UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
STAMCELTHERAPIE TER BEHANDELING VAN DEGENERATIEVE GEWRICHTSAANDOENINGEN BIJ PAARDEN
door
Elza DE SMET
Promotoren: Prof. Dr. Lieven Vlaminck Dr. Michèle Dumoulin
Literatuurstudie in het kader van de masterproef
©2014 Elza De Smet
Vrijwaringsclausule Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
STAMCELTHERAPIE TER BEHANDELING VAN DEGENERATIEVE GEWRICHTSAANDOENINGEN BIJ PAARDEN
door
Elza DE SMET
Promotoren: Prof. Dr. Lieven Vlaminck
Literatuurstudie in
Dr. Michèle Dumoulin
het kader van de masterproef
©2014 Elza De Smet
VOORWOORD In eerste instantie zou ik van de gelegenheid gebruik willen maken om mijn promotor Prof. Dr. Lieven Vlaminck te bedanken voor zijn uitstekende begeleiding tijdens het realiseren van mijn literatuurstudie. Zijn deskundig advies en geduld zijn onmisbaar geweest tijdens het opstellen van dit werk. Mede zou ik hierbij willen vermelden dat hij sinds het begin mijn onderwerp naar eigen keuze heeft ondersteund, wat ik erg op prijs stel.
Ondanks zijn weliswaar drukke agenda, heeft hij steeds zeer vlot feedback gegeven en mij
bijgestaan om boeiende literatuur te verzamelen.
Verder wil ik een woord van dank richten tot mijn ouders en mijn zus. Hun jarenlange steun en vertrouwen hebben ertoe bijgebracht dat ik de moed niet heb laten zakken tijdens mijn studies. Hoewel sommige mensen mijn studiekeuze in twijfel trokken, zijn zij mij altijd blijven steunen.
Tot slot wil ik mijn dankbaarheid uiten voor mijn vrienden, mijn papa en mijn zus die mijn literatuurstudie nagelezen hebben. Zij hebben mij geholpen om er een betere en mooiere versie van te maken.
INHOUDSTABEL SAMENVATTING .................................................................................................................................... 1 INLEIDING .............................................................................................................................................. 2 LITERATUURSTUDIE............................................................................................................................. 4 1. HET GEWRICHT................................................................................................................................. 4 1.1. DE GEWRICHTSSTRUCTUREN ............................................................................................ 4 1.1.1. Het gewrichtskraakbeen ................................................................................................... 4 1.1.2. Het gewrichtskapsel ......................................................................................................... 4 1.1.3. Het gewrichtsvocht .......................................................................................................... 4 1.2. DE FYSIOLOGIE VAN HET GEWRICHT ................................................................................ 5 1.3. LAESIES VAN HET KRAAKBEEN........................................................................................... 5 2. DEGENERATIEVE GEWRICHTSAANDOENINGEN ...................................................................... 6 2.1. DEFINITIE .................................................................................................................................... 6 2.2. ETIOLOGIE .................................................................................................................................. 6 2.3. VERSCHILLENDE TYPES ......................................................................................................... 7 2.4. SYMPTOMEN .............................................................................................................................. 7 2.5. PATHOGENESE .......................................................................................................................... 8 2.6. PATHOLOGIE .............................................................................................................................. 9 2.7. DIAGNOSE ................................................................................................................................ 10 2.7.1. Anamnese ...................................................................................................................... 10 2.7.2. Klinische tekenen ........................................................................................................... 10 2.7.3. Radiografie ..................................................................................................................... 10 2.7.4. Scintigrafie ...................................................................................................................... 11 2.7.5. Magnetic Resonance Imaging (MRI) .............................................................................. 11 2.7.6. Arthroscopie ................................................................................................................... 11 2.7.7. Ultrasonografie ............................................................................................................... 11 2.8. BEHANDELING ......................................................................................................................... 11 2.8.1. Medicamenteuze behandeling ....................................................................................... 12 2.8.1.1. Non-steroidale anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID’s) .............................. 12 2.8.1.2. Corticosteroiden en hyaluronzuur ............................................................................... 12 2.8.2.3. Polygesulfateerde glycosaminoglycanen (PSGAG’s) ................................................. 12 2.8.2.4. Orale gewrichtssupplementen ..................................................................................... 12 2.8.2. Nieuwere biologische therapieën ................................................................................... 12 2.8.3. Chirurgische behandeling ............................................................................................... 13 2.8.4. Extracorporal shockwave therapie (ESWT).................................................................... 14 2.8.5. Mesenchymale stamcellen ............................................................................................. 14 2.8.6. Hydrogel implantaten...................................................................................................... 14 2.9. PROGNOSE .............................................................................................................................. 14 3. MESENCHYMALE STAMCELLEN TER BEHANDELING VAN DEGENERATIEVE GEWRICHTSAANDOENINGEN ........................................................................................................... 15 3.1. DEFINITIE VAN MESENCHYMALE STAMCELLEN ................................................................ 15 3.2. BRONNEN VAN MESENCHYMALE STAMCELLEN ............................................................... 16 3.3. DE EFFECTEN VAN MSC’S WANNEER ZE TOEGEPAST WORDEN VOOR MUSCULOSKELETALE AANDOENINGEN ..................................................................................... 18 3.3.2.1. De effecten van mesenchymale stamcellen op andere cellen .................................... 18 3.3.2.2. Anti-inflammatoire en immunomodulatoire activiteiten van stamcellen ....................... 19 3.3.2.2.1. In vitro en in vivo immunomodulatoire eigenschappen van mscs ........................ 19 3.3.2.2.6.1. T-lymfocyten ................................................................................................. 21 3.3.2.2.6.2. Dendritische cellen ....................................................................................... 21 3.3.2.2.6.3. Natural killer cellen ....................................................................................... 22 3.3.3.1. Toepassing van mesenchymale stamcellen voor de behandeling van musculoskeletale problemen bij paarden ................................................................................. 22 3.3.3.2. Hoe worden stamcellen het best toegediend? ........................................................... 24 3.3.3.3. Evaluatie van de uitkomstresultaten van studies in verband met stamceltherapie ter behandeling van gewrichtsaandoeningen ................................................................................ 25 3.4. ANDERE TOEPASSINGEN VAN MSCs ................................................................................... 26 3.5. PROBLEMEN OMTRENT HET GEBRUIK VAN MESENCHYMALE STAMCELLEN BIJ PAARDEN ......................................................................................................................................... 26
3.6. ZIJN STAMCELLEN WERKELIJK NOODZAKELIJK?............................................................... 28 BESPREKING ....................................................................................................................................... 29 REFERENTIELIJST .............................................................................................................................. 30
SAMENVATTING Degeneratieve gewrichtsletsels vormen een belangrijke reden waarom paarden vroegtijdig uit de sport worden gehaald. Doordat de regeneratie van het gewrichtskraakbeen aanzienlijke beperkingen kent, wordt er een evoluerende belangstelling getoond voor onderzoek naar veelbelovende therapieën die de kans op een succesvolle genezing verzekeren. De laatste decennia bemerkt men een toegenomen interesse in de regeneratieve diergeneeskunde. Behandeling van onder andere pees-en gewrichtsletsels met behulp van stamcellen komt tot stand wanneer medicamenteuze behandelingen betreurenswaardige resultaten opleveren. In de paardendiergeneeskunde worden stamcellen voornamelijk gebruikt voor de behandeling van pees- en gewrichtsaandoeningen. Daarnaast vormt de regeneratieve diergeneeskunde ook een potentiele oplossing voor andere aandoeningen zoals huidletsels, oogletsels, immuun-gemedieerde ziekten, hartziekten, etc. Desalniettemin zal de wetenschap rond stamcellen nog heel wat moeten evolueren vooraleer stamcellen een voorspellende oplossing zullen kunnen bieden aan tal van aandoeningen. Eén van de hoofdproblemen waarmee deze wetenschap wordt geconfronteerd, is het gelimiteerde aantal paarden die met stamcellen worden behandeld. Hierdoor is het momenteel niet mogelijk om betrouwbare case-controle studies uit te voeren die expliciete resultaten opleveren.
1
INLEIDING Degeneratieve gewrichtsaandoeningen (DJD), ook wel vernoemd als Osteoartritis, vormen een frequent voorkomende en gevreesde problematiek bij sportpaarden. Deze verschillende aandoeningen met een soortgelijk eindstadium worden gekenmerkt door degeneratie van het gewrichtskraakbeen, alsook van de structuren die het gewricht omgeven. Paarden zijn omwille van de grote belasting op de gewicht dragende gewrichten, voorbestemd tot het ontwikkelen van DJD. Bovendien komt dit soort aandoeningen voornamelijk voor bij paarden die op hoog niveau presteren omwille van het feit dat de gewrichten nog meer belasting moeten incasseren. Andere afwijkingen, zoals bijvoorbeeld een abnormale stand, dragen eveneens bij tot het ontstaan van gewrichtsinstabiliteit en de daaropvolgende aantasting van het gewrichtskraakbeen. Ook is er een opmerkelijke progressieve toename op het ontstaan van gewrichtsproblemen bij vorderende leeftijd.
1,
2, 3, 4
De wetenschap rond regeneratieve geneeskunde spitst zich toe op het onderzoek naar therapieën die sneller en kwaliteitsvoller herstel van beschadigde weefsels zouden
garanderen. Hoewel dit soort
behandeling voor een resem aan aandoeningen gebruikt zou kunnen worden, wordt er in deze literatuurstudie voornamelijk nadruk gelegd op het genezen van degeneratieve gewrichtsletsels.
Stamcellen zijn ongedifferentieerde cellen die gebruikt kunnen worden omwille van hun tweeledige capaciteit. Enerzijds zijn ze in staat om zich ongelimiteerd te vermenigvuldigen en anderzijds beheersen ze het potentieel om zich te differentiëren in verschillende weefseltypes. Er zijn twee soorten stamcellen, namelijk de embryonale en de adulte stamcellen. Embryonale stamcellen worden gewonnen uit het embryo en zijn pluripotent of met andere woorden, ze zijn in staat om zich tot eender welk celtype te ontwikkelen. Ondanks hun enorme differentiatiecapaciteit, is het gebruik van embryonale stamcellen ietwat uit den boze. Voornamelijk het risico op ongecontroleerde vermenigvuldiging en daaruit voortvloeiend ontstaan van neoplasieën baart zorgen. Daarnaast kennen embryonale stamcellen een centrale plaats in een ethische discussie. Een tweede groep van stamcellen zijn de adulte stamcelen die gewonnen worden uit volgroeide weefsels of organen. Deze stamcellen zijn multipotent en beschikken dus over het vermogen om zich om te vormen tot cellen van verschillende weefseltypes, uitgezonderd de extra-embryonale weefsels. In de diergeneeskunde worden adulte mesenchymale stamcellen voornamelijk gebruikt om adipocyten, osteocyten en chondrocyten te creëren.
11, 32, 34, 35
Het voortschrijdend enthousiasme omtrent het gebruik van mesenchymale stamcellen (MSCs) voor gewrichtsletsels bij paarden, situeert zich in het feit dat kraakbeenregeneratie een gelimiteerd succes bereikt. Dit is onder andere te wijten aan het beperkt aantal cellen in kraakbeen, alsook de povere circulatie in dit weefsel. Bovendien worden bij paarden de gewrichtsoppervlakten onderworpen aan een extreme belasting tijdens prestatie. Medicamenteuze behandelingen blijken vaak onvoldoende efficiënt om een succesvolle kans op heling te bekomen.
17
In de paardengeneeskunde richt men zich op verscheidene
weefsels voor het winnen van stamcellen. Oorspronkelijk werd voornamelijk beenmerg aangewend als bron van MSCs, maar omwille van het invasieve karakter van de techniek werd er gezocht naar andere weefsels
2
die het preleveren van stamcellen toelieten. Deze zijn onder andere navelstrengbloed, perifeer bloed en vetweefsel. Het proces om stamcellen uit deze weefsels te ontwikkelen is niet alleen minder ingrijpend, het laat bovendien de gelegenheid toe aan de praktijkdierenarts om dergelijke technieken uit te voeren.
11
Deze literatuurstudie richt zich toe tot de behandeling van degeneratieve gewrichtsaandoening met behulp van mesenchymale stamcellen. Hierbij wordt er een overzicht gegeven van de voor- en nadelen die verbonden zijn aan deze beloftevolle techniek. Ook zal er een beschrijving aangehaald worden van wat de toekomstige perspectieven juist inhouden en wat er eventueel gedaan kan worden om de voorspellende waarde van dergelijke therapieën te kunnen verbeteren.
3
LITERATUURSTUDIE 1. HET GEWRICHT 1.1.
DE GEWRICHTSSTRUCTUREN
Synoviale (diarthrodiale) gewrichten zijn het belangrijkste type gewricht van het lichaam. Ze verzorgen de soepele beweging van het skelet en worden gevormd door verschillende structuren: de aanpalende beenderen, het gewrichtskraakbeen, het gewrichtskapsel, het gewrichtsvocht en peri- en intra-articulaire 1
ligamenten. (Figuur 1)
1.1.1.
Het gewrichtskraakbeen
Het gewrichtskraakbeen heeft een tweeledige functie, namelijk het ondersteunen van het gewicht en het glijden van beide gewrichtsoppervlakten ten opzichte van elkaar, waardoor een soepele beweging mogelijk wordt. De subchondrale beenplaat wordt door het gewrichtskraakbeen bedekt, en heeft als doel het opvangen van inwerkende krachten. Chondrocyten en extracellulaire matrix (deze bestaat uit water, proteoglycanen en collageen) ,zijn de twee 1
voornaamste componenten waaruit gewrichtskraakbeen is opgebouwd.
1.1.2.
Het gewrichtskapsel
Het gewrichtskapsel bestaat uit twee lagen. De buitenste laag is de fibreuze laag. De binnenste laag vormt het synoviale membraan, gevormd door synoviocyten type A en B.
1.1.3.
1
Het gewrichtsvocht
De voornaamste component van gewrichtsvocht is hyaluronzuur. Dit wordt geproduceerd door synoviocyten type B en staat in voor de smering van het gewricht.
1
4
Fig. 1: Illustratieve weergave van een synoviaal gewricht
1.2.
DE FYSIOLOGIE VAN HET GEWRICHT
Het normale gewricht is een virtuele ruimte. Bij een gestegen intra-articulaire druk wordt water uitgewisseld van het gewrichtskraakbeen naar het gewrichtsvocht. Gewrichtskraakbeen heeft een beperkte schokabsorberende activiteit en geeft inwerkende krachten door aan de subchondrale beenplaat. In het subchondrale bot bestaat een fysiologisch evenwicht tussen het ontstaan van microfractuurtjes en het helen en remodeleren ervan. Sclerose van het subchondrale bot ontstaat bij een overmaat aan microfracturen, waarbij het evenwicht verstoord geraakt. Inwerkende krachten kunnen in dit geval onvoldoende worden opgevangen door het subchondrale bot, waardoor kraakbeendegeneratie optreedt.
1.3.
1
LAESIES VAN HET KRAAKBEEN
Oppervlakkige kraakbeendefecten ondergaan een gebrekkige heling door proliferatie van chondrocyten. Diepe kraakbeendefecten helen vlotter door de vorming van een fibrineprop, die geïnvadeerd wordt door fibroblasten. Collageen type III wordt door deze fibroblasten gevormd en geeft ontstaan aan de vorming van fibrocartilago. Dit is extracellulaire matrix van minderwaardige kwaliteit. Het is minder in staat om schokken te absorberen, waardoor sneller laesies ontstaan zoals kraakbeenerosies en –fibrillaties.
1,
5
2.
DEGENERATIEVE GEWRICHTSAANDOENINGEN
2.1. DEFINITIE Degeneratieve gewrichtsaandoeningen (DJD), ook vaak Osteoartritis genoemd, worden gekarakteriseerd door een progressieve destructie van het gewrichtskraakbeen. Het is een verzameling van aandoeningen aan het gewrichtskraakbeen, gekenmerkt door een gelijkaardig eindstadium. Secundair aan de progressieve vernietiging van het gewrichtskraakbeen treden veranderingen op in het botweefsel en weke weefsels van 2
het gewricht. Synovitis, capsulitis, gewrichtseffusie, erosie van het gewrichtskraakbeen, vorming van osteofyten en subchondrale sclerose worden geassocieerd met deze aandoening.
2,3,4
Klinisch gezien treedt
er naast pijn en dysfunctie van het aangetaste gewricht ook spieratrofie op.
2,4
Degeneratieve
gewrichtsaandoeningen vormen een veel voorkomende oorzaak van kreupelheid bij presterende paarden.
6
2.2. ETIOLOGIE Factoren die predisponeren tot het ontstaan van DJD zijn onder andere gewrichtstrauma (acuut, herhaaldelijk, intra-articulaire fracturen), gewrichtsinstabiliteit (bijvoorbeeld luxaties en subluxaties), gewrichtsincongruentie (bijvoorbeeld varus, valgus, osteochondrale fragmenten) en toenemende leeftijd.
1,4
Bij sommige paarden treden gewrichtsblessures pas op na langdurige stress. Dit kan verschillende jaren in beslag nemen. Dit betreft de paarden met een correcte conformatie, waarvan de gewrichten sterk genoeg zijn om gedurende lange tijd weerstand te bieden aan repetitief trauma. Bij andere paarden treden reeds gewrichtskwetsuren
op
na
een
enkelvoudig
gewrichtsconformatie zouden hierbij predisponeren.
traumatisch
incident.
Abnormaliteiten
van
de
7
Secundair aan het gewrichtstrauma en –instabiliteit, ontstaat er inflammatie van het synoviale membraan. Dit 6
vormt de start van een degeneratieve cyclus binnenin het gewricht. (Figuur 2.)
Fig. 2: Cyclus van het ontstaan van degeneratieve gewrichtsaandoeningen. (uit de website van The Atlanta Equine Clinic, Client Education Library)
6
2.3. VERSCHILLENDE TYPES Men kan osteoartritis classificeren op basis van de oorzaak van gewrichtsdegeneratie. Primaire osteoartritis wordt veroorzaakt door chronisch repetitief trauma en overmatige belasting. Jonge paarden zijn geneigd tot het ontwikkelen van gewrichtsaandoeningen door hun snelle gewichtstoename. Risicofactoren die in aanmerking worden genomen zijn onder andere de leeftijd, het geslacht, de conformatie en voornamelijk het type arbeid. Secundaire osteoartritis is het gevolg van andere gewrichtsaandoeningen zoals traumatische artritis, intraarticulaire fracturen, osteochondrose, conformatie-abnormaliteiten (bijvoorbeeld valgus en varus) en septische artritis. Het kan ook geïnduceerd worden door het intra-articulair toedienen van corticosteroïden.
3
Men kan Osteoartritis ook indelen op basis van de lokalisatie van de letsels binnenin het gewricht.
a. Synovitis en capsulitis zonder aantasting van het gewrichtskraakbeen of de steun gevende structuren. Dit komt onder andere voor bij acute synovitis en capsulitis en de meerderheid van verstuikingen. b. Trauma van het gewrichtskraakbeen of complete ruptuur van de voornaamste steun gevende structuren. Dit ziet men onder andere bij ernstige verstuikingen, intra-articulaire fracturen en meniscus-scheuren. c. Post-traumatische degeneratieve gewrichtsaandoeningen waarbij er resterende schade is na initieel trauma. Dit type kan leiden tot gelimiteerde beweeglijkheid en gewrichtsinstabiliteit.
7
2.4. SYMPTOMEN Osteoartritis wordt klinisch gekenmerkt door claudicatie (voornamelijk bij de aanvang van arbeid), pijn, een positieve respons op flexieproef, verdikking van het gewricht (gewrichtseffusie), verminderde beweeglijkheid, gedaalde viscositeit van het gewrichtsvocht (door een daling van de hyaluronzuurconcentratie) en eventueel crepitus. Vaak zijn er weinig klinische tekenen voorhanden in geval van chronische osteoartritis bij paarden.
1,2,6
Het gewrichtskraakbeen zelf en het synoviale membraan zijn door hun beperkte bezenuwing weinig gevoelig. Het gewrichtskapsel en de steungevende structuren (ligamenten) daarentegen bevatten meer zenuwuiteinden. Er zijn drie primaire oorzaken van gewrichtspijn: gewrichtseffusie (pijn treedt op door uitrekking van het gewrichtskapsel), fibrosis van het gewrichtskapsel (in geval van capsulitis) en inflammatie van de geassocieerde ligamenten (desmitis).
6
7
2.5. PATHOGENESE Trauma van een gewricht kan op verschillende manieren tot stand komen, algemeen resulterend in beschadiging van het gewrichtskraakbeen. Abnormale krachten inwerkend op normaal kraakbeen of normale krachten inwerkend op beschadigd kraakbeen, worden in aanmerking genomen bij het ontstaan van 1,8
(Figuur 3)
beschadigd
worden,
degeneratie van gewrichtskraakbeen. Wanneer
chondrocyten
produceren
ze
proteolytische
enzymen
die
het
proteoglycaannetwerk beschadigen. Hierdoor komt de voeding van naburige chondrocyten in het gedrang, waardoor opnieuw proteolytische enzymen worden vrijgesteld. Uiteindelijk resulteert dit in een gedaalde biomechanische capaciteit van gewrichtskraakbeen en treedt slijtage op bij inwerking van normale krachten. Het kraakbeen wordt zacht, wat predisponeert tot verdere vordering van de mechanische schade en verhoogde permeabiliteit voor destructieve enzymen.
8
Fig. 3: Mogelijke pathways voor degradatie van gewrichtskraakbeen secundair aan gewrichtstrauma. (uit “From Arthroscopy to Gene Therapy – 30 Years of Looking in Joints” ,C. W. McIIwraith, Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, 2005 – Seattle, WA, USA)
Twee basis pathobiologische processen kunnen in beschouwing genomen worden in een getraumatiseerd gewricht, namelijk synovitis en capsulitis enerzijds en schade aan het gewrichtskraakbeen en botweefsel anderzijds.
3,8
(Figuur 4) Inflammatoire mediatoren (bv. Prostaglandines, histamine), vrije radicalen (bv.
superoxide), enzymen (bv neutrale metalloproteïnasen, collagenase), cytokines (bv. IL-1, TNF) en complement factoren worden vrijgesteld in geval van acute synovitis en capsulitis, en leiden tot het ontstaan 1,3
van een degeneratief proces in het gewricht.
8
Fig. 4: Factoren die een rol spelen in de enzymatische degradatie van gewrichtskraakbeen matrix. De stippellijnen geven de factoren weer die degradatie inhiberen. (uit “From Arthroscopy to Gene Therapy – 30 Years of Looking in Joints” ,C. W. McIIwraith, Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, 2005 – Seattle, WA, USA)
2.6. PATHOLOGIE Morfologische veranderingen van het kraakbeen zijn onder andere geelverkleuring, verzachting, dof worden, oppervlakte fibrillatie, erosies en ulceraties. Histologisch kan men chondrocytennecrose, fibrillatie en verminderde metachromasie waarnemen. Biochemische veranderingen uiten zich voornamelijk als proteoglycanen depletie, een toename van de waterinhoud en beschadiging van het collageen. De zachte weefsels ondergaan congestie en verdikking, villushypertrofie en infiltratie van mononucleairen, oedeem en fibrose van het gewrichtskapsel. Het botweefsel ondergaat eveneens veranderingen: osteofyten vorming en remodellering, subchondrale sclerose of lyse, articulaire fracturen en enthesiofyten vorming (dit wordt geassocieerd met inflammatie van de weke delen van het gewricht).
3
9
2.7. DIAGNOSE 2.7.1.
Anamnese
Predisponerende factoren zoals leeftijd, zware inspanningen, acuut trauma, gewrichtsinstabiliteit en – incongruentie moeten in acht genomen worden bij het diagnosticeren van osteoarthritis.
2.7.2.
4
Klinische tekenen
Kreupelheid, gewrichtspijn, positieve buigproef van het desbetreffende gewricht, toename van het gewrichtsvocht, gedaalde beweeglijkheid, gereduceerde viscositeit van het gewrichtsvocht en crepitus zijn symptomen die op degeneratie van het gewricht kunnen wijzen.
1,6
Pijn, synoviaal oedeem en proliferatie zijn
tekenen die in een vroege fase van de ziekte onderkend worden terwijl fibrose pas in het chronisch stadium optreedt. Er is slechts een beperkte correlatie tussen de mate van pijn en de graad van ernst van gewrichtsaantasting.
2.7.3.
1
Radiografie
Hoewel radiografie gelimiteerd is in het detecteren van vroegtijdige en subtiele laesies, is het een waardevolle techniek om veranderingen in het botweefsel geassocieerd met osteoartritis te diagnosticeren.
1
Initieel ziet men een vernauwde gewrichtsinterlinie, gestegen subchondrale botopaciteit (sclerose) en osteofytosis of enthesiofytosis. Later kunnen subchondrale botlyse, osteochondrale fragmentatie en 3
ankyloses ontwikkelen. (Figuur 5)
Fig. 5: Radiografiche opname (dorsolateraal-palmaromediaal oblique). Osteofyten vorming zichtbaar met proliferatieve en lytische veranderingen van het distale vlak van MC III samengaand met ernstige degeneratieve gewrichtsaandoening.
10
(uit Proceedings of the 13th Annual Resort Symposium of the American Association of Equine Practitioners AAEP, 2011, St. Michael, Barbados)
2.7.4.
Scintigrafie
Nucleaire scintigrafie verleent fysiologische informatie over het botmetabolisme. Verhoogde nucleotide opname kan radiografische veranderingen voorspellen, waardoor scintigrafie ondanks zijn lage sensitiviteit toch een waardevol hulpmiddel is in het vroeg onderkennen van degeneratieve aandoeningen.
2.7.5.
1,3
Magnetic Resonance Imaging (MRI)
MRI bezit de capaciteit om op een non-invasieve manier en met hoge resolutie een drie-dimensioneel beeld te verschaffen van de verschillende gewrichtscomponenten. In tegenstelling tot radiografie, staat MRI de 1
directe evolutie van kraakbeen toe. Zowel subchondrale bot- en kraakbeenabnormaliteiten kunnen in beeld worden gebracht. Niettemin geeft men toch de voorkeur aan radiografie voor het detecteren van periarticulaire osteofyten.
2.7.6.
3
Arthroscopie
Met behulp van arthroscopie kan men fibrillaties, verzachting en verlies van kraakbeen onderkennen. Ook osteofyten en samengaande subchondrale botabnormaliteiten kunnen door middel van deze techniek worden gevisualiseerd.
2.7.7.
3
Ultrasonografie
Het belangrijkste voordeel van ultrasonografie ten opzichte van radiografie, is zijn superioriteit in het aantonen van abnormaliteiten van het zachte weefsel (bijvoorbeeld verdikking van het synoviale membraan, beschadiging van intra- of peri-articulaire ligamenten). Alsook is het mogelijk om mits voldoende ervaring accumulaties van gewrichtsvocht te detecteren. Ook kunnen onregelmatigheden en abnormaliteiten aan het oppervlakkig botweefstel gedemonstreerd worden.
1
2.8. BEHANDELING De behandeling van osteoartritis berust op drie principes: 1. Primaire oorzaken van osteoartritis behandelen, bijvoorbeeld het herstellen van intra-articulaire fracturen, correctief hoefbeslag e.d.
11
2. De schade aan weke weefsels geassocieerd met osteoartritis behandelen. Dit kan onder meer door rust, fysische therapie, anti-inflammatoire geneesmiddelen, gewrichtsspoeling, hyaluronzuur, polygesulfateerde glycosaminoglycanen (PSGAG), disease modifying osteoartritic drugs (DMOAD’s) en synovectomie. 3. Het chirurgisch behandelen van gewrichtskraakbeendefecten in geval van fulminante DJD.
2.8.1.
1
Medicamenteuze behandeling
2.8.1.1. Non-steroidale anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID’s) De functie van NSAID’s berust op een remming van de cyclo-oxygenase activiteit. Voornamelijk geneesmiddelen die een selectieve onderdrukking uitoefenen op COX-2 (bijvoorbeeld Caprofen®) zijn doeltreffend. Phenylbutazone® daarentegen bezit een lagere selectieve werking op COX-2, en initieert bijgevolg
een
aantal
nevenwerkingen.
ontstekingsremmende functie.
NSAID’s
hebben
zowel
een
analgetische
als
een
1
2.8.1.2. Corticosteroiden en hyaluronzuur Corticosteroïden hebben een analgetische en anti-inflammatoire werking. Intra-articulaire toediening van corticosteroïden en hyaluronzuur wordt vaak in combinatie toegepast. Hyaluronzuur reduceert immers de nevenwerkingen (o.a. chondrodestructie), veroorzaakt door corticosteroïden.
5,8,9
2.8.2.3. Polygesulfateerde glycosaminoglycanen (PSGAG’s) Deze hebben een chondroprotectieve werking en worden recenter gedefinieerd als “disease modifying osteoartritic drugs”, of DMOAD’s. Ze worden vooral gebruikt indien er schade is aan het kraakbeen, eerder dan in geval van acute synovitis. De meest gebruikte PSGAG is Chondroïtinesulfaat (Adequan®).
4,5,8,9
2.8.2.4. Orale gewrichtssupplementen De meerderheid van deze producten bevatten chondroïtinesulfaat of glucosamines. Hun doel berust op het genezen van kreupelheid en het voorkomen van gewrichtsproblemen, voornamelijk in geval van synovitis.
2.8.2.
4,8
Nieuwere biologische therapieën
Er bestaan zowel Matrix Metalloproteïnase- als IL-1-inhibitoren die als therapeutische benadering gebruikt worden. Zoals in figuur 6 aangetoond wordt, is IL-1 de mediator die aan de top staat van de inflammatoire
12
cascade. IL-1 initieert immers de vrijstelling van onder andere Matrix Metalloproteïnasen, Aggrecanase en Prostaglandines. Zijn werking treedt in gang na het binden op de IL-1 receptor, gelegen ter hoogte van de celmembraan. Er zijn twee methoden om IL-1 te inhiberen. De eerste is via een natuurlijke antagonist (IRAP of Interleukine-1 Receptor Antagonist Protein) die zich op de IL-1 receptor bindt en hierbij IL-1 blokkeert. Een tweede manier is het gebruiken van receptoren waar IL-1 op bindt en waarbij dus geen verdere inflammatie optreedt.
8,9
Fig. 6: Schematische weergave van vrijstelling van MMP, aggrecanase en PGE2, na binding van IL-1 op IL-1 receptor ter hoogte van de celmembraan. (uit “From Arthroscopy to Gene Therapy – 30 Years of Looking in Joints” ,C. W. McIIwraith, Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, 2005 – Seattle, WA, USA)
2.8.3.
Chirurgische behandeling
Eén van de meest gebruikte technieken is chirurgische curettage van kraakbeen en bot. Hierbij kan, via het partieel of volledig verwijderen van het sclerotisch subchondrale botweefsel, vorming van nieuw weefsel in het defect worden geïnitieerd. Het verwijderen van osteofyten wordt enkel aangeraden indien de osteofyten van grote omvang zijn en de functionaliteit van het gewricht hinderen. Met behulp van groeifactoren, het induceren van subchondrale microfracturen, kraakbeen- en periostgreffen, boren in de subchondrale beenplaat, cultuurgreffen van chondrocyten e.d. wordt de kraakbeenheling gestimuleerd en kan herstel van degeneratieve letsels worden beoogd.
9
Chirurgische arthrodesis wordt toegepast indien erge degeneratieve processen ontstaan in een gewricht met beperkte locomotorische functie. In het geval van een chronische osteoartritis, kan eventueel het fibreuze non-productieve synoviale membraan worden verwijderd.
4,9
13
2.8.4.
Extracorporal shockwave therapie (ESWT)
Bij ESWT worden hoogenergetische geluidsgolven gegenereerd en gericht op de plaats die behandeld moet worden. De golven kunnen afhankelijk van hun energieniveau, doorheen verschillende soorten weefsels dringen en geven hierbij hun energie af. Hierdoor wordt lokaal de bloedcirculatie gestimuleerd, ontstekingsremmende factoren vrijgegeven en de pijn verzacht.
2.8.5.
4,8
Mesenchymale stamcellen
Multipotente mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd uit beenmerg, kraakbeen en vetweefsel. Nadat ze differentiëren tot chondrocyten kan er een verbetering worden opgemerkt van de degeneratieve letsels.
4,8
2.8.6.
Hydrogel implantaten
Hydrogel implantaten (Salucartilage®) blijken veelbelovend te zijn voor de behandeling van degeneratieve gewrichtsaandoeningen waarbij er een collaps van de gewrichtsruimte (verlies van een grote hoeveelheid gewrichtskraakbeen) opgetreden is.
8
2.9. PROGNOSE De prognose van Osteoartritis is afhankelijk van een aantal factoren, bijvoorbeeld uitgesproken klinische symptomen, het aantal aangetaste gewrichten, welke gewrichten het betreft, de mate van gewrichtsschade, de aanwezigheid van osteochondrale fragmenten en het competitieniveau. Eens radiografische veranderingen opgetreden zijn, voornamelijk vernauwde gewrichtsinterlinie, is de prognose voor volledig atletisch herstel pover. Mild aangetaste paarden kunnen mits zorgvuldig benadering bekwaam zijn om 1
lichtere vorm van arbeid te beoefenen.
14
3. MESENCHYMALE STAMCELLEN TER DEGENERATIEVE GEWRICHTSAANDOENINGEN
BEHANDELING
VAN
3.1. DEFINITIE VAN MESENCHYMALE STAMCELLEN Mesenchymale stamcellen (MSCs) resideren in alle volwassen weefsels en organen, waar ze een actieve rol spelen in de homeostase. Gegeven dat MSCs geïsoleerd en geëxpandeerd kunnen worden vanuit een wijde waaier aan adulte weefsels, bekwaam zijn om te differentiëren in verschillende musculoskeletale weefsel types, en opvallende immuno-modulatoire en anti-inflammatoire activiteiten hebben, vormen deze cellen een interessant onderwerp in het biomedisch onderzoek.
11, 34, 35
MSCs beschikken over het vermogen om clonaal te expanderen door middel van mitotische delingen en daarnaast zijn ze ook in staat om te differentiëren in verschillende mesenchymale cellijnen, voornamelijk osteocyten, adipocyten en chondrocyten . Hoewel MSCs een aanzienlijke capaciteit tot vermenigvuldiging hebben, is deze niet ongelimiteerd. Dit onderscheidt hen van embryonale stamcellen, die totipotent zijn en dus het vermogen bezitten om een oneindig aantal celcycli te ondergaan. Adulte of mesenchymale stamcellen zijn pluripotent, of met andere woorden, ze zijn in staat om cellen van het mesoderm, endoderm of ectoderm te vormen, maar geen cellen van extra-embryonale weefsels (naar lakshmipathy en Verfaillie, 35
2005). Hun uithoudingsvermogen en graad van vermenigvuldiging blijkt verschillend te zijn naargelang hun weefsel van herkomst. Algemeen wordt aanvaard dat MSCs gekweekt uit beenmergweefsel minder proliferatieve capaciteit hebben dan MScs afkomstig van andere weefsels.
12, 13
Mesenchymale stromale cellen (MSCs) stammen af van adulte mesenchymale weefsels en hebben het vermogen om te differentiëren in bot, kraakbeen en vet. De gebruikelijkste bronnen voor MSCs zijn beenmerg, dat oorspronkelijk de belangrijkste was, vetweefsel en navelstrengbloed. De productie van MSCs vereist heel specifiek productieprocessen (goede praktijkomstandigheden) om een veilige, reproduceerbare en efficiënte therapie te verzekeren (Figuur 7).
11
Onder gepaste omstandigheden, zoals bijvoorbeeld verlaagde zuurstofspanning, hoge cellulaire densiteit, blootstelling aan Dexamethasone en foetaal kalfserum-verrijkte media, kunnen mesenchymale stamcellen gericht worden tot chondrocyten-differentiatie.
33, 34, 35
15
Homing properties
Up regulation of profileration capacity
Fig. 7: schematische weergave van het productieproces van stamcellen. (uit www.fat-stem.com, clinical use of stem cells)
3.2. BRONNEN VAN MESENCHYMALE STAMCELLEN 3.2.1.
Beenmerg (BMD MSC)
Beenmerg MSCs vormen hematopoiëtische stamcel niches. Beenmerg kan bij het staande paard worden verzameld en is rijk aan ongedifferentieerde stamcellen. Bij paarden worden MSCs routinematig geïsoleerd uit beendermergaspiraten, verzameld uit de tuber coxae of het sternum. Deze laatste zou trouwens de belangrijkste bron zijn voor het isoleren van MSCs.
11, 33, 34
Het is aangetoond dat BMD MSCs in staat zijn om te differentiëren in verschillende mesenchymale cellijnen zoals bot, kraakbeen, vet, spier en pees. 3.2.2.
32, 35
Vetweefsel (AD MSC)
Er werd bevonden dat MSCs afkomstig van vetweefsel een aantrekkelijk alternatief vormen voor beendermerg MSCs, voornamelijk vanwege het gemak van weefselverzameling, de levering van een grote hoeveelheid cellen, een lager risico op afsterven van de donor site en dankzij hun uitmuntende proliferatie capaciteit. weefsel.
32
11, 32
AD MSCs kunnen succesvol differentiëren tot osseus, adipeus, myogeen en chondrogeen
Uitgaande van verschillende species zijn er indicaties dat MSCs afkomstig van vetweefsel minder
goed in staat zijn om osseus of kraakbenig weefsel te creëren in vergelijking met MSCs afkomstig van beenmerg.
14
Indicaties voor het gebruik van AD MSCs zijn voornamelijk anti-inflammatoire en
immunosuppressieve applicaties eerder dan het gebruik voor weefselregeneratie. De meest gebruikelijke locatie voor het verzamelen van AD MSCs is de zone rond de staartbasis, maar ook andere vetweefsel locaties zoals intrapatellair vet blijken geschikt te zijn.
11, 34, 35
16
3.2.3.
Navelstrengbloed en –weefsel (UCB MSC)
Verzameling van stamcellen uit het navelstrengbloed en omgevend collageenrijke weefsel is
bijzonder
interessant voor klinisch gebruik bij waardevolle sportpaarden. Het isoleren van de cellen gebeurt op een volledig non-invasieve manier en cellen zijn afkomstig van zeer jong weefsel. Het is wel noodzakelijk om een adequate celbank ter beschikking te hebben om UCB MSCs te bewaren voor toekomstig gebruik.
11
UCB
MSCs leveren een relatief laag aantal aan stamcellen, maar ze kunnen dienen als genen carriers en aldus groeifactoren secreteren. Dankzij hun oppervlakte-karakteristieken zijn stamcellen afkomstig van navelstrengbloed in staat om afstoting door het immuunsysteem uit te weg te gaan, waardoor ze een bijzonder potentieel vormen voor allogene celgemedieerde therapie.
3.2.4.
32
Spierweefsel (MD MSC)
Skeletspieren vormen een andere abundante en gemakkelijk te bereiken bron voor regeneratieve stamcellen. Ze bezitten het vermogen om differentiatie te ondergaan tot bot, kraakbeen, neuronen, endotheliaal weefsel en hematopoiëtisch weefsel.
32
Ondanks de vrijelijke beschikbaarheid van MSCs, is er momenteel nog steeds geen eenstemmigheid over het celtype dat de meest gewaardeerde bron zou vormen voor het behandelen van specifieke musculoskeletale aandoeningen bij paarden. Onderzoek zou moeten streven naar het bevestigen van een uniform protocol voor het kenmerken van MSCs, met als doel het realiseren van kwaliteitscontroles en om onderzoeksresultaten vanuit verschillende laboratoria te kunnen vergelijken.
15
Hoewel momenteel het
beenmerg en het vetweefsel de voornaamste bronnen zijn voor het collecteren van stamcellen, vormt navelstrengbloed een alternatief die talrijke voordelen biedt. (Tabel 1)
voordelen
Stamcellen uit navelstrengbloed
Stamcellen uit beenmerg
Zeer vlot te collecteren, bewaren en transporteren
Snellere innesteling na transplantatie
Snel beschikbaar
Meer ervaring met de technieken
Grotere kans op geschikte donor Lagere incidentie van graft versus host disease Transplantatie gemakkelijk te plannen nadelen
Verminderde overdracht van virale ziekten Minder ervaring met de technieken Beperkt aantal cellen per donor
Tekort aan donoren Meer tijd nodig voor het vinden van een geschikte donor
Tragere innesteling na transplantatie Hogere incidentie van graft versus host disease
Tabel 1: Stamcellen uit navelstrengbloed versus stamcellen uit beenmerg.
17
(uit Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 2009, 77)
3.3. DE EFFECTEN VAN MSC’S WANNEER ZE TOEGEPAST WORDEN VOOR MUSCULOSKELETALE AANDOENINGEN 3.3.1. Doelstellingen Initiële benaderingen voor het gebruik van mesenchymale stamcellen ter behandeling van musculoskeletale aandoeningen zijn gebaseerd op hun vermogen om te differentiëren in de gepaste weefseltypes en aldus 11
regeneratie van de beschadigde weefsels te verzorgen.
De regeneratieve geneeskunde streeft ernaar om het beschadigde weefsel te vervangen door weefsel dat dezelfde kwaliteit en functionaliteit als het oorspronkelijke weefsel garandeert. Dankzij een verbetering in de kwaliteit van het weefsel, wordt het risico op recidiveren van de letsels gereduceerd.
34
Het aanwenden van stamcellen ter behandeling van articulaire aandoeningen bij het paard, wordt gedreven door de significante impact van gewrichtsaandoeningen bij sportprestaties, de inadequate regeneratieve capaciteit van gewrichtskraakbeen, en de beperkingen van medische en chirurgische opties voor het behandelen van artritis. Bekend is dat gewrichtskraakbeen over een gelimiteerde capaciteit tot effectief herstel beschikt, deels te verklaren door de relatieve hypocellulaire en avasculaire natuur van het weefsel. Deze beperking wordt bij paarden, die op hoog niveau presteren, verergerd door extreme belasting die op de articulaire oppervlakten inwerken gedurende de competitie.
17
3.3.2. Het mechanisme van de activiteit van mesenchymale stamcellen 3.3.2.1. De effecten van mesenchymale stamcellen op andere cellen Volgens auteurs is het bekend dat MSCs waarschijnlijk niet rechtstreeks verantwoordelijk zijn voor musculoskeletale weefselregeneratie, maar dat ze wel een belangrijke paracriene en autocriene activiteit hebben via het vrijstellen van bioactieve mediatoren en endogene groeifactoren.
16, 5, 32
MSCs secreteren factoren die enerzijds angiogenesis stimuleren, gecompromitteerde host cellen beschermen tegen apoptose en residentiële stamcellen stimuleren, terwijl ze anderzijds inflammatie en 11
daaropvolgende fibrose inhiberen. (Fig. 8)
18
Figuur 8: Schematische weergave van de effecten van stamcellen met betrekking tot inflammatie, regeneratie en fibrose. De onderste grafiek toont de veranderingen in verband met inflammatie, regeneratie en fibrose, na het gebruik van stamcellen. (uit www.vet-stem.com)
3.3.2.2. Anti-inflammatoire en immunomodulatoire activiteiten van stamcellen MSCs hebben een tweeledige invloed op het immuunsysteem, namelijk het uitlokken van anti-inflammatoire en immuun-bevorderende responses. Deze cellen reguleren de immuunrespons, bijvoorbeeld door verandering van antilichaamproductie door B-lymphocyten (B-cellen), door verschuiving in T-lymphocyten subtypes en door inductie van immuun-tolerantie voor allogene transplanten.
19
3.3.2.2.1. In vitro en in vivo immunomodulatoire eigenschappen van MSCs MSCs
hebben
duidelijke
immunomodulatoire
functies
in
verband
met
het
inhiberen
van
littekenweefselvorming, het inhiberen van apoptose, het verhogen van de angiogenese en het stimuleren van de regeneratieve functie van intrinsieke progenitorcellen. Om deze functies te vervullen, interageren MSCs met nagenoeg alle types cellen van het afweersysteem: type B-lymfocyten, type T-lymphocyten, natural killer cellen, dendritische cellen, macrofagen/monocyten en neutrofielen. Het is onduidelijk of MSCs gecategoriseerd moeten worden als “immunosuppressief”, implicerende een non-specifieke down regulatie
19
van het immuunsysteem, of eerder als “immunotolerant”, implicerende een meer specifieke suppressie van aberrante immuun responsen. Wat wel duidelijk is, is dat de immunomodulatoire eigenschappen van MSCs afhankelijk zijn van verschillende factoren, met inbegrip van MSC activatie, MSC weefseloorsprong, MSC dosis, tijdstip van MSC administratie en MSC contact met cellen van het afweersysteem.
19
3.3.2.2.2. Activatie en preconditionering van MSCs MSCs secreteren enkel immunomodulatore proteïnen indien ze worden geactiveerd. In vivo zullen MSCs geactiveerd worden door het lokaal inflammatoir milieu. Acute schade, gekarakteriseerd door vrijstellng van interleukine-6, IL-1 of TNF-α, zou MSCs op een andere manier activeren dan een chronische immuungemedieerde lesie gekenmerkt door geactiveerde T-cellen of IFN- γ. Een hypoxisch milieu blijkt voordelig te zijn voor het overleven van MSCs en zou hun vermogen tot weefselregeneratie verhogen. Voornamelijk chronische peesletsels worden gekenmerkt door een laag zuurstofgehalte.
19
3.3.2.2.3. Weefsel van herkomst van MSCs Ondanks het feit dat onderzoek naar MSCs, afkomstig van verschillende weefsels bij paarden, nog maar recent is, heeft men reeds aangetoond dat ze vrij gelijkaardig zijn aan MSCs van andere species. Equine MSCs afkomstig van vetweefsel, beenmerg, navelstrengbloed en –weefsel reageren allen op activerende stimuli, bijvoorbeeld TNF-α, met de secretie van Prostaglandine E2. Desondanks kan de secretie van andere mediatoren zoals bijvoorbeeld stikstofoxiden (NO) wel afhankelijk zijn van het type weefsel. (Borjesson, ongepubliceerde data)
19
3.3.2.2.4. Dosis van MSCs De inhiberende effecten van MSCs zijn dosis-afhankelijk. Studies hebben reeds aangetoond dat hoge doses van MSCs immunosuppressieve activiteit teweeg brengen, terwijl lage doses eerder immuno-stimulerend zou werken.of het falen in het inhiberen van de lymfocyten-activiteit.
20
3.3.2.2.5. Administratie tijdstip van MSCs Er is zeer weinig informatie voorhanden in verband met het ideale tijdstip van toediening van MSCs. Er wordt gesteld dat een tijdskader van één week na het ontstaan van de lesie, nadat de acute inflammatie respons uitgedoofd is, het meest optimaal zou zijn.
19
Volgens bepaalde studies zouden naargelang het tijdstip van
therapeutische applicatie en het niveau van T-cel activatie, contradictoire effecten op het ziekteverloop uitgelokt kunnen worden.
21
20
3.3.2.2.6. Contact tussen MSCs en cellen van het immuunsysteem MSCs spelen een rol in het onderdrukken van de functie van verschillende cellen die behoren tot immuunsysteem. Dit is van belang om afstotingsreacties bij het inbrengen van lichaamsvreemde cellen tegen te gaan, en aldus complicaties te vermijden bij de toepassing van stamceltherapie. MSCs secreteren oplosbare mediatoren die rechtstreeks interageren met T-cellen om hun activiteit te moduleren. De immunosuppressieve capaciteit van MSCs wordt uitgelokt door apoptose van geactiveerde T-cellen, onderbreking van de celcyclus, vermindering van de T-cel proliferatie en verandering van het T-cel fenotype. Oplosbare mediatoren, zoals onder andere fransforming growth factor β, (TGF- β) en IFN-γ, zijn strikt noodzakelijk voor MSCs om proliferatie van lymfocyten te inhiberen (Borjesson, ongepubliceerde data). Algemeen wordt er aangenomen dat MSCs een verschuiving van het lymfocyten fenotype zouden kunnen induceren. Tregs zijn een speciale subpopulatie van T-cellen die de activatie van het immuunsysteem verhinderen en de tolerantie tot zelf-antigenen promoten. Natural killer cellen zijn de belangrijkste mediatoren van de aangeboren immuniteit en hun functie wordt eveneens geïnhibeerd door MSCs. Aldus veranderen MSCs het NK fenotyope, onderdrukken ze de cytokine-geïnduceerde proliferatie van NK cellen en onderdrukken ze de inductie van effector functies.
20
3.3.2.2.6.1. T-lymfocyten MSCs secreteren oplosbare mediatoren die rechtstreeks interageren met T-cellen om hun activiteit te moduleren. MSCs induceren apoptose van geactiveerde T-cellen, veroorzaken stilstand van de celcyclus, verminderen de T-cel proliferatie en veranderen het T-cel fenotype. Direct contact tussen MSCs en T-cellen zou de immunosuppressieve capaciteit van MSCs bevorderen. Waarschijnlijk heeft dit te maken met het feit dat de activiteit van lokaal geproduceerde, kortwerkende mediatoren, zoals NO, vergemakkelijkt wordt.
20
Oplosbare mediatoren zijn strikt noodzakelijk voor MSCs om proliferatie van lymfocyten te inhiberen (Borjesson, ongepubliceerde data). Deze mediatoren betrekken onder andere PGE2, hepatic growth factor, fransforming growth factor β, (TGF- β), IFN-γ, IL-10, leukemia inhibitory factor (LIF) en indoleamine 2,3dioxygenase (IDO). MSC-afgeleide Matrix Metalloproteïnasen kunnen eveneens binden op de IL-2 receptor op het oppervlak van geactiveerde T-cellen, resulterend in een gedaalde productie van IL-2.
20
Algemeen wordt er aangenomen dat MSCs een verschuiving naar een Treg fenotype zouden kunnen induceren. Tregs zijn een speciale subpopulatie van T-cellen die de activatie van het immuunsysteem verhinderen en de tolerantie tot zelf-antigenen promoten.
20
3.3.2.2.6.2. Dendritische cellen
21
MSCs blijken de dentritische cellen (DC) in een immature status te behouden en promoten de proliferatie van een meer immatuur regulator-fenotype. DCs interageren ook met B-lymfocyten en NK cellen. MSC modulatie van de DC functie en rijping komt tot stand dankzij oplosbare factoren zoals PGE2, IL-6 of TNF-α, of cel-cel contact, of beide.
20
3.3.2.2.6.3. Natural killer cellen NK cellen zijn de belangrijkste mediatoren van de aangeboren immuniteit en hun functie wordt eveneens geïnhibeerd door MSCs. Aldus veranderen MSCs het NK fenotyope, onderdrukken ze de cytokinegeïnduceerde proliferatie van NK cellen en onderdrukken ze de inductie van effector functies. MSC inhiberen zowel NK cel-gemedieerde cytolyse als de suppressieve functies van IFN-γ.
20
3.3.3. Toepassingen van equine mscs in de diergeneeskunde Het therapeutisch gebruik van MSCs voor orthopedische letsels bij het paard werd voor het eerst beschreven in 2003. De klinische toepassing van MSCs is heeft sindsdien een enorme uitbreiding gekend, waarbij duizenden paarden over de hele wereld reeds werden behandeld.
37
3.3.3.1. Toepassing van mesenchymale stamcellen voor de behandeling van musculoskeletale problemen bij paarden Mesenchymale stamcellen kunnen gebruikt worden in geval van diverse gewrichtspathologieën, onder andere gegeneraliseerde osteoarthritis en intra-articulaire letsels van de zachte weefsels. De toepassing van stamcellen blijkt eveneens succesvol te zijn in geval van pees- en ligamentletsels.
27
3.3.3.1.1. Gegeneraliseerde osteoartritis De behandeling van Osteoartritis verloopt moeizamer dan voor focale gewrichtsletsels. Gewrichtskraakbeen pathologie is bij osteoartritis immers vaak diffuus en omvat beide articulerende oppervlakten, evenals andere articulaire en peri-articulaire structuren (synoviale membraan, gewrichtskapsel, ligamenten, menisci en subchondraal bot).
17
Zoals werd aangetoond door Koelling et al., resideert een populatie van chondrogene precursorcellen in het subchondrale botcompartiment en migreert doorheen chondraal herstelweefsel in geval van gevorderde OA.
18
In een onbehandelde OA-gewricht kan het verwerven van subchondrale chondroprogenitorcellen enkel ontstaan nadat artritis-pathologie een gevorderd stadium heeft bereikt. Intrinsieke cellulaire responsen zijn inadequaat voor het omkeren of stoppen van de ziekteprogressie in dit stadium. Bij het intra-articulair inspuiten van exogene MSCs, wordt het proces van proliferatie van chondrogene precursorcellen
22
gestimuleerd. Hierdoor treedt er een snellere en effectievere migratie op van de precursorcellen, waardoor genezing van het letsel gerealiseerd wordt. Het gewrichtsvocht bevat een resem aan chemokines die chemotactische signalen veroorzaken, waarvoor MSCs responsief zijn. Bovendien secreteren chondrocyten in OA-gewrichten factoren die de differentiatie van MSCs tot chondrocyten stimuleren. In het geval van inflammatoire artritis, inhiberen MSCs de activatie van T-lymphocyten en secretie van inflammatoire cytokines, terwijl ze gelijktijdig de secretie van antiinflammatoire interleukinen stimuleren en vervolgens gewrichtsbeschadiging reduceren. Daarnaast hebben in vitro studies aangetoond dat MSCs, onder inflammatoire condities, de activiteit van Metalloproteïnasen onderdrukken door het secreteren van weefselinhibitoren van MMPs. Dit zou eveneens voordelig kunnen werken in het geval van klinische OA.
17
Verschillende studies hebben de voor- en nadelen van MSCs van verschillende oorsprong reeds afgewogen. 2
Volgens een studie van Murphy et al., wordt er een verbetering opgemerkt in PGE -"concentraties van het gewrichtsvocht van gewrichten behandeld met MSCs afkomstig van beenmerg. Alsook heeft de studie aangetoond dat er een verhoging van TNF-α en andere pro-inflammatoire cytokines in het gewrichtsvocht is, na intra-articulaire administratie van MSCs afkomstig van vetweefsel. De conclusie van deze studie luidde dat MSCs afkomstig van beenmerg algemeen betere resultaten opleverden.
29
Voor kraakbeendefecten van volledige dikte, is zowel kraakbeen als botweefsel vereist voor het 33
reconstrueren van de subchondrale beenplaat en het bovenliggende hyaliene kraakbeenoppervlak.
Tegenwoordig wordt er gebruik gemaakt van de bot-microfracturen om de genezing van gewrichtsletsels te bevorderen. Deze techniek bestaat erin om microfracturen te creëren in het bot dat zich onder het beschadigde kraakbeen bevindt. Hierin worden dan autologe MSCs aangebracht. De limiterende factor van deze techniek is dat de MSCs moeilijk in de microfracturen aanwezig blijven, vanwege het verdunde kraakbeen op deze lokalisatie. Het resultaat van deze chirurgische techniek blijkt optimaal te zijn indien het gecombineerd wordt met toediening van MSCs in de gewrichtsruimte.
17, 30,31
Er zijn aanwijzingen dat MSCs niet in alle gevallen van OA effectief zijn, maar momenteel is er nog onvoldoende informatie voorhanden om definitieve conclusies te kunnen trekken in verband met specifieke types van OA. Wel is het bewezen dat chirurgie met administratie van MSCs de kansen verhoogt op terugkeer van prestaties bij paarden lijdende aan ernstige meniscale verwondingen. Aangezien het gebruik van MSCs voor de behandeling van gewrichtsaandoeningen een evoluerende therapie is, wordt er verwacht dat deze in belang zal toenemen in de paardengeneeskunde.
17
Momenteel zijn de meeste klinische studies gebaseerd op de administratie van autologe MSCs, waarbij de cellen verzameld worden en opnieuw geleverd worden in dezelfde patiënt. Stamcellen ontbreken major histocompatibility complex II (MHC II) antigenen en herkenning door het immuunsysteem wordt hierdoor vermeden. Allogene MSCs, afkomstig uit gepaste donoren, kunnen eveneens gebruikt worden om kant-enklare allogene cel-voorraden te genereren. Hun voordeel is dat ze op en meer gestandaardiseerde manier gewonnen worden en dat ze onmiddellijk beschikbaar zijn, zonder de cultuurperiode die nodig is bij de
23
isolatie en expansie van autologe MSCs. Het nadeel van allogene MSCs is dat ze gepaard gaan met bijkomende kosten voor de bewaring en dat ze het risico op overdracht van infectieuze ziekten met zich meedragen.
24, 37
Een algemeen positieve indruk wordt door John F. Peroni en Dori L. Borjesson ervaren, omtrent het behandelen van paarden met intraveneuze of intralesionale injecties van allogene BM-MSCs.
20
Een gecombineerde benadering gebruikendmakende van een opeenvolging aan biologische producten (MSC, PRP, IRAP), zou voordelig zijn voor het bekomen van klinisch herstel. Het effect van verschillende groeifactoren op de differentiatie en synthetische activiteit van MSCs is significant en kan eventueel gebruikt worden in samenhang met MSC-greffen voor vernieuwing van het kraakbeenoppervlak. Gebruik makende van gen-verbeterde MSCs voor de vorming van chondrocyten, die getransplanteerd worden in kraakbeenoppervlak, zou een reëel potentieel bieden voor autogene chondrocyten-transplantatie bij paarden.
26, 33
3.3.3.1.2. Intra-articulaire letsels van de zachte weefsels Naar aanleiding van het succes met betrekking tot het gebruik van stamcellen voor de behandeling van letsels aan het gewrichtskraakbeen, wordt aangenomen dat MSCs eveneens voordelig kunnen werken in het genezen van schade aan de menisci. Onderzoekers van de Colorado State University hebben reeds veelbelovende resultaten geboekt bij de behandeling van klinische gewrichtsaandoeningen met letsels van de zachte weefsels, gebruik makende van een combinatie van hyaluronzuur en MSCs.
17
3.3.3.2. Hoe worden stamcellen het best toegediend? Onderzoekers van Cornell University gebruikten fibrine om MSCs in het kraakbeendefect te houden, waarbij het bereiden van MSCs de arthroscopie voorafgaat. Het nadeel van deze techniek is dat de chirurg onzeker is over de noodzaak van MSCs totdat de diagnostische arthroscopie plaatsgevonden heeft. Ook vereist deze techniek zeer gespecialiseerde instrumentarium.
27
Volgens het werk van Lee et al., zou rechtstreekse
administratie van MSCs op lange termijn voordelen vertonen, in vergelijking met levering van MSCs binnenin fibrine om kraakbeenoppervlak te vernieuwen.
28
In een studie van Seo JP et al. werd het effect onderzocht van dubbel gelaagde gelatine/β-tricalcium fosfaat (GT) sponzen geladen met mesenchymale stamcellen (MSC), chondrocyten(Ch), bone morphogenic proteïne-2 (BMP2) en platelet rich plasma (PRP) in osteochondrale defecten van de talus bij paarden. Hierbij werd de testgroep paarden vergeleken met een controlegroep, waarbij GT-sponzen werden gebruikt. Uit deze studie bleek dat het gebruik van dubbel gelaagde sponzen, bevattende Ch/MSC/PRP/GT voor de kraakbenige laag en MSC/BMP2/GT voor de benige laag, een positief effect had op de osteochondrale regeneratie.
36
24
3.3.3.3. Evaluatie van de uitkomstresultaten van studies in verband met stamceltherapie ter behandeling van gewrichtsaandoeningen 3.3.3.3.1. In vivo resultaten Hoewel biomechanische en kinetische studies beschikbaar zijn om gewrichtsbeweging en belasting te determineren, zijn studie-uitkomsten vaak gelimiteerd tot semi-objectieve kwantificatie van mankheidscores. Radiografie, echografie, arthroscopie, (staande) MRI, drukplaatanalyses en vloeibare biomarkers zijn voorbeelden van tools die gebruikt kunnen worden om beschadiging van gewrichtsstructuren te onderkennen.
22, 37
Ongeveer tachtig procent van de patiënten, lijdende aan gewrichtsaandoeningen, kunnen
na toepassing van MSCs terug op hun oorspronkelijk niveau presteren. Men bemerkt een sneller en beter herstel van de kraakbeenletsels in vergelijking met meer conventionele therapieën, waarbij het nieuwgevormde weefsel minstens even kwaliteitsvol is als het oorspronkelijk weefsel. (persoonlijke communicatie van Wim Malisart). In de huidige beschikbare literatuur zijn geen wetenschappelijk objectieve data voorhanden die exacte cijfers weergeven van het aantal succesvol behandelde paarden. 3.3.3.3.2. Post-mortem studies Beoordeling van de kwaliteit van het herstel kan door middel van mechanische testen gebeuren. Meting en lokalisatie van specifieke proteïnes en genen transcriptie, gewoonlijk gerelateerd aan chondrogenesis, worden eveneens frequent uitgevoerd.
22
De in-vitro differentiatiecapaciteiten van MSC kunnen bevestigd worden door bepaalde kwalitatieve aspecten van weefselvorming te beoordelen met behulp van weefselspecifieke histologische kleuringen. Desondanks wordt de complexe in- vivo weefselstructuur van gewrichtskraakbeen in vitro helemaal niet gerealiseerd. Bijgevolg is de in-vitrodifferentiatie van MSC’s geen garantie dat deze eveneens in vivo voor klinische toepassingen kunnen aangewend worden.
11
Daarnaast is er wetenschappelijk bewijs dat geïnjecteerde
MSCs niet gelokaliseerd blijven ter hoogte van het letsel. In een studie van Quintavalla et al. (2002) werd beschreven dat fluorescentgelabelde MSC’s veertien dagen later teruggevonden werden in dieper gelegen gebieden van het letstel alsook in het subchondrale bot. Dit wijst erop dat de geïnjecteerde MSCs een zekere migratie ondergaan. Ook werd gerapporteerd dat MSCs door middel van chemokinen aangetrokken worden naar plaatsen met weefselschade.
37
Er werd verwacht dat de beoordeling van histologische coupes van de beschadigde structuren, na behandeling met MSCs, veelbelovende resultaten zouden opleveren. Desalniettemin zijn er nog steeds moeilijkheden om een welomschreven verband te maken tussen specifieke scores van histologische bevindingen en klinische resultaten.
22
25
3.4. ANDERE TOEPASSINGEN VAN MSCs Vanwege hun belang in weefselregeneratie toepassingen voor kraakbeen, bot, pezen en ligamenten herstel, vormen MSCs een belangrijk aandachtspunt. Desondanks is nu gebleken dat MSCs hiernaast ook efficiënte therapeutische middelen zijn voor een waaier aan ziektetoestanden, bijvoorbeeld immuun-gemedieerde, auto-immune en genetische ziekten. In de paardendiergeneeskunde, wordt stamceltherapie ook vernoemd als
behandeling
van
onder
andere
laminitis,
excercise-induced
pulmonary
hemorrhage,
diepe
luchtwegenziekten en wondgenezing. De uitgestrektheid aan applicaties voor stamcellen ontstaat dankzij hun capaciteit tot het stimuleren van angiogenese, het verminderen van inflammatie, het rekruteren van host progenitorcellen en minimalisatie van fibrose. Ongetwijfeld zullen nieuwe applicaties voor stamceltherapie erkend worden indien het begrip van stamcel biologie toeneemt.
24
3.5. PROBLEMEN OMTRENT HET GEBRUIK VAN MESENCHYMALE STAMCELLEN BIJ PAARDEN 3.5.1. Huidige knelpunten en toekomstige indicaties De ontwikkeling van stamceltherapie is een veelbelovende techniek voor zowel geneeskundige als diergeneeskundige toepassingen, voornamelijk in condities waarin het resulterende littekenvorming of onderliggende degeneratieve natuur van de ziekte functioneel herstel tegenwerkt. Ondanks het huidige optimisme, zijn er nog vele aspecten van deze behandeling die opgehelderd dienen te worden.
24
De gebruikelijke bronnen van stamcellen in de paardengeneeskunde, worden doorgaans gebaseerd op het gemak van verzameling. De dosis van mesenchymale stamcellen en het tijdstip van administratie worden gedetermineerd door variabele combinaties van ontwikkelde hypothesen en de logistiek van casus presentatie. Bijvoorbeeld: hoewel de zone rond de staartbasis vaak wordt aangewend voor het verzamelen van vetweefsel bij paarden, is er toch de dwingende aanwijzing dat de specifieke eigenheden van stamcellen, afkomstig van vetweefsel, aanzienlijke variaties vertonen tussen de anatomische lokalisaties. Zo zouden stamcellen afkomstig van intra-articulair vetweefsel meer chondrogenisch zijn in vergelijking met stamcellen afkomstig van non-articulair vetweefsel.
24
3.5.2. EBM De term “EBM” (of Evidence Based Medicine) wordt aangewend om de efficaciteit van MSC therapie te evalueren op basis van klinische uitkomstresultaten. De gouden standaard voor EBM is het opstellen van geblindeerde, gerandomiseerde en gecontroleerde experimenten. De hedendaagse wetenschappelijke literatuur omtrent het therapeutisch gebruik van MSCs ter behandeling van orthopedische letsels bij paarden, is gebaseerd op studies die onvoldoende aan deze criteria beantwoorden. Hoewel verschillende recente studies met controlegroepen werden opgesteld, ontbreekt er enige experimentele waarde omwille van het feit dat er een
beperkt aantal paarden in deze studies worden opgenomen en er historische
26
controlegroepen als vergelijkingsmateriaal gebruikt worden. Ook de onderlinge variatie in de pathologische toestand van de patiënten, bemoeilijkt de correcte vergelijking van de behandelde groep en de controlegroep. Het genezingsproces is eveneens sterk afhankelijk van het management in de rehabilitatiefase en voornamelijk hoe de terugkeer in arbeid gemanaged et gemonitord wordt. Zo is het hoogstwaarschijnlijk dat het herstelproces van een paard die in de weide wordt gehouden en vroegtijdig terug in het werk wordt gezet, verschillend zal verlopen dan wanneer strikte stalrust wordt gerespecteerd en heropname van de arbeid nauw wordt opgevolgd in de context van opeenvolgende echografische onderzoeken. Eigenaarspaarden die kostelijke celtherapieën ondergaan hebben zullen ook nauwgezetter gevolgd worden dan paarden voor dewelke weinig investering in therapie wordt gedaan. Daarnaast zullen paarden met eenzelfde aandoening die verschillende disciplines beoefenen uiteenlopende resultaten opleveren, waardoor het onmogelijk wordt om deze paarden onderling te vergelijken. Een bijkomend probleem dat zich voordoet, is dat MSC-behandeling vaak gecombineerd wordt met andere biologische factoren (beenmerg (BM) supernatans, autoloog serum, platelet-rich plasma, etc.), waardoor het effect van MSCs alleen moeilijk na te gaan is. Dergelijke studies moeten op een ethische wijze gerealiseerd worden en zijn eveneens aan hoge kosten verbonden, waardoor het momenteel niet mogelijk blijkt om een groot aantal experimenten uit te voeren. De toekomstige uitdaging bestaat erin om klinische experimenten op te stellen waarin een voldoende aantal gelijkaardige gevallen worden opgenomen zodat objectieve en gestandaardiseerde beoordeling en opvolging gerealiseerd kunnen worden.
21, 22
3.5.3. Veiligheid en efficiëntie van stamceltherapie De introductie van stamcel therapie verschaft enorme voordelen op diergeneeskundig gebied. Stamcellen vormen potentiele oplossingen voor een variëteit aan ingewikkelde chronische ziekten voor dewelke hedendaagse farmacologische of chirurgische benaderingen vaak geen efficiënte behandeling opleveren. Hoewel er menige voordelen verbonden zijn aan het gebruik van stamcellen, zijn er ook potentiële risico’s in verband met dergelijke nieuwe technologieën die niet genegeerd mogen worden. Vele van de condities die ideaal leken voor stamcel therapie, bleken achteraf hetzij onvoldoende efficiënt of zelfs schadelijk voor het genezingsproces van het dier.
22
Wat de veiligheid betreft inzake MSC-therapie, zowel op korte als op lange termijn, is tot op heden nog maar weinig geweten. Dit komt doordat geen enkele officiële organisatie het empirische gebruik van equine MSCs controleert.
37
Eén van de problematieken die gepaard gaan met het gebruik van allogene stamcellen, is afstoting door het afweersysteem. Deze complicatie treedt voornamelijk op bij “graft versus hostziekte”. Ook is er enige oplettendheid vereist omwille van het risico op het overdragen van infectieuze en non-infectieuze ziekten. Momenteel is hierover nog geen wetenschappelijke informatie voorhanden die over dit soort problemen rapporteert. Anderzijds is er ook enige bezorgdheid over complicaties die optreden bij het gebruik van autologe stamcellen. Voorbeelden hiervan zijn onder andere sterfte van de donorplaats en erfelijke ziekten.
38
In een studie van Carrade et al. (2011) werden zowel autologe als allogene equine MSC afkomstig van navelstrengbloed intradermaal geïnjecteerd bij paarden. Het doel van deze studie was nagaan of er eventuele acute afstotings- of ontstekingsreacties waargenomen konden worden na injectie van MSCs. In
27
tegenstelling tot de controlegroep die een fysiologische zoutoplossing toegediend kreeg, kon er een milde zelflimiterende reactie waargenomen worden bij de paarden die intradermaal ingespoten werden. Volgens een andere studie van Carrade et al. (2011), werd er geen significant verschil in ontstekingsreactie waargenomen bij het intra-articulair toedienen van autologe of allogene MSCs. Hierbij werd tot de conclusie gekomen dat allogene MSCs veilig gebruikt kunnen worden ter behandeling van orthopedische letsels bij paarden.
37
3.6. ZIJN STAMCELLEN WERKELIJK NOODZAKELIJK? Er zijn geen sluitende indicatieve data die aantonen dat zuivere stamcelpopulaties enige intrinsieke superioriteit hebben ten opzichte van meer heterogene celculturen voor orthopedische toepassingen. Vanuit klinisch perspectief is functioneel herstel een belangrijker doel om na te streven dan authentieke weefselregeneratie. De nood aan exogene MSCs zou ook vermeden kunnen worden door klinisch doeltreffende hoeveelheden aan host MSCs te rekruteren in aangetaste plaatsen. MSCs worden gestimuleerd via de systemische circulatie naar gewonde plaatsen te migreren in respons op chemotactische factoren. Een waaier aan groeifactoren, inflammatoire cytokinen en chemokines reguleren de stamcelmigratie en -homing. Levering van chemokines en/of groeifactoren in beschadigde plaatsen zou gebruikt kunnen worden om voldoende MSCs aan te trekken voor doeltreffend herstel.
25
28
BESPREKING Het aanwenden van cel gebaseerde therapieën voor orthopedisch herstel bij paarden wordt klinisch aanzienlijk ondersteund, maar momenteel is het bewijs voor klinische efficiëntie nog niet zeer standvastig. Er is behoefte aan de ontwikkeling van meer sluitende klinische bewijzen om het rendement en therapeutische applicaties te constateren, wat een uitdaging gaat worden voor de paardengeneeskunde. Het uitvoeren van adequate studies wordt door tal van factoren bemoeilijkt: er zijn weinig mogelijkheden voor het randomiseren van behandelingen, de kosten van dergelijke beproevingen kunnen hoog oplopen, paarden worden vaak aanzien als een onderzoeksonderwerp met lage prioriteit, etc. Consensus is vereist voor wat betreft geëigende maatregelen om succes na te streven. De competentie om longitudinale studies uit te voeren in klinische populaties zal dé sleutel zijn tot het verwerven van een stevige basis voor goedkeuring van dergelijke technologieën. Stamceltherapie ter behandeling van aandoeningen bij paarden heeft een immens potentieel en het is van uiterst belang dat sterke bewijzen, om de voordelen ervan te ondersteunen, nu worden verworven.
22
29
REFERENTIELIJST 1. Mike W. Ross, Sue J. Dyson (2011). Diagnosis and Management of Lameness in the Horse. United
States: Elsevier Saunders, 1396 2. C. Wayne McILwraith (2003), Effectively diagnosing, treating equine Degenerative Joint Disease.
DVM360 Magazine 3. Tim S. Mair, Sandy Love, Jim Schumacher, Roger K.W. Smith & Grant Frazer (2013). Equine Medicine,
Surgery and Reproduction. Elsevier Saunders C. Wayne MCIlwraith (2010). Management of Joint diseases in Sport Horses. Proceedings of the 2010 Kentucky Equine Research Nutrition Conference 4. Vézina Audette R., Lavoie-Lamoureux A., Lavoie JP, Laventy S. (2014). Inflammatory stimuli differentially
modulate the transcription of paracrine signalling molecules of equine bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells. Osteoarthritis Cartilage. Epub 5. The Atlanta Equine Clinic- Client Education Library, Degenerative Joint Disease 6. Equine Joint Therapy: Causes and types of joint disease in the horse. Centre of Equine Therapy.
Verkregen op 20 november 2013 van http://www.equinenaturaltherapy.com/joint_disease.htm 7. C.Wayne MCIlwraith (2005). From Arthroscopy to Gene Therapy- 30 Years of Looking in Joints. Annual
Convention of the American Association of Equine Practitioners, Seattle 8. Ted S. Stashak, DVM, MS (1987). Adam’s Lameness in Horses. Lippincott Williams and Wilkins, 906,
157-165 9. Katherine S. Garrett, DVM (2011). Imaging of the Fetlock and Palmar/Plantar Metacarpus and th
Metatarsus. Proceedings of the 13 Annual Resort Symposium of the American Association of Equine Practitioners AAEP, St. Michael, Barbados 10. Matthew C. Stewart, Allison A. Stewart (2011). Mesenchymal Stem Cells: Characteristics, Sources and
Mechanisms of Action. Vet Clin Equine 27: 243-261 11. Kern S, Eichler H, Stoeve J, et al. (2006). Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone
marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells: 1294-301 12. Vidal MA,Kilroy GE, Lopez MJ, et al. (2007). Characterization of equine adipose tissue derived stromal
cells: adipogenic and osteogenic capacity and comparison with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Vet Surg: 36:613-22 13. Henning T, Lorenz H, Thiel A, et al. (2007). Reduced chondrogenic potential of adipose tissue derived
stromal cells correlated with an altered TGFβ, receptor and BMP profile and is overcome by BMP-6. J Cell Physiol; 21:682-91 14. Sarah E. Taylor, Peter D. Clegg (2011). Collection and Propagation Methods for Mesenchymal Stem
Cells. Vet Clin Equine 27: 263-274 15. Arnold I. Caplan, James E. Dennis (2006). Mesenchymal Cells as Trophic Mediators. J Cell Biochem;
98(5): 1076-84 16. David D. Frisbie, Matthew C. Stewart (2011). Cell-based therapies for Equine Joint Disease. Veterinary
Clinics of North America: Equine Practice 17. Koelling S., Kruegel J., Irmer M. et al. (2009). Migratory progenitor cells from repair tissue during the later
stages of human osteoarthritis. Stem Cell; 4(4): 324-35
30
18. John F. Peroni, Dori L. Borjesson (2011). Anti-inflammatory and Immunomodulatory Activities of Stem
Cells. Vet Clin Equine 27: 351-362 19. Najar M, Raicevic G, Boufker HI, et al. (2010). Mesenchymal stromal cells use PGE2 to modulate
activation and proliferation of lymphocyte subsets: combined comparison of adipose tissue, Wharton’s Jelly and bone marrow sources. Cell Immunol; 264(2): 171-9 20. Carrion F, Nova E, Luz P, et al. (2011). Opposing effect of mesenchymal stem cells on Th1 and Th17 cell
polarization according the state of CD4(+) T cell activation. Immunol Lett; 135(1-2): 10-6 21. Peter D. Clegg, Gina L. Pinchbeck (2011). Evidence-Based Medicine and Stem Cell Therapy: How Do
We Know Such Technologies are Safe and Efficacious? Vet Clin Equine 27; 373-382 22. Sackett DL, Rosenberg WV, Gray JA, et al. (1996). Evidence based medicine: what it is and what it isn’t.
BMJ 1996; 312:71-2 23. Matthew C. Stewart (2011). Cell-based Therapies: Current Issues and Future Directions. Vet Clin Equine
27; 393-399 24. Ponte AL, Marais E, Gallay N, et al. (2007). Mesenchymal Stem Cells: comparison of chemokine and
growth factor chemotactic activities. Stem Cells, 25:1737-45 25. Andrew P. Bathe (2012). Therapeutic Joint Management: From Nutriceuticals to Stem Cells. Proceedings
of the European veterinary Conference-Voorjaardsdagen, 2012 - Amsterdam, Netherlands 26. David D. Frisbie (2011). Stem Cells for Equine Joint Disease. Proceedings of the AAEP annual
Convention, San Antonio, TX, USA – November 18-22,2011 27. Lee KB, Hui JH, Song IC, et al. (2007). Injectable Mesenchymal Stem Cell Therapy for Large Cartilage
Defects – a Porcine Model. Stem Cells; 25:2964-2971 28. Murphy JM, Fink DJ, Hunziker EB, et al. (2003) Stem Cell Therapy in a Caprine Model of Osteoarthritis.
Arthritis Rheum; 48:3464-3474 29. Nixon AJ, Begum L., Mohammed HO, Huibregtse B, O’Callaghan MM, andMatthews GL. (2011).
Autologous Chondrocyte Implantation Drives Nearly Chondrogenesis and Organized Repair in Extensive Full- and Partial-thickness Cartilage Defects in an Equine Model. J.Orthop. Res. 9, 1121-1130 th
30. Peter Clegg (2011). New Therapies in Cartilage Repair in the Horse. Proceedings of the 50 British
Equine Veterinary Association Congress 2011 – Liverpool, United Kingdom 31. Alicia L. Bertone (2011) Cell Therapy for Equine Musculoskeletal Regeneration. Proceedings of the
annual Meeting of the Italian Association for Equine Veterinarians, Montesilvano, Italy 2011 32. Alan J. Nixon, Lisa A. Fortier (2001). New Horizons in Articular Cartilage Repair. Proceedings of the
Annual Convention of the AAEP Vol.47, 2001 33. Guy Wouters (2013). Regeneratieve Aanpak voor Orthopedische Letsels bij Paarden Loont. Fat Stem
Laboratories. http://fat-stem.be/wp-content/uploads/2013/01/Artikel-over-stamceltherapie.pdf 34. E. Van Haver, C. DE Schauwer, T. Rijsselaere, E. Meyer, A. Van Soom (2008).
Toepassingsmogelijkheden van Stamcellen in de Diergeneeskunde. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 2008, 77 35. Seo JP, Tanabe T, Tsuzuki N, Haneda S, Yamada K, Furuoka H, Tabata Y, Sasaki N. (2013). Effects of
the bilayer gelatin/β-tricalcium phosphate sponges loaded with mesenchymal stem cells, chondrocytes, bone morphogenic protein-2, and platelet rich plasma on osteochondral defects of the talus in horses. Res Vet Sci.
31
95(3): 1210-6 36. C. De Schauwer, E. Meyer, G. Van de Walle, A. Van Soom (2013). Toepassingen van mesenchymale
stamcellen bij het paard:huidige stand van zaken. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 2013, 823 Overzichtsartikel 327 37. Thomas G. Koch, Lise C. Berg, Dean H. Betts (2009). Current and future regenerative medicine -
principles, concepts, and therapeutic use of stem cell therapy and tissue engineering in equine medicine. The Canadian veterinary journal. La Revue Vétérinaire Canadienne (Impact Factor: 0.77): 50(2): 155-65. 38. Thomas G. Koch, Lise C. Berg, Dean H. Betts (2008). Concepts for the clinical use of stem cells in
equine medicine. The Canadian Veterinary Journal (La Revue Vétérinaire Canadienne) 49(10): 1009-17.
32
