 376(1) 24-30. Pradeep, B., Rai, P., Mohan, S. A., Shekhar, M. S. en Karunasagar, I. (2012). Biology, Host Range, Pathogenesis and Diagnosis of White spot syndrome virus. Indian journal of virology : an official organ of Indian Virological Society 23(2) 161-174. Rajendran, K. V., Vijayan, K. K., Santiago, T. C. en Krol, R. M. (1999). Experimental host range and histopathology of white spot syndrome virus (WSSV) infection in shrimp, prawns, crabs and lobsters from India. Journal of Fish Diseases 22(3) 183-191. Richard Waite, M. B., Randall Brumett, Sarah Castine, Nuttapon Chaiyawannakarn, Sadasivam Kaushik, Rattanawan Mungkung, Supawat Nawapakpilai, Michael Phillips (2014). Improving productivity and environmental performance of aquaculture. Riegel, J. A. (1963). Micropuncture Studies of Chloride Concentration and Osmotic Pressure in Crayfish Antennal Gland. Journal of Experimental Biology 40(3) 487-&. Riegel, J. A. (1966a). Analysis of Formed Bodies in Urine Removed from Crayfish Antennal Gland by Micropuncture. Journal of Experimental Biology 44(2) 387-&. Riegel, J. A. (1966b). Micropuncture Studies of Formed-Body Secretion by Excretory Organs of Crayfish Frog and Stick Insect. Journal of Experimental Biology 44(2) 379-&. Riegel, J. A. (1970). In vitro studies of fluid and ion movements due to the swelling of formed bodies. Comparative Biochemistry and Physiology 35(4) 843-856. Robertson, L., Bray, W., Leung-Trujillo, J. en Lawrence, A. (1987). Practical Molt Staging of Penaeus setiferus and Penaeus stylirostris. Journal of the World Aquaculture Society 18(3) 180-185. Roldan, B. M. en Shivers, R. R. (1987). The uptake and storage of iron and lead in cells of the crayfish (Orconectes propinquus) hepatopancreas and antennal gland. Comp Biochem Physiol C 86(1) 20114. Rosenberry, B. (1999). Shrimp white spot disease in latin America - an update. San Diego, California, USA, Rosenberry Bob. p. 4. Schaffner, A. en Rodewald, R. (1978). Filtration barriers in the coelomic sac of the crayfish, Procambarus clarkii. J Ultrastruct Res 65(1) 36-47. Schmidt-Nielsen, B., Gertz, K. H. en Davis, L. E. (1968). Excretion and ultrastructure of the antennal gland of the fiddler crab Uca mordax. J Morphol 125(4) 473-96. Siriwardena, P. P. G. S. N. (2001). Sri Lanka: national review on management strategies for major diseases in shrimp aquaculture. In: Subasinghe, R., Arthur, R., Phillips, M.J., Reantaso, M. (Eds.). WB/NACA/WWF/FAO. Thematic Review on Management Strategies for Major Diseases in Shrimp Aquaculture. Proceedings of a Workshop held in Cebu, Philippines. p. 79-84. Stachowitsch, M. (1992). The Invertebrates: An Illustrated Glossary. Wiley-Liss, New-York, p. 690.

82

Stentiford, G. D., Bonami, J. R. en Alday-Sanz, V. (2009). A critical review of susceptibility of crustaceans to Taura syndrome, Yellowhead disease and White Spot Disease and implications of inclusion of these diseases in European legislation. Aquaculture 291(1–2) 1-17. Stentiford, G. D. en Lightner, D. V. (2011). Cases of White Spot Disease (WSD) in European shrimp farms. Aquaculture 319(1–2) 302-306. Stentiford, G. D., Neil, D. M., Peeler, E. J., Shields, J. D., Small, H. J., Flegel, T. W., Vlak, J. M., Jones, B., Morado, F., Moss, S., Lotz, J., Bartholomay, L., Behringer, D. C., Hauton, C. en Lightner, D. V. (2012). Disease will limit future food supply from the global crustacean fishery and aquaculture sectors. Journal of Invertebrate Pathology 110(2) 141-157. Supamattaya, K., Hoffmann, R. W., Boonyaratpalin, S. en Kanchanaphum, P. (1998). Experimental transmission of white spot syndrome virus (WSSV) from black tiger shrimp Penaeus monodon to the sand crab Portunus pelagicus, mud crab Scylla serrata and krill Acetes sp. Diseases of Aquatic Organisms 32(2) 79-86. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. en Kumar, S. (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24 1596-1599. Tang-Nelson, K. en Lightner, D. V. (2001). Development of real-time PCR assays for detection of white spot syndrome virus, yellow head virus, Taura syndrome virus, and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp. Department of Veterinary Science and Microbiology, University of Arizona, , Tucson, VSA. Tang, K. F. (2013). Novel, closely related, white spot syndrome virus (WSSV) genotypes from Madagascar, Mozambique and the Kingdom of Saudi Arabia. Diseases of aquatic organisms 106(1) 1-6. Tikær Andersen, J. en Baatrup, E. (1988). Ultrastructural localization of mercury accumulations in the gills, hepatopancreas, midgut, and antennal glands of the brown shrimp, Crangon crangon. Aquatic Toxicology 13(4) 309-324. Tsai, J. M., Wang, H. C., Leu, J. H., Wang, A. H. J., Zhuang, Y., Walker, P. J., Kou, G. H. en Lo, C. F. (2006). Identification of the nucleocapsid, tegument, and envelope proteins of the shrimp white spot syndrome virus virion. Journal of Virology 80(6) 3021-3029. Tsai, J. R. en Lin, H. C. (2014). Functional anatomy and ion regulatory mechanisms of the antennal gland in a semi-terrestrial crab, Ocypode stimpsoni. Biology Open 3(6) 409-417. Tuyen, N. X., Verreth, J., Vlak, J. M. en de Jong, M. C. M. (2014). Horizontal transmission dynamics of White spot syndrome virus by cohabitation trials in juvenile Penaeus monodon and P. vannamei. Preventive Veterinary Medicine 117(1) 286-294. Ueno, M. en Inoue, Y. (1996). The fine structure of podocytes in crayfish antennal glands. Journal of Electron Microscopy 45(5) 395-400. Ueno, M., Inoue, Y. en Niwa, N. (1997). Podocytes of the freshwater shrimp - fine structure and effect of injected trypan blue. Journal of Electron Microscopy 46(6) 485-490. UN (2013). World population projected to reach 9.6 billion by 2050 with most growth in developing regions, especially Africa. p. 4. Untergasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M. en Rozen, S. G. (2012). Primer3-New Capabilities and Interfaces. Nucleic Acids Research 40(15) e115. Van Hulten, M. en Vlak, J. (2002). Genetic evidence for a unique taxonomic position of white spot syndrome virus of shrimp: genus Whispovirus. Diseases in Asian Aquaculture 4 25-35. Vargas, R. (2001). Country Paper: Costa Rica In:APEC/FAO/NACA/SEMARNAP. Transboundary Aquatic Animal Pathogen Transfer and the Development of Harmonized Standards on Aquaculture. Report of the Joint APEC/FAO/NACA/SEMARNAP Workshop, Puerto Vallarta, Mexico p. 100-101. Venegas, C. A., Nonaka, L., Mushiake, K., Nishizawa, T. en Murog, K. (2000). Quasi-immune response of Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV). Dis Aquat Organ 42(2) 83-9. Verhaegen, Y., Monteyne, E., Neudecker, T., Tulp, I., Smagghe, G., Cooreman, K., Roose, P. en Parmentier, K. (2012). Organotins in North Sea brown shrimp (Crangon crangon L.) after implementation of the TBT ban. Chemosphere 86(10) 979-984. Vogt, G. en Quinitio, E. T. (1994). Accumulation and Excretion of Metal Granules in the Prawn, PenaeusMonodon, Exposed to Water-Borne Copper, Lead, Iron and Calcium. Aquatic Toxicology 28(3-4) 223-241. Vogt, G. (2002). Functional Anatomy. In: Biology of Freshwater Crayfish. D. M. Holdich (editor). Blackwell Science Ltd, Oxford, UK. p. 53 – 151. Walker, P. J. en Mohan, C. V. (2009). Viral disease emergence in shrimp aquaculture: origins, impact and the effectiveness of health management strategies. Reviews in Aquaculture 1(2) 125-154.

83

Wang, C., Lo, C., Leu, J., Chou, C., Yeh, P., Chou, H., Tung, M., Chang, C., Su, M. en Kou, G. (1995). Purification and genomic analysis of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) of Penaeus monodon. Diseases of Aquatic Organisms 23(3) 239-242. Wang, Y. G., Hassan, M. D., Shariff, M., Zamri, S. M. en Chen, X. (1999). Histopathology and cytopathology of white spot syndrome virus (WSSV) in cultured Penaeus monodon from peninsular Malaysia with emphasis on pathogenesis and the mechanism of white spot formation. Diseases of Aquatic Organisms 39(1) 1-11. Wheatly, M. G., Gao, Y. P. en Nade, M. (2004). Integrative aspects of renal epithelial calcium transport in crayfish: temporal and spatial regulation of PMCA. Animals and Environments 1275 96-103. White, K. N. en Walker, G. (1981). The barnacle excretory organ. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 61(02) 529-547. Wongteerasupaya, C., Vickers, J. E., Sriurairatana, S., Nash, G. L., Akarajamorn, A., Boonsaeng, V., Panyim, S., Tassanakajon, A., Withyachumnarnkul, B. en Flegel, T. W. (1995). A non-occluded, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn penaeus-monodon. Diseases of Aquatic Organisms 21 69-77. Xiaoyun, L., Wei, X. en Zhenmin, B. (2003). Histology and Functions Study of the Antennal Gland of Penaeus chinensis. Journal of Ocean University of Qingdao 33(6) 854 – 860. Xugang, H., Guangfu, H. en Guangtao, L. (2013). The effect of lower salinity on microstructure of antennary gland of Litopenaeus vannamei. Journal of Food, Agriculture & Environment 11(1) 782785. Young, J. (1959). Morphology of The White Shrimp Penaeus setiferus (Linnaeus 175). In: Fishery Bulletin 145. (editor). The Fish and Wildlife Service, United States of America. p. 173. Zhan, W.-B., Wang, Y.-H., Fryer, J. L., Yu, K.-K., Fukuda, H. en Meng, Q.-X. (1998). White Spot Syndrome Virus Infection of Cultured Shrimp in China. Journal of Aquatic Animal Health 10(4) 405-410. Zhang, J.-S., Dong, S.-L., Tian, X.-L., Dong, Y.-W., Liu, X.-Y. en Yan, D.-C. (2006). Studies on the rotifer (Brachionus urceus Linnaeus, 1758) as a vector in white spot syndrome virus (WSSV) transmission. Aquaculture 261(4) 1181-1185. Zwart, M. P., Dieu, B. T. M., Hemerik, L. en Vlak, J. M. (2010). Evolutionary Trajectory of White Spot Syndrome Virus (WSSV) Genome Shrinkage during Spread in Asia. PLOS ONE 5(10) e13400.

84

0