UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2011-2012
MYCOPLASMA INFECTIES BIJ REPTIELEN door Evelien Bullaert
Promotor: Prof. Dr. F. Pasmans
Literatuurstudie in het kader
Medepromotor: Prof. Dr. A. Martel
van de masterproef
Auteursrecht De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
Voorwoord Als eerste zou ik mijn dank willen betuigen aan mijn promotor, Prof. Dr. F. Pasmans. Zonder zijn begeleiding zou deze literatuurstudie nooit geworden zijn zoals het moet. Hij leerde me zelfstandig werken en stuurde op tijd bij. Ik wil hem ook bedanken voor de boeiende wijze waarop hij les en uitleg geeft over reptielen en hun ziektes. Op de tweede plaats wil ik mijn ouders, Carine Beeckman en Tony Bullaert, bedanken voor hun steun en het nalezen en verbeteren van mijn literatuurstudie. Zonder hun hulp was ik nooit zover geraakt. Als derde gaat mijn dank uit naar mijn vrienden: Ellen Luyten, Nermin Caliskan, Annelies De Meulenmeester, Karlijn Debusschere, Anneleen Houtmeyers en Jan-Willem Dockx, voor hun steun en hun commentaar op mijn literatuurstudie. Tenslotte bedank ik mijn medepromotor Prof. Dr. A. Martel. Het is mede dankzij haar dat ik de kans kreeg deze literatuurstudie te mogen maken.
Inhoudsopgave Voorwoord Inhoudsopgave Samenvatting
p. 1
Inleiding
p. 2
Literatuurstudie
p. 3
A) Mycoplasma infecties: algemene informatie
p. 3
a. Taxonomie
p. 3
b. Morfologie
p. 5
c. Voorkomen
p. 6
B) Mycoplasma infecties: bij reptielen
p. 6
a. Epidemiologie
p. 6
b. Mycoplasma species bij reptielen
p. 7
b.1. Schildpadden
p. 7
b.2. Alligators, krokodillen en kaaimannen
p. 8
b.3. Hagedissen
p. 8
c. Pathogenese
p. 9
c.1. Adhesie
p. 10
c.2. Antigenische variatie
p. 10
c.3. Immuunrespons van de gastheer
p. 11
c.4. Virulentiefactoren
p. 11
d. Symptomen
p. 12
e. Letsels
p. 12
f.
Diagnose
p. 15
f.1. Symptomen
p. 15
f.2. Cultuur
p. 15
f.3. ELISA
p. 16
f.4. PCR
p. 17
g. Bestrijding
p. 17
g.1. Behandeling
p. 18
g.2. Preventie
p. 19
C) Discussie Referentielijst
p. 20 p. 21
Samenvatting en trefwoorden Mycoplasma infecties komen overal voor en vele diersoorten zijn gevoelig. Deze kiemen kunnen verschillende stelsels aantasten en een uitgebreid gamma aan klinische symptomen geven. Soms verlopen ze echter subklinisch. Bij reptielen zijn deze infecties voornamelijk onderzocht in verband met upper respiratory tract disease bij de landschildpadden. Mycoplasma agassizii leidt bij Gopherus agassizii en Gopherus polyphemus voornamelijk tot ademhalingsproblemen. Verder is er Mycoplasma alligatoris. Een infectie met deze kiem verloopt vaak lethaal bij alligators en wordt gekenmerkt door een multisystemische inflammatoire ziekte. De minder pathogene verwante van deze laatste, Mycoplasma crocodyli, geeft alleen milde ademhalingsproblemen bij krokodillen. De symptomen variëren naargelang de immuniteit van de gastheer en de pathogeniciteit van de kiem. Upper respiratory tract disease wordt gekenmerkt door neus- en ooguitvloei, oedeem van de oogleden en verminderde eetlust en gewichtsverlies. URTD is een multifactoriële ziekte en het is van belang de oorzaak te achterhalen om een geschikte therapie te kunnen vinden. De diagnostische technieken zijn derhalve van het grootste belang. Bij vermoeden van infecties met Mycoplasma spp. worden vooral ELISA en PCR als diagnostische technieken gebruikt. Deze twee testen worden ook gebruikt om de reptielen te screenen. Screening helpt ook bij preventie van de transmissie van Mycoplasma spp. Antibiotica zijn noodzakelijk bij de behandeling van besmette dieren. Er moet echter rekening worden gehouden met de natuurlijke resistentie die de Mycoplasma kiemen bezitten tegenover bepaalde antibiotica. Er wordt vooral gebruik gemaakt van fluoroquinolones. De behandeling duurt lang en elimineert de kiem meestal niet. Bij stopzetting komen de klinische symptomen vaak terug. Preventie van besmetting is dus essentieel. Dit gebeurt voornamelijk door strenge aankoopcontroles, quarantaines, eventuele vaccins en regelmatige screening.
Trefwoorden: Ademhalingsstelsel, Mycoplasma spp., Reptiel, URTD.
1
Inleiding Mycoplasma infecties komen bij zeer veel dieren voor en de symptomen kunnen sterk variëren, wat de diagnose bemoeilijkt. Het belang van deze bacteriën wordt vaak niet erkend. Bij diersoorten zoals hond, kat, paard, rund en varken is er reeds vrij veel informatie over te vinden. Over Mycoplasma bacteriën en hun effecten bij exotischere dieren, zoals reptielen, is bitter weinig bekend. Nochtans komen ook deze diersoorten frequent in aanraking met Mycoplasma. Er is slechts weinig onderzoek verricht naar infecties met Mycoplasma bij reptielen. Enkel inzake het voorkomen van de bacterie bij de landschilpadden is uitvoerig onderzoek verricht. Over het voorkomen van de kiem bij krokodillen en alligators is de informatie schaars. Aangezien er steeds meer reptielen worden gehouden als huisdier, stijgt ook het belang van informatie over deze veel voorkomende ziekten. Mycoplasma infecties moeten dan ook verder worden onderzocht, voornamelijk bij andere reptielen dan de landschildpad. Er is onder andere nog weinig bekend over de pathogenese van Mycoplasma infecties bij reptielen. Het is belangrijk te weten welke schade deze bacteriën aanrichten in het lichaam van hun gastheer, o.a. om bestrijdingsmaatregelen te kunnen ontwikkelen. Doordat deze bacteriën tot een gevarieerd ziektebeeld kunnen leiden, gaande van asymptomatische tot ernstige symptomen (neusvloei, ademhalingsproblemen en zelfs uitvallen van voortplanting), is het essentieel om alle gevallen correct te diagnosticeren. Dit heeft belang opdat eventuele asymptomatische dragers gevonden worden en die de ziekte dan niet kunnen verspreiden. Deze literatuurstudie zal dus vooral handelen over Mycoplasma agassizii bij de landschildpadden, omdat de beschikbare informatie voornamelijk over deze kiem handelt. Eerst wordt een beknopte uitleg gegeven over Mycoplasma spp. in het algemeen. Deze uitleg heeft vooral betrekking op de morfologie omdat deze zo afwijkend is van die van alle andere gekende bacteriën en van belang is bij een eventuele behandeling. Dan wordt er dieper ingegaan op Mycoplasma infecties bij reptielen. Mycoplasma agassizii, M. alligatoris en M. crocodyli worden als basis besproken aangezien hierover het meest bekend is.
Er wordt ingegaan op de prevalentie van deze kiemen, de gastheren, de
symptomen en de letsels die ze veroorzaken, met de nadruk op Upper Respiratory Tract Disease bij schildpadden. Er volgt een beknopte pathogenese. Deze is echter nog te weinig onderzocht waardoor veel van de aangehaalde zaken hypothetisch zijn en nog verder dienen onderzocht te worden. Tevens wordt een eventuele behandeling besproken. Tenslotte komt de preventie aan bod.
2
Literatuurstudie A) MYCOPLASMA INFECTIES: ALGEMENE INFORMATIE Dit hoofdstuk handelt over de algemene kenmerken van Mycoplasma infecties. a. Taxonomie Algemene stamboom (Tully, 1995) Klasse: Mollicutes Orde: Mycoplasmatales Familie: Mycoplasmataceae Genus: Mycoplasma Species: Mycoplasma species. De stamboom is gebaseerd op de kenmerken van deze kiemen. Een kiem behoort tot de klasse Mollicutes (Gram positief spectrum) als de celwand ontbreekt, ze klein genoeg zijn om door poriën met een doorsnede van 450- en 220-nm te passeren en in het bezit zijn van genomen die rijk zijn aan adenine en thymine. De verdere onderverdeling in ordes, families, genera, en species gebeurt op basis van de morfologie, gastheer origine, optimale groeitemperatuur, cultuur en biochemische eigenschappen. Het genus Mycoplasma is gebaseerd op het niet-obligaat anaeroob zijn, de noodzaak aan cholesterol of sterolen en een optimale temperatuur van boven 37°C om te groeien. Er zijn wel species verschillen. Mycoplasma kiemen kunnen geen ureum hydrolyseren en het genoom heeft een grootte van 600 tot 1,350 kilobasenparen (kbp) (Tully, 1995). Bij diagnostisch onderzoek is het niet eenvoudig om te bepalen over welke species van Mycoplasma het gaat. Bovendien is grondig onderzoek een dure aangelegenheid. Het spreekt dan ook voor zich dat hieromtrent nog veel informatie ontbreekt. Het is mogelijk om de genomische taxonomie van de verschillende species te bepalen met volgende technieken: Multilocus sequentie analyse (MLSA), average amino acid identity (AAI) of Karlin genomische signatuur (Thompson et al., 2011). Volgens McAuliffe et al. (2006) wordt voor de stam- of speciestypering van Mycoplasma vooral gebruik gemaakt van de techniek “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)”. Via deze test wordt het geamplificeerde V3 regio van het 16S rRNA gen opgespoord. Deze test laat toe de verschillende Mycoplasma stammen te differentiëren. Volgens Thompson et al. (2011) is de taxonomie, gebaseerd op de 16S rRNA gen sequentie analyse, DNADNA hybridisatie, serologie en fenotypische data, ook een geschikte manier om de species te bepalen. Taxonomie gebaseerd op de metabole kenmerken van de kiemen zou evenwel minder correct zijn volgens Thompson et al. (2011). Met metabole kenmerken bedoelt men het vermogen van
3
de kiem om glucose te fermenteren, arginine te hydrolyseren en eventuele noodzaak van cholesterol voor de groei. Tabel 1: Diergeneeskundig relevante Mycoplasma spp., hun plaats van kolonisatie en het effect. Gastheer
Mycoplasma
Plaats van
Effect van kolonisatie
Bron
spp
kolonisatie
Mycoplasma
Ademhalingswegen,
Polyartritis bij kalveren en
Radaelli et
bovis
voortplantingsstelsel
mastitis bij koeien,
al. (2011)
en gewrichten
broncho-pneumonie of
Rund
abortus Mycoplasma
Ademhalingswegen
dispar Mycoplasma
Ademhalingswegen
bovirhinis Mycoplasma
luchtwegen
(chronische)
Ayling et al.
ademhalingsstoornissen
(2004)
Pneumonie of
Ayling et al.
asymptomatisch
(2004)
Enzoötische pneumonie
Kuhnert et
hyopneumoniae Mycoplasma Varken
al. (2011) Bovenste luchtwegen
hyorhinis Mycoplasma
Erythrocyten
Pneumonie en
Santos et al.
polyserositis bij biggen
(2011)
Anemie
Groebel et
suis Mycoplasma
al. (2009) Gewrichten
hyosynoviae Mycoplasma
Ademhalingsstelsel
ovipneumoniae
Opgezette gewrichten en
Neto et al.
bewegingsproblemen
(2012)
Atypische enzoötische
Rifatbegović
pneumonie
et al. (2011)
Schaap en
Mycoplasma
Uier,
Besmettelijk agalactia
Amores et al.
geit
agalactiae
ademhalingswegen,
syndroom door mastitis
(2012)
Anemie en icterus
Santos et al.
(meestal vage klachten)
(2011)
Rhinitis en conjunctivitis
Soderlund et
ogen en gewrichten Mycoplasma
Erythrocyten
haemofelis Kat
Mycoplasma
Oog en
felis
ademhalingsstelsel
Mycoplasma
Ademhalingsstelsel
al. (2011) Chronische pneumonie
cynos Hond
Mycoplasma
al. (2009) Urogenitaalstelsel
canis
Paard
Mannering et
Voortplantingsstoornissen
Ulgen et al.
en azotemie
(2006)
Mycoplasma
Oog en
Oog- en
Soderlund et
felis
ademhalingsstelsel
ademhalingsproblemen
al. (2011)
Mycoplasma
Ademhalingsstelsel
Pneumonie (vooral
Wood et al.
jongere paarden)
(2005)
equirhinis
4
Diersoort
Vogels
Mycoplasma
Plaats van
spp.
kolonisatie
Mycoplasma
Ademhalingsstelsel
gallisepticum
Effect van kolonisatie
Bron
Tracheïtis, sinusitis,
Vitula et al.
pneumonie,
(2011)
luchtzakontsteking Mycoplasma
Ademhalingsstelsel,
Ademhalingsproblemen,
Samuel et al.
anatis
sinussen en cloaca
lagere vruchtbaarheid,
(1995)
conjunctivitis, sinusitis, tracheïtis, tenosynovitis, artritis en groei achterstand
Deze opsomming is onvolledig. Hiermee wordt enkel geïllustreerd dat alle diersoorten gevoelig zijn voor Mycoplasma spp. en dat deze kiemen verschillende ziektebeelden kunnen veroorzaken. Het is niet relevant voor deze literatuurstudie om hier verder op in te gaan. b.
Morfologie
Mycoplasma bacteriën zijn de kleinste (0.3-0.8μm diameter) bacteriën die tot nu toe gevonden zijn (Razin en Hayflick, 2010). Ze zijn ook de meest eenvoudige bacteriën. Ze hebben, in tegenstelling tot andere bacteriën, geen celwand. Normaal heeft de celwand als functie de structuur van de bacterie te bewaren. Doordat Mycoplasma geen celwand heeft, zijn deze bacteriën dus pleomorf. Ze kunnen naargelang de situatie een andere vorm aannemen. Meestal zijn ze te zien als bol- of eivorm. Mede door het ontbreken van een celwand zijn Mycoplasma bacteriën gevoeliger voor detergenten en osmotische shock dan bacteriën die wel een celwand hebben. Ze zijn resistent aan antibiotica die inwerken op de celwand, zoals β-lactam antibiotica. Deze kiemen worden omgeven door een plasmamembraan. Dit membraan bestaat uit een dubbele laag van fosfolipiden, eiwitten en andere componenten. Mycoplasma’s hebben tevens een klein genoom (Razin en Hayflick, 2010). Hierdoor bezitten ze een beperkte hoeveelheid genetische informatie met als gevolg dat ze op aangereikte media moeten worden gekweekt. Ze zijn zo klein dat eerst werd gedacht dat het virussen waren maar ze verschillen van virussen doordat ze zowel DNA als RNA hebben en kunnen groeien in media zonder eukaryote cellen. Mycoplasma’s hebben nood aan cholesterol uit de omgeving om te groeien. De meeste mycoplasma’s zijn facultatief anaeroob, wat inhoudt dat ze kunnen overleven zonder zuurstof. Ze overleven echter het beste bij aanwezigheid van zuurstof. Mycoplasma’s zijn in staat zich voort te bewegen door te glijden. Bewegingen worden gestuurd met behulp van een organel dat zich in een uitstulping aan de voorkant van de kiem bevindt (Miyata en Uenoyama, 2002). Er werd reeds vastgesteld dat Mycoplasma spp. in staat zijn een biofilm te vormen op glas en plastiek. Er kon echter nog niet worden vastgesteld of dit ook gebeurt op het tracheaal epitheel in vivo. Deze
5
biofilm zou de Mycoplasma spp. resistentie kunnen geven tegen lyse door middel van complement en van het antimicrobiële peptide gramicidin. Deze biofilms zouden dus bijdragen aan het overleven van de Mycoplasma in de gastheer (Simmons en Dybvig, 2009). Volgens Simmons en Dybvig (2009) is het V1-variabele surface antigeen (Vsa proteïne) van cruciaal belang in de overleving van Mycoplasma pulmonis. Het zou de lengte van de tandem repeat regio van het Vsa proteïne zijn dat de vorming van een biofilm bepaalt en dus ook de weerstand tegenover complement. Volgens Simmons en Dybvig (2009) zijn mycoplasma’s met een korte Vsa proteïne gevoeliger aan complement dan mycoplasma’s met een langere Vsa proteïne. c. Voorkomen Mycoplasma spp. komen wereldwijd verspreid voor en zeer veel diersoorten zijn er in een bepaalde mate gevoelig voor. Vooral bij varkens en runderen zijn mycoplasmen één van de belangrijkste bacteriële ademhaling pathogenen. Ook de mens is voor bepaalde Mycoplasma spp. gevoelig. De kiemen komen voor ter hoogte van de slijmvliezen van het ademhalingsstelsel en het genitaal stelsel (Cassell et al., 1985). Af en toe vindt een uitbraak plaats, bv. de uitbraak in Australië van Mycoplasma sp bovine group 7 (mbg7), maar dit betekent niet dat daarom de rest van de wereld er niet mee te maken heeft. Mycoplasma spp. zijn heel gastheerspecifiek en obligaat symbiotisch. Deze kiemen kunnen zich verspreiden via de lucht, direct contact, aerosolen en fomieten. B) MYCOPLASMA INFECTIES BIJ REPTIELEN Het is opmerkelijk hoe weinig informatie er beschikbaar is over mycoplasma’s bij reptielen. De enige dieren die grondig onderzocht zijn, zijn de landschildpadden en de krokodillen. De artikels die in deze literatuurstudie vermeld zijn, gaan voornamelijk over de landschildpad. a. Epidemiologie De verschillende Mycoplasma spp. die bij schildpadden voorkomen, zijn geografisch sterk verspreid. Gopherus polyphemus en G. agassizii zijn grondig onderzocht naar aanleiding van Upper Respiratory Tract Disease (URTD) bij in het wild levende populaties (Sandmeier et al., 2009). Infecties met Mycoplasma spp. zijn echter niet de enige aanwijsbare oorzaken van URTD. Volgens Berry en Slone (1990) was URTD medeverantwoordelijk voor de afname in de populatie van de woestijnschildpad (Gopherus agassizii) rond 1989 in de Mojave woestijn in California. G. agassizii schildpadden worden gevonden in de Mojave woestijn ten noorden en ten westen van de Colorado rivier, in de Colorado woestijn en in de Sonoran woestijn in California (Berry en Christopher, 2001). G. polyphemus komt dan weer vooral voor in het zuidoosten van de Verenigde Staten: Florida, Alabama, Georgia, Louisiana en Mississippi. Bij de landschildpadden Terrapene carolina ( ‘Eastern box turtles’) en T. ornata (‘Western box turtles’) komen infecties met Mycoplasma ook voor (Feldman et al., 2006 en Farkas en Gál, 2009). T. carolina schildpadden worden gevonden in de Verenigde Staten, van Texas doorheen het zuidoosten naar het noorden van Michigan en naar het zuiden van Massachusetts. T. ornata schildpadden worden voornamelijk waargenomen van West Mississippi tot Colorado en in New
6
Mexico. Naargelang de exacte streek van voorkomen krijgen we in deze twee grote groepen verdere onderverdelingen. Mycoplasma testudineum heeft ongeveer dezelfde distributie als Mycoplasma agassizii maar een lagere prevalentie in de populatie van G. polyphemus en G. agassizii schildpadden in Noord-Amerika (Brown et al., 2004). Mycoplasma infecties komen ook vaak voor bij vrijlevende landschildpadden in Europa, voornamelijk bij de soorten Testudo graeca, T. hermanni en T. marginata (Lecis et al., 2011). Mycoplasma infecties komen ook frequent voor bij alligators in Florida, Alligator mississippiensis, bij kaaimannen en krokodillen (vooral de Nijlkrokodillen in Zimbabwe, Crocodylus niloticus) (Brown et al., 2001). De transmissie van Mycoplasma spp. bij reptielen verloopt volgens Wendland et al. (2010) vooral door middel van direct contact: paren, vechten, enz. Volgens McRae et al. (1981) is de populatiegrootte een belangrijke parameter inzake de transmissie van Mycoplasma spp. bij mannelijke schildpadden omdat mannelijke schildpadden sneller seksueel actief en agressiever zijn. In een positieve populatie is de seroprevalentie hoger bij de mannelijke schildpadden dan bij de vrouwelijke (Auffenberg, 1969). Er wordt verondersteld dat mannelijke schildpadden jonger zijn als ze worden gecontamineerd met Mycoplasma spp. dan vrouwelijke schildpadden. Auffenberg (1969) beweert dit omdat jonge mannelijke schildpadden zich sneller moeten bewijzen in de sociale hiërarchie. Boglioli et al. (2003) gaan er vanuit dat in schildpadpopulaties met een normale bevolkingsdichtheid de besmetting van de vrouwelijke schildpadden vooral wordt veroorzaakt door de mannelijke schildpadden bij seksueel contact. Zoals bij andere diersoorten zal infectie met Mycoplasma sneller aanslaan bij reptielen in stresssituaties, zoals na transport of een nieuwe huisvesting. b. Mycoplasma species bij reptielen. b.1. Schildpadden De twee meest bestudeerde Mycoplasma species bij de landschildpadden zijn Mycoplasma agassizii en Mycoplasma testudinis. M. agassizii wordt vooral gevonden ter hoogte van het ademhalingsstelsel bij Gopherus agassizii en G. polyphemus schildpadden. Volgens Brown (1999) wordt dit pathogeen ook erkend als oorzaak van URTD bij Geochelone carbonaria (de kolenbranderschildpad), Geochelone elegans (sterschildpad), Geochelone pardalis (de luipaardschildpad) en Geochelone radiata (de stralenschildpad). M. testudinis wordt niet als schildpadpathogeen erkend. Het zou eerder een commensaal Mycoplasma spp. zijn en wordt gevonden ter hoogte van de cloaca. Volgens Brown en Hunt (2005) is M. agassizii één van de oorzaken van ‘chronic Upper Respiratory Tract Disease’ (URTD). Verder besluiten Brown en Hunt (2005) dat deze twee Mycoplasma spp. niet sterk verwant zijn ondanks dat ze beiden bij de landschildpad worden gevonden. Zij kwamen tot dit besluit omdat er geen kruisreactie plaatsvond tussen schildpadden-antistoffen tegen M. agassizii en M. testudinis. Naast deze twee Mycoplasma spp. werd bij Gopherus agassizii nog een Mycoplasma spp. gevonden, namelijk Mycoplasma testudineum, dat ook zou bijdragen tot klinische symptomen van URTD. M.
7
agassizii en M. testudineum hebben dezelfde distributie maar M. testudineum heeft een lagere prevalentie dan M. agassizzii wat betreft Gopherus agassizii en Gopherus polyphemus schildpadden in Noord-Amerika (Evans, 1976). Volgens Pasmans et al. (2008) zijn infecties met Mycoplasma kiemen in Europa voornamelijk onderzocht op de meest gehouden landschildpadden, Testudo hermanni (de Griekse landschildpad) en T. graeca (de Moorse landschildpad). b.2. Alligators, krokodillen en kaaimannen Bij alligators (Alligator mississippiensis) en kaaimannen (Caiman latirostris) werd vooral Mycoplasma alligatoris teruggevonden (Brown et al., 2002). Bij krokodillen (vooral de Nijlkrokodil, Crocodylus niloticus) werd vooral Mycoplasma crocodyli geïsoleerd. Volgens Brown et al. (2004) zijn M. crocodyli en M. alligatoris nauw aan elkaar verwant. M. alligatoris is echter veel pathogener dan M. crocodyli en infectie met dit species verloopt vaak fataal. b.3.Leguanen Bij de groene leguaan (Iguana iguana) werd recentelijk ontdekt dat naast Mycoplasma iguana tevens Mycoplasma insons voorkomt. Op basis van de 16S rRNA genensequentie werd besloten dat M. insons het meest gerelateerd is met Mycoplasma fastidiosum en Mycoplasma cavipharyngis. M. iguana heeft vermoedelijk een tropisme voor het centrale zenuwstelsel terwijl M. insons een tropisme vertoont voor het ademhalingsstelsel en erythrocyten (May et al., 2007). Samenvattende tabel 2: De soorten Mycoplasma infecties, hun gastheren en effecten (naar Brown, 2002). Mycoplasma species
Potentiele gastheer
Effect van kolonisatie
Mycoplasma agassizii
Landschildpadden (Gopherus en
Chronische URTD
Testudo spp.) en waterschildpadden (Terrapene carolina) Mycoplasma alligatoris
Alligators (Alligator mississippiensis)
Actute multisystemisch
en kaaimannen (Caiman
inflammatoire ziekte (synovitis,
latirostrisen)
meningitis, myocarditis, hepatotos, …)
Mycoplasma crocodyli
Krokodillen (Crocodylus niloticus)
Polyartitis en sub-acute pneumonie
Mycoplasma testudinis
Landschildpadden (Testudo graeca)
Voornamelijk commensaal
Mycoplasma insons
De groene leguaan (Iguana iguana)
Voornamelijk commensaal
Mycoplasma iguana
De groene leguaan (Iguana iguana)
vermoedelijk spinaal letsels
Mycoplasma spp. (nieuwe
De Birmaanse python (Python
Proliferatieve lymfocytaire
soort)
molurus bivittatus)
tracheïtis en pneumonie
8
In onderstaande stamboom (fig. 1) wordt geïllustreerd dat Mycoplasma agassizii met zijn unieke 16S rRNA gen een onderdeel is van de fylogenetische groep van Mycoplasme hyorhinis en het dichtste aanleunt bij Mycoplasma mobile (Brown, 2002). Volgens Brown (2002) maakt Mycoplasma crocodyli deel uit van de fylogenetische groep Mycoplasma fermentans en leunt M. crocodyli het dichtste aan bij Mycoplasma alligatoris (op zijn beurt ook weer deel van M. fermentans). Mycoplasma testudinis is volgens Brown (2002) onderdeel van de Mycoplasma pneumoniae fylogenetische groep. Fig.1: Fylogenetische stamboom gebaseerd op de 16S rRNA genen sequentie. Vergelijking tussen schildpadden Mycoplasma en Mycoplasma spp. bij andere diersoorten (uit: Feldman et al., 2006).
c. Pathogenese Over de pathogenese van Mycoplasma infecties bij reptielen is nog maar weinig bekend. Veel informatie hieromtrent is vergaard door extrapolatie van Mycoplasma bij andere diersoorten. Mycoplasma’s hebben door hun afwijkende morfologie nood aan bepaalde systemen om een gastheer te parasiteren. De kiemen maken onder meer gebruik van hun penetrerend vermogen in
9
gastheercellen, membraan transport, antigene variatie, gastheercel adhesie en hun glijdende manier van voortbewegen. Mycoplasma spp. komen voor ter hoogte van de mucosa. Ze veroorzaken voornamelijk chronische ziektes en kunnen gedurende langere periodes in hun gastheer aanwezig blijven (Browning et al., 2011). Volgens Dickinson et al. (2005) zijn de Mycoplasma infecties verantwoordelijk voor een grote uitval in de populatie van vrijlevende landschildpadden (voornamelijk Gopherus agassizii)
en
verspreiden ze zich voornamelijk door middel van direct contact. Ook volgens Brown (2002) verspreiden de infecties zich via direct contact maar tevens via geïnfecteerde objecten die als ‘vector’ fungeren. c.1. Adhesie Om de mucosa te koloniseren, moet de kiem aan het oppervlak adhereren. Volgens Brown (2002) kan M. agassizii adhereren aan het trilhaarepitheel van de ventrolaterale oppervlakten van de choanen. Hoe deze kiem zich vasthecht aan het epitheel is nog niet bekend maar volgens Brown (2002) zou M. agassizii geen specifiek organel hebben dat instaat voor de aanhechting in tegenstelling tot M. hyopneumoniae. Wat invasie betreft, is er een groot verschil tussen Mycoplasma agassizii en Mycoplasma alligatoris. M. agassizii leidt eerder tot chronische infecties door de trage invasie van de mucosa, maar M. alligatoris invadeert heel snel en heeft meer acute reacties tot gevolg. Afhankelijk van hoe de gastheer wordt geïnvadeerd, is de immuunrespons anders. c.2. Antigene variatie Er zijn verschillende multigene families die coderen voor verschillende oppervlakte-antigenen en die gebruik maken van “High frequency phase variation” in immunodominante antigenen. Deze multigene families zijn grotendeels ontstaan door genduplicatie maar een groot deel is ontstaan door frameshift mutaties (Browning, 2011). Deze genenfamilies worden gecontroleerd met behulp van verschillende mechanismen: ‘slipped strand mispairing’ en recombinatie (Czurda et al., 2010). Er wordt aangenomen dat door deze variatie de kiemen meer in staat zijn het immuunsysteem van de gastheer te omzeilen en dus langer in de gastheer kunnen overleven. Hier zijn echter nog geen bewijzen voor (Browning, 2011). Volgens Allen et al. (2005), Jeffery et al. (2006),
en Noormohammadi et al. (1998) vindt er bij
Mycoplasma spp. een horizontale uitwisseling van genen tussen verschillende Mycoplasma spp. plaats. Als er complete of partiële integratieve conjugatieve elementen (ICE) te vinden zijn (zoals bij Mycoplasma crocodyli) kan worden verondersteld dat een massale uitwisseling van genen is gebeurd, wat bijdraagt tot variatie en pathogeniciteit van de kiem.
10
c.3. Immuunrespons van de gastheer Daar Mycoplasma spp. op zich weinig histotoxisch lijken, zal de weefselschade ter hoogte van het mucosa epitheel voornamelijk te wijten zijn aan de sterke immuunrespons van de gastheer. Deze immuunrespons wordt op gang gebracht door de antigenen van de Mycoplasma kiem. Als het mucosa epitheel een infectie doormaakt met Mycoplasma spp. gaat dit veelal gepaard met een lymfoproliferatieve respons. Er wordt verondersteld dat de Mycoplasma spp. de immuunrespons kunnen regelen waardoor ze gedurende langere tijd virulent blijven in de gastheer. Dit wordt bewezen met M. gallisepticum bij kippen waarbij gezien werd dat macrofagen die zich bevinden ter hoogte van de infectieplaats weinig inflammatoire cytokines produceren. Muneta et al. (2008) besluiten dat Mycoplasma spp. een systemisch immunosuppressief effect hebben. Er zou namelijk een daling zijn in mitogene activiteit van de lymfocyten uit de milt. Volgens Brown (2002) beschikken reptielen over weefsel dat veel mastcellen bevat, voornamelijk eosinofiele granulocyten. Verder meent Brown (2002) dat reptielen basofielen hebben met antigeenspecifieke antistoffen. Deze zouden histamine vrijgeven naargelang de omstandigheden waarin ze zich bevinden (Calcium-, temperatuur- en antigeenafhankelijk). Reptielen zouden tevens meer diversiteit hebben dan zoogdieren wat het complementsysteem betreft. Fagocyten en Natural Killer cellen (NK cellen) komen vrij goed overeen met deze bij de zoogdieren. De macrofagen doen aan fagocytose, verwerking en presentatie van het gecapteerde antigeen. De fagocytotische granulocyten bij reptielen worden heterofielen genoemd. Als er een infectie plaatsvindt met Mycoplasma, zullen deze heterofielen degranuleren, waarna ze als vreemd voorwerp fungeren waardoor de macrofagen zich errond zullen verzamelen en alzo een granuloma vormen. Dit komt tot uiting als een kaasachtige substantie die accumuleert ter hoogte van verschillende holtes (Brown, 2002). c.4.Virulentiefactoren Volgens Brown en Hunt (2005) beschikt Mycoplasma alligatoris over sialidase en hyaluronidase. Deze functioneren als mogelijke activators van het CD95-gemedieerde eukaryote celdood. CD95 wordt tot expressie gebracht ter hoogte van het
hart, op de fibroblasten, skeletspieren en op embryo
fibroblasten. Wanneer er dus een infectie optreedt met M. alligatoris zien we al snel veranderingen aan de cardiale fibroblasten en skeletspiervezels door de CD95-gemedieerde celdood. Verder zouden deze kiemen verschillende glycosidases bevatten die in staat zijn de extracellulaire matrix op te lossen, waardoor de invasie van de kiem vlotter verloopt. Mycoplasma crocodyli kan ook de extracellulaire matrix oplossen want het bevat hyaluronidase maar geen sialidase. Mede door het gebrek aan sialidase is deze kiem minder pathogeen dan Mycoplasma alligatoris.
11
Op de meeste eukaryote cellen bevindt zich een CD44-receptor (hyaluronan-receptor) maar deze is inactief door de sialylatie en kan worden geactiveerd door de combinatie van hyaluronidase en sialydase. Hierna kan het signaal voor celdood worden doorgegeven naar CD95. Volgens Carson et al. (1979) kunnen de Mycoplasma spp. die voornamelijk pneumonie veroorzaken adhereren aan cilia-epitheel en deze ciliën stilleggen (ciliastase), de cilia doen verdwijnen en het epitheel zelf aantasten. Hierdoor kunnen eventuele secundaire pathogenen ook makkelijker aanslaan en het ziektebeeld verergeren. d. Symptomen Bij schildpadden uit de infectie met Mycoplasma agassizii zich voornamelijk door Upper Respiratory Tract Disease (URTD). Deze ziekte gaat gepaard met rhinitis, ooguitvloei, unilaterale of bilaterale sereuze tot mucopurulente neusuitvloei, die de neus eventueel kan doen verstoppen, perioculair oedeem, conjunctivitis en dyspneu (Origgi en Jacobson, 2000). Veelal worden de schildpadden lusteloos en anorectisch, ze dehydrateren en kunnen soms sterven aan cachexie (Brown, 2002). Volgens Stadtlander et al. (1991) leiden infecties met Mycoplasma voornamelijk tot chronische, subklinische infecties. Deze zijn frequent recidiverend en kunnen klinisch worden, zeker wanneer de gastheer een periode van stress doormaakt. Mycoplasma testudineum vertoont ongeveer dezelfde symptomen maar wordt minder vaak teruggevonden als pathogeen agens in vergelijking met M. agassizii. Infectie bij alligators met Mycoplasma alligatoris uit zich vaak in multisystemische inflammatoire symptomen zoals pneumonie, synovitis en polyserositis. Symptomen kunnen vaak al binnen een week na infectie optreden. Het hart is een frequent aangetast orgaan en dus zal infectie met deze kiemen vaak tot uiting komen door hartproblemen. Aangezien deze kiemen ook de hersenen kunnen aantasten, treden zenuwsymptomen op die overeenkomen met symptomen veroorzaakt door meningitis. Bij de meeste diersoorten zijn infecties met Mycoplasma spp. slechts zelden fataal. Bij de alligators is dit frequent het geval, vermoedelijk door meningitis en pneumonie. Mycoplasma crocodyli veroorzaakt een eerder milde infectie en verloopt uiterst zelden fataal. De hoofdsymptomen veroorzaakt door deze kiem zijn milde pneumonie en polyartritis (Brown, et al. 2011). Krokodillen, geïnfecteerd met M. crocodyli, vertoonden gezwollen gewrichten ter hoogte van de ledematen en progressief verergerende mankheid en parese. Bij een klein aantal dieren was er sprake van pneumonie (Kirchhoff et al., 1997). Bij leguanen zal infectie met Mycoplasma insons niet pathogeen verlopen. Infectie met Mycoplasma iguana infecteert vooral groene leguanen en zal volgens Brown et al. (2002) vooral aanleiding geven tot spinaal letsels. e. Letsels Door de adhesie ter hoogte van het trilhaar epitheel veroorzaken de Mycoplasma kiemen verlies van cilia epitheel, mucosale hyperplasie en invasie van mononucleaire leukocyten en granulocyten
12
(Carson et al., 1979). Dit resulteert in het verlies van de normale weefselstructuur en de functie van de cellen. De normale mucosa wordt vervangen door een geprolifereerd mucosaal epitheel. Er is een opstapeling van epitheel en ontstekingscellen in mucopurulente neusvloei. Bij alligators, geïnfecteerd met Mycoplasma alligatoris, werden vooral volgende letsels opgemerkt na autopsie: milde interstitiële en peribronchiolaire pneumonie tot fibronecrotische pneumonie. Wat betreft de extra-pulmonaire letsels is er vooral sprake van pericarditis, myocarditis en multifocale artritis. Bij autopsie werden vooral fibrineuze polyserositis en polyartritis teruggevonden. Volgens Brown et al. (2001) worden er op de longen van geïnfecteerde alligators paarse verkleuringen en fibrineuze pleuritis vastgesteld. Tevens werden er oedeem, een klein aantal mononucleaire cellen en heterofielen aangetroffen in het longinterstitium. Bij Mycoplasma alligatoris is ook het hart een doelorgaan (Brown en Hunt, 2005). Hier worden vooral de cardiale fibroblasten aangetast. Het pericardium verdikt en er kan een fibrineuze pericarditis tot pyogranulomateuze ontstekingen voorkomen. Ter hoogte van het mycoard kunnen zones van necrose te vinden zijn. Ook hier kan het evolueren tot een pyogranulomateuze myocarditis. Zowel ter hoogte van het myocardium als pericardium kan er vacuolisatie optreden. Ook de lever wordt aangetast. Hier is er sprake van fibrineus en sereus exsudaat ter hoogte van het kapsel. Het leveroppervlak kan pyogranulomateuze haardjes vertonen. Ter hoogte van de periportale zones zijn mononucleaire cellen en lymfocyten te vinden. Wat de milt betreft, werd een totaal verlies van structuur waargenomen. De milt werd aangetast door vorming van necrosehaarden, depletie van de lymfefollikels en een stijging van de mononucleaire cellen, macrofagen en heterofielen. Bij alligators worden ook de hersenen aangetast na infectie met M. alligatoris. Deze aantasting kan gaan van diffuus kleine tot ernstige heterofiele lymfocytaire meningitis en zelfs pyogranulomateuze meningitis. De artritis die veroorzaakt wordt door deze kiemen gaat gepaard met onderhuids oedeem ter hoogte van het aangetaste ledemaat en vlokkerig gele synoviale vloeistof. Er treedt een verdikking op van de synoviale aflijning en er is infiltratie van heterofielen en lymfocyten. Ernstig aangetaste gewrichten worden necrotisch tot pyogranulomateus. Infectie van krokodillen met Mycoplasma crocodyli geeft artritis met grote hoeveelheden geelkleurige mucus. Er is ook sprake van oedeem, necrose van de oppervlakkige cellagen, infiltratie van lymfocyten en fibrose (Kirchhoff et al., 1997). Voor de letsels, veroorzaakt door Mycoplasma agassizii, bestaat er een scoresysteem om de ernst te bepalen (Brown et al ., 1999). Score 0, normaal: hier worden af en toe kleine subepitheliale lymfoïde aggregaten en heterofielen in de lamina propria gevonden. Klier- en mucosa-epitheel zijn onveranderd en er is geen oedeem. Score 1, mild: hier worden multifocale, kleine subepitheliale lymfoïde aggregaten en kleine groepjes van heterofielen, lymfocyten en plasmacellen in de lamina propria gevonden. Er is tevens mild oedeem ter hoogte van de lamina propria en kleine veranderingen aan het mucosa epitheel.
13
Score 2 of 3, gemiddelde ernst: uitgebreide lymfoïde aggregaten, diffuus verspreide groepjes van heterofielen, lymfocyten en plasmacellen in de lamina propria, soms doorlopend in het mucosa epitheel. Er is oedeem in de lamina propria en het basale epitheel is gedesorganiseerd en veranderd. Score 4 of 5, ernstig: focaal uitgebreid tot diffuse banden van lymfocyten en plasmacellen, zelfs tot in het mucosa epitheel, in de lamina propria zijn er grote aantallen heterofielen te vinden die ook ter hoogte van het mucosa epitheel voorkomen. Verder is er duidelijk oedeem in de lamina propria, degeneratie, necrose en af en toe een erosie ter hoogte van het mucosa epitheel. De basale cellen van het epitheel prolifereren en er is een metaplasie van het mucosa en olfactorisch epitheel tot een basaloïd epitheel met af en toe zelfs squameuze metaplasie. Hieronder staat figuur 2 voor een concretere weergave van de letsels op basis van het scoresysteem. Bespreking van de foto’s volgens Stadtländer et al. (1991). Fig.2: Representatieve letsels ter hoogte van de bovenste ademhalingswegen
van
experimenteel
geïnfecteerde
Gopher agassizii schildpadden (uit: Stadtländer et al., 1991). Foto a: Milde letsels in de choanen gekenmerkt door infiltraties van lymfocyten en plasma cellen ter hoogte van de lamina propria (waar de pijltjes staan). Het epitheel is nog intact. Deze foto is een weergave van score 1.
Foto b: matig ernstige letsels gekenmerkt door een infiltratie van ontstekingscellen (IC), vooral bestaande uit lymfocyten macrofagen
en en
een
kleiner
aantal
heterofielen.
Het
plasmacellen, epitheel
is
gedesorganiseerd en bedekt door de ontstekingscellen. Deze foto is een weergave van score 2 of 3.
Foto c: ernstige letsels ter hoogte van de neussinus, gekenmerkt dor de ernstige erosies van het normale epitheel (donker gekleurde pijltjes), terwijl het resterende epitheel vooral opgebouwd is uit basaloide of squameuze cellen. Er is oedeem en infiltratie van ontstekingscellen (de ongekleurde pijltjes). Er is opvallend veel exsudaat aanwezig bestaande uit heterofielen en fibrine (E). Deze foto is een weergave van score 4 of 5.
14
f.
Diagnose
Het is van belang onderscheid te maken tussen infectie met het Herpesvirus, Pasteurella testudinis en Mycoplasma agassizii bij schildpadden. De symptomen kunnen sterk gelijkend zijn. Deze drie pathogenen kunnen immers allemaal bijdragen aan Upper Respiratory Tract Disease (URTD) maar de behandeling verschilt significant. Verder is een snelle en correcte diagnose van groot belang bij het limiteren van aangetaste gevallen in een populatie. De spreiding van infectie met Mycoplasma spp. moet vermeden worden door middel van regelmatige screening en surveillance. Dit wordt mogelijk gemaakt met goede diagnostische testen. Bij het nemen van stalen voor onderzoek is het van belang dat alles zo steriel mogelijk gebeurt om contaminatie zoveel mogelijk te beperken. Zo moet voor elke staalname bij een andere schildpad een vers paar steriele handschoenen gebruikt worden en moeten de gebruikte materialen gedesinfecteerd worden. Verder wordt elke schildpad voorafgaand aan de staalname algemeen lichamelijk onderzocht. f.1. Symptomen Als eerste criteria waarop een diagnose kan worden gesteld zijn de klinische symptomen van belang. Neusvloei, rhinitis, dyspneu, conjunctivitis, enz… zijn kenmerkend voor Upper Respiratory Tract Disease (URTD). Wat echter precies URTD veroorzaakt, is daarmee niet te bepalen, want URTD kan ontstaan uit meerdere oorzaken. Radiografie kan aangewend worden om na te gaan of er vocht ter hoogte van de longen zit (Wellehan en Gunkel, 2004). Het probleem is echter dat ook veel infecties met Mycoplasma spp. subklinisch verlopen. Subklinische geïnfecteerde dieren vertonen geen klinische symptomen van de ziekte maar kunnen wel bijdragen tot het verspreiden van de ziekte in de populatie. Dergelijke dragers moeten zo snel mogelijk worden opgespoord met behulp van andere methoden. Er kan ook sprake zijn van een apathogene infectie. Hierbij is de gastheer wel geïnfecteerd maar is de kiem niet pathogeen genoeg om ziekte te veroorzaken. Dit is veelal het geval met Mycoplasma testudinis en Mycoplasma insons. Als er gestorven dieren ter beschikking staan, kunnen eventuele autopsies verricht worden en stalen genomen
worden
van
de
meest
voorkomende
kolonisatiegebieden.
Deze
kunnen
dan
histopathologisch onderzocht worden en op basis van de laesies beoordeeld worden (zie het eerder vermelde score-systeem bij het onderwerp letsels). f.2. Cultuur Uit bekomen neusswabs, nasale spoelsels, tracheale spoelsels enz.... kan geprobeerd worden een reincultuur te bekomen. Volgens Pees et al. (2007) hebben tracheale lavage stalen een hogere sensitiviteit dan een pharyngeaal lavage staal. Om een degelijke cultuur te bekomen moet ten eerste de staalname correct gebeuren en moet het transport conform de regels verlopen, om kans op contaminatie met andere kiemen te verminderen. Ten tweede is het van belang te beseffen dat het kweken van Mycoplasma spp. voor cultuur geruime tijd kan duren. Zo moeten de culturen minimum zes weken behouden worden.
15
Hier volgt een voorbeeld voor het nemen van een nasaal spoelsel volgens Brown et al. (1999). Er wordt gebruik gemaakt van 0.5 ml (1 ml volgens Pees et al., 2007) tryptisch soja agar dat wordt ingebracht in de voorste neusgaten en na aspiratie opgeslagen in cryo buisjes voor het transport, na invriezen met vloeibaar stikstof. In het laboratorium worden ze in cultuur gebracht op een geschikt medium. Er wordt gebruik gemaakt van bloed agar ( met schapenbloed en tryptisch soja agar) of chocolade agar (geïncubeerd bij 35°C en 5% CO 2). Volgens Brown et al. (1999) kan het soms problemen opleveren om M. agassizii te isoleren van swabs daar deze kiemen normaal voorkomen op ventrolaterale depressies van de bovenste ademhalingswegen. Overwegend dat het maken van een cultuur veel tijd in beslag neemt, ervaring een grote vereiste is en dat de sensitiviteit slechts gemiddeld is, kan worden beslist dat cultuur geen aangewezen diagnostische techniek is voor deze kiemen. f.3. ELISA ELISA staat voor Enzyme-Linked Imunosorbent Assay en heeft als doel het opsporen van antistoffen tegen Mycoplasma spp. Deze test wordt na PCR het vaakst gebruikt voor de diagnose van Mycoplasma infecties. Er wordt zowel gebruik gemaakt van een positieve als van een negatieve controle om meer zekerheid te geven bij het aflezen van de resultaten van de test. Meestal wordt gebruik gemaakt van serologie om tot een sluitende diagnose te komen. Vaak kan met behulp van serologie besloten worden of een reptiel al contact heeft gehad met Mycoplasma spp. Als er tevens klinische symptomen aanwezig zijn, kan het gaan om een geïnfecteerde gastheer. Als er geen klinische symptomen zijn, kan het gaan om een drager ofwel een gastheer die de infectie al eerder heeft doorgemaakt. Het principe van indirecte ELSIA wordt frequent gebruikt. Als eerste wordt een microtiterplaat met 96 wellen gecoat met het antigeen waarvoor getest wordt, vb. het Mycoplasma agassizii antigeen. Dan wordt de microtiterplaat nagespoeld. Nadien wordt het serum van het te onderzoeken dier gebruikt, vb: serum van een Gopherus agassizii waarbij een infectie met M. agassizii wordt vermoed. Dit serum bevat misschien antistoffen tegen M. agassizii. Deze antistoffen zijn de primaire antistoffen (bij een directe ELISA zijn deze bekleed met een bepaald enzym om herkend te worden). Nadien worden de secundaire antistoffen toegevoegd. Dit zijn antistoffen tegen de primaire antistoffen, vb. antistoffen tegen schildpadantigenen, gehaald uit konijnenserum. Deze secundaire antistoffen zijn met een bepaald enzym bekleed. Nadien wordt een substraat aan de microtiterplaat toegevoegd dat reageert met het enzym van de secundaire antistoffen en bijvoorbeeld een kleurverandering geeft. Met andere woorden, als het te testen dier antistoffen heeft tegenover het geteste pathogene agens, wordt dit weergegeven aan de hand van een kleurverandering. Er is ook altijd een positieve en negatieve controle voorhanden om het resultaat nog nauwkeuriger te beoordelen. Een betrouwbare ELISA kan reeds 8 weken na infectie met M. agassizii uitgevoerd worden. Dan is er al een duidelijke stijging in de M. agassizii antistoffen (Schumacher et al., 1993). Volgens Schumacher et al. (1993) moet er rekening worden gehouden met eventuele kruisreactiviteit tussen Mycoplasma agassizii en Mycoplasma testudineum bij het gebruik van indirecte ELISA.
16
Volgens Hunter et al. (2008) kunnen met ELISA niet enkel de antistoffen worden opgespoord bij geïnfecteerde dieren maar tevens de natuurlijk aanwezige antistoffen tegen Mycoplasma agassizii. Deze natuurlijke antistoffen behoren meestal tot het IgM type, wat ook het geval is bij M. agassizii. Volgens hen kan het onderscheid gemaakt worden met behulp van Western Blot analyse. Hunter et al. (2008) merkten op dat bij schildpadden die met dezelfde hoeveelheid M. agassizii kiemen werden geïnoculeerd toch verschillende western blot analyseresultaten hadden. Volgens Hunter et al. (2008) kwam dit door de natuurlijke antistoffen. Volgens Wendland et al. (2010) heeft dit verschil in resultaten eerder te maken met de antigenische variatie die de kiem gebruikt om te ontsnappen aan de immuunrespons van de gastheer. Verder vinden Wendland et al. (2010) dat ELISA nog steeds de beste resultaten geeft en dat Western Blot analyse eerder gelimiteerd is. f.4. PCR Er worden swabs genomen van de neusuitvloei en eventueel van de ooguitvloei. Er worden ook bloedstalen genomen. Van schildpadden die gestorven zijn onder verdenking van infectie met Mycoplasma kunnen eventueel ook weefselstalen van de aangetaste gebieden genomen worden. Met behulp van eerder Mycoplasma positief bevonden stalen kunnen we een PCR test (Polymerase chain reaction test) uitvoeren en vergelijken met de positieve controles. Deze test kan echter soms een lage sensitiviteit hebben. Het principe van PCR berust op het opzoeken van DNA of RNA specifiek voor het pathogene agens. In dit geval dus van de verschillende Mycoplasma spp. In het geval van Mycoplasma spp. bij reptielen wordt de aandacht gevestigd op 16S rRNA sequentie, zo kunnen de verschillende species worden gevonden. Er wordt gebruik gemaakt van primers, eigen aan de 16S rRNA gensequentie van de te onderzoeken Mycoplasma spp. Wanneer een schildpad met symptomen van Upper Respiratory Tract Disease (URTD) een positieve PCR-test had op basis van Mycoplasma-DNA, wordt een RFLP (restrictie fragment lengte polymorfisme) test uitgevoerd om te bepalen of de Mycoplasma spp. ofwel M. agassizii ofwel M. testudineum is (Brown et al., 1999). PCR is de meest gebruikte diagnostische test voor infecties met mycoplasmen. De test heeft een hoge sensitiviteit en specificiteit en is accuraat. De sensitiviteit is wel grotendeels afhankelijk van de DNA-extractiemethode, het doel-gen en de primers. g. Bestrijding De bestrijding van infectie met Mycoplasma spp. is gesteund op een combinatie van preventieve en curatieve maatregelen. Ook is het van belang na te gaan of de dieren wel in goede omstandigheden worden gehuisvest. Als dit laatste niet het geval is, is het ten sterkste aan te raden ook deze parameter te optimaliseren.
17
g.1. Behandeling Volgens Brown et al. (1999) is een behandeling met antibiotica vaak voldoende om de klinische symptomen op te heffen bij schildpadden met Mycoplasma agassizii infectie maar niet om de infectie volledig te elimineren. Als een behandeling met antibiotica overwogen wordt, is het noodzakelijk rekening te houden met de natuurlijke resistentie van Mycoplasma spp. tegenover verschillende antibiotica. Zo is een behandeling met beta-lactam antibiotica niet nuttig, daar deze de celwandvorming inhiberen en Mycoplasma spp. geen celwand bezitten. Er zijn verschillende antibiotica die wel werkzaam zijn tegen Mycoplasma spp.: tetracycline, enrofloxacine, gentamicine en bepaalde macroliden. Een behandeling met enrofloxacine, een fluoroquinolone, kan wel aanslaan. Deze antibiotica interfereren met de DNA-replicatie Er is via farmaco-kinetische studie aangetoond dat de optimale dosis varieert tussen 5 mg/kg intramusculair (I.M.) elke 24 tot 48 uur bij de Gopherus polyphemus, tot 10 mg/kg elke 12 uur bij de Indische sterschildpad (Geochelone elegans). Er moet wel worden opgelet bij het I.M. inspuiten van enrofloxacine omdat dit soms kan gepaard gaan met necrose. Er moet ook over gewaakt worden dat dit antibioticum niet in contact komt met zenuwen. Zoals al eerder vermeld, zorgt behandeling met antibiotica wel voor het stopzetten van de symptomen maar niet voor het elimineren van infectie. De kans is derhalve groot dat deze ‘genezen’ schildpadden nog steeds dragers en tevens uitscheiders van de kiemen zijn (Wellehan en Gunkel, 2004). Volgens Wimsatt et al. (2008) treden klinische symptomen weer op binnen 2 tot 4 weken na het stopzetten van de behandeling. Verder kan een behandeling met clarithromycine, een macrolide antibioticum, ook voor goede resultaten zorgen tegen M. agassizii. Clarithromycine bindt op de 50S subunit van de bacteriële ribosomen waardoor er problemen ontstaan bij de vorming van peptiden. In Europa kunnen deze antibiotica worden ingespoten. In Amerika is enkel de orale vorm geregistreerd maar aangezien sommige schildpadden moeilijkheden hebben bij orale inname van het geneesmiddel kan er ook een preparaat in het rectum worden aangebracht. Verdere studies hebben uitgewezen dat er eventueel accumulatie van clarithromycine is bij Gopherus agassizii. Dit dient toch nog verder onderzocht te worden. Ook blijkt dat het volledig verdwijnen van de klinische symptomen meestal slechts plaatsvond na langdurige behandeling van weken tot zelfs maanden met hoge dosissen. De gebruikelijke dosis bedraagt 15 mg/kg en kan tweemaal daags worden toegediend om de gewenste resultaten te bekomen. Een langdurige toediening van deze antibiotica gaat gepaard met weinig neveneffecten en wordt dus als veilig gezien (Wimsatt et al., 2008). Een probleem dat recentelijk gesignaleerd wordt, is volgens Pasmans et al. (2008) het vermoeden van een toegenomen antimicrobiële resistentie. Dit vermoeden wordt gesteund door het voorkomen van meer gevallen van therapeutische falen na behandeling met antimicrobiële middelen. Naast
een
medicamenteuze
behandeling
is
het
optimaliseren
van
omgeving-
en
managementgerelateerde parameters een noodzaak. Zo moeten de dieren bij correcte temperatuur gehouden worden en is een temperatuurgradiënt essentieel opdat de dieren hun preferred body
18
temperature (PBT) kunnen bereiken. Ook het juiste voedsel is van belang. Extra aandacht dient besteed te worden aan de reductie van stress voor de dieren, zeker bij transport van dieren naar een nieuwe habitat. Als de stresslevels verhoogd zijn, wordt de immuniteit onderdrukt door verhoogde catecholaminegehaltes in het bloed. Dit kan leiden tot nieuwe infectie met Mycoplasma kiemen of kan een onderdrukte infectie laten recidiveren. Als alle factoren geoptimaliseerd zijn, is de kans op dergelijke infecties al sterk gereduceerd. g.2. Preventie Inzake preventie van infectie met Mycoplasma kiemen wordt erop gewezen dat, hoewel schildpadden in staat zijn antistoffen aan te maken tegen Mycoplasma kiemen, deze de infectie niet elimineren en niet beschermen tegen eventuele recidieven. Er worden dus asymptomatische dragers gevormd. Brown et al. (1999) raden aan om in verband met Mycoplasma agassizii een voldoende lange quarantaineperiode in te lassen bij import van nieuwe dieren, grondig te screenen en regelmatige surveillance te doen bij in gevangenschap levende reptielen. Om deze dieren grondig te screenen is er nood aan gestandaardiseerde testen. Een veelgebruikte methode van screening maakt gebruik van de gevormde antistoffen bij dieren die een infectie doormaken of hebben doorgemaakt. Schildpadden die geïnfecteerd zijn met M. agassizii vertonen 4 weken na blootstelling een stijging in IgM antistoffen. Deze antistoffen ondergaan na ongeveer 4 weken een shift naar gestegen IgY antistoffen (Brown et al., 2002). Volgens McLaughlin et al. (2000) wordt een plateaufase bereikt van de IgY spiegel bij een tweede infectie. Op basis van de resultaten van de screeningtesten kan beslist worden over het behandelen en eventueel transporteren van schildpadden. Een seropositieve status is een risicofactor voor de transmissie van Upper Respiratory Tract Disease (URTD) (Schumacher et al., 1997). Volgens Berry en Slone (1990) en Jacobson et al. (1995) wordt ter preventie van URTD een ELISA-test gedaan. Als de geteste schildpad seronegatief test, mag het dier geplaatst worden. Test de schildpad seropositief of wordt ze sterk verdacht van URTD, dan wordt ze geëuthanaseerd. Euthanasie ter preventie van verspreiding van URTD werd standaard toegepast van 1990 tot 2006. Deze techniek werd echter enkel gebruikt bij de Gopherschildpadden en is nooit in Europa toegepast. In Europa is het de bedoeling een efficiënte ingangscontrole uit te voeren. Dit is echter praktisch nog niet realiseerbaar omdat tot op heden de meeste informatie omtrent virulente Mycoplasma spp. gekend is over de Noord-Amerikaanse schildpadsoorten. Er is nog te weinig informatie over welke Mycoplasma spp. in Europa voorkomen en wat hun pathogeen belang is. Vaccinatie zou, na ingangscontrole, een tweede efficiënte maatregel kunnen zijn wat betreft preventie. Er is echter nog geen geschikt vaccin gevonden tot dusver. Tegenwoordig worden verdachte schildpadden of dieren die seropositief testen niet meer geëuthanaseerd. Ze worden afgezonderd en overgeplaatst en dragen bij aan het verdere onderzoek naar URTD.
19
C) DISCUSSIE Mycoplasma agassizii speelt een belangrijke rol in het ontstaan van Upper Respiratory Tract Disease (URTD) bij Gopherus agassizii en andere landschildpadden. Er is nood aan een goede preventie om de invoer van deze kiem en besmetting van de dieren zoveel mogelijk te voorkomen. Eens geïnfecteerd, is symptomatische behandeling niet al te moeilijk maar het elimineren van de kiem is niet eenvoudig. Dit leidt tot een hoger risico op dragers in een al dan niet sero-negatieve populatie waardoor de infectie in stand blijft. Dit moet worden verhinderd. Er is nood aan meer informatie betreffende de kiem om een betere preventie te bewerkstelligen. Zoals uit de literatuurstudie blijkt, is er al vrij veel informatie omtrent Mycoplasma agassizii bij verschillende landschildpadden, maar vooral bij Gopherus agassizii, beschikbaar. Deze informatie handelt echter vooral over het voorkomen, de diagnose en de symptomen in het kader van URTD. Er is nog maar weinig bekend over de pathogenese van de kiem in de gastheer. Deze informatie is evenwel van groot belang. Als men de kiem wil bestrijden, is het immers noodzakelijk te weten welke schade precies wordt aangericht bij de gastheer en hoe dit gebeurt. Extra onderzoek omtrent de pathogenese is dus een vereiste. Dit is niet enkel van toepassing op M. agassizii maar ook op andere Mycoplasma spp. bij reptielen. Bij M. crocodyli en M. alligatoris is niet enkel de pathogenese te weinig onderzocht maar ook de diagnose, de behandeling en het voorkomen zijn vooral geëxtrapoleerd van de eerder onderzochte M. agassizii. Het kan interessant zijn deze kiemen wat grondiger te bestuderen om zo de eventuele discrepanties te ontdekken. Een grondigere vergelijking tussen M. crocodyli en M. alligatoris is wellicht aangewezen daar M. alligatoris heel sterk gelijkt op M. crocodyli maar veel pathogener is en zowel bij krokodillen als bij alligators voorkomt. Misschien is het goed om na te gaan of vaccinatie tegen M. crocodyli geen kruisimmuniteit kan geven tegen M. alligatoris. Verder is het onduidelijk of schildpadjongen bij de geboorte over een maternale immuniteit beschikken die hun zou beschermen tegen infectie met M. agassizii. Er worden immers soms nogal hoge titers bekomen van antistoffen tegen M. agassizii, soms zelfs zonder dat de dieren in contact waren gekomen met de kiem. Nader onderzoek is hier dan ook aangewezen. Tenslotte is er zeer weinig informatie te vinden omtrent infecties met Mycoplasma spp. bij andere reptielen. De volgende stap zou onderzoek kunnen zijn naar het voorkomen van Mycoplasma spp. bij Baardagamen, daar deze dieren frequent als huisdier worden gehouden.
20
Referenties -
Allen J. L., Noormohammadi A. H. en Browning G. F.(2005). The vlhA loci of Mycoplasma synoviae are confined to a restricted region of the genome. Microbiology 151, 935–940.
-
Amores J., Sanchez A., Gomez-Martin A., Corrales, J. C., Contreras A. en de la Fe C. (2012). Surveillance of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma mycoides subsp capri in dairy goat herds. Small ruminant research 102, 89-93.
-
Auffenberg W. (1969). Tortoise behavior and survival. Rand McNally and Company. Chicago, Illinois, USA.
-
Ayling R. D., Bashiruddin S. E. en Nicholas R. A. J. (2004). Mycoplasma species and related organisms isolated from ruminants in Britain between 1990 and 2000. Veterinary record 155, 413-416.
-
Berry K. H. en Slone S.(1990). Final Notes from Meetings on Upper Respiratory Tract Disease Syndrome in Desert Tortoises 12–13.
-
Berry K. H. en Christopher M. M. (2001). Guidelines for the field evaluation of desert tortoise health and disease. Journal of wildlife diseases 37, 427-450.
-
Boglioli, M. D., Guyer C., en Michener W. K. (2003). Mating opportunities of female gopher tortoises, Gopherus polyphemus, in relation to spatial isolation of females and their burrows. Copeia 2003, 846–850.
-
Brown D. R., Farley J. M., Zacher L. A., Carlton J. M. R., Clippinger T. L., Tully J. G en Brown M. B. (2001). Mycoplasma alligatoris sp nov., from American alligators. International journal of systematic and evolutionary microbiology 51, 419-424.
-
Brown D. R., Farmerie W. G., May M., Benders G. A., Durkin A. S., Hlavinka K., Hostetler J., Jackson J., Johnson J., Miller R. H., Paralanov V., Radune D., Szczypinski B. en Glass J. I. (2011). Genome Sequences of Mycoplasma alligatoris A21JP2(T) and Mycoplasma crocodyli MP145(T). Journal of bacteriology 193, 2892-2893.
-
Brown D. R. (2002) Mycoplasmosis and immunity of fish and reptiles, FRONTIERS IN Bioscienc, 7, D1338-D1346.
-
Brown D. R. en Hunt M. E. (2005). Mycoplasma alligatoris infection promotes CD95 (FasR) expression and apoptosis of primary cardiac fibroblasts. Clinical and diagnostic laboratory immunology 12, 1370-1377.
-
Brown D. R., Merritt J. L., Jacobson E. R., Klein P. A., Tully J. G. en Brown M. B. (2004). Mycoplasma testudineum sp nov., from a desert tortoise (Gopherus agassizii) with upper respiratory tract disease. International journal of systematic and evolutionary microbiology 54, 1527-1529.
-
Brown D. R., Nogueira M. F., Schoeb T. R., Vliet K. A., Bennett R. A., Pye G. W. en Jacobson E. R. (2001). Pathology of experimental mycoplasmosis in American alligators. Journal of Wildlife Diseases 37, 671–679.
-
Brown D. R., Schumacher I. M., McLaughlin G. S., Wendland L. D., Brown M. B., Klein P. A. en Jacobson E. R. (2002). Application of diagnostic tests for mycoplasmal infections of desert
21
and gopher tortoises, with management recommendations. Chelonian Cons. Biol. 4, 497– 507. -
Brown M. B., McLaughlin G. S., Klein P. A., Crenshaw B. C., Schumacher I. M., Brown D. R. en Jacobson E. R. (1999). Upper respiratory tract disease in the gopher tortoise is caused by Mycoplasma agassizii. Journal of clinical microbiology 37, 2262-2269.
-
Browning G. F., Marenda M. S, Noormohammadi A. H., Markham P. F. (2011). The central role of lipoproteins in the pathogenesis of mycoplasmosis. Veterinary microbiology 153, 44-50.
-
Carson J., Collier A. M. en Clyde W. A. (1979). Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumonia infection. Science 206, 34951.
-
Cassell G. H., Clyde W. A. and Davis J. K. (1985). Mycoplasmal respiratory infections. The Mycoplasmas: Mycoplasma Pathogenicity 4, 65–106.
-
Czurda W., Jechlinger R., Rosengarten en Chopra-Dewasthaly R. (2010). Xer1-mediated site-specific DNA inversions and excisions in Mycoplasma agalactiae. J. Bacteriol.,
192,
4462–4473. -
Dickinson V. M., Schumacher I. M., Jarchow J. L., Duck T. en Schwalbe C. R.(2005). Mycoplasmosis in free-ranging desert tortoises in Utah and Arizona. Journal of Wildlife Diseases 41, 839–842.
-
Evans A. S. (1976). Causation and disease: the Henle-Koch postulates revisited. Yale J Biol Med 49, 175–195.
-
Farkas S. L. en Gál J. (2009). Adenovirus and mycoplasma infection in an ornate box turtle (Terrapene ornata ornata) in Hungary. Veterinary Microbiology 138, 169–173.
-
Feldman S. H., Wimsatt J., Marchang R. E., Johnson A. J., Brown W., Mitchell J. C. en Sleeman J. M. (2006). A novel mycoplasma detected in association with upper respiratory disease syndrome in free-ranging eastern box turtles (Terrapene carolina carolina) in Virginia. Journal of Wildlife Diseases 42, 270–289.
-
Groebel K., Hoelzle K., Wittenbrink M. M., Ziegler U. en Hoelzle L. E. (2009), Mycoplasma suis Invades Porcine Erythrocytes Infection and immunity 77, 576-584.
-
Hunter K. W., DuPre S. A., Sharp T., Sandmeier F. C. en Tracy C. R. (2008). Western blot can distinguish natural and acquired antibodies to Mycoplasma agassizii in the desert tortoise (Gopherus agassizii). Journal of microbiological methodes 75, 464-471.
-
Jacobson E. R., Brown M. B., Schumacher I. M., Collins B. R., Harris R. K. en Klein P. A. (1995). Mycoplasmosis and the desert tortoise (Gopherus agassizii) in Las Vegas Valley, Nevada. Chelonian Conservation and Biology 1, 279–284.
-
Jeffery N., Browning G. F. en Noormohammadi A. H. (2006). Organization of the Mycoplasma synoviae WVU 1853T vlhA gene locus. Avian Pathol. 35, 53–57.
-
Kirchhoff H., Mohan K., Schmidt R., Runge I. M., Brown D. R., Brown M. B.,Foggin C. M., Muvavarirwa P., Lehma H. en Flossdorf H. (1997). Mycoplasma crocodyli sp. nov., a New Species from Crocodiles. International journal of systematic bacteriology 47, 742-746.
-
Kuhnert P., Overesch G., en Belloy L. (2011). Genotyping of Mycoplasma hyopneumoniae in wild boar lung samples. Veterinary microbiology 152, 191-195.
22
-
Lecis R., Paglietti B., Rubino S., Are B. M., Muzzeddu M., Berlinguer F., Cheesa B., Pittau M. en Alberti A. (2011). Detection and Characterization of Mycoplasma spp. and Salmonella spp. in Free-living European Tortoises (Testudo hermanni, Testudo graeca, and Testudo marginata). Journal of wildlife diseases 74, 717-724.
-
Mannering S. A., McAuliffe L., Lawes J. R., Erles K. en Brownlie J. (2009). Strain typing of Mycoplasma cynos isolates from dogs with respiratory disease. Veterinary microbiology 135, 292-296.
-
May M., Ortiz G.J, Wendland L. D., Rotstein D. S., Relich F. R., Balish F. M. en Brown D. R. (2007), Mycoplasma insons sp. nov., a twisted mycoplasma from green iguanas (Iguana iguana). Fems Microbiology Letters 274, 298-303.
-
McAuliffe L., Lawes J., Bell S., Barlow A., Ayling R. en Nicholas R. (2006). 16S rDNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis; a single generic test for detecting and differentiating Mycoplasma species. Veterinary microbiology 117, 292-296.
-
McLaughlin G. S., Jacobson E. R., Brown D. R., McKenna C. E., Schumacher I. M., Adams P., Brown M. B. en Klein P. A. (2000). Pathology of upper respiratory tract disease of gopher tortoises in Florida. Journal of wildlife diseases 36, 272-283.
-
McRae W. A., Landers L. J., en Garner J. A. (1981). Movement patterns and home range of the gopher tortoise. American Midland Naturalist 106,165–179.
-
Miyata M.en Uenoyama A. (2002). Movement on the cell surface of the gliding bacterium, Mycoplasma mobile, is limited to its head-like structure. Fems Microbiol. Lett. 215, 285–289.
-
Muneta Y., Panicker I. S., Kanci A., Craick D., Noormohammadi A. H., Bean A., Browning G. F. en Markham P. F. (2008). Development and immunogenicity of recombinant Mycoplasma gallisepticum vaccine strain ts-11 expressing chicken IFN-gamma. Vaccine 26, 5449–5454.
-
Neto J. C. G., Gauger P. C., Strait E. L., Boyes N., Madson D. M. en Schwartz K. J. (2012). Mycoplasma-associated arthritis: Critical points for diagnosis. Journal of swine health and production 20, 82-86.
-
Noormohammadi A. H., Markham P. F., Duffy M. F., Whithear K. G. en Browning G. F.(1998). Multigene
families
encoding
the
major
hemagglutinins
in
phylogenetically
distinct
mycoplasmas. Infect. Immun. 66, 3470–3475. -
Origgi F. C. en Jacobson E. R. (2000). Diseases of the respiratory tract of chelonians. Veterinary Clinics North America: Exotic Animal Practice 3, 537–549.
-
Pasmans F., Blahak S., Martel A., Pantchev N. (2008). Introducing reptiles into a captive collection: the role of the veterinarian. Veterinary journal 175, 53-68.
-
Pees M., Schmidt V., Schlomer J. en Krautwald-Junghanns M. E. (2007). Examination on the relevance of the sampling points and the aerobic microbiological culture for the diagnosis of respiratory infections in reptiles. Deutsche Tieraztliche Wochenschrifte 114, 388-393.
-
Radaelli E., Castiglioni V., Losa M., Benedetti V., Piccinini, R., Nicholas R. A. J., Scanziani E. and Luini M. (2011). Outbreak of bovine clinical mastitis caused by Mycoplasma bovis in a North Italian herd. Research in veterinary science 91, 251-253.
23
-
Razin S. en Hayflick L. (2010). Highlights of Mycoplasma research-An historical perspective. Biologicals 38, 183-190.
-
Rifatbegović M., Maksimović Z. en Hulaj B.(2011). Mycoplasma ovipneumoniae associated with severe respiratory disease in goats. Veterinary Record 168, 565.
-
Samuel M. D., Goldberg D. R., Thomas C. B. en Sharp P. (1995). Effects of Mycoplasma anatis and cold stress on hatching success and growth of mallard ducklings 31, 172–178.
-
Sandmeier F. C., Tracy C. R., duPre S. en Hunter K. (2009). Upper respiratory tract disease (URTD) as a threat to desert tortoise populations: A reevaluation. Biological conservation 142, 1255-1268.
-
Santos A. P., Guimaraes A. M. S., do Nascimento N. C., SanMiguel P. J., Martin S. W. en Messick J. B. (2011). Genome of Mycoplasma haemofelis, unraveling its strategies for survival and persistence. Veterinary research 42, article number 102.
-
Schumacher I. M., Brown M. B., Jacobson E. R., Collins B. R. en Klein P. A. (1993). Detection of antibodies to a pathogenic Mycoplasma in desert tortoises (Gopherus agassizii) with upper respiratory tract disease. J Clin Microbiol 31, 1454–1460.
-
Schumacher I. M., Hardenbrook D. B., Brown M. B., Jacobson E. R. en Klein P. A. (1997). Relationship between clinical signs of upper respiratory tract disease and antibodies to Mycoplasma agassizii in desert tortoises from Las Vegas Valley, Nevada. J. Wildl. Dis. 33, 261–266.
-
Simmons W. L. en Dybvig K. (2009). Mycoplasma biofilms ex vivo and in vivo. Fems microbiology letters 295, 77-81.
-
Soderlund R., Bolske G., Holst B. S., Aspan A. (2011). Development and evaluation of a realtime polymerase chain reaction method for the detection of Mycoplasma felis. Journal of veterinary diagnostic investigation 23, 890-893.
-
Stadtlander C. T. K. H., Watson H.L., Simecka J.W., en Cassell H.G. (1991). Cytopathic effects of Mycoplasma pulmonis in vivo and in vitro. Infect. Immun 59, 4201-4211.
-
Ulgen M., Cetin C., Senturk S., Ozel A. E. en Ozdemir U. (2006). Urinary tract infections due to Mycoplasma canis in dogs. Journal of veterinary medicine series a-physiology pathology clinical medicine 53, 379-382.
-
Vitula F., Peckova L., Bandouchova H., Pohanka M., Novotny L., Jira D., Kral J., Ondracek K., Osickova J., Zendulkova D., Rosenbergova K., Treml F. en Pikula J. (2011). Mycoplasma gallisepticum
infection
in
the
grey
partridge
Perdix
perdix:
outbreak
description,
histopathology, biochemistry and antioxidant parameters. BMC Veterinary research 7, 7-34. -
Tully J.G. (1995). Revised Minimum Standards for Description of New Species of the Class Mollicutes (Division Tenericutes). International committee on systematic bacteriology subcommittee on the taxonomy of Mollicutes 45, 605-612.
-
Thompson C. C., Vieira N. M., Vicente A. C. P. en Thompson F. L. (2011). Towards a genome based taxonomy of Mycoplasmas. Infection genetics and evolution 11, 1798-1804.
-
Wellehan J. F. X. en Gunkel C. I. (2004). Emergent diseases in reptiles, Seminars in avian and exotic pet 13, 160-174.
24
-
Wendland L. D., Klein P. A., Jacobson E. R. en Brown M. B. (2010). Mycoplasma agassizii Strain Variation and Distinct Host Antibody Responses Explain Differences between EnzymeLinked Immunosorbent Assays and Western Blot Assays. Clinical and vaccine immunology 17, 1739-1745
-
Wendland L. D., Wooding J., White C. L., Demcovitz D., Littell R., Berish J. D., Ozgul A., Oli M. K., Klein P. A., Christman M. C., en Brown M.B. (2010). Social behavior drives the dynamics of respiratory disease in threatened tortoises. Ecology 91, 1257-1262.
-
Wimsatt J., Tothill A., Offermann C. F., Sheehy J. G. en Peloquin C. A.(2008). Long-term and per rectum disposition of clarithromycin in the desert tortoise (Gopherus agassizii). Journal of the American association for laboratory animal science 47, 41-47.
-
Wood J. L. N., Newton J. R., Chanter N. en Mumford J. A. (2005). Association between respiratory disease and bacterial and viral infections in British racehorses. Journal of clinical microbiology 43, 120-126.
25
