UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2008 -2009
TRANSGENE DIEREN IN DE VEETEELT: HEDEN EN TOEKOMST door Sander VANHOVE
Promotor: Dr. M. Van Poucke Co-promotor: Prof. Dr. L. Peelman
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
De auteur en de promotor geven de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen hiervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
VOORWOORD Hierbij wil ik alle personen bedanken die mij geholpen hebben met het tot stand komen van deze literatuurstudie. Vooreerst mijn ouders omdat zij mij de kans hebben gegeven om me te laten studeren, zonder hun steun had ik dit allemaal niet kunnen verwezenlijken. Ook zou ik mijn promotor Dr. M. Van Poucke ten harte willen bedanken voor zijn advies en begeleiding. Uiteraard mag ik ook Sarah Vandee niet vergeten te bedanken voor al haar hulp bij het corrigeren van taalfouten. Mijn vriendin wil ik bedanken, omdat zij altijd voor mij klaar staat en ik veel kracht put uit haar onvermoeibaar optimisme.
INHOUDSOPGAVE Samenvatting……………...….……...…………………………………………………….…………………p. 2 1.
Inleiding………………………………………………………………….……………….…………...…........p. 3
2.
Literatuurstudie……………………………………………………………………….……………………….p. 4
2.1.
Transgenese: een introductie…………………………………………………….……………………….…p. 4
2.2.
Technieken ter productie van transgene dieren……………………………….……………………….….p. 5
2.2.1.
DNA micro-injectie…………………………………………………………….……………………………...p. 6
2.2.2.
Gentransfer met behulp van transposons…………………………………………………….……..……..p. 6
2.2.3.
Gentransfer met behulp van virale vectoren……………………………….………………..………….…p. 7
2.2.4.
Intra cytoplasmatische sperma-injectie transgenese (ICSI-Tr)……………………………….……….…p. 8
2.2.5.
Gentransfer met behulp van pluripotente cellijnen……………………………………………….………..p. 8
2.2.6.
Het klonen van landbouwhuisdieren………………………………………………………………….…..…p. 9
2.2.6.1. Inleiding………………………………………………………………..………………………………….…….p. 9 2.2.6.2. Transfectie van cellijnen………………………………………………………………………………..….….p. 9 2.2.6.3. Kerntransplantatie (somatic cell nuclear transfer, SCNT)…………………………………………………p. 10 2.3.
Toepassingen…………………………………………………………………………………………………..p. 10
2.3.1.
Het belang van transgene landbouwhuisdieren in de biomedische wereld……………….…………....p. 10
2.3.1.1.
De farmacoboerderij………………………............................................................................................p. 11
2.3.1.2.
Landbouwhuisdieren als model voor humane pathologie…………………………………………..…….p. 12
2.3.1.3.
Xenotransplantatie ………………………………………………………………………………………..…..p. 13
2.3.2.
Transgene dieren in de landbouw………………………………………………………………………..…p. 14
2.3.2.1.
Karkas compositie…………………………………………………………………………………………..…p. 14
2.3.2.2.
Lactatie………………………………………………………………………………………………………....p. 15
2.3.2.3.
Milieuvriendelijke landbouwhuisdieren……………………………………………………………………...p. 16
2.3.2.4.
Ziekte resistentie……………………………………………………………………………………………....p. 16
2.4.
De ethische dialoog………………………………………………………………………………………...…p. 17
2.5.
Discussie…………………………………………………………………………………………………….....p. 18
3.
Literatuurlijst……………………………………………………………………………………………………p. 19
SAMENVATTING In deze literatuurstudie is het de bedoeling na te gaan wat transgenese ons nu en in de toekomst te bieden heeft. Eerst wordt het begrip transgenese van naderbij bekeken om de lezer een beeld te laten vormen van deze tak van de moderne biotechnologie. Het begrip wordt verder besproken met nadruk op de impact op de veeteelt. Nadien worden de verschillende technieken ter productie van transgene dieren uitgelegd. Veel aandacht gaat hierbij naar de voor- en nadelen van de beschikbare methodes. Wanneer men een beter inzicht heeft verkregen in het hoe, wordt er verder ingegaan op het waarom. Er worden een groot aantal toepassingen van transgenese in de landbouw en biomedische wereld besproken. Deze toepassingen zijn van ver uiteenlopende aard. Een recombinanteiwit in de melk van transgene dieren is reeds op de markt gebracht. Op andere toepassingen zullen we echter nog enkele jaren moeten wachten. Genetische modificatie zorgt voor een ethische dialoog met hevige voor- en tegenstanders. De emoties in het ggo-debat laaien geregeld hoog op. Daardoor verdwijnen wetenschappelijke feiten soms wat naar de achtergrond. De meest radicale vertegenwoordigers van beide kampen zijn soms zo overtuigd van hun eigen gelijk dat ze geen oren hebben naar argumenten van de tegenpartij. Het lijkt erg onwaarschijnlijk dat de ontwikkeling van ggo’s zal worden teruggeschroefd en dat ze plots van de aardbodem zullen verdwijnen. Vermoedelijk zal de toekomst uitwijzen welke problemen aan het kweken en telen van ggo’s verbonden zijn en of biotechnologen in staat zijn ze op te lossen. Ten slotte wordt er een kritisch beeld geschapen van de huidige consumptiemaatschappij en probeert men duidelijk te maken wat het nut is van de verdere ontwikkeling van transgenese in de veeteelt.
2
1. INLEIDING Genetische selectie voor gunstige kenmerken, alsook selectie tegen ongewenste kenmerken, paste men al toe sinds de start van de domesticatie van de eerste dieren, ongeveer 10,000 jaar geleden. Traditionele kweekmethodes zijn echter duur, inefficiënt, beperkt en tijdrovend. In wezen is transgenese niet zo verschillend van deze ouderwetse methodes, maar het biedt de mogelijkheid om veel sneller en nauwkeuriger aanpassingen aan het genoom van dieren door te voeren. Middels dit genetisch modificeren kan men productieprocessen winstgevender maken en hoopt men kwalitatief betere producten af te leveren. Met behulp van transgenese is men in staat om exogene genetische informatie stabiel te incorporeren in het genoom van landbouwhuisdieren. Het biedt ons de mogelijkheid om gekende genen verantwoordelijk voor voordelige productie eigenschappen beter uit te buiten en om ongewenste genen te inactiveren. Men kan tevens totaal nieuwe eigenschappen geven aan landbouwhuisdieren. De enorme snelheid en schaal waarop deze techniek hedendaags evolueert, zal een grote invloed hebben op de genetische optimalisatie van de veeteelt. Het ontrafelen van het volledig genoom van de verschillende landbouwhuisdieren draait op volle toeren. De continue vooruitgang in de identificatie van genen die productiekenmerken beïnvloeden en het verder begrijpen van de genen die belangrijk zijn voor de gezondheid van de mens, zal zich uiten in vele nieuwe toepassingen. Praktische toepassingen van transgenese in de veeteelt omvatten productie van recombinanteiwitten voor therapeutisch gebruik, productie van organen voor transplantatie, verbetering van de groei en karkaskwaliteit van dieren, verhogen van ziekteresistentie bij dieren en het verminderen van de negatieve invloed van landbouw op het milieu. De grootschalige toepassing van transgenese voor voedselproductie staat echter nog in haar kinderschoenen omwille van de relatief lage meerwaarde van het product en de negatieve publieke consensus die er nog steeds heerst rond de productie van genetisch gemodificeerde organismen voor consumptie. In de biomedische wereld is er momenteel een grotere rol weggelegd voor de toepassingen van transgenese. In 2006 werd het eerste recombinanteiwit geproduceerd door transgene dieren goedgekeurd voor therapeutisch gebruik. Vele andere recombinanteiwitten staan nog op de wachtlijst omdat ze eerst uitvoerig getest moeten worden. De ontwikkeling en perfectionering van nieuwe technieken en de verbetering van de gebruikelijke methodes (micro-injectie en klonen) zullen het mogelijk maken om goedkopere geneesmiddelen te produceren. Hierdoor kunnen mensen behandelingen krijgen die ze anders niet zouden kunnen betalen.
3
2. LITERATUURSTUDIE 2.1. TRANSGENESE: EEN INTRODUCTIE Sinds enkele decennia kunnen wetenschappers het genoom van micro-organismen, planten en dieren wijzigen en ze op die manier nieuwe, nuttige eigenschappen geven. Met ‘recombinant-DNAtechnieken’ kan men genen uit een organisme wegknippen en in het genoom van een ander organisme plakken. Het resultaat is een genetisch gewijzigd organisme of ‘ggo’. Het bijzondere aan genetische modificatie is dat bij het uitwisselen van genen de soortgrenzen kunnen worden doorbroken. Deze vorm van genetische modificatie wordt transgenese genoemd. Zo kan men bijvoorbeeld het humane gen coderend voor antithrombine III, een krachtige inhibitor van de coagulatie cascade, incorporeren in het genoom van een geit. Als alles goed verloopt, kan men in een later proces het antithrombine III uit de geitenmelk zuiveren. De eerste stap van genetische modificatie is het gewenste gen te isoleren uit het DNA. Genen bestaan echter niet enkel uit het deel dat wordt afgelezen om een eiwit te maken. Samen met het gewenste gen wordt er ook een promotor aangebracht, die bepaalt waar, wanneer en in welke hoeveelheid het nieuwe eiwit geproduceerd wordt. Het eiwit is immers niet altijd in alle cellen nodig. Gemakkelijkheidshalve wordt er ook bijna altijd een merkergen aangebracht. Dit zorgt ervoor dat men snel en eenvoudig kan controleren of het gen opgenomen is, of tot expressie gebracht wordt in een cel of organisme. Het genconstruct is het geheel van deze onderdelen. Om het genconstruct in een ander organisme te kunnen brengen moet het eerst worden ingebracht in een vector, die dient als drager van het DNA. Dit kan een stukje circulair bacterieel DNA (een plasmide) zijn, maar ook een virus of een liposoom. De meest directe manier om een genconstruct binnen te brengen in een dier, is door het gen rechtstreeks in een bevruchte eicel te injecteren, in de hoop dat het dier het in zijn DNA opneemt. Andere meer complexe technieken en de injectietechniek worden besproken verder in de literatuurstudie. De gewijzigde bevruchte eicellen worden na deling ingeplant in de uterus van een draagmoeder. Het is echter mogelijk dat het gen niet op de juiste plaats is ingebouwd en de extra eigenschap dus niet tot uitdrukking kan komen. Het is eveneens mogelijk dat de integratie van het DNA pas plaats vind als de bevruchte eicel zich al één of meerdere keren heeft gedeeld. Niet alle cellen van het dier zullen dus het nieuwe DNA bevatten. Enkel de dieren die het nieuwe gen in de geslachtscellen hebben, geven dit na gewone bevruchting door aan de volgende generaties. Er zijn dus vele dingen die fout kunnen gaan bij de productie van transgene dieren.
4
2.2. TECHNIEKEN TER PRODUCTIE VAN TRANSGENE DIEREN Transgene dieren kunnen geproduceerd worden met behulp van DNA micro-injectie in de pronucleus van een zygote (1), door gebruik te maken van lentivirale vectoren (2) of transposons (3), door sperma te incuberen met DNA gevolgd door in vitro fertilisatie gebruik makende van intracytoplasmatische sperma-injectie (4), door het transgen in te brengen in pluripotente cellen (embryonale stamcellen of primordiale kiemcellen) met als resultaat het tot stand komen van een chimaera, een mozaïek van gemodificeerde en niet-gemodificeerde cellen (5), en ten slotte door transfer van het transgen naar somatische cellen die in het kerntransplantatie proces gebruikt kunnen worden (6). Ze worden opgesomd in Fig. 1. Micro-injectie en kerntransplantatie worden hedendaags het meest toegepast. Ze zijn echter inefficiënt en kunnen leiden tot diverse abnormaliteiten in de ontwikkeling van het transgene dier.
.
Fig. 1. Verschillende methodes ter productie van transgene dieren (Houdebine, 2009)
5
2.2.1. DNA micro-injectie Pronucleaire DNA micro-injectie werd eerst ontwikkeld bij muizen en is nog steeds de meest courante techniek om transgene knaagdieren te produceren (Melo et al., 2007). Micro-injectie is een techniek die bij herkauwers en enkele andere dieren wordt geplaagd door een lage efficiëntie en bijgevolg een hoge kostprijs. Met behulp van een gespecialiseerde microscoop uitgerust met micromanipulatoren injecteert men een oplossing met een paar honderd kopieën van een genconstruct rechtstreeks in de mannelijke pronucleus van een recent bevrucht eencellig embryo, een zygote. Het DNA reparatie mechanisme zorgt voor de integratie van het genconstruct in het genoom. Na transfectie worden de embryo’s ingeplant in oestrus gesynchroniseerde draagmoeders. Men kan vooraf niet bepalen of het embryo dat men inplant wel degelijk transgeen is. Hierdoor kan men het aantal draagmoeders niet tot een minimum beperken, wat een grote kost met zich meebrengt. Heel vaak komt de ontwikkeling van de geïnjecteerde embryo’s tot stilstand. Soms word het geïnjecteerde DNA pas opgenomen in het genoom van de zygote als het zich ontwikkelende embryo zich al 1 of meerdere keren gedeeld heeft. Hierdoor ontstaat er een mozaïek van gemodificeerde en niet-gemodificeerde cellen (een chimaera), met tot mogelijk gevolg dat er geen kiemlijntransmissie optreedt waardoor de nakomelingen niet transgeen zijn (Gordon et al., 1980). De genconstructies integreren ad random in het genoom van het embryo en dit kan leiden tot een verstoorde activiteit van andere genen of kan invloed hebben op regio’s die genen in- en uitschakelen. Indien deze veranderingen drastisch genoeg zijn, kan hieruit een afwijkend fenotype volgen. Volgens Seidel (1993) moeten er door de lage efficiëntie ongeveer 1000 runder, 300 schaap en 200 geit zygoten geïnjecteerd worden om één transgeen dier te produceren. De enorm hoge kostprijs van de apparatuur en de lange leercurve om de micromanipulatie en micro-injectie techniek te beheersen, zijn eveneens onoverkomelijke nadelen van deze techniek. Als enkele schaarse voordelen zijn te vermelden: er is geen beperking qua grootte van het transgen dat men wil laten integreren en er is een meestal stabiele transmissie van generatie tot generatie. 2.2.2. Gentransfer met behulp van transposons In verschillende diersoorten wordt het vreemde DNA zelden opgenomen in het genoom van de gastheer (Houdebine, 2002). Door gebruik te maken van vectoren die de intrinsieke capaciteit hebben om te integreren in het genoom met hoge efficiëntie kan men dit probleem voorkomen. Transposons en retrovirussen behoren tot deze categorie. Transposons (jumping genes) zijn mobiele stukjes DNA op een chromosoom die in het genoom van plaats kunnen verwisselen. In het stukje DNA kunnen één of meerdere genen zitten en deze worden aan beide kanten begrensd door kleine, tegengestelde stukjes van nucleotiden (insertie-sequenties). Minstens één van deze genen codeert voor het enzym transposase. Transposase bindt zich aan de insertie-sequenties en aan de plaats waar het gen naar toe moet gaan, met als gevolg een verplaatsing van de genen gelegen tussen de insertie-sequenties. Transposons moeten genetisch gemodificeerd worden wil men er gebruik van maken als vector voor gen transfer. Het gen coderend voor transposase moet verwijderd worden om plaats te maken voor een vreemd gen en om te vermijden dat het recombinant transposon zich ongecontroleerd spreidt in het DNA van de gastheer. Het transposase werd eerst vaak exogeen toegediend, maar gezien de 6
technische problemen gerelateerd met de productie van transposases in vitro ontwikkelde men DNA en RNA gebaseerde procedures die toelieten om het transposase in situ te synthetiseren. Wu et al. (2006) concludeerden uit experimenten met enkele in situ gesynthetiseerde transposases dat het transposase piggy-Bac (PB) het efficiëntste was om tot een stabiele transgen insertie te komen. Maragathavally et al. (2006) koppelden het GAL4 DNA binding domein aan het PB transposase om te komen tot een gerichte integratie in specifieke gebieden van een doelwit DNA molecule. Deze technologie heeft de potentie om de ad random integratie van het transgen te minimaliseren en zo de invloed van de positie effecten op de expressie van het transgen teniet te doen. Transposons kunnen echter maar 2-3 kb aan vreemd DNA in zich dragen. 2.2.3. Gentransfer met behulp van virale vectoren Wegens de enorm hoge kosten voor de productie van transgene landbouwhuisdieren met behulp van micro-injectie ($60 000 geit of schaap, $300 000 rund) zoekt men steeds naar nieuwe methodes voor een efficiëntere productie van transgene dieren (Wall et al., 1997). Transgenese met behulp van lentivirale vectoren is een veelbelovende techniek die zijn waarde voor de veeteelt al heeft bewezen. Er werden reeds transgene varkens (Hofmann et al., 2003), runderen (Hofmann et al., 2004), kippen (McGrew et al., 2004), schapen en konijnen geproduceerd via deze techniek. Virale vectoren worden gebruikt om een transgen te introduceren in verschillende cellijnen, zygoten en eicellen. Volgens Robl et al. (2007) is transgenese met behulp van lentivirale vectoren, hedendaags de meest efficiënte methode om transgene dieren te produceren. Lentivirussen behoren tot de familie retroviridae. Na infectie van de gastheercel wordt het virale RNA via RT (reverse transcriptase) omgezet in DNA en dit wordt dan als een provirus ingebouwd in het genoom van de gastheercel. Om lentivirussen te kunnen gebruiken als virale vectoren voor transgenese, moeten de genen verantwoordelijk voor de pathogenese, de replicatie en de productie van infectieuze partikels uiteraard eerst geïdentificeerd worden. Vervolgens gaat men proberen deze genen zoveel mogelijk te verwijderen en introduceert men het transgen in het virus. Het virus wordt dus replicatie defectief gemaakt. Hoewel veelbelovend zijn er toch nog een aantal nadelen aan verbonden zoals het grote aantal embryo’s (73%) dat verloren gaat (Shinohara et al., 2007). Eén van de grootste nadelen van deze lentivirale vectoren is dat ze een beperkte ‘laad’ capaciteit hebben. Ze kunnen enkel kleine transgenen dragen (tot 8 kb) hoewel er in de praktijk al problemen zijn met verpakking en lage vector titers voor transgenen groter dan 6 kb (Whitelaw et al., 2008). Integratie in het genoom van de gastheer is ad random net zoals bij microinjectie. Er is echter een zeker risico verbonden aan het werken met retrovirale vectoren en de hoge veiligheidsnormen vereisen speciaal daarvoor uitgeruste laboratoria. Honaramooz et al. (2008) maakten gebruik van een adeno-associated virus (AAV) als virale vector. Ze transplanteerden getransfecteerde primordiale kiemcellen naar de testes van geiten waarvan de endogene kiemcellen verwijderd waren. Maar liefst 10% van de embryo’s geproduceerd via in vitro fertilisatie droegen het transgen in zich.
7
2.2.4. Intracytoplasmatische sperma-injectie transgenese (ICSI-Tr) Intracytoplasmatische sperma-injectie of ICSI is een manier van medisch geassisteerde voortplanting waarbij één spermacel rechtstreeks wordt ingebracht in een eicel. Spermacellen zijn in staat om spontaan vreemd DNA op te nemen. Het grootste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om zeer grote DNA fragmenten in het genoom te incorporeren. Het varken is tot op heden het enige landbouwhuisdier waarbij deze methode succesvol was (Yong et al., 2006). Perry et al. (1999) incubeerden muis spermatozoa na een vries-dooi cyclus met lineair dubbelstrengig DNA, dat het transgen bevatte en injecteerden dit sperma-DNA complex in het cytoplasma van eicellen. Het transgen wordt door het intrinsieke DNA reparatie mechanisme van de kern van de zygote in het genoom geïncorporeerd (Perry, 2000). De nood aan de activiteit van dit DNA reparatie mechanisme voor de incorporatie van het transgen, limiteert de efficiëntie en specificiteit van deze techniek (Moreira et al., 2004). Eén van de eerste verbeteringen van ICSI werd gerealiseerd door Morozumi et al. (2006). Na behandeling van spermatozoa met lysollecithine, een natuurlijk product van de hydrolyse van membraan fosfolipiden, meldden ze een versnelde activatie van de eicel en een verbeterde embryonale ontwikkeling. Liposomen (Smith en Spadafora, 2005) en antilichamen (Chang et al., 2002) kunnen gebruikt worden om de opname van vreemd DNA te vergemakkelijken. Om de transfectie efficiëntie en regiospecifieke insertie te verbeteren, werd er een nieuwe methode ontwikkeld die ICSI combineert met recombinases of transposases (Suganuma et al., 2005; Moisyadi et al., 2009). Deze enzymen zorgen ervoor dat het transgen voor zijn integratie niet meer afhankelijk is van het DNA reparatie mechanisme in de nucleus. De efficiëntie van enkele verschillende technieken wordt vergeleken in Tabel 1. Tabel 1. PiggyBac-ICSI efficiëntie versus lentivirale vectoren, micro-injectie en standaard ICSI De tabel geeft het percentage geïnjecteerde eicellen leidend tot de geboorte van transgene dieren weer. Ook weergeven is het percentage transgene dieren op het totaal van alle geboren dieren (Shinohara et al., 2007).
Methode
eicellen geïnjecteerd
dieren geboren
lentivirale vectoren
∼20%
∼80%
piggyBac-ICSI
∼20%
∼70%
micro-injectie (PNI,ICSI-Tr)
∼3-4,6%
∼20-46%
2.2.5. Gentransfer met behulp van pluripotente cellijnen Pluripotente stamcellen (embryonale stamcellen of embryonale kiemcellen) kunnen cellen vormen uit alle drie de kiemlagen van een embryo. Ze kunnen zich eveneens een ongelimiteerd aantal keer delen. Embryonale stamcellen worden verkregen door de inwendige celmassa van een jong embryo te isoleren en in cultuur te brengen. Embryonale kiemcellen kan men isoleren uit foetale gonaden. Na isolatie kan men genen toevoegen of inactiveren door middel van gene targeting. Gene targeting is een techniek die gebruik maakt van homologe recombinatie om een endogeen gen te wijzigen. Deze methode kan gebruikt worden om een gen te inactiveren (knock-out) of om een gen toe te voegen (knock-in). Selectie van cellen met de juiste genetische modificatie, is mogelijk voor implantatie. De 8
gemodificeerde cellen worden ingeplant in een zich ontwikkelende blastocyst en nemen deel aan de ontwikkeling van het dier. Hierdoor ontstaat een chimaera, een mozaïek van gemodificeerde en nietgemodificeerde cellen. De nakomelingen van een kruising van twee chimere dieren zullen volledig transgene dieren zijn. Tot op heden heeft men nog geen echte embryonale stamcellen kunnen isoleren van landbouwhuisdieren. De productie van transgene kippen uit embryonale kiemcellen werd echter onlangs gerealiseerd (van de Lavoir et al., 2006). Recente ontwikkelingen (Okita et al., 2007; Takahashi et al., 2007; Woltjen et al., 2009) toonden aan dat men humane en muriene fibroblasten volledig kon reprogrammeren tot pluripotente stamcellen. Dit biedt een nieuw perspectief ter creatie van pluripotente cellen afkomstig van landbouwhuisdieren. 2.2.6. Het klonen van landbouwhuisdieren 2.2.6.1. Inleiding In 1997 schokten Ian Wilmut en zijn team de wereld toen hij bekendmaakte dat zijn onderzoeksteam erin geslaagd was om een schaap te klonen met behulp van de kern van een volwassen, volledig gedifferentieerde cel (Wilmut et al.,1997). Dolly bewees dat het nu theoretisch mogelijk was om een ongelimiteerd aantal klonen van genetisch interessante landbouwhuisdieren te produceren. Dinnyes et al. (2008) melden dat er tot op heden al 18 verschillende diersoorten waaronder runderen, varkens, schapen en geiten, succesvol gekloond zijn. Tot de geboorte van Dolly werd algemeen aangenomen dat de mechanismen die de DNA-code selecteerden die een cel tot een huidcel maakten en niet tot een spiercel, hersencel of eender welk ander celtype, zo complex en zo star waren dat het onmogelijk zou zijn om ze ongedaan te maken. Vanaf toen werd de wereld van de transgenese ineens veel interessanter. Men kon nu genetische modificaties uitvoeren aan bepaalde cellijnen en enkel diegene selecteren, waarin het gelukt was de kern te modificeren. Er wordt enkel verdergegaan met de cellen die succesvol genetisch gemodificeerd zijn en blijven overleven. Zo moet men dus geen miljoenen embryo’s meer creëren en inplanten in draagmoeders om na de geboorte te kijken of het dier wel de gewenste genetische modificatie bezit. Omdat men tot nu toe spijtig genoeg enkel echte stamcellen heeft kunnen isoleren van muizen en primaten (Muñoz et al., 2008), biedt kerntransplantatie een uitstekend alternatief voor de productie van knock-out en knock-in dieren met behulp van gene targeting. 2.2.6.2. Transfectie van cellijnen De literatuur vermeldt een groot aantal methodes om tot een transfectie van eukaryote somatische cellen te komen waaronder micro-injectie (Sikes et al., 1994), partikel bombardement (Williams et al., 1991), calcium fosfaat gemedieerde gentransfer (Chen en Okayama, 1988), virus gemedieerde gentransfer (Kovesdi et al., 1997) en ten slotte gentransfer met behulp van liposomen (lipofectie). Deze laatste methode wordt tegenwoordig het meeste gebruikt omwille van de gemakkelijke toepasbaarheid en de uniforme transfectie efficiëntie (Melo et al., 2007).
9
2.2.6.3. Kerntransplantatie (somatic cell nuclear transfer, SCNT) Het principe van klonen is buitengewoon eenvoudig, je hebt maar twee cellen nodig. De ene is een eicel en de andere is een volwassen cel van het dier dat je wilt klonen. Je verwijdert de kern uit de eicel en dan breng je de genetische instructies van de donorcel in de eicel door ze te laten fuseren. Men maakt meestal gebruik van eicellen van ovaria die men in het slachthuis verzamelt. Deze overvloedige en goedkope aanvoer compenseert voor de iets mindere kwaliteit van eicellen in vergelijking met deze verkregen door superovulatie na een hormonale behandeling. Recent onderzoek (Yang et al., 2008) toonde aan dat door vitrificatie gecryopreserveerde boviene eicellen gebruikt kunnen worden als uitgangsmateriaal voor de productie van transgene gekloonde runderen. Klonen is ondanks de enorme vooruitgang die er geboekt is sinds 1997 nog steeds erg inefficiënt. Het slaagpercentage is bij de meeste diersoorten typisch minder dan 2% is. Runderen lijken een uitzondering op deze regel met een slaagpercentage van 15-20% (Kues en Niemann, 2004). Een voorname reden hiervoor is dat de herprogrammering van de getransplanteerde kern, onder meer door de factoren die zich in het cytoplasma van de eicel (o.a. het overgebleven maternaal mitochondriaal DNA) bevinden, vaak niet goed verloopt. Vele verschillen tussen volledig gedifferentieerde somatische cellen en gameten in methylatie en acetylatie patronen zouden verwijderd moeten worden tijdens het kloonproces. Het mechanisme dat hiervoor verantwoordelijk is wordt ook wel epigenetische herprogrammering genoemd. Een vaak voorkomende afwijking bij klonen is hypoacetylatie van histonen. Ding et al. (2008) toonden aan dat de efficiëntie van klonen van runderembryo’s tegelijkertijd behandeld met trichostatin A, een histon deacetylase inhibitor, en 5-aza2’-deoxycytidine, een DNA methyltransferase inhibitor, significant verbeterd kan worden. Doordat er bij klonen wordt afgeweken van het normale proces van seksuele voortplanting, ontstaan er fouten tijdens de inprenting van sommige genen. Bestaande inprentingen moeten weggehaald kunnen worden en er moeten er nieuwe gevormd kunnen worden. Dit gebeurt normaal in de geslachtscellen, waar de bestaande inprenting verwijderd wordt en dan opnieuw toegevoegd wordt volgens het geslacht van het individu. Inprenting is een epigenetisch proces. Veel ingeprente genen zijn betrokken bij de embryonale groei en ontwikkeling, alsook bij de groei van de placenta (Niemann et al., 2008). Ondanks sommige onderzoeken die aantoonden dat gekloonde dieren gezond zijn (Carter et al., 2002; Behboodi et al., 2005), is men er vandaag over eens dat klonen zeer vaak leidt complicaties zoals abnormale placenta vorming, abnormale foetale groei (o.a. large offspring syndrome) en postnatale afwijkingen (Farin et al., 2006). 2.3. TOEPASSINGEN 2.3.1. Het belang van transgene landbouwhuisdieren in de biomedische wereld Recombinanteiwitten kunnen worden geproduceerd in de melk van transgene runderen, geiten, schapen en konijnen. Transgene dieren worden gebruikt om onze kennis over bepaalde humane ziektes te vergroten. Binnen enkele jaren zullen transgene varkens hopelijk kunnen fungeren als leveranciers van organen voor xenotransplantatie. 10
2.3.1.1. De farmacoboerderij Het produceren van recombinanteiwitten in de melk van transgene dieren en het geld dat men hiermee kan verdienen, is één van de drijfveren voor de optimalisatie van transgenese in de veeteelt. Landbouwhuisdieren kunnen veranderd worden in levende medicijnfabrieken. Fermentatieketels, de reusachtige roestvrij stalen vaten waarin bacteriën en gisten worden gekweekt, zijn veel duurder dan het voer van de landbouwhuisdieren. Bovendien brengt het gebruik van micro-organismen nog een groter probleem met zich mee: deze eenvoudige organismen kunnen alleen eenvoudige eiwitten produceren. Complexere eiwitten die in het menselijk lichaam voorkomen, zijn voorzien van een suikerrest die zij nodig hebben om goed te kunnen functioneren (Fussenegger et al., 1999). Voor de farmacodieren op het toneel verschenen, kon men deze complexe glycoprotëinen enkel produceren in zoogdiercel bioreactoren; een omslachtig en duur proces, waaraan bovendien het risico kleeft dat tegelijkertijd menselijke ziekten geïsoleerd worden. Een groot aantal wetenschappers probeerde zo snel mogelijk ‘farmacoboer’ te worden, maar de goedkeuring van recombinanteiwitten neemt veel tijd in beslag door de hoge veiligheidsvereisten voor de producten van transgene dieren. De tijd vereist voor de ontwikkeling van een medicijn van synthese tot marktgoedkeuring bedraagt momenteel ongeveer 15 jaar (Miller, 2002). Recombinanteiwitten kunnen geproduceerd worden in verschillende biologische vloeistoffen zoals melk, urine, speeksel en bloed. Expressie van het transgen in de melkklier ligt het meest voor de hand omdat dit toelaat dagelijks grote hoeveelheden recombinanteiwitten te produceren en te oogsten op een niet-invasieve manier. Melk heeft eveneens een eenvoudige en goedgekende eiwitsamenstelling waardoor een bijkomend eiwit er gemakkelijk uit te zuiveren is. De melkklier kan meer dan 2 gram recombinant eiwit per liter melk produceren (van Berkel et al., 2002). Verschillende recombinanteiwitten geproduceerd in de melk van transgene dieren worden opgesomd in Tabel 2. Tabel 2. Enkele humane eiwitten gescreteerd in de melk van transgene landbouwhuisdieren (Melo et al., 2007) Farmacon
Diersoort
Toepassing/behandeling
Bedrijf
Referentie
Antithrombine III
Geit
Thrombose, pulmonaire embolie
GTC Biotherapeutics (USA)
Ebert et al. (1991)
tPA
Geit
Thrombose
PPL Therapeutics (UK)
Ebert et al. (1994)
α-antitrypsine
Schaap
Emfyseem en cirrose
PPL Therapeutics (UK)
Wright et al. (1991)
Factor IX
Schaap
Hemofilie b
PPL Therapeutics (UK)
Schnieke et al. (1997)
Factor VIII Polyclonale antilichamen
Schaap
Hemofilie a
PPL Therapeutics (UK)
Niemann et al. (1999)
Rund
Vaccins
Hematech (USA)
Kuroiwa et al. (2004)
Lactoferrine
Rund
Bactericied
Pharming Group (NED)
van Berkel et al. (2002)
C1 inhibitor
Konijn
erfelijk angioedeem
Pharming Group (NED)
van Doorn et al. (2005)
Calcitonine
Konijn
osteoporose en hypercalcemie
PPL Therapeutics (UK)
McKee et al. (1998)
In 2006 werd de commercialisering van het eerste recombinanteiwit geproduceerd door transgene dieren goedgekeurd door het ‘European Medicines Agency’. Recombinant antithrombine III, geproduceerd in de melkklier van transgene geiten, werd gelanceerd als ATryn voor de profylactische behandeling van patiënten met congenitale antithrombine deficiëntie (Echelard et al., 2006). Volgens 11
Niemann et al. (2009) oversteeg de globale marktwaarde van recombinanteiwitten geproduceerd door transgene landbouwhuisdieren 1 miljard dollar in 2008 en zal ze 18,6 miljard dollar in 2013 bereiken. Er hangt echter wel een prijskaartje van 800 miljoen dollar aan vast om een nieuw medicijn op de markt te brengen (Melo et al., 2007). Volgens Rudolph (1999) kan een relatief kleine kudde transgene landbouwhuisdieren de wereld voorzien van de benodigde recombinanteiwitten (Tabel 3). Tabel 3. Schatting van de benodigde kudde grootte vereist voor de productie van enkele eiwitten (Rudolph, 1999)
Recombinanteiwit
Geschat vereist (kg/j)
Diersoort Kudde grootte
Humaan serum albumine
100 000
Rund
5400
α1-Antitrypsine
5000
Schaap
4300
Monoklonaal antilichaam
100
Geit
58
Anti-thrombine III
75
Geit
43
Factor IX
2
Varken
4
Protein C1 inhibitor
1
Konijn
50
Kuroiwa et al. (2002) maakten een artificieel humaan chromosoom (HAC) dat de gehele sequenties van de humane immunoglobuline lichte en zware keten loci bevatte. Vervolgens introduceerden ze dit in boviene fibroblasten. Na kerntransplantatie verkregen zij 4 levende transchromosomale kalveren die humaan immunoglobine tot expressie brachten in hun bloed. Kiemlijn transmissie en stabiel behoud over meerdere generaties van het HAC moet nog worden aangetoond, maar uit opvolgstudies bleek dat de eerste generatie kalveren het HAC behielden minstens gedurende 3 jaar (Robl et al., 2007). Kuroiwa et al. (2009) herhaalden hetzelfde experiment, maar inactiveerden tegelijkertijd 2 boviene immunoglobine zware keten loci in de fibroblasten. Vervolgens hyperimmuniseerden ze de runderen met een antrax protectief antigen om te komen tot de productie van een hoge proportie antigen specifiek hIgG. Dit hIgG bleek zeer effectief in een in vivo muis challenge assay. Landbouwhuisdieren zouden mits verdere ontwikkeling van deze techniek een bron kunnen zijn voor een hele nieuwe generatie farmaca met een zeer hoge marktwaarde. Binnen een aantal jaren moet blijken of dit gerealiseerd kan worden. 2.3.1.2. Landbouwhuisdieren als model voor humane pathologie Om ziektes en hun relatie met genen te bestuderen, kunnen onderzoekers een vreemd gen, waarvan ze vermoeden dat het aan de basis van een aandoening ligt, in proefdieren inbrengen. Daarnaast kunnen ze genen in het proefdier op non-actief zetten. Dat leidt dan tot knock-out dieren waarbij een specifiek gen is uitgeschakeld. Door de dieren vervolgens te bestuderen, komen de wetenschappers meer te weten over de functie van het bewuste gen. Ze kunnen op deze manier eveneens ingestelde behandelingen evalueren. Vele erfelijke ziekten worden veroorzaakt door genetische mutaties die al gekarakteriseerd werden in muismodellen. De fysiologie, anatomie en levensduur van muizen verschilt weliswaar significant van die van mensen. Hierdoor zijn de knaagdiermodellen ongeschikt voor de bestudering van vele humane ziekten. Een stijgend aantal kandidaat genen zijn beschikbaar voor het opzetten van mogelijke modellen voor humane ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen (Parkinson, Alzheimer), huidaandoeningen (psoriasis, epidermolysis bullosa) of andere ziekten met 12
een verdachte of gekende genetische achtergrond (bepaalde types van diabetes mellitus, arteriosclerose en borstkanker) (Vajita en Gjerris, 2006). Er werd reeds een belangrijk varken model ontwikkeld voor het bestuderen van retinitis pigmentosa (RP), een zeldzame oogaandoening bij mensen (Petters et al., 1997). Patiënten lijdend aan RP ontwikkelen vroeg in hun leven nachtblindheid ten gevolge van een verlies aan fotoreceptoren. Transgene varkens met een mutatie van het rhodopsine gen hebben een fenotype gelijkend op dat van de humane patiënten en effectieve behandelingen worden ontwikkeld. Na lensectomie en vitrectomie was er een verminderde degeneratie bij de transgene varkens (Mahmoud et al., 2003). Monogenetische aandoeningen zijn gemakkelijk te bestuderen, maar ze zijn ook relatief zeldzaam. Multigenetische ziekten daarentegen, worden veroorzaakt door afwijkingen in verschillende genen. De relatie tussen de genetische afwijkingen en het effectief krijgen van de ziekte, is minder eenduidig dan bij monogenetische aandoeningen. De diermodellen hiervoor zullen dan logischerwijze ook moeilijker op te stellen zijn. 2.3.1.3. Xenotransplantatie Xenotransplantatie is de overdracht van organen, weefsels of cellen over de soortgrenzen heen. De transplantatie van menselijke organen of weefsels is momenteel vaak de enige behandeling wanneer een orgaan slecht of niet meer functioneert. Het aanbod van donorweefsels en organen (hart, lever, nier, enz.) kan de vraag echter niet bijhouden. Dat komt omdat men door de vooruitgang van de medische kennis steeds meer mensen met transplantaties kan helpen, terwijl door de vergrijzing van de bevolking het aantal kandidaten voor een transplantatie stijgt. Volgens Niemann en Kues (2003) sterven er elk jaar duizenden patiënten wegens een tekort aan geschikte organen. Alternatieven voor het gebruik van menselijke organen moeten ontwikkeld worden en deze omvatten stamceltherapie, kunstorganen en organen van andere species (xenografts). Ondermeer omdat varkens veel nakomelingen krijgen en hun organen fysiologisch gezien veel overeenkomsten met die van de mens vertonen, zijn zij de meest voor de hand liggende toekomstige leveranciers van organen voor transplantatie. Mensapen lijken op het eerste zicht meer geschikt omdat zij nauwer verwant zijn, maar er zijn ethische bezwaren tegen het gebruik van primaten en het feit dat zij maar één jong tegelijk produceren, zou pogingen om ze te humaniseren erg moeilijk maken. Alvorens men gebruik kan maken van varkensorganen voor transplantatie moet men een reeks precieze genetische modificaties doorvoeren aan het genoom van het varken. Deze omvatten ondermeer de toevoeging van genen die coderen voor factoren verantwoordelijk voor de suppressie van de afstoting van getransplanteerde varkensorganen en de inactivatie of verwijdering van ongewenste genen. Deze modificaties kunnen hedendaags enkel verkregen worden met behulp van doelgerichte recombinatie en kerntransplantatie. Hoewel het formaat van een varkenshart geschikt is voor transplantatie, verandert het na een paar uur in een zwarte massa als er menselijk bloed doorheen gestuurd wordt. Deze ‘hyperacute afstoting’ (HAR) wordt aanvankelijk in gang gezet door antilichamen in menselijk bloed en wordt vervolgens uitgevoerd door een lawine van enzymen die de membranen van de lichaamsvreemde cellen aanvallen. Eén varkens gen in het bijzonder vormt de grootste belemmering voor transplantaties van varken naar mens omdat het bij de menselijke ontvangers de afstoting van de dierlijke organen op gang brengt. Dat gen is verantwoordelijk voor de synthese van alfa-1,3 galactosyltransferase (GalT),
13
een enzym dat een suiker (α-Gal) bevestigt aan het oppervlak van varkenscellen, die vervolgens door het menselijke immuunsysteem herkend wordt als lichaamsvreemd. Mensen hebben dit gen niet en ongeveer 1% van de circulerende antilichamen in ons bloed zijn gericht tegen deze Gal epitopen (Petersen et al., 2009). Het binden van deze antilichamen met de Gal epitopen leidt tot een onmiddellijke activatie van de complement cascade en een afstoting van de varkenscellen binnen enkele minuten. Om HAR te voorkomen werden er reeds met succes transgene varkens geproduceerd door een knock-out van de galactosyltransferase locus (Dai et al., 2002; Harrison et al., 2002; Lai et al., 2002) en door expressie van humane complement regulerende proteïnen (Byrne et al.,1997; Adams et al., 2001; Niemann et al., 2001). Kuwaki et al. (2005) transplanteerden harten van GalT knock-out varkens in bavianen waarin deze 2 tot 6 maanden volledig functioneel bleven. Naast HAR bestaat er ook nog een acute vasculaire afstoting (AVR), een cellulaire afstoting (CR) en een chronische afstoting. AVR treedt op binnen enkele dagen en leidt tot een microvasculaire trombose. Er zijn reeds hoopvolle experimenten gedaan bij de muis om AVR te voorkomen (Cooper et al., 1996; Bach et al., 1997; Dwyer et al., 2006), maar het valt nog af te wachten of dit ook bij het varken te realiseren is. CR is het grootste probleem waarmee men te maken heeft bij allotransplantaties. Thelpercellen, cytotoxische T-cellen en macrofagen zorgen voor een uiteindelijke afstoting van het getransplanteerde orgaan. Het frequent toedienen van immunosuppressiva onderdrukt de cellulaire afstoting (Cozzi et al., 2003). Een mogelijk risico van xenotransplantatie is de overdracht van porciene endogene retrovirussen (PERVs) naar de mens. Dieckhoff et al. (2007) toonden aan dat het mogelijk is om met behulp van RNAi de expressie van PERVs te onderdrukken in varkenscellen. Er is een algemene overtuiging dat er voldoende middelen beschikbaar zijn om de risico’s veroorzaakt door PERVs te controleren (Petersen et al., 2009). De eerste klinische toepassingen van xenotransplantatie in de mens (hart, lever en nier) worden verwacht binnen 5 à 10 jaar, maar transplantatie van pancreascellen (insulineproductie bij diabetespatiënten) zou eventueel al vroeger gerealiseerd kunnen worden. Naast de biologische problemen spelen echter ook ethische, juridische en psychologische overwegingen mee. 2.3.2. Transgene dieren in de landbouw 2.3.2.1. Karkas compositie Wetenschappers zijn erin geslaagd zalm 4 tot 6 keer zo snel te laten groeien door het inbrengen van groeihormoongenen. Dat maakt het kweekproces aanzienlijk efficiënter en de aquacultuur aantrekkelijker. Ook met runderen, varkens en schapen wordt geëxperimenteerd, maar voorlopig met minder succes. Transgene varkens waarin een hMT-pGH construct (porcien groei hormoon gen gedreven door een humaan metallothioneïne promotor) is aangebracht, vertoonden een significante verbetering van groeisnelheid, voederconversie en spier/vet ratio. Deze promotor is induceerbaar, wat betekent dat de expressie van het transgen bepaald wordt door de dietaire opname van zink. Hierdoor verkreeg men een betere controle over de expressie van het transgen, wat met zich meebracht dat er geen neveneffecten optraden (Nottle et al., 1999). Een dieet rijk aan verzadigde vetzuren kan leiden tot een verhoogde cholesterol en bijgevolg een verhoogd risico voor arteriosclerose en hartstilstand bij mensen (Kromhout et al., 2002). Het is mogelijk om gezonder varkensvlees te maken door een 14
desaturase gen afkomstig van spinazie (Saeki et al., 2004) of Caenorhabditis elegans (een nematode) te introduceren in het genoom van varkens. Dit leidde tot een verhoogde inhoud van onverzadigde vetzuren in de skeletspieren van deze dieren. Lai et al. (2006) slaagden erin varkens rijk aan omega-3 vetzuren te produceren. Ze deden dit door een gen coderend voor een omega-3 vetzuur desaturase, afkomstig van C. elegans, te introduceren in porciene fibroblasten en deze vervolgens te gebruiken in het kerntransplantatieproces. De vraag naar omega-3 vetzuren steeg de laatste jaren sterk naarmate het bewijs voor de positieve eigenschappen toenam. Vis en plantaardige oliën (bvb. lijnzaadolie) zijn één van de weinige goede bronnen van omega-3 vetzuren. Wegens de lage visbestanden, te wijten aan overbevissing, en de mogelijke aanwezigheid van zware metalen en vetoplosbare toxines als PCB’s en dioxines in vette vis, is er nood aan alternatieve bronnen voor omega-3 vetzuren. Spijtig genoeg is de commercialisatie van transgene varkens uitgesteld wegens groot argwaan en scepticisme voor de consumptie van genetisch gemodificeerd voedsel. Iedereen kent wel de enorm gespierde runderen met een natuurlijke mutatie in het myostatine gen. De problemen bij het kalveren die hiermee gepaard gaan zouden wel eens vermeden kunnen worden met behulp van transgenese. Grobet et al. (2003) toonden aan dat men door middel van conditionele transgenese bij muizen het myostatine gen na de geboorte kon uitschakelen. De groei van de spiermassa was vergelijkbaar met deze van muizen met een constitutieve knock-out. 2.3.2.2. Lactatie Ongeveer 80% van de melkeiwitten zijn caseïnes, wat ze de meest waardevolle componenten van melk maken. Koeienmelk bestaat uit αS1-, αS2-, β- en κ-caseïne. Casseïnes zijn hydrofoob en aggregeren zich tot micellen in de melk. De structuur en stabiliteit van de micellen worden beïnvloed door kleine wijzigingen in de caseïne samenstelling, dat heeft een gewijzigde fysicochemische samenstelling van de melk tot gevolg. Brophy et al. (2003) demonstreerden met succes dat men met behulp van transgenese de economische waarde van melk kan verhogen. Ze introduceerden enkele kopieën van de genen coderend voor de β- en κ-caseïne in boviene fibroblasten. Na kerntransplantatie verkregen zij transgene koeien die 20% meer β- en tot 2x meer κ-caseïne in hun melk produceerden. Ongeveer 70% van de wereldbevolking is lactose intolerant omdat ze zelf te weinig lactase kunnen aanmaken. Productie van melk met een laag lactose gehalte zou de afzetmarkt aanzienlijk kunnen vergroten. De osmotische gradiënt van melk wordt voornamelijk bepaald door lactose waardoor een knock-down van de α-lactalbumine locus (verantwoordelijk voor de synthese van lactose) resulteert in een te hoge viscositeit van de melk. Jost et al. (1999) slaagden erin om muizen te maken die lactase in hun melkklier tot expressie brachten. De muizen produceerden 50 tot 85% minder lactose in hun melk. Naast de grootte van de worp zijn de overleving en groei van biggen tijdens hun eerste levensweken cruciaal voor de rendabiliteit van een varkensbedrijf. Bij zeugen geldt algemeen: hoe groter de worp, hoe hoger de totale melkproductie, doch hoe lager de productie per big. Wheeler et al. (2001) maakten boviene α-lactalbumine transgene varkens in een poging om de lactatie van zeugen en bijgevolg de groei van hun biggen te bevorderen. Transgene zeugen gaven van dag 3 tot dag 9 van de lactatie 20 tot 50% meer melk (Noble et al., 2002). Dit resulteerde in een snellere gewichtstoename van hun biggen in vergelijking met de controle groep.
15
2.3.2.3. Milieuvriendelijke landbouwhuisdieren Bijna tweederde van het fosfaat in planten bestaat uit fytinezuur. Dit organische fosfaat is praktisch onverteerbaar voor het varken, tenzij fytase als enzym aanwezig is. De nefaste invloed op het milieu van overtollig fosfaat dat via feces en urine in de mest terecht komt en aldus op het land, heeft ervoor gezorgd dat men op zoek ging naar manieren om de fosfaat uitscheiding te beperken. Golovan et al. (2001) slaagden hierin door gebruik te maken van het appA fytase gen van E. coli, onder transcriptionele controle van een speekselklier specifieke promotor. De aanwezigheid van fytase in het speeksel verminderde de fecale fosfaatuitscheiding tot 75%. De transgene varkens vertoonden bovendien een betere voederconversie doordat ze in staat waren om het fytinezuur te verteren. 2.3.2.4. Ziekte resistentie Mastitis (uierontsteking) is jaarlijks verantwoordelijk voor enorme verliezen in de veeteelt sector. Ongeveer 30% van alle klinische mastitis gevallen wordt toegeschreven aan een infectie met Staphylococcus aureus. Antibiotica therapie leidt slechts in minder dan 15% tot volledige genezing. Lysostaphine, een peptidoglycaan hydrolase geproduceerd door Staphylococcus simulans, is zeer efficiënt in het vernietigen van glycil-glycine verbindingen die zich bevinden in het peptidoglycaan van de celwand van S. aureus. Wall et al. (2005) gebruikten het gen coderend voor lysostaphine om boviene fibroblasten te transfecteren. Na kerntransplantatie werden de transgene koeien onderworpen aan een challenge met S. aureus. De meeste dieren bleken immuun te zijn. Richt et al. (2007) slaagden er onlangs in om runderen zonder het prion eiwit te produceren. Deze ontwikkelden zich c
verder normaal en schenen inderdaad niet vatbaar te zijn voor BSE. Het normale eiwit PrP wordt gecodeerd door PRNP, het prion protein gen. Knock-out van PRNP is de enige veilige manier om infectie en verspreiding van spongiforme encephalopathieën te voorkomen.
Influenza is een acute virale aandoening van de ademhalingswegen die een erg besmettelijk karakter heeft. De influenzavirussen hebben een ‘gesegmenteerd’ genoom, d.w.z. een nucleïnezuur dat uit 8 lineaire enkelstrengige stukken RNA bestaat. Wanneer 2 influenzavirussen gelijktijdig dezelfde cel infecteren kan er een uitwisseling van gensegmenten plaatsvinden tussen 2 totaal verschillende influenzavirussen. In bepaalde gevallen ontstaat hierdoor een virus met een nieuw subtype waarvoor de populatie-immuniteit nihil is. Eenden en wilde watervogels zijn de belangrijkste natuurlijke influenza A virusgastheren. Sporadisch treedt er virustransmissie op tussen wilde watervogels en andere gastheren, tussen de mens en het varken of omgekeerd, en tussen vogels en de mens. Het varken is, in tegenstelling tot andere dieren, gevoelig aan zowel vogelvirussen als humane virussen. Daarom kan het varken fungeren als een soort ‘mengvat’ waarin reassortanten worden gevormd van uit een vogelvirus met een humaan virus. De sterke intensivering van de industriële landbouw creëert een ideale omgeving voor het ontstaan van supervirussen. De drang naar steeds goedkoper vlees brengt dus een enorm risico met zich mee. Als we op deze manier verder gaan, zullen de varkensgriep en de vogelgriep slechts het begin zijn van een eeuw van virusuitbarstingen. We moeten er dus dringend iets aan doen. Met RNA interferentie beschikken we over een krachtige techniek om genexpressie te voorkomen. RNAi is een geconserveerd post translationeel genregulatie proces dat gebruikt kan 16
worden om de activiteit van genen stil te leggen op RNA niveau. Ondermeer in fungi, planten en dieren werd een klasse van kleine RNAs (miRNA) ontdekt die een rol hebben in het blokkeren van transcriptie van genen. Ze doen dit door te binden met messenger RNA met als uitkomst een degradatie van het mRNA of een inhibitie van translatie (Zhao en Srivastava, 2007). Men spreekt over short interfering RNAs (siRNAs) wanneer deze exogeen worden toegediend. De combinatie van siRNA en de lentivirus vector technologie geeft ons de kans om op een uiterst efficiënte manier specifieke genen uit te schakelen. Recente ontwikkelingen in RNAi en transgenese in vogels zou de ontwikkeling van pluimvee resistent aan influenza moeten vergemakkelijken. Een siRNA gericht tegen sterk geconserveerde regio’s van influenza genen zou een oplossing bieden. Het bleek krachtig de replicatie van verschillende subtypes influenzavirussen in cellijnen, kippenembryo’s en muizen te remmen (Ge et al., 2003, 2004). De ontwikkeling en distributie van pluimvee resistent aan influenza zal echter nog jaren vergen (Chen et al., 2008). Verder onderzoek en ontwikkeling van deze techniek mogen echter niet in het gedrang komen van de hoge initiële investeringen. De voordelen op lange termijn zijn immers enorm.
2.4. DE ETHISCHE DIALOOG
De moderne biotechnologie kan een sterke invloed hebben op ontwikkelingen in de samenleving en is daardoor een bron van voortdurende maatschappelijke discussie. Enerzijds biedt dit perspectief voor innovatie van de gezondheidszorg, de landbouw, de voeding en het milieu. Anderzijds roepen deze mogelijkheden vragen op. Mogen we het recht in eigen handen nemen om de genetische capaciteit van onze landbouwhuisdieren te verbeteren, aan te passen aan de veranderende wereld? Is alles wat technisch kan, ook gewenst, veilig en maatschappelijk ethisch aanvaardbaar? Kan men de consequenties van de ingrepen overzien? Mensen zijn bezorgd over de mogelijke risico’s voor hun gezondheid, het welzijn van de dieren en het milieu. Een volledige uitsluiting van risico's is onmogelijk. Door gebruik te maken van betrouwbare en gevoelige methodes om de producten van transgene dieren te karakteriseren, hoopt men de risico's echter wel zo klein mogelijk te houden. Het gaat om een afweging tussen mogelijke risico's en het beoogde maatschappelijk nut van nieuwe biotechnologische ontwikkelingen. Tegenstanders van ggo’s menen dat er te veel onzekerheid is over de gevolgen voor milieu en gezondheid. We moeten volgens hen wachten tot we alle korte- en langetermijn effecten kennen. Het recent gepubliceerde risk assessment rapport van de FDA verklaard dat de producten van gekloonde dieren geen gevaren voor de voedselveiligheid vormen (Rudenko et al., 2007). Dit is al een serieuze stap in de goede richting om in Europa te komen tot een duidelijke afbakening van een wettelijk kader en tot gefundeerde richtlijnen in verband met dierenwelzijn, wetende dat er zoveel embryo’s tijdens het kloonproces verloren gaan. De mogelijke toepassingen van transgene landbouwhuisdieren mogen niet in de kou komen te staan door de negatieve publieke perceptie. Het zou betreurenswaardig zijn mocht men deze techniek niet verder kunnen ontwikkelen wegens de enorme kosten en de lage efficiëntie die ermee gepaard gaan. Maar men mag bij het verder ontwikkelen van deze technieken zeker niet vergeten rekening te houden met welzijn van de dieren.
17
2.5. DISCUSSIE We proberen nu al tientallen jaren een oplossing te vinden voor de schijnbare tegenspraak dat we groei en ontwikkeling willen realiseren in industrie en landbouw, zonder daarbij het milieu te belasten en de schaarse natuurlijke hulpbronnen uit te putten. De wereldbevolking is tussen 1950 en 2000 met iets meer dan 143% toegenomen (van 2,515 naar ca. 6,121 miljard mensen in totaal). Indien deze groei niet stopt, zullen er steeds meer monden te voeden bijkomen. We hebben ons nog niet ten volle gerealiseerd dat dit voor een groot deel ten koste gaat van het milieu. Het verbranden van fossiele brandstoffen, ontbossing en bepaalde industriële en agrarische activiteiten doen de concentratie aan broeikasgassen in de aardatmosfeer stijgen met de opwarming van de aarde tot gevolg. Als de huidige kapsnelheid aangehouden wordt, zullen de overblijvende regenwouden mogelijk halverwege de 21e eeuw verdwenen. Brazilië is de grootste exporteur van rundvlees in de wereld. Veel van deze runderen staan nu te grazen op afgekapte bossen en worden bijgevoederd met genetisch gemodificeerde soja. Het fokken van dieren en het veredelen van planten, de klassieke biotechnologie, heeft in het verleden de mens meermaals geholpen zich aan te passen aan veranderende omgevingen. De moderne biotechnologie heeft geen pasklare oplossingen voor al deze uitdagingen, maar zij draagt in ieder geval de mogelijkheid in zich tot de vorming en uitwerking van een technologisch platform dat oplossingen voor die problemen kan bedenken. Er is wel degelijk een legitieme rol voor transgenese in al zijn aspecten en toepassingen. Transgenese kan bijdragen aan de gezondheid van de mens, niet alleen door ons van onze voedselvoorziening te verzekeren. En belangrijker, transgenese kan een rol spelen in het minimaliseren van de schade aan het milieu, berokkend door de veeteelt. De wetenschap staat niet stil. We zijn verplicht om mee te gaan met onze tijd. De ethische problematiek rond transgenese mag niet leiden tot een ban van genetisch gemodificeerde organismen. Het continue verbeteren van de technieken laat toe om steeds goedkoper transgene dieren te produceren. Zolang er echter onzekerheid heerst over de commercialisatie van transgene dieren, zal het voor wetenschappers moeilijk blijven fondsen te vinden om hun experimenten op te zetten. De mogelijke toepassingen van het toveren met genen zal in de toekomst, mits de wetgevingen het toelaten, de landbouwsector revolutioneren. Tegenwoordig kunnen patenten aangevraagd worden op planten, dieren en zelfs op afzonderlijke genen, zoals ziekteresistentiegenen. Biotechnologisch onderzoek is duur en de biotechbedrijven maken dan ook graag van die mogelijkheid gebruik. De patenten op zaai- en plantgoed maken boeren hier en in het Zuiden afhankelijk van de grote multinationals. Die verbieden immers na de oogst zaden over te houden om die opnieuw te zaaien. Daardoor zijn de boeren verplicht elk jaar nieuwe zaden te kopen. Omwille van deze ‘biopiraterij’ ziet de lokale bevolking meestal niets van de winst die de bedrijven aan het patent overhouden. Als transgene dieren in de toekomst op grote schaal geproduceerd worden, zal er om het monopolie van de biotechbedrijven te doorbreken, eerst een goed wettelijk kader opgesteld moeten worden.
18
3. LITERATUURLIJST 1. 2. 3. 4. 5.
6. 7. 8. 9. 10. 11.
12. 13. 14. 15. 16. 17.
18. 19. 20. 21. 22.
23.
24. 25.
Adams D.H., Kadner A., et al. (2001). Human membrane cofactor protein (MCP, CD46) protects transgenic pig hearts from hyperacute rejection in primates. Xenotransplantation 8, 36-40. Bach F.H., Hancock W.W., et al. (1997). Protective genes expressed in endothelial cells: a regulatory response to injury. Immunology Today 18, 483-486. Behboodi E., Ayres S.L., et al. (2005). Health and reproductive profiles of malaria antigen-producing transgenic goats derived by somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells 7, 107-118. Brophy B., Smolenski G., et al. (2003). Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of betacasein and kappa-casein. Nature Biotechnology 21, 157-162. Byrne G.W., McCurry K.R., et al. (1997). Transgenic pigs expressing human CD59 and decayaccelerating factor produce an intrinsic barrier to complement-mediated damage. Transplantation 63, 149-155. Carter D.B., Lai L., et al. (2002). Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning Stem Cells 4, 131145. Chang K., Qian J., et al. (2002). Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based spermmediated gene transfer. BMC Biotechnology 2, 5. Chen C.A. and Okayama H. (1988). Calcium Phosphate-Mediated Gene-Transfer - a Highly Efficient Transfection System for Stably Transforming Cells with Plasmid DNA. Biotechniques 6, 632-634. Chen J.Z., Chen S.C.Y., et al. (2008). Genetic strategy to prevent influenza virus infections in animals. Journal of Infectious Diseases 197, 25-28. Cooper J.T., Stroka D.M., et al. (1996). A20 blocks endothelial cell activation through a NF-kappaBdependent mechanism. Journal of Biologic Chemistry 271, 18068-18073. Cozzi E., Vial C., et al. (2003). Maintenance triple immunosuppression with cyclosporin A, mycophenolate sodium and steroids allows prolonged survival of primate recipients of hDAF porcine renal xenografts. Xenotransplantation 10, 300-310. Dai Y., Vaught T.D., et al. (2002). Targeted disruption of the alpha1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs. Nature Biotechnology 20, 251-255. Dieckhoff B., Karlas A., et al. (2007). Inhibition of porcine endogenous retroviruses (PERVs) in primary porcine cells by RNA interference using lentiviral vectors. Archives of Virology 152, 629-634. Ding X., Wang Y., et al. (2008). Increased pre-implantation development of cloned bovine embryos treated with 5-aza-2'-deoxycytidine and trichostatin A. Theriogenology 70, 622-630. Dinnyes A., Tian X.C., et al. (2008). Epigenetic regulation of foetal development in nuclear transfer animal models. Reproduction in Domestic Animals 43 Suppl 2, 302-309. Dwyer K.M., Mysore T.B., et al. (2006). The transgenic expression of human CD39 on murine islets inhibits clotting of human blood. Transplantation 82, 428-432. Ebert K.M., Selgrath J.P., et al. (1991). Transgenic Production of a Variant of Human Tissue-Type Plasminogen-Activator in Goat Milk - Generation of Transgenic Goats and Analysis of Expression. BioTechnology 9, 835-838. Ebert K.M., Ditullio P., et al. (1994). Induction of Human Tissue-Plasminogen Activator in the MammaryGland of Transgenic Goats. Bio-Technology 12, 699-702. Echelard Y., Ziomek C.A., et al. (2006). Procduction of recombinant therapeutic proteins in the milk of transgenic animals. Biopharm International 19, 36-38. Farin P.W., Piedrahita J.A., et al. (2006). Errors in development of fetuses and placentas from in vitroproduced bovine embryos. Theriogenology 65, 178-191. Fussenegger M., Bailey J.E., et al. (1999). Genetic optimization of recombinant glycoprotein production by mammalian cells. Trends in Biotechnology 17, 35-42. Ge Q., McManus M. T., et al. (2003). RNA interference of influenza virus production by directly targeting rnRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 2718-2723. Ge Q., Filip L., et al. (2004). Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 8676-8681. Golovan S.P., Meidinger R.G., et al. (2001). Pigs expressing salivary phytase produce low-phosphorus manure. Nature Biotechnology 19, 979-979. Gordon J.W., Scangos G.A., et al. (1980). Genetic-Transformation of Mouse Embryos by Micro-Injection of Purified DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of AmericaBiological Sciences 77, 7380-7384.
19
26. Grobet L., Pirottin D., et al. (2003). Modulating skeletal muscle mass by postnatal, muscle-specific inactivation of the myostatin gene. Genesis 35, 227-238. 27. Harrison S.J., Guidolin A., et al. (2002). Efficient generation of alpha(1,3) galactosyltransferase knockout porcine fetal fibroblasts for nuclear transfer. Transgenic Research 11, 143-150. 28. Hofmann A., Kessler B., et al. (2003). Efficient transgenesis in farm animals by lentiviral vectors. EMBO Reports 4, 1054-1060. 29. Hofmann A., Zakhartchenko V., et al. (2004). Generation of transgenic cattle by lentiviral gene transfer into oocytes. Biol Reprod 71, 405-409. 30. Honaramooz A., Megee S., et al. (2008). Adeno-associated virus (AAV)-mediated transduction of male germ line stem cells results in transgene transmission after germ cell transplantation. FASEB Journal 22, 374-82. 31. Houdebine L.M. (2002). The methods to generate transgenic animals and to control transgene expression. Journal of Biotechnology 98, 145-160. 32. Houdebine L.M. (2009). Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comparative Immunology Microbiology & Infectious Diseases 32, 107-121. 33. Jost B., Vilotte J.L., et al. (1999). Production of low-lactose milk by ectopic expression of intestinal lactase in the mouse mammary gland. Nature Biotechnology 17, 160-164. 34. Kovesdi I., Brough D.E., et al. (1997). Adenoviral vectors for gene transfer. Current Opinion in Biotechnology 8, 583-589. 35. Kromhout D., Menotti A., et al. (2002). Prevention of coronary heart disease by diet and lifestyle Evidence from prospective cross-cultural, cohort, and intervention studies. Circulation 105, 893-898. 36. Kues W.A. and Niemann H. (2004). The contribution of farm animals to human health. Trends Biotechnology 22, 286-294. 37. Kuroiwa Y., Kasinathan P., et al. (2002). Cloned transchromosomic calves producing human immunoglobulin. Nature Biotechnology 20, 889-894. 38. Kuroiwa Y., Kasinathan P., et al. (2009). Antigen-specific human polyclonal antibodies from hyperimmunized cattle. Nature Biotechnology 27, 173-181. 39. Kuwaki K., Tseng Y.L., et al. (2005). Heart transplantation in baboons using alpha1,3galactosyltransferase gene-knockout pigs as donors: initial experience. Nature Medicine 11, 29-31. 40. Lai L., Kolber-Simonds D., et al. (2002). Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science 295, 1089-1092. 41. Lai L.X., Kang J.X., et al. (2006). Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids. Nature Biotechnology 24, 435-436. 42. Mahmoud T.H., McCuen B.W., et al. (2003). Lensectomy and vitrectomy decrease the rate of photoreceptor loss in rhodopsin P347L transgenic pigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 241, 298-308. 43. Maragathavally K.J., Kaminski J.M., et al. (2006). Chimeric Mos1 and piggyBac transposases result in site-directed integration. Faseb Journal 20, 1880-1882. 44. McKee C., Gibson A., et al. (1998). Production of biologically active salmon calcitonin in the milk of transgenic rabbits. Nature Biotechnology 16, 647-651. 45. McGrew M. J., Sherman A., et al. (2004). Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO Reports 5, 728-733. 46. Melo E.O., Canavessi A. M.O., et al. (2007). Animal transgenesis: state of the art and applications. Journal of Applied Genetics 48, 47-61. 47. Miller H.I. (2002). As biotech turns 20... Nature Reviews Drug Discovery 1, 1007-1008. 48. Moisyadi S., Kaminski J.M., et al. (2009). Use of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) to generate transgenic animals. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases 32, 47-60. 49. Moreira P.N., Giraldo P., et al. (2004). Efficient generation of transgenic mice with intact yeast artificial chromosomes by intracytoplasmic sperm injection. Biology of Reproduction 71, 1943-1947. 50. Morozumi K., Shikano T., et al. (2006). Simultaneous removal of sperm plasma membrane and acrosome before intracytoplasmic sperm injection improves oocyte activation/embryonic development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 17661-17666. 51. Muñoz M., Diez C., et al. (2008). Embryonic stem cells in cattle. Reproduction in Domestic Animals 43, 32-37. 52. Niemann H., Halter R., et al. (1999). Expression of human blood clotting factor VIII in the mammary gland of transgenic sheep. Transgenic Research 8, 237-247. 53. Niemann H., Verhoeyen E., et al. (2001). Cytomegalovirus early promoter induced expression of hCD59 in porcine organs provides protection against hyperacute rejection. Transplantation 72, 1898-906.
20
54. Niemann H. and Kues W.A. (2003). Application of transgenesis in livestock for agriculture and biomedicine. Animal Reproduction Science 79, 291-317. 55. Niemann H., Tian X.C., et al. (2008). Epigenetic reprogramming in embryonic and foetal development upon somatic cell nuclear transfer cloning. Reproduction 135, 151-163. 56. Niemann H., Kues W., et al. (2009). Transgenic Farm Animals: Current Status and Perspectives for Agriculture and Biomedicine. Genetic Engineering in Livestock: New Applications and Interdisciplinary Perspectives 34, 1-30 57. Noble M. S., Rodriguez-Zas S., et al. (2002). Lactational performance of first-parity transgenic gilts expressing bovine alpha-lactalbumin in their milk. Journal of Animal Science 80, 1090-1096. 58. Nottle M.B., Nagashima H., et al. (1999). Production and analysis of transgenic pigs containing a metallothionein porcine growth hormone gene construct. Transgenic Animals in Agriculture, 145-156 59. Okita K., Ichisaka T., et al. (2007). Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448, 313-7. 60. Perry A.C.F., Wakayama T., et al. (1999). Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science 284, 1180-1183. 61. Perry A.C.F. (2000). Hijacking oocyte DNA repair machinery in transgenesis? Molecular Reproduction and Development 56, 319-324. 62. Petersen B., Carnwath J.W., et al. (2009). The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comparative Immunology Microbiology Infectious Diseases 32, 91-105. 63. Petters R.M., Alexander C.A., et al. (1997). Genetically engineered large animal model for studying cone photoreceptor survival and degeneration in retinitis pigmentosa. Nature Biotechnology 15, 965-970. 64. Richt J.A., Kasinathan P., et al. (2007). Production of cattle lacking prion protein. Nature Biotechnology 25, 132-138. 65. Robl J.M., Wang Z., et al. (2007). Transgenic animal production and animal biotechnology. Theriogenology 67, 127-33. 66. Rudenko L., Matheson J.C., et al. (2007). Animal cloning and the FDA - the risk assessment paradigm under public scrutiny. Nature Biotechnology 25, 39-43. 67. Rudolph N.S. (1999). Biopharmaceutical production in transgenic livestock. Trends in Biotechnology 17, 367-74. 68. Saeki K., Matsumoto K., et al. (2004). Functional expression of a Delta 12 fatty acid desaturase gene from spinach in transgenic pigs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 6361-6366. 69. Schnieke A.E., Kind A.J., et al. (1997). Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 278, 2130-2133. 70. Seidel G.E. (1993). Resource Requirements for Transgenic Livestock Research. Journal of Animal Science 71, 26-33. 71. Shinohara E.T., Kaminski J.M., et al. (2007). Active integration: new strategies for transgenesis. Transgenic Resource 16, 333-339. 72. Sikes M.L., Omalley B.W., et al. (1994). In-Vivo Gene-Transfer into Rabbit Thyroid Follicular Cells by Direct DNA Injection. Human Gene Therapy 5, 837-844. 73. Smith K. and Spadafora C. (2005). Sperm-mediated gene transfer: applications and implications. Bioessays 27, 551-62. 74. Suganuma R., Pelczar P., et al. (2005). Tn5 transposase-mediated mouse transgenesis. Biology of Reproduction 73, 1157-1163. 75. Takahashi K., Tanabe K., et al. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-72. 76. Vajta G. and Gjerris M. (2006). Science and technology of farm animal cloning: state of the art. Animal Reproduction Science 92, 211-230. 77. van Berkel P.H., Welling M.M., et al. (2002). Large scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows. Nature Biotechnology 20, 484-487. 78. van de Lavoir M.C., Diamond J.H., et al. (2006). Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature 441, 766-769. 79. van Doorn M.B.A., Burggraaf J., et al. (2005). A phase I study of recombinant human C1 inhibitor in asymptomatic patients with hereditary angioedema. Journal of Allergy and Clinical Immunology 116, 876-883. 80. Wall R.J., Kerr D.E., et al. (1997). Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. Journal of Dairy Science 80, 2213-24.
21
81. Wall R.J., Powell A.M., et al. (2005). Genetically enhanced cows resist intramammary Staphylococcus aureus infection. Nature Biotechnology 23, 897-897. 82. Wheeler M.B., Bleck G.T., et al. (2001). Transgenic alteration of sow milk to improve piglet growth and health. Control of Pig Reproduction Vi, 313-324 83. Whitelaw C.B., Lillico S.G., et al. (2008). Production of transgenic farm animals by viral vector-mediated gene transfer. Reproduction Domestic Animals 43 Suppl 2, 355-358. 84. Williams R.S., Johnston S A., et al. (1991). Introduction of Foreign Genes into Tissues of Living Mice by DNA-Coated Microprojectiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88, 2726-2730. 85. Wilmut I., Schnieke A.E., et al. (1997). Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810-813. 86. Woltjen K., Michael I.P., et al. (2009). piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 458, 766-770. 87. Wu S.C.Y., Meir Y.J.J., et al. (2006). piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to Sleeping Beauty, Tol2 and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 15008-15013. 88. Wright G., Carver A., et al. (1991). High-Level Expression of Active Human Alpha-1-Antitrypsin in the Milk of Transgenic Sheep. Bio-Technology 9, 830-834. 89. Yang B.C., Im G.S., et al. (2008). Development of vitrified-thawed bovine oocytes after in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer. Animal Reproduction Science 103, 25-37. 90. Yong H.Y., Hao Y.H., et al. (2006). Production of a transgenic piglet by a sperm injection technique in which no chemical or physical treatments were used for oocytes or sperm. Molecular Reproduction and Development 73, 595-599. 91. Zhao Y. and Srivastava D. (2007). A developmental view of microRNA function. Trends in Biochemical Sciences 32, 189-197.
22
