UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2010 – 2011
VACCINATIE TEGEN VLEKZIEKTE BIJ DOLFIJNEN door Yi CUI
Promotor : Prof. Dr. Eric Cox Medepromotor : Dr. Geraldine Lacave
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2010 – 2011
VACCINATIE TEGEN VLEKZIEKTE BIJ DOLFIJNEN door Yi CUI
Promotor : Prof. Dr. Eric Cox Medepromotor : Dr. Geraldine Lacave
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde
studies
en
eventueel
bijhorende
documentatie,
zoals
tabellen
en
figuren.
De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
VOORWOORD Een thesis maken is geen éénmanswerk. Er wordt veel werk verzet achter de schermen om het uiteindelijke stuk tot een goed einde te brengen. Graag zou ik mijn promotor, Prof. Cox willen bedanken om mij de kans te geven deze thesis aan te vatten, mij de juiste richtingen uit te sturen, bij te sturen indien nodig en te helpen bij de verschillende verbeteringen. Ook mijn begeleider Dr. Lacave zou ik graag bedanken. Bedankt om me te helpen in een wereld die niet altijd even makkelijk toegankelijk is. Ondanks uw drukke schema had u altijd wel ergens een kleine gaatje voor mij, bedankt daarvoor. Bedankt ook Prof. Dewulf voor het uitlenen van de epidemiologische boeken en het advies allerhande. Verder zou ik ook graag iedereen bedanken die mij het hele jaar heeft bijgestaan met het schrijven van mijn thesis. Het is geen vanzelfsprekende job om een klagende thesisstudente te ondersteunen en verder te helpen! Een extra bedankje gaat naar de mopeke van Dries en Dries zelf voor het nalezen van de thesis.
INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING ......................................................................................................................................................... 1 1
INLEIDING.......................................................................................................................................................... 2
2
LITERATUURSTUDIE ........................................................................................................................................ 4 2.1
E. rhusiopathiae bij het varken .................................................................................................................... 4
2.1.1
Epizoötiologie......................................................................................................................................... 4
2.1.2
Pathogenese .......................................................................................................................................... 4
2.1.3
Immunologie .......................................................................................................................................... 5
2.1.4
Diagnose................................................................................................................................................ 6
2.1.4.1
Klinische diagnose ......................................................................................................................... 7
2.1.4.2
Isolatie en identificatie van E. rhusiopathiae ................................................................................... 7
2.1.4.3
Serologische diagnose bij het levend dier ...................................................................................... 8
2.1.4.4
Evolutie in de diagnostische technieken voor de vlekziekte ............................................................ 8
2.1.5
Behandeling en bestrijding ..................................................................................................................... 9
2.1.5.1
Behandeling .................................................................................................................................. 9
2.1.5.2
Bestrijding ................................................................................................................................... 10
2.1.5.3
Toekomstige vaccins ................................................................................................................... 11
2.2
E. rhusiopathiae bij de dolfijn .................................................................................................................... 11
2.2.1
Epizoötiologie....................................................................................................................................... 11
2.2.1.1
Pathogenese ........................................................................................................................................ 12
2.2.3
Immunologie ........................................................................................................................................ 12
2.2.4
Diagnose.............................................................................................................................................. 13
2.2.5
Behandeling en bestrijding .................................................................................................................. 14
2.2.5.1
Behandeling ................................................................................................................................ 14
2.2.5.2
Bestrijding ................................................................................................................................... 14
2.2.6
Immunologisch profiel na vaccinatie bij de dolfijn .................................................................................. 15
2.2.6.1
Antistoffen aanwezig in het serum van de dolfijn .......................................................................... 16
2.2.6.2
Actieve immuniteit........................................................................................................................ 16
2.2.6.3
Vaccinatie met dolfijnenisolaten ................................................................................................... 16
2.2.6.4
Antistoffen in dolfijnenmelk .......................................................................................................... 17
2.2.6.5
Vaccinatie bij dolfijnkalveren ........................................................................................................ 17
2.2.6.6
Cellulaire immuniteit na vaccinatie ............................................................................................... 17
2.3
Epidemiologie: klinische veldstudie ........................................................................................................... 18
2.3.1
Algemeen............................................................................................................................................. 18
2.3.2
Protocol van een klinische veldstudie ................................................................................................... 18
2.3.2.1
Achtergrond en „het waarom‟ van de studie .................................................................................. 18
2.3.2.2
Specifieke doelstellingen.............................................................................................................. 19
2.3.2.3
Criteria voor het selecteren van dieren ......................................................................................... 19
2.3.2.4
Beschrijving van de studieopzet ................................................................................................... 20
2.3.2.5
Beschrijving van de behandelingsprocedure ................................................................................ 23
2.3.2.6
Beschrijving van alle klinische, biologische e.a. methodes ............................................................ 23
2.3.2.7
Kwaliteitscontrole......................................................................................................................... 23
2.3.2.8
Parameters ter vergelijking .......................................................................................................... 24
2.3.2.9
Opvolging (follow-up) ................................................................................................................... 24
2.3.2.10
Definitie van bijwerkingen ............................................................................................................ 25
2.3.2.11
(Statistische) analyse ................................................................................................................... 25
2.3.3 2.4 3
Bron van infectie .......................................................................................................................... 11
2.2.2
Veldstudie: Evaluatie van vlekziektevaccins bij varkens ........................................................................ 25 Conclusies ............................................................................................................................................... 27
LITERATUURLIJST .......................................................................................................................................... 28
SAMENVATTING Erysipelothris rhusiopathiae veroorzaakt vlekziekte bij verschillende dieren. Het dringt binnen via de exogene en endogene weg en manifesteert zich in drie vormen bij de dieren, namelijk de acute, de subacute en de chronische vorm. Men kan tegen deze ziekte vaccineren met levend verzwakte of geïnactiveerde vaccins. Vooral in de varkensindustrie heeft de ziekte een grote economische impact. De laatste jaren ondervinden de varkensbedrijven in Amerika, Australië en Azië opnieuw opflakkeringen van vlekziekte. De uitbraken veroorzaken veel economische verliezen in de industrie. Men heeft de laatste tien jaar veel onderzoek verricht naar nieuwe diagnostische technieken (genetische identificatie en dergelijke) om de kiem op te sporen en te karakteriseren. Verder wordt gewerkt aan onderzoek naar nieuwere vaccins. Men heeft potentiële kandidaten (namelijk oppervlakte antigenen) gevonden die men als subeenheid in een vaccin kan gebruiken. Deze proteïnen zijn sterk immunogene antigenen. Het ontwikkelen van DNA vaccins behoort ook tot de toekomstige mogelijkheden. Ook bij de dolfijn veroorzaakt E. rhusiopathiae veel problemen. De belangrijkste weg van besmetting is de perorale weg (via gecontamineerde vis en water). Hier komt de ziekte enkel in de acute en chronische vorm voor. Wegens de zeer acute aard van de eerste vorm wachten de verzorgers van de dieren niet tot ze symptomen vertonen. De dieren worden direct behandeld met hoge dosissen antibiotica en symptomatische ondersteuning. Men kan ook hier preventief ingrijpen door de dolfijnen te vaccineren met commerciële varkensvaccins. Deze vaccins gaven echter aanleiding tot problemen in Amerika, Zuid-Afrika en Australië. Zo stierven in het verleden al dolfijnen door anafylactische shock, geïnduceerd door de vaccinatie. Hierdoor stopten de meeste dolfinaria in deze gebieden met vaccineren en bleven ze twijfelachtig tegenover het gebruik van commerciële vaccins. Europese dolfinaria bleken niet met deze problemen van anafylactische shock te kampen te hebben, maar vaccineerden in die periode ook minder. Sinds men in de jaren negentig begonnen is met het onderzoek naar vaccinatie bij de dolfijn, zijn vele dolfinaria in Europa begonnen met het gebruiken van het commerciële varkensvaccin “Eurovac Ery®”, dat in het onderzoek gebruikt werd. Dit vaccin was niet op de Amerikaanse markt. Een nieuw bacterinvaccin, “ER BAC® PLUS”, beschikbaar sinds een aantal jaren in Amerika, maar nog niet in Europa, zou de neveneffecten van oudere vaccins reduceren of elimineren. Mede hierdoor, en ook omdat er de laatste jaren meerdere acute gevallen van vlekziekte gerapporteerd werden binnen grote privécollecties van walvisachtigen, hebben sommige Amerikaanse dolfinaria rond 2003 besloten tot het herinvoeren van het vaccinatieprogramma tegen vlekziekte. Doordat “Eurovac Ery®” tegenwoordig uit de Europese markt genomen is door de komst van nieuwe vaccins, tracht men het Amerikaanse vaccin, “ER BAC® Plus”, te registreren voor het gebruik op de Europese markt. Dit vaccin heeft als voordeel dat het de bijwerkingen van de oudere vaccins elimineert en reeds werd uitgetest in de praktijk in Amerika (Lacave G., Persoonlijke mededeling, 2011). Hoe kan men echter de efficiëntie van een nieuw vlekziektevaccin evalueren? Dit probleem werd vanuit een epidemiologische standpunt benaderd. Vertrekkende vanuit een theoretische achtergrond werd ook bekeken hoe men in de praktijk een epidemiologische veldstudie tot stand kan brengen.
1 INLEIDING E. rhusiopathiae is de verwekker van vlekziekte. De kiem is een niet-zuurvast gram-positief staafje. Het is een onbeweeglijke, niet sporenvormende, obligaat parasitaire, facultatief pathogene, facultatief anaerobe en αhaemolytische bacterie (Morgan et al., 1994; Wood 1984). De kiem komt ubiquitair voor. Hij kan geïsoleerd worden uit de tonsillen van gezonde varkens, wilde varkens, vogels, vissen, runderen, schapen, knaagdieren, zeezoogdieren en ook uit de bodem. Hoewel de kiem geïsoleerd kan worden uit de slijmlaag van vissen, is hij niet pathogeen voor de vis zelf. Voor een niet sporenvormend bacterie is E. rhusiopathiae opmerkelijk resistent tegen uitwendige invloeden (Cornelisse, 1993). De bacterie is wel gevoelig aan een lage pH en galzouten, en is dus geen enterische kiem (Bauwens et al., 1992). Men onderscheidt twee kolonietypen: de S(mooth) en de R(ough)-vorm. Bij inoculatie op bloed agars vormt het S-type kleine, ronde, gladde, glanzende kolonies, omgeven door een partiële zone van haemolyse. Deze kolonies worden gevormd uit smalle, kromme staafjes die men isoleert bij acuut geïnfecteerde dieren. Het Rtype daarentegen vormt ruwe, onregelmatige, doffe kolonies die niet haemolytisch zijn. De R kolonies ontwikkelen zich uit de filamenteuze vormen van de bacterie, die men kan isoleren uit chronisch geïnfecteerde dieren (Bauwens et al., 1992; Wood, 1992). Het R-type is in het algemeen minder virulent dan het S-type (Cornelisse, 1993). Het genus Erysipelothrix werd door Takahashi et al. (1987a, 1992) in twee species onderverdeeld: Erysipelothrix rhusiopathiae (serotypes 1a, 1b, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 21 en serotype N) en Erysipelothrix tonsillarum (serotypes 3, 7, 10, 14 en 20). Het onderscheid tussen de twee bovenstaande species gebeurt met behulp van DNA-DNA hybridisatie. De twee species verschillen van elkaar in hun mogelijkheid om zuur te produceren uitgaande van saccharose. E. tonsillarum is niet pathogeen voor het varken, in tegenstelling tot E. rhusiopathiae (Takahashi et al., 2008). De stammen die tot de serotypes 13, 17, 18, 22 en 23 behoren, vertonen patronen die niet samengaan met één van de twee hoger vermelde species. De verschillende isolaten worden geserotypeerd door een immunoprecipitatietest met gekende antisera (antisera specifiek voor bepaalde serotypes). Dit gebeurt op basis van antigenische verschillen tussen de diverse hittestabiele, oplosbare peptidoglycaanfragmenten van de celwand. Deze fragmenten mogen niet verward worden met de glycolipoproteïne-antigenen die de gastheerimmuniteit induceren (Wood, 1979). De Nstammen bezitten geen hitte-stabiele antigenen (Takahashi et al., 1992). De meeste stammen van de vlekziekte bezitten één of meerdere gemeenschappelijke hitte-labiele celwandantigenen (proteïnen of proteïne-saccharide-lipide complex). De aanwezigheid van deze antigenen resulteert in kruisagglutinatie of gemeenschappelijke kruisimmuniteit (Wood, 1992). Erysipelothrix rhusiopathia produceert de virulentiefactor neuraminidase om zijn pathogeniciteit te verhogen. Neuraminidase verwijdert N-acetylneuraminezuur van mucine, fibrinogeen en erythrocyten. Het verhoogt tevens het katabolisme door zijn invloed op de erythrocyten, leukocyten en de levensduur van de glycoproteïnen. De virulentiefactor neuraminidase tast ook het N-neuraminezuur van de hartcellen en de immunoglobulines aan. Men vindt neuraminidase niet terug in de niet-pathogene Erysipelothrix species (zoals E. tonsillarum) (Abrashev en Orozova, 2006; Gyles en Thoen, 1993; Wang et al., 2005). Een andere virulentiefactor is een hitte-labiele en trypsinegevoelige structuur op de bacteriële oppervlakte die verantwoordelijk is voor de adhesie (Muller, 1980; Takahashi et al., 1987b).
2
De virulentie van de kiem wordt ook gedefinieerd door zijn capaciteit om de immuniteit van de gastheer te omzeilen. Erysipelothrix rhusiopathiae slaagt erin om na fagocytose te overleven en zich te vermenigvuldigen in een macrofaag. De verklaring kan deels gezocht worden in de gereduceerde productie van de reactieve oxidatieve metabolieten van de macrofaag. Een hypothese is dat vlekziekte de gastheercel binnendringt via een receptor die de oxidatieve burst niet initieert (Yoshihiro et al., 1996). Men heeft ook gevonden dat bij het verlies van het exopolysaccharide kapsel bij mutanten van vlekziekte, de kiem niet meer in staat is om de fagocytose te overleven in de proefmuizen. Ze worden gefagocyteerd door de polymorfonucleaire leukocyten en overleven ook niet meer in macrofagen. Dit suggereert dat het kapsel ook een virulentiefactor is. Het kapsel beschermt waarschijnlijk tegen gastheerreacties zoals fagocytose en adhesieve oppervlakteproteïnen die binden aan de extracellulaire matrixproteïnen (Shimoji et al., 1994; Shimoji et al., 1998; Shimoji et al., 2003). E. rhusiopathiae bezit het heat-shock proteïne gen dat samen met de dnaJ en grpE co-chaperone genen wordt geactiveerd in stressomstandigheden (de immuniteitsrespons van de gastheer creeërt bijvoorbeeld zo‟n stressmilieu). Na de beschadiging van de cellulaire proteïnen door de stress-situatie is hun hoofddoel de eiwitten herplooien in hun correcte driedimensionele structuur. Ook katalyseren ze de degradatie van de beschadigde proteïnen bij onmogelijk herstel. Deze genen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van de gram-positieve bacterieën in hun strijd tegen de gastheerimmuniteit (Rockabrand et al., 1993). Hieronder worden de verschillende facetten van vlekziekte bij het varken en de dolfijn besproken. Er wordt ook nader ingegaan op de verschillen tussen de twee diersoorten. Tenslotte wordt er uitgebreid ingegaan op de methodes voor het opzetten van een epidemiologische veldstudie.
3
2 LITERATUURSTUDIE 2.1 E. RHUSIOPATHIAE BIJ HET VARKEN 2.1.1
Epizoötiologie
Het varken is het belangrijkste reservoir voor E. rhusiopathiae. Bijna de helft van de varkens is drager van de kiem in de tonsillen en andere lymfoïde weefsels. Buiten de varkens komt de kiem ook voor bij talrijke andere dieren (wilde zoogdieren, wilde vogels, verschillende huisdieren, vissen, zeezoogdieren,…). Hun rol in de spreiding van de ziekte is echter van ondergeschikt belang (Buxton en Fraser, 1977; Geraci et al., 1966). Door de omgevingsresistentie van de kiem kunnen mechanische vectoren zoals huisvliegen en bloedzuigende arthropoda ook een middel zijn van verspreiding (Geraci et al., 1966). Vlekziekte is tevens een zoönose. Ze wordt meestal verspreid door een wondinfectie en komt dus voornamelijk voor bij mensen die vis of vlees hanteren (Brooke 1999). 2.1.2
Pathogenese
Het al dan niet ontstaan en het verloop van de ziekte hangt sterk af van de virulentie van de stam, de infectiedruk, predisponerende factoren en de afweer van de gastheer. Het gaat om een facultatief pathogene kiem die zowel een endogene als exogene infectie kan veroorzaken. De bacterie kan bij een exogene infectie intreden via een huidwonde, per oraal of via inhalatie. Bij een endogene infectie zijn de pathogenen aanwezig in de tonsillen. Door omgevingsfactoren (zoals voeding, omgevingstemperatuur, stress, transport,…) doorbreekt de kiem de epitheelbarrière ter hoogte van de tonsillen en komt zo in de bloedbaan terecht. Na de exogene of endogene infectie treedt een septicemie op. Deze evolueert dan verder tot een acuut, subacuut, subklinisch of chronisch ziektebeeld (Buxton en Fraser, 1977; Gyles en Thoen, 1993; Cornelisse, 1993; Timoney en Groschup, 1993; Wood, 1984; Wood 1992). Varkens zijn het meest gevoelig tussen de leeftijd van drie maanden en drie jaar. Vóór de drie maanden speelt de maternale immuniteit een rol in de protectie tegen vlekziekte. Vanaf drie jaar ouderdom hebben de varkens al een beschermende immuniteit opgebouwd door meervoudige subklinische infecties gedurende hun leven (Opriessnig et al. 2004). Acute vlekziekte wordt gekenmerkt door het plots optreden van (ernstige) algemene symptomen. Koorts kan aanleiding geven tot abortus (er vindt geen transplacentaire overdracht van de kiem plaats) en vruchtbaarheidstoornissen. Bij een uitgebreide septicemie vindt men vaak hyperacute sterfte. Men constateert ook frequent hemorrhagische plekken op meerdere plaatsen van het lichaam. Bewegingstoornissen kunnen aanwezig zijn ten gevolge van (acuut) non-purulente arthritis. Bij subacute vlekziekte zijn de algemene symptomen en non-purulente arthritis gelijkaardig aan het acute beeld, maar minder sterk uitgesproken. Het sterftepercentage ligt ook lager. Typerend aan de subacute vorm of huidvorm zijn de centraal gedepigmenteerde, grijze, rhomboïde letsels (“diamond skin lesions”) verspreid over het lichaam. Na enkele dagen treedt er genezing op van de vlekken. Men kan in de praktijk niet altijd even duidelijk het onderscheid maken tussen de acute en subacute vorm, omdat er vaak overgangsvormen voorkomen (Buxton en Fraser, 1977; Gyles en Thoen, 1993; Cornelisse, 1993; Timoney en Groschup, 1993; Wood, 1984; Wood 1992). 4
Vanuit de acute, subacute en subklinische vorm kan vlekziekte evolueren tot een chronische ziekte. Deze wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van proliferatieve endocardities, arteritis en/of polyarthritis. Men vermoedt dat door een continue aanwezigheid van de pathogeen of zijn antigenen een type III allergie (vorm van hypersensitiviteit) wordt uitgelokt. Initiële schade (bijvoorbeeld aan het kraakbeen) wordt veroorzaakt door de pathogeen zelf, maar de latere destructie is mogelijk een gevolg van de opgewekte type III allergie. Dit impliceert dat de behandeling van deze vorm sterk bemoeilijkt wordt (Buxton en Fraser, 1977; Denecke en Trautwein, 1986; Drommer, 1982; Schulz et al., 1980; Wood, 1984; Wood 1992) 2.1.3
Immunologie
De vlekziektebacil induceert zowel de humorale als cellulaire immuniteit (Galán en Timoney, 1990). Desondanks speelt de humorale immuniteit wel een grote rol in de bescherming (Shimoji et al., 1996; Imada et al., 1999). De IgA, IgG en IgM antistoffen worden gevormd in het verweer tegen de Erysipelothrix. IgG en IgM zijn complement-activerende en opsoniserende antistoffen. Protectie wordt geboden door binding van de antistoffen op het sterk immunogene Spa antigen van vlekziekte. De opsoniserende antistoffen zorgen ook voor een efficiëntere eliminatie van de kiem door het activeren van de macrofagen en de polymorfonucleaire leukocyten (Roit et al., 1993; Sawada et al., 1987). Eerder onderzoek heeft uitgewezen dat een antigen ter grootte van 64-66 kDa zeer immunogeen is. Dit celwandproteïne blijkt het voornaamste protectieve oppervlakte-antigen (SpaA) te zijn (Galán en Timoney, 1990; Makino et al., 1998). De antigenstructuur heeft veel gelijkenis met de glycopeptide- componenten die men vaak terugvindt in de celwanden van bacteriën. Na het toedienen van dat antigen aan muizen stelde men vast dat muizen actief worden beschermd tegen vlekziekte. Protectie bestaat dan voornamelijk uit het vormen van antistoffen tegen dit antigen (Timoney en Groshup, 1993). Deze bescherming is ook niet serotype-specifiek. Met behulp van een latex-agglutinatietest wil men de antistoffen tegen die 64-66 kDa proteïnen opsporen (Sato et al., 1998, White et al., 1970). Later heeft men ook gevonden dat het SpaA proteïne gecodeerd wordt door het spaA gen. De volledige sequentie van het spaA lijkt sterk geconserveerd te zijn bij alle serotypes van E. rhusiopathiae die dit gen bezitten (Imada et al., 1999). Het gaat hier om de serotypes 1a, 1b, 2, 5, 8, 9, 12, 15, 16, 17 en N van E. rhusiopathiae (Makino et al., 1998). Met behulp van sequentie analyse heeft men de spa gerelateerde genen van alle E. rhusiopathiae serotypes en van het serotype 18 onderzocht. Men heeft hierbij drie spa gerelateerde molecules gevonden die aanwezig zijn in het Erysipelothrix genus. Hieruit blijkt dat alle E. rhusiopathiae serotypes minstens één Spa proteïne op hun celloppervlak hebben. De drie Spa proteïnes kunnen worden geclassificeerd in drie moleculaire soorten: SpaA, SpaB en SpaC. Na onderzoek met PCR en immunoblotting heeft men dit Spa gen/proteïne niet teruggevonden bij E. tonsillarum. Dit suggereert dat de Spa proteïnen misschien ook een virulentiefactor zouden kunnen zijn tijdens de pathogenese van vlekziekte.
Ze kunnen dus ook gebruikt worden in het
differentiatieproces tussen de twee Erysipelothrix species met behulp van diagnostische technieken (PCR, immunoblotting,…). Het SpaA proteïne komt, zoals hierboven beschreven voor bij de serotypes 1a, 1b, 2, 5, 8, 9, 12, 15, 16, 17 en N van E. rhusiopathiae. SpaB komt voor bij de serotypes 4, 6, 11, 19 en 21. Serotype 18 produceert het SpaC proteïne. Serotype 18 wordt niet geclassificeerd bij E. rhusiopathiae of E. tonsillarum. De gelijkenissen
5
tussen de aminozuursequenties zijn het grootst bij de serotypes die behoren tot dezelfde Spa soort en kleiner tussen de serotypes van verschillende Spa soorten. De grootste diversiteit in de Spa proteïnen vindt men terug ter hoogte van het N-terminale uiteinde van de molecule. Dit uiteinde speelt ook een belangrijke rol in de bescherming tegen vlekziekte. Met immunoblotting heeft men gevonden dat konijn-antiserum dat specifiek gericht is tegen elk van de Spa proteïnen, sterker reageert met een homoloog Spa proteïne dan met een heteroloog Spa proteïne. Een muis kruis-protectie test toonde aan dat de drie recombinante Spa stammen een hogere bescherming bieden aan de homologe stammen dan aan de heterologe. Het recombinante SpaC heeft zelfs goeie protectie tegen de heterologe stammen. Men had dit niet verwacht omdat de sequentie tussen SpaA en SpaC, in het domein belangrijk voor de inductie van de immunologische bescherming, sterk divers zijn. Men kan dit fenomeen op twee manieren verklaren. Een eerste verklaring is dat er bij beide Spa‟s eventueel gelijkaardige, korte, lineare epitopen voorkomen in het protectieve domein. Een andere verklaring is dat in de SpaC conformationele epitopen aanwezig zijn die functioneren als kruis-protectieve epitopen. Hoe dan ook, het SpaC heeft het meeste potentieel om als antigeen te fungeren in een nieuw vaccin (To en Nagai, 2007). De Spa proteïnen hebben twee evolutionair sterk geconserveerde regio‟s. Het C-terminale uiteinde met negen “tandem-repeats” van 20 aminozuren en het N-terminale uiteinde met aminozuursequenctie van de signaalsequentie regio.
De “tandem-repeats” regio van het C-terminale uiteinde zou functioneren als een
verankeringssysteem om het Spa proteïne stevig te binden aan het bacteriële oppervlakte (To en Nagai, 2007). De aanwezigheid van die 20-aminozuren “tandem-repeats” zou essentieel zijn voor de inductie van de immuniteit, wat het een goede kandidaat maakt voor een toekomstige subeenheid vaccin tegen vlekziekte (Makino et al., 1998). Imada et al. (1999) en Shimoji et al. (1999) betwisten echter het belang hiervan. Shimoji et al. (1999) hebben in een proefopstelling waarbij muizen geïmmuniseerd werden met ofwel het SpaA proteïne of het C-terminale uiteinde, aangetoond dat het C-terminale uiteinde niet aan de basis ligt van de protectie. Daarbij is het voorkomen van deze “repeat” regio ook niet exclusief bij E. rhusiopathiae, men heeft het ook nog gevonden
bij
oppervlakteproteïnen
van
andere
gram-positieve
bacteriën.
Dit
suggereert
dat
het
verankeringsmechanisme behalve bij vlekziekte ook nog voorkomt bij andere gram-positieve pathogene bacteriën (To en Nagai, 2007). De aminozuren van de “signaal-sequentieregio” van het N-terminale deel van de Spa‟s zijn identiek voor alle Spa proteïnen. Men vermoedt dat de Spa proteïnen doorheen de bacteriële celwand kunnen migreren en uiteindelijk gesecreteerd kunnen worden met behulp van een secretiemechanisme dat voorkomt bij E. rhusiopathiae stammen. In de α helicale helft van het N-terminale uiteinde vindt men de sequentiediversiteit weer van de Spa proteïnen. Dit gebied zou men kunnen aanduiden als een hypervariabel domein. Men heeft ook gevonden dat deze helft van het N-terminale uiteinde belangrijk is voor de immunoprotectie tegen E. rhusiopathiae infectie (Imida et al. 1999; Shimoji et al. 1999; To en Nagai, 2007). Imida et al. (1999) hebben in hun onderzoek gevonden dat de N-terminale 342 aminozuren (van 90 tot 431) van de Fujisawa SpaA, gefusioneerd met een histidine hexameer, de component is die bescherming induceert in het varken tegen de vlekziekte serotype 1 en 2. 2.1.4
Diagnose
Diagnose van de vlekziekte gebeurt op basis van de klinische tekens, bacteriologisch onderzoek en serologie.
6
2.1.4.1
Klinische diagnose
Door de vage aard van de symptomen is het onmogelijk een onderscheid te maken tussen de vlekziekte en andere septicemische aandoeningen. Enkel de rhomboïde huidletsels zijn pathognomonisch voor de vlekziekte, maar deze zijn enkel te zien bij de subacute vorm. Bij varkens kan men een hoge dosis penicilline gebruiken als een diagnostische behandeling bij acute vlekziekte. Na deze behandeling treedt na 24-36 uur een opmerkelijke verandering op (Wood, 1992). 2.1.4.2
Isolatie en identificatie van E. rhusiopathiae
De kiem kan bij een acute infectie geïsoleerd worden uit verschillende organen (lever, milt, nier, long, hart, gewrichten) van het gestorven dier. Bij een chronische infectie kan de bacterie enkel nog geïsoleerd worden uit de gewrichten. Het cultiveren van de bacterie gebeurt in eerste instantie in een cultuurmedium aangevuld met tryptose, of in een vleesinfusiemedium met of zonder bloed of serum (Wood, 1992). Men heeft daarnaast selectieve media die de kiem verder kunnen onderscheiden van andere contaminanten. Een medium met inhibitoren zoals natriumazide, kristalviolet, fenol en/of kanamycine kan ook gebruikt worden (Bratberg, 1981). Men kan de kiem ook opkweken in een aanrijkend milieu zoals “Wood‟s Erysipelothrix selectieve bouillon”. Opkweken in zo‟n aanrijkend milieu maakt dat de isolatie van de kiem met een hogere gevoeligheid kan gebeuren dan de directe isolatie (Bender et al. 2009). Ook een hemocultuur kan gebruikt worden worden voor isolatie bij levende dieren. Hierbij dient men wel stalen te nemen van verschillende geïnfecteerde dieren omdat de kiem niet altijd aanwezig is bij elk individueel dier (Wood, 1992). Een manier om de vlekziekte-bacil van andere gram-positieve bacillen (Listeria monocytogenes, Corynebacterie species) te differentiëren is door zijn serum-coagulerende eigenschappen na te gaan. De kiem wordt vaak verward met andere gram-positieve bacillen door hun gelijkende gramkleuring en koloniemorfologie. E. rushiopathiae veroorzaakt geen stafylocoagulase geïnduceerde coagulatie van het serum. Het bezit dus geen coagulase enzyme dat de coagulatiecascade in gang zet. Wat het wel doet is het anticoagulerende citraat afbreken tijdens de bacteriële groei, zodat er fysiologische coagulatie kan plaatsvinden (Takahashi et al., 1990). Men kan de verschillende stammen serotyperen aan de hand van de oplosbare peptidoglycaan-fragmenten van de bacteriële celwand. Deze fragmenten zijn hittestabiele antigenen die antigenisch verschillend zijn. Met behulp van een immunoprecipitatietest met antisera specifiek tegen bepaalde serotypes, gaat men de verschillende stammen serotyperen (Wood, 1979). Bij varkens met acute vlekziekte behoren de meeste isolaten tot serotype 1a, 1b en 2 (Eamens et al., 1988; Wood, 1979), in tegenstelling tot de isolaten die bij de varkens geen acute vlekziekte veroorzaken. Twintig procent daarvan behoort tot andere serotypes dan de courante serotypes 1a, 1b en 2 (Wood en Harrington 1978). Volgens Opriessnig et al. (2004) worden de serotypes 1a en 1b eerder geassocieerd met de acute vlekziekte en serotype 2 eerder met de chronische vorm.
7
2.1.4.3
Serologische diagnose bij het levend dier
Voor de serologische diagnose zijn meerdere testen beschikbaar, namelijk de hemagglutinatie-inhibitietest, de
complementbindingsreactie,
de
micro-agglutinatietest,
de
buisjesagglutinatietest,
de
indirecte
immunofluorescentie, de passieve hemagglutinatietest en de groei-agglutinatietest. Voor routineonderzoek zijn deze testen echter ongeschikt, mede door het feit dat ze niet gevoelig genoeg zijn (Wood, 1992). Een groot nadeel bij de indirecte immunofluorescentietest is de residuele niet specifieke fluorescentie.
Bij
agglutinatietesten worden dan weer vooral de IgM antistoffen opgespoord en minder de IgG, terwijl de IgG antistoffen juist een belangrijke parameter zijn voor systemische afweer. Ook geven agglutinatietesten frequent ongewenste en aspecifieke reacties door antistoffen die binden aan een verwant antigen, rouleaux-vorming van erythrocyten of door aggregatie onder invloed van sommige chemische substanties (hyaluronzuur, metaalionen, …). Men heeft dus bij deze testen vaak te maken met vals positieven en vals negatieven (Kennedy-Stoskopf, 1990). 2.1.4.4
Evolutie in de diagnostische technieken voor de vlekziekte
Voor de detectie van antilichamen tegenover pathogene organismen is de “enzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA) een nieuwer populaire techniek. De specificiteit van deze techniek is wel afhankelijk van het voorhanden zijn van een specifiek en stabiel (subunit) antigen om de gewenste antilichamen mee op te sporen. Men heeft gevonden dat het immunogene 65kDa antigen een goeie kandidaat is voor het opsporen van de antiE. rhusiopahtiae antilichamen (IgG, IgM, IgA). Dat antigen werd gebruikt in een ELISA voor het serologisch onderzoek van varkens geïnfecteerd met serotype 1a, 1b en 2. In alle drie de gevallen gaf de ELISA een positief resultaat. Verder onderzoek naar verband tussen de kwantiteit van de antilichamen en de protectieve mogelijkheden ervan moet nog gebeuren (Chin et al., 1991). Een nieuwere techniek van detectie van E. rhusiopathiae is PCR (polymerase chain reaction). Men maakt hierbij gebruik van species-specifieke primers die gevormd zijn op basis van de sequenties op de chromosomale loci die vermoedelijk verantwoordelijk zijn voor de virulentie van de bacterie. Men kan ook gebruik maken van species-specifieke primers op basis van het ribosomale DNA (Shimoji et al., 1998a; Takeshi et al. 1999; Yamazaki 2006). Deze vorm van detectie maakt het mogelijk om ook een onderscheid te maken tussen E. rhusiopathiae, E. tonsillarum en andere micro-organismen (Streptococcus suis, Mycoplasma hyosynovia en Mycoplasma hyorhinis). Men kan met deze methode ook de klassieke vlekziekte serotypes differentiëren van de nieuwere E. rhusiopathiae soorten (voorbeeld de serotypes 13 en 18) (Shimoji et al., 1998a; Takeshi et al. 1999). In het onderzoek van Takeshi et al. (1999) paste men PCR toe op weefselstalen van het slachthuis en heeft men de resultaten vergeleken tussen de directe PCR detectie en cultivatie. Men kwam tot de conclusie dat de resultaten van de directe PCR detectie evenwaardig waren aan de isolatie. Bij de PCR duurde de test in totaal slechts vijf uur. In die gevallen van klinisch aangetaste dieren waar rechtstreekste opsporing met PCR negatief waren, werden de kiemen eerst aangerijkt door cultiveren in een verrijkt milieu. Dit is vaak nodig bij chronisch geïnfecteerde dieren waar men de kiemen probeert te detecteren uit bijvoorbeeld het synoviaal vocht. Dit heeft echter als nadeel dat de testen langer duren (24u), omdat men eerst de kiemen moet opkweken (Shimoji et al., 1998a; Yamazaki 2006).
De detectielimiet is ongeveer van 10 3 tot 105 kolonievormende
eenheden (CFU)/reactie. Bij gebruik van de kwantitatieve real-time PCR heeft men maar een aanrijkingsperiode 8
van 12 uur nodig en duurt de test zelf maar 90 minuten, waardoor de resultaten veel sneller beschikbaar zijn dan bij de klassieke PCR (To et al. 2009). Wegens de eenvoud, snelle beschikbaarheid en hoge sensitiviteit kan men de PCR gebruiken als een eerste-lijns screening waar men de resultaat snel nodig heeft (Shimoji et al., 1998a; Takeshi et al. 1999; To et al. 2009). In Amerika was er tijdens de zomer van 2001 een stijgend aantal uitbraken van vlekziekte op zowel gevaccineerde als niet gevaccineerde varkensbedrijven. De varkens stierven hoofdzakelijk aan de acute vorm van E. rhusiopathiae. In de slachthuizen werden ook meer varkens afgekeurd door het voorkomen van vlekziekte-achtige huidletsels. De industriële gemeenschap vreest voor de mogelijke ontwikkeling van nieuwe erysipelas serotypes of stammen, daling van de vaccin-efficaciteit of dat de uitbraken veroorzaakt werden door de vaccins zelf. Men maakt gebruik van “pulsed-field” gelelektroforese (PFGE) voor de differentiatie van de genotypes binnenin de serotypes (Eriksson et al., 2009; Opriessnig et al. 2004). PFGE is een techniek die grote deoxiribonucleïnezuur (DNA) molecules scheidt met behulp van een elektrisch veld. Het is de eerste keer in Amerika dat men een genetische karakterisatie maakt van een stam van een bepaald serotype. Op deze manier heeft men geprobeerd om de geïsoleerde stammen met de gekende te vergelijken. Daaruit bleek dat men niet te maken heeft met nieuw ontwikkelde stammen. Of de uitbraken veroorzaakt worden door het vaccin zelf, had men geen conclusieve resultaten. De uitbraken kunnen eventueel ook het gevolg zijn van een slecht vaccinatieschema (schema niet strikt opgevolgd, geen rekening gehouden met maternale immuniteit,…) of door recurrente opflakkering van andere agentia (porcine reproductive en respiratoire syndroom, porcine circovirus type 2) die de immuniteit van de varkens onderdrukten en zo vlekziekte de kans geven om op te komen. Andere technieken werden ook aangewend om E. rhusiopathiae isolaten verder te onderzoeken die eventueel een rol hebben gespeeld in uitbraken. Eamens et al. (2006a) hebben bacteriële isolaten van uitbraken (bij zowel gevaccineerde als niet gevaccineerde dieren) gekarakteriseerd met moleculaire fingerprinting strategiën: “restriction fragment length polymorphism” (RFLP) analyse en “plasmid profiling”. Het zijn goede onderzoeksmethoden om te gebruiken bij epidemiologische toezicht op de E. rhusiopathiae stammen die zowel in het verleden als nu circuleren. In hun onderzoek gebruikten de onderzoekers de restrictie-enzymen: RsaI en AluI. Sinds men in Japan gebruik maakt van een gecommercialiseerd levend verzwakt vaccin is de prevalentie van de acute en subacute vorm van vlekziekte sterk teruggedreven. Maar men komt steeds meer en meer de chronische vorm van de ziekte tegen in de slachthuizen. Om te achterhalen of dit mogelijk het gevolg is van het gebruik van een geattenueerd vaccin, heeft men een procedure opgesteld om te screenen naar vaccingerelateerde stammen. Men gaat eerst de geïsoleerde stammen serotyperen en onderwerpen aan random “amplified polymorphism” DNA (RAPD) analyse. De tweede stap is een sequentieanalyse van de hypervariabele regio in het spaA gen (Nagai et al. 2008). In het onderzoek van Imada et al. (2004) heeft men met behulp van RAPD gevonden dat in de laatste elf jaar, 37% van de chronische gevallen van vlekziekte bij varkens te wijten is aan het levend verzwakte vaccin. 2.1.5 2.1.5.1
Behandeling en bestrijding Behandeling
Men kan penicilline en antiserum, vaak gecombineerd, toedienen tegen vlekziekte. Deze therapie is het meest efficiënt in een vroeg stadium van de ziekte. Bij het varken zou het toedienen van een hoge dosis 9
penicilline een zichtbare klinische verbetering moeten geven binnen de 24 tot 36 uur. In de chronische fase heeft de pathogeen al irreversibele schade veroorzaakt in het lichaam. Bovendien is de kiem moeilijk bereikbaar voor het therapeuticum. Dit heeft tot gevolg dat de behandeling niet meer effectief is in dit stadium. Deze chronisch geïnfecteerde dieren kunnen wel nog steeds de kiem uitscheiden en de omgeving contamineren (Buxton en Fraser, 1977; Wood, 1992). Naast het toedienen van penicilline en een antiserum moeten de dieren ook symptomatisch behandeld worden. Rust, koele ligplaats, licht-verteerbaar of vloeibaar voedsel, weren van insecten e.d. is dan ook geen overbodige luxe (Cornelisse, 1993). 2.1.5.2
Bestrijding
Door zijn ubiquitair voorkomen en zijn uitgesproken resistentie tegenover de omgeving, is het bijna onmogelijk om de kiem uit te roeien. Daarom zijn profylactische maatregelen en behoud van goede hygiëne zeer belangrijk. Men past zowel passieve als actieve immunisatie toe (Cornelisse, 1993). Passieve immunisatie richt zich naar de niet-klinisch zieke contactdieren in een besmet milieu. Het hyperimmuunserum wordt subcutaan achter het oor toegediend. De bescherming duurt 1 à 2 weken (Cornelisse, 1993). Actieve immunisatie gebeurt aan de hand van levend verzwakte of geïnactiveerde vaccins. Door passage van serovar 1 of serovar 2 stammen op geëmbryoneerde eieren, konijnen of door het kweken van vlekziekte-stammen in een medium dat acridine kleurstoffen bevat, kan men levend verzwakt vaccin bekomen. Men kan deze stammen zowel parenteraal als via het drinkwater en via aërosol toedienen. In België worden geen verzwakte vaccins gebruikt (Buxton en Fraser, 1977; Wood 1992). Voor het bekomen van geïnactiveerde vaccins maakt men gebruik van stammen die behoren tot het serovar 2. Als men deze stammen opkweekt in een medium dat serum bevat, vormen ze een immunogeen, oplosbaar glycolipoproteïne (antigen). Dit antigen is noodzakelijk voor het induceren van de bescherming. Het met formaline geïnactiveerde vaccin bevat naast geïnactiveerde kiemen, het bovenvernoemde oplosbaar antigen en een adjuvans (aluminiumhydroxide) (Gyles en Thoen 1993; Wood, 1984; Wood 1992). De vaccins worden subcutaan of intramusculair toegediend. Voor de primo-vaccinatie moet het dier twee maal gevaccineerd worden, met een interval van drie tot vier weken. De vaccins beschermen het dier tegen zowel de acute als subacute vorm van E. rhusiopathiae, maar niet tegen de chronische ziektevorm (Haesebrouck et al., 2004; Wood 1992). Deze bescherming duurt ongeveer zes maanden. De colostrale immuniteit kan interfereren met de vaccinatie. Men neemt aan dat bij biggen van gevaccineerde zeugen, de duur van interferentie maximaal vier maanden bedraagt (Buxton en Fraser, 1977; Cornelisse, 1993). Om het bestaan van kruisprotectie tussen de verschillende serotypes te achterhalen heeft men varkens gevaccineerd met het serotype 2 vaccin, gechallenged met andere serotype stammen. Behalve de serotypes 9 en 10 die wel nog acute of gegeneraliseerde urticaria letsels veroorzaken, gaven de andere stammen (1a, 1b, 2, 5, 8, 11, 12, 18, 19, 21) geen vlekziekte meer. Hoewel er kruisprotectie is tussen de meeste stammen is dit niet het geval voor alle serotypes (Wood 1979, Wood et al., 1981; Takahashi 1984). Om de effectiviteit van het vaccin te evalueren kan men ook de cellulaire immuniteit bepalen. Eamens et al. (2006b) maten in het bloed van varkens de graad van lymfocytenproliferatie wanneer ze in contact kwamen met specifieke (serovar 2 lysaat) of niet specifieke (concanavalin A, ConA; phytohaemagglutinin, PHA) mitogenen. In hun studie hebben ze zelfs
10
gevonden dat sommige vaccins een immunosuppressieve werking kunnen hebben op de cellulaire immuniteit, wat deels het falen van sommige vaccins kan verklaren. 2.1.5.3
Toekomstige vaccins
Men heeft in een onderzoek nagegaan wat het protectieve effect zou zijn van een met NaOH geëxtraheerde inactief vlekziekte vaccin in varkens. Hierbij gebruikte men de Kyoto stam (serotype 2) van E. rhusiopathiae. Zowel de SPF (speficic pathogen free) biggen als conventionele biggen die nog maternale immuniteit bezaten op het opgenblik van de vaccincatie, vertoonden een hoge antistoffentiter na de vaccinatie. De antistoffentiter was nog hoger bij het gebruik van olie-adjuvanten in het vaccin. Beiden groepen proefdieren waren klinisch beschermd tegen een challenge met de serotypes 1a en 2 van de vlekziekte. De beschermde varkens vertoonden zelfs geen rhomboïdale huidletsels, dit in tegenstelling tot varkens die ingeënt werden met een levend vaccin van de Koganei 65-0.15 stam (serotype 1a). Een mogelijke verklaring hiervoor zou de hoge antistoffentiter kunnen zijn die geïnduceerd wordt na de vaccinatie (Kitajima et al., 1997). Shimoji et al. (1998b) suggereren het ontwerpen van een recombinant levend vaccin dat zowel humorale als cellulaire immuniteit moet induceren. In hun proefopzet hebben ze een veelbelovende kandidaat gevonden die als vector kan dienen voor het vaccin, namelijk de acapsulaire E. rhusiopathiae YS-1 mutant.
2.2 E. RHUSIOPATHIAE BIJ DE DOLFIJN 2.2.1 2.2.1.1
Epizoötiologie Bron van infectie
E. rhusiopathiae kent verschillende infectiewegen bij de dolfijn. De belangrijkste is de perorale weg: via gecontamineerd voedsel (vis, schaaldieren,…) en water wordt de kiem opgenomen. De voornaamste infectiebron is besmette zeevis (Greenwell et al., 2002; Suer et al., 1988a). Men vermoedt dat de besmetting van de vissen gebeurt na de vangst, gezien vissen in volle zee normaal gezien onbesmet zijn (Cornelisse, 1993). Men heeft in de Antwerpse Zoo over meerdere jaren vier verschillende vissoorten (wijting, sprot, makreel en haring) onderzocht. Bijna de helft van de vissen hadden vlekziekte-isolaten in hun oppervlakkige slijmlaag (Bauwens, 1992). In een studie van Greenwell et al. (2002) heeft men ook de vlekziektekiem geïsoleerd uit haring, lodde en inktvis. Doordat de kiem via de oppervlaktewateren naar andere plaatsen kan getransporteerd worden, zou rioleringsverontreiniging van kustwater ook een besmettingsweg kunnen zijn van de zeevissen (Wood, 1992). De bacterie is niet pathogeen voor de vis zelf, maar wordt gedragen in de slijmlaag van de vissen. De infectie kan ook via schaafwonden of andere huidletsels binnendringen (Geraci et al., 1966). Dit laatste is geen onbelangrijke intredepoort, gezien dolfijnen vaak huidwonden oplopen tijdens het spelen (Gray en Klontz, 1974). De kiem kan ook binnendringen via de conjunctivale, respiratoire en parenterale infectieweg, door bijvoorbeeld steekvliegen en bloedzuigende arthropoden (Geraci et al., 1966; Neundorf en Seidel, 1977). Men heeft gevonden dat bij vis-isolaten verschillende serotypes van vlekziekte voorkomen. Hierbij is vooral het serotype 2 verantwoordelijk voor vlekziekte bij walvisachtigen in gevangenschap (Hashimoto et al., 1974; Turcksin, 2002).
11
Gezien vlekziekte een zoönose is, kan de dierenverzorger besmet geraken en vice versa. Dit gebeurt waarschijnlijk via gecontamineerde handen of geïnfecteerde huidwonden (Geraci et al., 1966; Dunn, 1990; Veraldi et al. 2009). Men heeft gevonden dat de serotypes 2, 5, 6, 15 en 21 bij de dolfijnen vlekziekte veroorzaken (Hermans, 1997; Lacave et al., 2001). Het is wel opmerkelijk dat serotype, 2 en 5 relatief veel voorkomen bij dolfijnen. Dit is belangrijke informatie naar de vaccinatie toe, gezien het commerciële vaccin bij varkens onder andere bestaat uit stammen behorend tot serotype 2 (Turcksin, 2002). 2.2.2
Pathogenese
Men dacht vroeger dat bij de dolfijn enkel de exogene infectieweg voorkomt, doordat men er nog niet in geslaagd was om de kiem te isoleren uit gezonde dolfijnen (Van Poucke, 1994). Later heeft men het agens kunnen isoleren uit klinisch normale walvisachtigen in gevangenschap, bijvoorbeeld een toevalsbevinding bij een elfjarige mannelijke tuimelaar met een maagtorsie, maar ook uit vrijlevende walvisachtigen (Greenwell et al., 2002, Lacave en Cox, Persoonlijke mededeling 2011). De pathogenese is vergelijkbaar met die van het varken. Het ziekteproces hangt ook af van de virulentie van de stam, de infectiedruk, de afweer van de gastheer en de predisponerende factoren (zoals stress, voeding, populatiedensiteit, waterkwaliteit, extreme temperatuurschommelingen, zware parasitaire infestaties, stress tijdens het voorplantingsseizoen, …) (Archaeopteryx, referaat 90; Calle et al., 1993; Sweeney en Ridgway, 1975; Wood 1992). Bij dolfijnen komen maar twee vormen van vlekziekte voor. De acute septicemische vorm en de subacute vorm of huidvorm. De chronische vorm die zich bij het varken uit in endocarditis, arteritis en/of non-purulente arthritis heeft men bij dolfijnen nog niet waargenomen (Fowler en Allen, 1986; Lacave et al. 2001; Sweeney en Ridgeway, 1975). Een vierde vorm, de vesiculaire glossitis, werd beschreven bij een zwaardwalvis (Orcinus orca). De bacterie werd ook geïsoleerd uit de tong van een tuimelaar (Bossart en Eimstad, 1988; Lacave G., Persoonlijke mededeling 2011). Bij de acute septicemische vorm krijgt men meestal sterfte van de dolfijn voordat men enige symptomen heeft waargenomen. Indien er klinische symptomen optreden zijn ze eerder vaag, zoals anorexie, depressie, sufheid, flatulentie, hypersalivatie, dysfagie, leucocytose, ... . Histopathologisch vindt men hyperemie en degeneratie van de lever, nier en myocard terug. Zelfs met een vroege, agressieve behandeling kunnen de dieren sterven binnen enkele uren na het verschijnen van de eerste klinische symptomen (Dunn, 1990; Fowler en Allen, 1986; Gauckler, 1976; Geraci et al., 1966; Hoorens et al., 1988). De subacute vorm vertoont meestal algemene ziektesymptomen met leucocytosis, maar in minder erge mate dan bij de acute vorm (Dunn, 1990; Gearhart et al. 2005). Typisch zijn de verheven, diamant- of rechthoekvormige gedepigmenteerde huidlaesies. De leasies kunnen daarnaast ook onregelmatig van vorm zijn. Bij de huidvorm is herstel mogelijk, maar het kan ook eindigen met acute hemorragische septicemie en sterfte binnen enkele dagen of weken na het opkomen van de huidletsels (Archaeopteryx, referaat 90; Fowler en Allen, 1986; Lacave et al. 1997). 2.2.3
Immunologie
Dolfijnen vertonen een gelijkaardige immunologische reactie tegen vlekziekte als varkens. Zowel de humorale als cellulaire respons wordt getriggered door vlekziekte. Bij de humorale respons worden er buiten de
12
antistoffen tegen de 64-66 kDa proteïnen ook nog “anti-neuraminidase” immunoglobulines geproduceerd (Gyles en Thoen, 1993). Door het acute en vaak fatale verloop van de vlekziekte bij de septicemische vorm, wordt er aan de verdachte dieren onmiddellijk antibiotica toegediend. Een diagnostische bevestiging van de E. rhusiopathiae infectie wordt niet afgewacht. Dit zou kunnen leiden tot een antibiotica gestuurde, vervroegde beëindiging van de infectie. Het genereren van een T-cell gemedieerde immuniteitsrespons komt hierbij in het gedrag. Door het gebrek aan, of onvoldoende opbouw van een “geheugen-immuniteit”
is het dier zeer vatbaar voor een
herinfectie (Sitt et al., 2010; Tseng et al.,2009) . 2.2.4
Diagnose
De diagnose bij de dolfijn gebeurt op gelijkaardige manier als bij het varken. Voor de isolatie en identificatie van de kiem kan men bij de dolfijn ook gebruik maken van een selectief medium zoals de Colombia agar bloedplaat, gesupplementeerd met nalidixinezuur en colistine (Hoorens et al., 1988). Vroeger dacht men dat de hemocultuur waarschijnlijk niet aangewend kon worden als een diagnostisch middel wegens het acuut verloop van vlekziekte bij de dolfijn (Wood, 1992). Tegenwoordig wordt in sommige dolfinaria een hemocultuur en hematologie tergelijkertijd in gang gezet met een antibioticatherapie wanneer de dolfijnen enige afwijkende tekens (gedragsveranderingen, anorexie, lethargie,… ) vertonen (Greenwell et al., 2002). Serologische diagnose bij de levende dolfijn kan gebeuren met behulp van een agglutinatietest, haemagglutinatie-inhibitietest of precipitatietest (Van Bressem et al., 1999). Men kan gebruik maken van een latex-agglutinatietest om antistoffen tegen de 64-66 kDa proteïnen op te sporen (Jones et al., 2001; Sato et al., 1998). Haemagglutinatie inhibitietest kan gebruikt worden om antistoffen tegen E. rhusiopathiae te bepalen in het serum, volgens de methode van Rice. Een nadeel van de test is dat men geen antistoffen kan opsporen tegen bacteriële metabolieten. De aangetoonde antistoffen werken enkel tegen de antigenen van de celwand of van die van het kapsel (Gilmartin et al., 1971). Een nieuwere serologische techniek bij de dolfijn is de ELISA waarmee isotype-specifieke antistoffen (IgA, IgM, IgG) tegenover E. rhusiopathiae opgespoord kunnen worden (Suer et al. 1988b). Deze test is niet zo kostelijk vergeleken met de andere testen, en kan snel uitgevoerd worden. De species-specifieke indirecte ELISA‟s worden dan ook vaak beschouwd als de test bij uitstek voor serologische diagnose (Harlow en Lane, 1999; Van Bressem et al., 1999). Voor de test heeft men speciesspecifieke anti-immunoglobuline monoclonale (MAb) of polyclonale antilichamen (polyAb) nodig. Bij de walvisachtigen heeft men een tekort aan zulke antilichamen (Nollens et al., 2007). Nollens et al. (2007) heeft één polyAb en twee MAbs ontwikkeld die specifiek gericht zijn tegen de IgG van de tuimelaar. Men weet niet of deze antistoffen ook gaan binden op de antistoffen van andere walvisachtigen, daarvoor is verder onderzoek vereist. Men kan ook gebruik maken van PCR technieken om preventief/diagnostisch de aanwezigheid van de Erysipelothrix kiem te detecteren in de slijmlaag van vis (Palmer en Jones. 2005; Boerner et al., 2004) . Palmer en Jones. (2005) hebben het PCR protocol toegepast van Takeshe et al. (1999) en vermoeden dat de techniek eventueel gevoelig genoeg is voor de rechtstreekse detectie van de kiem in de slijmlaag, een eventuele verrijking zou niet nodig zal zijn. Dit zou de duur van de detectie gevoelig reduceren, wat een groot voordeel is.
13
2.2.5 2.2.5.1
Behandeling en bestrijding Behandeling
Net zoals bij het varken bestaat de therapie bij de dolfijn ook in het toedienen van een antibioticatherapie. Hyperimmuunserum is moeilijk te verkrijgen voor dolfijnen wegens moeilijkheden met het zuiveringsproces. Daarom wordt het af en toe eens gebruikt voor preventie, of bij eventuele protectie van een dolfijn- of orcakalfje (Lacave G., Persoonlijke mededeling, 2011). De therapie dient ook in een vroeg stadium toegepast te worden (Wood, 1992). In tegenstelling tot het varken resulteert het toedienen van een hoge dosis penicilline in een vroeg stadium niet in een snelle verbetering binnen de 24 tot 36 uur (Archaeopteryx, referaat 90). Daarnaast mag het symptomatisch behandelen (electrolytenoplossing, maagbeschermers, …) zeker niet verwaarloosd worden (Calle et al., 1993). Vochttherapie is essentieel voor de overleving van de dolfijn, men moet hierbij ook opletten dat men niet overhydrateert en de pulmonaire complicaties in de gaten houden. De gegeven medicijnen moet men ook aanpassen aan de renale excretie capaciteiten, zodat de nieren bij septicemie niet overbelast worden (Gearhart et al., 2005). Niet enkel dient de therapie zeer vroegtijdig gestart te worden, ze moet ook zo correct mogelijk nageleefd worden, waarbij men best om het uur of bij verbetering om de dag de conditie van de patiënten controleert. Een geëngageerd team is daarbij uitermate belangrijk (Gearhart et al., 2005). 2.2.5.2
Bestrijding
De huisvestingscondities (waterzuiveringssysteem, temperatuur, …) dienen zo optimaal mogelijk gehouden te worden (Geraci, 1986). Om de overdracht van vlekziekte zoveel mogelijk te beperken is het geven van vis van goede kwaliteit noodzakelijk. De verzorgers en trainers moeten ook op regelmatige basis hun handen reinigen en ontsmetten (Archaeopteryx, referaat 90). De dieren worden best preventief geïmmuniseerd tegen vlekziekte. Hoewel vaccineren met een levend verzwakt vaccin een betere immuniteit geeft dan met geïnactiveerd vaccin, worden levende vaccins bij de dolfijn niet meer gebruikt. De reden is een uitbraak van vlekziekte bij twee dolfijnen van de Amerikaanse marine na gebruik van een levend vaccin (Dunn. 1990; Gilmartin et al., 1971). Het geïnactiveerde vaccin bestaat uit met formaline gedode serotype 2 stammen (Gyles en Thoen, 1993). In een onderzoek van Nollens et al. (2005) heeft men ook de humorale immuniteit geëvalueerd na de vaccinatie met een commercieel varkensvaccin. Men heeft gevonden dat de humorale respons bij de dolfijnen zeer gelijkaardig is aan deze bij het varken (Lacave en Cox, 2000). Nollens et al. (2005) stellen een schema voor van een primo-vaccinatie bestaande uit twee vaccinaties met vier weken tussenpauze en dan om de zes maanden een boostervaccin. Het boostervaccin zou nodig zijn omdat men twaalf maanden na de primo-vaccinatie geen antistoffen meer kan aantonen in het serum. Mogelijke bijwerking bij geïnactiveerde vaccins zouden een anafylactische repons en lokale reacties kunnen zijn, en dit meestal op het tijdstip van de boostervaccinatie (Sweeney en Ridgway, 1975; Walsh et al., 2005). Dit werd waargenomen in Amerika, Zuid-Afrika en Australië, maar niet in Europa (Lacave, persoonlijke mededeling, 2011). De nevenwerkingen zouden geminimaliseerd worden door de grondige controle van de huidige varkensvaccins op bijwerkingen (Van Poucke , 1994). Nieuwere vaccins worden ontwikkeld die het gezuiverde protectieve 64 kDa vlekziekteproteïne bevatten. Het nieuwe “ER BAC® PLUS” bacterinvaccin heeft geen bijwerkingen of toch zeker een reductie van de
14
neveneffecten die bij de oudere vaccins werden gezien. Het vaccin wordt intramusculair toegediend en gedurende 30 minuten wordt de ademhalingsfrequentie, het gedrag en het bewegingpatroon van het dier bijgehouden om snel te kunnen optreden bij neveneffecten. Preventiemaatregelen worden ook genomen tijdens de vaccinatie. Endotracheale tubes, zuurstof, steroïden en adrenaline worden klaar gehouden om eventuele neveneffecten te stabiliseren. Zowel vóór als na de vaccinatie wordt bloed afgenomen voor verdere onderzoek naar de effectiviteit van de vaccinatie. In Amerika zijn er tot nu toe geen gevallen vastgesteld van anafylactische shock of van infectie na het gebruik van het vaccin (Walsh et al., 2005). De geleidelijke verschuiving van het ziektebeeld van chronische dermatologische vlekziekte naar acute septicemische vlekziekte bij walvisachtigen in Amerika heeft veel dolfinaria aangezet tot het herzien van hun mening over een vaccinatieprogramma. In een Amerikaans onderzoek op 200 walvisachtigen werden in de periode van 1985 tot 2000 vijf chronisch dermatologische gevallen gerapporteerd. Er waren geen klinische gevallen van de acute systemische infectie. Tussen 2000 en 2009 waren er op dezelfde groep dieren acht gevallen van acute septicemie door vlekziekte met meestal fatale gevolgen, en maar één chronisch geval. Veel dolfinaria in Amerika worden nu eerder gestimuleerd tot het herinvoeren van het vaccinatieprogramma tegen E. rhusiopathiae. Deze stap is ook gemakkelijker gezet door de opkomst van nieuwere en minder risicovolle bacterinvaccins (Boehm et al., 2000; Sitt et al., 2010). In een ander, internationaal onderzoek over 142 faciliteiten waaraan in totaal 1373 walvisachtigen deelnamen, heeft men gedurende de periode van 1989 tot 2000 wél 29 fatale gevolgen geregistreerd. Van die 1373 dieren had 4.22% vlekziekte (Lacave, 2000). In sommige faciliteiten waar de dolfijnen niet werden gevaccineerd, kwamen wel acute gevallen van vlekziekte voor. Bij de regelmatig (jaarlijks) gevaccineerde dolfijnen waren er geen gevallen van erysipelas. In tegenstelling tot in Amerika waren er bij de gevaccineerde dolfijnen in Europa geen gevallen van anafylactische shock met sterfte tot gevolg. Men heeft daar sinds de jaren negentig gebruik gemaakt van het commerciële varkensvaccin “Eurovac Ery®”, dat in het onderzoek naar vaccinatie bij dolfijnen werd gebruikt. Dit vaccin was niet op de Amerikaanse markt beschikbaar. Doordat “Eurovac Ery®” tegenwoordig uit de Europese markt genomen is door de komst van nieuwe vaccins, tracht men het Amerikaanse vaccin, “ER BAC® Plus”, te registreren voor het gebruik op de Europese markt. Dit vaccin heeft als voordeel dat het de bijwerkingen van de oudere vaccins elimineert en reeds werd uitgetest in de praktijk in Amerika. Men vreest in Europa echter dat het adjuvans (amphygen) dat dient als immuniteitsstimulans een eventuele anafylactische shock zou kunnen veroorzaken. Dit moet men nog nader onderzoeken (Lacave, persoonlijke mededeling, 2011). 2.2.6
Immunologisch profiel na vaccinatie bij de dolfijn
Bij onderzoek naar aanwezige antistoffen tegen vlekziekte na vaccinatie is het belangrijk te weten dat er kruisreagerende antistoffen zijn. Men heeft inderdaad gevonden dat er sterke kruisreactie is met Erysiplothrix tonsillarum, deels met Listeria monocytogenes en bijna niet met G. hemolysans. Verwijdert men de kruisreagerende antistoffen, dan verkleinen de verschillen tussen de gevaccineerde en niet-gevaccineerde dolfijnen. Het gebruik van een specifieke ELISA test om de antistoffen na vaccinatie op te sporen is dan ook onontbeerlijk. Echter na vaccinatie met één serotype wordt er wel kruisprotectie gezien tegenover meerdere serotypes maar niet tegenover alle serotypes van de vlekziektebacil (Van Poucke 1994).
15
2.2.6.1
Antistoffen aanwezig in het serum van de dolfijn
De aanwezigheid van de antistoffen (IgG en IgM) wordt opgespoord met behulp van een dolfijnspecifieke ELISA. Men gebruikt hierbij een gezuiverde vlekziektestam van de dolfijnen als antigencoating en
met
dolfijnen-antistoffen kruisreagerende anti-hond isotype (IgG en IgM) specifieke antistoffen voor isotype specifieke respons. Deze kruisreagerende anti-hond isotype specifieke antistoffen herkennen de zware ketens van de IgG en IgM isotypes van de dolfijnen. Het IgG gehalte is belangrijker dan het IgM gehalte om bescherming door het vaccin te beoordelen. Het heeft een hogere affiniteit voor een antigen dan IgM en het speelt een belangrijke rol in de bescherming tegen septicemische ziektes (Lacave et al., 1997a). Na een primaire immunisatie met een commercieel geïnactiveerd serotype 2-stammen varkensvaccin (“Aescovac Ery®”, later “Eurovac Ery®” genoemd) vindt men initieel een trage stijging van IgG antistoffen, maar een sterke stijging van de IgM antistoffen. Dit wijst op een primaire respons. Na een kleine maand gaat de IgM concentratie dalen en de IgG concentratie bereikt een plateau. Een boostervaccin is nodig opdat de vaccinatie effectief zou zijn. Bij de hervaccinatie nemen de concentraties van IgM, maar vooral IgG toe, echter na vier maanden dalen ze terug naar hun basaal niveau. Indien men een blijvende hoge antistoffenconcentratie wil bekomen, zou men ideaal gezien om de vier maanden moeten hervaccineren (Van Poucke, 1994; Vandorpe, 1997). Bij herhaaldelijke vaccinatie is vooral de verhoging van de IgG antistoffenconcentratie duidelijk (Van Poucke, 1994). 2.2.6.2
Actieve immuniteit
De beschermende werking van de antistoffen na vaccinatie wordt nagegaan door een “challenge” met virulente Erysipelothrix rhusiopathiae stammen in een muizenmodel. De muis lijkt een beter studiemodel dan het varken omdat het proefdier meer gevoelig is voor de pathogene vlekziekte-stammen bij de doflijn, dan het varken. Vaccinatie met het commerciële varkensvaccin (“Eurovac Ery®”, Eurovet, België) in een muizenmodel kruisbeschermt tegen dolfijnspecifieke isolaten (Hermans 1997). Lacave et al. (2001) hebben de duur van de actieve immuniteit na vaccinatie met het varkensvaccin nagegaan. Deze duurt tot acht weken na de vaccinatie. Na die periode kan de bescherming niet meer verzekerd worden, hoewel er eventueel wel sprake kan zijn van partiële bescherming. Het boostervaccin dient dus bij voorkeur gegeven te worden acht weken na de primaire vaccinatie. Halfjaarlijkse hervaccinatie wordt dan ook geprefereerd om een optimale actieve immuniteit te behouden. Gezien men in de bovenstaande studie werkt met een muizenmodel, moet men zich wel realiseren dat er verschillende antistoffenprofielen verkregen kunnen worden bij vaccinatie met dezelfde antigenen van verschillende diersoorten. Men kan dus niet met zekerheid zeggen of de mate van bescherming bij vaccinatie van dolfijnen en van muizen overeenkomstig zijn (Wood, 1979). 2.2.6.3
Vaccinatie met dolfijnenisolaten
Ook hier wordt het muizenmodel gebruikt om na te gaan of men een betere bescherming zou kunnen bekomen door vaccinatie met geïnactiveerde dolfijnenisolaten in plaats van met het commerciële varkensvaccin.
16
De kruisbescherming tussen de verschillende dolfijnspecifieke stammen was zwak. De protectie geïnduceerd door de geïnactieveerde dolfijnisolaten is onvoldoende. Men kan dus beter werken met het commerciële varkensvaccin (Vandorpe, 1997; Lacave en Cox, 1997b). 2.2.6.4
Antistoffen in dolfijnenmelk
Er is nog niet veel geweten over de maternale immuniteit bij de dolfijn. De dolfijn heeft een epitheliochoriale placenta waardoor de maternale antistoffen worden overgedragen naar de baby-dolfijn via het colostrum. Men vindt post partum in de melk van een gevaccineerde dolfijn een gestegen IgG en IgM gehalte. IgA heeft men niet in de melk teruggevonden. Door de actieve secretie van IgG vanuit het serum in het colostrum en de melk, vindt men in de eerste maand na partus een hoger IgG gehalte in de melk dan in het serum. Twee maanden post partum vindt men een daling van het melk IgG gehalte. IgM wordt door de plasmacellen van de melkklier zelf gesynthetiseerd. Hierdoor is het onafhankelijk van de serumconcentratie. Ondanks de aanwezigheid van de colostrale en lactogene antistoffen weet men niet in hoeverre en hoelang ze protectief zijn voor het kalfje (Vandorpe, 1997). 2.2.6.5
Vaccinatie bij dolfijnkalveren
Vroeger dacht men dat kalveren onder één jaar niet moesten gevaccineerd worden. De reden hiervoor is dat men aannam dat besmette vis de voornaamste infectieweg is. Kalveren jonger dan één jaar (speenleeftijd) aten vroeger geen vis en zouden hiervoor niet gevoelig zijn. Tegenwoordig kunnen de kalveren echter al gevoed worden met vis rond de leeftijd van drie tot vier maanden, dit mede door een goede relatie met de trainer (Lacave G., Persoonlijke mededeling, 2011). In 1991 stierf in het dolfinarium van Brugge een dolfijnkalf aan de vlekziekte, hoewel het dier nog zoogde bij de moeder (Van Poucke, 1994). Jonge dolfijnkalveren hebben ook een lagere serumeiwitconcentratie, in het bijzonder de gammaglobulineconcentratie. Hieruit leidt men af dat hun immuniteit lager is dan bij volwassen dieren, waardoor ze vaak ook gevoeliger zijn voor infecties. Om deze redenen hebben Lacave en Cox (2000) aangeraden om de dolfijnkalveren het primovaccin te geven rond drie tot zeven maanden. Voor het geven van het vaccin moeten de dieren gezond verklaard worden, wat gebeurt met een voorafgaand bloedonderzoek. Echter na één enkele vaccinatie is de antistoffentiter niet genoeg gestegen om bescherming te bieden. De dolfijnkalveren moeten dus een boostervaccinatie krijgen. Dit gebeurt best één of twee maanden na de primaire vaccinatie en wordt best gevolgd door een bloedonderzoek ter controle. Sitt et al. (2010) hebben de cellulaire immuniteitsrepons op een infectie of vaccinatie bij dolfijnkalveren onderzocht. De resultaten suggereren dat het een goede aanpak is om de dolfijnkalveren vroeg te vaccineren, vanaf een leeftijd van vier tot zes maanden oud. 2.2.6.6
Cellulaire immuniteit na vaccinatie
Net zoals bij het varken heeft men bij de dolfijn de cellulaire immuniteit na een vaccinatie geanalyseerd om de sterkte van de cellulaire respons en de grootte van het immuungeheugen te kennen. De interferon gamma (INF-γ) messenger ribonucleïnezuur (mRNA) expressie kan men correleren aan de T helper1 cel (TH1) respons van de gastheer. TH1 cellen mediëren cellulaire immuniteit belangrijk voor de eliminatie van intracellulaire pathogenen. De interleukines 4 (IL-4) en 13 worden gecorreleerd met de TH2 reactie. TH2 is vooral belangrijk
17
voor antistoffenrespons (acute overgevoeligheidsreacties, eliminatie van parasitaire infecties en mucosale immuniteit). Men heeft gezien dat na vaccinatie een gebalanceerde TH1 en TH2 memory respons ontstond. Dit ondersteunt de bevindingen van andere onderzoeken dat vaccinatie een goede preventieve maatregel is (Sitt et al. 2010).
2.3 EPIDEMIOLOGIE: KLINISCHE VELDSTUDIE 2.3.1
Algemeen
Een klinische veldstudie is een prospectieve studie die de effecten van een bepaalde profylactische of therapeutische ingreep wenst te onderzoeken. Deze vorm van studie geeft de beste evaluatie voor het uittesten van onder meer nieuwe management, behandelingstechnieken, medicijnen, vaccins of vaccinatieschemas,… (Thrusfield 2005). Een belangrijke vorm van klinische veldstudie is de gerandomiseerde gecontroleerde opzet (“randomized controlled setup”). Bij zo‟n studie worden twee of meerdere behandelingen volgens toeval aan dieren of diergroepen toegekend. Men werkt hierbij met heterogene diergroepen, zodat de factoren die eventueel een invloed kunnen uitoefenen op het effect van de vaccinatie, het aanslaan van de ziekte of de ziekte zelf, ad random verdeeld worden. Het grote voordeel van deze opzet is dat ze een hoge externe validiteit heeft. Hiermee bedoelt men dat men relatief makkelijk, de resultaten kan extrapoleren naar de praktijk. De verschillende factoren die de externe validiteit beïnvloeden worden later verder besproken. Hoewel de gerandomiseerde gecontroleerde veldstudies meestal het streefdoel zijn voor een goed klinisch onderzoek, kan men ze vaak door praktische tekortkomingen niet realiseren. In dit geval moet men zich beperken tot ongecontroleerde en niet gerandomiseerde veldstudies (Smith 2006). 2.3.2
Protocol van een klinische veldstudie
Voor men begint met de eigenlijke veldstudie moet men eerst een gedetailleerd protocol opstellen. Dit bevat alle elementen van de studie, vanaf het ontwerp tot de uitvoering van het onderzoek. Het geeft de richtlijnen weer volgens dewelke de proef zal uitgevoerd worden. Op die manier kan de waarde en validiteit van de voorgestelde studie beoordeeld worden. Het geeft ook achtergrondinformatie aan de deelnemende dierenartsen en eigenaars (Dohoo et al., 2003; Thrusfield 2005). 2.3.2.1
Achtergrond en „het waarom‟ van de studie
Een eerste stap in elk onderzoek moet bestaan uit een uitgebreide studie van reeds uitgevoerde onderzoeken. Dit vermijdt onnodige herhalingen of gedeeltelijke herhaling van hetzelfde onderzoek. Een grondige achtergrond zal ook helpen bij het beslissen welke methodiek gebruikt moet worden voor de studie: niet alle probleemstellingen worden best via een klinische studie benaderd (Dewulf J., Persoonlijke mededeling, 2010). Tenslotte is het ook belangrijk een kosten/baten-analyse uit te voeren, om te kijken of het onderzoek wel diergeneeskundig relevant is en de financiële kost en het dierlijk leed wel opwegen tegen de eventuele voordelen (Martin et al., 1987).
18
2.3.2.2
Specifieke doelstellingen
Een tweede stap is het nauwkeurig vastleggen van de doelstellingen van de studie. Deze doelstellingen moeten precies en ondubbelzinnig zijn. Ze kunnen gebruikt worden om in een vroeg stadium een hypothese op te stellen, die dan later kan geaccepteerd of afgekeurd worden. Hoewel men werkt met verschillende doelstellingen is het nuttig om een hoofdcriterium te bepalen voor het testen van de hypothese. Men noemt dit het primaire eindpunt (“primary end point”). Verschillende vraagstellingen hebben invloed op de keuze van het hoofdcriterium: wat is klinisch en economisch het meest belangrijke criterium? Wat zijn de praktische (bijvoorbeeld financiële) beperkingen? Welk criterium kan men makkelijk meten? Het hoofdcriterium helpt orde te scheppen in het onderzoek. Indien men teveel doelstellingen zou hebben, zou de complexiteit van het onderzoek dit onderzoek zelf tegenwerken (Martin et al., 1987; Thrusfield 2005). 2.3.2.3
Criteria voor het selecteren van dieren
Een volgende stap is het definiëren van de steekproefpopulatie en de studiepopulatie. De studiepopulatie is de populatie van alle dieren die relevant zijn voor de studie. Dit zijn dus niet enkel de dieren die effectief deelnemen aan de studie, maar ook de dieren waar men de studieresultaten naar wil extrapoleren. De groep van dieren die effectief deelnemen aan de studie noemt men de steekproefpopulatie. Om de externe validiteit hoog te houden, moet de steekproefpopulatie de studiepopulatie zo goed mogelijk representeren. Hiertoe maakt men meestal gebruik van randomisatietechnieken (Dohoo et al., 2003). Men moet hierbij rekening houden met het feit dat in zulke onderzoeksprojecten meestal gewerkt wordt met vrijwilligers. Onderzoek heeft uitgewezen dat vrijwilligers op verschillende vlakken anders reageren dan niet vrijwilligers. Indien het mogelijk is zou men de karakteristieken van de vrijwilligers moeten kunnen vergelijken met de niet-vrijwilligers. Op deze manier kan men de resultaten van de veldstudie beter extrapoleren naar de doelpopulatie (Martin et al., 1987). Het selectieproces duidelijk weergeven is van uiterst belang in een klinische veldstudie. Om dit te verwezenlijken maakt men gebruik van in- en exclusiecriteria. Deze bepalen welke dieren of bedrijven in de studie worden opgenomen. Het doel van deze criteria is te zorgen dat alleen dieren met een relevante conditie voor de behandeling, worden opgenomen in de studie. Zo zal in een onderzoek naar de toepassingen van insuline één van de criteria zijn dat alle deelnemende patiënten diabetes hebben. Opdat men objectief de deelnemers zou selecteren moet men de conditie waarop men selecteert diagnostisch definiëren (Martin et al., 1997; Thrusfield 2005). Men moet hier voorzichtig en evenwichtig te werk gaan. Indien te strikte criteria worden gehanteerd, zijn de uitkomsten van de studie enkel toepasbaar op de dieren en bedrijven die voldoen aan die criteria. Extrapoleren naar de studiepopulatie komt hiermee in het gedrang. Het voordeel is wel dat men makkelijker statistische relevantie zal kunnen aantonen. Wanneer er te weinig of geen criteria worden ingevoerd, bekomt men een grotere hoeveelheid potentiële kandidaten voor het onderzoek. Dan kan de diversiteit tussen de deelnemende dieren of bedrijven echter zodanig groot zijn dat men geen eenduidige conclusie meer kan trekken na het onderzoek (Dohoo et al., 2003; Martin et al., 1998). In het algemeen moeten de criteria geval per geval opgesteld worden en dit in functie van de doelen van de studie en de beoogde toekomstige doelpopulatie van de behandeling (Zwarenstein et al., 2006).
19
In de klinische veldstudie werkt men met experimentele eenheden. Een experimentele eenheid is de kleinste eenheid waar het effect van behandeling onafhankelijk is van de omgeving. Deze eenheid kan een onderdeel van een dier zijn, een individueel dier of een diergroep (hok, kennel, bedrijf,…). De onderzochte behandeling bepaalt in zekere mate of een experimentele eenheid om een onderdeel van een dier, een individueel dier of een diergroep gaat (Dohoo et al., 2003). Een onderdeel van een dier kan bijvoorbeeld een uierkwartier bij een koe zijn, waar men de werking van intramammaire preparaten wil evalueren. Aan de andere kant kunnen dieren die samen gehuisvest worden onder invloed staan van externe factoren (hygiëne, …) die de hele groep beïnvloeden. Zulke factoren kunnen vaak niet onderscheiden worden van het effect van behandeling op een individueel dier. Het is in zo‟n geval wenselijk om de groep van dieren die samen gehuisvest worden als experimentele eenheid te nemen (Thrusfield 2005). Ook als men het effect van een nieuw vaccin op groepsniveau wilt meten, zoals bij samen gehuisvest varkens, zal de experimentele eenheid een diergroep zijn. Wil men daarentegen het vaccin testen op individueel niveau, wat vaak het geval is bij dolfijnen, dan zal de experimentele eenheid het individueel dier zijn. Als men de experimentele eenheid niet goed definieert, kan dat grote gevolgen hebben voor de interpretatie van de bekomen resultaten. Dit is een probleem dat vrij vaak voorkomt (Martin et al. 1988). De eigenaars van de dieren of verantwoordelijke van de deelnemende bedrijven moeten na voldoende informatie over de studie hun “informed consent” geven. Pas na het krijgen van de “informed consent” mag men overgaan tot het vormen van experimentele groepen (Mausner en Kramer, 1985; Thrusfield 2005). 2.3.2.4
Beschrijving van de studieopzet
Belangrijkste studieopzettypes Er zijn verschillende manieren om een studie op te zetten. De manier van opzetten wordt bepaald door verschillende factoren zoals het aantal verschillende behandelingen die er zijn, ethische overwegingen, het effect van het niet behandelen van een dier, enzovoort. Hieronder worden de belangrijkste types besproken. “Parallel-group” De experimentele eenheden worden at random verdeeld over verschillende groepen. Men heeft minstens één behandelingsgroep en één controlegroep. De verschillende groepen worden tegelijkertijd aan hun behandeling onderworpen. De controlegroep kan geen behandeling krijgen (of een placebo) of kan de al reeds best gekende behandeling krijgen. Het grootste voordeel van deze vorm is dat tijdsgebonden invloeden minder doorwegen in de resultaten. Ook zal het makkelijker zijn om objectiviteit te garanderen omdat de processen gelijktijdig plaats grijpen. “Cross-over-design” In deze onderzoeken worden meerdere behandelingen toegepast op alle dieren. Men vergelijkt dan per dier wat het verschil in effect is van elke behandeling. Dat wil zeggen dat de dieren dus eigenlijk hun eigen controlegroep vormen. Deze opzet heeft als nadeel dat er overlap kan zijn in de effecten van de verschillende behandelingen. Het is daarom belangrijk om genoeg tijd te laten tussen de verschillende behandelingen. Dit soort onderzoek is vooral van toepassing bij chronische aandoeningen waarbij de behandeling symptomatisch inwerkt, omdat bij het starten van een nieuwe behandeling de beginconditie dan telkens dezelfde is (wegens de chronische aard van de aandoening). “Factorial-design” 20
Deze vorm is een lichte variatie op het “parallel-group” onderzoek, waarbij combinaties van de verschillende behandelingen worden gemaakt. In een onderzoek met twee verschillende behandelingen A en B, worden vier groepen gemaakt: een eerste groep (de controlegroep) die geen behandeling krijgt, een tweede groep die enkel behandeling A krijgt, een derde groep die behandeling B krijgt en een laatste groep die behandeling A en B tegelijk krijgt. Dit ontwerp laat toe om combinaties van behandelingen ook te bestuderen (Martin et al. 1987; Petrie en Watson 1999; Thrusfield 2005). In deze literatuurstudie wordt vooral aandacht besteed aan het veldstudietype dat belangrijk is voor het uittesten van een nieuw vaccin. Vermits het parallelle groep ontwerp het beste is voor deze situatie zullen de hierna besproken facetten vooral hierop van toepassing zijn (Smith 2006). Randomisatie Bij het opdelen van de dieren in de behandelingsgroepen en de controlegroep is het uiterst belangrijk dat deze groepen vergelijkbaar zijn voor alle factoren (in het bijzonder de factoren die een invloed hebben op de bestudeerde ziekte zelf), behalve de behandelingsfactor. De patiënten worden daarom willekeurig in groepen ingedeeld. Elke groep krijgt daarna een behandeling toegewezen. Op deze manier wordt de behandeling willekeurig verdeeld over de deelnemende dieren. Als men de groepen manueel zou indelen zou er bewust of onbewust een selectiebias kunnen optreden. Dit wil zeggen dat de onderzoeker bewust of onbewust de behandeling zou toekennen aan bepaalde dieren en niet aan andere. Dit heeft vertekeningen van het onderzoeksbeeld tot gevolg. Een ander voordeel is dat de data bruikbaar zullen zijn voor statistische evaluatie van de resultaten. In zo‟n analyse is randomisatie immers vaak een voorwaarde (Martin et al. 1987; Mausner en Kramer 1985). Men heeft verschillende vormen van randomisatie die men toepast naargelang de situatie. “Simple randomization” is een basis randomisatieprocedure. Hierbij heeft elk dier evenveel kans om in de te onderzoeken groepen terecht te komen. Pure randomisatie is moeilijk te bekomen, meestal gebruikt men hierbij een randomgenerator. Met deze vorm is het mogelijk dat de grootte van de groepen sterk verschilt, in het bijzonder bij onderzoek met weinig proefdieren. Dat probleem kan men oplossen door het gebruik van “Restricted” of “blocked” randomisatietechnieken. Deze zijn een lichte wijziging van simpele randomisatie waarbij er gezorgd wordt dat de groepen even groot zijn. Bij “Group randomization” selecteert men groepen of clusters van dieren die worden getest. Men gebruikt deze vorm van randomisatie als men gegevens heeft over de groepen of clusters dieren maar weinig individuele gegevens (zoals voorbeeld in een varkensstal). Ook wordt het toegepast als de behandeling moet gegeven worden aan een groep van dieren (vaccinaties, voedingswijzigingen,…) “Stratified randomization” wordt toegepast in een situatie waarbij de steekproefpopulatie zeer klein is in vergelijking met de totale populatie. Het gevolg hiervan is dat door toeval bepaalde dieren, diergroepen of deelnemende bedrijven ondervertegenwoordigd worden in de steekproefpopulatie. Om dit te vermijden worden de dieren onderverdeeld in verschillende strata. Elk stratum wordt gekenmerkt door een bepaalde eigenschap (bijvoorbeeld een leeftijdsgroep). Men neemt dan uit elk stratum een aantal dieren. Op deze manier benadert de steekproefpopulatie zo optimaal mogelijk de studiepopulatie. Een “non- randomization” methode is de systematische steekproef. In plaats van het gebruik van een randomgenerator gaat men hier systematisch het nde (n = populatieomvang/steekproefpopulatie) dier uit de
21
populatie selecteren. Hoewel theoretisch de standaard-randomisatie beter is, worden in praktijk eerder systematische steekproeven genomen. Men moet hierbij wel voorkomen dat men niet te maken heeft met een populatie die onderhevig is aan cyclische invloeden (Petrie en Watson 1999). Hoewel men ernaar streeft, kan de randomisatie van de groepen geen volledige garantie geven dat de groepen inderdaad voor alle facetten gelijk zijn. Dit probleem komt vooral voor bij een proefopstelling met maar een klein aantal patiënten (Petrie en Watson 1999). De controlegroep Een controlegroep is noodzakelijk opdat men kan concluderen dat de therapie effect heeft op de proefdieren. Bij een nieuw vaccin of vaccinatieschema kan het niet aanslaan van vlekziekte liggen aan de werking van het vaccin, maar ook aan andere factoren, zoals een lage infectiegraad, lage virulentie, immuniteit van de gastheer enzovoort. Daarbij kan het zijn dat bij gebrek aan een controlegroep men subjectief gaat vaststellen dat de behandelde dieren inderdaad betere resultaten produceren dan in werkelijkheid het geval is (Petrie en Watson 1999). De controle kan onderverdeeld worden in drie methoden. Een historische controle houdt in dat de resultaten van de huidige behandeling worden vergeleken met resultaten van behandelingen bekomen in het verleden. Door de interferentie van tijdsgebonden evoluties wordt dit type van controle eerder afgeraden. Indien toegepast, is dit vaak in gevallen waar men het aantal dieren dat participeert in het onderzoek wil beperken, of wanneer men de nieuwe behandeling aan alle dieren wil toedienen (vanuit ethisch standpunt) (Mausner en Kramer 1985; Petrie en Watson 1999). In een tweede methode werkt men met een controlegroep die men geen behandeling geeft, dit noemt men een negatieve controle. De uitkomst van de controlegroep wordt dan vergeleken met die van de behandelingsgroep. Opdat de eigenaar of de onderzoeker niet op de hoogte zou zijn van welke dieren effectief behandeld worden („double blinding‟, zie verder), kan men de dieren in deze groep een placebobehandeling geven. Een placebo is een product dat niet onderscheiden kan worden van het eigenlijke onderzochte product, maar dat geen klinisch effect heeft. Vaak gaat het gewoon om het omhulsel van het product en dient men niets toe aan het dier. Deze vorm van controle wordt toegepast in situaties waarbij de aandoening minder ernstig is en/of er geen goede behandeling beschikbaar is (Dohoo et al. 2003; Mausner en Kramer 1985; Petrie en Watson 1999). Bij een positieve controle worden de resultaten van de nieuwe behandeling vergeleken met de resultaten van een gekende standaardtherapie. Dit wordt toegepast in gevallen waarbij het gaat om ernstige aandoeningen met een gekende standaardtherapie (Mausner en Kramer 1985; Petrie en Watson 1999). Kwaliteit van informatie: onderscheidend vermogen (Power) Het onderscheidend vermogen van een studie is de kans dat men in een studie terecht een significant verschil kan aantonen. Deze kans is afhankelijk van de grootte van de studiepopulatie, de grootte van het effect van de interventie en de natuurlijke variatie in de gemeten parameters. Bepalen van de grootte van een populatie is een delicate opdracht. Neemt men teveel dieren, dan is het niet enkel duur, maar men loopt ook het risico om een significantie aan te tonen tussen biologisch irrelevante factoren. Dit geeft een type 1 fout: de kans om verkeerdelijk een verschil aan te tonen. Als men te weinig dieren
22
in de studie opneemt kan men soms geen significante correlatie aantonen tussen biologisch relevante factoren. Uit zo‟n situatie krijgt men een type 2 fout: de kans om verkeerdelijk geen verschil aan te tonen (Martin et al. 1988). Overzicht van de verschillende mogelijkheden bij het testen van hypothesen (Dewulf J. 2010-2011) . Werkelijkheid Niet effectief
Effectief
Niet effectief
Correct besluit: 1 – α betrouwbaarheidsniveau (vb.. 95%)
Foutief besluit: β type II fout (vb.. 20%)
Effectief
Foutief besluit: α type I fout (vb.. 5%)
Correct besluit: 1 – β power (vb.. 80%)
Waargenomen (in experiment)
Wil men een realistische kans hebben op het aantonen van verschillen in behandelingen, dan kan men best een “power calculatie” uitvoeren. Dit is een “berekening van de benodigde steekproefgrootte”. Uit die berekening weet men hoeveel dieren nodig zijn voor de studie. Indien men de type I en type II fouten klein wil houden, heeft men meer dieren nodig voor het onderzoek. Het aantal proefdieren zal ook moeten stijgen als het effect van de behandeling klein is of als er veel variatie is tussen de resultaten (Martin et al. 1987; Thrusfield 2005). De grootte van een behandelingseffect is makkelijker aan te tonen als het gaat over een groot effect, dan wanneer men te maken heeft met een klein effect (Martin et al. 1987; Thrusfield 2005). Bij variabiliteit in de parameters is het vanzelfsprekend dat grotere variatie in de parameters aanleiding geeft tot de noodzaak voor meer observaties. Indien er een klein aantal variaties is, zijn minder observaties voldoende (Martin et al. 1987; Thrusfield 2005). 2.3.2.5
Beschrijving van de behandelingsprocedure
De behandelingsprocedure die men wenst te testen moet gedetailleerd beschreven worden. De toedieningswijze, tijdstip van toedienen, dosering, duur van behandeling enzovoort, dienen nauwkeurig omschreven te worden. Op deze manier beperkt men de persoonlijke interpretatie van het protocol waardoor de resultaten zo weinig mogelijk subjectief beïnvloed worden (Thrusfield 2005). 2.3.2.6
Beschrijving van alle klinische, biologische e.a. methodes
Alle methodes (zoals autopsie, bloedafnames, enzovoort), gebruikt voor het opvolgen van de bestudeerde factoren en andere variabelen, worden ook beschreven in het protocol. Het onderzoek wordt zo goed gedocumenteerd en het vergemakkelijkt ook het opvolgen van het gehele onderzoek door alle participanten (Thrusfield 2005). 2.3.2.7
Kwaliteitscontrole
Om de betrouwbaarheid van het onderzoek te verzekeren is het uitermate belangrijke om op de gebruikte technieken een kwaliteitscontrole uit te voeren. Zonder deze controle kunnen de resultaten van de technieken niet beschouwd worden als betrouwbare gegevens. Zo‟n controle kan bijvoorbeeld bestaan uit het bepalen van de hoeveelheid antigen in het vaccin (Dewulf J., Persoonlijke mededeling 2010).
23
2.3.2.8
Parameters ter vergelijking
De parameters die men gebruikt om de bestudeerde behandeling te beoordelen moet men op voorhand vastleggen. Daarbij wordt een onderscheid gemaakt tussen de belangrijke en bijkomende variabelen. De voorkeur wordt gegeven aan de belangrijke parameters die men objectief en kwantitatief kan meten. Bij schattingen die subjectief getint kunnen zijn, kan men met behulp van een score systeem zoveel mogelijk objectiviteit toevoegen. Zo‟n scoresysteem wordt bijvoorbeeld toegepast bij het vaststellen van het jeukgedrag bij een patiënt. (Martin et al. 1987). 2.3.2.9
Opvolging (follow-up)
Blindering Wanneer de eigenaar van het dier of de onderzoeker op de hoogte is van welke dieren een behandeling hebben gekregen, kunnen ze de parameters subjectief beoordelen. Om dit te voorkomen werkt men met blinderingsmethodes. Bij een „single-blind‟ onderzoek weet ofwel de eigenaar van het dier, ofwel de onderzoeker niet welke dieren behandeld zijn. Bij „double-blind‟ onderzoek zijn beiden niet op de hoogte. „Double-blind‟ onderzoek wordt gebruikt wanneer de parameters niet objectief kunnen gemeten worden (vb. klinische toestand). „Triple-blinding‟ onderzoek houdt in dat zowel de eigenaar, de onderzoeker als de dataanalyst niet op de hoogte zijn van welke dieren behandeld zijn en welke niet (Martin et al., 1987; Mausner en Kramer, 1985; Petrie en Watson, 1999; Thrusfield 2005; Smith 2006). Het is belangrijk om het succes van de „blinding‟ methode te evalueren en niet zomaar aan te nemen (Boutron et al., 2005). Deze evaluatie kan gebeuren met behulp van een placebo. Door het toedienen van een placebo weet de eigenaar of onderzoeker werkelijk niet welke dieren er behandeld worden en welke niet. In sommige gevallen is het gebruik van een placebo niet voldoende om het succes van een „blinding‟ methode te garanderen. Dit zijn situaties waarin de therapie een sterk zichtbaar effect heeft op het dier. Hierdoor kan de eigenaar of onderzoeker direct opmerken welke dieren de therapie hebben gekregen en welke niet, ondanks het gebruik van een placebo (Hrobjartsson et al., 2007; Dohoo et al., 2003; Martin et al., 1987; Mausner en Kramer, 1985; Petrie en Watson, 1999; Thrusfield 2005; Smith 2006). Loss to follow up en „compliance‟ Doorheen de klinische studie moeten alle dieren of diergroepen goed opgevolgd worden, om een betrouwbaar resultaat te kunnen bekomen. Deze opvolging geldt zowel voor de periode rond de behandeling als voor de periode na de behandeling. Gedurende deze periode is het mogelijk dat men informatie verliest, door „loss to follow up‟ of „lack of compliance‟ (zie hieronder), zeker als het gaat om langdurige studies of het bestuderen van zeer grote groepen (Dohoo et al., 2003; Thrusfield 2005). „Loss to follow up‟ gebeurt wanneer men proefdieren verliest gedurende de periode van de veldstudie. Mogelijke oorzaak kan zijn dat de eigenaar niet langer wil participeren aan de klinische studie. Men probeert altijd zo goed mogelijk om alle dieren doorheen de hele proefperiode te behouden. Eén van de meest efficiënte manieren om dat te verwezenlijken is via regelmatig contact met de participanten. De eigenaars kunnen beter gemotiveerd worden als ze bijvoorbeeld goed op de hoogte worden gehouden van de stand van zaken, of wanneer er een financiële tegemoetkoming is. Ondanks de moeite is het vaak onvermijdelijk dat men
24
proefdieren verliest tijdens het onderzoek. Het is dan belangrijk om bij te houden wat de reden is van de „dropout‟ en in welke toestand het dier zich bevond net voor de „drop-out‟. Doorheen het onderzoek moeten al deze verliezen genoteerd worden. Tijdens het verwerken van de gegevens en interpretatie van de resultaten moet men hiermee rekening houden (Dohoo et al., 2003; Thrusfield 2005). „Compliance‟ houdt in dat de uitvoering en opvolging van het onderzoek gebeurt volgens het vooropgestelde protocol. Vaak komt het voor dat de eigenaar of de onderzoeker zich hier niet aan houdt: men noemt dit dan „poor compliance‟ of „lack of compliance‟. „Poor compliance‟ komt vaker voor bij ingewikkelde en langdurige proeven en/of proeven met een vaag en onduidelijk protocol. Men moet dit zoveel mogelijk vermijden wil men objectieve resultaten bekomen (Thrusfield 2005). Er zijn verschillende mogelijkheden om de „compliance‟ van de eigenaars te evalueren. De onderzoeker kan bij een routinematig bezoek aan de eigenaar een lijst van vragen stellen waaruit blijkt of de eigenaar zich al dan niet houdt aan het protocol. Een andere manier is controle van het medicatieniveau bij de dieren, om te kijken of ze de juiste dosis van de medicatie krijgen (Thrusfield 2005; Dohoo et al., 2003). 2.3.2.10 Definitie van bijwerkingen Uittesten van nieuwe behandelingen of vaccinaties houdt ook in dat men vaak te maken zal hebben met bijwerkingen. Zo kan bijvoorbeeld het adjuvans van een nieuw vaccin een anafylactische shock teweeg brengen bij dolfijnen. Het is daarom belangrijk een methode te ontwikkelen om deze bijwerkingen zo spoedig mogelijk op te sporen en volgens protocol in te grijpen (Dewulf J., Persoonlijke mededeling 2010). 2.3.2.11 (Statistische) analyse De resultaten van het onderzoek moeten tenslotte door een data-analyst verwerkt worden. In de statistische testen maakt men meestal gebruik van de p-waarde. De p-waarde is de kans dat een verschil tussen de behandelingen door toeval wordt veroorzaakt. In de praktijk wordt meestal een waarde van 0.05 (5 procent kans op toeval) aangehouden als breekpunt. Dit breekpunt noemt men het significantieniveau. Bij een p-waarde kleiner dan 0.05 wordt aangenomen dat het verschil niet door toeval is ontstaan (Martin et al., 1987). Statistisch significante resultaten in het onderzoek impliceren niet dat er ook klinische relevantie is. Men moet dus zowel rekening houden met de statistische resultaten als met de klinische impact van de behandeling (Smith 2006). 2.3.3
Veldstudie: Evaluatie van vlekziektevaccins bij varkens
Ter ondersteuning van de hierboven gegeven theoretische benadering van de klinische veldstudie zal wordt een praktische veldstudie beschreven. In een Australische onderzoek van Eamens et al. 2006 wordt de efficaciteit van verschillende vaccins tegen E. rhusiopathiae in varkens geëvalueerd. Vaccins Men test in totaal vier verschillende vaccins. Twee commerciële bivalente bacterinvaccins met aluminiumhydroxide adjuvans en twee experimentele vaccins gevormd uit twee stammen van de serotype 2 vlekziekte.
25
Studieopzet De studie werd opgezet met een “parallel group design”. Men werkt met vijf groepen, één voor elk vaccin en één controlegroep. Men gebruikt in de proefopzet 24 beren van 13 weken oud. De beren komen van een commercieel bedrijf en werden voordien gehuisvest in eenzelfde groep. Dit garandeert dat de dieren onder dezelfde externe omstandigheden zijn opgegroeid. De proef werd goedgekeurd door de ethische commissie voor dierenwelzijn. De dieren werden in groepen ingedeeld via een gestratificeerd randomisatie patroon. Daarbij worden de beren volgens gewicht at random verdeeld over de 5 behandelingsgroepen. Vervolgens werden de 24 dieren per drie geplaatst op acht verschillende locaties, waarbij elk dier weer at random aan een locatie werd toegekend. Hierdoor wordt het effect van de omgevingsfactoren makkelijker onder controle gehouden. Er werd een strikt vaccinatieschema toegepast: de eerste vaccinatie gebeurde in week 13 en de tweede in week 16. Daarna werden de vijf groepen beren geanesthesieerd en intradermaal geïnoculeerd met de E. rhusiopathiae stammen op week 18. Acht dagen na de inoculatie worden de dieren geëuthanaseerd. “Challenge” stammen Voor de “challenge” gebruikt men 8 vlekziektestammen met serotypes 1a, 1b of 2. De dosis van de toegediende kiemen werden via eerder onderzoek bepaald, net zoals de post-inoculatie tijdstippen om de huidletsels te beoordelen. Metingen en staalname De afmetingen van de huidletsels 24, 48 en 72u post-inoculatie bepaalden mee de mate van protectie van het vaccin. Zowel de grootte van de huidletsels als de vorm van de letsels worden opgemeten. Men maakt ook een onderscheid tussen de circulaire post-inoculaire huidreactie en de typische rhomboïdale vlekken. Daarnaast werden de klinische conditie van de varkens ook bijgehouden tijdens de eerste week na de challenge en werden bloedstalen genomen voor en na de inoculatie en bij euthanasie. De antilichamentiters tegen E. rhusiopathiae werden bepaald met ELISA en lymfocytenproliferatie in respons op vlekziekte antigenen en non-specifieke mitogenen werden als maatstaf genomen voor celgemedieerde immuniteit. Resultaten Na statistische analyse blijkt dat het eerste commerciële vaccin het minst goed scoort. Na de challenge vertonen de varkens die gevaccineerd werden met dit vaccin de meest opvallende klinische letsels (de controlegroepsdieren niet meegerekend). Zowel de humorale als de celgemedieerde immuniteit werden het minst gestimuleerd. Bovendien werkte het ook het meest immunosuppresief op de celgemedieerde immuunrespons in vergelijking met de drie andere vaccins. De beste resultaten werden bekomen met het tweede commerciële vaccin (hoogste antistoffen tegen serotype 1 vlekziekte, en hoogste cellulaire immuunrespons tegen serotype 2 antigenen). De twee experimenteel bekomen vaccins gaven gemiddelde resultaten wat betreft de humorale en cellulaire immuunrespons.
26
2.4 CONCLUSIES Vlekziekte blijft doorheen de jaren in bepaalde regio‟s in de wereld een belangrijke ziekte in de varkensindustrie, waar ze voor economische verliezen verantwoordelijk is. Daarom wordt nog veel onderzoek, verricht dat leidt tot het beter begrijpen en bestrijden van deze ziekte. Opvallend is dat deze onderzoeken meestal gebeuren in Japan, Amerika en Australie. Men kan bijna geen artikels vinden over erysipelas vanuit de Europese Unie (EU). In Japan zijn er de laatste jaren vaker problemen met vlekziekte. Men heeft opgemerkt dat er een verschuiving is van de acuut septicemische vorm naar de chronisch, dermatologische vorm. In Amerika en Australië ziet men uitbraken van acute vlekziekte, daarbij wordt de chronische vorm ook vaker opgemerkt in sommige bedrijven. Opmerkelijk is dat men in de EU geen problemen heeft met deze uitbraken: de situatie in de EU is dat de ziekte bijna geëradiceerd is met behulp van vaccinatieprogramma‟s (Haesebrouck, Persoonlijke mededeling 2011). Eén van de theorieën is dat de chronische vorm veroorzaakt wordt door het gebruik van geattenueerde vaccins. In Japan, Amerika en Australië werkt men zowel met levend verzwakte als met geïnactiveerde vaccins. Dit is in de EU niet het geval. Daar wordt enkel gebruik maken van geïnactiveerde vlektziektevaccins (European pharmacopoeia). Men vindt in de literatuur tegenstrijdige bevindingen hieromtrent. Verder onderzoek is nog nodig voor een sluitend antwoord. Een tweede mogelijkheid is dat er een daling is van de vaccin-efficaciteit of dat het vaccinatieprogramma niet strikt wordt nageleefd (Eriksson et al. 2009; Imada et al. 2004; Nagai et al. 2008; Opriessnig et al. 2004). Een derde verklaring kan zijn dat de vlekziektestammen in de EU minder virulent zijn dan in Japan, Amerika en Australië, zoals bijvoorbeeld ook het geval is voor het Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), waarbij er minder virulente stammen zijn in België dan in sommige andere landen. Een vierde mogelijkheid is, doordat in de EU nieuw ontwikkelde vaccins aan zeer strenge registratieregels onderworpen zijn, dat deze vaccins beter geschikt zijn voor inductie van immuniteit tegen de serotypes die in de EU voorkomen. Enkele voorbeelden van huidig gebruikte vaccins tegen E. rhusiopathiae zijn Ruvax®, Erysorb®. Veel informatie over vlekziekte bij dolfijnen moet men proberen te extrapoleren uit onderzoek verricht op varkens. In deze literatuurstudie werd bekeken welke epidemiologische voorwaarden belangrijk zijn om een goede experimentele veldstudie op te stellen voor het uittesten van de efficaciteit van een nieuw vaccin. Hierna werd bekeken hoe zo‟n epidemiologische studie in praktijk wordt uitgevoerd. Hoewel het enorm nuttig zou zijn, kan de methodiek die toegepast wordt in de varkensindustrie niet toegepast worden bij dolfijnen. Men kan ten eerste al geen placebo geven aan deze dieren. De dolfinaria zouden immers nooit toelaten dat het ene dier behandeld wordt en het andere niet. Inoculatie van de kiem is ook volledig uit den boze. Een ander groot nadeel is het beperkt aantal dieren waarop men de studie kan baseren. Als al de dolfinaria in Europa zouden willen samenwerken, kan men een studie opzetten met ten hoogste 120 walvisachtigen, wat een zeer klein aantal is om een grondige epidemiologische studie uit te voeren (Lacave, Persoonlijke mededeling 2011). Een epidemiologische studie bij dolfijnen wordt om deze redenen dus sterk bemoeilijkt. In het labo van Prof. E. Cox heeft men bloedstalen van gevaccineerde dolfijnen genomen over een periode van twintig jaar. Verschillende dolfijnen zijn gedurende deze periode met verschillende vaccins gevaccineerd. Een mogelijkheid tot een klinische veldstudie kan zijn om deze bloedstalen te onderzoeken en de verkregen immunologische profielen na vaccinatie met de verschillende vaccins te vergelijken (historische controlegroep). Dit zal het onderwerp zijn van het vervolg op deze masterproef. 27
3 LITERATUURLIJST Abreshev I., Orozova P. (2006). Erysipelothrix rhusiopathiae neuraminidase and its role in pathogenicity. Z Naturforsch C. 61(5-6), 434-8. Archaeopteryx. Veterinaire vereniging voor vogels en bijzondere dieren, referaat 90. Vlekziekte bij de dolfijn, rijksuniversiteit Utrecht. Bauwens l., Cnops S., De Meurichy W. (1992). Isolation of Erysipelothrix rhusiopathiae from frozen fish and fish-eating animals at Antwerp Zoo. Acta Zoologica et Pathologica Antwerpiensia 82, 41-49. Bender J.S., Kinyon J.M., Kariyawasam S., Halbur P.G., Opriessnig T. (2009). Comparison of conventional direct and enrichment culture methods for Erysipelothrix spp. from experimentally and naturally infected swine. J Vet Diagn Invest 21, 863-868. Boehm J., Lacave G., Patterson R. (2000). Proceedings of the first international workshop on Erysipelas in cetaceans. Chicago, Illinois, USA. Boerner L., Nevis K.R., Hinckley L.S., Weber E.S., Salvator F. Jr. (2004). Erysipelothrix septicemia in a little blue pengium (Eudyptula minor). J Vet Diagn Invest 16, 145-149. Bossart G.D., Eimstad E.A. (1988). Erysipelothrix vesiculair glossitis in a killer whale (Orcinus orca). Journal of zoo animal medicine 19, 42-47. Boutron I., Estellat C., Ravaud P. (2005). A review of blinding in randomized controlled trials found results inconsistent and questionable. J. Clin. Epidemiol 2005. 58, 1220-6. Bratberg A.M. (1981). Observations on the utilization of a selective medium for the isolation of Erysipelothrix rhusiopathiae. Acta vet. Scand. 22, 55-59. Brooke C.J., Riley T.V. (1999). Erysipelothrix rhusiopathiae: bacteriology, epidemiology, and clinical manifestations of an occupational pathogen. Journal of Medical Microbiology 48, 789-799. Buxton A., Fraser G. (1977). Animal Microbiology. Oxford, Blackwell. Calle P.P., David E.K., Cook R.A. (1993). Successful treatment of suspected erysipelas septicaemia in a Beluge whale (Delphinapterus leucas). Zoo biology 12, 483-490. Chin J.L., Turner B., Eamens G.J. (1991). Serological assay for swine erysipelas using nitrocellulose particles impregnated with an immunodominant 65 kDa antigen form Erysipelothrix rhusiopathiae. Veterinary Microbiology 31, 169-180. Cornelisse J.L. (1993). Erysipelothrix. In: J.L. Cornelisse (ed). Bacteriële ziekten en Mycotische Aandoeningen bij Dieren, Tweede geheel herziene druk, wettenschappelijke uitgeverij Bunge, Utrecht p. 238-245. Denecke R., Trautzein G. (1986). Local antigen persistence and chronicity of experimental erysipelas polyarthritis. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 99, 200-208. Dewulf J. (2010-2011). Beginselen van de veterinaire epidemiologie. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p. 77-87. Dierauf L. A., Gulland F. M. D. (2001). eds CRC handbook of marine mammal medicine. Boca Raton, FL, CRC Press, 2nd ed., p.115-125. Dohoo I., Martin W., Stryhn H. (2003). Veterinary epidemiologic research, 2nd edition, p. 213-235. Drommer W. (1982). Pathogenesis of joint alterations in experimental erysipelas polyarthritis. In: Proceedings of the International Pig Veterinary Society. Ed. Necoechea R.R., Pijoan C., Cesarin A., Guzman M. p. 159.
28
Dunn J.R. (1990). Bacterial and mycotic deseases of cetaceans and pinnipeds. In: L.A. Dierauf (ed). CRC Handbook of Marine Mammal Medicine: health, disease, and rehabilitation. Boca Raton, Florida, CRC Press. p. 73-87. Eamens G.J., Chin J.C., Turner B., Barchia I. (2006a). Evaluation of Erysipelothrix rhusiopathiae vaccines in pigs by intradermal challenge and immune responses. Veterinary Microbiology 116, 138-148 Eamens G.J., Forbes W.A., Djordjevic S.P. (2006b). Characterisation of Erysipelothrix rhusiopathiae isolates from pigs associated with vaccine breakdowns. Veterinary Microbiology 115, 329-338 Eamens G.J., Turner M.J., Catt R. E. (1988). Serotypes of Erysipelothrix rhusiopathiae in Australian pigs, small ruminants, poultry, and captive wild birds and animals. Australian Veterinary Journal, Vol. 65, No. 8. Eriksson H., Jansson D.S., Johansson K.E., Baverud V., Chirico J., Aspan A. (2009). Characterization of Erysipelothrix rhusiopathiae isolates from poultry, pigs, emus, the poultry red mite and other animals. Veterinary Microbiology 137, 98-104. European Pharmacopoeia fifth edition. Fowler M. E., Allen M. E. (1986). Zoo and wild animal medicine. Philadelphia (Pa.), Saunders, p.777-779. Galán J.E., Timoney J.F. (1990). Cloning and expression in Escherichia coli of a protective antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae. Infection and Immunity 58, 3116-3121. Gauckler A. (1976). Delphine. In: H.G. Klös en E.M. Lang (eds). Zootier krankheiten, p.128-133. Gearhart S., Walsh M., Chittick B. (2005). Medical management of peracute Erysipelothrix rhusiopathiae septicemia and complications in a Tursiops truncates. Proceedings of the 36th Annual Conference of the IAAAM, p. 138-139. Geraci J.R. (1986). Husbandry, Marine Mammals (Cetacea, Pinnipedia, and Sirenia). In: M. E. Fowler (ed). Zoo and Wild Animal Medicine, 2nd edition, W.B. Saunders Company, Philadelphia, p. 771-777. Geraci J.R., Sauer R.M., Medway W. (1966). Erysipelas in dolphins. American Journal of Veterinay Research 27, 590-606. Gilmartin G., Allen J.F., Ridgway S.H. (1971). Vaccination of porpoises (tursiops truncatus) against Erysipelothrix rhusiopahtiae infection. Journal of Wildlife Diseases 7, 292-295. Gray K.N. en Klontz G.W. (1974). Some serological aspects of the immune response in the Atlantic Bottlenosed porpoise. Journal of Wildlife diseases 10, 180-186. Greenwell M. G., Boehm J. R., Harris B. M. (2002). A one-year surveillance program for Erysipelothrix rhusiopathiae: methodology, findings, and recommendations. Proceedings of the 33rd Annual Conference of the IAAAM, p.148-152. Gyles C.L., Thoen C.O. (1993). Pathogenesis of bacterial infection in animals. 2th edition. Iowa State University Press, 331 pages. Haesebrouck F., Pasmans F., Chiers K., Maes D., Ducatelle R., Decostere A. (2004). Efficacy of vaccines against bacterial diseases in swine: what can we expect? Vet. Microbiol. 100, 255-268. Harlow E., Lane D. (1999). eds Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 7-23. Hashimoto K., Yoshida Y., Sugaware H. (1974). Serotypes of Erysiplothrix insidiosa isolated from swinem fish and birds in Japan. National Institute Animal Health Quarter 14, 113-120.
29
Hermans J. (1997). Kruisprotectie tussen vlekziekte-isolaten van het varken en de dolfijn. Afstudeerwerk Faculteit Diergeneeskunde, Gent. Hoorens J.K., Devriese L., Thoonen H., Lescrauwaet A., Hoste L. (1988). Septicemische vlekziekte bij een dolfijn. Vlaams Diergeneeskundig tijdschrift 57, 62-64. Hrobjartsson A., Forfang E., Haahr M.T., Als-Nielsen B., Brorson S. Blinded trials taken to the test: an analysis of randomized clinical trials that report tests for the succes of blinding. Int J Epidemiol 2007 36, 654-63. Imada Y., Goji N., Ishikawa M., Sckizaki T. (1999). Truncated surface protective antigen (SpaA) of Erysipelothrix rhusiopathiae serotype 1a elicits protection against challenge with serotypes 1a and 2b in pigs. Infection and Immunity 67(9), 4376-4382. Imada Y., Takase A., Kikuma R., Iwamaru Y., Akachi S., Hayakawa Y. (2004). Serotyping of 800 strains of Erysipelothrix Isolated from Pigs Affected with Erysipelas and Discrimination of Attenuated Live Vaccine Strain by Genotyping. Journal of clinical microbiology p. 2121-2126 Jones J. C., Middlebrooks B. L., Patterson R. A. (2001). Comparison of a developmental ELISA for antiErysipelothrix rhusiopathiae antibodies with a passive agglutination assay using latex beads coated with a purified 64 kDa E. rhusiopathiae specific protein. Proceedings of the 32nd Annual Conference of the IAAAM, p.108. Kennedy-Stoskopf S. (1990). Immunology of Marine Mammals. In: L.A. Dierauf (ed). CRC Handbook of Marine Mammal Medicine: Health Disease and Rehabilitations. Boca Raton, Florida, CRC press, p. 115-125. Kitajima T., Oishi E., Amimoto K., Ui S., Nakamura H., Okada N., Sasaki O., Yasuhara H. (1997). Protective effect of NaOH-Extracted Erysipelothrix rhusiopathiae Vaccine in Pigs. J. Vet. Med. Sci. 60(1), 9-14. Lacave G. (2000). International Survey on Erysipelas Incidence in Cetaceans Since 1989. Proceedings of the First International Workshop on Erysipelas in Cetaceans in Chichage Illinois, USA. P.68 Lacave G., Cox E. (2000). Erysipelas in cetaceans, more particulary the handling and vaccination in young Turiops truncates calves. EAAM abstract book, p.10. Lacave G., Cox E., Goddeeris B. (1997b). Cross-reaction of antisera against immunoglobulins of several species with dolphin immunoglobulins. Proceedings of the IAAAM, p.87-90. Lacave G., Cox E., Hermans J., Devriese L., Goddeeris B.M. (2001). Induction of cross-protection in mice against dolphin Erysipelothrix rhusiopathiae isolates with a swine commercial vaccine. Veterinary Microbiology 80, 247-253. Lacave G., Hermans J., Cox E., Goddeeris B. (1997a). Protection of mice against dolphin erysipelas isolates following vaccination with a commercial erysipelas vaccine. Proceedings of the IAAAM, p.82-86. Makino S., Yamamoto K., Murakami S., Shirahata T., Uemura K., Sawada T., Wakamoto H., Morita Y. (1998). Properties of repeat domain found in a novel protective antigen, SpaA, of Erysipelothrix rhusiopathiae. Microbial Pathogenesis 25, 101-109. Martin S.W., Meek A.H., Willeberg P. (1988). Veterinary Epidemiology. Principles and Methods. Iowa State University Press, Iowa, USA, p.176-192. Mausner J.S., Kramer S. (1985). Epidemiology, An introductory Text. W.B. Saunders, Philadelphia, PA, USA, p.195-213. Morgan M.J., Britt J.O., Cockrill J.M., Eiten M.J. (1994). Erysipelothrix rhusiopathiae infection in an emu (Dromaius novaehollandiae). J Vet Diagn Invest 6(3), 378-9.
30
Muller H.E. (1980). Neuraminidase and other enzymes of Erysipelothrix rhusiopathiae as possible pathogenic factors. In arthritis: Models and Mechanisms, ed, H. Deicher and L.C. Schulz. Springer Verlag, New York, p. 5867. Nagai S., To H., Kanda A. (2008). Differentiation of Erysipelothrix rhusiopathiae strains by nucleotide sequence analysis of hypervariable region in the spaA gene: discrimination of a live vaccine strain from field isolates. J Vet Diagn Invest 20, 336-342 Neundorf R., Seidel H. (1977). Schweinerortlauf. In: H. Seidel (ed). Schzeinekrankheiten. F.E. Verlag, Stuttgart, p. 692-699. Nollens H., Green L. G., Duke D., Walsh M. T., Chittick B., Gearhart S., Klein P. A., Jacobson E. R. (2007). Development and validation of monoclonal and plolyclonal antibodies for the detection of immunoglobulin G of bottlenose dolphins (Tursiops truncates). Journal of Veterinary Diagnostic Investigation Vol. 19 Issue 5, 465-470. Nollens H., Jacobson E. R., Walsh M. T., Chittick B., Gearhart S., McBain J., Reidarson T., Schmitt T. (2005). Evaluation of the humoral immune response of bottlenose dolphins (Tursiops truncates) to an erysipelas vaccine. Proceedings of the 36th annual conference of the IAAAM, p.140. Opriessnig T., Hoffman L.J., Harris K.L., Gaul S.B., Halbur P.G. (2004). Erysipelothrix rhusiopahtiae: genetic characterization of Midwest US isolates and live commercial vaccines using pulsed-field gel electrophoresis. J Vet Diagn Invest 16, 101-107. Palmer C., Jones J.C. (2005). The use of colony PCR for the rapid detection of Erysipelothrix rhusiopathiae. Proceedings of the 36th annual conference of the IAAAM, p.141. Petrie A., Watson P. (1999). Statistics for Veterinary and Animal Science. Blackwell Science, Oxford, UK, p.5472. Rockabrand D., Partridge J., Krska J., Blum P. (1993). Nucleotide sequence analysis and heterologous expression of the Erysipelothrix rhusiopathiae dnaJ gene. FEMS Microbiology Letters 111, 79-86. Roit I., Brostoff J., Male D. (1993). Introduction to the Immune System. Moby-Year Book Europe Ltd., Londen, Engeland, p. 1.1-1.12. Sato H., Yamazaki Y., Tsuchya K., Aoyama T., Akaba N., Suzuki T., Yokoyama A., Saito H., Maehara N. (1998). Use of the protective antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae in ELISA and Latex-agglutination. Dep. of Vet. Microbiology, School of Vet. Med. and Animal Science, Kitasato University, Tawada, Aomori, Japan, B 45, p. 407-420. Sawada T., Tamura Y., Takahashi T. (1987). Mechanism of protection induced in mice against Erysipelothrix rhusiopathiae infection by treatment with porcine antiserum to the culture filtrate of an attenuated strain. National Veterinary Assay 17, 65-74. Schulz L.C., Ehard H., Hermanns W., Messow c;, Drommer W., Trautwein G., Winkelmann J., Bohm K.H., Rimpler M., Kirchoff H., Marquardt K., Burow K., Rapp K. (1980). The different phases of Erysipelothrix polyarthritis: Comparison with other microbials models. In arthritis: Models and Mechanisms, ed, H. Deicher and L.C. Schulz. Springer Verlag, New York, p. 12-23. Shimoji Y., Mori Y., Fischetti V.A. (1999). Immunological Characterization of a Protective Antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae: Identification of the Region Responsible for Protective Immunity. Infection and Immunity, p. 1646-1651.
31
Shimoji Y., Mori Y., Hyakutake K., Sekizaki T., Yokomizo Y. (1998a). Use of an Enrichment Broth Cultivation– PCR Combination Assay for Rapid Diagnosis of Swine Erysipelas. Journal of Clinical Microbiology, p. 86-89. Shimoji Y., Mori Y., Sekizaki T., Shibqhqrq T., Yokomizo Y. (1998b). Construction and Vaccine Potential of Acapsular Mutants of Erysipelothrix rhusiopathiae: Use of Excision of Tn916 To Inactivate a Target Gene. Infection and Immunity, p. 3250-3254. Shimoji Y., Ogawa Y., Osaki M., Kabeya H., Maruyama S., Mikami T., Sekizaki T. (2003). Adhesive surface proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae bind to polystyrene, fibronectine, and types I and IV collagens. J. Bacteriol. 185, 2739-2748. Shimoji Y., Yokomizo Y., Moti Y. (1996). Intracellular survival and replication of Erysipelothrix rhusiopahtiae within murine macrophages: Failure of induction of the oxidative burst of macrophages. Infection and Immunity 64, 1789-1793. Shimoji Y., Yokomizo Y., Sekizaki T., Mori Y., Kubo M. (1994). Presence of a Capsule in Erysipelothrix rhusiopathiae and Its Relationship to Virulence for Mice. Infection and Immunity, p. 2806-2810. Sitt T., Bowen L., Blanchard M. T., Gershwin L. J., Byrne B. A., Dold C., McBain J., Stott J. L. (2010). Cellular immune responses in cetaceans immunized with a porcine erysipelas vaccine. Veterinary Immunology and Immunopathology 137, 181-189. Smith R.D. (2006). Veterinary Clinical Epidemiologie. 3rd edition. Boca Raton, CRC/Taylor & Francis, p.127-135. Suer L.D., Vedros N. A., Schroeder J.P., Dunn J.L. (1988a). Erysipelothrix rhusiopahtiae. I. Isolation and characterization from pinnepeds and bite/abrasion wounds in humans. Dis. Aquat. Org. 5, 1-5. Suer L.D., Vedros N. A., Schroeder J.P., Dunn J.L. (1988b). Erysipelothrix rhusiopahtiae. II. Enzyme immunoassay of sero from wild and captive marine mammals. Dis. aquat. Org. 5, 7-13. Sweeney J.C., Ridgway S.H. 1975. Common diseases of small cetaceans. Journal of The American Veterinary Medical Association 67, 533-540. Takahashi T., Fujisawa T., Umeno A., Kozasa T., Yamamoto K., Sawada T. (2008). A taxonomic study on erysiplothrix by DNA-DNA hybridization experiments with numerous strains isolated from extensive origins. Microbiol Immunol 52, 469-478 Takahashi T., Norio H., Sawada T., Yutaka T., Masataka M. (1987a). Correlation between adherence of Erysipelothrix rhusiopathiae strains of serovars 1a to issue culture cells originated from porcine kidney and their pathogenicity in mice and swine. Veterinary Microbiology 13, 57-64. Takahashi T., Sawada T., Masataka M., Yutaka T., Tomohiko F., Yoshimi B., Tomotari M. (1987b). Serotype, antimicrobial suspectibility and pathogenicity of Erysipelothrix rhusiopathiae isolates from tonsils of apparently healthy slaughther pigs. Journal of Clinical Microbiology 25, 536-539. Takahashi T., Takagi M., Sawada T., Seto K. (1984). Cross protection in mice and swine immunized with live erysipelas vaccin to challenge exposure with strains of Erysipelothrix rhusiopathiae of various serotypes. American Journal of Veterinary Research 45, 2115-2118. Takahashi T., Takahashi I., Tamura Y., Sawada T., Yoshida T., Suzuki S., Muramutsu M. (1990). Mechanism of Plasma Clotting by Erysipelothrix rhusiopathiae. Jounal of Clinical Microbiology, p. 2161-2164. Takahashi T., Tomohiko F., Yutaka T., Shoko S., Masataka M., Sawada T., Yoshimi B., Tomotari M. (1992). DNA relatedness among Erysipelothrix rhusiopathiae strains representing all twenty-three serovars and Erysipelothrix tonsillarium. International Hournal of Systematic Bacteriology 42, 469-473.
32
Takeshi K., Makino S., Ikeda T., Takada N., Nakashiro A., Nakanishi K., Oguma K., Katoh Y., Sunagawa H., Ohyama T. (1999). Direct and Rapid Detection by PCR of Erysipelothrix sp. DNAs Prepared from Bacterial Strains and Animal Tissues. Journal of Clinical Microbiology, p.4093-4098. Thrusfield M. (2005). Veterinary Epidemiology. 3th edition. Blackwell Science, Oxford, UK, p.289-304. Timoney J.F., Groshup M.H. (1993) Properties of a protective protein antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae. Veterinary Microbiology, Volume 37, Issues 3-4, p. 381-387. To H., Koyama T., Nagai S., Tuchiya K., Nunoya T. (2009). Development of quantitative real-time polymerase chain reaction for detection of and discrimination between Erysipelothrix rhusiopathiae and other Erysipelothrix species. J Vet Diagn Invest 21, 701-706. To H., Nagai S. (2007). Genetic and Antigenic Diversity of the Surface Protective Antigen Proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae. Clinical and Vaccine Immunology, p.813-820. Tseng K. E., Chung C. Y., H‟ng W. S., Wang S. L. (2009). Early Infection Termination Affects Number of CD8+ Memory T Cells and Protective Capacities in Listeria monocytogenes-Infected Mice upon Rechallenge. The Journal of Immunology 182, 4590-4600. Turcksin B. (2002). Vlekziekte, prevalentie en vaccinatie bij walvisachtigen. Afstudeerwerk Faculteit Diergeneeskunde, Gent. Van Bressem M. F., Van Waerebeek K., Raga J. A. (1999). A review of virus infections of cetaceans and the potential impact of morbilliviruses, poxviruses and papillomaviruses on host population dynamics. Dis Aquat Organ 38, 53-65. Van Poucke S. (1994). Onderzoek naar IgG- en IgA- antistoffen tegenover Erysipelothrix rhusiopathiae bij al dan niet gevaccineerde dolfijnen. Afstudeerwerk Faculteit Diergeneeskunde, Gent. Vandorpe V. (1997-1998). Humorale immuniteit bij dolfijnen. Afstudeerwerk Faculteit Diergeneeskunde, Gent. Veraldi S. Girgenti V., Dassoni F., Gianotti R. (2009). Erysipeloid: a review. Clinical and Experimental Dermatology 34, 859-862. Walsh M.T., Elizabeth C., Gearhart S., McBain J., Reidarson T., Schmitt T., St. Leger J., Dalton L., Patterson R.A., Nollens H., Kerivan J., Hughes B. (2005). Development of an Erysipelothrix rhusiopathiae vaccination program at seaworld Orlando. Proceedings of the 36th annual conference of the IAAAM, p.135-137. Wang Q., Chang B.J., Mee B.J., Riley T.V. (2005). Neuraminidase production by Erysipelothrix rhusiopathiae. Veterinary Microbiology 107, 265-272. White R.R., Verway W.F. (1970). Isolation and Characterization of a Protective Antigen-Containing Particle from Culture Supernatant Fluids of Erysipelothrix rhusiopathiae. Infection and Immunity 1, 380-386. Wood R.L. (1979). Specificity in Response of Vaccinated Swine and Mice to Challenge Exposure with Strains of Erysipelothrix rhusiopathiae of Various Serotypes. American Journal of Veterinary Research 40, 795-801. Wood R.L. (1984). Swine erysilepas – a review of prevalence and research. American Journal of Veterinary Association 184, 944-949. Wood R.L. (1992). Erysipelas. In: Diseases of swine. H.W. Dunn, A.D. Leman (eds). 7th edition, Iowa State University Press, Ames, USA, p.475-486. Wood R.L., Booth G.D., Cutlip R.C. (1981). Susceptibility of Vaccinated Swine and Mice to Generalized Infection with Specific Serotypes of Erysypelothrix rhusiopathiae. American Journal of Veterinary Research 42, 608-614.
33
Wood R.L., Harrington R Jr. (1978). Serotypes of Erysipelothrix rhusiopahtiae isolated from swine and from soil and manure of the United States. American Journal of Veterinary Research 39, 1833-1840. Yamazaki Y. (2006). A multiplex polymerase chain reaction for discriminating Erysipelothrix rhusiopathiae from Erysipelothrix tonsillarum. J Vet Diagn Invest 18, 384-387. Yoshihiro S., Yuichi Y., Yasuyuki M. (1996). Intracellular survival and replication of Erysipelothrix rhusiopathiae within murine macrophages: failure of induction of the oxidative burst of macrophages. Infection and Immunity 64, 1789-1793. Zwarenstein M., Oxman A., Pragmatic Trials in Health Care Systems (PRACTICH). Why are so few randomized trials useful, and what can we do about it? J Clin Epidemiol 2006. 59, 1125-6.
34
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2010 - 2011
VERSLAG VAN DE DIERENARTSENSTAGE door
Yi CUI
Stageverslag in het kader van de Masterproef
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2010 - 2011
VERSLAG VAN DE DIERENARTSENSTAGE door
Yi CUI
Stageverslag in het kader van de Masterproef
De auteur geeft de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur is niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
INHOUDSOPGAVE 1
2
3
Stage gezelschapsdieren ................................................................................................................ 1 1.1
Logboek stage gezelschapsdieren ......................................................................................... 1
1.2
Casuïstiek gezelschapsdieren .............................................................................................. 10
1.3
Analyse van structuur en management praktijk gezelschapsdieren ..................................... 14
Stage grote huisdieren .................................................................................................................. 16 2.1
Logboek stage grote huisdieren ........................................................................................... 16
2.2
Casuïstiek grote huisdieren .................................................................................................. 23
2.3
Analyse van structuur en management praktijk grote huisdieren.......................................... 25
Persoonlijke reflectie ..................................................................................................................... 27
1 STAGE GEZELSCHAPSDIEREN 1.1 LOGBOEK STAGE GEZELSCHAPSDIEREN Datum
Uur
Aard consultatie/huis-/bedrijfsbezoek
Opmerkingen
11/4/11
15u
Border Collie, V, 2j, 14.75kg
Milbemax®(praziquantal,
–
Hond moet terug naar Engeland.
milbemycine oxime)
20u
Controle op rabiës vaccinatie, klinisch onderzoek: alles
Frontline combo ®
normaal.
(fipronil, methoprenum)
Dwergkonijn, M, 6m, 1.8kg Afspraak voor castratie Controle geslacht + klinisch onderzoek : alles normaal FV, M, 1j
Metacam®(Meloxicam)
Probleem: eigenaar heeft opgemerkt dat de kat mankt aan één van de achterbenen. Men heeft de kat laten stappen, geen tekens van manken. Orthopedisch onderzoek: alles normaal. Temperatuur: 39,6° (lichte koorts). Boxer, M, 2j
Milbemax®
Probleem: Hond vertoont jeuk.
Bayer advocate®
Diagnose na klinisch onderzoek: vlooien.
(Imidodopride, Moxidectine) + Bayer advocate® voor de katten thuis en aanraden om het huis te reinigen
FV, M, Middelbare leeftijd, 4.85kg
Sedatie: Dolorex®
Detartratie.
(butorphanol)
Tandvlees wat ontstoken.
Antirobe® (clindamycine, hydrochloridum).
FV, M, 6m, 5kg
Medetor® (medetomidine,
Castratie + jaarlijkse hervaccinatie + nagels knippen.
hydrocholoride) Anesketin® (ketamine hydrochloride). Vaccinatie tegen
1
panleukopenie, rhinotracheïtis en calicivirus. Huisbezoek: FV, V, 16j
Baytril®(enrofloxacine)
Probleem: Kattin heeft ademhalingsproblemen.
dagelijks geven.
Klinisch onderzoek: etter in de neusgang, voor de rest alles normaal. Diagnose: ontsteking van de luchtwegen.
12/4/11
15u
FV, M, 9j, 6.8kg
Milbemax®
–
Jaarlijkse hervaccinatie + ontworming.
Vaccinatie tegen
20u
Klinisch onderzoek: alles normaal.
panleukopenie, rhinotracheïtis, calicivirus en leukose. (buitenhuiskat).
FV, V, 5j, 2,65kg
Vaccinatie tegen
Jaarlijkse hervaccinatie + kattin heeft last van klitten.
panleukopenie,
De klitten werden doorgekamd.
rhinotracheïtis en calicivirus. Voedingsstaal van Bayer: vetzuren supplement.
Soft couted white terrier, M, 14j
Metacam®
Probleem: de hond heeft zich gekwetst door uitglijden en
Rimadyl® (carprofen): 2x
vallen in spreidstand. Sindsdien stapt hij stijfjes. Het dier
per dag voor 6 dagen.
heeft een geschiedenis van problemen aan de achterhand. Diagnose: vermoeden van kwetsuur aan de nervus obtoratorius. Dobbermanpincher, V, 10.2kg
Milbemax®
Hond moet ontwormd worden en nagels geknipt. Huisbezoek: Windhond, V, 3j, 25kg Probleem: De hond werd aangevallen door een andere hond, er was een bijtwonde aan de linkerflank (8-11cm). De hond werd geanestheseerd. De wonde werd grondig gereinigd, verder onderzocht (geen tekenen van perforatie) en primair gedicht.
2
CV, M, 9j, 20.4kg
Dog appealing
Probleem: hond met gedragsproblemen onrustig, blaft
pheromone
meer en bijt de sofa kapot als de eigenaar niet thuis is.
Milbemax®
Hervaccinatie en ontworming.
Vaccinatie tegen hondenziekte, parvovirus, HCC
FV, V, 2j, 5.4kg
Metacam® gegeven, als
Probleem: door omgevingsveranderingen wil de kat niet
de koorts niet betert,
meer eten en drinken.
terugkomen naar de
Klinisch onderzoek: alles normaal behalve 40.15°C
dierenarts.
koorts. Castratie dwergkonijn van 6m
Dolorex®, Anesketin®, Medetor®, na de operatie: Antisedan® (atipamezole hydrocloride).
13/4/11
15u
FV, M, 5kg
Bayer advocate® +
–
Probleem: Kale plekken op de achterhand.
product ook geven aan de
19u
Klinisch onderzoek: Vlooien gezien zowel op de onderrug
hond thuis.
als op de buik. Ook op de buik zijn er kale plekken.
Moderin®
Vermoedelijke diagnose: Vlooienallergie.
(Methylprednisolone).
FV, M, 4.5kg
Milbemax®
Eigenaar heeft de kat gevonden en komt voor een
Vaccinatie tegen
algemeen onderzoek.
panleukopenie,
Klinisch onderzoek: Alles normaal, aan het gebit schat de
rhinotracheïtis en
dierenarts het dier 1-2j oud. De kat is reeds gecastreerd.
calicivirus.
Gevaccineerd (primovaccin?) + ontworming FV, V, 6j
Feliway®
Probleem: Gedragsproblemen sproeit in huis sinds de
(kattenhormonen).
eigenaars voor een week weg waren. Waarschijnlijk had de kat last van stress. FV, V, 8w, 800gr
Milbemax®
Primovaccin (over maand herhalen) + ontworming.
Vaccinatie tegen panleukopenie,
3
rhinotracheïtis en calicivirus. Stafford pup, V, 9w
Milbemax®
Klinisch onderzoek: alles normaal.
Bayer advocate®.
Primovaccin (over maand herhalen), ontworming en
Vaccinatie tegen
ontvlooiing.
hondenziekte, parvovirus, HCC
14/4/11
15u
FV, V, 9j
Voor de sedatie:
–
Probleem: progressieve paralyse van de achterhand
Aensketin®, Dexdomitor®
20u
(reeds 3 maanden). Vermoedelijk door trauma aan de
(dexmedetomidine
rug.
hydrochloride)
Eigenaar wil geen verdere behandeling om financiële
Dolethal® (pentobarbital)
redenen euthanasie. FV, V, 2j
Rimadyl®
Probleem: Kat is gevallen van een kast, heeft licht gemankt aan rechter voorpoot. Klinisch onderzoek: Alles normaal, geen letsels te voelen aan de rechter voorpoot. CV, M, 5j Jaarlijkse controle: Klinisch onderzoek is volledig
Vaccinatie tegen
normaal, anaalklieren uitgeduwd, hervaccinatie.
hondenziekte, parvovirus, HCC
FV, M, 16j, 3.7kg Probleem: Anorexie, vermijdt de eetbak, stinkende adem
Moderin® + na 2w,
Klinisch onderzoek: gezwollen tandvlees + opgezette
hercontrole door de
lymfeklieren.
dierenarts
Diagnose: Gingivostomatitis. FV, V, 5j, 7.3kg Probleem: Diabetespatiënt die op controle komt. Klinisch
onderzoek:
Alles
normaal,
Dieetvoeder
glucosegehalte
normaal. Windhond, V, 3j, 25kg Probleem: Verwijderen nietjes na operatie op 12/4. Klinisch onderzoek: Alles normaal.
4
FV, M, 7m, 4.3kg
Anesketin®, Medetor®
Castratie.
15/4/11
15u
Maltezer, V, 12j, 4kg
–
Probleem: Kortstondig manken aan linker achterbeen,
21u
daarna weer normaal lopen. Ontsteking van de huid tussen de zoolkussens van het rechterachterbeen.
Ceporex® (cefalexine) Vaccinatie tegen hondenziekte, parvovirus,
Hervaccinatie.
HCC
Klinisch + orthopedisch onderzoek: Alles normaal. Diagnose: Vermoeden van patellaluxatie + likdermatitis ter
hoogte
van
de
zoolkussens
van
het
rechterachterbeen. FV, V, 2j, 4.35kg
Hypoallergeen dieet voor
Probleem: Kat heeft jeuk aan de oren, werd eerder al
minimum 4 weken.
behandeld met corticoïden.
Moderin®
Klinisch onderzoek na sedatie: Korsten aan de oren
Covenia® (cefovecin)
(vermoedelijk van het krabben), veel oorsmeer in de oren en ook veel huidschilfers. Voor de rest is alles normaal. Diagnose: Vermoeden van voedingsallergie. FV (lapjeskat), V, 10j
Vaccinatie tegen
Probleem: Kat wil niet eten en het kauwen gaat moeilijk
panleukopenie,
Klinisch onderzoek: In de muil zat een zeer losse rechter
rhinotracheïtis en
haaktand. Voor de rest was het dier normaal.
calicivirus.
De haaktand werd getrokken + hervaccinatie. Vlinderhond, M, 1,5j, 2kg Hervaccinatie + ontworming
Milbemax® Vaccinatie tegen hondenziekte, parvovirus, HCC
Cocker spaniel, V, 11j
Oestrogenen
Probleem: Urine-incontinentie tijdens het neerliggen. Klinisch onderzoek: Alles is normaal. Urineonderzoek: Alles negatief. Degu Probleem: Boven en ondersnijtand doorgegroeid.
5
Behandeling: Tanden bijgeschaafd + advies van veel vezelrijk voedsel. FV, M, 7m, 4.5kg
Anesketin®, Medetor®
Castratie Jack Russel terrier, V, 6j, 7.75kg
Anesketin®, Medetor®
Verwijderen van mamatumor aan de voorlaatste tepel van
Na de chirurgie werd ook
de rechter kant.
nog Covenia® en Rimadyl® gegeven.
16/4/11
10u
FV, V
Dolorex® en dexdomitor®
–
Probleem: Klitten in de haren uitborstelen na sedatie
Vaccinatie tegen
12u
Hervaccinatie.
panleukopenie, rhinotracheïtis en calicivirus.
FV, V, 8m Verwijderen hechtdraad van sterilisatie. Jack Russel terrier, M, 5j, 7kg
Dog apeasing pheromone
Probleem: Speekselen en beven tijdens een lange autorit
Milbemax®.
(reisziekte).
Vaccinatie tegen
Hervaccinatie en ontworming.
hondenziekte, parvovirus, HCC
18/4/11
15u
Buldog, M, 4j
Marbocyl®
–
Probleem: Evenwichtsstoornissen, hoofd helt naar de
(marbofloxacine)
21u
rechterkant. Diagnose: Vermoeden van middenoorinfectie. FV, V, 8j
Diagnostisch behandelen
Probleem: Strangurie, hematurie.
met Covenia®,
Klinisch onderzoek: Pijn bij palpatie van de blaas,
Metacam®.
daarnaast is alles normaal. FV, M, 5j, 5kg
Hypoallergeen dieet (met
Probleem: Erythrema thv gehele oor, oorbasis en
gehydroliseerde eiwitten).
omgeving van de neus. Kat braakt na de maaltijd. Veel
Kela anti-haarbal
haarverlies.
(voedingssuplement voor
6
Klinisch onderzoek: Alles normaal, ook buikpalpatie is
katten).
normaal. Diagnose: Vermoeden van voedselallergie. Hervaccinatie + ontworming. CV, V, 7j, 5kg
Delvosteron®
Loopsheidsonderbreking
(proligeston)
CV, V, 15j
Dolorex® en dexdomitor®
Probleem: stoelgang met lintworm, doffe vacht.
Milbemycine®,
Detartratie na sedatie.
stomorgyl® (spiramycine), vivavetderm (meervoudige onverzadigde vetzuren).
CV, V, 8j, 6.7kg
Anesketin®, Medetor®
Probleem: Vetgezwel tussen de tenen van de achterpoot. Chirurgische excisie. FV, V, 6m, 2.5kg
Anesketin®, Medetor®
Sterilisatie FV, M, 8m, 3.5kg
Anesketin®, Medetor®
Castratie, primovaccinatie en ontworming.
Milbemax®, Vaccinatie tegen panleukopenie, rhinotracheïtis en calicivirus.
19/4/11
15u
Yorshire terrier, V, 12j, 4kg
Voor de sedatie:
–
Probleem: Hematurie, strangurie en sterk vermageren.
Anesketin®, Dexdomitor®
20u
Probleem is al 6m aanwezig.
Dolethal® (pentobarbital)
Klinisch onderzoek: Bij buikpalpatie was er een zeer grote abdominale massa. Het dier is ook een cryptorch. Euthanasie wegens financiële redenen. Golden retriever, V, 4j, 30.5kg
Clavaseptin® (amoxiciline
Probleem: Productieve hoest met slijm.
+ clavulaanzuur) voor 1w.
Klinisch onderzoek: Gezwollen tonsillen, voor de rest is alles normaal. Diagnose: Vermoeden van tonsilitis. FV, V, 7j, 6.5kg
Metacam®, Covenia®
7
Probleem: Anorexie, braken (soms hematemesis) en
Controle na 1 week.
vermageren. De kat vecht ook veel. Klinisch onderzoek: 40,2°C koorts, diffuse zwelling van de linker onderkaak, gezwollen mandibulaire lnn. Diagnose: Vermoeden van abces thv de linker onderkaak en eventueel septicemie (vermoedelijk door gevecht). CV, M, 11j, 5.4kg
Dolorex® en dexdomitor®
Detartratie na sedatie. Welsh terrier, M, 8j, 6kg
Anesketin®, Medetor®
Castratie, tandextractie van P1 en detartratie.
Stomorgyl®, Dupamox® long acting (amoxicicline), Rimadyl® Vet aquadent® (antitandplaque vloeistof voor in het drinkwater).
CV, V, 4j, 13.5kg
Apomorfine
Probleem: Opeten van lokaas vermoedelijk met vergif.
Konakion® (VitK)
Diagnose: Vermoedelijk rattenvergif.
20/4/11
15u
Yorkshire terrier, M, 5j, 5.2kg
–
Probleem: Het zoolkussen van de rechter achterpoot was
20u
licht gezwollen.
Advies: afwachten.
Klinisch onderzoek: Geen CA gevonden. FV, V, 1.5j, 5.8kg
Advies: Afwachten,
Probleem: Niesbuien sinds vorige avond en een zeer
misschien is het een
vochtige neus. Op de grond waren er vochtplekken,
reactie op het stuifmeel
eigenaar vermoedt van het braken. De eigenaar had wel
van de orchidee.
nieuwe bloemen in huis gehaald. Klinisch onderzoek: Alles normaal, geen CA gevonden in de neus, neus was vochtiger dan normaal. Maltezer, M, 5j
Specific CID/CIW
Probleem: Braken.
Digestive support Bayer
Klinisch onderzoek: Alles normaal.
Cerenia®
Eigenaar
wil
geen
bijkomend
onderzoek
(RX,
8
bloedonderzoek,…) wegens financiële beperkingen. Golden Retriever, M, 15j, 33kg
2de opinie van collega:
Probleem: Ulcererend gezwel aan het midden van de
eventueel staartamputatie
staart.
met gasanaesthesie.
Vermoeden van een talgkliergezwel. Lhasa apso, V, 5j
Controlac 2®
Probleem: Schijndrachtig.
(metergoline). Afspraak voor sterilisatie.
FV, V, 7m, 2.5kg
Anesketin®, Medetor®
Sterilisatie FV, V, 7j, 4.4kg (2de bezoek voor het probleem)
Metacam® + urinair dieet
Probleem: Strangurie, hematurie, anorexie, lethargie.
van Hills (s/d Hills).
Klinisch onderzoek: Bij een vroeger bezoek was er bij de buikpalpatie een abdominale massa. Toen werd Cerenia® (macropitant)
gegeven
(vermoedelijk
een
Controle 2 weken later.
ontstoken
blaas). De kat werd niet beter. De eigenaar had gevraagd voor verder onderzoek. Bijkomend onderzoek: Exploratieve laparatomie: sterk en hard gezwollen blaas. Diagnose: Vermoedelijke cystitis.
21/4/11
15u
FV, M, 2j
–
Probleem: Rhinitis, stomatitits, opgezette tonsillen.
Covenia®, Metacam®
20u Wolfspits, M, 5.5j, 8.6kg
DOUXO calm spray
Probleem: Mijten allergie (jaarlijks probleem).
(hinokitiol + phytosphingosine).
CV, M, 8j Vaccinatie tegen kennelhoest (voor hondeschool) Jack Russel terrier, V, 2j, 6.2kg
Surolan® (miconazole,
Probleem: Krabben aan oor, dikke korsten in en rond de
polymixine B,
oorschelp.
prednisolone).
Eerder verdacht op atopie: dier werd al op hypoallergeen dieet gezet.
9
4 Chihuahua pups, 8w
Vaccinatie tegen
Vaccinatie en chippen
hondenziekte, parvovirus, HCC Over maand hervaccinatie.
Duitse herder, V, 3.5m, 13.3kg
Milbemycine®
Probleem: Pas aangekochte pup, algemene controle.
Advantage
Klinisch onderzoek: Alles normaal. De pup geeft een licht
Bayer advocate®
soporeuze indruk. Volgens de eigenaar was de pup
Vaccinatie tegen
gewoon moe in de gaten laten houden door de
hondenziekte, parvovirus,
eigenaar.
HCC
Vaccinatie, ontwormen en ontvlooien. FV, V, 8m, 3.35kg
Anesketin®, Medetor®
Sterilisatie
1.2 CASUÏSTIEK GEZELSCHAPSDIEREN Anamnese CV, V, 4j, 13.5kg De eigenaars hadden Saima een verdacht lokaas (paté?) met blauwe korrels zien opeten in de loop van de avond van 19/4. De hond is in spoed binnengekomen bij de dierenarts omdat de eigenaars ongerust waren. Klinisch onderzoek Bij het klinisch onderzoek waren de hartfrequentie, ademhaling, polssterkte, lichaamstemperatuur en lymfeknopen normaal. De capillaire vullingstijd van de mucosa was lager dan 2 seconden. De mondmucosa was mooi roze. Probleemlijst
Verdachte blauwe korrels opgegeten
Differentiaal diagnose 4-OH-Coumarine
derivaten
(warfarine,
coumatetralyl,
difethialon,
difenacoum,
brodifacoum,
bromadiolone, flocoumafen): het meest waarschijnlijk.
Deze worden frequent gebruikt als rodenticide. Ze worden ook verwerkt in geplette granen die een blauw-groene kleur hebben.
10
Het dier vertoont enkele uren na de inname van het vergif geen duidelijke tekenen van vergiftiging, wat indicatief kan zijn voor de coumarine-derivaten. Deze hebben een zekere latentietijd nodig voordat de symptomen zich manifesteren.
Het product beschadigt de capillaire wand en geeft stoornissen in het bloedstollingsproces
Indaandionverbindingen (difacinon, chlorofacinon): minder waarschijnlijk.
Dit is een rodenticide dat gebruikt wordt tegen de muskusrat. Men gebruikt het dus meer in de landelijke gebieden, wat hier niet het geval is: de eigenaars van de hond wonen in het stad.
Deze producten veroorzaken ook bloedstollingsstoornissen, dus de behandeling ervan is dezelfde als bij de coumarine-derivaten.
Thalium: nog minder waarschijnlijk.
Dit product werd vroeger gebruikt als rodenticide, maar is tegenwoordig vooral vervangen door de coumarine derivaten. Graankorrels geïmpregneerd met thalliumsulfaat hebben een groene kleur.
Het product heeft een etsende werking op het maagdarmkanaal waardoor er acuut gastrointestinale symptomen zouden moeten optreden (koliek/braken, bloederige diarree). Bij een hoge dosis zou er ook motorische paralyse en ademhalingsverlamming optreden. In een subacuut geval ziet men bij lagere dosissen ook al gastro-intestinale verschijnselen. Deze symptomen kwamen bij de patiënt niet voor, waardoor het veel minder waarschijnlijk is dat Saima dit product heeft opgenomen.
Organische carbamaatesters (aldicarb, carbofuran, methiocarb): nog minder waarschijnlijk
Deze worden gebruikt als insecticide, nematocide en acaricide en bestaan uit blauwe korrels.
Deze producten geven neurologische symptomen (door inhibitie van choline-esterase). Deze symptomen kwamen bij de patiënt niet voor.
Bijkomend onderzoek Saima kreeg apomorfine IM toegediend en heeft erna 5 keer gebraakt. Kort erna heeft Saima ook stoelgang geproduceerd, met daarin verschillende graankorrels. De dierenarts heeft ook nog een bijkomend hematologisch en biochemisch onderzoek gedaan. De waarden van de hematologie en biochemie waren volledig normaal. Ook werden er stollingstesten uitgevoerd. De cit-aPTT was verlengd maar de cit-PT was normaal. Diagnose Thalium geeft gastro-intestinale verschijnselen (koliek/braken, bloederige diarree), spier- en zenuwaandoeningen (verlammingen, perifere neuritiden, psychische stoornissen), symptomen van de sympaticus stimulatie (tachycardie, bloeddrukstijging, obstipatie, haaruitval). Het is ook een algemeen celgif (het tast dus het hart, de lever en de nieren aan). De patiënt was volledig normaal op het algemeen klinisch onderzoek, vertoonde geen symptomen, had een normaal biochemisch en hematologisch onderzoek. Met deze gegevens kon een thalium-intoxicatie uitgesloten worden.
11
Organische carbamaat-esters inhiberen choline-esterase. Dit zorgt voor een waaier aan neurologische symptomen
zoals
misselijkheid,
braken,
diarree,
koliek,
spierspasmen
gevolgd
door
spierverlamming,… . De patiënt vertoonde geen neurologische symptomen, en gezien deze verbindingen traagwerkend zijn, kunnen we deze uitsluiten. Hoogstwaarschijnlijk gaat het hier om een coumarine-vergiftiging. De vertraging in het optreden van de symptomen en de verhoogde stollingstijd zijn hiervoor sterk indicatief. Indien het toch een indaandionverbinding zou zijn, verloopt de behandeling hetzelfde.
Figuur 1 - Bloedonderzoek dag 1
12
Figuur 2 - Bloedonderzoek dag 2
Behandeling Omdat men niet weet of het gaat om een coumarine-derivaat van de eerste of tweede generatie, start men een behandeling voor een derivaat van de tweede generatie (gezien het toedienen van een hogere hoeveelheid Vit K dan eventueel nodig, maar niet schadelijk is). Saima werd opgenomen en ze kreeg een infuus van NaCl (0.9%) en ook konakion (5mg/kg) SC. De volgende dag werd ze nog eens klinisch volledig onderzocht en getest op stollingstijden en hematologie. Alles was normaal. Saima mocht ‟s middags weer naar huis. Als nabehandeling kreeg ze nog konakion voor 2 weken (2.5mg/kg) PO. Na 2 weken volgt een controle om nog eens de stollingswaarden te hertesten. Prognose Gezien de eigenaar er zeer snel bij was, en er een langdurige Vit K kuur gestart werd, is haar prognose zeer gunstig. Referenties Croubels S., De Backer P. (2009). Diergeneeskundige Toxicologie. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent. Daminet S. (2010). Algemene en aanvullende geneeskundige ziektenleer van de gezelschapsdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent.
13
1.3 ANALYSE
VAN
STRUCTUUR
EN
MANAGEMENT
PRAKTIJK
GEZELSCHAPSDIEREN De dierenarts van de gezelschapsdieren werkt in een eenmanspraktijk als zelfstandige. Hij is begonnen met zijn eigen praktijk in het jaar 1976, vlak na het afstuderen. De eerste jaren werkte de hij vooral voor de afbetaling van zijn apparatuur. Het is pas na het derde jaar dat de praktijk effectief winst is beginnen maken. In het verleden werkte de dierenarts nauw samen met andere collega‟s. Vele chirurgische ingrepen werden gedaan met twee en men maakte ook gebruik van elkaars apparatuur. Als de ene dierenarts op vakantie ging, kon een collega tijdelijk de cliënten opvangen. De vrouw van de dierenarts hielp in het begin ook mee. Sinds 1995 zijn de meeste collega‟s waar hij mee samenwerkte gepensioneerd, waardoor de dierenarts nu meestal alleen werkt. Hij houdt zich dan ook meestal bezig met eerstelijnsgevallen. De tweedelijns gevallen worden doorverwezen naar zijn collega‟s. Sinds 2000 is de dierenarts ook gaan keuren voor de grensinspectiepost (GIP) van het Federale Agentschap voor Voedsel Veiligheid (FAVV). De praktijk richt zich voor drie vierde op de gezelschapsdieren en één vierde op de keuring. De dierenarts gaat in de vroege voormiddag keuren (vismijn, luchthaven, eventueel slachthuis, enzovoort) en opent zijn consultatie van 15u tot 18u. Operaties en eventuele huisbezoeken worden na de uren gepland. De keuringsinskomsten worden door de dierenarts beschouwd als een soort pensioensparen. In het verleden is de dierenarts ook verschillende keren benaderd geweest door een collega om een associatie op te richten, maar dat was moeilijk realiseerbaar door de (vaak chaotische) planning die hij kreeg als keurder van de GIP. Het gebeurde niet zelden dat men de opdrachten maar enkele dagen op voorhand doorgaf. Dit zou moeilijk te combineren zijn met een associatie waar men altijd aanwezig moet zijn. Voor de consultaties werkt de dierenarts met steekkaarten voor zijn cliënteel. Gezien hij vooral vast cliënteel heeft en goed gezichten onthoudt, is dit een vrij efficiënt systeem. De computer die zich boven de consultatieruimte bevindt, wordt vooral gebruikt voor de boekhouding (bestellingen, facturen, …). De dierenarts verzorgt de boeken voor de BTW en de boekhouder neemt de rest over. De dierenarts bezit de apparatuur, nodig voor een eerstelijnspraktijk. Hij heeft een RX-toestel, maar geen echotoestel en ook geen gasanesthesie-apparatuur. Gezien de dierenarts over enkele jaren met pensioen gaat, heeft hij geen financiële investering gedaan in nieuwe toestellen. Indien nodig heeft hij wel beschikking over deze apparatuur bij een collega in de buurt. De mentaliteit bij de klanten is veel veranderd doorheen de jaren. Vroeger consulteerde men een dierenarts alleen als het echt nodig was. De eigenaars hadden financieel niet zoveel over voor hun gezelschapsdieren. Vaccinaties werden amper toegepast omdat men het nut er niet van inzag. Sinds de uitbraak van parvo in 1978 werden veel dieren verplicht gevaccineerd. Beetje bij beetje is dan het besef van het belang van vaccinaties gestegen. Destijds werd een beroepsfout ook veel gemakkelijker vergeven dan nu.
14
Met de stijgende bezorgdheid van eigenaars voor hun huisdieren en de populariteit van de tvprogramma‟s zoals “dieren in nesten” of “vinger aan de poot” wordt nu veel meer zorg en aandacht besteed aan de kleine huisdieren. Eigenaars komen sneller naar de dierenarts met “kleinere” problemen en hebben financieel veel meer over voor hun metgezellen. De eisen voor de dierenarts zijn daardoor veel hoger, er wordt meer professionalisme verwacht en fouten worden niet meer zomaar vergeven. Het is nu dus zeker belangrijk dat de dierenarts verzekerd is tegen beroepsfouten. In tegenstelling tot bij de grote huisdieren zijn de prijzen voor de dierenarts samen gestegen met de kosten. De winstmarge is doorheen de jaren dus niet gedaald, soms zelfs licht gestegen. Een grote bron van inkomsten van een dierenarts is ook de verkoop van gespecialiseerd voeder (dieetvoer, hypoallergeen voer, enzovoort). De verkoop van producten tegen vlooien en teken is wel gedurende de jaren gedaald, doordat de apotheek dergelijke producten ook mag verkopen. Om onder andere aan de eisen van de eigenaars te voldoen, gaat de dierenarts ook op regelmatige basis naar de bijscholing. Voor het FAVV zijn er jaarlijks ook verplichte bijscholingen. Hij investeert ook in nieuwere, up-to-date boeken voor zijn collectie. De werkweek van de dierenarts ziet er variërend uit. Afhangend van de hoeveelheid cliënteel en de opdrachten van het FAVV heeft hij werkweken van 40uur tot 80uur. De zomer is zeker de drukste periode. De dierenarts krijgt dan buiten zijn vaste klanten ook veel toeristen over de vloer. Zijn praktijk ligt aan een invalsbaan, is vlot bereikbaar en het uithangbord met het blauwe kruisje wordt makkelijk opgemerkt op die grote baan. In de zomer kunnen de consultaties soms rond 14u al starten en uitlopen tot 19u. De dierenarts had vroeger meer nachtwerk dan nu. Er waren geen wachtdiensten en de meeste incidenten waren bijtwonden omdat toen honden nog niet verplicht waren om aan de leiband te lopen. In de periode van 1990 tot 1998 werkten er 9 dierenartsen samen voor de wachtdiensten, wat het individuele nachtwerk ook verlichtte. Nog niet zo lang geleden werd in de buurt een kliniek opgericht die 7/7, 24/24 beschikbaar is, waardoor de mensen minder naar een éénmanspraktijk gaan. Men mag deze diensten tegenwoordig ook adverteren in de kranten, waardoor de mensen meer op de hoogte zijn van welke dierenartsen bereikbaar zijn tijdens de nachten en weekends.
15
2 STAGE GROTE HUISDIEREN 2.1 LOGBOEK STAGE GROTE HUISDIEREN Datum
Uur
Aard consultatie/huis-/bedrijfsbezoek
28/7/10
17u
KI vaars (vleesvee) van 15 maanden oud
Opmerkingen
22u
Stieraankoopsonderzoek Bloedafnamen voor onderzoek van: BVD, genetische afwijkingen (DCM 1/2, nanisme, hamartoma, SQT, AS+,…). Tuberculinatietest. Muilonderzoek: kijken naar aanwezigheid van een varkensmuil of een snoekmuil. Stier heeft 2 grote testes. Bekijken van de stand van de poten (niet overkoot en hoog op de benen). Afstamming van de stier nagekeken.
Hond 1 Probleem:
Behandeling:
Diabetespatiënt + gewrichtsproblemen
Metacam® (Meloxicam) gegeven tegen de pijn
Hond 2 Probleem:
Behandeling:
Te lange nagels + ontsteking (zwelling) tussen de
Ontsmetting met
tenen
isobetadine
Diagnose: vermoeden van aanwezigheid graszaad.
+ knippen van de nagels
Exploratie met een pincet (na verdoving): geen CA gevonden.
Koe 1 Probleem:
Behandeling:
Retentio secundarum na keizersnede.
Verwijderen van de nageboorte + toedienen van tetracycline
16
Koe 2 Probleem:
Behandeling: niet van
Manken aan rechtervoorpoot.
toepassing.
Diagnose: Voor de behandeling werd het dier eerst gesedeerd met xylazine en de hoeven werden bekapt. Er werd niets gevonden. Vermoeden van eventuele verzwikking van 1 van de klauwen.
Melkkoe Probleem:
Behandeling:
Melkkoe met koorts (39.9°C), gedaalde melkafgifte en
Diagnostische
waterige melk.
behandeling met
Diagnose: vermoeden van E.coli mastitis.
cortico's, Metacam®, enrofloxacine en Relixine® (cephalexine, cephalosporine) tubes.
30/7/10
9u -
6 Chihuahua pups gechipt en gevaccineerd
19u
(primovaccin).
Beagle: Jaarlijkse hervaccinatie.
Kalveren Blauwtong vaccinatie (primovaccin ) van verschillende kalveren boven de 3m (te herhalen over 1m).
Melkkoe van 28/7 (21u20) Probleem: Melkkoe ligt neer op de grond. Door het algemeen ziek zijn is de voedselopname gedaald. Dit heeft een Catekort tot gevolg. De koe verzwakt, zakt door haar poten en gaat op de grond liggen. Advies: De melkkoe buiten leggen op het gras zodat ze grip heeft op de grond om eventueel terug recht te kunnen komen.
17
De poten werden aangeprikt om te zien of er al dan niet zenuwschade is. De poot reageerde na aanprikken, vermoedelijk was er geen zenuwschade. Keizersnede bij een dikbilkoe (4de keer dat er keizersnede werd gedaan op deze koe: veel “wild vlees”: verbindweefseling aan de linkerflank).
Berner Senner
Behandeling:
Probleem:
AB (cephalosporine: SC
Symmetrische huidirritatie op achterhand .
+ tabletjes) en cortisone SC.
Melkveebedrijf
Koe 1 Probleem:
Behandeling:
Te weinig melk, te slappe mest.
Ontworming met Pour-
Diagnose:
on: Eprinex®
Sondage van de urinewegen: urinestaal werd getest op
(ivermectine met geen
ketonemie: negatief.
wachttijd), Naxel®
Rectaal onderzoek: abnormaal vergrote linker
(langwerkende ceftiofur-
nierlobben.
cephalosporine zonder
Oedeem tussen de kaaktakken.
wachttijden voor melk):
Prognose:
gespoten in het
Ongunstig + koe is te mager voor de slachtbank.
vetweefsel aan de oorbasis.
Koe 2 Probleem:
Behandeling:
Retentio secundarum + te weinig melk.
glucose IP, Naxel®
Diagnose: Urinestaal is positief voor ketonemie. Koe 3 Probleem:
Behandeling:
Anorexie + te weinig melk.
Catosal® (butafosfan,
Diagnose:
cyanocobalamine
Geen pingeluiden van lebmaag.
organische
Geen penscontracties.
fosforverbindingen met
18
Metaaldetector: op zoek naar metaalfragmenten die
Vit B12).
zich in de magen kunnen bevinden, er werd niks gevonden. Urinestaal negatief voor ketonemie. Vermoeden: pensparalyse.
60 vleesvee runderen werden behandeld voor schurft + ontworming met Dextomax® (doramectine).
5/8/10
9u -
Keizersnede bij een dikbilkoe.
12u
Keizersnede bij een dikbilkoe.
6/8/10
13u
CV
-
Probleem:
Behandeling:
19u
Eczeem aan de oortoppen, gehoorgangen normaal,
Ontvlooid, ontwormd,
vlooien aanwezig in de vacht.
Ceporex® (cefalexine: AB voor huidinfecties)
Kat Probleem:
Behandeling:
Niest, licht verkleven van de ogen.
Naxcel®
Diagnose: Gebaseerd op de symptomen: niesziekte.
Franse buldog Probleem:
Doorverwezen naar
De temporalis streek leek wat ingevallen, geen
collega KHD.
pijnsymptomen. Vermoeden: Atrofie van de m. temporalis . Keizersnede dikbilkoe (voor de 2de maal)
Koe 1
19
Probleem:
Behandeling:
Manken aan de linkerachterpoot.
De blaar aan de hoef
Diagnose:
werd geopend om de
Exsudatieve pododermatitis.
hoef te ontlasten.
Koe 2 Probleem:
Behandeling:
Manken aan rechterachterpoot.
Excenel® (ceftiofur:
Diagnose:
geen wachttijd voor
Interdigitale pododermatitis.
melk)
Koe 3 Probleem:
Behandeling:
Manken aan rechterachterpoot, de koe had aan die
Hoef werd bekapt en
poot ook een verkalkte hoornlaag.
verder met rust gelaten.
Melkkoe Probleem: Abortus van kalf. Drachttijd was 4m. Diagnose: Abortusprotocol: bloed (gestold en ongestold) genomen, nageboorte en foetus werden opgestuurd voor verder labo-onderzoek.
Vleeskalf 14d oud, BWB Probleem:
Behandeling:
Diarree en opgezette buik. Het enige kalf in de stal met
Boviferm plus,
diarree.
Promycine® (colistine)
Men weet niet of er voldoende biest werd opgenomen.
bolussen en Cobactan® (cefquinomesulfaat, cephalosporine) SC gegeven.
7/8/10
13u
Vaccinatie van 2 paarden tegen influenza en tetanus.
– 17u
20
Vaccinatie van 1 paard tegen influenza en tetanus.
Vleeskalf Probleem:
Behandeling:
Vleeskalf had 2 kromme voorpoten.
Xylazine IV en aanbrengen van strekgips (natuurlijke). Na 3 weken mag de strekgips verwijderd worden.
10/9/10
9u
Keizersnede van dikbilkoe
– 15u
Keizersnede van dikbilkoe.
KI van 4 jaar oude koe (al reeds 2 keizersnedes).
Vleeskalf Probleem:
Behandeling:
Kalf met chronische diarree, mager en klein (bij de
Al reeds behandeld:
geboorte was het kalf al relatief aan de kleine kant, nu
ontworming,
is het bijna een derde kleiner dan zijn
coccidiostatica, …
leeftijdgenootjes).
Nu werd er getest op BVD.
11/9/10
8u
Keizersnede van dikbilkoe.
– 12u
Melkkoe Probleem:
Behandeling:
Koe mankte rechts achter, er was een lichte zwelling
De rechter achterpoot
van de weke delen thv de rechtervoorpoot.
werd bekapt. Daar heeft
21
men een blaar gevonden. De blaar werd geopend (Doel: ontlasting van de druk in de blaar). Er werd ook ceftiofur gegeven
Melkkoe Probleem: Gestorven koe (autopsie vereist). Anamnese: Ingevoerde melkkoe uit Nederland, sedert 1w op het bedrijf. De koe was vermoedelijk niet geadapteerd aan een grote hoeveelheid maïs in het voeder. Voor de sterfte had de koe diarree en gaf ze minder melk. Autopsie: Sterk gestuwde pensmucosa, veel vocht in de pens (waarschijnlijk heeft de koe veel gedronken). Diagnose: Vermoeden van pensacidose (mogelijk door een verhoogde hoeveelheid maïs in de voeding in de nieuwe huisvesting).
30/10/10
17u
Vleeskoe (vetmesting) Probleem:
Behandeling:
Unilaterale facialis paralyse (afgezakt oor, oog,
Excenel® 1gr IV +
mondhoek en neusvleugel). De koe vertoonde ook
Rapidoxon®
typische cirkelbewegingen.
(dexamethazone).
Diagnose: Lysteriose.
31/10/10
10u
Keizersnede van dikbilkoe.
12u
Keizersnede van dikbilkoe.
22
2.2 CASUÏSTIEK GROTE HUISDIEREN Anamnese Op vrijdag 6 augustus 2010 kwamen we aan op de boerderij waar een kalf (BWB) van 13 dagen oud last had van diarree. Het kalf had ook een opgezette buik. Op vlak van huisvesting waren er weinig opmerkingen op het eerste zicht. De kalveren hadden elk hun eigen box. Het stro in de boxen was niet sterk bevuild. De bezettingsgraad van de stallen was normaal. Klinisch onderzoek De diarree van het kalf was waterig. Het dier was wat lethargisch en had anorexie. Er was sprake van een lichte tachycardie bij de auscultatie. De temperatuur werd gemeten, ze bedroeg 39,9°C. Er waren geen duidelijke tekenen van dehydratatie. Probleemlijst
13 dagen oud BWB-kalf
Waterige diarree
Opgezette buik
Lethargie en anorexie
Lichte tachycardie
Koorts: 39.9°C
Differentiaal diagnose Diarree bij het kalf is vaak een complex en multifactorieel gegeven. De meest voorkomende oorzaken zijn: 1. Nutritionele problemen a. Verandering van voeder: dit is in deze casus niet het geval b. Abnormale kwaliteit van het voeder: de kalveren kregen hun normale voeder. Tenzij er veranderingen zijn gebeurd bij de leveranciers zou dit geen storende factor mogen zijn. c.
Overvoedering: de boer had niet het idee dat het kalf de laatste tijd meer had opgenomen dan normaal.
2. Infectieus a. Virale oorsprong i. Rota-corona virus: mogelijkheid ii. BVD: mogelijkheid b. Bacteriële oorsprong i. Escherichia coli
23
1. ETEC: maar het kalf in kwestie is ouder dan 1 week 2. EPEC: mogelijke kandidaat omdat het kalf ouder is dan 1 week ii. Salmonella (mestkalveren): mogelijk: het komt voor bij elke leeftijdscategorie, maar vooral kalveren tussen 2-6 weken oud zijn het meest gevoelig voor klinische salmonellose. Het dier vertoont wel lichte koorts en is inderdaad ook wat apathisch en anorectisch. De diarree bevat wel geen bloed of mucus. iii. Clostridium perfringens: minder mogelijk. Gezien de korte incubatietijd van de ziekte en het uitblijven van de eventuele centrale zenuwstoornissen met plotse sterfte is deze kiem minder waarschijnlijk de boosdoener. c.
Parasitaire oorsprong i. Cryptosporidium (3 – 15d): mogelijk, het kalf is 14d oud ii. Coccidiose (>2- 3w): dubieus: het kalf is net geen 2 weken iii. Strongyloides (> 1w): mogelijk: het kalf is inderdaad ouder dan 1 week iv. Giardia (1-10m): weinig waarschijnlijk: het kalf is jonger dan een maand
Diagnose Buiten de anamnese en een beoordeling van de klinische symptomen kan de dierenarts ook gebruik maken van bijkomende onderzoeken voor een diagnose:
Bacteriologisch onderzoek van mest of darminhoud (kweek, ELISA, PCR)
Virologisch onderzoek van mest (ELISA, EM), darminhoud (ELISA, EM), darm (IF), of bloedonderzoek (Ag bepaling BVD)
Parasitologisch onderzoek van mest (sedimentatie-flottatie, kleuring, ELISA)
De dierenarts heeft ervoor gekozen om het kalf diagnostisch te behandelen. De redenen hiervoor zijn de financiële beperkingen van de cliënt en ook de tijdsbeperkingen. Voordat de dierenarts de resultaten zou kunnen krijgen van de diagnostische testen zijn er al zeker enkele dagen voorbij. Voor bloedonderzoek worden de buisjes ook maar 2 keer per week opgehaald. Door te wachten op de testresultaten zou het kalf er misschien veel slechter aan toe zijn dan bij een onmiddellijke diagnostische behandeling. Behandeling Het kalf werd behandeld met Boviferm plus® SID. Dit product zorgt voor een toevoer van elektrolyten en buffer (alkaliniserend) tegen dehydratatie en acidose. Het bevat ook lactose als probioticum voor het herstel van de natieve intestinale microflora. Het bevat tenslotte ook darmprotectiva (mucines en pectines) die zorgen voor een vastere stoelgang: ze binden aan toxines en medicatie en beschermen de mucosa. Soms kunnen pectines wel een negatief effect hebben op de absorptie van de ionen en vocht. Het product heeft ook een goeie smaak, wat niet onbelangrijk is gezien de patiënt anorectisch is. De dierenarts heeft ook Promycine® (colistine) bolussen en Cobactan® (cefquinomesulfaat, cephalosporine) SC gegeven. Colistine werkt tegen gram-negatieve bacteriën. De cephalosporines
24
werken tegen zowel gram-positieve als gram-negatieve kiemen. Het is indicatief voor E.coli bij kalverendiarree. Prognose De dierenarts was snel bij het zieke kalf en gezien de milde symptomen en de brede behandeling ziet de prognose er gunstig uit. Een week na de behandeling heeft de dierenarts bij een volgend bezoek aan de cliënt vernomen dat alles in orde was met het kalf. Referenties Haesebrouck F. (2009). Bacteriële en mycotische ziekten bij het rund. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent. Deprez P., Van Loon G. (2010). Inwendige ziekten van de grote huisdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent.
2.3 ANALYSE VAN STRUCTUUR EN MANAGEMENT PRAKTIJK GROTE HUISDIEREN De dierenarts met wie ik meeliep, werkt in een eenmanspraktijk. Driekwart van de tijd spendeert hij als dierenarts van grote huisdieren, het andere kwart van de tijd werkt hij als keurder voor de grensinspectiepost (GIP). Hij werkt al 30 jaar lang als dierenarts van grote huisdieren en sinds de laatste 5 jaar is hij ook gaan keuren. De dierenarts werkt met een volledige boekhouding als natuurlijk persoon. Zijn vrouw is ingeschreven als meewerkende echtgenote in het bedrijf en verzorgt de administratieve (bestellingen, facturatie,...) zijde van het praktijk. Men maakt geen gebruik van specifieke software, noch voor de consultaties, noch voor de administratie. In de 30 jaar dat de dierenarts zijn praktijk heeft, is er niet zoveel veranderd aan de structuur van het bedrijf. Na het afstuderen in april 1981 is de dierenarts direct alleen begonnen met zijn praktijk. Gezien hij al 5 jaar lang tijdens zijn studie had meegelopen met een dierenarts, had hij ook de nodige kennis voor het starten van een eigen praktijk. Doordat hij weinig nood had aan dure apparatuur in zijn praktijk, was er ook geen probleem met afbetalingsplannen. De dierenarts vindt het niet meer nuttig nieuwe, dure apparatuur zoals een echotoestel en dergelijke aan te schaffen, omdat hij momenteel zijn consultaties eerder wat aan het afbouwen is. Zijn motto is altijd geweest: men moet in de praktijk meer de ogen openen om te zien wat het probleem is en de handen uit de mouwen steken om te voelen wat er aan de hand is. Gedurende die tientallen jaren werkervaring zijn er eigenlijk wel wat dingen veranderd. Waar vroeger de boer de dierenarts op zijn woord nam, zijn de boeren de dierenartsen meer en meer gaan benaderen vanuit een zakelijk standpunt. Daarbij zijn de boeren ook alsmaar inventiever geworden in hun samenwerking. Je werkt dus als dierenarts niet meer voor een individu dat je kent als de buurman naast de deur, maar voor een bedrijf waar je goed van bewust moet zijn waar je aan
25
begint. Fouten worden niet snel meer vergeven en hebben vaak ook grote gevolgen. Hoewel de eisen van de boeren doorheen de jaren zeker een stijging hebben gekend, kan men dit echter niet zeggen van de financiële tegemoetkoming. De prijzen hebben zeker niet een gelijkaardige klim gekend als de kosten. Hoewel de kosten van een keizersnede zijn gestegen is de prijs voor de keizersnede quasi hetzelfde gebleven als 20 jaar geleden („89). Geneesmiddelen zijn ook veel duurder geworden door de registratieprocedure (bijvoorbeeld een fles van chloramphenicol van 250ml werd vroeger verkocht als florfenicole aan €10. Nu kost zo‟n fles €110). De visites zijn mee geïndexeerd. De kosten voor de Goede Veterinaire Praktijken (GVP) keuring zijn ook gestegen. Dit en nog andere dingen hebben er samen voor gezorgd dat de winstmarge van de dierenarts een serieuze deuk heeft gekregen. Zoals te verwachten komen de klanten in tegenstelling tot bij de kleine huisdieren niet naar de praktijk. Een groot deel van de dag wordt dan ook besteed aan huisbezoeken. Een ander verschil met de praktijk van een kleine huisdierenarts is dat de boeren op het einde van de maand pas een factuur krijgen. De kosten worden dus niet onmiddellijk betaald. De dierenarts rijdt met een bedrijfswagen waar quasi al zijn instrumenten en medicatie in liggen, het is dus een soort van mobiele praktijk. Daarnaast heeft hij in zijn eigen praktijk ook nog een kleine consultatieruimte vrij. Deze wordt meestal gebruikt als er af en toe eens een klant komt met zijn/haar gezelschapsdier. Dit zijn dan meestal mensen die in de buurt wonen of sporadisch ook eens een toerist. De drukste periode van het jaar is zeker van half januari tot half juli. De dierenarts werkt dan ook gemiddeld 12 uren per dag. Daarnaast zijn er ook nog veel keizersneden die gedaan moeten worden tijdens de nacht. Vroeger waren dat soms nog meerdere uren (kon oplopen tot 18 uren of meer). Het begint voornamelijk rustiger te worden als het kalverenseizoen voorbij is. Vanaf half juli tot half januari werkt hij meestal 6 uren per dag. Om de klanten tevreden te houden zorgt de dierenarts ervoor dat ze een collega kunnen contacteren als hij op reis of afwezig zou zijn. Vroeger werkte de dierenarts met een vaste collega samen om elkaars patiënten op te vangen. Na het overlijden van die collega is hij samen gaan werken met twee anderen die ook in de omgeving wonen. De klant wordt dan telefonisch rechtstreeks doorgeschakeld naar één van die twee collega‟s.
26
3 PERSOONLIJKE REFLECTIE Het doel van deze stage was om de studenten kennis te laten maken met het praktijkleven van een dierenarts van grote en kleine huisdieren. Dit helpt ons verder in de keuze van de afstudeerrichting in het laatste jaar. Voor mij persoonlijk was de stage een enorme hulp in mijn keuze tussen de twee richtingen. Stage grote huisdieren De eerste stage die ik gelopen heb was die bij een dierenarts grote huisdieren, tijdens de zomervakantie vorig jaar. De praktijk waar ik de stage gevolgd heb was een éénmanspraktijk. De dierenarts werkt vooral met runderen: behalve voor eenvoudige vaccinaties verwijst hij klanten met paarden meestal door naar collega's. De dierenarts keurt ook regelmatig voor de grenspostinspectie. Hoewel ik af en toe meeliep met een dierenarts van kleine huisdieren had ik eigenlijk geen realistisch idee van de praktijk van een dierenarts voor grote huisdieren. Het was dus de eerste keer dat ik een kijkje heb genomen in zo‟n praktijk. Dit was een zeer leerrijke ervaring. De runderen benaderen in de praktijk is toch wat anders dan in de universitaire kliniek. Eigenlijk zijn de dieren in de kliniek veel rustiger dan bij het cliënteel van de dierenarts. Men moet daarom veel voorzichtiger tewerk gaan. De effecten van een kleine fout kunnen immers grote gevolgen hebben. Uiteraard worden de dieren ook op een andere manier gehanteerd dan bij de gezelschapsdieren. Tijdens de stage met de dierenarts heb ik veel praktische handelingen mogen uitvoeren, zoals de dieren merken, vaccineren en AB inspuiten. Het was toen ook dat ik mijn eerste rectaal en vaginaal onderzoek heb mogen uitvoeren, wat zeer leerrijk was. Er is uiteraard een groot verschil tussen de theorie in de cursussen en eigenhandig het dier van binnenuit aftasten. Van de dierenarts mocht ik ook assisteren bij de keizersneden. Hij heeft zelf verschillende vleeskoeien en schapen. Ik heb tijdens de stage mogen meehelpen bij de kunstmatige inseminatie van deze koeien. De dierenarts heeft mij ook getoond hoe men het best de koeien en de schapen in de weide benadert (in het bijzonder het alfa-mannetje van de schapen). Zeer interessant bij al deze zaken was de persoonlijke begeleiding die ik gekregen heb van de dierenarts. In tegenstelling tot in de kliniek, was ik de enige student en had de dierenarts dus veel tijd om mijn vragen te beantwoorden. Hij gaf altijd uitleg bij wat hij deed en waarom het in de praktijk soms anders verloopt dan in de kliniek op de universiteit. Hij liet mij ook veel dingen zelf doen en uitproberen. In de kliniek komt dit nog niet zo veel aan bod voor 2de master-studenten. De dierenarts stelde mij altijd gerust en liet mij rustig de tijd om de onderzoeken te verrichten. Zeker bij zijn eigen dieren gaf hij mij grote vrijheid. Een ander groot verschil met de kliniek is dat men directe interactie heeft met de eigenaren van de dieren. De meeste onderzoeken en ingrepen vinden immers plaats bij de boer zelf, waar hij vaak ook
27
aanwezig is. In tegenstelling tot wat ik vaak gehoord heb van medestudenten, werd ik bij de boeren meestal zeer professioneel en positief behandeld. Vaak hoort men dat vrouwen, en in het bijzonder stadskinderen, eerder neerbuigend bekeken worden. Dat was bijvoorbeeld het geval tijdens de stage in het eerste masterjaar, bij de varkensboer. Deze vooroordelen zijn natuurlijk ook niet allemaal ongegrond: stadsmensen zien dieren immers door een volledige andere bril als boeren. Waar bij stadsmensen dieren eerder als metgezel worden behandeld, zijn ze voor boeren nutsdieren die moeten voldoen aan de economische realiteit. Zelfs de honden en katten op een boerderij hebben elk hun functie. De dierenarts weet dan ook te vertellen dat vele dierenartsen van de grote huisdieren die uit de stad komen vaak na enkele jaren toch overschakelen naar een praktijk voor kleine huisdieren. Daaruit volgt dat de geneeskunde bij grote huisdieren vanuit een andere visie gestuurd wordt dan bij de kleine dieren. Het doel is om geld te verdienen, waardoor elke interventie wordt afgewogen wat betreft zijn kosten en baten. Hoewel men mij dit natuurlijk al wel verteld had, was het zeer interessant om dit aan de lijve te ondervinden. Het verschil tussen de eerstelijnshulp in de praktijk en de tweedelijnshulp in de kliniek is zeer opmerkelijk: in een praktijk wordt de dierenarts nog meer in zijn handelingen beperkt door de financiële mogelijkheden van de boer (in de kliniek zien we vaker meer gemotiveerde eigenaars met meer waardevolle dieren) en de tijdsbeperkingen (een simpel bloedonderzoek voor de dierenarts op het veld neemt enkele dagen in, waar zoiets in de kliniek op enkele uren geregeld is). Misschien het meest interessante onderdeel van de stage was de persoonlijke input van de dierenarts en zijn partner over het beroep in het algemeen. Zij konden mij inzicht geven in de verschillende voordelen en nadelen die verbonden zijn aan het werken als dierenarts met grote dieren en aan het werken in een éénmanspraktijk. Zo vertelde hij mij dat de dagelijkse job van de dierenarts grote huisdieren fysiek zeer zwaar kan zijn. In de winter, wanneer het hoog kalfseizoen is, is het vaak werken van 's ochtends zeer vroeg tot 's avonds zeer laat. Vaak wordt de dierenarts ook 's nachts opgeroepen, omdat bijvoorbeeld een keizersnede 's nachts moet uitgevoerd worden. Hierbij zijn de omstandigheden vaak eerder onaangenaam: de ingrepen vinden plaats in de stallen, die zeer koud en nat kunnen zijn. Omdat gewerkt wordt met grote en zware dieren zijn de taken bij deze dieren meestal zwaarder dan bij de kleine dieren. Zo is het hechten van de huid bij een koe significant zwaarder dan bij bijvoorbeeld een hond, en het extraheren van een kalf trek-en-sleurwerk. Vaak moet de dierenarts ook ergonomisch slechte posities aannemen, zoals bij het kappen van de hoeven van een rund. Het vele avond- en nachtwerk maak de combinatie van de job met een gezinsleven zeer moeilijk. Daarenboven appreciëren de meeste boeren het niet als hun dierenarts langdurig (meer dan één week) vakantie neemt. Het voordeel bij groepspraktijken is dat men elkaar kan afwisselen in shiften. Op deze manier wordt bijvoorbeeld een zwangere vrouw gemakkelijker vervangen voor een jaar zonder dat de klant daar ongemak van ervaart. Men hoeft dan ook niet elke dag paraat te staan, wat de lasten toch wat verlaagt. In een groepspraktijk kan men de meningen van collega's raadplegen bij geval van twijfel. Vanuit een associatie kan men ook gemakkelijker infosessies geven en bedrijfsbegeleiding
28
aanbieden. Het is zeer moeilijk voor een dierenarts die er alleen voorstaat, om ook nog infosessies en dergelijke voor te bereiden. Het nadeel van een groepspraktijk is dan weer dat meestal de jonge vennoten in zo‟n praktijk belast worden met het nacht- en weekendwerk. Dit zorgt voor wrijving binnen de associatie. De dierenarts vertelde mij dan ook dat hij veel associaties heeft zien komen en gaan. In de zomer valt het voor een associatie ook zwaar omdat het werk sterk beperkt kan zijn en de jonge vennoten toch uitbetaald moet worden. Stage kleine huisdieren De tweede stage die ik gelopen heb, vond plaats tijdens de paasvakantie bij mijn eigen dierenarts. Ik heb ook al eerder vrijwillige stage gelopen bij deze dierenarts, dus het was niet een geheel nieuwe ervaring zoals die van de grote huisdieren. De dierenarts is een klassieke, eerstelijnsdierenarts die geen bijzondere specialisatie heeft. Hij beschikt niet over tweedelijnsapparatuur zoals een echotoestel of gasanesthesie. Voor een aantal onderzoeken verwijst hij dan ook door naar collega's. Tijdens deze stage heb ik mogen assisteren bij sterilisaties en castraties. Ik heb ook vaak zelf vaccinaties en intramusculaire injecties uitgevoerd. Verder heb ik gezien hoe je het best een dier manipuleert voor klinische onderzoeken en hoe je kan omgaan met wilde katten. Tenslotte heb ik ook veel bijgeleerd over hoe je het best de eigenaars benadert, aangezien deze wereld grondig verschilt van die van de grote huisdieren. Men gaat immers veel persoonlijker om met de eigenaars van de kleine huisdieren dan bij de grote huisdieren. Soms gebeurt het zelfs dat een eigenaar komt voor een babbel met de dierenarts. Net zoals bij de stage van de grote huisdieren werd ik zeer goed begeleid door de dierenarts. Ik werd uitgenodigd om veel vragen te stellen en mij af te vragen waarom er zulke grote verschillen kunnen zijn tussen de theorie in de cursus en de behandelingswijzen in de praktijk. De dierenarts staat ook zeer open voor nieuwe inzichten in de diagnose en therapieën voor bepaalde aandoeningen die aan bod zijn gekomen tijdens de klinieken. Naast zijn job in de praktijk, keurt de dierenarts sinds een paar jaar voor de grenspostinspectie. Hij doet dit als aanvulling voor zijn pensioen, en ook omdat hij gezien zijn leeftijd een beetje aan het uitbollen is van zijn praktijk. Dit heeft mij laten inzien dat het vak Veterinaire Volksgezondheid een zeer interessante aanvulling kan zijn voor mijn opleiding: dit zou als back-up plan kunnen dienen voor als ik niet direct werk vind. Het keuren gebeurt immers in de ochtend, wat de rest van de dag vrijlaat voor het zoeken naar werk of het uitvoeren van vrijwillige stages. Net zoals bij de dierenarts grote huisdieren zijn er natuurlijk ook bij de kleine dieren minder leuke kanten aan het werk. Omdat de dierenarts in een eenmanspraktijk werkt, maar toch altijd wil klaarstaan voor zijn klanten, heeft dat als gevolg dat hij vaak avond- en weekendwerk moet doen. Soms durven eigenaars hem voor kleinigheden uit bed bellen, wat tot slaaptekort en frustratie kan leiden. Het verbaasde mij ook dat er veel klanten zijn die geen verdere stappen willen ondernemen
29
voor hun dier. Door in de kliniek te staan was ik gewoon dat de eigenaars echt ver willen gaan voor hun huisdieren, maar dit blijkt in de eerstelijnshulp niet zo te zijn. Zoals professor Daminet zegt, zijn er veel eigenaars die liever een melanoom kweken dan hun huisdier te genezen. Mijn dierenarts vertelde dat hij vermoedde dat het deels ook ligt aan de geografische ligging van de praktijk. In groepspraktijken heb je net zoals bij de grote huisdieren het voordeel dat je elkaar kan aflossen en dat raadplegingen bij collega's dierenartsen makkelijker worden. Ook heeft een groepspraktijk grotere financiële middelen, wat dieper onderzoek en betere diagnoses mogelijk maakt. In groepspraktijken is het vaak ook zo dat de dokters zich meer verdiepen in een bepaalde tak van de geneeskunde. Nadelen van groepspraktijken zijn dat nieuwe dierenartsen vaak worden aangenomen als schijnzelfstandigen, waarvoor geen minimumverloningen bestaan. Mijn dierenarts vertelde dat een ander nadeel aan de groepsprakijken is, dat het persoonlijke contact met de dierenarts dreigt weg te vallen, vermits klanten vaak geholpen worden door verschillende artsen. Tenslotte verlies je als dierenarts natuurlijk een deel van je vrijheid in een groepspraktijk: je moet het beleid van de praktijk mee volgen. Besluit Voor mij persoonlijk waren deze twee stages zeer leerrijk. Ik heb veel nieuwe dingen bijgeleerd en theoretische kennis kunnen omzetten in de praktijk. Door beide takken te ondervinden in de praktijk, kon ik een meer gefundeerde beslissing nemen over mijn studierichting. Uit de twee stages heb ik beslist om verder te gaan in de optie kleine huisdieren. Ik zou graag willen werken in een groepspraktijk, en mij verder verdiepen in een bepaalde tak. De belangrijkste factor in mijn keuze was de emotionele en fysische belasting. Fysisch gezien ben ikzelf niet zo robuust gebouwd en denk ik dat de grote huisdieren een te grote belasting zouden vormen voor mij. Emotioneel gezien komen de kleine huisdieren meer overeen met mijn motivatie om dierenarts te gaan studeren: het helpen van dieren en het verbeteren van hun levenskwaliteiten. Ik zou zeer graag in de tweede lijn werken bij de kleine huisdieren, omdat je dan meer in contact komt met gemotiveerde eigenaars. Er is immers niets meer frustrerend dan een dier te kúnnen behandelen maar gestopt te worden door de eigenaar.
30
