UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2010-2011
EMBRYOCULTUURSYSTEMEN BIJ HET PAARD Door Lynn VANDENBERGHE
Promotor: Dierenarts Hilde Nelis Medepromotor: Prof. Dr. Ann Van Soom
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
VOORWOORD
Eerst en vooral wil ik mijn dank betuigen aan mijn promotor Dr. Hilde Nelis. Zij is de belangrijkste factor geweest in het tot stand komen van deze thesis. Ondanks haar drukke schema was zij altijd beschikbaar voor vragen en het nodige duwtje in de rug. Bovendien werd deze thesis door haar steeds aan een kritische evaluatie onderworpen. Verder wil ik graag Eva Saron bedanken, voor de vele brainstormsessies, daar onze thesissen vrij gelijklopend zijn. Als laatste gaat mijn dank uit naar mijn zus Eva Vandenberghe, schoonbroer Steven Van Laecken en mijn vriend Hendrik Westbroek voor het nalezen van deze literatuurstudie en naar mijn ouders, Jim Vandenberghe en Marie-Rose Declercq om mij de kans te geven mijn kinderdroom te verwezelijken en dierenarts te worden. Mama, je was trots dat ik dit onderwerp kreeg maar je hebt de realisatie ervan niet meer mogen meemaken en ik wil je alsnog bedanken voor het doorzettingsvermogen, een eigenschap die jij hoog in het vaandel droeg.
INHOUDSOPGAVE Samenvatting ..................................................................................................................................... p.1 1. Inleiding ........................................................................................................................................ p.2 2. Literatuurstudie ........................................................................................................................... p.3 2.1. In vitro maturatie ................................................................................................................. p.3 2.1.1. Problematiek .............................................................................................................. p.3 2.1.2. Basisprincipes ............................................................................................................. p.4 2.1.3. Collectie van eicellen .................................................................................................. p.4 2.1.3.1. Methoden ter recuperatie van eicellen .............................................................. p.4 2.1.3.2. Follikelwandschraping ....................................................................................... p.6 2.1.4. Cultuur en evaluatie ................................................................................................... p.7 2.1.4.1. Voorwaarden en beoordeling van de bekomen eicellen ................................... p.7 2.1.4.2. Maturatiemedia ................................................................................................. p.9 2.1.4.3. Evaluatie van de eicelmaturatie ........................................................................ p.10 2.2. In vitro fertilisatie ................................................................................................................. p.12 2.2.1. Problematiek .............................................................................................................. p.12 2.2.2. Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) ............................................................. p.13 2.3. In vitro embryocultuur .......................................................................................................... p.15 2.3.1. Problematiek .............................................................................................................. p.15 2.3.2. Ontwikkeling in vivo ..................................................................................................... p.16 2.3.3. Cultuurmedia .............................................................................................................. p.17 2.3.4. Co-culturen .................................................................................................................. p.19 2.3.4.1. De beschikbare co-cultuursystemen ................................................................. p.19 2.3.4.2. De invloed van co-culturen op het embryo ....................................................... p.20 2.4. Fotografische weergave van in vitro productie van paardenembryo‟s ............................... p.22 2.5. Bespreking .......................................................................................................................... p.23 3. Literatuurlijst ................................................................................................................................. p.25
SAMENVATTING
In tegenstelling tot het grote succes en de uitgebreide kennis met betrekking tot in vitro reproductie bij het rund, is men wat deze technieken betreft minder snel geëvolueerd bij het paard. De in vitro productie van embryo‟s is een complexe procedure en omvat verschillende stadia. Men start met gematureerde eicellen die door middel van verscheidene in vitro en in vivo methodes kunnen worden verkregen. Bij de in vitro procedure brengt men de gerecupereerde eicellen in een aangepast cultuurmedium, al dan niet in co-cultuur, waarbij de eicellen verder delen tot ze het niveau van de e
metafase van de 2 meiotische deling met uitstoot van het eerste poollichaampje hebben bereikt. In dit stadium kunnen zij worden bevrucht via in vitro fertilisatie. De conventionele in vitro fertilisatie bleek helaas bij het paard weinig succesvol. Er werd gezocht naar alternatieven om de voornaamste struikelblokken van deze techniek, de onvoldoende capacitatie en penetratie van de zona pellucida (Dell‟Aquila et al., 1996), te vermijden. De oplossing diende zich aan onder de vorm van intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI), waarbij men de spermacel rechtstreeks injecteert in de (in vitro) gematureerde eicel. De aldus bekomen zygote zal nu moeten ontwikkelen tot blastocyst- of late morulastadium, een stadium geschikt om bij de receptormerrie te worden ingeplant. Gedurende deze fase van de in vitro embryoproductie zal het gebruikte medium van cruciaal belang zijn. Er werd geëxperimenteerd met een grote verscheidenheid aan cultuurmedia, „incubatordieren‟ (het schaap, het paard zelf en de muis) en co-culturen met somatische cellen, waarbij men zich voornamelijk gebaseerd heeft op de ervaring die men opgedaan heeft bij het rund en andere diersoorten. Na jaren van onderzoek heeft men zich een beter beeld kunnen vormen van de meest geschikte methode om in vitro embryo‟s bij het paard te kunnen produceren. Het plaatje is echter verre van compleet en verder onderzoek naar nieuwere technieken en inzichten zal nodig zijn om tot een commerciële productie van paardenembryo‟s te komen.
1. INLEIDING In vitro productie van embryo‟s wordt reeds routinematig toegepast bij de mens, het rund, het varken en verschillende laboratoriumdieren. Dankzij dit succes zijn wetenschappers en fokkers steeds meer gaan geloven in het potentieel van deze technieken ten voordele van vruchtbaarheidsproblemen en genetische vooruitgang bij het paard. Helaas is het paard geen dankbare diersoort gebleken. Een aantal redenen hiervoor zijn het beperkte aanbod van slachthuismateriaal, het beperkte succes van conventionele in vitro fertilisatie en de geringe interesse vanuit de sector. Toch kan het paard worden beschouwd als een uitstekend model om de vroege embryonale ontwikkeling en embryo-maternale interacties te bestuderen omwille van verschillende redenen: (1) paardenblastocysten kunnen vandaag de dag volledig in vitro worden geproduceerd door middel van intracytoplasmatische spermainjectie, net als humane embryo‟s, (2) de oudere merrie kan gebruikt worden als model om het reproductief verouderingsproces bij de vrouw te bestuderen (Carnevale, 2008; Altermatt et al., 2009), (3) het genoom van het paard is volledig gesequeneerd (Chowdhary and Raudsepp, 2008; Brosnahan et al., 2010), (4) het individuele paard is waardevol genoeg om in vitro productie (IVF) van embryo‟s in de praktijk toe te passen (Hinrichs, 1998).
De omstandigheden waarin in vitro maturatie van eicellen (IVM), in vitro fertilisatie (IVF of ICSI) en in vitro cultuur van embryo‟s (IVC) verlopen, zijn bij het paard nog steeds suboptimaal. De beschreven blastocystpercentages blijven in vergelijking met het rund en de mens laag: 10-30% bij het paard (Smits, 2010) versus 20-40% bij het rund (Garcia-Rosello et al., 2009). Bepaalde embryo-maternale interacties kunnen in vitro blijkbaar niet of onvoldoende doorgaan. Daarom is het absoluut noodzakelijk om in vitro de in vivo situatie zo correct mogelijk na te bootsen. Een eerste stap in deze richting is het optimaliseren van een embryo co-cultuursysteem met somatische cellen.
In deze literatuurstudie worden de in vitro maturatie, in vitro fertilisatie en cultuur van naderbij bekeken en getoetst met de beperkt beschikbare gegevens over de in vivo situatie. De gebruikte technieken worden afzonderlijk beschreven en onderling vergeleken. Ook het principe van co-culturen wordt aan een kritische blik onderworpen. Mogelijke verklaringen voor hun gunstige werking op de embryonale ontwikkeling worden aangehaald.
2
2. LITERATUURSTUDIE
2.1. IN VITRO MATURATIE
In 1983 werd de eerste muis ter wereld gebracht waarvan de eicel in vitro gematureerd en bevrucht werd (Minato and Toyoda, 1983). Bij de muis resulteerde in vitro maturatie in een betere ontwikkeling van de jonge eicel dan het geval zou zijn in vivo (in de fase voor de implantatie) (Eppig and O‟Brien, 1996). Dit veelbelovend resultaat kon echter niet worden gerealiseerd bij het paard. Desalniettemin heeft IVM bij het paard toch voor praktische toepassingen gezorgd: het verkrijgen van nakomelingen van kostbare merries na sterfte.
2.1.1. Problematiek
Een groot aantal eicellen zijn nodig om in vitro fertilisatie (IVF) te kunnen realiseren bij het paard. Bij deze diersoort kan men slechts een beperkt aantal eicellen verkrijgen uit pre-ovulatoire follikels. Om dit euvel te verhelpen is het noodzakelijk om immature eicellen te collecteren en deze in vitro verder te laten ontwikkelen (Bézard et al., 1997). In vitro maturatie bij het paard werd voor het eerst beschreven door Fulka and Okolski (1981). De resultaten van hun proefopstelling worden weergegeven in tabel 1. Omtrent IVM bij de herkauwer is er reeds zeer veel onderzoek verricht, dit in tegenstelling tot het paard. De voornaamste redenen zijn de beperkte beschikbaarheid van ovaria in slachthuizen (Tremoleda et al., 2001), de arbeidsintensiviteit en de geringe interesse vanuit de paardensector (Galli et al., 2007). Bovendien bezit de merrie slechts een klein aantal, 1 à 2, pre-ovulatoire follikels op het ovarium waardoor men niet in staat is om voldoende eicellen te collecteren. Dit is één van de redenen waarom IVF onderzoek minder snel geëvolueerd is bij het paard ten opzichte van de andere diersoorten, in het bijzonder bij het rund. Bij deze diersoort verkrijgt men een groter aantal gematureerde eicellen na superovulatie. Deze procedure is echter ook bij de merrie geprobeerd. Men is erin geslaagd superovulatie te bewerkstellingen bij het paard door middel van equine follikel stimulerend hormoon (eFSH) maar niet in voldoende mate om de oplossing te vormen voor het probleem (Squires et al., 2003, Squires and McCue, 2007). Dit resulteerde in een in vitro maturatie percentage van slechts 70% bij het paard, terwijl de resultaten bij het rund en het varken ongeveer 90% bedragen (Dell‟Aquila et al., 2001).
Tabel 1. Maturatie van equine eicellen in vitro (uit Fulka and Okolski, 1981)
3
2.1.2. Basisprincipes
Wanneer een eicel ovuleert is de oögenese niet volledig voltrokken. Het paard ovuleert eicellen die e
de metafase van de 2 meiotische deling hebben bereikt (Hafez, 1974; Palmer et al., 1987). Dit zullen we proberen nabootsen in vitro waarbij men enerzijds de nadruk legt op de nucleaire maturatie en anderzijds op cytoplasmatische maturatie (Tremoleda, 2003). Om in vitro maturatie beter te begrijpen dienen we inzicht te krijgen in de maturatie van eicellen in vivo, namelijk in de follikel (aangepast van: Tremoleda, 2003): “Het proces van oögenese begint al vanaf het embryonale leven met een aantal premeiotische en een meiotische deling. Kort na de geboorte zal de meiose starten tot het punt van de eerste meiotische deling waarna de eicel in een rustfase terecht komt (zogenaamde germinale vesikel of GV fase). Deze meiotische stop wordt geïnduceerd door de granulosacellen waarmee de eicel verbonden is via gap junctions. Tijdens de vroege ontwikkeling van de follikel zal de eicel een voorraad aan mRNA en proteïnes aanleggen: dit proces wordt prematuratie genoemd. De GV fase wordt beëindigd wanneer de follikel gestimuleerd wordt om te ovuleren door een sterke stijging van maternaal luteïniserend hormoon (LH). Gedurende de nucleaire maturatie zal de GV afbraak kennen en verder in de eerste meiotische deling evolueren waarbij een set chromosomen zal worden uitgestoten onder de vorm van het eerste poollichaampje (PB). De eicel deelt verder en blijft steken in de metafase van de 2
e
meiotische deling (MII); ovulatie kan nu plaatsvinden.”
Figuur 1: Het eerste poollichaampje van paardeneicellen in metafase II (uit Grondahl et al., 1997).
2.1.3. Collectie van eicellen
2.1.3.1. Methoden ter recuperatie van eicellen (naar Alm et al.; 1997)
-
Transvaginale follikelaspiratie in vivo of ovum pick-up (OPU: figuur 2) is een transvaginale folliculaire aspiratie van eicellen onder echografische begeleiding (Cook et al., 1993; Carnevale and Ginther, 1993). Deze techniek kan ook worden aangewend om in vivo gematureerde eicellen te recupereren (Colleoni et al., 2007).
4
-
Follikelaspiratie in vitro: na verwijderen van de tunica albuginea wordt de inhoud van follikels zichtbaar aan het oppervlak geaspireerd door middel van een 18G naald en spuit van 10 ml.
-
Via isolatie uit follikels in vitro: de ovaria worden 2 maal gespoeld met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) waarna omgevend weefsel verwijderd werd. De follikels worden vrij geprepareerd en onder microscopische controle tot barsten gebracht.
-
Afschrapen van de follikelwand in vitro: follikels zichtbaar aan het oppervlak werden ingesneden waarna de wand aan de binnenzijde met een curette werd afgeschraapt. Ook follikels dieper in het stroma worden ingesneden en afgeschraapt.
-
Combinatie van aspiratie en afschrapen van de follikelwand (Figuur 3: Smits, 2010).
Figuur 2: Transvaginale follikelaspiratie of ovum pick-up (uit Carnevale, 2007).
Alm et al. (1997) bestudeerden welke van deze 4 methodes de meeste eicellen oplevert. De resultaten van de studie zijn weergegeven in tabel 2.
Tabel 2: Recuperatie van paardeneicellen door middel van verschillende methoden (uit Alm et al., 1997).
5
Uit deze studie blijkt dat zowel follikelisolatie als follikelschraping betere resultaten opleveren dan aspiratie in vivo en in vitro. De reden hiervoor is dat de cumulus oöphorus vrij sterk aan de wand van de follikel bevestigd is (Hawley et al., 1995). Follikelisolatie en -schraping genereren wel het hoogst aantal eicellen maar deze procedure is ook het meest arbeidsintensief. Dit is echter verantwoord aangezien de beperkte beschikbaarheid van paardeneicellen aldus Alm et al. (1997). Daarnaast heeft men ook de morfologie van de bekomen eicellen bestudeerd. Uit de resultaten blijkt dat schraping van de follikels het grootst aantal cumulus intacte eicellen oplevert (Alm et al. 1997).
A
B
C
Figuur 3: Recuperatie van paardeneicellen (uit Smits, 2010): A. Folliculair vocht wordt geaspireerd uit oppervlakkig gelegen follikels. B. De follikelwand wordt geschraapt. C. Het ovarium wordt geopend om dieper gelegen follikels te bereiken.
2.1.3.1. Follikelwandschraping
Techniek beschreven door Hinrichs (2007b): “Een ovarium afkomstig van een slachthuispreparaat wordt vrij gedissecteerd tot de follikels op het oppervlak herkenbaar worden. Een follikel wordt volledig geopend met behulp van een scalpelmesje, waarna de granulosalaag door middel van een botcurette van 0,5 cm wordt afgeschraapt. Het verkregen weefsel wordt van de curette gewassen en in een petrischaal geplaatst waarin zich een specifiek medium bevindt.” Dit medium bevat: Hepes gebufferd TCM199 met Hanks zouten en ticarcilline. Een fosfaat gebufferde zoutoplossing is volgens de auteur ook mogelijk, maar zou pH veranderingen teweeg kunnen brengen. In deze proefopstelling worden niet enkel de grote follikels benut maar ook de kleinere die volgens de auteur (Hinrichs and Smith, 2000) ook nog voldoende potentieel bezitten. Vervolgens beoordeelt men de eicellen op basis van de cumulusmorfologie waarna men de eicel isoleert uit de granulosacellen en deze overbrengt in een nieuwe petrischaal die hetzelfde medium bevat als voorheen. Eicellen kunnen tot 4u verblijven in dit medium zonder hiervan schade te ondervinden (Love et al., 2002).
6
2.1.4. Cultuur en evaluatie
2.1.4.1. Voorwaarden en beoordeling van de bekomen eicellen
Men verkrijgt betere maturatieresultaten indien: -
De eicel wordt gecollecteerd tijdens de folliculaire fase (Goudet et al., 1998).
-
Geëxpandeerde eicellen
bereiken de metafase II eerder
dan compacte cumulus
eicelcomplexen (Hinrichs et al., 1993; Hinrichs and Williams, 1997). -
De gap junctions tussen de eicellen en de granulosacellen intact zijn. De granusolacellen nemen essentiële metabolieten op die via de gap junctions worden doorgegeven aan de eicel. Deze metabolieten zijn van belang voor de ontwikkeling van de eicel (Eppig, 1979). Dit is echter van beperkt praktisch belang aangezien het enkel op te merken valt via elektronenmicroscopie.
-
De tijdspanne tussen de dood van de merrie en de collectie van de eicel minimaal is. De meer fragiele compacte cumuluscomplexen degenereren snel (Hinrichs, 2010a). Bewaring van ovaria langer dan 7 uur na recuperatie in het slachthuis zou de ontwikkelingscompetentie van de eicellen in sterke mate negatief beïnvloeden (Ribeiro et al., 2008).
-
Ook de grootte van de gebruikte follikels zou een rol spelen. Hinrichs and Schmidt (2000) stelden de grens op > 20 mm, waarbij zij suggereerden dat met toenemende follikelgrootte de maturatiecapaciteit van de eicellen beter wordt.
De eicellen die men verkregen heeft uit de ovaria kan men indelen volgens een classificatiesysteem dat werd opgesteld door Leibfried and First (1979) en Hinrichs (1991):
-
Klasse 1: de compacte cumulus: een compacte laag cellen omgeeft de eicel volledig (figuur 4).
-
Klasse 2: de partiële cumulus: een compacte laag cellen omgeeft de eicel slechts deels.
-
Klasse 3: corona radiata: enkel de corona radiata omgeeft de eicel.
-
Klasse 4: naakte eicel: hier is zelfs geen corona radiata meer aanwezig.
-
Klasse 5: deels geëxpandeerd.
-
Klasse 6: volledig geëxpandeerd: van zowel de cumulus als de granulosacellen (figuur 4).
-
Klasse 7: gedegenereerd.
Deze classificatie is van groot belang aangezien deze klassen niet dezelfde omstandigheden voor optimale maturatie vereisen. Bij het paard zijn zowel geëxpandeerde eicellen als compacte eicellen, indien deze afkomstig zijn uit follikels > 20 mm diameter, van nut (Hinrichs, 2007b). Klasse 4 en 7 worden niet benut voor maturatie. Ook de toestand van het cytoplasma staat in relatie tot de
7
maturatiecapaciteit van de eicel: eicellen met een gefragmenteerd of heterogeen cytoplasma worden beter niet gebruikt voor IVM (Tabel 3: Del Campo et al., 1995).
De eicel zelf heeft een eerder onregelmatige vorm als gevolg van een schijnbaar willekeurige verdeling van donkere granules in het cytoplasma. Bij het paard duidt dit op eicel die voldoende in staat is om de meiotische deling te hervatten (Hinrichs and Williams, 1997).
Figuur 4: A. Geëxpandeerd cumulus-eicel-complex (COC); B. Compact COC (vergroting: 100X) (uit Smits, 2010).
Tabel 3: De relatie tussen de morfologie van de cumulus en het cytoplasma van de eicel en de maturatiecapaciteit in vitro (uit Del Campo et al., 1995).
8
2.1.4.2. Maturatiemedia
-
Synthetisch oviductvocht met groeifactoren, steroidhormonen en luteïniserende hormonen (Maclellan et al., 2001).
-
M199 met Hanks zouten, 25mM Hepes, 5µU/ml FSH, 10% foetaal kalfserum en 25 µg/ml gentamycine. Geen CO2 incubatie, wel O2 + CO2 + N2 (Love et al., 2003).
-
M199 met Earles zouten, 5 µU/ml FSH, 10% foetaal kalfserum en 25 µg/ml gentamycine + 5% CO2 incubatie gecombineerd met een buffer teneinde een pH van 7,4 te behouden (Hinrichs, 2007a).
-
Tissue culture medium 199 (TCM199) met 20% hitte behandeld paardenserum, 100IU 6
penicilline/ml, 100µg streptomycine/ml en granulosacellen van de merrie (2 – 5x10 /ml) (Alm and Torner, 1994). -
Dulbecco‟s modified Eagle‟s medium/nutrient mixture F12 (DMEM/F12): Lange tijd was TCM199 het meest gebruikte medium voor eicelmaturatie, voornamelijk door het grote succes bij het rund. In 2005 echter werd het gebruik van DMEM/F12 onderzocht. Dit medium bleek superieur aan TCM199 (Tabel 4; Galli et al., 2007).
Tabel 4: De invloed van maturatiemedia op maturatie, delingspercentage en embryonale ontwikkeling na ICSI (uit Galli et al., 2007).
Door toevoeging van het groeihormoon (GH) en insulin-like growth factor (IGF-1) aan het maturatiemedium wordt een gunstig effect op de nucleaire maturatie bekomen (Goudet et al., 2000; Carneiro et al., 2001) als ook, voor IGF-1 in het bijzonder, op de cytoplasmatische maturatie (Tremoleda, 2003).
Ook het gebruik van co-culturen op basis van foetale fibroblastcellen en oviduct epitheelcellen blijken een meerwaarde te bieden ten opzichte van “gewone” cultuurmedia. Dit komt vooral tot uiting wanneer de in vitro gematureerd eicel door middel van intracytoplasmatische sperma-injectie wordt bevrucht. Er zullen meer zygoten ontwikkelen tot het blastocyststadium wanneer men gebruik maakt van foetale fibroblastcellen en oviduct epitheelcellen in vergelijking met een gewoon medium zoals TCM199 (Tabel 5) (Li et al., 2001). Thecacellen daarentegen bieden geen meerwaarde, aldus Choi et al. (2002).
9
Tabel 5: Invloed van co-cultuursystemen op in vitro maturatie en embryonale ontwikkeling na in vitro fertilisatie.
Type co-cultuur
Controlemedium
Criterium maturatie
- Thecacellen
M199
Nucleaire cytoplasmatische maturatie
- Foetale fibroblast cellen
TCM199
Nucleaire maturatie
- Oviduct TCM199 epitheliale cellen (UTEC)
Resultaten controle
Resultaten co-cultuur
Bron
en 25%
30%
Choi et al., 2002
49%
51%
Delingspercentage na 63% ICSI
57%
Li et al., 2001
Blastocystvorming
0%
17%
Nucleaire maturatie
49%
53%
Delingspercentage na 63% ICSI
65%
Blastocystvorming
30%
0%
Li et al., 2001
2.1.4.3. Evaluatie van de eicelmaturatie
Na maturatie van gemiddeld 36 tot 48u (Hinrichs et al., 1993; Alm and Torner, 1994; Tabel 6: Del Campo et al., 1995) wordt de eicel beoordeeld. Dit gebeurt op basis van de uitstoot van het eerste e
poollichaampje (metafase van 2 meiotische deling, figuur 5), een intacte eicelmembraan en een cytoplasma met donkere en lichtere zones met een duidelijk zichtbare cytoplasmatische membraan (Hinrichs, 2007b).
Figuur 5: Gematureerde eicel met poollichaampje (pijl; vergroting 300X) (uit Smits, 2010).
10
Tabel 6: De cultuurtijd in functie van de ontwikkeling van paardeneicellen in vitro (uit Del Campo et al., 1995).
Recent wordt ook in de humane geneeskunde in vitro maturatie van eicellen toegepast. Zo werd in november 2010 de eerste IVM baby geboren.
11
2.2. IN VITRO FERTILISATIE (IVF)
2.2.1. Problematiek
In vitro fertilisatie is een techniek die reeds succesvol toegepast werd bij verschillende diersoorten en zelfs routinematig bij de mens. Het paard vormt hier echter de uitzondering op. Bij deze diersoort slaagt men er niet in om deze techniek op grote schaal toe te passen, zeker niet indien men gebruik maakt van in vitro gematureerde eicellen. In vitro fertilisatie blijft echter van belang aangezien het een oplossing biedt voor merries die zelf niet in staat zijn een embryo voort te brengen, voor hengsten met een laag aantal spermacellen en een slechte spermakwaliteit. Bovendien is de techniek veel minder arbeidsintensief en duur dan intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). Ook kent IVF zijn nut als evaluatietest voor diepgevroren sperma (Squires et al., 2003). De procedure van conventionele IVF omvat een aantal stappen: in vivo of in vitro maturatie van de eicel, capacitatie van het sperma, de fertilisatie, de embryocultuur en –transfer (Bezard et al., 1992).
De onvoldoende capacitatie van de spermacellen en de afwijkende verharde zona pellucida vormen bij het paard de voornaamste struikelblokken (Blue et al., 1989; Zhang et al., 1989; Dell‟Aquila et al., 1996; Squires et al., 2003). Men heeft getracht voor deze problemen passende oplossingen te bedenken:
-
Aanvankelijk had men het vermoeden dat verharden van de zona pellucida (“zona hardening”) een negatieve invloed had op het slaagpercentage na IVF. Dell‟Aquila et al. (1999) en Hinrichs et al. (2002) zijn erin geslaagd deze hypothese te verwerpen.
-
Gebruik van calcium ionofoor A 23187 bij vers sperma en heparine bij diepvriessperma resulteren in hogere penetratie- en fertilisatiepercentages bij in vitro gematureerde eicellen (Grondahl et al., 1995; Li et al., 1995; Alm et al., 2001). Ook het effect van zona pellucidaproteïnen, caffeïne en lysofosfolipiden
werd
onderzocht.
Deze
moleculen
ondersteunen
de
capacitatie
en
acrosoomreactie maar geven geen aanleiding tot betere spermapenetratie van de eicel (Graham, 1996). -
McPartlin et al. (2009) opperde dat een behandeling van de spermacellen met procaïne een hyperactivatie teweeg zou kunnen brengen maar een hoger ontwikkelingscijfer werd nog niet aangetoond.
-
“Drilling” en partieel verwijderen van de zona pellucida of cumuluscellen behoren tot de mogelijkheden om de techniek van IVF te optimaliseren (Choi et al., 1994; Li et al., 1995; Dell‟Aquila et al., 1996).
Conventionele IVF bij het paard heeft dan ook aanleiding gegeven tot slechts 2 veulens (Palmer et al., 1991; Bézard et al., 1992). Bovendien waren de eicellen in vivo gematureerd. In 1988 vond men een manier om deze hindernissen te ontwijken (Hosoi et al., 1988). Het betrof een methode waarbij men één enkele spermatozoön rechtstreeks injecteert in het cytoplasma van een
12
gematureerde eicel (ICSI). Men omzeilt op deze manier het hele proces van capacitatie, binding en penetratie van de zona pellucida (Dell‟Aquila et al., 1996). ICSI geeft dan ook aanleiding tot hogere delingspercentages: 40 - 52% ten opzichte van 5% voor conventionele IVF (Grondahl et al., 1997; Smits et al., 2010).
2.2.2. Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI)
Intracytoplasmatische sperma-injectie vereist een gematureerde eicel in metafase II en vers of diepvriessperma. De eicel kan gematureerd worden in het laboratorium (in vitro) of worden verkregen uit een pre-ovulatoire follikel door middel van ovum pick-up (OPU) na stimulatie met gonadotrofine releasing hormoon (GnRH) in vivo (Hinrichs, 2005). Men zorgt ervoor dat de spermamembraan van de te injecteren spermacel verbroken wordt om de vrijstelling van factoren essentiëel voor de activatie van de eicel te garanderen (Chung et al., 2000). Dit realiseert men door de staart van de spermacel tegen de bodem van het petrischaaltje te drukken, waardoor de spermacel geïmmobiliseerd en de spermamembraan beschadigd wordt (Dozortsev et al., 1995; Choi et al., 2002). Er is een vermoeden dat de Ca
2+
geïnduceerde pathway volgend op fertilisatie met spermacellen, nodig voor de activatie
van eicellen, onvoldoende doorgaat. Dit zou een mogelijke verklaring zijn voor de lage slaagpercentages van ICSI (Bedford et al., 2003). De nood aan extra chemische activatie van de eicel na het gebruik van vers sperma bij ICSI kan door dit mechanisme worden verklaard. In theorie zou diepvriessperma op dit vlak een groot voordeel kennen: de nodige activatiefactoren worden namelijk sneller vrijgesteld (Choi et al., 2002). Dit verschil lijkt in de praktijk echter van ondergeschikt belang: Choi et al. (2002) toonde aan dat het gebruik van diepvries, dan wel vers sperma geen significant verschil oplevert met betrekking tot de ontwikkelingscompetentie na ICSI.
Figuur 6: Sweet Pea: één van de eerste ICSI veulens uit een in vitro gematureerde eicel afkomstig van een drachtige merrie (uit Cochran et al., 1998). Het allereerste veulen uit een in vitro gematureerde eicel zag reeds 2 jaar eerder het levenslicht en was afkomstig van slachthuisovaria (Squires et al.,1996).
13
Figuur 7: In België kwam het eerste ICSI veulen, SMICSI, pas ettelijke jaren later ter wereld. Deze bijzondere gebeurtenis vond plaats op 27 oktober 2009 aan de universitaire dierenkliniek te Merelbeke (uit Smits et al., 2010).
Deze innovatieve IVF-techniek bleek daarenboven ook voor hengsten met slechte spermakwaliteit een uitkomst te bieden (Lazzari et al.,2002; Choi et al., 2006). Uiteindelijk bereikt de gecreëerde eicel het morula –of vroege blastocyst stadium alvorens transcervicaal te worden ingeplant in een gesynchroniseerde receptormerrie (figuur 6 en 7).
Ook ICSI leek in het verleden moeilijkheden op te leveren, tot men in 2002 het Piezo trilsysteem introduceerde (Piezo-geassisteerde ICSI: Choi et al., 2002). Dit systeem veroorzaakt vibraties in de injectiepipet waardoor de zona pellucida beter gepenetreerd kan worden en de plasmamembraan van zowel spermacel als eicel verbroken wordt (Hinrichs, 2005). Het Piezo trilsysteem heeft aldus geleid tot betere delings - en ontwikkelingscijfers (delingspercentages van meer dan 75%: Smits, 2010 en ontwikkelingscijfers tot 38%: Yanagida et al., 1998; Choi et al., 2002; Hinrichs et al., 2005; Galli et al., 2007, Smits et al., 2010). Men vermoedt dat bij conventionele ICSI-procedures, waarbij men geen gebruik maakt van het Piezo systeem, de door de injectiepipet veroorzaakte schade aan de zona pellucida te groot is (Ergenc and Olgac, 2007). Het Piezo systeem bestaat echter uit kwik, een zeer toxisch materiaal. In 2007 introduceerden Ergenc and Olgac omwille van deze reden een nieuw kwikvrij injectiesysteem genaamd de “rotationally oscillating drill” (Ros-Drill©). Hoewel ICSI een hele stap voorwaarts is in de in vitro productie van paardenembryo‟s, blijft het een zeer dure en arbeidsintensieve techniek met een relatief laag blastocystpercentage (figuur 8 en 9). Zo kost een ICSI -sessie met eicellen uit slachthuisovaria ongeveer 350 euro, exclusief arbeidsuren. Er zijn wereldwijd slechts 2 laboratoria die ICSI commercieel toepassen: Texas A&M University (K. Hinrichs) en Avantea, Italië (C. Galli).
14
Het eerste poollichaampje.
Figuur 9: De ICSI-microscoop (Reproductive Biology Unit, Faculteit
Figuur 8: ICSI: vergroting: 300X (uit Smits, 2010)
diergeneeskunde, Universiteit Gent).
2.3. IN VITRO EMBRYOCULTUUR (IVC)
2.3.1. Problematiek
Het onderzoek naar geschikte embryocultuursystemen voor paarden heeft zijn moeilijkheden gekend. Een beperkende factor in deze studies is de gelimiteerde beschikbaarheid van paardenembryo‟s (Choi et al., 2002). Het belang van ICSI en IVF in de praktijk is dus afhankelijk van de mate waarin men erin slaagt om goede bevruchtingsresultaten te realiseren enerzijds in vivo en anderzijds na deling in een geschikt cultuurmedium. Vooral dit laatste is van praktisch belang, aangezien er nood is aan cultuursystemen die in staat zijn het embryo te laten ontwikkelen tot een stadium dat geschikt is om intra-uterien te worden ingeplant: het blastocyst- of late morulastadium (Tremoleda, 2003; Smits et al., 2010). Intracytoplasmatische sperma-injectie heeft in het kader van deze problematiek zijn nut bewezen als beoordelingssysteem voor de kwaliteit van in vitro gematureerde eicellen (Squires et al., 2003). Tot nu toe is het percentage embryo‟s dat het blastocyststadium bereikt na IVC vrij laag (<10%: Choi et al., 2004). Bijkomend leiden in vitro ontwikkelde blastocysten vaak enkel tot een „trofoblast‟-dracht, dit betekent dat de blastocyst enkel uitgroeit tot een trofoblast maar dat dit het eindpunt vormt in zijn evolutie. Hinrichs et al. (2007) vermoeden dat abnormaliteiten in de embryonale pool in de ontwikkelende blastocyst aan de basis liggen van dit probleem. In vitro geproduceerde embryo‟s hebben sowieso de tendens om te verschillen van hun in vivo tegenhangers. Tremoleda et al., 2003 toonde een aantal van deze cruciale verschillen aan:
15
“De in vitro embryo‟s bezitten een lager celaantal, gewijzigde inwendige celmassa:trophectoderm ratio, onregelmatige grootte van de blastomeren en een toegenomen incidentie van cytoplasmatische fragmentatie.
Van
deze
factoren
is
bekend
dat
zij
aanleiding
geven
tot
verminderde
ontwikkelingscompetentie. Daarenboven wordt er vaker apoptose waargenomen en ook de kapselvorming, een uniek en noodzakelijk kenmerk bij het paard, is afwijkend.” Bovendien verschilt de genexpressie bij in vitro ten opzichte van in vivo geproduceerde embryo‟s (Smits et al., 2011).
Figuur 10: Illustratie van het kapsel van 2 paardenblastocysten (uit Smits, 2010).
Slechts enkele geboorten van veulens zijn gerapporteerd na toepassing van ICSI gevolgd door in vitro cultuur van paardenblastocysten (Li et al., 2001; Galli et al., 2007; Hinrichs et al., 2007; Smits et al., 2010).
2.3.2. Ontwikkeling in vivo
-
Merrie: Wanneer men een na ICSI verkregen zygote rechtstreeks inplant in het oviduct van een merrie (in vivo) dan zal de ontwikkeling van de zygote superieur zijn ten opzichte van de ontwikkeling van een zygote in een cultuurmedium in vitro. Zowel in vivo als in vitro vindt men delingspercentages van 85% resp. 80% maar het nucleusaantal (blastomeren) ligt 2 maal hoger na in vivo cultuur. Ook het aantal embryo‟s dat zich ontwikkelt tot blastocyst ligt significant hoger (Choi et al., 2004).
-
Schaap: Transfer van de paardenzygote naar het schapenoviduct in vivo is zeer succesvol gebleken. Ook hier ligt het ontwikkelingspercentage hoger dan in vitro (45%: Allen and Pashen, 1984; Pashen et al.,1987; Tabel 7: Galli and Lazzari, 2001; Galli et al., 2002).
-
Muis: Men heeft verschillende pogingen ondernomen om een paardenzygote over te brengen in het oviduct van muizen. Helaas zonder veel succes, er werd hoogstens een 2-cellig stadium bereikt (Grondahl et al., 1997).
16
Tabel 7: Het effect van in vitro of in vivo schaapoviductcultuur op embryonale ontwikkeling (uit Galli and Lazzari, 2001)
Besluit: Aangezien deze methodes chirurgie vereisen, ethisch omstreden, duur en arbeidsintensief zijn en hun commercieel gebruik verboden is in verschillende Europese landen, is er nood aan alternatieve systemen (Tremoleda, 2003).
2.3.3. Cultuurmedia
Naar analogie met het rund werden verscheidene cultuurmedia in de literatuur beschreven. Dat paardenembryo‟s andere behoeften hebben in vitro, hoeft niet te verbazen. In tabel 8 wordt een overzicht gegeven van de verschillende media en hun respectievelijke ontwikkelingspercentages.
-
G1.2 Medium met incubatie in 38,2° met 5%CO 2. G1.2 is een medium met een gehalte laag aan glucose en gebaseerd op synthetisch oviduct vocht. Na gebruik van G1.2 wordt het embryo overgeplaatst in een medium rijker aan glucose (G2.2) op dag 3 of 4. Deze procedure is succesvol gebleken bij zowel de mens als het rund, waarbij blastocystpercentages werden bereikt vergelijkbaar met de resultaten in vivo (Choi et al., 2002). Onderzoek naar dit type medium en de invloed van glucose op het vroege embryo werden in 1995 door Azuma et al., in 2000 door Li et al. en in 2002 door Choi et al. uitgevoerd. Na een cultuur van 7 dagen met G1.2/2.2 ontwikkelden 9% van de zygotes in blastocysten (Choi et al., 2004). In vitro cultuur van paardenembryo‟s met G1.2 medium resulteert in een vergelijkbaar delingspercentage maar een kleiner aantal cellen ten opzichte van in vivo cultuur in het oviduct (Choi et al., 2002). Gebruik van gemodifieerd Chatot, Ziomek, Bavister medium (CZB) leverde gelijkaardige resultaten op (Choi et al., 2004). Een laag glucosegehalte voor 1 tot 4 dagen gevolgd door een hoger glucoseniveau in het medium zou de ontwikkeling tot het morulastadium op dag 8 bevorderen (Azuma et al., 1995). Tegenstrijdige gegevens hieromtrent zijn echter aanwezig en verder onderzoek is nodig (Choi et al., 2004). DMEM/F-12 wordt verondersteld superieur te zijn aan het G medium aldus Hinrichs et al. (2007).
17
-
SOF: synthetisch oviduct vocht: een verhoogd ontwikkelingspercentage werd gerapporteerd door Galli et al. (2002) ten opzichte van andere cultuurmedia. Helaas bleek uit later onderzoek dat dit percentage overschat was (Choi et al., 2004) en dat weefselcultuurmedium (TCM)199 beter geschikt was om embryonale ontwikkeling te ondersteunen (Rosati et al., 2002).
-
Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM) /F-12: dit cultuurmedium bleek echt een meerwaarde te bieden wanneer vergeleken met de reeds onderzochte media. Men kon hieruit besluiten dat het paardenembryo compleet andere behoeften heeft dan het runder- of humane embryo (Choi et al., 2004) aangezien dit medium een concentratie aan glucose bevat (17mM) dewelke nefast is gebleken voor de ontwikkeling van embryo‟s van andere diersoorten (Hinrichs et al., 2007). Hinrichs (2005) slaagde erin om het ontwikkelingspercentage op te drijven tot 35% door gebruik te maken van het Dulbecco's modified Eagle's celcultuurmedium (DMEM/F-12) in een “mixed-gas” omgeving.
Besluit: Hoewel het DMEM/F-12 medium een vooruitgang betekent voor de in vitro cultuur van paardenzygoten, blijft het blastocystpercentage eerder aan de lage kant (gemiddeld 15%; Tremoleda et al., 2003) en zijn er fundamentele verschillen tussen in vitro en in vivo geproduceerde embryo‟s.
Tabel 8: Percentage blastocysten na ontwikkeling met verschillende cultuurmedia.
Oorsprong
Cultuur medium
Omstandigheden
Percentage blastocysten
Referentie
ICSI
G1.2/2.2
38,2°C met 5% CO2
9%
ICSI
CZB
38,2°C met 5% CO2
0%
ICSI
DMEM/F12
38,2°C met 5% CO2
15%
DMEM/F12
Mixed gas: 38.2°C met 35% 5% CO2, 5% O2, en 90% N2
Choi et al., 2002 Choi et al., 2004 Choi et al., 2004 Hinrichs, 2005
SOF
/
Embryo
ICSI
10%
39°C met 5% CO2, 5% O2 0% en 90% N2 38.58°C met 5% CO2, 5% 6,30% O2, and 90% N2.
18
Galli et al., 2002 Rosati et al., 2002 Tremoleda al., 2003
et
2.3.4. Co-culturen
2.3.4.1 De beschikbare co-cultuursystemen
In een poging om de in vivo situatie zoveel mogelijk na te bootsen werden er tal van embryo cocultuursystemen met somatische cellen uitgetest. In tabel 9 wordt een overzicht gegeven van de besproken co-cultuursystemen en hun respectievelijke ontwikkelingspercentages. Co-culturen worden in verschillende onderzoeken als superieur beschouwd ten opzichte van de “gewone” media wat betreft blastocystvorming. Het tot stand komen van dergelijke co-culturen werd dan ook bij tal van diersoorten beschreven.
-
Uit een studie van Dell‟Aquila et al. (1997) blijkt dat follikelvocht (uit pre-ovulatoire follikels) als additief in het cultuurmedium bij in vitro maturatie van eicellen een gunstige invloed heeft op de bevruchtings- en ontwikkelingspercentages na ICSI. Hierbij werden Vero cel monolagen (cellijn afkomstig van de epitheliale cellen van de nieren van de groene meerkat (Cercopithecus aethiops)) benut in Ménézo B2 medium gesupplementeerd met 15% foetaal runderserum. Het waren Bézard et al. die in 1989 als eerste de gunstige invloed van dit milieu op de ontwikkeling van 1 tot 2 cellige embryo‟s aantoonden. Toevoegen van folliculair vocht zou de maturatie van eicellen in positieve zin kunnen beïnvloeden indien deze worden bevrucht via ICSI. Via IVF echter biedt folliculair vocht geen meerwaarde voor een vlotte sperma-eicel interactie. Door de auteur kon de meerwaarde van de Vero cellijn worden aangetoond met betrekking tot het delingspercentage ten opzichte van granulosacel monolagen en oviduct epitheliale cellen. Resultaten over de verdere in vitro ontwikkeling van het embryo zijn echter onbekend (Guignot et al., 1998). Bij het rund is deze cellijn effectief gebleken in de cultuur van embryo‟s (Menck et al., 1996).
-
Ook de positieve invloed van granulosacellen als co-cultuursysteem op embryonale ontwikkeling werd aangetoond (Rosati et al., 2002).
-
Oviduct epitheliale cellen (UTEC) hebben niet alleen hun nut bewezen met betrekking tot de in vitro maturatie van paardeneicellen an sich maar ook hun positief effect in de latere ontwikkeling tot blastocyst. Een gelijkaardig effect is aangetoond voor de foetale fibroblastcellen (Li et al., 2001). Een studie van oudere datum heeft gebruik gemaakt van in vivo gefertiliseerde eicellen in het één of 2-cellig stadium en hun ontwikkeling geobserveerd tot blastocyst na cultuur met of zonder UTEC (Ball et al., 1993). Een gelijkaardig onderzoek werd een jaar eerder uitgevoerd waarbij men als startstadium 4 tot 8-cellig paardenembryo‟s cultiveerde. Vanuit dit stadium is men erin geslaagd
een
normale
dracht
te
bewerkstelligen
(Ball
and
Miller,
1992).
Het
ontwikkelingspercentage vanuit het 4 tot 8-cellig stadium bleek succesvoller dan vanuit het 1 tot 2cellig stadium (Ball et al., 1993).
19
-
Trofoblastvesikels zijn in staat de ontwikkeling van een 4 tot 8-cellig embryo te ondersteunen tot het morulastadium. Deze co-cultuur zou, net als UTEC en uterien weefsel (Weber et al., 1993), superieur zijn aan cultuur van equine embryo‟s met een gewoon medium (Ball et al., 1990). UTEC heeft wel een grotere waarde als co-cultuur dan trofoblastvesikels (Weber et al., 1993).
Tabel 9: Percentage blastocysten na ontwikkeling met verschillende co-cultuursystemen.
Co-cultuur: Cellen Verocellen
Co-cultuur: Percentage blastocysten Medium Ménézo B2 + 15% foetaal 16,70% runderserum
Referentie
TCM199
Guignot et al., 1998
8,30%
Granulosacellen
TCM199 + 10% runderserum
foetaal 11,10%
Oviduct epitheliale cellen
Ham‟s F-12 en DMEM
Dell‟Aquila et al., 1997
Rosati et al., 2002
35%
Ball et al., 1993
42,90%
Ball et al., 1990
66%
Freeman et al., 1991
DMEM/F12
16%
Choi et al., 2004
TCM 199
/*
Li et al., 2001
Trofoblastvesikels Ham‟s F-12 en DMEM
0%
Ball et al., 1990
Cumuluscellen DMEM * Ontwikkeling werd enkel geregistreerd tot 2-cellig stadium
0%
Li et al., 2001
Foetale fibroblastcellen
Bovenstaande tabel weerspiegelt de resultaten die men in verschillende onderzoeken heeft verkregen. Deze onderzoeken verschillen op vlak van omstandigheden, techniek en cultuurmedium. Bovendien werken sommige onderzoekers met in vitro gematureerde eicellen (al dan niet met co-cultuur: Li et al., 2001) waarna ICSI volgt, terwijl anderen zich baseren op de ontwikkeling van in vivo gematureerde eicellen in verschillende stadia van ontwikkeling. Dit impliceert dat men niet in staat is de percentages van de verschillende co-cultuurmedia onderling te vergelijken. Een gelijkaardige bedenking kan men maken met betrekking tot tabel 8. Het zou interessant zijn om de verschillende beschikbare media onderling te toetsen onder gestandaardiseerde omstandigheden.
2.3.4.2. De invloed van co-culturen op het embryo
Reeds in 1989 werd verondersteld dat de aanwezigheid van het epitheel van het oviduct een groeibevorderende werking heeft op het embryo (Bavister, 1988; Gandolfi et al., 1989). Het zou een oplossing vormen voor de zogenaamde “developmental block” waarmee de in vitro ontwikkeling van
20
embryo‟s gepaard gaat. Het paard is een typische diersoort bij wie dit nog steeds een fundamenteel probleem vormt voor de in vitro productie van embryo‟s. De meerwaarde van co-culturen zou op verschillende niveaus liggen (Kane et al., 1992; Nancarrow and Hill, 1994; Joo et al., 2001).:
-
De productie van mitogene factoren door de co-cultuurcellen: een niet celspecifiek effect. Het betreft groeifactoren, specifieke proteïnes en polyamines: zogenaamde „positieve conditionering‟ (Orsi and Reischl, 2007).
-
Ondersteuning van de embryonale ontwikkeling: dit zou vooral het geval zijn voor oviduct epitheliale cellen.
-
Capteren van schadelijke stoffen in het medium en moduleren van de fysicochemische eigenschappen van het medium: bescherming tegen superoxide radicalen dewelke aanleiding geven tot embryonale degeneratie, productie van taurine (een antioxidant) en verwijderen van hypoxanthine (Bavister, 1992). Dit valt onder de noemer „negatieve conditionering‟ (Orsi and Reischl, 2007).
Een alternatief voor co-cultuursystemen is het gebruik van een geconditioneerd medium. Dit medium wordt vooraf aan somatische cellen (granulosacellen of oviductcellen) blootgesteld en bevat aldus factoren die door de helpercellen werden vrijgesteld. Dit protocol is gebaseerd op het principe dat de diffusie van gunstige factoren belangrijker is dan het celcontact voor de cultuur van embryo‟s. Men vermoedt echter dat de communicatie tussen embryo en maternaal geslachtsstelsel belangrijk blijft (Orsi and Reischl, 2007).
Besluit: Alhoewel algemeen wordt aangenomen dat co-culturen een meerwaarde vormen voor in vitro embryoproductie, is het belangrijk om kritisch te blijven. Bavister (1992) publiceerde toch enkele bedenkingen met betrekking tot de embryotrofische en zuiverende eigenschappen van “helper”-cellen. Hij geeft aan dat de voordelige kenmerken van co-culturen naar de achtergrond verdwijnen indien men meer rigoureus te werk gaat bij het klaarmaken en gebruik van een “gewoon” cultuurmedium.
21
2.4. FOTOGRAFISCHE WEERGAVE VAN IN VITRO PRODUCTIE VAN PAARDENEMBRYO‟S
Onderstaande figuren vormen een overzicht van de verschillende stadia in het productieproces van paardenembryo‟s (naar Smits, 2010).
A
B
C
D
E
F
G
H
A: Een geëxpandeerd cumulus eicel-complex
D-E: Het delende embryo
B: De paardeneicel na in vitro maturatie
F: De blastocyst
C: ICSI
G-H: De uitkippende blastocyst
22
2.5. BESPREKING
Dat in vitro reproductie bij het paard geen eenvoudig vraagstuk is, is reeds vele jaren bekend. Velen hebben geprobeerd maar slechts weinigen zijn erin geslaagd om de geboorte van een levend veulen te realiseren na in vitro maturatie van een eicel, in vitro fertilisatie en in vitro embryocultuur (Li et al., 2001; Hinrichs, 2005; Galli et al., 2007). Dit uit zich dan ook in slechts een beperkt aantal artikelen die de volledige procedure duidelijk en ondubbelzinnig beschrijven. In tegenstelling tot het rund, waar men deze technieken reeds op grote schaal toepast, is het onderzoek bij het paard achterop geraakt. Zowel technische factoren, zoals de beperkte beschikbaarheid van slachthuisovaria, als diersoortspecifieke eigenschappen liggen aan de basis van de problematiek met betrekking tot in vitro reproductie bij het paard. Hoewel intracytoplasmatische sperma-injectie een hele stap voorwaarts betekend heeft, mag het duidelijk wezen dat nog veel bergen zullen moeten worden verzet om het niveau van kennis en techniek te bereiken zoals bij het rund en de mens.
Bovendien bestaat er geen eenduidigheid over het gebruik van media en de omstandigheden waarin een in vitro embryocultuur of in vitro eicelmaturatie zou moeten verlopen. Verschillende auteurs publiceren hierover data in uiteenlopende omstandigheden waardoor vergelijken en interpreteren zeer moeilijk wordt. Wanneer men de waaier aan cultuurmedia en co-culturen op een rijtje zet (tabel p. 10, tabel p. 18 en tabel p. 20) is het onmogelijk om tot een conclusie te komen. Omwille van die reden zou het interessant kunnen zijn om in een gestandaardiseerd onderzoek de verschillende media te testen om aldus tot een objectief en correct resultaat te komen. Het is wel duidelijk dat er nood is aan onderzoek naar nieuwe en betere media.
In Italië (Galli et al., 2007) en de V.S. (Hinrichs, 2010b) zijn er laboratoria die ICSI commercieel toepassen. Zij beschikken over het medium, op basis van DMEM/F12, dat tot nu toe aanleiding heeft gegeven tot het hoogste percentage blastocysten (35%; Hinrichs, 2005). Het succes van deze onderzoeksgroep is waarschijnlijk te wijten aan de doorgedreven selectie van de eicellen vóór ICSI, de beschikbaarheid van voldoende ovaria en bepaalde (ongepubliceerde) stoffen die aan het embryocultuurmedium worden toegevoegd. Ondanks dit medium blijven de blastocystpercentages na in vitro productie van paardenembryo‟s laag (10-30%; Smits, 2010).
Om een embryocultuurmedium te ontwikkelen dat zo goed mogelijk de in vivo situatie benadert, is het noodzakelijk om de embryomaternale interacties tijdens de eerste week van de dracht te onderzoeken. Het ontrafelen van deze interacties in vivo is extreem duur en moeilijk. Daarom is er nood aan een in vitro model. Een co-cultuur van oviductcellen met paardenembryo‟s lijkt daarvoor het meest geschikt. Een studie bij muizen (Lee et al, 2002) toonde aan dat het genexpressiepatroon in oviductcellen verandert door de aanwezigheid van embryo‟s. Dit suggereert dat het oviduct niet alleen wordt voorbereid op de passage van een embryo maar dat het specifieke signalen kan geven op de aanwezigheid van specifieke embryonale stadia. Bovendien toont dit aan dat met een dergelijk co-
23
cultuursysteem
(flarden
van)
de
embryomaternale
dialoog
kan
worden
opgevangen.
Genexpressiestudies (“genomics”) en proteoomanalyses (“proteomics”) zijn hierbij dus onontbeerlijk. Resultaten uit een dergelijke in vitro benadering zouden kunnen leiden tot het oplichten van een tipje van de sluier betreffende vroege embryomaternale interacties bij het paard. Dit zou bijdragen tot de optimalisatie van een embryocultuurmedium wat een stap voorwaarts zou betekenen voor de in vitro productie van paardenembryo‟s.
24
3. LITERATUURLIJST
Allen W.R., Pashen R.L. (1984). Production of monozygotic (identical) horse twins by embryo micromanipulation. Journal of Reproduction and Fertility 71, 607–613. Alm H., Torner H. (1994). In vitro maturation of horse oocytes. Theriogenology 42, 345–349. Alm H., Torner H., Blottner S., Nurnberg G., Kanitz W. (2001). Effect of sperm cryopreservation and treatment with calcium ionophore or heparin on in vitro fertilization of horse oocytes. Theriogenology 56, 817–829. Alm H.,Torner H., Kanitz W., Becker F. and Hinrichs K. (1997). Comparison of different methods for recovery of horse oocytes. Equine Veterinary Journal Suppl 25,47–50. Altermatt J.L., Suh T.K., Stokes J.E., Carnevale E.M. (2009). Effects of age and equine follicle-stimulating hormone (eFSH) on collection and viability of equine oocytes assessed by morphology and developmental competency after intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Reproduction, Fertility and Development 21, 615–623. Azuma T., Choi Y.H., Hochi S., Oguri N. (1995). Effect of glucose in the culture medium on development of horse oocytes matured and microfertilized in vitro. Reproduction, Fertility and Development 7,1067-1107. Ball B.A., Altschul M., Ellington J.E. (1990). In vitro development of day-2 equine embryos cocultured with oviductal explants or trophoblastic vesicles. Theriogenology 35, 669-682. Ball B.A., Miller P.G (1992). Survival of equine embryos co-cultured with equine oviductal epithelium from the four to eight-cell to the blastocyst stage after transfer to synchronous recipient mares. Theriogenology 37, 979-991. Ball, B. A., Thomas P. G., Brinsko S. P., Miller P. G., and Ellington J. E. (1993). Development to blastocysts of one- to two-cell equine embryos after coculture with uterine tubal epithelial cells. American Journal of Veterinary Research. 54,1139–1144. Bavister B.D. (1988). Role of oviductal secretions in embryonic growth in vivo and in vitro. Theriogenology 29, 143-154. Bavister B.D. (1992). Co-culture for embryo development: is it really necessary? Human Reproduction 7,1339-41. Bedford S.J., Kurokawa M., Hinrichs K., Fissore R.A. (2003). Intracellular calcium oscillations and activation in horse oocytes injected with stallion sperm extracts or spermatozoa. Reproduction 126, 489–499. Bézard J., Magistrini M., Battut I., Duchamp G., Palmer E.(1992). In vitro fertilization in the mare. Receuil de Médecine Vétérinaire 168, 993–1003. Bézard J., Mekarska A., Goudet G., Duchamp G., Palmer E. (1997). Timing of in vivo maturation of equine preovulatory oocytes and competence for in vitro maturation of immature oocytes collected simultaneously. Equine Veterinary Journal Supplement 25, 33–37. Blue B.L., McKinnon A.O., Squires E.L., Seidel G.E., Muscari K.T. (1989) Capacitation of stallion spermatozoa and fertilization of equine oocytes in vitro. Equine Veterinary Journal Supplement 8, 111–116. Brinsko S.P.,Ball B.A. and Ellington J.E. (1995). In vitro maturation of equine oocytes obtained from different age groups of sexually mature mares. Theriogenology 44, 461–469. Brosnahan M.M., Brooks S.A., Antczak D.F. (2010). Equine clinical genomics: A clinician‟s primer. Equine Veterinary Journal 42, 658-670. Carneiro G., Lorenzo P., Pimentel C., Pegoraro L., Bertolini M., Ball B., Anderson G., Liu I. (2001). Influence of insulin-like growth factor-I and its interaction with gonadotropins, estradiol, and fetal calf serum on in vitro maturation and parthenogenetic development in equine oocytes. Biology of Reproduction 65, 899-905. Carnevale E.M. (2007). Collection and transfer of oocytes in mares. In: Samper J.C., Pycock J.F., McKinnon A.O. (Editors). Current therapy in equine reproduction. Saunders Elsevier, Mossouri; United States of America. p. 289-295. Carnevale E.M. (2008). The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology 69, 23–30. Carnevale E.M., Coutinho da Silva M.A., Panzani D., Stokes J.E., Squires E.L. (2005). Factors affecting the success of oocyte transfer in a clinical program for subfertile mares. Theriogenology 64, 519–527.
25
Carnevale E.M., Ginther O.J. (1993). Use of a linear ultrasonic transducer for a transvaginal aspiration and transfer of oocytes in the mare. Journal of Equine Veterinary Science 13, 331– 333. Cochran R., Meintjes M., Reggio B., Hylan D., Carter J., Pinto C., Paccamonti D., Godke R.A. (1998). Live foals produced from sperm-injected oocytes derived from pregnant mares. Journal of Equine Veterinary Science 18,736–740. Colleoni S., Barbacini S., Necci D., Duchi R., Lazzari G., Galli C. (2007). Application of ovum pick-up, intracytoplasmic sperm injection and embryo culture in equine practice. Proceedings of the American Association of Equine Practitioners 53, 554–559. Cook N.L., Squires E.L., Ray B.S., Jasko D.J. (1993). Transvaginal ultrasoundguided follicular aspiration of equine oocytes. Equine Veterinary Journal Supplement 15, 71-74. Choi Y.H., Love C.C., Chung Y.G., Varner D.D., Westhusin M.E., Burghardt R.C., Hinrichs K. (2002). Production of nuclear transfer horse embryos by Piezo-driven injection of somatic cell nuclei and activation with stallion sperm cytosolic extract. Biology of Reprodion 67, 561–567. Choi Y.H., Love C.C., Love L.B., Varner D.D., Brinsko S., Hinrichs K. (2002). Developmental competence in vivo and in vitro of in vitro-matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection with fresh or frozenthawed spermatozoa. Reproduction 123, 455–465. Choi Y.H., Love C.C., Varner D.D., Hinrichs K. (2006). Equine blastocyst development after intracytoplasmic injection ofsperm subjected to two freeze-thaw cycles. Theriogenology 65, 808–819. Choi Y.H., Love L.B., Varner D.D., Hinrichs K. (2004). Factors affecting developmental competence of equine oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Reproduction 127, 187194. Choi Y.H., Okada Y., Hochi S., Braun J., Sato N., Oguri N. (1994). In vitro fertilization rate of horse oocytes with partially removed zonae. Theriogenology 42, 795–802. Choi Y.H., Roasa L.M., Love C.C., Varner D.D., Brinsko S.P., Hinrichs K. (2004) Blastocyst formation rates in vivo and in vitro of in vitro-matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection. Biology of Reproduction 70, 1231-1238. Choi Y.H., Shin T., Love C.C., Johnson C.A., Varner D.D., Westhusin M.E., Hinrichs K. (2002). Effect of co-culture with theca interna on nuclear maturation of horse oocytes with low meiotic competence, and subsequent fusion and activation rates after nuclear transfer. Theriogenology 57, 1005-1011. Chowdhary B.P., Raudsepp T. (2008). The horse genome derby: racing from map to whole genome sequence. Chromosome Research 16, 109-127. Chung J.T., Keefer C.L., Downey B.R. (2000). Activation of bovine oocytes following intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Theriogenology 53,1273-1284. Del Campo M. R., Donoso X., Parrish J.J., Ginther O.J. (1995). Selection of follicles, preculture oocyte evaluation, and duration of culture for in vitro maturation of equine oocytes. Theriogenology 43, 1141-1153. Dell‟Aquila M.E., De Felici M., Massari S., Maritato F., Minoia P. (1999) Effects of fetuin on zona pellucida hardening and fertilizability of equine oocytes matured in vitro. Biology of Reproduction 61, 533–540. Dell‟Aquila M.E., Cho Y.S., Minoia P., Traina V., Fusco S., Lacalandra G.M., Maritato F., (1997): Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) versus conventional IVF on abattoir-derived and in vitro-matured equine oocytes. Theriogenology 47, 1139–1156. Dell‟Aquila M.E., Cho Y.S., Minoia P., Traina V., Lacalandra G.M., Maritato F. (1997): Effects of follicular fluid supplementation of in vitro maturation medium on the fertilization and development of equine oocytes after in-vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction 12, 2766–2772. Dell‟Aquila M.E., Fusco S., Lacalandra G.M., Maritato F. (1996). In vitro maturation and fertilization of equine oocytes recovered during the breeding season. Theriogenology 45, 547– 560. Dell‟Aquila M.E., Masterson M., Maritato F., Hinrichs K. (2001). Influence of oocyte collection technique on initial chromatin configuration, meiotic competence, and male pronucleus formation after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of equine oocytes. Molecular Reproduction and Development 60, 79–88. Dosortsev D. (1995). Intracytoplasmic sperm injection in human. Investigations of mechanism of fertilization and development of methodology. PhD Thesis. Rijksuniversiteit Gent, België.
26
Ellington J.E., Ball B.A., Yang X. (1993). Binding of stallion spermatozoa to the equine zona pellucida after coculture with oviductal epithelial cells. Journal of Reproduction and Fertility 98, 203–208. Eppig J.J. (1979). A comparison between oocyte growth in coculture with granulosa cells and oocytes with granulosa cell-oocyte junctional contact maintained in vitro. Journal of Experimental Zoology 209, 345-353. Eppig J.J., O‟Brien M.J. (1996). Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction 54,197–207. Ergenc A.F., Olgac N. (2007). New technology for cellular piercing: rotationally oscillating muinjector, description and validation tests. Biomedical Microdevices 9, 885–891. Fulka J.,Okolski Jr., Okolski A. (1981). Culture of horse oocytes in vitro. Journal of Reproduction and Fertilility 61, 213–215. Galli C., Crotti G., Duchi R., Mari G., Zagaglia G., Duchamp G., Daels P., Lazzari G. (2002). Frozen-thawed embryos produced by ovum pick up of immature oocytes and ICSI are capable to establish pregnancies in the horse. Theriogenology 58, 705–708. Galli C., Colleoni S., Duchi R., Lagutina I., Lazzari G. (2007). Developmental competence of equine oocytes and embryos obtained by in vitro procedures ranging from in vitro maturation and ICSI to embryo culture, cryopreservation and somatic cell nuclear transfer. Animal Reproduction Science 98, 39–55. Galli, C., Lazzari, G. (2001). In vitro and in vivo culture in the sheep oviduct of equine embryos obtained by IVM and ICSI. In: Stout, T.A.E.,Wade, J.F. (Eds.), Proceedings of the Second Meeting of the European Equine Gamete Group. Loosdrecht, The Netherlands Newmarket: R&W Publications Abstract, 55–56. Gandolfi F., Brevini T.A.L., Richardson L., Brown C.R., Moor R.M. (1989). Characterization of proteins secreted by sheep oviduct epithelial cells and their function in embryonic development. Development 106, 303-312. Garcia-Rosello E., Garcia-Mengual E., Coy P., Alfonso J., Silvestre M.A. (2009). Intracytoplasmatic sperm injection in livestock species: an update. Reproduction of Domestic Animals 44, 143-151. Goudet G., Belin F., Mlodawska W., Bézard J. (2000). Influence of epidermal growth factor on in vitro maturation of equine oocytes. Journal of Reproduction and Fertilility Supplement 56, 483-492. Goudet G., Bézard J., Belin F., Duchamp G., Palmer E., Gerard N. (1998). Oocyte competence for in-vitro maturation is associated with histone H1 kinase activity and is influenced by estrous cycle stage in the mare. Biology of Reproduction 59, 456–462. Goudet G., Bézard J., Duchamp G., Gérard N., Palmer E. (1997). Equine oocyte competence for nuclear and cytoplasmic in vitro maturation: effect of follicle size and hormonal environment. Biology of Reproduction 57, 232-245. Graham J.K. (1996). Methods for induction of capacitation in the acrosome reaction of stallion spermatozoa. In: EL Squires, Editor, Veterinary Clinics of North America, Equine Practice: Diagnostic Techniques and Assisted Reproductive Technology. 12, 111–117. Grondahl C., Hansen T.H., Hossaini A., Heinze I., Greve T. (1997). Intracytoplasmic sperm injection of in vitro matured equine oocytes. Biology of Reproduction 57, 1495–1501. Grondahl C., Host T., Bruck I., Viuff D., Bézard J., Fair T., Greve T., Hyttel P. (1995). In vitro production of equine embryos. Biology of Reproduction Monograph Series 1, 299–308. Guignot F., Ottogalli M., Yvon J.M., Magistrini M. (1998). Preliminary observations in in vitro development of equine embryo after ICSI. Reproduction Nutrition Development 38, 653-663 Hafez, E.S.E. (1974) Reproduction in farm animals. Philadelphia PA: Lea & Febiger. Hawley L.R., Enders A.C., Hinrichs K. (1995). Comparison of equine and bovine oocytecumulus morphology within the ovarian follicle. In: Sharp DC, Bazer FW (eds.), Equine Reproduction VI. Madison, WI: Society for the Study of Reproduction, 243-252. Hinrichs K. (1991). The relationship of follicular atresia to follicle size. oocyte recovery on aspiration and oocyte morphology in the mare. Theriogenology 36, 157- 168. Hinrichs K. (1998). Production of embryos by assisted reproduction in the horse. Theriogenology 49, 13-21. Hinrichs K. (2005). Update on equine ICSI and cloning. Theriogenology 64, 535–541. Hinrichs K. (2007a). In vitro fertilisation. In: Samper J.C., Pycock J.F., McKinnon A.O. (Editors). Current therapy in equine reproduction. Saunders Elsevier, Mossouri; United States of America. p. 308-309.
27
Hinrichs K. (2007b). In vitro oocyte maturation. In: Samper J.C., Pycock J.F., McKinnon A.O. (Editors). Current therapy in equine reproduction. Saunders Elsevier, Mossouri; United States of America. p. 310-314. Hinrichs K. (2010a). The equine oocyte: Factors affecting meiotic and developmental competence. Molecular Reproduction and Development 77, 651-661. Hinrichs K. (2010b). In vitro production of equine embryos: State of the art. Reproduction in Domestic Animals Supplement 45, 3-8. Hinrichs K., Choi Y.H., Love L.B., Love C.C., Varner D.D., Ingram L.A. (2002). Effect of holding time and media on meiotic and developmental competence of horse oocytes. Theriogenology 58, 675-678. Hinrichs K., Choi Y.H., Love L.B., Varner D.D., Love C.C., Walckenaer B.E. (2005). Chromatin configuration within the germinal vesicle of horse oocytes, changes post mortem and relationship to meiotic and developmental competence. Biology of Reproduction 72, 11421150. Hinrichs K., Choi Y.H., Walckenaer B.E., Varner D.D., Hartman D.L. (2007). In vitro-produced equine embryos: production of foals after transfer, assessment by differential staining and effect of medium calcium concentrations during culture. Theriogenology 68, 521–529. Hinrichs K., Martin M.G., Schmidt A.L., Friedman P.P. (1995). Effect of follicular components on meiotic arrest and resumption in horse oocytes. Journal of Reproduction and Fertility 104,149–156. Hinrichs K., Schmidt A.L (2000). Meiotic competence in horse oocytes: interactions among chromatin configuration, follicle size, cumulus morphology, and season. Biology of Reproduction 62, 1402-1408. Hinrichs K., Schmidt A.L., Friedman P.P., Selgrath J.P., Martin M.G. (1993). In vitro maturation of horse oocytes: characterization of chromatin configuration using fluorescence microscopy. Biology of Reproduction 48, 363–370. Hinrichs. K. and Williams K.A. (1997) Relationships among oocyte-cumulus morphology, follicular atresia, initial chromatin configuration and nieiotic competence in the horse. Biology of Reproduction 57, 377-384. Hosoi Y., Miyake M., Utsumi K., Iritani A. (1988) Development of rabbit oocytes after microinjection of spermatozoon. Proceedings of the 11th International Congress of Animal Reproduction and Artificial Insemination 3, 331-333. Joo B.S., Kim M.K., Na Y.J., Moon H.S., Lee K.S., Kim H.D. (2001). The mechanism of action of coculture on embryo development in the mouse model: direct embryo-to-cell contact and the removal of deleterious components. Fertilility and Sterility 75, 193-199. Kane M.T., Carney E.W., Ellington J.E. (1992). The role of nutrients, peptide growth factors and co-culture cells in development of preimplantation embryos in vitro. Theriogenology 38, 297–313. Lazzari G., Crotti G., Turini P., Duchi R., Mari G., Zavaglia G., Barbacini S., Galli C. (2002). Equine embryos at the compacted morula and blastocyst stage can be obtained by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of in vitro matured oocytes with frozen-thawed spermatozoa from semen of different fertilities. Theriogenology 58, 709-712. Leibfried L., First N.L (1979). Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. Journal of Animal Science 48, 76-86. Lee K.F., Yao Y.Q., Kwok K.L., Xu J.S., Yeung W. (2002). Early developing embryos affect the gene expression patterns in the mouse oviduct. Biochemical and Biophysical Research Communications 292, 564-570. Li L.Y., Meintjes M., Graff K.J., Paul J.B., Denniston R.S., Godke R.A. (1995) In vitro fertilization and development of in vitro-matured oocytes aspirated from pregnant mares Biology of Reproduction Monograph Series 1, 309–317. Li X., Morris L.H., Allen W.R. (2000). Effects of different activation treatments on fertilization of horse oocytes by intracytoplasmic sperm injection. Journal of Reproduction and Fertility 119, 253-260. Li X., Morris L.H., Allen W.R. (2001). Influence of co-culture during maturation on the developmental potential of equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), Reproduction 121, 925–932. Love C.C., Love L.B., Varner D.D., Hinrichs K. (2002). Effect of holding at room temperature after recovery on initial chromatin configuration and in vitro maturation rate of equine oocytes. Theriogenology 57, 1973-1979.
28
Love L.B., Choi Y.H., Love C.C., Varner D.D., Hinrichs K. (2003). Effect of ovary storage and oocyte transport method on maturation rate of horse oocytes. Theriogenology 59, 765-774. MacLellan L.J., Sims M.M., Squires E.L. (2001). Effect of invasive adenylate cyclase during oocyte maturation on development of equine embryos following ICSI. Proceedings of the 5th International Symposium on Equine Embryo Transfer, Havemeyer foundation Monograph Series 3, 35-36. MacPartlin L. A., Suarez S. S., Czaya C. A., Hinrichs K., Bedford-Guaus S. J. (2009). Hyperactivation of stallion sperm is required for successful in vitro fertilization of equine oocytes. Biology of Reproduction 81, 199–206. Menck M.C., Guyader-Joly C., Peynot N., Le Bourhis D., Lobo R.B., Renard J.P., Heyman Y. (1997). Beneficial effects of Vero cells for developing IVF bovine eggs in two different coculture systems. Reproduction Nutritrion Development 37, 141-150. Minato Y., Toyoda Y. (1983). Development to normal young of mouse oocytes matured and fertilized in vitro. Japanese Journal of Zootechnical Science 54, 387. Nancarrow C.D., Hill J.L. (1994). Co-culture, oviduct secretion and the function of oviductspecific glycoproteins. Cell Biology International 18, 1105–1114. Orsi N.M., Reischl J.B. (2007). Mammalian embryo co-culture: trials and tribulations of a misunderstood method. Theriogenology 67, 441–58. Palmer E., Bézard J., Magistrini M., Duchamp G. (1991). In vitro fertilization in the horse. A retrospective study. Journal of Reproduction and Fertility Supplement 44, 375–384. Palmer E., Duchamp G., Bézard J., Magistrini M., King W.A., Bousquet D., Betteridge K.J. (1987). Non-surgical recovery of follicular fluid and oocytes of mares. Journal of Reproduction and Fertility Supplement 35, 689–690. Ribeiro B.I., Love L.B., Choi Y.H., Hinrichs K. (2008) Transport of equine ovaries for assisted reproduction. Animal Reproduction Science 108,171–179. Rosati I., Berlinguer F., Bogliolo L., Leoni G., Ledda S., Naitana S. (2002). The effect of coculture on the development of in vitro matured equine oocytes after intracytoplastic sperm injection. Equine Veterinary Journal 34, 673–678. Scott T.J., Carnevale E.M., Maclellan L.J., Scoggin C.F., Squires E.L. (2001). Embryo development rates after transfer of oocytes matured in vivo, in vitro, or within oviducts of mares.Theriogenology 55, 705–715. Shabpareh V., Squires E.L., Seidel G.E., Jasko Jr., Jasko D.J. (1993). Methods for collecting and maturing equine oocytes in vitro. Theriogenology 40, 1161–1175. Smits K., Goossens K., Van Soom A., Govaere J., Hoogewijs M., Vanhaesebrouck E., Galli C., Colleoni S., Vandesompele J., Peelman L. (2009). Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in equine in vivo and fresh and frozen-thawed in vitro blastocysts. BMC Research Notes 2, 246. Smits K. (2010). Equine embryos produced in vitro: how much do they miss a mare? Doctoraatsthesis Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p.7-31. Smits K., Govaere J., Hoogewijs M., De Schauwer C., Van Haesebrouck E., Van Poucke M., Peelman J., van den Berg M.,Vullers T., Van Soom A. (2010). Birth of the first ICSI foal in the Benelux. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 79, 134-138. Squires E.L., Carnevale E.M., McCue P.M., Bruemmer J.B. (2003). Embryo technologies in the horse, Theriogenology 59, 151–170. Squires E.L., McCue P.M. (2007). Superovulation in mares. Animal Reproduction Science 99, 1–8. Squires E.L., Wilson J.M., Kato H., Blaszczyk A. (1996); A pregnancy after intracytoplasmic sperm injection into equine oocytes matured in vitro. Theriogenology 45, 306. Tremoleda J.L. (2003). In vitro production of horse embryos: fundamental aspects. Doctoraatsthesis Faculteit Diergeneeskunde, Utrecht, p.1-21. Tremoleda J.L., Schoevers E.J., Stout T.A., Colenbrander B., Bevers M.M. (2001). Organisation of the cytoskeleton during in vitro maturation of horse oocytes. Molecular Reproduction and Development 60, 260–269. Tremoleda J.L., Stout T.A., Lagutina I., Lazzari G., Bevers M.M., Colenbrander B., Galli C (2003). Effects of in vitro production on horse embryo morphology, cytoskeletal characteristics, and blastocyst capsule formation. Biology of Reproduction 69, 1895-1906. Weber J.A., Woods G.L., Freeman D.A., Vanderwall D.K (1993). Oviductal and uterine influence on the development of Day-2 embryos in vivo and in vitro. Theriogenology 40, 689698.
29
Yanagida K., Yazawa H., Katayose H. (1998) Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction 13, 2223–2226. Zhang J.J., Boyle M.S., Allen W.R., Galli C. (1989). Recente studies on in vivo fertilization of in vitro matured horse oocytes. Equine Veterinary Journal Supplement 8, 101–104. Zhang J.J., Muzs L.Z., Boyle M.S. (1990). In vitro fertilization of horse follicular oocytes maturated in vitro. Molecular Reproduction and Development 26, 361–365.
30
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2010-2011
VERSLAG VAN DE DIERENARTSENSTAGE Door Lynn VANDENBERGHE
Stageverslag in het kader van de Masterproef
De auteur geeft de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur is niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
VOORWOORD Ik wens mijn dank te betuigen aan mijn stagebegeleiders voor de tijd en moeite die zij in mij hebben geïnvesteerd. Het is uiteraard niet evident om een student gedurende een volledige week op sleeptouw te nemen en wegwijs te maken doorheen de dagelijkse activiteiten van een dierenartsenpraktijk. Zij hebben deze functie dan ook met veel enthousiasme en overtuiging vervuld. Verder gaat mijn dank uit naar mijn zus Eva Vandenberghe, mijn schoonbroer Steven Van Laecken en mijn vriend Hendrik Westbroek voor het nalezen van dit stageverslag.
INHOUDSOPGAVE 1. Stage gezelschapsdieren .....................................................................................................p.1 1.1. Logboek stage gezelschapsdieren ...............................................................................p.1 1.2. Casuïstiek gezelschapsdieren ......................................................................................p.8 1.3. Analyse van structuur en management praktijk gezelschapsdieren ............................p.11 2. Stage grote huisdieren .........................................................................................................p.14 2.1. Logboek grote huisdieren .............................................................................................p.14 2.2. Casuïstiek grote huisdieren ..........................................................................................p.22 2.3. Analyse van structuur en management praktijk grote huisdieren .................................p.24 3. Algemene reflectie ................................................................................................................p.27 4. Referentielijst ........................................................................................................................p.30
1. STAGE GEZELSCHAPSDIEREN
1.1. LOGBOEK GEZELSCHAPSDIEREN
Datum
17/08/10
Uur
Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
14u –
Consultatie: Vaccinatie kat en geven voorlichting aan de
Vaccinatie gebeurt met
14u 30
eigenaar met betrekking tot sterilisatie en castratie.
Fevaxyn: Felien panleukopenievirus, Felien calicivirus, Felien herpesvirus, Chlamydia psittaci. Subcutaan in de nek toegediend.
14u 30 – Consultatie: Vaccinatie hond en kat. Bij elke vaccinatie wordt Vaccinatie poes: Fevaxyn 15u
het vaccinatieboekje nagekeken en eventueel vervolledigd.
(zie boven) hond: ziekte van Carré, parvovirose, leptospirose, infectieuze tracheobronchitis (kennelhoest) en infectieuze hepatitis.
15u -
Huisbezoek: Chihuahua vaccineren vanwege bezoek aan
Vaccinatie buitenland:
16u
het buitenland.
rabiës is verplicht voor
De hond werd ook preventief behandeld tegen teken
elke reis naar het
vanwege het bezoek aan warme streken.
buitenland.
16u -
Huisbezoek: Controle Maltezer. Dit hondje werd reeds
Een dieet werd
16u40
eerder aan een mammatumor geopereerd.
voorgesteld vanwege obesitas.
17u -
Huisbezoek: Controle wonde van een kat waarvan eerder de De kat had de draadjes
18u30
poot geamputeerd werd.
eruit gebeten. Deze
De kat werd overgebracht naar het kabinet.
werden in het kabinet vervangen door nietjes. Vervolgens werd zalf aangebracht die de
wondheling bevordert en slecht smaakt. De kat kreeg geen kraagje om.
18u30 -
In het kabinet: Castratie kater. De kat was reeds de dag
Anesthesie: Ketamine en
19u30
ervoor gehospitaliseerd zodat deze zeker nuchter zou zijn.
Xylazine (0,1 cc/kg). Antibiotica: Amoxycilline.
19u30 -
Bespreking castratie kater.
20u
2
Datum
21/08/10
Uur
Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
9-
In het kabinet: Sterilisatie drachtige poes. De eigenaar
Ovariohysterectomie.
10u30
wou absoluut geen jongen. De jongen sterven in utero
Anesthesie: Ketamine en
vanwege de anesthesie en storing in doorbloeding en
Xylazine.
oxygenatie van de uterus.
Antibiotica: Amoxycilline.
In het kabinet: Castratie kater.
Anesthesie: Xylazine en
10u30 11u15
Ketamine. Antibiotica: Amoxycilline.
11u30 -
Consultatie: Spoedgeval: kat aangereden. Er was een
Op RX opname:
13
deformatie van de kaak zichtbaar.
mandibula gebroken
Er werden RX opnames gemaakt.
zowel ter hoogte van de kaaktak als ter hoogte van de symphysis.
13u -
Bespreking RX opnames en uitleg over mogelijke
13u20
behandelingen.
13u20 – Consultatie: Spoedgeval: kat aangereden: vermoeden van Op RX opname: geen 15u.
hernia diafragmatica.
hernia diafragmatica: wel
Er werden RX opnames gemaakt.
vocht op de longen,
Voor de RX opnames wordt samengewerkt met een
bronchiaal patroon
bevriende practicus. Het dier werd verhuisd naar de
zichtbaar.
desbetreffende practicus en aldaar gehospitaliseerd.
15 -
Consultatie: Mankende hond na wandeling in het bos.
Vermoeden van
15u30
verstuiking.
15u30 – Consultatie: Bloederige uitvloei bij hoogdrachtige
Hier werd een echo
16u45
Chihuahua.
gemaakt. Op echo waren
Ook hier werd de echo genomen bij een bevriende
3 puppy's zichtbaar, met
practicus waarmee de dierenarts samenwerkt.
kloppend hartje. Het
3
vocht was helder. Geen afwijkingen gezien op echo.
16u45 -
Huisbezoek: Telefoontje van ongeruste eigenares. De kat
Na het vangen van de
18u20
speekselt en zou tranenvloed en neusvloei vertonen. De
poes werd deze
kat is echter niet tam en heeft zich verscholen onder het
overgebracht naar de
dak.
praktijk. Er was geen tranenvloed of neusvloei, enkel speekselen. Uit klinisch onderzoek bleek ernstige gingivitis en cariës.
18u20 -
Bespreking met de dierenarts van de casussen.
19u
4
Datum
31/08/10
Uur
9u - 11u
Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
Consultatie: Maltezer, mannelijk, 11 jaar met urine-
Deze reu leek niet over
incontinentie
testikels te beschikken. De eigenaar beweert de hond nooit gecastreerd te hebben.Vermoeden van cryptorchidie. Op echo werd prostaathypertrofie vastgesteld, op echo werden geen abdominale testikels vastgesteld.
11u -
Huisbezoek: Kattin met nierfalen, blindheid en braken.
Bloedonderzoek.
13u -
In het kabinet: Verwijderen van tandsteen bij een
De dierenarts raadt elke
14u
Chihuahua.
klant aan de tanden
12u
goed te verzorgen d.m.v. Oral Bar, eventueel met de hand poetsen en verwijderen van tandsteen.
14-
In het kabinet: Castratie van Chihuahua.
15u30
15u30-
Bespreking castratie Chihuahua, gebruik hechtmaterialen,
16u
sterilisatie materiaal.
5
Datum
06/10/10
Uur
Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
14u -
Consultatie: Stafford Terriër, manken. De hond bleek niet
Dexametasone 2 mg/ml
14u30
te manken maar eerder rugklachten ter hoogte van de
parenteraal.
lumbale regio te vertonen. Uit de anamnese bleek dat de
Metacam voor 5 dagen
kinderen uit het gezin vaak op de rug van de hond gaan
per os.
zitten.
14u30 – In het kabinet: Castratie: Beagle 4 jaar, 15 kg.
Xylazine 1,5 cc,
16u
Ketamine 1,3cc + 0,5cc, Temgesic (o,5 cc: 1cc/33 kg) en Amoxycilline (1cc/10kg):
16u -
In het kabinet: Ovariëctomie: buikspieren en subcutis
17u30
hechten via matrashechting (doorlopend zonder achterhaling) en huid hechten: afzonderlijke hechtingen.
17u30 -
Consultatie: Vaccinatie poes.
18u
18u -
Fevaxyn (zie hoger) en advies tot sterilisatie.
Consultatie: Vaccinatie Duitse Herder 2 jaar.
18u30
Vaccinatie met Vanguard DA2Pi-CPV-Lepto en Pneumodog. Bijkomend werden de anaalzakjes door de dierenarts manueel geledigd.
18u30 – Consultatie: Duitse staande draadhaar, met verdikkingen
Bloedonderzoek: zie
20u
ter hoogte van de huid. Uit het klinisch onderzoek bleek
bijgevoegd.
dat de hond erg mager was, melkgifte werd vastgesteld.
Echografie van het
Schijndracht werd gediagnosticeerd. Later werd Adisson
abdomen: geen
vermoed.
pyometra, wel abnormaal uitzicht van de linker nier.
6
Datum
10/02/11
Uur
9-11u
Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek
In het kabinet: Sterilisatie Bouvierteefje 4 jaar.
Opmerkingen
De operatie werd uitgevoerd in samenwerking met een bevriende practicus.
11-12u
Consultatie: Schnauzer met verhoogde buikspanning en kolieken. Uit de echografie bleek niets abnormaals, er werden ook geen afwijkingen in het algemeen onderzoek vastgesteld.
13u-
In het kabinet: Operatie kater naar aanleiding van
14u30
complicaties na castratie.
14u30-
In het kabinet: Wegname mammatumoren bij poes.
16u
16u-
In het kabinet: Consultatie Labrador 8 jaar oud met
17u30
cataract. De dierenarts heeft bloed afgenomen om diabetes als oorzaak van cataract uit te sluiten. Tevens werden de tanden en tandvlees gecontroleerd.
Datum
Uur
Aard consultatie/ huis-/ bedrijfsbezoek
Opmerkingen
09/02/11 9–11u
Huisbezoek: Vaccinatie Chihuahua's, adult en puppy's. Registratie stamboek, klinisch onderzoek hart, chippen.
11-12u
Huisbezoek: Chinese naakthond, bloedafname progesteronbepaling.
13u-14u Huisbezoek: Maltezer met afwijkende longgeluiden en hond (onbekend ras) met hoesten t.g.v tracheïtis.
14u-15u Huisbezoek: Oudere hond met epilepsie.
7
Vermoeden van tumor.
1.2. CASUÏSTIEK GEZELSCHAPSDIEREN Ovariëctomie van een kattin
Signalement:
Diersoort: kat. Geslacht: vrouwelijk. Leeftijd: 2 jaar. Gewicht: 3 kg.
Anamnese: De kattin is volledig gezond, de eigenaar wenst anticonceptie.
Klinisch onderzoek: Pols: goed geslagen. Hartslag: regelmatig, geen bijgeruis. Overige parameters (temperatuur, ademhaling, lymfeknopen, mucosae en capillaire vullingstijd) werden niet gecontroleerd. Het betrof een perfect gezonde kattin. De algemene indruk was goed, blinkende vacht, gezond tandvlees en mooie tanden (geen periodontitis).
Voordelen ovariëctomie: Anticonceptie. Preventie mammaire neoplasiën en pyometra en diabetes mellitus. Nadelen ovariëctomie:
Gewichtstoename. Urine-incontinentie (minder bij de kattin). Verandering van karakter en vachtstructuur.
Behandeling: Ovariëctomie
Voorbereiding: de kat wordt een dag voor de ingreep gehospitaliseerd bij de dierenarts om zeker te zijn dat de kat nuchter zal zijn voor de operatie (min. 12 tot 18u vasten). Indien de kattin niet nuchter is, bestaat het gevaar op aspiratiepneumonie. Katten zijn gevoelig en zullen eerder gaan braken als gevolg van de anesthesie (xylazine) dan honden.
Anesthesie: Xylazine (2 mg per kg lichaamsgewicht, subcutaan) en ketamine (5 - 10 mg per kg lichaamsgewicht, intramusculair). Indien de anesthesie voldoende is ingetreden, wordt de kat op de rug gefixeerd met de pootjes bevestigd aan de operatietafel.
Voorbereiding van het operatieveld: de kat wordt geschoren ter hoogte van de linea alba rond de navel, dit gebeurt met een clipper. Vervolgens wordt de huidzone gescrubd. Dit gebeurt met een verdunde chloorhexidine-oplossing en steriele tampons. Waarbij men gradueel van binnen (ter hoogte van de linea alba) naar buiten toe werkt. Vervolgens wordt de chloorhexidine-oplossing verwijderd door middel van in alcohol gedrenkte tampons. Men vermijdt om met de tampons terug te keren naar de regio waar men reeds met alcohol heeft geswabd. Deze procedure herhalen we tot 3 maal toe, waarbij men zich ervan verzekert dat er geen vuil meer aan de tampons kleeft.
8
Als laatste stap brengt men een steriel operatiedoek aan, waardoor het operatieveld wordt afgebakend. Ter hoogte van de plaats van incisie, knipt de dierenarts met de steriele schaar een opening in het (wegwerp-)operatiedoek . Het doek wordt bevestigd door middel van doekklemmen type Backhaus. De operatie: 1 cm caudaal van de navel wordt een insnede van ongeveer 2 – 3 cm gemaakt. Daarbij snijdt men (d.m.v een scalpel) doorheen de huid, het subcutane vet en de linea alba. Wanneer men de insnede vergroot, brengt de dierenarts een pincet (dit kan ook gebeuren met behulp van een v-vormige sonde) in de buikholte onder de beoogde incisieplaats en worden de buikspieren ietwat omhoog getrokken, dit teneinde geen darmen te beschadigen bij het insnijden. Wanneer onze incisie groot genoeg is, gaat men op zoek naar het ovarium. Hiervoor dient men eerst het omentum naar craniaal te verschuiven om het gezichtsveld breder te maken. Het ovarium wordt door een geoefende dierenarts door middel van vingerexploratie gelokaliseerd, de uterushoorn glipt onder de vinger door. Het ovarium wordt vervolgens uit de incisie-opening naar buiten gebracht. Het ligamentum suspensorium wordt hiertoe stuk getrokken en in het mesovarium wordt een opening gemaakt, caudaal van de bloedvaten. Vervolgens plaatst men 3 klemmen (type Mosquito) ter hoogte van de arterie en vene ovarica die het ovarium bevloeien. Na het verwijderen van de verste klem plaatst men op deze kneuzingsplaats een ligatuur (polyglactine 910: Vicryl® 3/0). Vervolgens wordt het mesovarium en zijn bloedvaten doorgesneden (aan de zijde van de hechting gericht naar het ovarium, tussen de dichtste en middelste klem). De stomp verdwijnt terug in het abdomen. Men zoekt nu het craniale uiteinde van de uterushoorn op.
Enkele centimeters (1 à 2 cm) van het uiteinde van de uterushoorn (in het ligamentum proprium) plaatst de dierenarts opnieuw een ligatuur. Craniaal van deze ligatuur wordt het geheel doorgeknipt en verwijderd (controleer of het volledige ovarium werd verwijderd). Het andere ovarium wordt zoals hierboven beschreven gelocaliseerd, afgebonden en verwijderd van de uterushoorn. Steeds let men erop dat er geen bloedingen plaatsvinden alsvorens de uterus terug in het lichaam van het dier te laten verdwijnen.
Hechten: de linea alba wordt gehecht. Vanwege het feit dat deze linea alba een pezige structuur is (waar de buikspieren samen komen), zal de heling langer duren dan bij een gewone spier. Het is van belang hier een resorbeerbare draad te gebruiken die voldoende lang aanwezig blijft. De dierenarts heeft hier gebruik gemaakt van polyglactine 910. De linea alba wordt gehecht via een doorlopende hechting zonder achterhaling, net als het subcutane weefsel. Voor de huid benut men afzonderlijke hechtingen.
9
Figuur 1. Ovariëctomie (uit F.W. Fossum, Small Animal Surgery, 2002).
Nabehandeling: De wonde wordt behandeld met adhesieve spray en Hypafix waarna de kattin in een bench wordt geplaatst tot de verdoving is uitgewerkt. Postoperatief krijgt de kattin Tolfedine (tolfenamzuur: 1mg/kg, subcutaan).
10
1.3. ANALYSE VAN STRUCTUUR EN MANAGEMENT PRAKTIJK GEZELSCHAPSDIEREN
Voorgeschiedenis: De dierenarts is gestart als rundveepracticus. Door gezondheidsproblemen werd hij gedwongen om over te schakelen op gezelschapsdieren en paarden. Vanwege de economische
crisis
en
wanbetalingen
heeft
de
dierenarts
besloten
bepaalde
paardeneigenaren uit zijn klantenbestand te schrappen en zich meer toe te spitsen op de gezelschapsdieren.
Rechtsvorm van de onderneming en samenwerkingsverbanden: De dierenarts werkt als zelfstandige in een éénmanszaak. Verder bestaat er een samenwerkingsverband met een 4-tal dierenartsen. Het betreft een losse samenwerking zonder contractbasis. De deelnemers komen op vaste tijdstippen samen waarbij onder andere de weekenddiensten worden verdeeld. Zo kan men aangeven welke weekends men niet bereikbaar kan zijn, waarbij een andere dierenarts zich beschikbaar kan stellen. Indien de dierenarts zich niet beschikbaar heeft gesteld voor een bepaald weekend, maar hij toch een oproep krijgt, kan de dierenarts vrijwillig beslissen deze oproep door te geven aan de collega van dienst of zelf te behandelen indien hij/zij dat wenst. Men werkt met een automatisch doorschakelingssysteem waarbij de cliënt meteen in contact komt met de dienstdoende dierenarts. Naast de verdeling van de weekenddiensten kan er ook gebruik worden gemaakt van materialen en infrastructuur van één van de deelnemende dierenartsen. De opbrengst wordt vervolgens verdeeld. Bijvoorbeeld: Een echografie kost de cliënt 45 Euro; hiervan gaat 20 Euro naar de aanbrengende dierenarts en 25 Euro naar de bevriende practicus die de echografie uitvoert. e
Een gelijkaardige overeenkomst bestaan in het samen uitvoeren van operaties: 1/4 van de e
e
opbrengst gaat naar de aanbrengende practicus, 1/4 naar de chirurg, 1/4 naar de assistent e
en 1/4 naar diegene die het materiaal ter beschikking stelt. Ook beschikt men over één gezamenlijke dierenartsassistent.
Toekomstplannen: De dierenarts en zijn 4 collega‟s hebben concrete plannen om een klein dierenartsencentrum voor kleine huisdieren en paard op te richten. Het betreft geen dierenkliniek, men zal dus niet 24u op 24u en 7 dagen op 7 beschikbaar zijn. Het doel is om over een afzonderlijke hospitalisatieruimte, operatieruimte en kabinet te beschikken. Momenteel beschikken de dierenartsen thuis enkel over een kabinet waarin ook de hospitalisatie en operaties plaatsvinden. Bovendien komt er een mogelijkheid om enkele paarden
te
hospitaliseren.
Naast
dit
dierenartsencentrum
blijven
de
afzonderlijke
satellietpraktijken echter wel bestaan. Het centrum zal zich bevinden naast de privé-woning van één van de dierenartsen en is centraal in het dorp gelegen naast de huidige succesvolle praktijk. Er zal één dierenartsassistent (professionele bachelor agro- en biotechnologie afstudeerrichting dierenzorg) worden aangenomen om de telefoon te bedienen en de dierenarts bij te staan bij zijn/haar dagelijkse activiteiten.
11
Werkschema: Overdag is er mogelijkheid tot huisbezoeken maar ook tot consultatie en operatie. Consultatie kan ook vanaf 19u op afspraak. Er is geen vrij spreekuur. De dierenarts heeft hier bewust voor gekozen. In het begin van zijn carrière heeft hij het systeem van vrij spreekuur toegepast, maar dit heeft enkel tot frustraties geleid. Men zit aldus te wachten tot een patiënt verschijnt en verspeelt zo kostbare tijd. In het dierenartsencentrum zal er wel mogelijkheid zijn tot vrij spreekuur. De arbeidsduur van de dierenarts bedraagt ongeveer 40 uren per week.
Boekhouding: De boekhouding wordt verzorgd door een extern boekhoudkantoor. De klant kan meteen cash betalen of een factuur vragen. Dit maandelijks factureren gebeurt doorgaans bij de paardeneigenaren. Er wordt geen extra toelage gerekend indien men niet meteen betaalt. De cliënt dient 30 dagen na factuurdatum te betalen. Uit ervaring weet de dierenarts dat de grotere bedrijven, eigenaren met meerdere paarden, de neiging hebben hun schulden niet te betalen. De dierenarts heeft dan ook besloten deze klanten uit zijn klantenbestand te weren. De dierenarts beschikt over een computerprogramma genaamd Recipet. Dit is een professioneel softwarepakket voor de dierenarts met de nadruk op gezelschapsdieren. Er bestaat ook een variant voor grote huisdieren (Recifarm). Dit programma maakt het mogelijk om aan geavanceerde facturatie te doen. De dierenarts verdient het meeste aan de consultaties en operaties, gevolgd door verkoop van voeding.
Inkomsten
Consult en Operatie 50% Voeding 30% Medicatie 20%
Figuur 2. Globaal beeld van de inkomsten van een gezelschapsdierenpraktijk.
12
Recipet: Dit computerprogramma is een zeer praktisch softwarepakket voor de dierenarts. Dit programma stelt de dierenarts in staat een uitgebreid en overzichtelijk dossier over zijn patiënten op te stellen. Hierin worden de consultaties, klantgegevens en verwijsbrieven bijgehouden. Naast dossierbeheer is er mogelijkheid tot voorraadbeheer, netwerkbeheer met collega‟s en beschikt Recipet over een eenvoudig boekhoudprogramma.
Figuur 3. Recipet (http://www.recipet.be/images/scr_recipet/Recipet_002.jpg).
Sterke en zwakke punten: o
Sterke punten: klantvriendelijkheid, ervaring en deskundigheid.
o
Zwakke punten: beschikbaarheid.
13
2. STAGE GROTE HUISDIEREN 2.1. LOGBOEK GROTE HUISDIEREN Datum
Uur
Aard consultatie / huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
6 juli
8u–
Stalronde in de kliniek: evalueren patiënten en toedienen
Deze ronde wordt 3 maal
2010
13u
van dagelijkse geneesmiddelen/ behandelingen:
daags gelopen: om 8u, 16u
1. KWPN 10 jaar: volvolus van jejunum en ileum.
en 22u door de
2. KWPN 4 jaar: koliek (ileum) en reflux.
dierenartsen die hier een
3. Haflinger: hoefbevangen: hierbij werd een RX
internship volgen,
opname gemaakt om 10u30: er was reeds een
momenteel zijn 2
hoefbeenkanteling te zien van 15°. Euthanasie
dierenartsen aangenomen
om 15u.
voor die taak.
4. Merrie met retentio secundinarum. 5. KWPN: griffelbeen, breuk linksachter. 6. Vosveulen: hoest en jagende ademhaling. 7. KWPN met partiële strekpeesruptuur: nieuwe wonddressing o.b.v zilveralginaat werd aangebracht. 8. Bonte merrie met vleeswonde linksachter.
14u –
Consultatie: jonge Friese hengst met weinig
Via endoscopie in rust werd
14u30
uithoudingsvermogen en snurkend geluid.
niets afwijkends vastgesteld, er werd bloed en mestonderzoek gedaan.
14u30
Consultatie: Friese merrie met cysten t.h.v neusslijmvlies
Op endoscopie werden
– 15u
en neusseptum. Deze werden verwijderd waarbij een
geen afwijkingen
deel van het neustussenschot werd weggenomen. Er is
waargenomen, tijdens
nog steeds geluid tijdens het werken.
palpatie werden wel kleine vochtophopingen gevoeld. Cysten hebben de neiging te recidiveren.
15u –
Euthanasie Halfinger.
17u30
Stalronde: Sonderen en toedienen van geneesmiddelen.
14
Datum
7 juli
Uur 8 – 12u
2010
Aard consultatie / huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
Stalronde in de kliniek: evalueren patiënten en toedienen van dagelijkse geneesmiddelen/ behandelingen: 1. KWPN 10 jaar: volvolus ileum en jejunum: geen veranderingen opgemerkt. 2. KWPN 4 jaar: er werd rectaal onderzoek
Dagelijks worden ook de borborygmen, temperatuur en hartslag gecontroleerd.
uitgevoerd, maar weinig afwijkingen werden gevoeld. Op echo nam men overvulde dunne darmen en hypomotiliteit waar. 3. Friese merrie had een temperatuur van 39,1°. Zij werd nogmaals gespoeld.
Om complicaties zoals hoefbevangenheid te vermijden werden de hoeven
4. Vosveulen: dood aangetroffen in de box.
van de merrie
5. Bonte merrie met bilwonde: gereinigd en
ondergedompeld in koud
ontsmet.
water.
13u –
Consultatie: Springmerrie van 5 jaar: presteert niet. Op
Eigenaar dringt aan op
13u40
het bloedonderzoek was LDH te hoog. De dierenarts gaf
maagscopie. Op de
advies om het paard te ontwormen en eind juli terug te
maagscopie worden geen
komen.
erosies of onregelmatigheden waargenomen.
14u –
Consultatie: Veulen met zwelling ter hoogte van de hak;
Het hematoom werd meteen
14u30
na punctie werd een hematoom gediagnosticeerd.
geopend en uitgespoeld te worden.
14u30
Koelen van de hoeven van de Friese merrie met retentio
–
secundinarum ter preventie van hoefbevangenheid.
14u50 15u –
Autopsie op gestorven veulen; hierbij werden kleine
15u30
haarden ter hoogte van de longen vastgesteld. De haarden zijn vast van structuur. Het hart is vergroot en bezit een verdikte wand vanwege het longoedeem.
15u30-
Nemen van RX opnames; keuring hengst.
– 16u
15
16u –
Stalronde: Een nieuw veulen werd aangemeld met
18u
ronkend geluid tijdens zuigen. Het veulen krijgt melk uit de fles aangezien de merrie geen melk geeft.
Nacht
4u –
Veulen melk geven, het veulen moet om de 2u melk
4u20
krijgen. De beurten worden onderverdeeld tussen de dierenartsen en stagiaires.
Datum
Uur
Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek
8 juli
8u –
Stalronde in de kliniek: evalueren patiënten en
2010
12u
toedienen van dagelijkse geneesmiddelen/
Opmerkingen
behandelingen: 1. KWPN 10 jaar met volvulus ileum en jejunum. 2. KWPN 4 jaar met koliek. 3. Merrie: geen koorts meer, uterus dient niet meer gespoeld te worden. 4. Bonte merrie: verzorging bilwonde. 5. Veulen met septische artritis: kreupel links voor en rechts achter. 6.
“Standmerrie” van de kliniek: ovaria werden verwijderd.
7. Veulen met ronkend geluid: werd naar huis gestuurd op verzoek van de eigenaars. 13u –
RX controle-opname van hengst: werd geopereerd ter
14u
behandeling van OCD in de knie. RX controle-opname van merrie: werd geopereerd ter
Op de controle-opname was
behandeling van OCD in de kogel: rechtsvoor lateraal
een resterend fragment te
een plantaire chip t.h.v het sesambeen.
zien.
14u –
Praktisch oefening: Aanbrengen maagsonde bij het
15u
paard en het aanleggen van verbanden. De kliniek heeft beschikking over een aantal eigen paarden, zij dienen als bloeddonoren, “standmerries” en oefenpaarden voor de stagiaires.
16u – 18u
Stalronde.
16
Datum
9 juli
Uur
Aard consultatie / huis- / bedrijfsbezoek
8 – 12u
Stalronde in de kliniek: evalueren patiënten en toedienen
Er werd een thoraxdrain
van dagelijkse geneesmiddelen/ behandelingen:
geplaatst, waarna het vocht
2010
Opmerkingen
1. Friese merrie met pleuritis.
werd afgelaten. De merrie
2. Zie patiënten 8 juli 2010.
was echt kortademig.
3. Veulen met septische artritis: lichte
Vervolgens werd gespoeld
ademhalingsproblemen werden vastgesteld.
met fysiologische vloeistof. e
Tijdens de 2 spoelbeurt werd de merrie echt benauwd, vanwege de pijn en het ongemak kreeg de merrie voor het spoelen een sedativum. De merrie kreeg het steeds moeilijker en had anemische slijmvliezen met blauwe rand t.h.v tandvlees, ook de tong werd blauw. Er werd besloten de merrie meteen te euthanaseren.
Datum
13 – 14
Bedrijfsbezoek: Draversstal: infuus op basis van
u
elektrolyten en vitaminen inbrengen bij enkele dravers.
Uur
Aard consultatie / huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
10 juli
8u –
Consultatie: kreupelheidsonderzoek: Fries 10 jaar
Op de RX van de kogel
2010
10u
linksachter kreupel: men vermoedde kogel of knie. De
echter zag men kleine
knie had reeds eerder voor problemen gezorgd. Indien
onregelmatigheden
de gewrichten op RX mooi zijn zou overgegaan worden
proximaal op het
op echografie van de knie.
sesambeen, er was ook reactiviteit te zien t.h.v de dorsale rand van het kogelgewricht.
11u –
Bijwonen staande castratie.
Half-bedekt, open castratie.
13u
17
Datum
11 juli
Uur 8 – 12u
2010
Aard consultatie / huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
Stalronde in de kliniek: evalueren patiënten en toedienen van dagelijkse geneesmiddelen/ behandelingen: 1. Minipaardje: moeilijke partus. 2. Veulen met septische artritis: geen koorts meer, geen ademhalingsproblemen meer: werd naar huis gestuurd.
12u –
Spoedconsultatie: partus bij merrie: veulen is
De merrie dronk en at niet.
13u30
ankylotisch. Dierenarts thuis had reeds opgevoeld. De
Er was geen ontlasting en de
merrie werd op transport geplaatst. De dienstdoende
merrie vertoonde duidelijk
dierenarts op de kliniek herpositioneerde het veulen met
ongemak. Na rectaal
de hand waarna een levend en groot veulen geboren
onderzoek bleek het rectum
werd. Dit veulen bleek ankylotisch. De merrie echter
vol mest zonder
was uitgeput en er had zich enkele malen een
defecatiereflex.
rectumprolaps voorgedaan tijdens de partus.
Men dacht aan schade t.h.v
Later werd overgegaan tot euthanasie van de merrie, uit
mesenterium (en zijn
een punctie bleek een grote hoeveelheid bloed in de
zenuwen) a.g.v de
buikholte.
rectumprolaps. Ook de blaas was erg vol. Men besluit af te wachten en de merrie manueel te verlichten.
14u –
Consultatie: Pony 16 jaar: koliek binnen het half uur na
De eigenaars besloten niet
15u
voederen. Op echo werd gas in het colon, vrij vocht in
over te gaan tot operatie. De
de buikholte waargenomen. Rectaal voelde men
pony werd geëuthanaseerd.
opgezette darmen en strakke taeniae. 16 –
Stalronde.
18u
Nacht
4u –
Melken merrie en geven flesje veulen.
4u30
18
Datum
Uur
Aard consultatie/ huis- / bedrijfsbezoek
Opmerkingen
12 juli
8u –
Consultatie: Kreupelheidsonderzoek: KWPN bleek
Na het nemen van RX
2010
10u
kreupel rechts voor op de harde volte, minder op de
opnames zag men een
zachte bodem. Buigproef werd uitgevoerd: knie +/+++
afwijkend straalbeen klasse
en onder de kogel ++/+++. De hoefkatrolregio en
III (volgens Nederlandse
achterzijde hoef werd uitverdoofd. Op de volte voor
richtlijnen). Op de RX
80% beter na de verdoving.
opname zag je “lollypops” (2 grotere en 1 kleinere) en onregelmatige dorsale rand.
10u30
Consultatie: Paard 8 jaar: sinds 5 à 6 weken kreupel:
Op RX zag men
– 12
had reeds eerder een hoefabces gehad. Het paard was
onregelmatigheden t.h.v. het
intermitterend mank tot zelfs fractuurmank. Het
straalbeen. Ook via echo zag
hoefabces was opgelost. Het paard vertoonde
men een onderbreking op het
kreupelheid op de harde volte, na verdoving 70%.
oppervlak. Men diagnosticeerde een cyste lateraal in het straalbeen met opening naar het gewricht.
13u –
Nemen van RX – opnames: merrie rechts voor mank;
13u30
op de metacarpus werd een periostale reactie opgemerkt.
14u –
Consultatie: Caslick merrie (zie casuïstiek grote
14u20
huisdieren).
15u –
Praktische oefening: Rectaal leren voelen naar ovaria
16u
en uterus.
19
Datum
Uur
Aard consultatie / huis- / bedrijfsbezoek
13 juli
8u –
Melken merrie en geven flesje biest. Typisch voor het
2010
8u40
tekort aan zuurstof tijdens de geboorte is de mentale
Opmerkingen
achterstand van het veulen (duurde erg lang voor het kon drinken en staan) en het veulen was erg moeilijk uit slaap te wekken. 9u –
Consultatie: Shetlandpony veulen: voedselbrokken
Ter plaatse werd geprobeerd
9u45
keren terug langs de neus en vroeger klacht van
de houtsplinters te
hoesten. Via endoscopie werd een brok waargenomen
verwijderen via een grijpertje
in de slokdarm bevattende houtsplinters. In de trachea
langsheen de endoscopie.
was alles normaal uitgezonderd een klein slijmspoortje.
Dit mislukte. Er werd geopteerd voor operatie later op de dag.
10u –
Consultatie: Merrie 3 jaar: slechte algemene conditie:
11u
systolisch bijgeruis: op echo/ECG werd een septumventrikeldefect gediagnosticeerd en klepfalen van de rechter atrioventriculaire kleppen vanwege het septumdefect. Later kreeg de merrie in de kliniek ook koliek: het bleek om een cecuminvaginatie te gaan.
14u –
Operatie: Shetlandpony met slokdarmobstructie. De
Op echo werd ook een
15u30
brok werd via endoscopie toch doorgespoeld. De
dorsoventraal afgeplatte
volgende dag werd een controle-endoscopie
trachea opgemerkt.
uitgevoerd, de slokdarm bleek terug doorgankelijk.
20
Datum
Uur
Aard consultatie / huis- / bedrijfsbezoek
14 juli
8u –
Spoedoperatie: Drachtige merrie met koliek: op rectaal
2010
11u
onderzoek werden “fietsbanden” gevoeld en een “grote
Opmerkingen
ballon”. Eens geopend bleek het om een hernia mesenterialis te gaan. De dunne darmen waren over een lengte van 7 meter hemorrhagisch geïnfarceerd. Er werd besloten over te gaan tot euthanasie op de operatietafel.
11u30
Operatie: Verwijderen keratoma bij ruin 16 jaar.
– 13u 14u –
Huisbezoek: Endoscopie onder het zadel/in arbeid: de
16u
dynamische respiratoire scopie (DRS). Hier ter controle van een draver die een licht snurkend geluid maakt.
16u20
Consultatie: Verwijderen granulatieweefsel ten gevolge
–
van een letsel t.h.v. linker achterbeen (pijp).
16u40
Datum
Uur
Aard consultatie / huis- / bedrijfsbezoek
15 juli
8u –
Lijkschouwing merrie met hartfalen en
2010
10u
darminvaginatie: cecum was bijna over de gehele lengte geïnvagineerd. Het septumdefect werd niet teruggevonden, de merrie werd wel verdacht van een ductus van Botalli.
10u –
Helpen bij voorbereiding operatie: urinekatheder
10u30
aanbrengen, positioneren,…
15u –
Chiropraxie.
16u 16u –
Stalronde.
18u
21
Opmerkingen
2.2. CASUÏSTIEK GROTE HUISDIEREN De vulvoplastie volgens Caslick bij de merrie
Signalement:
Diersoort: paard Geslacht: vrouwelijk (merrie) Leeftijd: 8 jaar Ras: Koninklijk Warmbloed Paardenstamboek Nederland (KWPN)
Anamnese: De merrie werd door de eigenaar aangeboden met een veulen aan de voet. De klacht betrof het niet correct sluiten van de vulva sinds de partus en de eigenaar had de indruk dat de merrie „lucht zoog‟. Na een beperkt klinisch onderzoek, waarbij normale parameters werden verkregen, onderzoekt de dierenarts de vulva. De merrie heeft reeds 4 maal geveulend. Deze partus was opvallend zwaar geweest.
Klinische onderzoek: temperatuur: 37,3°C.
Diagnose: onvoldoende sluiting van de vulva. Dergelijke conformatie kan aanleiding geven tot een uro- of pneumovagina. Dit verlaagt het drachtigheidspercentage na kunstmatige inseminatie of natuurlijke dekking. De vulva vormt nu geen efficiënte barrière meer voor pathogenen. Een slecht sluitende vulva leidt hierdoor sneller tot het ontstaan van infecties (vaginitis en endometritis), wat aanleiding kan geven tot abortus bij drachtige merries. De oorzaak van deze slecht sluitende vagina kan liggen in het meer horizontaal komen van de vulva, zoals het geval is bij oudere of magere merries. Deze merrie is slechts 8 jaar oud en is goed doorvoed. De eigenaar bracht ter sprake dat het een „staande‟ bevalling geweest was en dat het veulen met hulp geboren werd. De vulva kan hierdoor ingescheurd of overrekt zijn.
Behandeling: Aangezien het een drachtige merrie betrof, werd besloten over te gaan tot een vulvoplastie volgens Caslick.
Procedure:
De merrie werd in een opvoelbox geplaatst. De staart werd opgebonden en gebandageerd en de vulva gereinigd. Men kan ervoor kiezen de merrie te sederen (een veel gebruikt preparaat in de kliniek is detomedine hydrochloride) alvorens de lokale anesthesie toe te passen. Bij deze merrie was sedatie niet noodzakelijk.
Figuur 4. De slecht sluitende vulva (uit Ricketts and Curnow, 1988).
22
Vervolgens werd ter hoogte van de mucocutane overgang van de vulva een lokaal anestheticum geïnjecteerd. Het betreft 15 tot 20 ml lidocaïne met adrenaline. De naald wordt ingebracht via ventraal, gericht naar de dorsale commissuur, waarbij men geleidelijk het preparaat injecteert terwijl men de naald naar e
ventraal opschuift (tot op niveau van 2/3 van de vulva).
Figuur 5. De lokale anesthesie (uit Ricketts and Curnow, 1988).
Door middel van een gebogen schaar werd ongeveer 5 mm van elke vulvalip ter hoogte van de mucocutane overgang het weefsel weggeknipt.
Figuur 6. Excisie van de mucocutane overgang van de vulva (uit Ricketts and Curnow, 1988).
Ter hoogte van deze excisieplaats bracht de dierenarts de hechting
aan.
Hij
benutte
hiervoor
niet-resorbeerbaar
hechtmateriaal (Polyglactine 910). De hechting start vanaf de e
dorsale commissuur en eindigt aldus op ongeveer 2/3 van de vulvalengte. Het betrof een doorlopende hechting met achterhaling.
Figuur 7. Plaatsen van de hechting (uit Ricketts and Curnow, 1988).
Nabehandeling: In principe is bij deze procedure geen nabehandeling noodzakelijk. Alvorens de merrie in partus gaat zal deze hechting verwijderd moeten worden.
23
2.3. ANALYSE VAN STRUCTUUR EN MANAGEMENT PRAKTIJK GROTE HUISDIEREN
Voorgeschiedenis: de kliniek is ontstaan uit een kleine praktijk met 2 dierenartsen. Deze dierenartsen behandelden niet enkel paarden maar ook gezelschapsdieren en runderen. In hetzelfde dorp was er een tweede dierenkliniek aanwezig. Vanaf 2000 zijn deze klinieken gefusioneerd en sinds slechts een paar jaar is elke dierenarts diersoortspecifiek gaan werken. De kliniek bestaat nu uit een gezelschapsdieren-, rundvee- en paardenafdeling op afzonderlijke locaties. De paardenafdeling bestaat nu uit 7 dierenartsen, 7 assistentes, 3 medewerkers en 2 interns; men kan er zowel voor eerstelijns als tweedelijns diergeneeskunde terecht.
Rechtsvorm van de onderneming en samenwerkingsverbanden: Het betreft een maatschap. Het maatschap van de paardenafdeling bestaat uit 7 dierenartsen die zich voor een bepaald bedrag hebben ingekocht. Meestal bedraagt dit een jaarloon. Het maatschap komt 1 maal per maand samen. Zij spreken zich uit over grote beslissingen en stippelen het beleid uit. Verder bestaat er een dagelijks bestuur (MT) samengesteld uit één dierenarts uit elke afdeling. Zij komen 1 maal per week samen. Kleinere beslissingen zoals het aannemen van personeel valt onder hun verantwoordelijkheid. Binnen elke afdeling (administratie, paard, rundvee en gezelschapsdieren) vinden verder ook afzonderlijke vergaderingen plaats: o
Paard: Dierenartsenoverleg: 1 maal per week. Werklunch: 1 maal per 2 weken. Assistentenoverleg: 1 maal per kwartaal.
o
Rund: Dierenartsenoverleg: 1 maal per week.
o
Gezelschapsdieren (GD): Dierenartstenoverleg: 1 maal per 2 weken. Assistentenoverleg: 1 maal per kwartaal.
Maatschap
Dagelijks Bestuur (MT)
Administratie
Paard
Rundvee
Assistentes
Assistentes
Figuur 8. Aansturing en overlegstructuur.
24
Gezelschapsdieren (GD)
Toekomstplannen: Er zijn concrete plannen om alle afdelingen te fusioneren en onder te brengen in één gebouw. Dit gebouw zou gelegen zijn aan de rand van de stad. Er is nu namelijk een nijpend tekort aan ruimte, vooral bij de paardenafdeling. Men streeft naar een groter stallencomplex, een aparte quarantaine-afdeling, meer opvoelboxen, een extra recoverybox en een eigen binnenpiste. Momenteel wordt een binnenpiste gehuurd bij een bevriende manège. De opbrengsten worden gedeeld over alle afdelingen, maar wel percentagegewijs gesplitst. De reden waarom er nu voornamelijk geïnvesteerd zal worden in de paardenafdeling is om dat deze afdeling de grootste bron van inkomsten vormt.
Werkschema en verloning: Per kwartaal wordt een rooster opgesteld met betrekking op het weekendwerk. Eén dierenarts per sector is hiervoor verantwoordelijk. Verder heeft elke dierenarts één vaste dag in de week dienst, samen met een assistente en eventueel intern. De 2 interns zijn elk om de beurt in het weekend beschikbaar. De dierenartsen hebben een vast salaris voor de gewerkte uren, niet afhankelijk van het aantal behandelde patiënten. Dit zou men in de toekomst willen veranderen. Openingsuren:
o
Balie & apotheek: ma t/m vrij 8.00 - 17.00 uur.
o
Onderzoek & behandeling op afspraak: ma t/m vrij 8.00 - 17.00 uur.
o
Vrij spreekuur: ma t/m vrij 8.00 - 9.00 uur en 13.30 - 14.00 uur.
o
Opgeven visites: ma t/m zat 8.00 - 9.00 uur.
o
Noodgevallen: 24u/24u; 7dagen op 7.
Software: De dierenkliniek maakt gebruik van Viva. Dit systeem is echter verouderd en voldoet niet helemaal meer aan de wensen. Voornamelijk het boekhoudprogramma is moeilijk en omslachtig. Men wenst binnenkort over te schakelen op Easyvet of Animana. Elke afdeling heeft toegang tot alle bestanden.
Extra o
Infosessies voor de klanten: Ongeveer 1 maal per jaar bieden de verschillende afdelingen een uitgebreide infosessie aan. Deze infosessies bestaan uit lezingen over de meest actuele onderwerpen. Er worden niet enkel lezingen gehouden voor het cliënteel maar ook voor collega-dierenartsen.
o
Opleidingen en bijscholing: De dierenartsen krijgen de mogelijkheid om op kosten van de kliniek bijscholingscursussen te volgen. Elk jaar krijgt elke dierenarts een specifiek bedrag aangeboden. Indien men een groter budget wenst te besteden wordt dit voorgelegd aan het dagelijks bestuur. Zij beslissen of dit extra budget wordt toegekend. De betreffende dierenarts is in dat geval wel verplicht gedurende een
25
bepaald periode werkzaam te blijven in de kliniek. Indien deze voorwaarde geschonden wordt, is de dierenarts verplicht een deel van het budget terug te betalen. o
Erkend stagebedrijf in Nederland: Om als stagebedrijf te worden erkend moet de kliniek aan bepaalde voorwaarden voldoen. De stagebegeleiders moeten een cursus volgen en de stagiair(e) dient een logboek bij te houden. Op die manier garandeert men dat bepaalde leerdoelen bereikt worden. Men kan het als een kwaliteitsmerk beschouwen.
o
Public Relations: Elke afdeling beschikt over een eigen website. Ook hier speelt men met het idee om de website in een nieuw jasje te steken. De vernieuwde website wordt meer interactief. Men wil graag een soort logboek creëren met leuke verhaaltjes om potentiële klanten te lokken en op die manier ook meer vertrouwen uitstralen. Verder wil men gebruik maken van de nieuwe media zoals Facebook en Twitter. De kliniek werkt bovendien ook samen met een bekend paardentijdschrift. Elke maand publiceert één van de dierenartsen van de paardenafdeling een artikel over een hot topic.
Sterke en zwakke punten: o
Sterke
punten:
goed
bereikbaar,
infrastructuur. o
Zwakke punten: ruimtegebrek.
26
kwalitatief
goede
dierenartsen,
moderne
3. ALGEMENE REFLECTIE
Globaal geëvalueerd zijn beide stage, zowel grote huisdieren als gezelschapsdieren, door mij als zeer aangenaam ervaren. Uiteraard is er een groot verschil tussen de twee praktijken. Onderling zijn ze op managementsniveau bijna niet te vergelijken. De ene stageplaats betrof een goed geoliede dierenkliniek, gespecialiseerd in paarden, de andere een kleinschaligere éénmanspraktijk voor gezelschapsdieren en occasioneel een schaap of paard. Daar mijn hart vooral uitgaat naar de grote huisdieren, meerbepaald het paard, hoef ik niet te verduidelijken waarom de stage op de paardenkliniek door mij meer werd gesmaakt. Ik dien echter op te merken dat ook de stage bij de gezelschapsdieren door mij als leerzaam werd ervaren.
De gezelschapsdierenpraktijk
De dierenarts van de éénmanspraktijk is een uitstekende didacticus én clinicus. Hij heeft heel veel ervaring en door de gesprekken, meestal gevoerd achter het stuur op weg naar de volgende klant, kan ik mij een beter beeld vormen van een dierenartsenpraktijk zoals ze is in de realiteit.
Zo ben ik onder andere tot het besef gekomen dat men niet altijd in staat is een om bij elke patiënt een uiteindelijke diagnose te bekomen. Soms moet men zich erbij neerleggen dat men in de eerstelijns diergeneeskunde over onvoldoende diagnostische middelen beschikt om op elke klinisch symptomenbeeld een exact etiket te kleven. Zo zal men bij een hondje met bijvoorbeeld een hoest als gevolg van tracheïtis voornamelijk symptomatisch behandelen. De exacte kiem hoeft daarom niet meteen te worden aangetoond. Wanneer men zich nog op de schoolbanken bevindt en geen notie heeft van de praktijk, is men geneigd te denken dat de dierenarts bij elke patiënt een exacte pathogenese kan achterhalen. Met die ingesteldheid ben ik dan ook aan deze stage begonnen; de dierenarts spit alle problemen uit tot op het bot en tovert dan miraculeus de énige en echte diagnose uit zijn mouw. Niets is echter minder waar, men moet kunnen leven met het idee dat sommige zaken opgelost kunnen worden zonder de precieze oorzaak te kennen. Dit is zeker het geval voor een eerstelijns praktijk, veel hangt namelijk af van de diagnostische middelen waarover de dierenarts beschikt en zijn capaciteiten op dat vlak. Uiteraard ligt de situatie volledig anders wanneer men over uitgebreide infrastructuur beschikt, zoals het geval was in de paardenkliniek. Hier kan men meteen een bloedonderzoek, mestonderzoek, bronchiaal spoelsel, endoscopisch of echografisch onderzoek uitvoeren. De klanten die naar deze kliniek komen, zijn vaak ook bereid om voor deze onderzoeken te betalen. Dit zorgt er natuurlijk voor dat men vaker tot een exacte diagnose kan komen. Uit dit betoog mag niet worden afgeleid dat de éénmanspraktijk over geen diagnostische middelen beschikt! Dierenarts X van de gezelschapsdierenpraktijk werkt samen met een 4-tal andere dierenartsen. Dit heeft als voordeel dat er gemeenschappelijk gebruik is van bepaalde apparatuur, maar ook dat de dierenarts ten allen tijde ten rade kan gaan bij een collega. Deze collega heeft dan bijvoorbeeld een specifieke opleiding genoten op het vlak van echografie. Op die manier worden ieders tekorten aangevuld teneinde de patiënten een betere service te kunnen bieden. Dierenarts X en zijn collegae
27
hebben dan ook concrete plannen om een klein dierenartsencentrum uit te bouwen en aldus de krachten te bundelen op één locatie. “Niet
enkel
de
patiënt
is
van
belang!”:
een
uitspraak
van
Dierenarts
X
van
de
gezelschapsdierenpraktijk. Reeds de eerste stagedag werd ik er door hem al op attent gemaakt dat niet enkel het dier maar ook de eigenaar een belangrijke rol speelt. Dit is niet enkel het geval in de kleine huisdierensector maar dit fenomeen is ook gebleken in de paardenkliniek. De klanten zijn steeds beter geïnformeerd en beschikken over verschillende media zoals het internet. Het is dus geen uitzondering dat men steeds vaker “googelt” naar de klachten van het troeteldier. Men moet aldus over een gezonde dosis tact en empathie beschikken om zowel patiënt als eigenaar tevreden te houden. Dierenarts X van de gezelschapsdierenpraktijk gaat er prat op om bij elk huisbezoek even met de eigenaar rond te tafel te gaan zitten, gezellig een kopje koffie te drinken, terwijl men de aandoening, behandeling en eventueel nog wat ditjes en datjes bediscussieert. Voor hem is dit een vorm van public relations en een manier om de klanttevredenheid te garanderen. Deze quality time veruitwendigt zich in minder huisbezoeken per uur maar de dierenarts is zeer gerespecteerd en geliefd bij zijn klanten. Dierenarts X heeft in het verleden zijn activiteiten als dierenarts even stop gezet, maar toen het de ronde deed dat hij terug in het zadel zat, zijn de meeste van zijn oude klanten bij hem teruggekeerd. Een veeg teken dat klanttevredenheid een belangrijke rol speelt in het slagen van een praktijk. Een minpunt aan deze vorm van praktijkvoeren is dat dierenarts X zijn klanten dan weer teveel in de watten legt. Wanneer een eigenaar bijvoorbeeld een geneesmiddel of zak voeding nodig heeft, maakt dierenarts X te snel de belofte om het bij de persoon thuis af te leveren „wanneer hij daar eens langs moet‟. De klant gaat er vervolgens van uit dat het gevraagde reeds binnen de dag, maximum 2 dagen, bij hem op de stoep ligt. Dit is voor dierenarts X praktisch en economisch niet interessant. Een betere aanpak zou zijn om de klant op de hoogte te brengen dat het pakket beschikbaar is en kan worden afgehaald tijdens het spreekuur. De klant hoeft hiervoor niet op consultatie komen maar kan het pakket afhalen bij de secretaresse of iemand van het huisgezin. Ik moet vermelden dat deze vorm van praktijkvoeren misschien niet de meest ideale is, maar dierenarts X is tevreden binnen dit systeem, net als de meeste van zijn klanten. In een éénmanspraktijk legt iedere bedrijfsvoerder zijn eigen accenten. Ikzelf kan mij zeker vinden in het systeem van de samenwerking met de andere dierenartsen. Een dergelijke wisselwerking kan enkel voordelen met zich meebrengen.
De paardenkliniek
De dierenkliniek daarentegen heeft aanleiding gegeven tot een volledig andere ervaring. Het betreft een kliniek met 7 dierenartsen, 7 assistenten, 3 medewerkers en 2 interns. Het spreekt voor zich dat het er hier organisatorisch compleet anders aan toe gaat. Elke dierenarts krijgt elke week een assistent toegewezen die hem assisteert in zijn dagelijkse bezigheden. De boekhouding wordt volledig voor de rekening genomen van een praktijkmanager, die dierenarts hoeft zich enkel te concentreren op het diagnosticeren en genezen. Hij heeft hiervoor alle denkbare tools voor handen. Alhoewel het
28
hier gaat om een grootschaliger bedrijf met tal van persoonlijkheden blijft de werksfeer heel aangenaam. Er worden geregeld werklunchen georganiseerd waarbij iedereen kan vertellen wat op zijn/haar lever ligt. Deze kliniek heeft een uitstekende reputatie opgebouwd en niet zonder reden. De 7 dierenartsen hebben elke hun specialiteit dus praktisch iedereen kan hier terecht. Het enige waar men niet over beschikt is een CT en MRI toestel, maar dat is geen gemis. Bovendien is de kliniek als stagebedrijf erkend in Nederland. Dit biedt tal van voordelen voornamelijk voor de student. De begeleiders hebben een opleiding genoten, er is een vast draaiboek waardoor gegarandeerd wordt dat alle leerdoelen zullen worden gehaald. Bovendien beschikt de kliniek over enkele standmerries en bloeddonoren zodat er altijd ruimte is voor de student om verbanden te leren aanlegen, slokdarmsondes en katheders te plaatsen. Er hoeft geen twijfel te bestaan dat dit een uiterst leerrijke stage was.
Globaal beeld
Er moeten echter ook een paar mindere facetten aan deze stage worden vermeld. Het is het eerste jaar dat men dit stageconcept organiseert voor studenten in de masterjaren. Ikzelf heb deze stage e
e
e
afgelegd in de vakantieperiode tussen 1 en 2 master. Ik had toen net de examens van 1 master achter de rug. Dit heeft echter enkel op vlak van tijdsbesteding in mijn voordeel gewerkt. Na het eerste masterjaar te hebben afgewerkt heeft men nog onvoldoende kennis en inzicht verworven in de ziekteleer, heelkunde en verloskunde om vlot mee te helpen in de praktijk. Ik moest de dierenartsen in de paardenkliniek er voortdurend op attent maken dat ik nog maar net mijn eerste masterjaar had afgewerkt. Dit houdt in dat mijn kliniekervaring nog nagenoeg onbestaande was. Men is amper geïntroduceerd geweest in de kliniekomstandigheden op de faculteit. De stagebegeleider verwacht van de stagiaire echter meer, aangezien zij voornamelijk studenten aangeboden krijgen uit het laatste e
jaar. Nu ik mijn 2 masterjaar bijna heb beeïndigd, heb ik een beter klinisch inzicht en zal voor mij een dergelijke stage veel interessanter worden. Uiteraard kan men voorheen al veel leren, maar persoonlijk heb ik nood aan een theoretische kennis om wat ik zie te kunnen onthouden. De dierenarts heeft echter niet altijd de tijd om alles zeer uitgebreid uit te leggen: bijvoorbeeld wanneer men een kattin steriliseert, is het interessant om al eens wat uitleg gekregen te hebben over de hechttechnieken, hechtmaterialen en anesthesie om zo een compleet beeld te krijgen. Hoewel het voornaamste doel van deze stage is een kennismakingsstage is en vooral een manier om de studenten gefundeerd te laten kiezen tussen kleine en grote huisdieren, wordt deze stage niet op een dergelijke manier beoordeeld door de stagebegeleider. Op het evaluatieformulier moet de stagebegeleider namelijk een mening vormen over de kennis en vaardigheden van de student. Wanneer een student nog geen kennis heeft over hechtmaterialen, anesthesie, verloskunde of ziekteleer dan heeft de dierenarts de neiging om de kennis van de student als onvoldoende te bestempelen, terwijl deze stage enkel als doel heeft om de praktijk te leren kennen. Misschien moet er beter gecommuniceerd worden wat nu precies de leerdoelen zijn van een dergelijke stage.
29
4. LITERATUURLIJST
Hedlund C.S. (2002): Surgery of the reproductive and genital systems. In: Fossum T.W. (Editor): Textbook of Small Animal Surgery. 2nd edition. Mosby, St. Louis, Missouri, p. 617– 618.
Ricketts S.W., Curnow W.M. (1988). Caslick‟s vulvoplasty for the correction of pneumovagina in mares. In practice 10, p. 204-208.
Recipet: Http://www.recipet.be/images/scr_recipet/Recipet_002.jpg. Geconsulteerd op 20 februari 2011.
30
