UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2009-2010

HISTOLOGISCHE STUDIE NAAR DE NORMALE KERATINISATIE VAN DE HUID TIJDENS DE FOETALE ONTWIKKELING BIJ HET RUND door Philippe GELAUDE

Promotor: Dr. P. Cornillie

Onderzoek in het kader van de Masterproef

WOORD VOORAF Ik had graag iedereen bedankt die mij geholpen en gesteund heeft in het afwerken van dit onderzoek. Op de eerste plaats mijn promotor die mij begeleid en gecorrigeerd heeft, waardoor dit werk zijn uiteindelijke vorm kreeg. Daarnaast bedank ik ook mijn ouders, mijn broer en mijn schoonzus voor de steun en het herhaaldelijk nalezen. Tevens ben ik ook mijn vriendin dankbaar, omdat zij steeds zorgde voor een opkikker indien nodig.

INHOUDSOPGAVE Samenvatting

1

1. Inleiding ............................................................................................................................................... 2 2. Materiaal en methoden ...................................................................................................................... 4 2.1. Bioptname .................................................................................................................................... 4 2.2. Histologische technieken ............................................................................................................. 4 2.2.1. Lichtmicroscopie.................................................................................................................... 4 2.2.2. Scanning elektronen microscopie ......................................................................................... 6 2.3. Resultaten..................................................................................................................................... 9 3. Discussie ............................................................................................................................................ 15 4. Literatuurlijst ..................................................................................................................................... 16 5. Bijlagen .............................................................................................................................................. 17 5.1. Data foeti .................................................................................................................................... 17

De auteur en de promotor geven de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingenvan het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). Het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

SAMENVATTING De doelstelling van dit uitgevoerde onderzoek is het achterhalen van het keratinisatietijdstip van de huid bij de foetus van het rund. Hiervoor werden 17 drachtige baarmoeders verzameld in het slachthuis. De leeftijden van de foeti varieerden van 54 dagen tot 247 dagen. Naargelang de uiterlijke kenmerken van de foetus werden huidstalen genomen van de flank, de kroonrand, de navelhuid, de mucocutaneuze overgang van de lip, het ooglid en het hoofd. Vervolgens zijn de huidbiopten lichtmicroscopisch en elektronenmicroscopisch onderzocht. De eerste tekenen van verhoorning zijn te zien als subperidermale hoornparels. Deze parels treden achtereenvolgens op ter hoogte van mucocutaneuze overgang (dag 116), navelhuid (dag 134), flank en kroonrand (dag 164). Lichtmicroscopisch kan het stratum corneum onderscheiden worden van de andere cellagen vanaf dag 164 ter hoogte van de mucocutaneuze overgang van de lip. Ter hoogte van de andere regio’s is dit stratum pas te zien vanaf dag 184. Op dag 222 is over het volledige lichaam een volwaardig verhoornd plaveiselepitheel aanwezig. Elektronenmicroscopisch is er reeds huidschilfering zichtbaar ter hoogte van de flank op dag 191. Uit het onderzoek is gebleken dat het tijdstip van keratinisatie afhankelijk is van de lichaamsregio. Tevens kan men door elektronenmicroscopie reeds vroeger tekenen van verhoorning waarnemen dan met lichtmicroscopie.

1

1. Inleiding De huid of tegument vormt het grootste orgaan van het lichaam en fungeert hoofdzakelijk als een barrière die de onderliggende weefsels beschermt tegen dehydratatie, schadelijke stoffen en kiemen vanuit de omgeving. Het tegument kan worden opgedeeld in drie lagen die elk een typische bouw en functie vertonen. Achtereenvolgens onderscheidt men de oppervlakkige epidermis of opperhuid, de dermis of lederhuid en de onderliggende hypodermis of subcutis (Junqueira en Carneiro, 2004).

De epidermis is van ectodermale afkomst (Sinowatz, 1991; Junqueira en Carneiro, 2004). Aanvankelijk bestaat deze opperhuid enkel uit een stratum basale. Deze enkelvoudige laag kubische cellen zal prolifereren met de vorming van een tweede bovenliggende laag afgeplatte cellen of periderm (zie Fig. 1). Naarmate de basale cellen verder vermenigvuldigen bekomt men een drielagig epiderm bestaande uit het bovenliggende epiderm, het stratum intermedium en het onderliggende stratum basale. Het stratum intermedium zal het grootste deel uitmaken van de epidermis (zie fig. 2A).

Tijdens de tweede helft van de dracht zal bij zoogdieren het stratum intermedium en het stratum basale onder invloed van TGF-α verder differentiëren (Sinowatz, 1991; McGeady et al., 2006). Van basaal naar het oppervlak van de huid toe kan men nu achtereenvolgens het stratum basale, spinosum, granulosum en corneum onderscheiden (Haake en Holbrook, 1999; Junqueira en Carneiro, 2004). Tegelijkertijd zullen de peridermale cellen – die tot dan toe nog steeds de meest oppervlakkige laag vormden – apoptose ondergaan en wordt het periderm volledig vervangen door het stratum corneum (zie Fig. 2B en Fig. 3). Door deze verhoorning is er geen uitwisseling meer mogelijk van water en elektrolyten tussen de opperhuid en het amnionvocht (Sinowatz, 1991; McGeady et al., 2006). Volgens Sinowatz (1991) treden de eerste tekenen van verhoorning op tijdens het laatste trimester van de dracht. De epidermis zal daarenboven beschermd worden tegen de inwerking van het amnionvocht door de vernix caseosa. Deze witte slijmerige massa ontstaat doordat de afgeschilferde cellen van het stratum corneum zich vermengen met het secreet van de huidklieren (Sinowatz, 1991).

De dermis en hypodermis ontstaan allebei uit het mesoderm en zijn slechts van elkaar te onderscheiden vanaf de ontwikkeling van de haren (Sinowatz, 1991). De vorming van de haarfollikels vindt plaats van dag 77 tot dag 166 van de prenatale ontwikkeling. Pas van dag 200 in utero zijn de haren van de eerstgevormde haarfollikels zichtbaar (Lyne en Heideman, 1958).

Het doel van dit onderzoek is een beter inzicht te verwerven in de embryonale ontwikkeling van de huid bij het rund. Meer specifiek het achterhalen van het keratinisatietijdstip van het tegument. Indien geweten is op welk tijdstip de verhoorning plaatsvindt kan deze als mogelijk richtpunt worden gebruikt om prenataal keratinisatiestoornisen op te sporen (Gelaude, 2009).

2

Fig. 1 : Schematische weergave van de ontwikkelende huid. Het tegument ontstaat als een éénlagige ectodermale laag (A) die zal proliferren tot het tweelagig epiderm (B) bestaande uit het periderm en onderliggend ectoderm. (uit McGeady et al., 2006)

Fig. 2: Schematische weergave van de ontwikkelende huid waarbij het tweelagig epiderm verder differentieert tot het drielagig epiderm. Dit drielagig epiderm bestaat uit het oppervlakkige periderm en het onderliggende stratum intermedium en stratum basale (A). In een volgend stadium van de ontwikkeling zal het periderm afschilferen en het stratum intermedium differentieren (B). (uit McGeady et al., 2006)

Fig. 3: Schematische weergave van de typische epitheliale lagen waarbij het periderm volledig is vervangen door het stratum corneum. (uit McGeady et al., 2006)

3

2. Materiaal en methoden 2.1. Bioptname In het runderslachthuis te Zele werden drachtige baarmoeders opgehaald. Deze zijn vervolgens ingesneden op de faculteit diergeneeskunde te Gent waarbij de foeti volgens grootte gerangschikt werden. De leeftijd van de foeti is achteraf bepaald op basis van hun kruin-stuit lengte. De kruin-stuit lengte is de rechte gemeten vanaf de kruin van het foetale rund tot aan zijn stuit. Vervolgens werd de lengte

omgerekend

naar

de

foetale

leeftijd

met

behulp

van

de

calculator

op

http://www.ansci.wisc.edu/jjp1/ansci_repro/lab/lab12_03/crown-rump_analysis3.html.

Afhankelijk van de uiterlijke kenmerken werd van elke foetus vier tot zes huidbiopten genomen (zie bijlage 5.1.). Deze stalen zijn voornamelijk afkomstig van de huidregios waar reeds tekenen van beharing te zien waren. Tevens is er steeds een staal genomen van de flank (m.u.v. foetus 2 en 3) die meestal nog niet behaard was. Dit maakt het mogelijk om keratinisatieverschillen met de behaarde huiddelen aan te tonen. Naargelang de histologische techniek bewaart men de foetale biopten in het geschikte medium, nl. formaldehyde voor lichtmicroscopie en HEPES buffer met glutaraldehyde voor Scanning Electronen Microscopie (SEM).

2.2. Histologische technieken 2.2.1. Lichtmicroscopie Voor lichtmicroscopie is er geopteerd voor twee histologische kleuringen van de staalnamen, nl. een Hematoxyline-Eosine (HE) en een Performic Acid Alciaan Blue (PAAB) kleuring. De voorbereiding van de biopten is echter voor beide kleuringen gelijk. Weefsel bestaat hoofdzakelijk uit water. De biopten dienen echter opgeblokt te worden in paraffine. Het grote nadeel van paraffine is dat deze slecht oplosbaar is in water. Het is dan ook van groot belang dat zoveel mogelijk vocht wordt verdreven uit de staalnames. Om een zo goed mogelijke dehydratatie te bekomen werd er gebruik gemaakt van de dual tissue processor STP 420D (Microm International/Thermo Fisher, Duitsland). Hierin worden de stalen tijdens een overnachtprogramma, achtereenvolgens ondergedompeld in een alcoholbad van respectievelijk 50%, 70%, 85%, 96% en 100%. Vervolgens wordt de alcohol verdreven uit het weefsel d.m.v. xyleen dat op zijn beurt wordt vervangen door paraffine. Na dit proces werden de biopten m.b.v. de Microm EC350-1 (Microm International/Thermo Fisher, Duitsland) opgeblokt in paraffine. Nadat de paraffine is opgesteven kunnen coupes met een dikte van acht micrometer gesneden worden met de microtoom. In dit onderzoek werd er gebruik gemaakt van de HM 360 (Microm International/Thermo Fisher, Duitsland). Vervolgens werden de weefselsneden in een bad gelegd met een gelatineoplossing (48°C). Op die manier vindt er een goede weefselstrekking plaats en verbetert de fixatie van de coupe aan het draagglas.

4

Van elk biopt werden twee coupes gemaakt per kleuring.

HE-kleuring: Voor het uitvoeren van de HE-kleuring werd er gebruik gemaakt van de Linear stainer II (Sakura finetek europe B.V., Nederland). Hierbij ondergaan de coupes volgende stappen:

1

3x 1minuut 45 seconden in xyleen

2

2x 1minuut 45 seconden in alcohol 100%

3


4


5

1x 1minuut 45 seconden in leidingwater

6

3x 1minuut 45 seconden in hematoxyline

7


8

3x 1minuut 45 seconden in eosine

9


10


11


12


13


14

3x 1minuut 45 seconden in xyleen

15

monteren van coupes m.b.v. DPX

PAAB-kleuring: Deze histologische kleuring is een specifieke kleuring om keratinisatie aan te tonen. De intensiteit van de blauwkleuring is evenredig met de concentratie aan disulfide dat aanwezig is in keratine.

Voorbereiding: Permierenzuur oplossing: 40 ml 98% mierenzuur 4 ml 100 vol. waterstofperoxide 0.5 ml geconcentreerd zwavelzuur

Alciaan blauw oplossing: 1g Alciaan blauw 2.7 ml 98% zwavelzuur 47.2 ml gedistilleerd water

5

Methode: 1

coupes onderdompelen in water en afdeppen

2

5 minuten in permierenzuur oplossing

3

10 minuten spoelen met leidingwater

4

drogen in de oven op 60°C

5

besprenkelen met leidingwater

6

1 uur in Alciaan blauw oplossing

7

Spoelen met leidingwater

8

contrastkleuring

met

neutraal

rood

indien

gewenst 9

spoelen met leidingwater

10

dehydratatie via alcoholbaden

11

onderdompelen in xyleen

12

monteren van coupes m.b.v. DPX

2.2.2. Scanning elektronen microscopie De scanning elektronenmicroscoop werkt op basis van een bundel elektronen gecondenseerd door magnetische lenzen die invallen op de biopten. De secundaire elektronen - uitgezonden door het staal ten gevolge van de invallende elektronenbundel – worden gedetecteerd, gescintilleerd en vervolgens vermenigvuldigd door een foto-multiplier. De elektronen die de foto-multiplier verlaten worden omgezet tot een fotografisch beeld dat ons informatie verschaft over het oppervlak van het biopt (Kessel en Shih, 1974). (zie Fig. 4).

Fig. 4: Schematische weergave van de elektronoptische kolom van de SEM ( Bron: http://www.purdue.edu/REM/rs/sem.htm)

6

De werkwijze voor scanning elektronenmicroscopie kan men opdelen in drie fasen; de voorbereiding van de stalen, het “kritisch punt drogen” en metaalsputteren.

Voorbereiding:

1

weefsel verkleinen tot een maximum grootte van 0.5cm²

2

overnacht fixeren in HEPES-buffer met glutaraldehyde

3

3x 10 minuten wassen in Aqua Dest

4

postfixatie, 2 uur in 1% Osmiumtetroxide bij kamertemperatuur

5

3x 10 minuten wassen in Aqua Dest

6

dehydratatie in alcohol / aceton: 20 Minuten in alcohol 50% alcohol 70% alcohol 80% alcohol 96% (gedenatureerde) alcohol 96% / aceton (verhouding 50/50) alcohol 96% / aceton (verhouding 30/70) alcohol 96% / aceton (verhouding 10/90)

7

overnachten in aceton

“Kritisch punt drogen”: Zoals reeds beschreven hierboven, genereert de vacuümpomp van de elektronenmicroscoop een constant vacuüm in de bioptkamer. Hierdoor werken sterke vervormingskrachten in op het weefsel waarbij verdamping van het vocht optreedt. Tevens zal het biopt bevriezen als niet al het water uit het specimen is verdreven. De vorming van ijskristallen en de inwerkende krachten leiden tot onherroepelijke schade aan de cellen waardoor de bekomen topografische beelden van de SEM waardeloos zijn (Kessel en Shih, 1974). “Kritisch punt drogen” maakt het echter mogelijk om al het vocht uit het staal te verdrijven, zonder een wijziging in de oorspronkelijke structuur van de cellen en het weefsel aan te brengen (Kessel en Shih, 1974; Nowell en Pawley, 1980). Deze methode is gebaseerd op het feit dat een bepaalde vloeistof boven zijn kritisch punt overgaat naar de gasfase zonder enige vervormingskrachten (Kessel en Shih, 1974).

In onderstaande fasediagram (zie Fig. 5) wordt weergegeven hoe de materie in zijn vloeibare fase wordt gescheiden van zijn gasfase door de evaporatie-stoomcurve (blauwe lijn). Deze curve is niet oneindig en eindigt bij een welbepaalde druk en temperatuur. Dit punt is het kritische punt waarboven geen onderscheid meer kan gemaakt worden tussen vloeistof en gas (Walker, 2004).

7

Fig. 5: Schematische weergave van het kritisch punt en de evaporatiestoomcurve van materie in een fasediagram (Bron: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Phase- 1)

Voor het “kritisch punt drogen” wordt er gebruik gemaakt van een Balzers CPD 030 (Balzers, Liechtenstein). 1) De biopten worden in de specimendrukkamer gebracht. Het is van belang dat de biopten ondergedompeld zijn in aceton om het drogen aan de lucht te voorkomen (Kessel en Shih, 1974) 2) De specimenkamer wordt afgesloten en vloeibare 𝐶𝑂2 wordt toegelaten om de aceton in de biopten te vervangen door 𝐶𝑂2 dat reeds een kritisch punt heeft bij 31 °C en 73.9 * 10³ hPa (Kessel en Shih, 1974; Nowell en Pawley, 1980). De specimenkamer dient kouder te zijn dan het 𝐶𝑂2 -opslagvat. Op die manier voorkomen we dat het koolstofdioxide overgaat van vloeistof naar gas beneden zijn kritisch punt en zo de evaporatie-stoomcurve zou doorbreken (Nowell en Pawley, 1980). 3) Voor een betere menging van het aceton met 𝐶𝑂2 wordt er 15 minuten geroerd (Nowell en Pawley, 1980). 4) Het 𝐶𝑂2 -aceton mengsel wordt bijna volledig verwijderd uit de specimenkamer, waarna stap 1 tot en met 4 wordt herhaald tot het aceton volledig is vervangen door koolstofdioxide (Kessel en Shih, 1974; Nowell en Pawley, 1980). 5) Indien het aceton volledig is vervangen wordt de specimenkamer opgewarmd tot 40 °C. Hierdoor wordt het kritisch punt van 𝐶𝑂2 overschreden. Tevens zal de druk in de kamer stijgen tot 103.4 * 10³ hPa (Kessel en Shih, 1974; Nowell en Pawley, 1980). 6) Vervolgens wordt de druk in de specimenkamer verlaagd. Dit dient traag te gebeuren om vervorming van het biopt ten gevolge van decompressie te beperken (Kessel en Shih, 1974; Nowell en Pawley, 1980).

8

Metaalsputteren: Om een maximum aan topografische informatie te bekomen dient het biopt gecoat te worden met een metaal. Dit metaal (goud of platina) zorgt voor een toename van de hoeveelheid secundaire elektronen die gevormd worden (Nowell en Pawley, 1980). In het kader van dit onderzoek werd er gewerkt met de JFL-1300 auto fine coater (JEOL, Japan) en gesputterd met platina.

1

plaats

de

gedroogde

stalen

op

een

specimenhouder 2

plaats de specimenhouders in de sputteraar en sluit de kamer af

3

schakel het toestel in en start de cyclus bij 40mA/Pa

4

na 60 seconden sputteren kan het toestel worden uitgeschakeld en de stalen verwijderd uit de sputteraar

5

de stalen kunnen bekeken worden onder de SEM

2.3. Resultaten De resultaten worden besproken per histologische techniek en plaats van staalname.

Lichtmicroscopie: Alle coupes werden bekeken met een Olympus BX61 (Olympus, Japan). Tabel 1. Lichtmicroscopische resultaten van de huidbiopten.

Fnr

FL

BPl

TCL

(dagen)

Str.

Str. I.

B.

(CL)

Per.

Subp.

Str.

HP

C.

1

54

2

68

MCO lip

5

Ja

3

Ja

Nee

Nee

3

70

MCO lip

9

Ja

7

Ja

Nee

Nee

4

83

Fl

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

OL

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

MCO lip

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

Fl

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

NH

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

OL

4-7

Ja

2-5

Ja

Nee

Nee

MCO lip

7

Ja

5

Ja

Ja

Nee

Fl

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

OL

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

MCO lip

5

Ja

3

Ja

Nee

Nee

5

6

96

99

Opmerkingen

n.b.

Zie Fig. 6

9

7

116

Fl

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

NH

4-5

Ja

2-3

Ja

Nee

Ja

Naargelang de plaats is Per.

of

celkernen

Str.

C.

met

aanwezig

(zie

Fig.8)

8

9

10

11

116

125

128

134

KR

14

Ja

12

Ja

Nee

Nee

MCO lip

6-10

Ja

4-8

Ja

Ja

Nee

Fl

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

NH

4

Ja

2

Ja

Nee

Nee

OL

4-5

Ja

2-3

Ja

Ja

Nee

MCO lip

6-8

Ja

4-6

Ja

Ja

Nee

Fl

5

Ja

3

Ja

Nee

Nee

NH

5

Ja

3

Ja

Nee

Nee

KR

9

Ja

7

Ja

Nee

Nee

MCO lip

8

Ja

6

Ja

Nee

Nee

Fl

5

Ja

3

Ja

Nee

Nee

NH

5

Ja

3

Ja

Nee

Nee

KR

8

Ja

6

Ja

Nee

Nee

MCO lip

8

Ja

6

Nee

Nee

Ja

Fl

5

Ja

3

Ja

Nee

Nee

NH

5

Ja

3

Ja

Ja

Nee

KR

9

Ja

7

Ja

Nee

Nee

OL

6

Ja

4

Ja

Nee

Nee

Afplatting celkernen Str. I.

MCO lip

6-7

Ja

4-5

Ja

Nee

Nee

Eosinofiele

Eosinofiele korreling Str. I.

Eosinofiele korreling Str. I. Str. C. met celkernen

korreling

en

afplatting celkernen Str. I. 12

164

Fl

5-6

Ja

3-4

Ja

Nee

Nee

NH

5

Ja

3-4

Ja

Nee

Nee

KR

11

Ja

9

Ja

Ja

Nee

MCO lip

6-7

Ja

4-5

Ja

Nee

Ja

Eosinofiele korreling

Sommige

plaatsen

verhoornd plaveiselepitheel 13

184

Fl

6

Ja

4

Ja

Ja

Nee

Ho

5-6

Ja

3-4

Ja

Nee

Ja

Naargelang de plaats is Per. of Str. C. aanwezig

NH

6

Ja

4

Ja

Nee

Nee

KR

6

Ja

5

Nee

Nee

Ja

OL

4-6

Ja

2-5

Ja

Ja

Ja

Eosinofiele korreling

Naargelang de plaats is Per.

of

Str.

C.

celkernen aanwezig MCO lip

5

Ja

3

Nee

Nee

Ja

Str. C. met celkernen

10

met

14

191

Fl

6-7

Ja

4-5

Ja

Nee

Nee

Eosinofiele

korreling

en

afplatting celkernen Str. I. Ho

6

Ja

4-5

Ja

Nee

Ja

Naargelang de plaats is Per. of Str. C. aanwezig

NH

5-6

Ja

4-5

Nee

Nee

Ja/

Naargelang de plaats is er

Nee

een

onverhoornd

tot

verhoornd plaveiselepitheel waarbij

Str.

C.

met

celkernen

15

216

KR

5

Ja

4

Nee

Nee

Ja


OL

6-7

Ja

5-6

Nee

Nee

Ja


Fl

6

Ja

4

Ja

Ja

Nee

Eosinofiele korreling Str. I. (zie Fig. 7 en 10)

Ho

3-4

Ja

2-3

Nee

Nee

Ja

Str. C. met celkernen (zie Fig. 11)

16

222

NH

4

Ja

3

Nee

Nee

Ja


KR

6

Ja

5

Nee

Nee

Ja


OL

4

Ja

3

Nee

Nee

Ja


MCO lip

5

Ja

3

Nee

Nee

Ja


Fl

2-3

Ja

1-2

Nee

Nee

Ja

Ho

3

Ja

2

Nee

Nee

Ja

NH

3

Ja

2

Nee

Nee

Ja

KR

3

Ja

2

Nee

Nee

Ja

OL

4-7

Ja

3-6

Nee

Nee

Ja

MCO lip

5

Ja

3

Nee

Nee

Ja/

Naargelang de plaats is er

Nee

een

Zie Fig.11

onverhoornd

tot

verhoornd plaveiselepitheel waarbij

Str.

C.

met

celkernen 17

247

Fl

2

Ja

1

Nee

Nee

Ja

NH

6

Ja

5

Nee

Nee

Ja

KR

3

Ja

2

Nee

Nee

Ja

BPl: bioptplaats

NH: navelhuid

CL: aantal cellagen

OL: ooglid

Fl: flank

Per.: periderm

FL: foetale leeftijd

Str. B.: stratum basale

Fnr: foetaal nummer

Str. C.: stratum corneum

Ho: hoofd

Str. I.: stratum intermedium

KR: kroonrand

Subp. HP: subperidermale hoornparel

MCO: mucocutane overgang

TCL: totaal aantal cellagen

n.b.: niet bepaald

11

Fig. 6: HE-kleuring (vergroting x60) Schematische weergave van het drielagig epiderm ter hoogte van de flank. Van het oppervlak naar basaal toe onderscheidt men achtereenvolgens het periderm (A), stratum intermedium (B) en stratum basale (C).

Fig. 8: HE-kleuring (vergroting x60) Schematische weergave van het tegument ter hoogte van de navelhuid. Achtereenvolgens onderscheidt men van het oppervlak naar basaal toe het stratum corneum met celkernen (A), stratum intermedium (B) en stratum basale (C).

Fig. 7: HE-kleuring (vergroting x40) Schematische weergave van het drielagig epiderm ter hoogte van de flank. Van het oppervlak naar basaal toe onderscheidt men achtereenvolgens het periderm (A), stratum intermedium (B) en stratum basale (C). Subperidermaal is er een hoornparel (D) gelegen.

Fig. 9: HE-kleuring (vergroting x60) Schematische weergave van het verhoornd plaveiselepitheel ter hoogte van de navelhuid. Van het oppervlak naar basaal toe onderscheidt men het stratum corneum (A), stratum intermedium (B) en stratum basale (C).

12

Fig. 10: PAAB-kleuring (vergroting x40) Schematische weergave van het tegument ter hoogte van de flank met een subperidermaal gelegen hoornparel (A).

Fig. 11: PAAB-kleuring (vergroting x40) De donkerblauwe aflijning van de epidermis ter hoogte van het hoofd, wijst op de aanwezigheid van keratine en dus verhoorning. Deze aflijning komt overeen met het stratum corneum.

Scanning Electronen Microscopie: De stalen voor SEM werden bekeken met een JSM-5600LV (JEOL, Japan).

Flank Foetaal

Foetale

nummer

leeftijd

(zie 5.1)

(dagen)

12

164

Waarneming

Geen losse huidschilfers te zien, de oppervlakkige epidermale cellen sluiten nauw aan (zie Fig. 12).

13

184

Geen losse huidschilfers te zien. De breuklijnen tussen cellen zijn echter wel zichtbaar.

14

191

Losse huidschilfers aanwezig (zie Fig. 13). Tevens ziet men op dwarse doorsnede het stratum corneum (zie Fig.14).

Kroonrand Foetaal

Foetale

nummer

leeftijd

(zie 5.1)

(dagen)

12

164

Waarneming

Breuklijnen van de huidschilfers zijn zichtbaar en enkele van deze hoornschilfers komen los (zie Fig. 15).

13

184

T.o.v. Fig.34 is de hoeveelheid huidschilfers sterk toegenomen en zijn ze sterker afgelijnd (zie Fig. 16).

14

191

Sterke schilfering van de epidermis (zie Fig.17).

13

A

A A A

Fig. 12: Oppervlakte aanzicht van het epiderm van de flank met artefact (A) (vergroting x330)

Fig. 13: Oppervlakte aanzicht van het epiderm van de flank met huidschilfers (vergroting x400)

A A A

Fig. 14: Dwarse doorsnede doorheen het epiderm van de flank met het stratum corneum (A) (vergroting x120)

Fig. 15: Oppervlakte aanzicht van het epiderm van het onderbeen. Breuklijnen met beginnende schilfering (A). (vergroting x300)

Fig. 16: Stratum corneum met duidelijke hoornschilfers die zich aftekenen. (vergroting x300)

Fig. 17: Sterke schilfering van het stratum corneum. (vergroting x120)

14

3. Discussie De ontwikkeling van het tegument van een éénlagig epiderm tot een verhoornd plaveiselepitheel, is verschillend naargelang de plaats op het lichaam. Zo ziet men lichtmicroscopisch reeds de vorming van subperidermale hoornparels t.h.v. de flank en de kroonrand op dag 164. Dit in tegenstelling tot de MCO t.h.v. de lip waar hoornparels respectievelijk optreden op dag 116 en de navelhuid waar deze optreden op dag 134. Deze vroegtijdige tekenen van verhoorning stroken echter niet met het vooropgestelde tijdstip door Sinowatz (1991).

Het stratum corneum of de meest oppervlakkige laag van het plaveiselepitheel is, m.u.v. de flank, overal aanwezig vanaf dag 184. Ter hoogte van de MCO van de lip kan men dit stratum reeds onderscheiden van de overige cellagen op dag 164. Er dient echter op gewezen te worden dat men in dit stadium van verhoorning nog te maken heeft met een onvolwaardig verhoornd plaveiselepitheel. De reden hiervoor, is de aanwezigheid van celkernen in de hoornlaag. Bij de foeti 7 en 10 vindt men veel vroeger een stratum corneum met celkernen terug. Bij foetus 7 is dit op dag 116, ter hoogte van de navelhuid. Bij foetus 10 is dit op dag 128, ter hoogte van de MCO van de lip. Ondanks het regiospeciefieke tijdstip wat betreft de keratinisatie, vindt men op dag 222 ( m.u.v de MCO ter hoogte van de lip) nergens meer celkernen terug in het stratum corneum en kunnen we spreken van een volwaardig verhoornd plaveiselepitheel.

Het driedimensioneel beeld dat wordt bekomen bij SEM, laat ons toe om volledige cel- en weefselopervlakten te bekijken. Dit in tegenstelling tot het tweedimensioneel beeld van de lichtmicroscoop. Hierdoor wordt het dus mogelijk om wijzigingen aan het oppervlak van het weefsel te zien. De resultaten bekomen bij SEM komen echter niet volledig overeen met deze bij lichtmicroscopie. Zo ziet men t.h.v. de flank reeds huidschilfers en een stratum corneum op dag 191. Deze verschijnselen konden echter niet worden aangetoond tijdens de lichtmicroscopische studie. De bevindingen t.h.v. de kroonrand stemmen wel overeen met elkaar.

De resultaten bekomen in dit onderzoek geven ons een idee over het tijdstip waarop keratinisatie van de huid plaatsvindt. Specifiekere data zouden eventueel kunnen worden bekomen door het uitvoeren van immunohistochemie. Door middel van deze histologische techniek, kan men de keratinisatiespecifieke keratines K1 en K10 of andere eiwitten die bijdragen tot de keratinisatie van de cel aantonen.

15

4. Literatuurlijst Gelaude P. (2009). Etiologie en pathogenese van ichthyosiforme aandoeningen. Literatuurstudie Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p. 16

Haake A.R. en Holbrook K. (1999). The structure and development of skin. In : Freedberg M.I., Eisen A.Z., Wolf K., Austen K.F., Goldsmith L.A., Katz S.I., Fitzpatrick T.B. (Editors) Fitzpatrick’s dermatology in general medicine, vol.1, McGraw-Hill, New York, p. 70-82

Junqueira L.C. en Carneiro J. (2004). De huid. In : Functionele histologie, Elsevier Gezondheidszorg, Maarssen, p. 483-502. Kessel R.G. en Shih C.Y. (1974). Scanning Electron Microscopy in biology: a students’ atlas on biological organization. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, p. 1-13.

Lyne A.G. en Heidemann M.J. (1959). The prenatal development of skin and hair in cattle. Australian journal of biological sciences 12, 72-95.

McGeady T.A., Quinn P.J., Fitzpatrick E.S., Ryan M.T. (2006). Integumentary system. In : Veterinary embryology, Blackwell Publishing, Oxford, p. 313-330.

Nowell J.A. en Pawley J.B. (1980). Preparation of experimental animal tissue for SEM. In: Johari O. (Editor) Scanning electron microscopy: an international journal of scanning electron microscopy, related techniques and applications, vol. 2, AMF O’Hare SEM Inc., Chicago, p. 119.

Sinowatz F. (1991). Haut (Integument) und Anhangsorgane. In : Rüsse I. en Sinowatz F. (Editors) Lehrbuch der Embryologie der Haustiere, Parey Verlag, Berlin, p. 399-408.

Walker J.S. (2004). Phase equilibrium and evaporation. In: Physics, 2

nd

edition, Pearson education

Inc., New Yersey, p. 551-556.

16

5. Bijlagen 5.1. Data foeti Geslacht

Ras

Kruin-stuit

Foetale

Lengte

Leeftijd

(cm)

(dagen)

Beharing

Bioptnamen

1

♂

n.b.

7

54

Niet zichtbaar

Flank

2

♂

n.b.

11

68

Niet zichtbaar, wel papillen t.h.v.

MCO lip

ooglid 3

♂

n.b.

11.5

70


MCO lip

ooglid 4

5

6

7

♀ ♀ ♂ ♂

n.b.

n.b.

n.b.

n.b.

15.5

19.5

20.5

26

83

96

99

116


Flank, MCO

ooglid en lip

lip, NH, OL


Flank, MCO

ooglid en lip

lip, NH, OL


Flank, MCO

ooglid en lip

lip, NH, OL

Kleine haren zichtbaar t.h.v. lip

KR, Flank, MCO lip, NH

8

♀

n.b.

26

116


Flank, MCO lip, NH, OL

9

♀

n.b.

29

125



10

♂

n.b.

30

128



11

♂

n.b.

32

134

Duidelijk haren zichtbaar t.h.v. de

KR, Flank,

lippen

MCO lip, NH, OL

12

♂

BWB

43

164

Haren zichtbaar t.h.v. lippen,

HE: KR, Flank,

tevens wenkbrauw en wimpers

MCO lip, NH

aanwezig

SEM: Flank, KR

13

♂

BWB

51

184

Haren zichtbaar t.h.v. lippen, KR

HE: KR, Flank,

en ooropening, tevens

MCO lip, NH,

wenkbrauw en wimpers

Hoofd, OL

aanwezig

SEM: Flank, KR

17

14

♀

BWB

54

191

Haren zichtbaar t.h.v. lippen, KR

HE: KR, Flank,

en ooropening, tevens

MCO lip, NH,

wenkbrauw en wimpers

Hoofd, OL

aanwezig

SEM: Flank, OB

15

16

17

♂

♀

♂

BWB

BWB

Holstein

65

68

82

216

222

247

Niet zichtbaar t.h.v. flank

KR, Flank,

Wel zichtbaar t.h.v. KR, lip,

MCO lip, NH,

wimpers en NH

Hoofd, OL

Flank en achterbil fijnbehaard

KR, Flank,

NH en onderpoten goed behaard

MCO lip, NH,

Wimpers

Hoofd, OL

Heel het lichaam goed behaard


KR: kroonrand MCO: mucocutane overgang NH: navelhuid OL: ooglid HE: Hematoxyline kleuring SEM: Scanning Elektronen Microscopie n.b.: niet bepaald

18

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Recommend Documents