UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
ACADEMIEJAAR 2013-2014
MASTERPROEF DEEL 2 door Lindsey CANTILLON
Casussen in het kader van de Masterproef
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
ACADEMIEJAAR 2013-2014
RANAVIROSE BIJ AMFIBIEËN door Lindsey CANTILLON
Promotor: Prof. dr. An Martel Copromotor: Dr. Mark Blooi
Casusbespreking in het kader van de masterproef
VOORWOORD Bij het schrijven van deze casusbespreking heb ik zowel professionele als morele steun gekregen van verschillende mensen, die ik dan ook graag zou willen bedanken. Bedankt aan mijn promotor Prof. dr. An Martel en copromotor dr. Mark Blooi voor de begeleiding en nuttige tips. Mijn ouders bedank ik voor hun aanmoediging gedurende de volledige studie, en om steeds in mij te blijven geloven, ook op momenten dat ik dat zelfs niet deed.
INHOUDSTABEL SAMENVATTING .....................................................................................................................................1 1. INLEIDING ............................................................................................................................................2 2. SYSTEMATIEK DER AMFIBIEËN .......................................................................................................4 3. FYSIOLOGIE VAN AMFIBIEËN ...........................................................................................................4 3.1. Levenscyclus .............................................................................................................................4 3.2. Thermoregulatie en metabolisme ..............................................................................................5 3.3. Huid ...........................................................................................................................................6 3.2.1. Opbouw .............................................................................................................................6 3.2.2. Osmoregulatie ...................................................................................................................7 3.2.3. Ademhaling ........................................................................................................................7 3.4. Immuunsysteem ......................................................................................................................10 4. RANAVIROSE ....................................................................................................................................11 4.1. Taxonomie en karakteristieken ...............................................................................................11 4.2. Ecologie ...................................................................................................................................12 4.2.1. Reservoirspecies .............................................................................................................12 4.2.2. Transmissieroutes ...........................................................................................................13 4.2.2.1. Direct ................................................................................................................13 4.2.2.2. Indirect .............................................................................................................13 4.2.3. Vatbaarheid en virulentie .................................................................................................14 4.2.3.1. Gastheerfactoren .............................................................................................14 4.2.3.2. Omgevingsfactoren ..........................................................................................15 4.2.3.3. Virusgeassocieerde factoren ...........................................................................16 4.3. Pathologie................................................................................................................................16 4.3.1. Symptomen en macroscopisch letsels ............................................................................16 4.3.2. Microscopisch letsels .......................................................................................................17 4.4. Diagnose .................................................................................................................................18 4.4.1. Staalname........................................................................................................................18 4.4.2. Histologie .........................................................................................................................19 4.4.3. Elektronenmicroscopie ....................................................................................................19 4.4.4. Immunochemie ................................................................................................................19 4.4.4.1 Immunohistochemie (IHC) ................................................................................19 4.4.4.2. Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) ...............................................20 4.4.5. Virusisolatie .....................................................................................................................20 4.4.6. Moleculaire technieken ....................................................................................................21 4.4.6.1. Polymerase kettingreactie (PCR) ....................................................................21 4.4.6.2. Restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) en natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) .................................................21
4.4.6.3. Sequentieanalyse ............................................................................................22 4.5. Monitoring en urveillance ........................................................................................................23 4.6. Behandeling en preventie........................................................................................................24 4.7. Impact op amfibieënpopulaties................................................................................................25 5. BESPREKING ....................................................................................................................................26 6. LITERATUURLIJST............................................................................................................................28
SAMENVATTING De 3 grote orden van amfibieën zijn morfologisch sterk verschillend van elkaar, maar delen bepaalde fysiologische karakteristieken die hun duidelijk afzondert van andere vertebraten. Zo brengen de meeste amfibieën een deel van hun leven door in het water (larven), en een deel op het land (adulten). Deze 2 ontwikkelingsstadia worden van elkaar gescheiden door een metamorfose die zorgt voor de nodige aanpassingen om het leven op land mogelijk te maken. Een ander belangrijk kenmerk is dat amfibieën ectotherm zijn. Amfibieën zijn, door hun dunne en permeabele huid, niet in staat hun lichaamstemperatuur constant te houden. Ze zullen daarom zelf geen warmte produceren waardoor hun metabolisme veel lager is dan dat van andere vertebraten. Dit huidtype geeft amfibieën enerzijds het voordeel dat ze de huid kunnen gebruiken als ademhalingsorgaan, maar maakt hun anderzijds enorm gevoelig aan uitdroging, toxines en pesticiden. Bovendien vervult de huid, buiten ademhaling, nog vele andere belangrijke functies waardoor letsels aan de huid een grote impact kunnen hebben op de overleving van een amfibie. Huidletsels kunnen veroorzaakt worden door niet infectieuze oorzaken, zoals fysische of chemische schade, of door infectieuze oorzaken waarvan chitridiomycose en ranavirose ongetwijfeld de belangrijkste zijn. Ranavirussen worden geassocieerd met massale sterfte bij amfibieën in het wild en in gevangenschap, zowel in larven als adulten. Ze kunnen verschillende gastheerspecies infecteren waarbij sommigen kunnen fungeren als reservoirspecies. Transmissie van het virus kan direct, zoals door contact met geïnfecteerde individuen of orale opname van geïnfecteerde weefsels, maar ook indirect via water, sediment en voorwerpen. De impact van een infectie verschilt naargelang species, ontwikkelingsstadia en de aanwezige stressoren en kan variëren van subklinisch geïnfecteerd tot erge letsels en snelle dood. Bij larven worden de uitwendige letsels vooral gekenmerkt door huidbloedingen en zwelling van de poten, terwijl bij adulten vooral huidulceraties voorkomen. Op autopsie springen de inwendige bloedingen en gezwollen en bleke levers het meest in het oog. De histologische bevindingen bestaan uit necrose en bloedingen in verschillende organen en basofiele intracytoplasmatische inclusieslichaampjes. Het vermoeden van een ranavirusinfectie kan bevestigd worden door virusisolatie, elektronenmicroscopie, immunochemie en moleculaire technieken zoals de polymerase kettingreactie (PCR). De toegenomen sterfte t.g.v. ranavirose kan te wijten zijn aan immunosuppressie t.g.v. natuurlijke (bv. omgevingstemperatuur, predatoren, competitie) en anthropogene (bv. pesticiden, veeteelt, habitatfragmentatie) stressoren, maar kan ook het gevolg zijn van verspreiding van ranavirussen door de mens. Het identificeren van de verschillende factoren die hiertoe bijdragen en nagaan op welke gebieden kan worden ingegrepen, vormt een belangrijke stap om de afname in amfibieënpopulaties te stoppen, en eventueel om te keren.
1
1. INLEIDING Amfibieënpopulaties nemen sterker af en zijn meer bedreigd dan andere groepen van vertebraten1,2. Binnen de klasse van amfibieën zijn momenteel 28,7% van de species opgenomen op de rode lijst van de internationale unie voor natuurbescherming (IUCN) binnen de categorieën kwetsbaar, bedreigd of kritiek bedreigd, terwijl dit 13.5% bedraagt voor vogels en 22.8% bedraagt voor zoogdieren. Deze vaststelling wekt bezorgdheid op, niet alleen om amfibieën, maar om de volledige natuur. Amfibieën worden gebruikt als een indicator voor de omgevingsgezondheid omdat ze, door hun dunne permeabele huid en hun bifasisch leven, gevoeliger zijn voor omgevingsveranderingen dan andere dieren3,4. De verschillende oorzaken die verantwoordelijk kunnen zijn voor de afname in amfibieënpopulaties kunnen ingedeeld worden in 2 klassen4. Onder klasse 1 vallen de oorzaken waarvan men een goed begrip heeft van het onderliggende mechanisme zoals overexploïtatie, biotoopveranderingen en exoten. Globale veranderingen (UV radiatie, klimaat), contaminanten (bv. pesticiden) en opkomende infectieuze ziektes vallen onder klasse 2, dit zijn de oorzaken waarvan men het mechanisme nog niet volledig heeft opgehelderd. Binnen de infectieuze ziektes zijn er 2 agentia die sterk op de voorgrond treden, namelijk de schimmel Batrachochytrium dendrobatides en ranavirussen. Ranavirose wordt geassocieerd met massale en wereldwijde sterfte van amfibieën, 3,5,6
zowel in het wild als in gevangenschap
. In België en Nederland (2004) werd sterfte gerapporteerd
van in het wild gevangen geïmporteerde salamanders (Tylototriton Kweichowensis) (Casereport 1)6. Honderd salamanders afkomstig vanuit Azië werden geïmporteerd door een Belgische dierenwinkel en verkocht. De salamanders verkeerden bij aankomst in goede conditie, maar binnen 2 maanden stierven 38/39 dieren die gehouden werden door 3 verschillende liefhebbers. Een overlevend dier werd 7 maanden in quarantaine gehouden en vervolgens in een toom van 4 salamanders geïntroduceerd. De 5 dieren stierven allen binnen 2 weken. De opgemerkte symptomen waren huidulceratie, anorexie, apathie en oedeem. Uit virologisch onderzoek van 3 dode dieren van verschillende eigenaars werd een Iridovirus geïsoleerd en uit de polymerase-chain-reaction (PCR) test bleek het om een Ranavirus te gaan, namelijk Frog Virus 3 (FV3). Experimentele infectie van axolotls met dit isolaat leverde geen ziektebeeld op (enkel tijdelijk een verminderde eetlust) en 9 weken na de inoculatie kon het virus zelfs niet meer opgespoord worden. Dit kan te maken hebben met het speciesverschil, maar kan anderzijds ook te wijten zijn aan de stress die de dieren ondervonden hebben t.g.v. het vangen en importeren, wat kan leiden tot immunosuppressie en dus tot een verhoogde sensitiviteit voor het virus. In 2010 werd de eerste uitbraak van ranavirose-geassocieerde 7 sterfte in het wild in Nederland gerapporteerd (Casereport 2) . Hierbij stierven meer dan 1000 groene
kikkers (Pelophylax spp.) en tenminste 10 salamanders (Lisotriton vulgaris). De dieren vertoonden huidbloedingen en bij de kikkervisjes kon oedeem en erytheem worden waargenomen. De necrotische letsels
in
lever,
milt
en
nier
die
gepaard
gingen
met
basofiele
intracytoplasmatische
inclusielichaampjes op het histologische beeld wezen in de richting van een Iridovirus. Dit kon bevestigd worden door middel van PCR waaruit geconcludeerd werd dat men te maken had met het common midwife toad virus (CMTV), een species binnen het genus van de Ranavirussen. Uit de voorgaande cases blijkt dus dat ranavirussen verschillende gastheren kunnen infecteren maar dat de vatbaarheid varieert tussen species. De vatbaarheid wordt mede bepaald door een combinatie
2
van natuurlijke en anthropogene stressoren die interageren met het immuunsysteem, de virulentie van het virus en reservoirspecies3,4. Het doel van deze casusbespreking is een duidelijk beeld te geven omtrent de fysiologie van amfibieën en de daarmee gepaard gaande kwetsbare punten, de complexe ecologische interacties die een rol spelen binnen ranavirose en hoe deze een invloed kunnen uitoefenen op de pathogenese. Er zal ook dieper worden ingegaan op de pathologie die dit virus teweegbrengt, de diagnostiek, de toegepaste methoden voor preventie en surveillance, en mogelijke toekomstgerichte werkpunten.
3
2. SYSTEMATIEK DER AMFIBIEËN De klasse der amfibieën, waartoe momenteel ongeveer 6792 soorten behoren, worden ingedeeld in 3 orden: Anura of ‘staartlozen’ (kikkers en padden), Caudata (salamanders) en Gymnophiona (wormsalamanders)8,9. Kikkers en padden zijn het sterkst vertegenwoordigd met ongeveer 6996 species verspreid op alle continenten met uitzondering van Antarctica8,9. Kikkers kunnen op het eerste zicht onderscheiden worden van padden op basis van hun smaller lichaam met langere achterpoten en hun vochtige gladde huid. Padden daarentegen hebben een dikker lichaam met korte achterpoten en een oneffen droge huid10. De orde van de salamanders omvat ongeveer 608 species die wijdverspreid voorkomen maar afwezig zijn in Australië, het grootste deel van Afrika en Antarctica. Wormsalamanders zijn de kleinste orde van amfibieën met ongeveer 188 species. Het zijn gesegmenteerde, cilindrische, poot- en staartloze dieren die ondergronds leven en voorkomen in tropische gebieden8,9. De grote uiterlijke diversiteit aan amfibieën (die gelijkaardig is aan deze van zoogdieren) reflecteert de complexe en lange evolutie die ze ondergaan hebben en hun aanpassingen aan verschillende leefomstandigheden. Hun levensstijl is verschillend maar niet minderwaardig aan deze van zoogdieren. Integendeel, deze afwijkende fysiologie en levensstijl stelt amfibieën in staat te overleven in omstandigheden die voor zoogdieren moeilijk/niet leefbaar zijn8.
3. FYSIOLOGIE VAN AMFIBIEËN 3.1. Levenscyclus Amfibie komt van het Grieks ‘amphibios’ wat dubbel leven betekent8,11. Amfibieën hebben een bifasisch leven dat bestaat uit een vrijlevend larvaal aquatisch stadium en een op land levend juveniel/volwassen stadium, daarom spreekt men ook wel van een ‘complexe’ levenscyclus (bv. Pelophylax spp.). Eitjes worden in het water afgelegd waaruit vervolgens waterlevende larven komen. Deze larven groeien tot ze metamorfose ondergaan naar een adult die semi-aquatisch is of volledig op het land leeft. Op deze complexe levenscyclus bestaan er een tal van uitzonderingen. Zo zullen vele soorten hun volledige levenscyclus op het land (bv. Oedipina gracilis) of in het water (bv. Ambystoma mexicanum) doorbrengen. Deze laatsten zijn neoteen, dit wil zeggen dat ze een aantal van hun larvale karakteristieken doorheen hun hele leven behouden. Ook de metamorfose die amfibieën ondergaan verschilt tussen soorten
9,11
. Larven van salamanders (bv. Salamandra salamandra) en
wormsalamanders zullen zich geleidelijk aan ontwikkelen tot adulten, in tegenstelling tot anuren (bv. Pelophylax spp.) waar er een drastische metamorfose plaatsvindt. Dit verschil heeft o.a. te maken met de omschakeling in dieet die plaatsvindt bij anuren, maar niet bij salamanders. Salamanders zijn doorheen hun hele leven carnivoor, terwijl anuren tijdens hun larvale stadium herbivoor zijn en als adult carnivoor. Deze shift vereist grondige aanpassingen aan het spijsverteringsstelsel. Verder kunnen nog een tal van andere veranderingen, afhankelijk van de species, worden waargenomen9,11.
4
3.2. Thermoregulatie en metabolisme De levenswijze van amfibieën is gebaseerd op een laag energieverbruik. Vele morfologische en fysiologische karakteristieken van amfibieën, die vaak als primitief worden beschouwd, zijn aanpassingen om deze lage energiebehoefte mogelijk te maken. Een belangrijk kenmerk van amfibieën is dat ze poikilotherm (de lichaamstemperatuur is niet constant) en exotherm zijn (de lichaamstemperatuur wordt bepaald door omgevingstemperatuur)8,9. Endotherme dieren zijn in staat hun lichaamstemperatuur op peil te houden door endogene warmteproductie afkomstig van hun metabolisme. Deze manier van thermoregulatie vraagt veel energie. Bij exotherme dieren speelt deze endogene warmteproductie geen rol, bovendien hebben ze een dunne naakte huid waardoor ze de geproduceerde warmte niet kunnen vasthouden. Hun lichaamstemperatuur varieert met de omgevingstemperatuur en vereist dus veel minder energie12,13. Alle fysiologische processen worden beïnvloedt door temperatuur en dus bij amfibieën door de omgevingstemperatuur. De temperatuur waarop fysiologische processen optimaal verlopen wordt de ‘preferred body temperature’ (PBT) genoemd en is soortspecifiek’ (figuur 1)8,9. Processen die bij amfibieën het meest duidelijk beïnvloed worden door temperatuur zijn waterbalans (een toename van temperatuur gaat gepaard met waterverlies) en gedrag. Om de lichaamstemperatuur binnen bepaalde grenzen te houden gaat een dier thermoreguleren. Endotherme dieren zullen dit vooral doen door hun metabolisme aan te passen terwijl exotherme dieren gedragsmatig thermoreguleren. Hieronder valt o.a. de keuze van een habitat met een bepaald microklimaat (‘microhabitat’), controle van waterverlies en absorptie en temporele aanpassing van activiteit8. Het temperatuursbereik waarbinnen een dier actief is wordt afgebakend door een gecontroleerde (‘voluntary’) minimum en maximum temperatuur (figuur 1). Dit is, respectievelijk, een lage en een hoge temperatuur die aanleiding geeft tot het zich terugtrekken naar een gepaste microhabitat en definieert dus de temperatuursvoorwaarden waaronder een dier normaal kan functioneren. Wanneer de lichaamstemperatuur deze grenzen overschrijdt is het mogelijk dat de minimale of maximale kritische temperatuur bereikt wordt (figuur 1). Boven/onder deze kritische temperatuur is een dier niet meer in staat tot gecoördineerde beweging en kan het dus ook niet meer ontsnappen naar een microhabitat, wat snel zal leiden tot het bereiken van de lethale temperatuur en dus sterfte
8,14
. Onder normale omstandigheden zullen de bovenste en onderste kritische temperatuur
niet bereikt worden aangezien het dier zich zal terugtrekken naar een microhabitat en inactief zal worden.
Figuur 1: Profiel van de lichaamstemperatuur bij amfibieën (uit Vitt & Caldwell, 2013)8.
5
De term hibernatie of winterrust is voorbehouden om een periode van inactiviteit gerelateerd aan winterkoude te beschrijven, terwijl estivatie staat voor inactiviteit getriggerd door droogte en/of warmte. Tijdens deze periodes zal het metabolisme sterk worden gereduceerd en zal er dus minder energie worden verbruikt wat toelaat te overleven in extreme omstandigheden8. 3.3. De huid De huid is een complex orgaan dat vele functies uitoefent die noodzakelijk zijn voor de dagdagelijkse overleving van amfibieën. De 3 hoofdfuncties zijn ademhaling, osmoregulatie en verdediging, zowel tegen infecties als predatoren. Verder speelt de huid een belangrijke rol in excretie, thermoregulatie, reproductie, perceptie en camouflage9,15,16. 3.3.1. Opbouw Amfibieën hebben een naakte, permeabele, dunne huid, opgebouwd uit een epidermale en dermale laag die van elkaar gescheiden wordt door de basale membraan. De huid van larven onderscheidt zich van de adulte huid door een kleiner aantal cellagen en de afwezigheid van zowel een gekeratiniseerde buitenste cellaag als van dermale klieren8,16. De adulte epidermis is van buiten naar binnen opgebouwd uit het stratum (str.) corneum (gekeratiniseerde cellen), str. granulosum, str spinosum, str. germinativum en de basaal membraan8,17 (figuur 2). Het str. granulosum en spinosum zijn opgebouwd uit 2 verschillende soorten cellen, nl. de principiële cellen en mitochondria-rijke (MR) cellen17. De dermis is een dikkere laag bestaande uit verschillende celtypes en structuren zoals klieren, bloedvaten, zenuwen en pigmentcellen die zich allen bevinden in een bindweefselmatrix. In de dermis van juveniele en adulte amfibieën bevinden zich 2 soorten klieren: muceuze klieren en granulaire klieren8,15,18. Beide soorten hebben een gelijkaardige opbouw: ze zijn multicellulair en flesvormig waarvan de bulbus zich in de dermis bevindt en de nek zich uitstrekt in de epidermis. Ze zijn omgeven door gladde spiercellen die geïnnerveerd worden door sympatische zenuwen18,19. Muceuze klieren zijn talrijker aanwezig dan de granulaire klieren en zijn vooral dorsaal dens geconcentreerd. Ze secreteren continu een slijm dat de vochtigheid van de huid bewaart en een mechanische bescherming biedt. Granulaire klieren komen vooral voor ter hoogte van het hoofd en de schouders en kunnen zich soms organiseren tot macroscopisch zichtbare klieren zoals de parotoïd klier die aanwezig is bij sommige soorten15,18,19. Deze klieren produceren giftige/ schadelijke secreties als bescherming tegen pathogenen en predatoren. Deze secreties zijn zeer divers zelfs binnen individuen van éénzelfde soort. Men deelt ze in een een viertal hoofdcategorieën: biogene amines, cardiotoxines, alkaloïden en peptiden8,15,19. De dunne, permeabele, naakte huid heeft als grote nadeel dat deze erg kwetsbaar en gevoelig is aan uitdroging. Verder is de huid, ten gevolge van het verschaffen van water en zuurstof, de perfecte groeibodem voor aërobe micro-organismen9,15,16. Dit alles maakt de huid het doelwit van allerlei problemen gaande van huisvesting tot infectieuze ziektes.
6
Figuur 2: Schematische voorstelling van de epidermis van amfibieën. 1. stratum corneum; 2. stratum granulosum + spinosum; 3. stratum germinativum; 4. basale membraan; 5. mitochondria-rijke cel; 6. principiële cel; a. tightjunction (naar Larsen, 1991)21.
3.3.2. Osmoregulatie Ten gevolge van de dunne, permeabele en rijk gevasculariseerde huid zijn amfibieën constant onderhevig aan waterverlies via de huid en dus erg gevoelig aan dehydratatie. Ondanks dit waterverlies zijn amfibieën toch in staat gedurende een langere periode (afhankelijk van de soort) op land te overleven. Dit is mogelijk door een aangepaste levensstijl, gedrag en fysiologie22. Zo zijn amfibieën nachtactieve dieren die zich vaak zullen ingraven en op zoek gaan naar vochtige microklimaten. Ze zijn bovendien in staat om op een enorm snelle manier te rehydrateren via osmotische absorptie doorheen de huid. Deze rehydratatie gaat vaak gepaard met een bepaald gedrag (waterrespons) waarbij de ventrale huid tegen een nat oppervlak wordt geduwd. De secreties van de muceuze klieren die door de poten over het lichaam verdeeld worden werken eerder preventief door het beperken van vochtverlies via de huid15,16,22. De absorptie van water en ionen doorheen de huid van amfibieën wordt gedreven door zowel actief transport als door een osmotische gradiënt. Natriumionen treden de cellen van het str. granulosum (zowel de principiële als de MR-cellen) binnen via natriumkanaaltje in de apicale membraan. Deze ionen kunnen vervolgens via Na+-K+-pompen in de basolaterale membraan naar de intercellulaire ruimte getransporteerd worden. Water volgt passief de ionenstroom17. De MR-cellen staan in voor een gespecialiseerd chloortransport omdat dit soort transport extra energie vergt dat geleverd wordt door V-ATPase ter hoogte van de apicale membraan van de MR-cellen22. Bij amfibieën bestaat, net zoals bij zoogdieren, een antidiuretische hormoon dat wordt vrijgesteld bij dehydratatie. Dit hormoon, genaamd arginine vacotocine (AVT), werkt in op waterkanalen (aquaporines) zowel ter hoogte van de huid als ter hoogte van de blaas en renale tubuli en zorgt op die manier voor reabsorptie van water22,23. 3.3.3. Ademhaling Huidademhaling is het best gekend bij amfibieën, maar ook andere klassen zoals reptielen en vissen maken gebruik van dit type ademhaling. Het kan ademhaling doorheen longen (adulten) of kieuwen
7
(amfibieënlarven en neotene amfibieën) aanvullen en in sommige gevallen zelfs volledig vervangen zoals bij salamanders van de familie Plethodontidae24. Zowel de huid als het circulatiestelsel zijn aangepast om de regulatie van CO2 en O2 uitwisseling mogelijk te maken. Dezelfde karakteristieken die de huid effectief maakt als ademhalingsorgaan maken de huid ook eveneens gevoelig aan waterverlies24. In verschillende studies omtrent huidademhaling werden de huid en de longen in functie van ademhaling met elkaar vergeleken en werden de beperkingen van huidademhaling naar voor geschoven24,25. Zo zal bij long- en kieuwademhaling, t.g.v. de dunne membraan waardoor de gasuitwisseling gebeurt, snel een evenwicht worden opgebouwd tussen gasconcentraties in het bloed en in het ademhalingsmedium (lucht/water). Deze snelle diffusie maakt het voor dieren met kieuw- of longademhaling mogelijk gasuitwisseling te reguleren door het beïnvloeden van de bloedvloei doorheen het orgaan. Dit is in tegenstelling met huidademhaling waarbij het opdrijven van de bloedvloei weinig effect heeft op de totale gasuitwisseling omdat de gasuitwisseling, ten gevolge van de relatief dikke huid, diffusie gelimiteerd is. Dit wil zeggen dat de gasuitwisseling doorheen de membraan trager verloopt dan de aan- en afvoer van bloed naar de huid. Het evenwicht dat zich opbouwt aan beide zijden van de membraan wordt beschreven in de diffusiewet van Fick: “de mate van gasuitwisseling is proportioneel met het verschil tussen partiële gasdruk in het medium en de partiële gasdruk in het bloed”. Deze wet roept meteen een aantal beperkingen op omtrent huidademhaling. Bijvoorbeeld, wanneer het medium waarin het dier zich bevindt een grotere partiële CO2 druk heeft dan het bloed, zal CO2 opgenomen in plaats van te worden uitgescheiden. Omgekeerd geldt natuurlijk ook dat O2 verloren gaat wanneer het hoger is in het bloed dan de omgeving. Uit het voorgaande lijkt het er op dat huidademhaling een slecht gereguleerd en passief proces is, maar niets is minder waar25. Amfibieën hebben een aantal mechanismen ontwikkeld die huidademhaling omvormen tot een efficiënte manier van gasuitwisseling. Men kan deze mechanismen opbouwen in 2 soorten, enerzijds permanente morfologische aanpassingen en anderzijds aanpassingen in respons op de onmiddellijke respiratoire noden24. Omdat de mate van gasuitwisseling afhankelijk is van het totale huidoppervlak zullen sommige soorten hun huidoppervlak
vergroten.
Een
typisch
voorbeeld
hiervan
de
ontwikkeling
van
bepaalde
huidaanhangsels bij mannelijke dieren tijdens het paarseizoen als respons op de hogere zuurstofbehoefte ten gevolge van de paringsrituelen. Zo ontwikkelt de mannelijke harige kikker (Astylosternus robustus), kleine dermale papillen op het achterlichaam. Andere morfologische veranderingen zijn een lange staart/lichaam, bijkomende huidplooien en reductie van de huiddikte of beter, de diffusiebarrière. Dit laatste moet men beschouwen als een vermindering in afstand tussen het ademhalingsmedium en de huidcapillairen en niet als een reductie van de totale huiddikte. De voorafgaande besproken aanpassingen hebben zich allen ontwikkeld over een langere periode en zullen dus niet van belang zijn indien een dier in plotse zuurstofnood verkeert. Om deze noden te compenseren zijn amfibieën in staat tot capillaire rekrutering
24,25
. Dit wil zeggen dat niet steeds alle
capillairen continu bevloeid zijn zodat er nog een reserve aanwezig is. Omgekeerd kan op deze manier ook O2 verlies beperkt worden wanneer het dier in een O2 arme omgeving terecht komt. Gedragsveranderingen spelen, net zoals bij osmoregulatie, ook hier een belangrijke rol24,25,26. Amfibieën gaan bepaalde bewegingen doen toenemen bij een lage O2 concentratie. Dit is te begrijpen
8
als men bedenkt dat beweging invloed heeft op de partiële druk van de gassen in huidcapillairen en het respiratoir medium. Wanneer zowel het dier als medium stationair zijn zal O2 diffusie vanuit het medium in de huid leiden tot de opbouw van een grenszone met lage partiële O2 druk wat tot gevolg heeft dat de gasuitwisseling zal afnemen (zie wet van Fick). Beweging van het dier leidt tot het verdwijnen van deze grenszone en dus tot een toename van O2 diffusie langsheen de huid. Een ander belangrijk controlepunt is de mate van oxygenatie van het bloed. Door te controleren of het bloed vloeiend doorheen de huid zuurstofarm of zuurstofrijk is, kan de hoeveelheid O2 en CO2 dat doorheen de huid diffundeert aangepast worden24.
Figuur 3: het circulatoir systeem van amfibieën. Dit systeem laat toe dat O2 arm bloed naar de huid stroomt waardoor zuurstof diffusie doorheen de huid toeneemt. Ondanks dat zuurstofarm en zuurstofrijk bloed gemengd wordt in het ventrikel vindt er toch een scheiding plaats van zuurstofarm bloed naar de pulmocutane arteries en zuurstof rijk bloed naar systemische arteries. Het zuurstofarm bloed in de pulmocutane arteries kan vervolgens naar de longen/huid gestuurd worden afhankelijk van het meest efficiënte gasuitwisselingsorgaan op dat moment (uit Feder & Burggren, 1985)24.
Cutane gasuitwisseling is het meest effectief als enkel O2 arm bloed doorheen de huid vloeit omdat het verschil in partiële druk dan het grootst is. Amfibieën zijn, in tegenstelling tot andere vertebraten, in staat om O2 arm bloed in de systemische circulatie te verkrijgen (figuur 3)24. Dit is o.a. mogelijk door de onvolledige scheiding van het rechter en linker hart waardoor zuurstofarm bloed rechtstreeks naar de huid kan vloeien zonder eerst langs de longen te passeren. Het bloed kan het ventrikel verlaten via
9
2 wegen, enerzijds de systemische arteries die O2 rijk bloed naar de hersenen, spieren, viscera en huid transporteren en anderzijds de pulmocutane arteries die O2 arm bloed naar de longen sturen via de pulmonale arteries en naar de huid via cutane arteries. Doorheen welke arteries (cutaan of pulmonaal) het O2 arm bloed gestuurd wordt is afhankelijk van de O2 en CO2 concentratie in beide respiratoire organen24,25.
3.4. Het immuunsysteem Het immuunsysteem van vertebraten kan ingedeeld worden in een aangeboren, aspecifiek systeem en een verworven, specifiek systeem. Het aspecifieke immuunsysteem reageert snel en altijd op dezelfde manier. Het is een eerstelijns defensie tegen pathogenen maar speelt ook een belangrijke rol in het opstarten van het specifieke immuunsysteem28,29. Het aspecifieke immuunsysteem van amfibieën verschilt nauwelijks met dat van zoogdieren29,30. Het bestaat uit een externe barrière, namelijk de huid en mucosae, en een interne barrière die cellen (macrofagen, neutrofielen en natural killer cellen) en antimicrobiële peptiden (complement, acute fase proteïnen, interferon) omvat28,29,31. De effectorcellen elimineren geïnfecteerde cellen en pathogenen door fagocytose (neutrofielen en macrofagen) of door directe cytotoxiciteit (natural killer cellen). Bovendien zijn de effectorcellen in staat tot productie van cytokines die de immuunrespons verder stuurt28,29,31. Een zeer belangrijke factor in het aspecifieke immuunsysteem van amfibieën zijn de antimicrobiële peptiden (AMP’s) geproduceerd door de granulaire klieren in de dermis. Deze klieren, en dus AMP’s, zijn pas terug te vinden na metamorfose15,18,32. AMP’s bestaan uit 10-46 aminozuren en zijn actief tegen zowel Gramnegatieve als Gram-postieve bacteriën, fungi, virussen en protozoa. Elk species produceert een specifieke set van peptiden die werkzaam zijn tegen een variëteit van micro-organismen. De meeste van deze peptiden zijn amfipatische, kationische peptiden met een helicale structuur. Door deze eigenschappen binden ze met de negatief geladen fosfolipiden van de membraan en verstoren ze de structuur19,20. De reactie van het specifieke immuunsysteem is trager, maar wel specifiek gericht tegen een bepaald antigeen. Na activatie zullen geheugencellen in het lichaam aanwezig blijven zodat bij een 2de blootstelling aan hetzelfde antigeen de reactie sneller en sterker is28,29,31. De meeste kennis omtrent het verworven immuunsysteem komt voor Anura uit studies met Xenopus laevis en voor Caudata uit studies met de axolotl (Ambsytoma mexicanum)31. Uit deze studies blijkt dat het specifieke immuunsysteem (zowel de humorale als de cellulaire component) van de axolotl, ondanks de aanwezigheid van B-cellen, T-cellen, T-cel receptoren, MHC-proteïnen en immunoglobulines veel minder goed ontwikkeld is dan dat van de anuren en zoogdieren33,34. Zo wordt de humorale respons enkel gemedieerd door IgM, leidt een 2de blootstelling aan hetzelfde antigen niet tot een snellere en sterkere respons35 en blijken T-cel gemedieerde allograft reacties zich veel trager te ontwikkelen33. Indien het immuunsysteem van Xenopus laevis gelijkaardig is aan dat van andere anuren dan is het specifieke immuunsysteem van deze orde grotendeels gelijkaardig aan dat van zoogdieren. Anura ontbreken lymfeknopen en lymfopoëse gaat niet door in het beenmerg Ze hebben wel een milt en thymus en de differentiatie van B-cellen gaat door in de lever en de milt31,36. Bovendien zijn de Bcellen, in tegenstelling tot B-cellen van zoogdieren, in staat tot fagocytose37. B-lymfocyten van
10
Xenopus laevis produceren 3 klassen immunoglobulines, namelijk IgM, IgX, IgY. In Silurana tropicalis werden ook nog IgF en IgD gevonden29,37. IgM is het meest geproduceerde en het wijdst verspreide immunoglobuline, IgX komt voor t.h.v. de darmen, milt en lever en kan beschouwd worden als analoog van het IgA van zoogdieren. IgY komt voor in de lever, milt en in het bloed, maar niet t.h.v. de darmen39. Verschillende stressoren kunnen een invloed hebben op de werking van het immuunsysteem. Deze stressoren zijn factoren die endogene productie van corticosteroïden veroorzaken3,31. Corticosteroïden kunnen op korte termijn bijdragen aan overleving maar zullen op lange termijn leiden tot suppressie van T-lymfocyten en een verminderde productie van antilichamen. Koude, predatie, een slechte waterkwaliteit, voedseltekort, UV-B licht en tal van andere factoren kunnen beschouwd worden als stressoren31. Ook ontwikkelingsgebonden veranderingen kunnen een effect hebben op het immuunsysteem. De
verschillende componenten van
het immuunsysteem ontwikkelen op
verschillende momenten en volledige immunocompetentie wordt vaak pas bereikt na de metamorfose. Deze metamorfose gaat gepaard met een stijging van glucocorticoïden, thyroïd hormonen en groeihormoon40,41. De stijging van glucocorticoïden leidt tot apoptose van lymfocyten. Hoewel deze tijdelijke immunosuppressie normaal zonder neveneffecten overleefd wordt kunnen er wel problemen optreden indien de metamorfose plaatsvindt in een amfibie met een ondermaats(e) lichaamsgrootte en immuunstatus. Dit kan gebeuren onder invloed van bepaalde stressoren en leidt tot een massalere destructie van lymfocyten waardoor de dieren veel gevoeliger worden aan infecties42,43,44,45.
Een
mogelijke reden voor deze glucocorticoïd-geïnduceerde apoptose is waarschijnlijk dat de lymfocyten van larven tolerant moeten worden aan nieuwe adult-geassocieerde moleculen en dat de lymfocyten die reageren op de oude larvale moleculen vernietigd moeten worden46,47,48. Een ander opvallend fenomeen is dat larven van Xenopus laevis geen MHC-1 proteïnen tot expressie brengen terwijl deze expressie toeneemt vanaf het begin van de metamorfose en het eerst wordt waargenomen op erythrocyten48,49,50. De expressie van MHC-2 proteïnen op T-cellen wordt ook pas opgemerkt na de metamorfose51. In neotene soorten, zoals de axolotl, treedt er geen metamorfose op door het gebrek aan thyroid stimulating hormone (TSH). De ontwikkeling van het immuunsysteem is leeftijdsafhankelijk en is voltooid op een leeftijd van ongeveer 1 jaar52,53. 4. RANAVIROSE 4.1. Taxonomie en karakteristieken De familie Iridoviridae, waartoe ranavirussen behoren, bestaat uit grote (120-300 nm) dubbelstrengige DNA virussen met een icosahedrale structuur. Zowel naakte virions als virions met enveloppe zijn infectieus. Ze hebben een lineair genoom bestaande uit 102-212 kbp. Deze familie omvat 5 genera waarvan 2 enkel invertebraten infecteren (Iridovirus en Chloriridovirus) en 3 die koudbloedige vertebraten infecteren (Ranavirus, Lymfocystivirus en Megalocytivirus)54. Terwijl lymfocystivirussen en megalocystivirussen enkel vissen infecteren, komen ranavirussen voor bij zowel vissen, reptielen als amfibieën. Het genus Ranavirus kan worden opgedeeld in verschillende species gebaseerd op multiple criteria zoals gastheerbereik, sequentie van het genoom, proteïne- en restrictie-fragmentlengte-polymorfisme profielen54,55. Het genoom van ranavirussen bevat ongeveer 105 kbp en is
11
gemethyleerd54. Deze methylatie gebeurt door het virale enzym ‘DNA-methyltransferase’ en zou het genoom beschermen tegen endonucleases van de gastheer. Het gemethyleerd genoom leek een karakteristiek te zijn van Iridovirussen die in staat zijn vertebraten te infecteren, maar dit werd in twijfel getrokken wanneer het Singapore grouper iridovirus (SGIV) geïsoleerd werd dat geen gemethyleerd genoom heeft
56,57
. Een ander belangrijke criteria voor de karakterisatie van ranavirussen is de
sequentie van een basepaar regio in het gen dat codeert voor het ‘Major Capsid Protein’ (MCP), een proteïne dat sterk geconserveerd is tussen de verschillende species van ranavirussen55. Momenteel zijn er 6 species erkend, waarvan er 4 species amfibieën infecteren: Ambystoma tigrinum virus (ATV), Bohle iridovirus (BIV), Frog Virus 3 (FV3) en Rana catesbeiana virus Z (RCV-Z)55,58,59. European Catfish Virus (ECV) en Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus hematopoëtisch (EHNV) infecteren enkel vissen (figuur 4).
Figuur 4: Een schematische voorstelling van de taxonomie van Iridoviridae. ATV= Ambystoma tigrinum virus; BIV= Bohle iridovirus; FV3= Frog virus 3; RCV-Z= Rana Catesbeiana Virus Z; EHNV= Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus; ECV= European Catfish Virus.
Hoeveel ranavirus soorten er precies zijn is nog niet geheel duidelijk en het onderscheid tussen een nieuwe soort en een nieuwe stam is soms moeilijk te maken, zeker indien de opbouw van het genoom niet volledig achterhaald is. Om deze reden krijgen nieuwe isolaten vaak een informele naam zoals bv. het Common midwife toad virus (CMTV) dat voor het eerst geïsoleerd werd in Spanje, maar ondertussen ook in Nederland geassocieerd werd met sterfte in amfibieënpopulaties7,60. 4.2. Ecologie 4.2.1. Reservoirspecies Ranavirussen kunnen multiple gastheerspecies infecteren. De vatbaarheid voor infectie en ziekte varieert vaak sterk tussen species, waarbij de minst vatbare species kunnen optreden als reservoir6164
. De transmissie van ranavirussen kan gebeuren tussen dieren van eenzelfde species (intraspecies
transmissie), tussen dieren van verschillende species (interspecies transmissie) en mogelijk zelfs tussen verschillende genera (interklasse transmissie)3,61,65,66-70. Er wordt verondersteld dat species waarvan de larven en adulten overwinteren in het water belangrijke reservoirs zijn aangezien ze continu virus uitscheiden en, door hun verworven immuniteit t.g.v. herhaalde blootstelling, zelf weinig problemen vertonen66. In amfibieën met een complexe levenscyclus waarbij larven en adulten niet overwinteren in het water is het mogelijk dat 1 ontwikkelingsstadium fungeert als intraspecies reservoir voor een ander stadium. Dit mechanisme werd aangetoond in salamanders blootgesteld aan ATV, een erg virulent virus dat normaal sterfte veroorzaakt binnen de 2-3 weken67. De transmissie tussen larven, die meestal leven in dense populaties, verloopt vlot waardoor er een epizoötie kan ontstaan.
12
Vele larven sterven, maar diegene die de metamorfose overleven zijn soms chronisch geïnfecteerd. De juveniele/adulte dieren leven in veel minder dense populaties waardoor transmissie tussen de dieren minder vanzelfsprekend is. Wanneer de chronisch geïnfecteerde dieren terug keren naar het water om zich voort te planten kunnen ze op die manier naïeve larvale populaties infecteren en aanleiding geven tot recurrente epizoötieën. In dit systeem zijn de larven dus de ‘gastheer’ die zorgen voor een toenemende virale prevalentie, en de chronisch geïnfecteerde adulten zijn het ‘reservoir’ die zorgen voor persistentie van het virus tussen opeenvolgende epizoötieën. Ranavirussen voorkomend bij amfibieën werden ook reeds geïsoleerd bij reptielen en vissen en in sommige gevallen geassocieerd met ziekte
65,68-70
. De mate waarin reptielen en vissen belangrijk zijn als reservoir voor
amfibieën is afhankelijk van het type ranavirus en gastheer, maar de impact ervan is nog onduidelijk. 4.2.2. Transmissieroutes De transmissie bepaalt sterk de impact van het pathogeen op de populatie, en om preventie- en eradicatiestrategieën op te starten is het noodzakelijk om het spreidingsmechanisme van een ziekte te achterhalen71. We kunnen een onderscheid maken tussen directe en indirecte transmissie. Directe transmissie vereist onderlinge interactie tussen dieren en wordt bijgevolg beïnvloed door de densiteit van de populatie. Voor indirecte transmissie is er nood aan persistentie van het virus in de omgeving3,62. 4.2.2.1. Directe transmissie Directe transmissie kan plaatsvinden via zowel beschadigde als intacte huid. Contact gedurende 1 seconde zou al voldoende zijn om infectie te veroorzaken72, bijgevolg kan elk fysiek contact tussen amfibieën leiden tot infectie. Ook orale opname van geïnfecteerd weefsel blijkt een efficiëntie transmissieroute te zijn. Verschillende studies toonden aan dat de mortaliteit hoger was, en sneller verliep, indien larven de kans kregen om te eten van geïnfecteerde karkassen72-74. Verticale transmissie van ranavirose zou mogelijk kunnen zijn maar werd nog niet bewezen. Wel werden er reeds eitjes gevonden positief voor ranavirose, maar deze infectie kan ook hebben plaatsgevonden in de cloaca66,75. 4.2.2.2. Indirecte transmissie Indirecte transmissie kan slechts plaatsvinden indien het virus in staat is om te persisteren in de omgeving. Voor aquatische larven en adulten zijn water en sediment effectieve transmissieroutes voor ranavirussen. In meerdere studies werd aangetoond dat water en sediment dat voordien in contact kwam met geïnfecteerde dieren in staat is om infectie en ziekte te veroorzaken in een naïeve populatie72-74,76. Voor landbewonende species kan ook de bodem een belangrijke infectiebron zijn, tenminste als deze vochtig blijft. Brunner en collega’s vergeleken de virulentie van ATV in zowel vochtige bodem als gedroogde bodem van 3 verschillende vijvers waaruit bleek dat enkel vochtige bodem in staat was naïeve larven te infecteren72. Hoe lang ranavirussen kunnen persisteren in de omgeving is niet precies geweten, maar verschillende studies tonen aan dat dit mogelijk enkele weken tot maanden kan bedragen72,77-79. Bovendien zal de persistentie van het virus mede afhankelijk zijn
13
van de temperatuur en de watersamenstelling72,77. De transmissie van ranavirose is dosisafhankelijk en een dosis van 2 x 104 virions in het water zou voldoende zijn om infectie te veroorzaken72,73,77,80. 4.2.3. Vatbaarheid en virulentie Een vatbaar individu is een individu dat het risico loopt om geïnfecteerd te worden, terwijl virulentie kan gezien worden als een maat voor de hoeveelheid schade die een micro-organisme aanricht in de gastheer. Of een individu geïnfecteerd en uiteindelijk ziek wordt is afhankelijk van een combinatie van risicofactoren
die
ingedeeld
kunnen
worden
in
gastheerfactoren,
omgevingsfactoren
en
virusgeassocieerde factoren (figuur 5).
Figuur 5: Een schematische voorstelling van de interacties tussen gastheerfactoren (geel), omgevingsfactoren (blauw) en virusgeassocieerde (rood) die aanleiding kunnen geven tot het ontstaan van ziekte (zwart).
Het begrijpen van de bijdrage van elk van deze factoren is belangrijk om er achter te komen of de toenemende morbiditeit en mortaliteit door ranavirose te wijten is aan een toegenomen agressiviteit van de isolaten of eerder het gevolg is van immunosuppressie die mogelijk gerelateerd is aan omgevingsgebonden stressoren31,81. De term stressor wordt in de ecologie gebruikt in de brede zin van het woord, namelijk elke verandering waaraan het dier niet volledig is aangepast, ongeacht of het wel dan niet een verhoogde corticosteroïdenproductie veroorzaakt. 4.2.3.1. Gastheerfactoren Ranavirussen kunnen alle klassen behorende tot de ectotherme vertebraten infecteren, maar de verschillende isolaten vertonen een specificiteit betreffende species en leeftijd55,58. Terwijl men van ATV vermoedt dat het enkel tijgersalamanders infecteert65, zijn FV3 en BIV in staat om zowel vissen, amfibieën als reptielen te infecteren68,82. Uit studies met FV3 geïnfecteerde Xenopus laevis blijkt dat adulten vrijwel resistent zijn aan het virus, terwijl het virus voor kikkervisjes sterk pathogeen is83,84. Het immuunsysteem van adulte kikkers dat voor de eerste maal geïnfecteerd wordt met FV3 is in staat het virus te elimineren binnen 20-30 dagen. Deze klaring gaat gepaard met een piek in de cellulaire en humorale immuniteit en met het verdwijnen van symptomen85. Kikkervisjes daarentegen zijn vaak niet in staat om het virus te overwinnen, en een groot percentage sterft aan de infectie binnen 2 maanden83,84. Na een 2de infectie zijn de adulten sneller virusvrij, treden er geen symptomen meer op en kan er een sterke humorale respons van het IgY isotype worden aangetoond36,84. De antistoffen kunnen tot 8 weken aanwezig blijven en bieden dus een langdurige bescherming86. Zowel de hogere
14
vatbaarheid van de kikkervisjes voor FV3 als de sterkere immuunrespons na herhaalde blootstelling benadrukken de kritieke rol van CD8+ T-cellen en MHC-1 klasse proteïnen voor een effectieve antivirale respons. Net zoals bij zoogdieren herkennen en lyseren CD8+ T-cellen geïnfecteerde cellen die MHC-1 tot expressie brengen i.c.m. virale antigenen84. Zoals hogerop besproken brengen anuren pas MHC-1 proteïnen tot expressie nadat ze metamorfose hebben ondergaan, wat de hogere vatbaarheid van kikkervisjes in vergelijking met adulten kan verklaren48, 49, 50. De immunosuppressie geassocieerd met metamorfose zorgt ervoor dat amfibieën in dit stadium van de ontwikkeling het meest vatbaar zijn voor ranavirose42,47. De snellere virale klaring na herhaalde infectie is te wijten aan de opbouw van CD8+ geheugencellen die aanwezig blijven na de primaire infectie. Proliferatie van CD8+ T-cellen in de milt kon reeds worden waargenomen op dag 3 postinfectie en 3 dagen later kon het virus niet meer worden gedetecteerd, terwijl dit na een primaire infectie respectievelijk 6 en 20-30 dagen duurt84. Verschillen in het MHC genotype zouden kunnen verklaren waarom bepaalde individuen binnen een species meer vatbaar zijn voor ranavirose dan anderen. Voor vogels en zoogdieren werd reeds bewezen dat homozygositeit en bepaalde MHC haplotypen aanleiding kunnen geven tot een hogere vatbaarheid voor infecties87. Gantress en collega’s vergeleken de immuunrespons op FV3 infectie van wild-type Xenopus laevis met ingeteelde lijnen van deze soort, waarbij men er van uitgaat dat wild-type individuen MHC heterozygoot zijn en inteeltlijnen homozygoot zijn. Hieruit blijkt dat de homozygote lijnen 2 maal meer tijd nodig hadden om het virus te bestrijden in vergelijking met de heterozygote individuen. Deze trend werd nog duidelijk wanneer men het experiment herhaalde met kikkervisjes: voor inteeltlijnen kon er 100% morbiditeit binnen de 2 weken postinfectie worden waargenomen in vergelijking met 80% na 2 maanden voor wild-type Xenopus 83 laevis .
4.2.3.2. Omgevingsfactoren Omgevingsgebonden factoren kunnen ingedeeld worden in natuurlijke stressoren en anthropogene stressoren. Een belangrijke natuurlijke stressor is de omgevingstemperatuur. Zowel voor anuren als salamanders werd bewezen dat koude temperaturen aanleiding geven tot een verminderde proliferatie van
T-lymfocyten
en
eosinofielen
en
een
verminderde
complementactiviteit88-90.
Deze
temperatuursafhankelijke immuniteit kan een aanpassingsmechanisme zijn aan de lagere groeiratio van pathogenen bij lagere temperaturen om op die manier energie uit te sparen90. Dit is echter niet zonder gevolgen. In verschillende studies werd aangetoond dat, ondanks de verminderde replicatieratio, de morbiditeit en mortaliteit aan ranavirose bij lage temperaturen duidelijk hoger is77,91. Blootstelling aan predatoren en competitie voor voedsel kunnen aanleiding geven tot stress en dus tot vrijstelling van corticosteroïden wat de dieren vatbaarder kan maken voor pathogenen92. Hoe groot de impact hiervan is voor ranavirose is niet geweten. Ook voortplanting kan gezien worden als een natuurlijke stressor. Voortplanting bevordert transmissie door aggregatie van amfibieën rond broedplaatsen en direct contact tussen individuent3. Anthropogene stressoren zijn stressoren die tot stand komen onder invloed van de mens. Zowel de hogere concentraties van ammoniak, nitraat en nitriet in het water t.g.v. veeteelt als het gebruik van pesticiden dragen bij tot een slechte waterkwaliteit91,93,94. Verschillende studies toonden aan dat
15
pesticiden, zowel bij anuren als salamanders, zorgen voor een verminderde proliferatie van lymfocyten95,96. Dit, samen met veranderingen in de habitat van amfibieën gepaard gaande met landbouw97, maken dat agricultuur een belangrijke rol speelt in de afname van amfibieënpopulaties en sterfte ten gevolge van ranavirussen91,98. De gevolgen van een verhoogde blootstelling aan ultravioletB straling t.g.v. een reductie van de ozonlaag werd reeds aangetoond voor zoogdieren99. In hoeverre deze resultaten geëxtrapoleerd mogen worden naar amfibieën en wat het effect is voor de vatbaarheid voor ranavirose is niet duidelijk31. Habitatfragmentatie kan, bijkomend aan de directe effecten op de individuele overleving, leiden tot een verminderde genetische diversiteit van natuurlijke populaties, en kan op die manier een belangrijke bijdrage leveren aan de verhoogde vatbaarheid voor pathogenen, inclusief ranavirussen83,100. De mens kan eveneens zorgen voor de spreiding en introductie van nieuwe ranavirusisolaten in naïeve gebieden, dit fenomeen wordt ook wel ‘pathogeen pollutie’ genoemd101. Dit kan onder andere door larven te gebruiken als lokaas tijdens het vissen71,102, door het transporteren van gecontamineerd water en voorwerpen, of door het verhandelen van geïnfecteerde dieren103. 4.2.3.3. Virusgeassocieerde factoren Zowel viruskarakteristieken als variatie in dosis van het inoculum kunnen de virulentie beïnvloeden. Welke virale genen bijdragen tot een verhoogde virulentie is niet geweten, maar het lijkt weinig waarschijnlijk dat de toegenomen morbiditeit en mortaliteit door ranavirose te wijten is aan virale mutaties, aangezien Iridoviridae evolutionair niet veel veranderd zijn81,104. Studies met kikkervisjes van luipaardkikkers (Lithobates pipiens), boskikkers (Lithobates sylvatica), Italiaanse springkikkers (Rana latastei) en larven van tijgersalamanders (Ambystoma tigrinum) toonden aan dat de infectieratio en mortaliteit stijgen bij een toenemende dosis van FV3 of ATV, terwijl de overlevingstijd daalt66,72,73,105. In het experiment met tijgersalamanders nam de kans op mortaliteit toe met een factor van 2.4 voor elke tienvoudige stijging in de dosis van ATV72. Deze trend kon niet worden waargenomen bij een hoge populatiedensiteit72,105. De stress veroorzaakt door de hoge densiteit overheerst in dit geval de negatieve effecten veroorzaakt door het virus105. 4.3. Pathologie 4.3.1. Symptomen en macroscopische letsels De impact van een ranavirusinfectie kan variëren van geen symptomen tot erge letsels en snelle dood. Hoewel sterfte vaak het enige klinisch teken is dat opgemerkt wordt, werden ook andere symptomen zoals erratisch zwemmen, lethargie, anorexie en verlies van evenwicht beschreven106-109. Bij salamanders kan bijkomend ook nog hematemesis, bloederige faeces en de productie van kleverig dik slijm dorsaal en t.h.v. de staart worden opgemerkt106,109. Uitwendig zichtbare letsels bestaan uit zwelling t.h.v. de poten en het lichaam, huidverkleuringen, erytheem t.h.v. de poten en het ventrum, en multifocale bloedingen t.h.v. de huid en rond de anus106-110 . Bij salamanders kunnen nog aanvullende letsels worden waargenomen zoals bloedingen plantair t.h.v. de voetjes en staart, en oedeem in het thoracale gebied en de keelregio104,105. Terwijl bloedingen en zwellingen de belangrijkste letsels zijn in larven, komen huidulceraties vooral voor in adulten66,106. Inwendige
16
macroscopische letsels die na autopsie kunnen worden waargenomen zijn petechiën en ecchymosen in interne organen (vooral t.h.v. de nieren en de lever), een gezwollen en bleke lever, vocht in de coeloomholte en een leeg gastro-intestinaal stelsels met vergrootte galblaas t.g.v. anorexie106-108, 110,111
. In een experimentele studie met tijgersalamanders geïnjecteerd met ATV konden cutane
poliepen worden waargenomen die denser werden naarmate het ziekteproces vorderde en uiteindelijk de hele huid gingen bedekken109, deze letsels werden nog niet waargenomen in veldstudies.
Figuur 6: 1) Adulte salamander (Tylotriton kweichowensis) met huidulceraties (pijl) (uit Pasmans et al., 2008)6. 2) Kikker met multiple bloedingen in de huid (pijlen) (uit Kik et al, 2011)7. 3) Dood metamorfoserend kikkervisje met bloedingen in de huid (zwarte pijl) en subcutaan oedeem van de poten (witte pijl) (uit Kik et al, 2011)7.
De casereports, aangehaald in de inleiding, rapporteerde letsels consistent met de hierboven beschreven letsels. In de eerste case werd autopsie uitgevoerd op 18 dieren, de resultaten waren als volgt: 6/18 vertoonden huidulceratie (figuur 6:1) , 2/18 oedeem en niet-ontwormde dieren hadden een massale longworminfectie (Rhabdias tokyoensis) met wormen in de longen en migrerende larven in de lichaamsholte (10/10)6. In de tweede case werd autopsie uitgevoerd op 8 kikkers. De huid van kikkers vertoonde focaal grijsverkleuringen, erytheem en bloedingen (figuur 6: 2 + 3), de levers waren vergroot en bleek, en de nieren waren bleek7. 4.3.2. Microscopische letsels De histologische letsels veroorzaakt door verschillende genera van iridovirussen in verschillende gastheerspecies
zijn
grotendeels
gelijkaardig
en
worden
gekenmerkt
door
basofiele
106-111
intracytoplasmatische inclusies gepaard gaande met necrose en bloedingen
. Deze letsels
kunnen terug gevonden worden in bijna alle orgaansystemen en komen het meest voor in de nier, lever, milt, huid en gastro-intestinaalstelsel. Het zenuwweefsel en spierweefsel blijft meestal onaangetast, hoewel uitzonderingen zijn beschreven107,110. Necrose treft vooral endotheelcellen, maar ook hepatocyten, enterocyten, en renale tubulaire epitheelcellen106,107,110,112. Huidletsels werden door Bollinger en collega’s ingedeeld in 3 types die elkaar opvolgen in de tijd104. Vroege letsels bestaan uit inter- en intracellulair oedeem t.h.v. het stratum spinosum met gebieden van ballooning degeneratie, gecondenseerde en gevacuoliseerde nuclei en vele intracytoplasmatische inclusies. Hierop volgend kunnen intra-epidermale spleten en vesikels met necrotische en gedegenereerde acanthocyten worden waargenomen. Tot slot ontstaan er focale gebieden van epidermale hyperplasie en parakeratotische hyperkeratose waarbij de intracytoplasmatische inclusies nog steeds talrijk aanwezig
17
zijn. Uit elektronenmicroscopisch onderzoek blijken deze inclusies aggregaten te zijn van parakristallijne icosahedrale virions met een diameter van 120-300nm106,111, wat typisch is voor Iridoviridae112.
1
2
Figuur 7: 1) De lever van een kikker met multifocale intracytoplasmatische inclusielichaampjes (pijlen) in de hepatocyten. 2) Transmissie elektronenmicroscopisch beeld van de lever van een kikker. Er zijn icosahedrale 7 viruspartikels te zien (pijlen) in inclusielichaampjes die zich bevinden in de hepatocyten (uit Kik et al, 2011) .
De histologische letsels die werden teruggevonden in weefsels van 3 salamanders in de eerste case waren gerelateerd aan de longworminfectie en degeneratie van secundaire follikels en zijn niet specifiek voor ranavirose6. In de 2de case werd necrose waargenomen van milt, hepatocyten (figuur 7:1), glomeruli en renale tubulaire epitheelcellen7. Basofiele intracytoplasmatische inclusies waren aanwezig in hepatocyten, endotheelcellen van de milt en glomeruli, renale tubulaire eptiheelcellen en de exocriene pancreas van de kikkers en in de lever van de salamander. Een gebied met inclusies werd geselecteerd en onderzocht met een elektronenmicroscoop. Partikels overeenkomstig met iridoviruspartikels werden teruggevonden in virale inclusies aanwezig in de lever van zowel de kikkers als de salamander (figuur 7:2). 4.4. Diagnose Om te kunnen differentiëren tussen een infectie en ziekte is het belangrijk gebruik te maken van verschillende diagnostische testen en na te gaan of deze correleren met de aanwezige klinische symptomen, gedragsveranderingen en pathologie. Voorheen beschreven macroscopische en histologische letsels kunnen een vermoeden geven van klinische ranavirose. Dit vermoeden kan bevestigd
worden
door virusisolatie, elektronenmicroscopie, immunochemie
en
moleculaire
technieken zoals PCR. Wilt men het isolaat karakteriseren tot op het species niveau, dan zijn er bijkomende technieken vereist zoals RFLP, natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese
(SDS-PAGE) en sequentie analyse van bepaalde genen111. 4.4.1. Staalname Indien men postmortem onderzoek verricht is het belangrijk dat de tijd tussen sterfte en onderzoek geminimaliseerd wordt111. Grote amfibieën laat men 30s baden in 70% ethanol, kleine amfibieën 5s en vervolgens worden ze afgespoeld met steriel water en gedisseceerd. Lever, nier, milt, long en huid
18
worden verzameld en eventueel andere weefsels indien dit relevant lijkt114. Wilt men stalen bewaren voor isolatie of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) worden deze ingevroren tussen -20 en 80°C, weefsels voor histologie worden gefixeerd in formaline114. Moleculaire testen kunnen gebeuren op vers of gefixeerd weefsel, bloed en, in geval van antemortem onderzoek, ook op faeces en swabs van de cloaca en/of mondholte115,116. 4.4.2. Histologie Histologisch onderzoek van coupes van verschillende weefsel (epidermis, nier, milt, lever) aangekleurd
met
haematoxylin-eosine
(H&E)
is
de
beste
methode
om
een
aanwezige
3
ranavirusinfectie in verband te brengen met het effectieve ziektebeeld . De uitgebreidheid van de specifieke letsels veroorzaakt door ranavirussen (zie hoger) en veranderingen t.g.v. opportunistische en secundaire pathogenen (bv. Aeromonas hydrophila) kunnen op deze manier beoordeeld worden110. Het toepassen van IHC117,118 en elektronenmicroscopie106,111,119,120 op histologische coupes kunnen vervolgens helpen om de aanwezigheid van een Iridovirus aan te tonen in bepaalde cellen. 4.4.3. Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie kan gebruikt worden om virions te detecteren in weefselscoupes (figuur 7:2) of celculturen106,111,119,120. Het classificeren van het virus kan slechts tot op het familieniveau, nl. Iridoviridae aan de hand van de typische structuur van de virions113. Andere methodes zijn dus nodig om een virus te bestempelen als zijnde ‘Ranavirus’. Indien men de weefselcoupes incubeert met antistoffen gemerkt met goudpartikels (i.e. immunogoud elektronenmicroscopie) is het mogelijk virale antigenen aan te kleuren (deze worden gezien als een zwarte stip) en te differentiëren tussen de verschillende genera121. 4.4.4. Immunochemie Immunochemie is gebaseerd op het aantonen van antigenen in weefsel m.b.v. antilichamen. Het zichtbaar maken van het antigeen-antilichaamcomplex kan op verschillende manier. Men kan het antilichaam koppelen aan een enzym (bv. peroxidase) dat, na toedienen van een substraat, een kleurreactie kan veroorzaken (immunohistochemie [IHC]). Antilichamen kunnen ook gemerkt worden met een fluorofoor of met een metaalbolletje (bv. goud), waarna het resultaat bekeken kan worden met, respectievelijk, een fluorescentiemicroscoop (immunofluorescentie) en een elektronenmicroscoop (immuno-elektronenmicroscopie)114,122. Het antiserum gebruikt in deze technieken is niet commercieel beschikbaar en wordt opgewekt in konijnen op basis van gezuiverde virions afkomstig uit het isolaat. Het is belangrijk om te weten dat de antilichamen kruisreageren met alle ranavirussen, met als gevolg dat deze technieken niet kunnen differentiëren tussen de verschillende ranavirusspecies123. 4.4.4.1. IHC Een methode om ranavirussen te detecteren m.b.v. immunohistochemie werd beschreven door Reddacliff & Whittington op basis van een EHNV infectie in een regenboogforel (Oncorhynchus mykiss)117. Het peroxidase enzym dat in deze studie en in vele andere studies gebruikt werd109,116
19
geeft als resultaat een bruine aankleuring van het virale antigen dat vooral zichtbaar zal zijn in gebieden die necrose omgeven (figuur 8.1)114. Een ander veel gebruikt enzym is alkalische fosfatase wat een paarse kleuring geeft van de virale antigenen (figuur 8.2)117.
Figuur 8: IHC van de nier. 1) Glomerulus positief voor ranavirus antigen aangetoond d.m.v. de peroxidase 111 kleuring (uit Balseiro et al., 2009) . 2) Renaal interstitium positief voor ranavirus antigen aangetoond d.m.v. alkalische fosfatase kleuring (uit Cunningham et al., 2008)117.
4.4.4.2. ELISA Het principe van een ELISA test is dat viruspartikels gevangen worden door antilichamen die gecoat werden op de bodem van een recipiënt122. Vervolgens worden secundaire antilichamen toegevoegd die gemerkt zijn met peroxidase. Na toevoegen van het substraat, nl. waterstofperoxide, ontstaat er een kleurreactie114. Het eerste ELISA protocol voor ranavirose werd beschreven door Hyatt en collega’s en is eveneens gebaseerd op een EHNV infectie in de regenboogforel124. Dit protocol werd later geoptimaliseerd door als eerste antistof gebruik te maken van konijnenantiserum dat opgezuiverd werd door affiniteitschromatochrafie in plaats van ongezuiverd schapenantiserum. Dit geoptimaliseerd protocol leverde een sensitiviteit op van 81,2% en een specificiteit van 98,9%125. 4.4.5. Virusisolatie Virusisolatie is de gouden standaard maar duur, tijdrovend en vaak niet succesvol3,126. Het kan gebruikt worden om levend virus aan te tonen en vervolgens verder te karakteriseren m.b.v. andere technieken zoals PCR, ELISA of immuno elektronenmicroscopie. Ranavirussen worden in cultuur gebracht op viscellijnen zoals o.a. bluegill fry (BF-2)126, bullfrog tongue107, fathead minnow107,117,120 en epithelioma papulosum cyprini (EPC)106, en geïncubeerd aan een temperatuur tussen 15 en 25°C105,112. De cellen dienen dagelijks geëvalueerd te worden op cytopathisch effect (CPE) dat zich uit in focale lyse omgeven door ronde granulaire cellen. Deze veranderingen breiden zich uit in de volledig monolayer welke vervolgens zal loslaten en desintegreren114. Indien er na 2 weken geen cytopathisch effect kan worden waargenomen is het aan te raden een extra passage uit te voeren en opnieuw 2 weken te incuberen vooraleer de stalen negatief te verklaren106,107,127. Aangezien virusisolatie vaak niet succesvol is, kan infectie niet uitgesloten worden op basis van een negatieve isolatie.
20
4.4.6. Moleculaire technieken 4.4.6.1. PCR D.m.v. PCR is het mogelijk uit een kleine hoeveelheid DNA een specifiek deel te amplificeren. Dit gebeurt aan de hand van een primer (een klein stukje RNA) dat specifiek aangemaakt werd om het DNA stukje van interesse te vermeerderen. Wanneer er voldoende DNA aangemaakt is kunnen de DNA strengen gescheiden worden d.m.v. agarosegelektroforese en zichtbaar gemaakt worden met ethidiumbromide, wat resulteert in een bandenpatroon119. Om ranavirussen aan te tonen worden meestal oligonucleotide primers gebruikt die complementair zijn met regio’s in het MCP gen127,128. Hyatt en collega’s publiceerde primers die in staat zijn het volledige ranavirus MCP gen te amplificeren in 3 overlappende fragmenten123. Ook primers specifiek voor regio’s in andere genen, zoals DNApolymerase129,111 en DNA-methyltransferase128, werden reeds gebruikt voor het opsporen van ranavirussen. De PCR test op basis van het MCP gen is specifiek voor ranavirussen maar kan niet differentiëren tussen verschillende species130. Om de hoeveelheid oorspronkelijk virus in een staal te bepalen kan men gebruik maken van kwantitatieve PCR (qPCR)
80,131,132
. Hiervoor wordt gebruikt
gemaakt van primers gemerkt met fluorescerende probes. Van zodra de PCR op gang komt zullen de probes afgebroken worden en wordt er licht uitgezonden. Des te meer DNA er aangemaakt wordt, das te sterker het signaal wordt. Het aantal cycli waarbij het signaal boven de detectiegrens uitkomt (treshold cyclus of Ct-waarde) is een maat voor de oorspronkelijk DNA concentratie in het staal. Aan de hand van Ct-waarden van referentiestalen wordt er een ijklijn opgesteld waaruit de concentratie kan worden afgeleid. Verschillende studies toonden aan de qPCR sensitiever is dan conventionele PCR in het detecteren van een virusinfectie
80,131,133
. De invloed van de staalname op de resultaten van
de PCR test en het voorkomen van vals-positieve en –negatieve resultaten wordt verder besproken onder ‘surveillance’120. 4.4.6.2. RFLP en SDS-PAGE Restrictie-enzymen zijn proteïnen die fosfodiësterbindingen tussen nucleotiden in het DNA hydrolyseren (‘knippen’). De knipplaats is kenmerkend voor het enzym. Met deze enzymen kan het DNA dus in verschillende fragmenten geknipt worden, nl. restrictiefragmenten, die vervolgens op basis van lengte gescheiden kunnen worden d.m.v. gelelektroforese. Na southern blotting en hybridisatie van de fragmenten met een gelabelde probe, kunnen de fragmenten zichtbaar gemaakt worden met fluorografie, wat resulteert in een restrictie enzymprofiel122. Verschillen in knipplaatsen in een genoom leiden tot lengteverschillen van de ontstane fragmenten (lengte polymorfismen) en dus tot een ander restrictie-enzymprofiel. Omdat RFLP het volledige virale genoom in beschouwing neemt heeft deze techniek het meeste potentieel om verschillen tussen isolaten aan te tonen107. Bollinger en collega’s gebruikten o.a. deze techniek om een ranavirus (‘Regina ranavirus’), geïsoleerd uit tijgersalamanders, te onderscheiden van FV3 en andere ranavirussen en te bestempelen als een nieuw species, nl. ATV (figuur 9)106.
21
Figuur 9: Restrictie enzym profielen van viraal DNA gebruikmakend van de enzymen Hind 3 (links) en Xba 1 (rechts). Er werd viraal DNA gebruikt van FV3 en Regina ranavirus (RRV) culturen. Het RRV profiel verschilt duidelijk van het FV3 profiel en vertoont banden van een lager moleculair gewicht (uit Bollinger et al., 1991)106.
SDS-PAGE is een gelijkaardige techniek waarbij men eiwitten gaat scheiden op basis van grootte d.m.v. polyacrylamidegelelektroforese. Na visualisatie ontstaat dan weer een bandenpatroon, nl. het proteïneprofiel, dat vergeleken kan worden met de profielen van verschillende species106,107,127. 4.4.6.3. Sequentieanalyse M.b.v. sequentieanalyse kan men de volgorde van baseparen in DNA achterhalen. De meest gebruikte methode is deze van Sanger134. Door gebruik te maken van nucleotide databanken kan het resultaat vervolgens vergeleken worden met andere sequentieanalysen en kan het percentage overeenkomst bepaald worden. In 1996 werd voor het eerst sequentieanalyse uitgevoerd van een ranavirus, FV3, waarbij de basenpaar volgorde van het volledige MCP gen werd vastgelegd127. Ondertussen werd het volledige genoom van 2 species (ATV en FV3) achterhaald 135,136. De sequentie van het MCP gen is sterk gelijkend tussen de verschillende ranavirusspecies waardoor diagnostische testen gebaseerd op dit gen, enkel nuttig zijn voor detectie en niet voor de definitieve classificatie van een isolaat. De diagnose van ranavirose in de eerste case werd gesteld a.d.h.v. van virusisolatie op Viper Heart cellen (VH2), PCR en sequentie analyse van het geamplificeerde fragment6. Virusisolatie leverde na 5 dagen cytopathogene effecten op. PCR uitgevoerd op de geïnoculeerde celculturen volgens het protocol beschreven door Mao en collega’s leverde een 499bp product. Uit sequentieanalyse bleek dit fragment 99,8% gelijkheid te vertonen met FV3. In de 2de case werd PCR uitgevoerd met DNA afkomstig van ingevroren weefsels van 9 volledige kikkervisjes, ingevroren stalen van huid, lever, nier en darm van 8 adulte kikkers, en een leverstaal ingebed in paraffine afkomstig van een salamander. Uit alle stalen kwam een PCR product van 530bp dat na sequenering 100% identiek bleek te zijn aan
22
het CMTV dat geïsoleerd werd in spanje7,60. Om sterfte door Batrachochytrium dendrobatidis uit te sluiten werd een qPCR uitgevoerd die een negatief resultaat opleverde. 4.5. Monitoring en surveillance Monitoring en surveillance zijn belangrijk om de prevalentie en geografische distributie van ranavirose in kaart te brengen en op die manier een beter begrip te krijgen van de epidemiologie van ranavirussen, maar ook om preventiestrategieën te sturen en om de mogelijke impact van ranavirose op amfibieënpopulaties beter te begrijpen. Ranavirose staat op de lijst van de aangifteplichtige ziektes van de Wereldorganisatie van Diergezondheid (OIE), en de richtlijnen van deze organisatie verplichten dat amfibieën negatief moeten testen voor ranavirose alvorens ze internationaal getransporteerd worden
137,129
. Aangezien surveillance voor ranavirussen alsmaar belangrijker wordt91,138,139, neemt ook
de nood aan een goed testprotocol toe. De PCR test wordt momenteel wereldwijd gebruikt voor zowel screening als diagnosestelling129. Hiervoor worden 4 staalname procedures beschreven: het volledig organisme, enkel interne organen, stukje staart of teen (‘tail/toe clipping’) en swabs (huid, cloaca en mondholte)129,137,140. Het is belangrijk dat de resultaten van de test geïnterpreteerd worden met een begrip van de sterktes en beperkingen van deze procedures129. Het gebruik van interne organen, en dan vooral de lever, wordt aanzien als de gouden standaard (i.e. de best mogelijke benadering van de realiteit), maar de invasiviteit van deze techniek leidt tot belangrijke beperkingen. Zo is het bijvoorbeeld onmogelijk om de infectiestatus van een dier over de tijd op te volgen, wat ook tot gevolg heeft dat transmissiestudies niet correct kunnen worden uitgevoerd aangezien de initiële infectiestatus niet bekend is, en is monitoring op grote schaal uitgesloten129,137,140. Verschillende studies hebben het effect van de staalname op de betrouwbaarheid van een PCR test onderzocht129,137,140. Uit een studie met salamanders geïnoculeerd met ATV bleek dat de sensitiviteit van de PCR test toeneemt met de tijd, maar in het vroege stadium van de infectie hoger was voor homogenaten van het volledige dier dan voor ‘tail clip’ stalen. Twaalf dagen post-infectie was de sensitiviteit voor beide methoden hetzelfde (figuur 10). Een mogelijke verklaring hiervoor kan zijn dat de ‘tail clip’ stalen in het vroege stadium van de infectie nog niet voldoende virus bevatten voor PCR detectie129. Een andere studie met Amerikaanse brulkikkervisjes, geïnoculeerd met FV3, vergeleek de PCR resultaten van ‘tail-clip’ stalen en swabs (1 swab waarmee zowel de mondholte als cloaca geswabd wordt) met die van leverstalen, waarbij deze laatsten aanzien werden als de gouden standaard135. ‘Tail-clip’ stalen bleken in 20% van de gevallen vals-negatief en in 6% vals-positief, terwijl dit voor swabs respectievelijk 22% en 12% was. Indien men kiest voor een niet-lethale staalname geniet de ‘tail-clip’ methode dus de voorkeur137.
23
Figuur 10: Sensitiviteit en specificiteit over de tijd voor zowel homogenaten van het volledig dier als ‘tail clip’ 129 stalen (uit Greer & Collins, 2007) .
Men kan dus besluiten dat een niet-lethale staalname techniek voordelen heeft ten opzichte van lethale technieken, maar dat deze resultaten de ware prevalentie van ranavirose onderschatten. Dit kan leiden tot een sterke spreiding van het pathogeen alvorens de problematiek erkend wordt. 4.6. Behandeling en preventie De behandeling van amfibieën in gevangenschap tegen ranavirose bestaat in de eerste plaats uit de isolatie van aangetaste dieren, desinfectie van de omgeving en een ondersteunende therapie die gericht is op het bestrijden van secundaire bacteriële infecties en het reduceren van stress141,142. Vooraleer nieuwe dieren in een toom worden geïntroduceerd, is het belangrijk deze tijdelijk in quarantaine te plaatsen en geregeld een klinisch, virologisch en bacteriologisch onderzoek te verrichten142. Warmte ( >25°C), desinfectie, het frequent verversen van water en een beperking van de populatiedensiteit zijn goede preventieve strategieën om de kans op een uitbraak van ranavirose in gevangenschap te beperken141,142. Er bestaat nog geen ranavirusvaccin, wel werd er reeds met succes een preventief vaccin ontwikkeld tegen het Rode zeebrasem Iridovirus143. Wat betreft amfibieën in de natuur is het vooral belangrijk preventiestrategieën te richten op het beperken van anthropogene stressoren. Dit kan men o.a. doen door een vegetatiebuffer te voorzien rondom broedplaatsen om de impact van agricultuur op amfibieënpopulatie te beperken91,40, door een verbod in te lassen op het gebruik van amfibieën als lokaas131, en door het belang aan te kaarten van een grondige desinfectie van voorwerpen die in contact komen met water3. Voor een optimale werking van het desinfectans is het belangrijk het materiaal vooraf grondig te reinigen. Een efficiënte desinfectie kan gebeuren door oplossingen van 3% bleekwater (natriumhypochloriet), 0.75% chloorhexidine, 1% Virkon S® (kaliumperoxymonosulfaat) gedurende 1 minuut te laten inwerken en vervolgens grondig af te spoelen145. Sterk geconcentreerde oplossingen en lange contacttijden zijn niet nodig om ranavirussen te inactiveren en worden dus best vermeden om schadelijke effecten voor de omgeving, materiaal en amfibieën te beperken143. .
24
4.7. Impact op amfibieënpopulaties Sinds 1960 zijn er als maar meer meldingen van afname en extinctie van amfibieënpopulaties1,2. Er zijn verschillende mechanismen beschreven die de kans op ziekte-geïnduceerde extinctie bevorderen zoals de aanwezigheid van reservoirspecies, persistentie van het virus in de omgeving en frequentieafhankelijk ziektetransmissie3,146 . Al deze mechanismen blijken een rol te spelen in de massale sterfte veroorzaakt door ranavirussen63,65,66,70,72,77-79. Frequentie-afhankelijke ziektetransmissie betekent dat de spreiding van de ziekte proportioneel is met het aantal geïnfecteerde individuen, wat tot gevolg heeft dat de ziekte aan een hoge incidentie aanwezig kan blijven in de populatie, ongeacht de populatiedichtheid146. Dit is in tegenstelling tot densiteits-afhankelijk transmissie waarbij de spreiding afhankelijk is van de dichtheid van de vatbare populatie. Wanneer de dichtheid beneden een bepaalde treshold komt is er geen efficiënte transmissie meer en wordt er verondersteld dat de ziekte uitsterft alvorens de populatie kan uitsterven147. Frequentie-afhankelijke overdracht is het geval voor sexueel overdraagbare ziektes, ziektes overgedragen door vectoren en bij het vertonen van nauw sociaal contact zoals aggregatie van kikkervisjes en het nauwe contact tijdens het paarseizoen146. Omdat ranavirussen gemakkelijk worden overgedragen door direct contact is de efficiëntie van overdracht tijdens het paarseizoen hetzelfde als een sexueel overdraagbare ziekte11. Het is belangrijk te begrijpen dat het ontstaan van een kleine populatie, ten gevolge van eender welke oorzaak, de populatie predisponeert voor extinctie. Dit wordt ook wel het ‘Allee-effect’ genoemd en wordt omschreven als een negatieve groeiratio van de populatie, bij een lage populatiedensiteit, die te wijten kan zijn aan sociale factoren en inteeltdepressie146.
25
5. BESPREKING Er bestaat geen eenvoudig antwoord op de vraag wat de oorzaak is van de afnemende amfibieënpopulaties, maar opkomende infectieuze ziektes, zoals ranavirose, spelen hier een belangrijke rol in4,81,98,117. Ranavirussen zijn wijdverspreide pathogenen geassocieerd met sterfte bij amfibieën in Amerika, Europa en Azië, zowel in gevangenschap als in het wild6,111,120,116. Het grootste aantal gerapporteerde sterfgevallen is afkomstig uit Noord-Amerika en overschrijdt 3 tot 4 maal het aantal sterfgevallen veroorzaakt door andere pathogenen75,71,98,106,. De hoogste mortaliteit doet zich voor bij veel voorkomende species98,120, maar sterfte werd ook gerapporteerd bij zeldzame soorten zoals Rana muscosa, Rana aurora, Bufa boreas en Ambystoma stebbinsi104,148. Men kan dus stellen dat ranavirussen een bedreiging vormen voor de biodiversiteit. Wijdverspreide surveillance projecten zijn noodzakelijk om species en gebieden te identificeren die het ergst getroffen zijn en om na te gaan of ranavirussen wel degelijk in staat zijn om extincties te veroorzaken. Om deze surveillance acties tot een succes te brengen is er nood aan de ontwikkeling van een niet-lethale staalnametechniek met hoge sensitiviteit en specificiteit, in een vroeg stadium van de ziekte, die gebruikt kan worden in veldstudies127,135. Hoewel uitroeiing van amfibiespecies door ranavirose nog niet bewezen werd, hebben ranavirussen hier wel het potentieel voor. Zo zijn ze in staat te persisteren via 3 wegen: in subklinisch geïnfecteerde dieren62,63 in de omgeving78 en in reservoirspecies61,64. Ranavirussen kunnen verschillende species infecteren waarbij de vatbaarheid sterk kan verschillen en waarbij de meest tolerante species en ontwikkelingsstadia (adulten) kunnen optreden als reservoir61,64. Uit een studie waarbij 19 Noord-Amerikaanse amfibiespecies werden blootgesteld aan 2 ranavirusisolaten (FV3 en FV3-like) bleken de boskikker (Lithobates sylvaticus) en de gopherkikker (Lithobates capito) het meest vatbaar te zijn, terwijl de Amerikaanse brulkikker (Lithobates catesbeiana) volledig resistent bleek te zijn147. Ecologische experimenten werden tot op heden vooral uitgevoerd met ATV en Ambystoma tigrinum65,67,72,77,80, maar gezien de grote variatie in vatbaarheid aan verschillende ranavirustypes is het noodzakelijk hierin ook andere ranavirustypes te betrekken3. In een aantal studies werd reeds aangetoond dat ranavirussen kunnen persisteren in water, bodem, afgestorven weefsel en voorwerpen72-74,76, maar over de duur van persistentie en de beïnvloedende factoren is nog weinig geweten. De kans op een lokale uitroeiing is dus afhankelijk van de samenstelling van de amfibieënpopulatie en de bijdrage van de habitat aan persistentie en transmissie van virussen3. Studies zijn nodig om het gastheerbereik, species-specifieke vatbaarheid en geografische distributie van verschillende ranavirustypes te begrijpen, maar vooruitgang op dit gebied wordt verhinderd door een gebrek aan viruskarakterisatie. Hoewel het MCP gen het meeste gebruikte gen is voor classificatie van ranavirussen, is deze methode, aangezien de conservatieve natuur van het gen, niet ideaal106,107,111. Het betrekken van meerdere genen en aanvullende methode, zoals RFLP en proteïne profielen, kan leiden tot een meer correcte classificatie137,150. Een voorbeeld hiervan is het RCV-Z virus dat door Majji en collega’s beschreven werd als zijnde een nieuw species. Hoewel de MCP sequentie identiek is aan die van andere ranavirusspecies (FV3 en ATV), zijn er duidelijke verschillen in RFLP en proteïne profielen59. Deze moleculaire technieken zouden, waar mogelijk, samen moeten gaan met histopathologisch onderzoek en onderzoek naar andere pathogenen om een onderscheid te kunnen maken tussen reservoirspecies, subklinisch geïnfecteerde dieren en zieke dieren, en om de
26
bijdrage van andere pathogenen (zoals o.a. Batrachochitrium dendrobatidis, A. hydrophila en parasieten) in amfibieënsterfte te kunnen inschatten. De informatie verkregen uit surveillance studies kan eveneens gebruikt worden om te differentiëren tussen nieuwe en endemische virustypes. Indien een pathogeen zich spreidt naar een gebied waar deze voorheen afwezig was, spreekt men van een nieuwe opkomende ziekte151. Als een pathogeen reeds aanwezig was in de omgeving, maar een toename veroorzaakt in morbiditeit en mortaliteit ten gevolge van immunosuppressie of toegenomen pathogeniciteit van het agens, spreekt men van een endemisch opkomende ziekte151. Beide scenario’s blijken mogelijk te zijn voor ranavirussen131 en het begrijpen van de humane bijdrage hierin is uiterst belangrijk omdat dit het punt is waarop het gemakkelijkst kan worden ingegrepen4. Antropogene factoren kunnen enerzijds zorgen voor de spreiding
van
ranavirussen
naar
naïeve
populaties
en
anderzijds
aanleiding
geven
tot
immunosuppressie waardoor de kans op infectie, morbiditeit en mortaliteit toeneemt. Studies rond het effect van anthropogene factoren zouden moeten samen gaan met natuurlijke stressoren om de interactie tussen beiden en de impact ervan op populatieniveau te kunnen inschatten3. Hoewel verondersteld wordt dat de toegenomen sterfte ten gevolge van ranavirose niet te wijten is aan een toegenomen pathogeniciteit van het virus, werd er reeds aangetoond dat bepaalde isolaten meer pathogeen zijn dan anderen131, maar welke genen hiertoe bijdragen is niet geweten. Het gebruik van knock-down mutanten en sequentieanalyse van het ranavirus genoom kunnen helpen met het identificeren van virale genen in virulentie en immuunevasie141. Deze studies zijn eveneens nuttig voor de ontwikkeling van een vaccin voor gebruik in gevangenschap en herintroductie projecten. Verschillende studies bewezen dat een primaire infectie met een ranavirus leidt tot een versterkte immuunrespons tegen een volgende infectie59,88, wat alvast een basis vormt voor de ontwikkeling van een ranavirusvaccin. Informatie over het immuunsysteem van amfibieën is vooral gebaseerd op experimenten met de Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis)83,84. Deze studies tonen aan dat de immuunrespons
beïnvloedt
wordt
door
het
ontwikkelingsstadium,
waarbij
individuen
die
metamorfoseren het zwakst zijn, gevolgd door kikkervisjes. Deze trend kan men eveneens waarnemen in de natuur75,148,152, behalve voor anuren in de UK, waar sterfte door ranavirussen werd gerapporteerd bij enkel adulte kikkers117,120. Er is dus meer onderzoek nodig naar de werking van het immuunsysteem tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia en dit onderzoek zou moeten uitgebreid worden naar andere species met een verschillende vatbaarheid voor ranavirussen3. Door wijdverspreide surveillance projecten en gecontroleerde experimenten zullen we een beter beeld krijgen van de ecologie en pathologie van ranavirussen en de factoren die bijdragen aan de toenemende problematiek van ranavirose3. Om de complexiteit van dit systeem te ontcijferen is het noodzakelijk dat onderzoekers van verschillende disciplines (ecologie, pathologie, diergeneeskunde, immunologie, genetica, microbiologie) samenwerken en communiceren. Op die manier kunnen er gerichte strategieën opgesteld worden om de impact van ranavirose tot een minimum te beperken.
27
6. REFERENTIELIJST 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
12. 13. 14. 15.
16. 17.
18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.
Stuart, S. N., et al. (2004). "Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide." Science 306(5702): 1783-1786. Houlahan, J. E., et al. (2000). "Quantitative evidence for global amphibian population declines." Nature 404(6779): 752-755. Gray, M. J., et al. (2009). "Ecology and pathology of amphibian ranaviruses." Diseases of Aquatic Organisms 87(3): 243-266. Collins J.P., Storfer A. (2003). “Global amphibians declines: sorting the hypothesis.” Divers Distrib 9: 89-98. Lesbarreres, D., et al. (2012). "Ranavirus: past, present and future." Biol Lett 8(4): 481-483. Pasmans, F., et al. (2008). "Ranavirus-associated mass mortality in imported red tailed knobby newts (Tylototriton kweichowensis): A case report." Veterinary Journal 176(2): 257-259. Kik, M., et al. (2011). "Ranavirus-associated mass mortality in wild amphibians, the Netherlands, 2010: a first report." Veterinary Journal 190(2): 284-286. Vitt L.J. and Caldwell J.P. (2014). “Herpetology: an introductory biology of amphibians and reptiles”. 4th edition . Academic Press, San Diego, 630p. Pasmans F. (2012-2013). “gezondheidszorg van reptielen en amfibieën in gevangenschap. “ Cursus faculteit diergeneeskunde Gent. Grenard S. (2007) Frogs and toads: your happy healthy pets. Second edition. Wiley Publishing, p. 11-14. Wells, K. D. (2007). “Complex life cycles and ecology and the ecology of amphibian metamorphosis”. In: The ecology and behavior of amphibians. 1st edition. University of Chicago press, Chicago, p .599-645 Wells, K. D. (2007). “Temperature relations”. In: The ecology and behavior of amphibians. 1st edition. University of Chicago press, Chicago, p. 122-15 F. Harvey Pough (1980). “The Advantages of Ectothermy for Tetrapods”. The American Naturalist115(1):92-112 Heatwole, H. and B. T. Firth (1982). "Voluntary Maximum Temperature of the Jackie Lizard, Amphibolurus-Muricatus." Copeia(4): 824-829. Clarke, B. T. (1997). "The natural history of amphibian skin secretions, their normal functioning and potential medical applications." Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 72(3): 365-379. Poll, C. R. (2009). "Wound Management in Amphibians: Etiology and Treatment of Cutaneous Lesions." Journal of Exotic Pet Medicine 18(1): 20-35. Guo, P., et al. (2003). "A two-barrier compartment model for volume flow across amphibian skin." American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology 285(6): R1384-R1394. Toledo, R. C. and C. Jared (1995). "Cutaneous Granular Glands and Amphibian Venoms." Comparative Biochemistry and Physiology a-Physiology 111(1): 1-29. Rollins-Smith, L. A., et al. (2005). "Antimicrobial Peptide defenses in amphibian skin." Integr Comp Biol 45(1): 137-142. Simmaco, M., et al. (1998). "Antimicrobial peptides from amphibian skin: What do they tell us?" Biopolymers 47(6): 435-450. Larsen E.H. (1991). “Chloride transport by high-resistance heterocellular epithelia. Phyiol. Rev.(71): 235-283. Hillyard, S. D. (1999). "Behavioral, molecular and integrative mechanisms of amphibian osmoregulation." Journal of Experimental Zoology 283(7): 662-674. Ogushi, Y., et al. (2010). "Water Adaptation Strategy in Anuran Amphibians: Molecular Diversity of Aquaporin." Endocrinology 151(1): 165-173. Feder, M. E. and W. W. Burggren (1985). "Skin Breathing in Vertebrates." Scientific American 253(5): 126-&.
28
25.
26. 27. 28. 29. 30. 31. 32.
33. 34. 35.
36. 37. 38. 39. 40. 41.
42.
43. 44. 45. 46.
47.
Burggren, W. and R. Moalli (1984). "Active Regulation of Cutaneous Gas-Exchange by Capillary Recruitment in Amphibians - Experimental-Evidence and a Revised Model for Skin Respiration." Respiration Physiology 55(3): 379-392. Burggren, W. W. and M. E. Feder (1986). "Effect of Experimental Ventilation of the Skin on Cutaneous Gas-Exchange in the Bullfrog." Journal of Experimental Biology Moalli, R., et al. (1980). "Skin Circulation of the Frog, Rana-Catesbeiana - Distribution and Dynamics." Respiration Physiology 40(2): 137-148. Sjaastad & Hove & Sand (2003). “immunology”. In: Physiology of domestic animals.1st edition. Scandinavian veterinary press, Finland, p. 305-323 Robert, J. and Y. Ohta (2009). "Comparative and Developmental Study of the Immune System in Xenopus." Developmental Dynamics 238(6): 1249-1270. Dupasquier, L., et al. (1989). "The Immune-System of Xenopus." Annual Review of Immunology 7: 251-275. Carey, C., et al. (1999). "Amphibian declines: an immunological perspective." Dev Comp Immunol 23(6): 459-472. Reilly, D. S., et al. (1994). "Expression of Magainin Antimicrobial Peptide Genes in the Developing Granular Glands of Xenopus Skin and Induction by Thyroid-Hormone." Developmental Biology 162(1): 123-133. Ching, Y. C. and R. J. Wedgwood (1967). "Immunologic responses in the axolotl, Siredon mexicanum." J Immunol 99(1): 191-200. Rosenkilde, P., and Ussing, A.P. (1990). “regulation of metamorphosis”. Progr. Zool. 38, 125138 Tournefier, A., et al. (1988). "Monoclonal-Antibodies to Axolotl Immunoglobulins Specific for Different Heavy-Chains Isotypes Expressed by Independent Lymphocyte Subpopulations." Immunology Letters 18(2): 145-148. Du Pasquier, L., et al. (2000). "B-cell development in the amphibian Xenopus." Immunol Rev 175: 201-213 Li, J., et al. (2006). "B lymphocytes from early vertebrates have potent phagocytic and microbicidal abilities." Nat Immunol 7(10): 1116-1124. Zhao, Y. F., et al. (2006). "Identification of IgF, a hinge-region-containing Ig class, and IgD in Xenopus tropicalis." Proc Natl Acad Sci U S A 103(32): 12087-12092. Mussmann, R., et al. (1996). "Is Xenopus IgX an analog of IgA?" Eur J Immunol 26(12): 28232830. RollinsSmith, L. A., et al. (1997). "Involvement of thyroid hormones in the expression of MHC class I antigens during ontogeny in Xenopus." Developmental Immunology 5(2): 133-144. Jaudet, G. J. and J. L. Hatey (1984). "Variations in Aldosterone and Corticosterone PlasmaLevels during Metamorphosis in Xenopus-Laevis Tadpoles." General and Comparative Endocrinology 56(1): 59-65 Rollins-Smith, L. A., et al. (1988). "Effects of thyroxine-driven precocious metamorphosis on maturation of adult-type allograft rejection responses in early thyroidectomized frogs." Differentiation 37(3): 180-185. Rollins-Smith, L. A., et al. (1997). "Involvement of glucocorticoids in the reorganization of the amphibian immune system at metamorphosis." Developmental Immunology 5(2): 145-152. Martinez, I. P., et al. (1996). "Growth and metamorphosis of Rana perezi larvae in culture: Effects of larval density." Aquaculture 142(3-4): 163-170. Skelly, D. K. and E. E. Werner (1990). "Behavioral and Life-Historical Responses of Larval American Toads to an Odonate Predator." Ecology 71(6): 2313-2322. Du Pasquier, L. (1982). Ontogeny of immunological functions in amphibians. In: The Reticuloendothelial Sytem, A comprehensive Treatise, Vol. 3: Phylogeny and ontogeny, Cohen N., and Sigel M.M., Eds. New York: Plenum Press, p. 633-657. Flajnik, M. F., et al. (1987). "Changes in the Immune-System during Metamorphosis of Xenopus." Immunology Today 8(2): 58-64.
29
48.
49.
50. 51. 52. 53. 54. 55. 56.
57.
58.
59. 60.
61. 62.
63. 64. 65. 66. 67. 68. 69.
Rollins-Smith, L.A., and Cohen, N. (1996). Metamorphosis: An immunologically unique period in the life of the frog. In: Metamorphosis: Postembryonic Reprogramming of Gene Expression in Amphibian and Insect Cells, Gilbert L.I., Tata J.R., and Atkinson B.G., Eds. New York: Academic Press, p625-646. Flajnik, M. F., et al. (1986). "Major histocompatibility complex-encoded class I molecules are absent in immunologically competent Xenopus before metamorphosis." J Immunol 137(12): 3891-3899. Flajnik, M. F. and L. Dupasquier (1988). "Mhc Class-I Antigens as Surface-Markers of Adult Erythrocytes during the Metamorphosis of Xenopus." Developmental Biology 128(1): 198-206. Rollins-Smith L.A., Blair P. (1990) “expression of class 2 major histocompatibility complex antigens on adult T-cells in Xenopus is metamorphosis-dependent.” Dev Immunol (1):97-104 Volk, H., et al. (1998). "Wide tissue distribution of axolotl class II molecules occurs independently of thyroxin." Immunogenetics 47(5): 339-349. Salvadori F., Tournefier A., (1996). “Activation by mitogens and superantigens of axolotl lymphocytes: functional characterization and onogenic study.” Immunology 88, p. 586-592 vo, T., et al. (2005). "A decade of advances in iridovirus research." Advances in Virus Research, Vol 65 65: 173-+. Chinchar, V. G. (2002). "Ranaviruses (family Iridoviridae): emerging cold-blooded killers - Brief review." Archives of Virology 147(3): 447-470. Ting, J. W., et al. (2004). "Identification and characterization of a novel gene of grouper iridovirus encoding a purine nucleoside phosphorylase." Journal of General Virology 85(Pt 10): 2883-2892. Song, W. J., et al. (2004). "Functional genomics analysis of Singapore grouper iridovirus: complete sequence determination and proteomic analysis." Journal of Virology 78(22): 1257612590. Chinchar V.G., Essbauer S., He J.G., Hyatt A., Miyazaki T., Seligy V., Williams T. (2005) Iridoviridae. In Fauguet C.M., Mayo M.A., Maniloff J. Desselberger U., Ball L.A. Virus taxonomy: 8Th report of the international committee on the taxonomy of viruses. Elsevier, London, p 163175. Majji, S., et al. (2006). "Rana catesbeiana virus Z (RCV-Z): a novel pathogenic ranavirus." Diseases of Aquatic Organisms 73(1): 1-11. Mavian, C., et al. (2012). "The Genome Sequence of the Emerging Common Midwife Toad Virus Identifies an Evolutionary Intermediate within Ranaviruses (vol 86, pg 3617, 2012)." Journal of Virology 86(20): 11413-11413. Hoverman, J. T., et al. (2010). "Anuran susceptibilities to ranaviruses: role of species identity, exposure route, and a novel virus isolate." Diseases of Aquatic Organisms 89(2): 97-107. Morales, H. D., et al. (2010). "Innate immune responses and permissiveness to ranavirus infection of peritoneal leukocytes in the frog Xenopus laevis." Journal of Virology 84(10): 49124922. Robert, J., et al. (2007). "Xenopus laevis: a possible vector of Ranavirus infection?" J Wildl Dis 43(4): 645-652. Schock, D. M., et al. (2008). "Experimental evidence that amphibian ranaviruses are multi-host pathogens." Copeia(1): 133-143. Jancovich, J.K., Davidson, E.W., Seiler, A., Jacbs, B.L., and Collins, J.P. (2001). Transmission of the ambystoma tigrinum virus to alternative hosts. Dis Aquat. Org. 46:159-163. Duffus, A. L., et al. (2008). "Frog virus 3-like infections in aquatic amphibian communities." J Wildl Dis 44(1): 109-120. Brunner, J. L., et al. (2004). "Intraspecific reservoirs: Complex life history and the persistence of a lethal ranavirus." Ecology 85(2): 560-566. Ariel, E. and L. Owens (1997). "Epizootic mortalities in tilapia Oreochromis mossambicus." Diseases of Aquatic Organisms 29(1): 1-6. Johnson, A. J., et al. (2008). "Ranavirus Infection of Free-Ranging and Captive Box Turtles and Tortoises in the United States." J Wildl Dis 44(4): 851-863.
30
70.
71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79.
80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89.
90. 91.
92.
93.
Ariel, E., et al.(1997). “pathology and serological aspects of Bohle Iridovirus infections in six selected waterassociated reptiles in North Queensland. Ph.d. Thesis, James Cook university, Queensland, Australia. Jancovich, J. K., et al. (2005). "Evidence for emergence of an amphibian iridoviral disease because of human-enhanced spread." Molecular Ecology 14(1): 213-224. Brunner, J. L., et al. (2007). "Transmission dynamics of the amphibian ranavirus Ambystoma tigrinum virus." Diseases of Aquatic Organisms 77(2): 87-95. Pearman, P. B., et al. (2004). "Response of the Italian agile frog (Rana latastei) to a Ranavirus, frog virus 3: A model for viral emergence in naive populations." J Wildl Dis 40(4): 660-669. Harp, E. M. and J. W. Petranka (2006). "Ranavirus in wood frogs (Rana sylvatica): Potential sources of transmission within and between ponds." J Wildl Dis 42(2): 307-318. Greer, A. L., et al. (2005). "Five amphibian mortality events associated with ranavirus infection in south central Ontario, Canada." Diseases of Aquatic Organisms 67(1-2): 9-14. Greer, A. L., et al. (2008). "Testing a key assumption of host-pathogen theory: density and disease transmission." Oikos 117(11): 1667-1673. Rojas, S., et al. (2005). "Influence of temperature on Ranavirus infection in larval salamanders Ambystoma tigrinum." Diseases of Aquatic Organisms 63(2-3): 95-100. Nazir, J., et al. (2012). "Environmental persistence of amphibian and reptilian ranaviruses." Diseases of Aquatic Organisms 98(3): 177-184. Langdon, J. S. (1989). "Experimental Transmission and Pathogenicity of Epizootic Hematopoietic Necrosis Virus (Ehnv) in Redfin Perch, Perca-Fluviatilis L and 11 Other Teleosts." Journal of Fish Diseases 12(4): 295-310. Brunner, J. L., et al. (2005). "Dose and host characteristics influence virulence of ranavirus infections." Oecologia 144(3): 399-406. Daszak, P., et al. (1999). "Emerging infectious diseases and amphibian population declines." Emerging Infectious Diseases 5(6): 735-748. Stohr, A. C., et al. (2013). "Ranavirus infections associated with skin lesions in lizards." Veterinary Research 44(1): 84. Gantress, J., et al. (2003). "Development and characterization of a model system to study amphibian immune responses to iridoviruses." Virology 311(2): 254-262. Morales, H. D. and J. Robert (2007). "Characterization of primary and memory CD8 T-cell responses against ranavirus (FV3) in Xenopus laevis." Journal of Virology 81(5): 2240-2248. Robert, J., et al. (1995). "Ontogeny of the alloimmune response against a transplanted tumor in Xenopus laevis." Differentiation 59(3): 135-144. Maniero, G. D., et al. (2006). "Generation of a long-lasting, protective, and neutralizing antibody response to the ranavirus FV3 by the frog Xenopus." Dev Comp Immunol 30(7): 649-657. Kaufman, J. (2000). "The simple chicken major histocompatibility complex: life and death in the face of pathogens and vaccines." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 355(1400): 1077-1084. Cooper E.L., Wright R.K., Klempau A.E., Smith C.T. (1992) Hibernation alters the frogs immune system. Cryobiology 29:616-631. Maniero, G. D. and C. Carey (1997). "Changes in selected aspects of immune function in the leopard frog, Rana pipiens, associated with exposure to cold." Journal of Comparative Physiology B-Biochemical Systemic and Environmental Physiology 167(4): 256-263. Raffel, T. R., et al. (2006). "Negative effects of changing temperature on amphibian immunity under field conditions." Functional Ecology 20(5): 819-828. Gray, M. J., et al. (2007). "Frog virus 3 prevalence in tadpole populations inhabiting cattleaccess and non-access wetlands in Tennessee, USA." Diseases of Aquatic Organisms 77(2): 97-103. Glennemeier, K. A. and R. J. Denver (2002). "Role for corticoids in mediating the response of Rana pipiens tadpoles to intraspecific competition." Journal of Experimental Zoology 292(1): 3240. Rouse, J. D., et al. (1999). "Nitrogen pollution: An assessment of its threat to amphibian survival." Environmental Health Perspectives 107(10): 799-803.
31
94. 95. 96. 97.
98.
99. 100.
101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111.
112. 113. 114. 115.
116.
Davidson, C. and R. A. Knapp (2007). "Multiple stressors and amphibian declines: Dual impacts of pesticides and fish on yellow-legged frogs." Ecological Applications 17(2): 587-597. Gendron, A. D., et al. (2003). "Exposure of leopard frogs to a pesticide mixture affects life history characteristics of the lungworm Rhabdias ranae." Oecologia 135(3): 469-476. Forson, D. D. and A. Storfer (2006). "Atrazine increases ranavirus susceptibility in the tiger salamander, Ambystoma tigrinum." Ecological Applications 16(6): 2325-2332. Greer, A. L. and J. P. Collins (2008). "Habitat fragmentation as a result of biotic and abiotic factors controls pathogen transmission throughout a host population." Journal of Animal Ecology 77(2): 364-369. Green, D. E., et al. (2002). "Epizootiology of sixty-four amphibian morbidity and mortality events in the USA, 1996-2001." Domestic Animal/Wildlife Interface: Issue for Disease Control, Conservation, Sustainable Food Production, and Emerging Diseases 969: 323-339. Vermeer, B. J. and M. Hurks (1994). "The Clinical Relevance of Immunosuppression by Uv Irradiation." Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology 24(3): 149-154. Pearman, P. B. and T. W. J. Garner (2005). "Susceptibility of Italian agile frog populations to an emerging strain of Ranavirus parallels population genetic diversity." Ecology Letters 8(4): 401408. Cunningham, A.A. et al. (2003). Pathogen pollution: defining a parasitological threat to biodiversity conservation. J Parasitol 89(Suppl):78-83. Picco A.M., Collins J.P. (2008.”Amphibian commerce as a likely source of pathogen pollution. Conserv Biol 22: 1582-1589. Schlaepfer, M. A., et al. (2005). "Challenges in evaluating the impact of the trade in amphibians and reptiles on wild populations." Bioscience 55(3): 256-264. Chinchar, V. G., et al. (2009). "Family Iridoviridae: Poor Viral Relations No Longer." Lesser Known Large Dsdna Viruses 328: 123-170. Echaubard, P., et al. (2010). "Context-Dependent Effects of Ranaviral Infection on Northern Leopard Frog Life History Traits." PLoS One 5(10). Bollinger, T. K., et al. (1999). "Pathology, isolation, and preliminary molecular characterization of a novel iridovirus from tiger salamanders in Saskatchewan." J Wildl Dis 35(3): 413-429. Docherty, D. E., et al. (2003). "Diagnostic and molecular evaluation of three iridovirusassociated salamander mortality events." J Wildl Dis 39(3): 556-566. Greer, A. L., et al. (2005). "Five amphibian mortality events associated with ranavirus infection in south central Ontario, Canada." Diseases of Aquatic Organisms 67(1-2): 9-14 Jancovich, J. K., et al. (1997). "Isolation of a lethal virus from the endangered tiger salamander Ambystoma tigrinum stebbinsi." Diseases of Aquatic Organisms 31(3): 161-167. Miller, D. L., et al. (2007). "Frog virus 3 infection, cultured American bullfrogs." Emerging Infectious Diseases 13(2): 342-343. Balseiro, A., et al. (2009). "Pathology, isolation and molecular characterisation of a ranavirus from the common midwife toad Alytes obstetricans on the Iberian Peninsula." Diseases of Aquatic Organisms 84(2): 95-104. Wolf, K., et al. (1968). "Tadpole Edema Virus - a Viscerotropic Pathogen for Anuran Amphibians." Journal of Infectious Diseases 118(3): 253-&. Willis, D. B., et al. (1985). "Macromolecular-Synthesis in Cells Infected by Frog Virus-3." Current Topics in Microbiology and Immunology 116: 77-106. OIE (2012). Infection with ranavirus. In: Manual of diagnostics test for aquatic animals. World organization for animal health, p1-21. Green, D.E. et al. (2009). “Disease monitoring and biosecurity”. In Dodd CK (ed) Amphibian ecology and conservation: a handbook of techniques. Oxford university press, Oxford, p481506. Driskell, E. A., et al. (2009). "Pcr Detection of Ranavirus in Adult Anurans from the Louisville Zoological Garden." Journal of Zoo and Wildlife Medicine 40(3): 559-563.
32
117. Cunningham, A. A., et al. (2008). "Immunohistochemical demonstration of ranavirus antigen in the tissues of infected frogs (Rana temporaria) with systemic haemorrhagic or cutaneous ulcerative disease." Journal of Comparative Pathology 138(1): 3-11. 118. Reddacliff, L. A. and R. J. Whittington (1996). "Pathology of epizootic haematopoietic necrosis virus (EHNV) infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss walbaum) and redfin perch (Perca fluviatilis L)." Journal of Comparative Pathology 115(2): 103-115. 119. Cunningham, A. A., et al. (1993). "Unusual mortality associated with poxvirus-like particles in frogs (Rana temporaria)." Vet Rec 133(6): 141-142. 120. Cunningham, A. A., et al. (1996). "Pathological and microbiological findings from incidents of unusual mortality of the common frog (Rana temporaria)." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 351(1347): 1539-1557. 121. Hyatt, A.D. (1991). “Immunogold labeling techniques”. In: electron microscopy in biology: a practical approach, Harris R., ed. IRL Press, Oxford, UK, 59-81. 122. Favoreel H. (2012-2013). “Celbiologische en moleculaire technieken voor biomedisch onderzoek”. Cursus faculteit diergeneeskunde Gent. 123. Hyatt, A. D., et al. (2000). "Comparative studies of piscine and amphibian iridoviruses." Archives of Virology 145(2): 301-331. 124. Hyatt, A. D., et al. (1991). "Epizootic Hematopoietic Necrosis Virus - Detection by Elisa, Immunohistochemistry and Immunoelectron-Microscopy." Journal of Fish Diseases 14(6): 605617. 125. Whittington, R. J. and K. A. Steiner (1993). "Epizootic Hematopoietic Necrosis Virus (Ehnv) Improved Elisa for Detection in Fish-Tissues and Cell-Cultures and an Efficient Method for Release of Antigen from Tissues." Journal of Virological Methods 43(2): 205-220. 126. Cullen, B. R. and L. Owens (2002). "Experimental challenge and clinical cases of Bohle iridovirus (BIV) in native Australian anurans." Diseases of Aquatic Organisms 49(2): 83-92. 127. Mao, J. H., et al. (1997). "Molecular characterization, sequence analysis, and taxonomic position of newly isolated fish iridoviruses." Virology 229(1): 212-220.Mao, J., et al. (1999). "Molecular characterization of iridoviruses isolated from sympatric amphibians and fish." Virus Res 63(1-2): 45-52. 128. Hanson, L. A., et al. (2006). "A broadly applicable method to characterize large DNA viruses and adenoviruses based on the DNA polymerase gene." Virology Journal 3: 28. 129. Greer, A. L. and J. P. Collins (2007). "Sensitivity of a diagnostic test for amphibian Ranavirus varies with sampling protocol." J Wildl Dis 43(3): 525-532. 130. Pallister, J., et al. (2007). "Development of real-time PCR assays for the detection and differentiation of Australian and European ranaviruses." Journal of Fish Diseases 30(7): 427438. 131. Storfer, A., et al. (2007). "Phylogenetic concordance analysis shows an emerging pathogen is novel and endemic." Ecology Letters 10(11): 1075-1083. 132. Driskell, E. A., et al. (2009). "PCR detection of ranavirus in adult anurans from the Louisville Zoological Garden." J Zoo Wildl Med 40(3): 559-563. 133. Sanger, F. and A. R. Coulson (1975). "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase." J Mol Biol 94(3): 441-448. 134. Jancovich, J. K., et al. (2003). "Genomic sequence of a ranavirus (family Iridoviridae) associated with salamander mortalities in North America." Virology 316(1): 90-103. 135. He, J. G., et al. (2002). "Sequence analysis of the complete genome of an iridovirus isolated from the tiger frog." Virology 292(2): 185-197. 136. Marsh, I. B., et al. (2002). "Rapid differentiation of Australian, European and American ranaviruses based on variation in major capsid protein gene sequence." Molecular and Cellular Probes 16(2): 137-151. 137. Gray, M. J., et al. (2012). "Reliability of non-lethal surveillance methods for detecting ranavirus infection." Diseases of Aquatic Organisms 99(1): 1-6.
33
138. Greer, A. L., et al. (2009). "Spatial and temporal patterns of Ambystoma tigrinum virus (ATV) prevalence in tiger salamanders Ambystoma tigrinum nebulosum." Diseases of Aquatic Organisms 85(1): 1-6. 139. Hoverman, J. T., et al. (2012). "Widespread occurrence of ranavirus in pond-breeding amphibian populations." Ecohealth 9(1): 36-48. 140. St-Ainour, V. and D. Lesbarreres (2007). "Genetic evidence of Ranavirus in toe clips: an alternative to lethal sampling methods." Conservation Genetics 8(5): 1247-1250. 141. Miller, D., et al. (2011). "Ecopathology of Ranaviruses Infecting Amphibians." Viruses-Basel 3(11): 2351-2373. 142. EAZWV. Transmissible disease fact sheet: ranavirus infection in amphibians. European Association of Zoo and Wildlife Veterinarians. Sheet n°50. 143. Nakajima, D., et al. (1999). “Effectiveness of a vaccine against red see bream Iridoviral diease in a field trial test. Dis. Aquat. Organ 36: 73-75. 144. Semlitsch, R. D. and J. R. Bodie (2003). "Biological criteria for buffer zones around wetlands and riparian habitats for amphibians and reptiles." Conservation Biology 17(5): 1219-1228. 145. Bryan, L. K., et al. (2009). "Efficacy of select disinfectants at inactivating Ranavirus." Diseases of Aquatic Organisms 84(2): 89-94. 146. de Castro, F. and B. Bolker (2005). "Mechanisms of disease-induced extinction." Ecology Letters 8(1): 117-126. 147. May, R. M. and R. M. Anderson (1979). "Population Biology of Infectious-Diseases .2." Nature 280(5722): 455-461. 148. Converse , K.A. & Green D.E. (2005). “Diseases of tadpoles.” In: wildlife diseases: Landscape epidemiology, spatial distribution and utilization of remote sensing technology. The Pennsylvania Academy of science: Easton, USA. Chapter 7, pp. 72-88. 149. Ridenhour, B. J. and A. T. Storfer (2008). "Geographically variable selection in Ambystoma tigrinum virus (Iridoviridae) throughout the western USA." Journal of Evolutionary Biology 21(4): 1151-1159. 150. Hoverman, J. T., et al. (2011). "Phylogeny, Life History, and Ecology Contribute to Differences in Amphibian Susceptibility to Ranaviruses." Ecohealth 8(3): 301-319. 151. Rachowicz, L. J., et al. (2005). "The novel and endemic pathogen hypotheses: Competing explanations for the origin of emerging infectious diseases of wildlife." Conservation Biology 19(5): 1441-1448. 152. Une, Y., et al. (2009). "Ranavirus Outbreak in North American Bullfrogs (Rana catesbeiana), Japan, 2008." Emerging Infectious Diseases 15(7): 1146-1147.
34
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
ACADEMIEJAAR 2013-2014
Anesthesie bij een konijn met hydrometra door Lindsey CANTILLON
Promotor: Dierenarts Annika Koenraadt Copromotor: Prof. Dr. I. Polis
Casusbespreking in het kader van de masterproef
VOORWOORD Bij het schrijven van deze casusbespreking heb ik zowel professionele als morele steun gekregen van verschillende mensen, die ik dan ook graag zou willen bedanken. Bedankt aan mijn promotor Annika Koenraadt en copromotor prof. dr. Ingeborgh Polis voor de begeleiding en nuttige tips. Mijn ouders bedank ik voor hun aanmoediging gedurende de volledige studie, en om steeds in mij te blijven geloven, ook op momenten dat ik dat zelfs niet deed.
INHOUDSTABEL Samenvatting ............................................................................................................................................1 1. Inleiding ................................................................................................................................................2 2. Casuïstiek .............................................................................................................................................3 3. Discussie ..............................................................................................................................................5 3.1. Voorbereiding op de anesthesie ...........................................................................................5 3.2. Premedicatie .........................................................................................................................7 3.3. Inductie .................................................................................................................................8 3.4. Onderhoud ..........................................................................................................................12 3.5. Monitoring .............................................................................................................................0 3.6. Analgesie ..............................................................................................................................0 3.7. Postoperatieve zorgen ..........................................................................................................0 3.8. Complicaties .........................................................................................................................0 4. Besluit ...................................................................................................................................................5 5. Literatuurlijst .........................................................................................................................................0
SAMENVATTING In deze masterproef worden de basisprincipes van anesthesie en analgesie bij het konijn besproken aan de hand van een klinische case, namelijk een konijn met hydrometra. De belemmerde gezondheidstoestand van het konijn geeft aanleiding tot een meer risicovolle anesthesie, maar er kan getracht worden deze risico’s te reduceren door het gebruik van een correct anesthesieprotocol. Een zeer belangrijke factor bij konijnen is het beperken van stress, zowel tijdens de hospitalisatie als tijdens de verschillende anesthesiestadia. Dit kan men onder andere verwezenlijken door het konijn te hospitaliseren in een rustige omgeving met degelijke bedding en voer, door de noodzakelijke handelingen op een rustige manier uit te voeren en door een goede analgesie te voorzien. De anesthesie dient te gebeuren met anesthetica met minimale cardiovasculaire en respiratoire neveneffecten.
Doseringen
moeten
hierbij
berekend
worden
op
basis
van
het
magere
lichaamsgewicht, waarbij men dus rekening moet houden met de gewichtstoename geassocieerd met vochtopstapeling in de uterus. Omwille van de grote druk die door de volumineuze uterus op het diafragma wordt uitgeoefend, is het uiterst belangrijk dat men de mogelijkheid heeft over te schakelen op artificiële respiratie indien nodig. Endotracheale intubatie bij konijnen is moeilijker dan bij andere diersoorten, maar is omwille van de vele voordelen steeds aan te raden. Alternatieven voor endotracheale intubatie zijn nasotracheale intubatie of een laryngeaal masker. Voor onderhoud wordt de voorkeur gegeven aan gasanesthesie met 100% O2 als draaggas via een half-open systeem. De technische hulpmiddelen voor monitoring die routinematig gebruikt worden bij andere diersoorten zijn niet allemaal even bruikbaar voor het konijn, waardoor monitoring met behulp van eigen waarnemingen des te belangrijker is. Een goede monitoring laat toe tijdig te anticiperen op mogelijke problemen. Monitoring dient nauwkeurig verder gezet te worden post-anesthesie om mogelijke complicaties zoals hypothermie, ileus en chirurgie-gerelateerde problemen tijdig op te merken. Gezien het veelvuldig voorkomen van ileus postoperatief, is het belangrijk dat men het eetgedrag stimuleert en dat men bij het vermoeden van ileus onmiddelijk overgaat tot het opstarten van een prokinetische therapie. Het ontstaan van ileus kan beperkt worden door het reduceren van stress en door een adequate pijnbestrijding.
1
1. INLEIDING Uit onderzoek is gebleken dat konijnen een groter risico hebben op anesthesie-gerelateerde mortaliteit dan honden en katten (respectievelijk 1,4%, 0,17% en 0,24%). Onder anesthesie-gerelateerde mortaliteit verstaat men sterfte die niet enkel te wijten is aan de chirurgische procedure of reeds bestaande medische problemen. Als verklaring hiervoor worden verschillende factoren aangehaald zoals stress tijdens inductie, verhoogd risico op hypothermie, subklinische luchtweginfecties en moeilijke endotracheale intubatie. De meeste sterfgevallen bij konijnen (60%) treden op tijdens de post-anesthetische fase. Adequate postoperatieve zorg is dus cruciaal om de anesthesie-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit te beperken. Stress kan levensbedreigend zijn voor konijnen en kan onder andere veroorzaakt worden door hospitalisatie en pijn. Inzicht in het gedrag en de noden van een konijn, het herkennen van pijn en goede pijnbestrijding zijn daarom belangrijke stappen om tot een succesvolle recovery te komen. Deze casus heeft als doel de basisprincipes van anesthesie en analgesie bij het konijn te bespreken, waarbij aan de hand van een klinische case dieper zal worden ingegaan op de mogelijke problemen en complicaties die kunnen optreden en de preventie ervan.
2
2. CASUÏSTIEK Op 1 oktober 2013 werd een 2 jaar oude, vrouwelijk intacte Franse hangoor van 6,8 kg aangeboden op de faculteit diergeneeskunde te Merelbeke met de klacht van vermageren en abdominale distentie. Op lichamelijk onderzoek was het abdomen duidelijk opgezet, moeilijk te palperen en erg gevoelig. Er was geen sprake van vaginale uitvloei en urineren en defaeceren verliepen normaal. De body condition score (BCS) werd geschat op 2/5. Op echo abdomen werd een pyo/hydrometra vastgesteld. Het konijn werd gehospitaliseerd en kreeg profylactisch 10 mg/kg enrofloxacine (Baytril, Bayer) intraveneus (IV) toegediend via een 24G-katheter in de marginale oorvene. De volgende dag werd een ovariohysterectomie uitgevoerd. Op pre-anesthetisch onderzoek was de pols sterk en regelmatig geslagen met een frequentie van 240 slagen per minuut (bpm), de capillaire vullingstijd (CVT) was minder dan 2 seconden en de mucosae waren roze. Long- en hartauscultatie waren normaal. Er waren geen tekenen van neusvloei en hoesten. Normaalwaarden voor verschillende fysiologische parameters worden opgesomd in tabel 1.
Ademhalingsfrequentie Hartfrequentie Lichaamstemperatuur Drinkwateropname Bloeddruk (MAP)
30-60/minuut 180-325/minuut 38.5-40.5°C 100 ml/kg lichaamsgewicht/dag 70-170 mmHg
Tabel 1: Fysiologische parameters bij het konijn. Na toedienen van 10 mg/kg enrofloxacine (Baytril, Bayer) IV werd het konijn gepremediceerd met 20 µg/kg buprenorphine (Vetergesic, Patheon) IV en gepreoxygeneerd via een masker (2 L/min). De inductie gebeurde met 0,3 mg/kg midazolam (Dormicum, Roche Pharma) in combinatie met 10 mg/kg ketamine (Anesketin, Eurovet) IV, gevolgd door 0,4 mg/kg alfaxalone (Alfaxan, Vétoquinol) IV. Doseringen werden berekend op een lichaamsgewicht van 5 kg, rekening houdend met het gewicht van de uterus. Na een vlotte inductie werd overgegaan tot tracheale intubatie (3,5 mm ID endotracheale tube met cuff). Hiervoor werd een “blinde’ techniek toegepast waarbij men gebruik maakt van de capnograaf bevestigd aan de endotracheale tube. Aan de hand van het capnogram kan in dit geval worden waargenomen wanneer de tracheotube juist zit. De larynx werd vooraf lokaal verdoofd door middel van 0,2 mL lidocaïne (Xylocaine 2%, AstraZeneca). Onderhoudsanesthesie gebeurde met isofluraan in zuurstof, waarbij gebruik werd gemaakt van een rebreathing systeem. Als vloeistoftherapie tijdens de anesthesie werd Ringer lactaat (B. Braun Vet Care Hartmann’ s Lactated Ringers Solution) toegediend 10 mL/kg/u. De ademhaling gebeurde spontaan gedurende de volledige anesthesie. Monitoring omvatte pulse-oximetrie (Cicero, Dräger), capnografie (Cicero, Dräger), invasieve bloeddrukmeting (Cardiocap, Datex) via een 22G-katheter in de a. auricularis van het rechteroor en bloedglucosemeting (One touch ultra 2, Lifescan). Elektrocardiografie (Cardiocap, Datex) werd aangesloten, maar werkte niet. De gemiddelde bloeddruk (Mean Arterial Pressure (MAP)) was gedurende de gehele anesthesie gelijk aan of minder dan 60 mmHg. Om de hypotensie te corrigeren werd aan de start van de chirurgie een bolus kristalloïden van 10 mg/kg IV toegediend, wat een bloeddrukstijging gaf van 48 mmHg naar 60 mmHg. Op het moment dat de uterus uit het
3
abdomen gehaald werd, trad er opnieuw een bloeddrukdaling op tot 41 mmHg. Vervolgens werd een bolus colloïden van 5 mL/kg IV toegediend. Deze gaf slechts een lichte bloeddrukstijging tot 45 mmHg, waardoor werd besloten 0,5 mg/kg efedrine (Ephedrine Sulfate, Sandoz) IV toe te dienen. Ook dit had weinig effect op de bloeddruk. Overige parameters waren stabiel gedurende de volledige anesthesie. De recovery verliep vlot en postoperatief was de rectale temperatuur 37,5°C. De temperatuur werd verder opgevolgd en een Bair hugger werd gebruikt tot de lichaamstemperatuur weer op peil was. Vloeistoftherapie werd dezelfde dag nog verdergezet door middel van subcutane (SC) toediening van 20 mL Ringer lactaat (B. Braun Vet Care Hartmann’ s Lactated Ringers Solution) om de 2 uur. Buprenorfine (0,05 mg/kg IV om de 6-12 uur), metoclopramide (Primperan, Sanofi Aventis, 0,5 mg/kg IV, 3 keer per dag), en silicone (0,7 ml per os (PO), 3 keer per dag) werden toegediend. De ochtend na de operatie waren er aanwijzingen voor een lichte ileus en werd er besloten cisapride (Cisaral drops, ASTfarma, 0,5 mg/kg, PO, 3 keer per dag) op te starten. Drie dagen na de operatie kon het konijn naar huis. Antibiotica (10 mg/kg enrofloxacine (Baytril, Bayer), PO, 2 keer per dag) en ontstekingsremmers (0,5 mg/kg meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim), PO, 2 keer per dag) werden nog enkele dagen verder gezet, cisapride werd gestopt.
4
3. DISCUSSIE 3.1 Voorbereiding op de anesthesie Vooraleer aan de eigenlijke anesthesie te beginnen is het, net zoals bij andere species, van uiterst belang dat men zich goed voorbereidt. Een goede anamnese en pre-anesthetisch onderzoek zijn hierbij erg belangrijk. Men moet onnodige stress bij het konijn zoveel mogelijk proberen te voorkomen. Stress zorgt immers voor vrijstelling van corticosteroïden en catecholamines wat nadelige gevolgen heeft, onder andere op verschillende organen (tabel 2)3,4. Het reduceren van stress, zowel tijdens hospitalisatie als anesthesie, is dus een belangrijke factor om tot een goede recovery te komen. Cardiovasculair
Tachycardie, aritmieën, veranderde cardiac output en verhoogde myocardiale O2 consumptie, vasoconstrictie
Respiratoir
Verhoogde ademhalingsfrequentie met kleiner tidaal volume
Metabool
Hyperglycemie, katabole effecten, verminderde wondheling en immuunrespons
Gastro-intestinaal
Anorexie en verminderde gastro-intestinale motiliteit met als gevolg •
dehydratatie en negatieve energiebalans hepatische lipidose en vetinfiltratie in de nieren
•
maagulcera
•
fermentatie van de inhoud gasaccumulatie maagdilatatie
•
sterfte
Tabel 2: Nadelige gevolgen van stress op verschillende organen (Grint et al., 2013)3.
In de anamnese is het onder andere belangrijk om te vragen naar het ziekteverloop en de aanwezige symptomen, zowel aspecifieke (lusteloosheid, depressie, zwakte) als specifieke (zoals abdominale distentie, vaginale uitvloei en symptomen van nierinsufficiëntie in geval van pyometra). Ook moet men op de hoogte worden gebracht over de huidige medicatie die het konijn krijgt of eerder kreeg toegediend, eerdere complicaties tijdens/na anesthesie en eventueel reeds aanwezige specifieke aandoeningen. Dit konijn kreeg preventief enrofloxacine IV toegediend. Andere antibiotica die veilig aan konijnen kunnen worden toegediend worden opgesomd in tabel 35.
Actief bestanddeel
Dosis
Enrofloxacine
5-20 mg/kg PO/SC/IM sid of bid 5 mg/kg IV bid Kan irriterend zijn bij (spiernecrose/abcessen): verdunnen Niet bij jonge dieren (kraakbeenschade)
Metronidazole
20 mg/kg PO bid 40 mg/kg PO bid
Oxytetracycline
50 mg/kg PO bid
Procaine penicilline
40000 U/kg SC bid
Trimethoprim/sulfa
30 mg/kg PO bid
injectie
Tabel 3: Veilig te gebruiken antibiotica + dosering voor gebruik bij het konijn (Herman K, 2013)5. PO= per oraal; SC= subcutaan; IM= intramusculair; IV= intraveneus; sid.= 1 maal per dag; bid= 2 maal per dag.
5
Ook het gevaar van andere problemen, zoals obesitas, anorexie en dehydratatie moet vooraf geëvalueerd worden en, indien mogelijk, gecorrigeerd worden3,4,5. Dehydratatie kan gecorrigeerd worden door het volume vocht toe te dienen dat bekomen wordt door het lichaamsgewicht te vermenigvuldigen met het geschat dehydratatiepercentage, met een maximum van 60 mL/kg/u bij erge hypovolemie3. Bij milde dehydratatie kan men het vocht eventueel subcutaan (SC) toedienen, waarbij men best niet meer dan 20 mL/kg per plaats injecteert. Bij matige tot erge dehydratatie moet men altijd opteren voor intraveneuze (IV) of intraosseuze (IO) toediening, omdat de absorptie na subcutane toediening zeer traag verloopt3. Intraveneuze katheterisatie gebeurt meestal ter hoogte van de marginale oorvene met een 22-24G katheter (figuur 1 en 2)3,4. Men kan de punctieplaats vooraf lokaal verdoven door middel van een topicaal anestheticum (EMLA crème, AstraZeneca) en dit 30 minuten te laten inwerken. Bepaalde sedativa (bv. α-2 adrenerge agonisten) zullen aanleiding geven tot perifere vasoconstrictie en het plaatsen van de katheter daarna bemoeilijken. Andere venen die eventueel gebruikt kunnen worden zijn de a. saphena en de a. cephalica. Het plaatsen van een katheter is eveneens nuttig voor het inspuiten van anesthetica en analgetica en voor het waarborgen van de vochtbalans tijdens de anesthesie3,4.
Figuur 1: Marginale vena auricularis; figuur 2: Plaatsing van een katheter in de marginale vena auricularis (uit Longley et al., 2008)4.
Obesitas kan aanleiding geven tot hypertensie, een hoge basale hartfrequentie en cardiale hypertrofie, waardoor obese konijnen slechte kandidaten zijn voor anesthesie. Bovendien zijn ze gepredisponeerd voor het ontwikkelen van hepatische lipidose3,4,5. De druk van de volumineuze abdominale organen op het diafragma en de longen kan de ventilatie ernstig belemmeren, zeker indien het konijn in dorsale decubitus gepositioneerd wordt. Dit probleem is nog meer uitgesproken in geval van obesitas (of abdominale distentie). Het is daarom belangrijk dat de thorax iets boven het abdomen gepositioneerd wordt (trendelenburg positie) en dat er een mogelijkheid is tot artificiële respiratie. De doseringen van de gebruikte producten dienen berekend te worden op basis van het mager lichaamsgewicht. Hoewel het konijn in dit geval niet obees was (BCS van 2/5), was het lichaamsgewicht niet representatief voor het echte lichaamsgewicht omwille van de aanwezigheid van een omvangrijke hydro/pyometra. Naast het doseren op het ideale lichaamsgewicht, is het nog meer van belang dat men titreert op effect. Indien men doseringen opzoekt in handboeken moet men er rekening mee houden dat deze vaak gebaseerd zijn op studies met proefdieren die specific-pathogen-
6
free (SPF) zijn en dus gezonder zijn dan normale dieren. Daardoor liggen de vermelde dosissen vaak hoger dan deze gebruikt in de praktijk3. Een routinematig bloedonderzoek is niet nodig bij gezonde konijnen, maar kan aangewezen zijn indien afwijkingen gevonden worden op klinisch onderzoek. Wanneer men een bloedonderzoek uitvoert moet ermee rekening gehouden worden dat het nut beperkt is ten gevolge van het ontbreken van goede referentiewaarden. Bij deze patiënt had men eventueel een bloedonderzoek kunnen doen om de nierfunctie te evalueren. Rekening houdend met de anamnese, het pre-anesthetisch onderzoek en de aanwezige aandoening, werd het konijn ingedeeld in ASA (American Society of Anesthesiologists) -klasse 3 (i.e. erge systeemziekte met functionele limitatie- waarbij intraveneuze katheterisatie, vochttherapie en mogelijkheid tot ventilatie sterk aangeraden worden). Bij konijnen is het niet nodig, en zelfs niet wenselijk, dat ze uitgevast worden. Konijnen zijn immers niet in staat om te braken en het uitvasten zal weinig effect hebben op het volume van de abdominale organen. Bovendien kan uitvasten aanleiding geven tot dysbacteriose en het ontstaan van 3,4,5,8
hypoglycemie
. Eventueel kan men wel de voeding 1 uur pre-operatief wegnemen om het
achterblijven van voedsel in de mondholte te voorkomen8. 3.2. Premedicatie Premedicatie dient hoofdzakelijk om inductie en onderhoudsanesthesie vlotter te laten verlopen, om dosisreductie van andere anesthetica te bekomen en om verschillende nevenwerkingen en stress te beperken5. Hiervoor maakt men gebruik van sedativa, analgetica en eventueel anticholinergica. Deze laatste, zoals atropine (Atropine sulfaat, Vedco) en glycopyrrolaat (Robinul, Baxter Healthcare Corporation), onderdrukken de vagale activiteit met als gevolg een verminderde speeksel- , bronchiaal-, en zweetsecreties en een toename in hartfrequentie met een gedaald slagvolume3,8,9,10. Men raadt aan deze producten niet routinematig te gebruiken, maar enkel wanneer sterke vagale reflexen optreden gedurende de anesthesie3,8,10. Veel konijnen bezitten het enzym atropinesterase, waardoor atropine niet werkzaam is3,11. Als alternatief kan er gebruik gemaakt worden van het meer potente glycopyrrolaat. De gebruikte dosis bedraagt 0,01 mg/kg IV en 0,1 mg/kg SC of intramusculair (IM)3,4,5,9. In dit geval was er geen indicatie voor het gebruik van anticholinergica. Verschillende sedativa, zoals acepromazine, midazolam, α-2 adrenerge agonisten en fluanisone kunnen gebruikt worden voor de sedatie en/of premedicatie van konijnen. Aangezien deze producten over weinig tot geen analgetische eigenschappen beschikken worden ze, zeker in het geval van pijnlijke ingrepen, altijd gegeven in combinatie met een analgeticum, voornamelijk opiaten (in het kader van preventieve analgesie, zie 3.6.). Opiaten hebben zowel sedatieve als analgetische eigenschappen en de mate van analgesie is afhankelijk van het soort opiaat dat gebruikt wordt4,10,12. Er zijn grote verschillen in snelheid van inwerking en werkingsduur tussen de verschillende producten en alle producten (maar voornamelijk de volle µ-agonisten) geven aanleiding tot een dosisafhankelijke ademhalingsdepressie en bradycardie10,12.
7
Major tranquilizers, waaronder acepromazine (Placivet, KELA N.V.) geven ten gevolge van het αsympaticolytisch effect, aanleiding tot vasodilatatie met als gevolg hypotensie en hypothermie. Dit laatste kan, zeker bij kleine dieren zoals konijnen, problemen geven waardoor het gebruik van dit product dus beter vermeden wordt10. Alpha-2 adrenerge agonisten geven een diepe sedatie en goede viscerale analgesie en spierrelaxatie, maar het gebruik ervan is beperkt tot gezonde en jonge dieren (ASA-1 en 2)3,4,8,10. Dit omwille van de uitgesproken cardiovasculaire effecten, zoals bradycardie en hypotensie. De geadviseerde dosis bedraagt 80-100 µg/kg IM of SC voor medetomidine (Sedator, Eurovet) en 25 µg/kg IM voor dexmedetomidine (Dexdomitor, Orion). De effecten kunnen ongedaan gemaakt worden met het antidoot atipamezole (Antisedan, Orion, 1 mg/kg). Minor tranquilizers, waaronder midazolam (Dormicum, Roche Pharma), geven een goede sedatie en spierrelaxatie met minimale cardiorespiratoire effecten, waardoor het gebruik ervan niet beperkt is tot gezonde dieren8,9,10,13. Midazolam kan worden gebruikt aan een dosis van 0,5-1 mg/kg IV of IM en kan ook intranasaal (IN) toegediend worden3,14. De excitatie die reeds beschreven werd bij hond en kat wordt niet opgemerkt bij konijnen10,13. Antidotering kan door middel van flumazenil (Flumazenil, Sandoz, 0,1 mg/kg). De combinatie van fentanyl met fluanisone (Hypnorm, Animal Medics, 0,2-0,3 ml/kg, IM) geeft een goede sedatie en analgesie gedurende 3 uur. Fentanyl is een volle opioïd-agonist die vooral op de µ-receptor inwerkt en voornamelijk analgesie en sedatie geeft, maar daarnaast ook voor een uitgesproken ademhalingsdepressie kan zorgen. Fluanisone (butyferonderivaat) zorgt voor sedatie en kan de respiratoire depressie, veroorzaakt door fentanyl, gedeeltelijk teniet doen3,4,8,9. In deze case werd als premedicatie enkel gebruik gemaakt van buprenorfine, waardoor een milde sedatie bekomen werd. Buprenorfine is een opioïd die behoort tot de partiële µ-agonisten, met een langdurige werkingsduur (6-12u). Door de sterke bindingsafficiteit voor de µ-receptor is het niet mogelijk, om binnen deze werkingsduur, de analgesie nog te versterken door herhaalde toediening (‘ceiling effect’) of toediening van een volle µ-agonist10,12. De geadviseerde dosis van burpenorfine bedraagt 0,01-0,05 mg/kg SC of IV3,4,5,8,9. Als antidoot kan gebruik gemaakt worden van naloxone (Narcan, Endo pharmaceuticals, 0,03 mg/kg). Er wordt aangeraden na de premedicatie de patiënt 3-5 minuten te pre-oxygeneren voor inductie, om zo de zuurstofsaturatie te maximaliseren en op deze manier te anticiperen op mogelijke problemen, zoals inductieapnee. Dit kan het beste door gebruik te maken van een goed aansluitend en doorzichtig masker om de zuurstofstroom zoveel mogelijk te optimaliseren en gelijktijdig de kleur van de mucosae te kunnen observeren3,4,8,9. 3.3. Inductie Inductie van de anesthesie kan gebeuren door gebruik te maken van injecteerbare anesthetica of door volatiele anesthetica via maskerinductie. Dit laatste wordt het best vermeden bij dieren die bewust zijn, omdat de geur van de isofluraan en sevofluraan aanleiding geeft tot inductieapnee, met als gevolg bradycardie, hypoxie en hypercapnie. Het kan eventueel gebruikt worden indien het dier erg verzwakt of gesedeerd is, en moet dan steeds voorafgegaan worden door pre-oxygenatie waarna men de concentratie van het anesthetica gradueel opbouwt3,4,5,8,12. Maskerinductie kan nuttig zijn voor ASA-
8
klasse 3 of 4 patiënten, omdat de cardiovasculaire neveneffecten hierbij minimaal zijn. Bovendien kan de inductie onmiddellijk stopgezet worden indien nodig, waarbij de gassen zich snel terug uit het lichaam verwijderen3. De voorkeur voor inductie gaat uit naar een gebalanceerd protocol, bestaande uit een combinatie van verschillende injecteerbare producten (tabel 4). Ketamine, behorend tot de dissociatieve anesthetica, wordt routinematig gebruikt voor inductie van konijnen. Het is een NMDA-receptor antagonist, die de NMDA-receptor blokkeert en er zo voor zorgt dat pijnprikkels niet meer worden doorgegeven naar de hersenschors3,10. Dit geef aanleiding tot een oppervlakkige slaap en somatische analgesie, waarbij geen
spierrelaxatie
optreedt
en
de
reflexen
behouden
blijven3,4,9,10.
Ketamine
werkt
10
sympaticomimetisch, met als mogelijke nevenwerkingen hypertensie en tachycardia . Omdat ketamine geen spierrelaxatie geeft moet het altijd gegeven worden in combinatie met een ander product, zoals α-2 adrenerge agonisten of midazolam. Bij het gebruik van α-2 adrenerge agonisten verkiest men medetomidine (Sedator, Eurovet) boven xylazine (Rompun, Bayer), omwille van de minder uitgesproken cardiovasculaire en respiratoire neveneffecten15. Alpha-2 adrenerge agonisten geven een beperkte mate van analgesie (zie 3.6.), die versterkt kan worden door het toedienen van opiaten. Deze combinatie zorgt voor chirurgische anesthesie gedurende 30-40 minuten en kan dus volstaan voor intubatie en korte ingrepen5. Wil men de effecten van medetomidine ongedaan maken door toediening van atipamezole (Antisedan, Pfizer) dan wacht men best tot dat de ketamine uitgewerkt is (ongeveer 40 minuten), omdat anders spiertremoren en –rigiditeit kunnen ontstaan. Toediening van fentanyl/fluanisone, gevolgd door midazolam ongeveer 10-15 minuten later, geeft een goede chirurgische anesthesie gedurende 30-40 minuten3,4,8,9,12. De toediening van midazolam is noodzakelijk omdat fentanyl/fluanisone op zichzelf geen spierrelaxatie geeft3. Deze combinatie kan aanleiding geven tot een matige ademhalingsdepressie en een langdurige recovery door de lange werking van fluanisone en midazolam3,4,8. Het voordeel van deze combinatie is dat ze volledig geantidoteert kan worden door de toediening van buprenorfine of naloxone en flumazenil8. Een ander veel gebruikt inductiemiddel is propofol (Propovet, Abbott Animal Health). Dit product staat bekend om zijn snelle metabolisatie (ter hoogte van nier, longen en lever) en dus snelle recovery3,4,10. Propofol is minder effectief bij het konijn in vergelijking met andere species. Bij het toedienen van de geadviseerde dosis (tabel 4) wordt slechts een lichte en korte anesthesie bekomen12, bij het gebruik van hogere doseringen neemt het risico op apnee en hypotensie sterk toe3,4,12. Om deze redenen is het gebruik van propofol voor onderhoudsanesthesie bij konijnen niet aangewezen4,8. Het risico op inductieapnee kan sterk verminderd worden door het traag te injecteren4. Om de dosis zo laag mogelijk te houden, is een goede premedicatie aangewezen (bv. fentanyl/fluanisone) alvorens over te gaan tot inductie met propofol4. De effecten teweeggebracht door het inductiemiddel alfaxalone (Alfaxan, Vétoquinol), zijn vergelijkbaar met deze van propofol: een lichte en korte anesthesie gedurende 5-10 minuten met inductieapnee als vaak voorkomend neveneffect3,12,16. De doseringen die bij het konijn nodig zijn om tot een chirurgische anesthesiediepte te komen, kunnen aanleiding geven tot plotse apnee gevolgd tot hartstilstand12. Dit product is dus eveneens geen goede kandidaat voor onderhoudsanesthesie, maar wel voor inductie en intubatie16. Het geeft een snelle inductie en recovery, lichte analgesie en een goede spierrelaxatie10,16.
9
Door in deze case een combinatie van producten te gebruiken, slaagde men erin met lage doseringen tot een vlotte inductie te komen en de vaak voorkomende inductieapnee, geassocieerd met alfaxalone, te vermijden.
Product
Dosis (mg/k g)
Route
Effect (F)
Opmerkingen
Ketamine3,12
10 -15
IV/IM
Immobiliteit, lichte slaap en perifere analgesie
Pijnlijke I.M. toediening geen spierrelaxatie, reflexen behouden, sympatische stimulatie
+ medetomidine
1
IM
Chir. anesthesie van 20-30min
+ midazolam
0.5-2
IM/IV
Lichte anesthesie van 20-30 min
0.2-0.3
IM
Fentanyl/fluanisone3,8 + midazolam3,8
Matige ademhalingsdepressie en lange recovery
0.5-2
IV
Chir. anesthesie van 20-40 min.
Propofol 3,8
3-6 3,8
IV
Lichte anesthesie van 5-10 min.
Inductieapnee + hypotensie Snelle inductie + recovery
Alfaxalone8,16
2-3
IV/IM
Lichte anesthesie van 5-10 min.
Inductieapnee Snelle inductie + recovery
Tabel 4: Injecteerbare producten met dosissen gebruikt voor inductie van het konijn (Grint et al., 20133; Grint et 16 8 al., 2008 ; Wenger et al.,2012 ). PO= per oraal; SC= subcutaan; IM= intramusculair; IV= intraveneus; sid= 1 maal per dag; bid = 2 maal per dag; Chir= chirurgische
Na inductie, met onder andere als gevolg het verdwijnen van de kaaktonus, kan overgegaan worden tot intubatie. De oropharynx van het konijn is gekenmerkt door een lange en nauwe mondholte, vlezige tongbasis en een smalle glottis gevoelig voor spasmen3,4,9. Ten gevolge van deze anatomische kenmerken is endotracheale intubatie bij het konijn moeilijker dan bij hond en kat, maar gezien de verschillende voordelen is het toch steeds het proberen waard. Intubatie biedt bescherming tegen luchtwegobstructie, vergemakkelijkt de overschakeling naar artificiële respiratie indien nodig, voorkomt apnee als reactie op de geur van inhalatieanesthetica en vermijdt omgevingspollutie met volatiele gassen3. Om necrose te voorkomen en om tubes met een zo groot mogelijke diameter te kunnen gebruiken, wordt meestal gebruik gemaakt van tubes zonder cuff3,4,5,9. De diameter van de tube kan variëren van 2-5,5 mm, afhankelijk van grootte van het konijn3. De passage kan vergemakkelijkt worden door de tube te bespuiten met een silicone spray en door op de larynx een lokaal anestheticum (zoals lidocaïne) aan te brengen, zodat laryngospasmen vermeden worden3,4,8,9. Omdat tijdens een normale hoofdpositie de nasopharynx aansluit op de trachea, is het noodzakelijk dat de nek van het konijn in hyperextensie gebracht wordt zodat de oropharynx verbinding maakt met de trachea. Men maakt onderscheid tussen een blinde intubatietechniek en een techniek waarbij men de larynx tracht te visualiseren3,4,8,9. Het is de bedoeling de tube in te brengen tijdens de inspiratiefase, omdat de stembanden zich dan in abductie bevinden. Bij de blinde techniek baseert men zich op de ademhalingsgeluiden- en bewegingen. Visualisatie van de larynx kan bekomen worden met een pediatrische laryngoscoop of een otoscoop, waarna een urinaire katheter in de trachea kan gebracht
10
worden als leidraad voor de tracheotube over te leiden. Op het moment dat de tube de trachea binnentreedt zullen sommige konijnen hoesten. Wanneer de tube juist zit zijn de ademgeluiden aan het einde van de tube hoorbaar en zal er bij aansluiting van de capnograaf, een capnogram zichtbaar zijn. Het laryngeale weefsel is zeer gevoelig en trauma ervan kan aanleiding geven tot zwelling en bloeding met als gevolg luchtwegobstructie. Om deze reden is het uiterst belangrijk dat bij het ondervinden van weerstand de tube onmiddellijk teruggetrokken wordt en dat na maximaal 3 pogingen overgegaan wordt tot het gebruik van een goed aansluitend masker of een alternatieve techniek4,5. Eén van deze alternatieven is nasotracheale intubatie. Hierbij blijft de mondholte vrij, wat een voordeel is tijdens het uitvoeren van tandheelkundige ingrepen. Deze techniek zou gemakkelijker uit te voeren zijn dan de endotracheale intubatie, omdat deze weg de natuurlijke ademroute van een konijn is17. Ook het plaatsen van een laryngeaal masker is eenvoudiger dan endotracheale intubatie. Een laryngeaal masker bestaat uit een tube met opblaasbare cuff die over de larynx geplaatst wordt (figuur 3)3,4,8. Ze zijn in verschillende maten verkrijgbaar, maar de kleinste maat is bedoeld voor konijnen van meer dan 4 kg, waardoor deze techniek dus niet toepasbaar is voor kleinere konijnen. Een ander nadeel van dit masker is dat de trachea niet goed wordt afgesloten, waardoor vocht afkomstig van de mond of oesophagus geaspireerd kan worden en waardoor intermitterende positieve druk ventilatie (IPPV) aanleiding kan geven tot maagdilatatie.
Figuur 3: Een laryngeaal masker (uit Grint et al., 20133).
Deze nadelen zijn niet aanwezig bij het gebruik van een supraglottic airway device (V gel, Millpledge)3,18. Dit apparaat maakt gebruik van een niet-opblaasbare cuff bestaande uit gel om de glottis op een atraumatische manier af te sluiten. Daarnaast sluit het eveneens de oesophagus af (figuur 4 en 5). Er bestaan verschillende maten waarvan de kleinste geschikt is voor konijnen vanaf 600 gram.
11
Figuur 4: V-gel® supraglottic airway devic, Millpledge; Figuur 5: Schematische weergave van V-gel® supraglottic 18 airway device in situ (http//:millpledge.com ).
3.4. Onderhoud Voor een korte procedure kan een combinatie gebruikt voor inductie volstaan (zoals ketamine met medetomidine), voor langere procedures kunnen eventueel na-injecties gegeven worden, kan er een constant rate infusion (CRI) opgestart worden met deze combinatie (totaal intaveneuze anesthesie (TIVA)) of kan men overschakelen op gasanesthesie5,12. In alle gevallen is zuurstofsupplementatie een must3. De inductiecombinatie die zich het beste leent voor TIVA is fentanyl/fluanisone met midazolam3.
De
anesthesieduur
kan
verlengd
worden
door
bijkomende
dosissen
van
fentanyl/fluanisone toe te dienen (0,1 mg/kg). Echter, als de anesthesie meerdere uren duurt kan men zich best beperken tot herdosering met enkel fentanyl (30-100 µg/kg) om accumulatie van fluanisone te voorkomen12. Ook de combinatie van ketamine met medetomidine kan voor TIVA gebruikt worden door het injecteren van 1/3de van de oorspronkelijk toegediende dosis8. Het voordeel van TIVA is dat het gemakkelijk, voorspelbaar en effectief is, en dat er geen technisch materiaal voor nodig is. Nadelen zijn de onmogelijkheid om de diepte van de anesthesie te regelen en de langere recovery. Gasanesthesie kan men daarentegen gemakkelijk titreren op effect en doordat de volatiele anesthetica een lage bloed-gascoëfficiënt hebben en weinig gemetaboliseerd worden (3% voor sevofluraan en 0,2% voor isofluraan), zullen ze aanleiding geven tot een snelle en rustige recovery3,10. De minimum alveolaire concentratie (MAC) van de verschillende gassen is hoger bij konijnen (3,7% voor sevofluraan en 2,49% voor isofluraan) dan bij honden of katten (bv. hond: 2,36% voor sevofluraan en 1,28% voor isofluraan)3,10. Alle volatiele anesthetica geven een dosisafhankelijke ademhalingsonderdrukking met als gevolg een daling van het tidaal volume en dus uiteindelijk een stijging van paCO2 3,4,10. Het tidaal volume van een konijn is kleiner dan dat van een hond of kat en bedraagt tijdens anesthesie ongeveer 6 mL/kg3,4. Volatiele anesthetica hebben ook een onderdrukking van cardiovasculair systeem tot gevolg, met een daling van het hartdebiet en de bloeddruk en een verminderde renale bloedvloei3,4,10. Deze effecten kan men minimaliseren door een adequate vochttherapie. De snelheid voor onderhoudsvochttherapie bedraagt 4 mL/kg/u, maar tijdens anesthesie dient deze opgedreven te worden tot 10 mL/kg/u om te compenseren voor de hierboven vermelde cardiovasculaire depressie en verliezen ten gevolge van bloedverlies en evaporatie via de luchtwegen en de open buikholte3. Aangezien het bloedvolume van een konijn slechts 60 mL/kg bedraagt (in tegenstelling tot 90 mL/kg bij de hond) is zelfs een beperkte hoeveelheid bloedverlies van
12
belang. Het gebruik van N2O als draaggas bij konijnen wordt afgeraden. Eén van de redenen is het risico op accumulatie in een met lucht gevulde ruimte, zoals bijvoorbeeld in het maagdarmstel bij tympanie of ileus3. De bloed-gascoëfficiënt van N2O is veel hoger dan deze van stikstof, waardoor elke molecule stikstof wordt vervangen door meerdere moleculen N2O en er op die manier accumulatie en dus volume toename van de holte kan optreden3,10. Een andere reden waarom men N2O als draaggas bij konijnen best vermijdt, is het veelvuldig voorkomen van (subklinische) respiratoire problemen. Door het toedienen van een combinatie van N2O en O2 (meestal 50:50) is het ingeademde zuurstofpercentage (FiO2) minder dan bij het gebruik van 100% O2. Het volumepercentage O2 in de ingeademende lucht moet gedurende de hele anesthestie minimaal 30% bedragen3,10. Een voordeel van N2O als draaggas is dat het analgetische eigenschappen heeft en dat het de behoefte aan andere volatiele anesthetica vermindert3,10. Een bijkomend voordeel is het ‘second gas effect’ waarbij het simultaan toegediende volatiele anestheticum sneller opgenomen wordt aan het begin van de anesthesie3,10. Indien men toch op een veilige manier N2O wil gebruiken wordt aangeraden dit slechts tijdelijk te doen en deze naar het einde van de anesthesie tijdig te vervangen door 100% O2 om het ontstaan van diffusiehypoxie te vermijden3,10. Bij de keuze van het anesthesiesysteem voor kleine dieren moet men opteren voor het systeem met de minste dode ruimte en weerstand3,10. De voorkeur gaat daarom uit naar een half-open systeem, zoals het co-axiaal systeem van Bain of het T-stuk van Ayre, waarbij de verwijdering van het geëxpireerde CO2 gebeurt door een overmaat aan verse gassen3,10. Open systemen, zoals een masker, vereisen hoge flows en percentages. Hierbij treedt er omgevingspollutie op, wat schadelijk is voor de gezondheid van de werknemers. Om deze reden en omwille van de vele voordelen van intubatie zou het gebruik van een masker zoveel mogelijk beperkt moeten worden. Gezien het effect van gasanesthesie op de bloeddruk is het, vooral in dit geval van een slechte algemene toestand, zeer belangrijk de dosis volatiel anestheticum zo laag mogelijk te houden door een goede premedicatie en voldoende analgesie. 3.5. Monitoring De monitoring zou moeten starten vanaf het moment van premedicatie en moet verder gezet worden tijdens de recoveryperiode. Monitoring kan gebeuren door middel van de eigen zintuigen en kan ondersteund worden door allerlei technische hulpmiddelen. De diepte van de anesthesie kan gecontroleerd worden aan de hand van de aan- of afwezigheid van reflexen. De terugtrekreflex is negatief bij het bereiken van een chirurgische anesthesiediepte. De corneareflex moet steeds positief blijven, anders wijst dit op een gevaarlijk diepe anesthesie4,19. Door het evalueren van de polssterke en -frequentie (via a. auricularis centralis en a. femoralis) en de mucosae (kleur en CVT), kan men een idee krijgen over de cardiovasculaire toestand. De normale polsfrequentie van een konijn varieert tussen 180-350 bpm, maar kan bij konijnen gepremediceerd met medetomidine dalen tot 120 bpm. Dit is te wijten aan een toegenomen vagale tonus als antwoord op de initiële hypertensie ten gevolge van de α2-receptor stimulatie. Het gebruik van een oesophageale stethoscoop kan helpen om de hartfrequentie op te volgen. De respiratoire functie kan geëvalueerd worden aan de hand van beweging van de thorax of ademballon. De normale ademhaling bij konijnen is regelmatig en traag,
13
met een frequentie van 30-60 bewegingen per minuut. Monitoring op basis van eigen zintuigen is goedkoop, maar subjectief en vereist ervaring, waardoor bijkomende monitoring door middel van technische apparatuur sterk aan te raden is. Capnografie geeft informatie over metabolisme, ventilatie, circulatie en over het anesthesietoestel (o.a. lekken, te lage flow bij non-rebreathing systemen)3,10. Sidestream capnografen zijn te verkiezen boven mainstream capnografen omdat deze de minste weerstand en dode ruimte opleveren3,4. Het normale eind-tidale CO2 gehalte ligt bij konijnen tussen 35-45 mmHg3. Pulse-oximetrie wordt onder andere aangeraden wegens het veel voorkomen van subklinische ademhalingsinfecties bij konijnen3. De probe kan geplaatst worden op de tong, het oor of de tenen3,4. Perifere vasoconstrictie, pigmentatie en beharing kunnen interfereren met de meting en pulse-oximeters voor humane doeleinden kunnen onbetrouwbare resultaten geven, omdat ze niet ontworpen zijn voor dergelijk hoge hartfrequenties3,10. De zuurstofsaturatie (SaO2) dient net zoals bij andere species hoger te zijn dan 95%. Bloeddrukmeting kan direct gebeuren via een arteriële katheter in de a. auricularis centralis of indirect door middel van Doppler of oscillometrische bloeddrukmeting. De directe methode is het meest accuraat, maar het plaatsen van een arteriële katheter vergt ervaring en kan erge schade geven aan de oorschelp3,4. Doppler blijkt, in vergelijking met de invasieve meting, een overschatting te geven van de MAP met gemiddeld 10 mmHg7. De cuffbreedte moet ongeveer 40% van de omtrek van het lidmaat bedragen en kan net distaal van de elleboog of proximaal van de knie geplaatst worden. De normale bloeddruk van een konijn is gelegen tussen 70-170 mmHg, en hypotensie wordt gedefinieerd als zijnde een gemiddelde bloeddruk van minder dan 60 mmHg bij arteriële bloeddrukmeting en minder dan 80 mmHg indien een indirecte techniek gebruikt wordt6,7. In dit geval was de hypotensie, die gedurende de volledige anesthesie gezien kon worden, niet alleen te wijten aan de invloed van de anesthesie zelf, maar ook aan de met vocht gevulde uterus die uit het abdomen werd verwijderd. Hoewel men heeft proberen anticiperen op de aankomende bloeddrukdaling, kon deze niet vermeden worden. Ook de daaropvolgende bolus colloïden en efedrine brachten nauwelijks verandering in deze toestand. Monitoring van de lichaamstemperatuur kan intermitterend gebeuren met behulp van een thermometer of continu door het gebruik van een temperatuur probe (thermistor). Deze laatste kan in de nasopharynx, oesophagus of het rectum geplaatst worden. Terwijl rectale meting eerder een perifere temperatuur weergeeft, weerspiegelt de oesophagale probe de temperatuur van het hart en dus de ‘kern’ temperatuur. De grotere lichaamsoppervlakte/volume ratio van kleine dieren maakt ze bijzonder 3 gevoelig voor hypothermie . Bovendien onderdrukken anesthetica het thermoregulatiecentrum,
kunnen ze aanleiding geven tot perifere vasodilatatie en zorgen non-rebreathing systemen voor extra warmteverlies via de luchtwegen. Dit, samen met de onbeweeglijkheid tijdens anesthesie en het scheren en scrubben van het operatieveld, zorgt ervoor dat hypothermie een regelmatig voorkomende complicatie is tijdens de anesthesie van een konijn3. Door hypothermie verlaagt het metabolisme en verandert als gevolg daarvan ook de farmacokinetiek. Hierdoor gaat de metabole klaring van geïnjecteerde anesthetica trager en vermindert de MAC waarden van volatiele anesthetica3,9. Hypothermie kan tegengegaan worden door eenvoudige methodes, zoals het gebruik van warmtematjes of dekentjes, het toedienen van intraveneuze vloeistoffen op lichaamstemperatuur, het gebruik van povidone-iodine scrub ( in plaats van alcohol) en het bedekken van de oorschelpen met
14
isolerend materiaal aangezien deze een grote rol spelen in thermoregulatie3,9,20. Ook het gebruik van een rebreathing systeem, zoals in deze casus, draagt bij tot het beperken van het evaporatief warmteverlies via de luchtwegen aangezien de warme uitgeademde lucht, na verwijdering van CO2, terug ingeademd wordt. Het voorkomen van hypothermie is gemakkelijker dan het terug opwarmen van een afgekoeld dier3. Monitoring en tijdig ingrijpen is dus belangrijk. 3.6. Analgesie Het is belangrijk pijn tijdig te herkennen, zodat men kan ingrijpen alvorens er nadelige effecten optreden te wijten aan de stressrespons (tabel 2). Het waarnemen en evalueren van pijn is moeilijker bij prooidieren, omdat deze zullen proberen hun pijn te verbergen. Het is belangrijk om inzicht te hebben in het normale gedrag van een konijn8,21,. Tekenen van pijn zijn onder andere een verminderde eetlust, apathie, veranderde houding/gang, overdreven likken en bijten ter hoogte van een bepaalde plaats, weinig tot geen faecesproductie, gesloten ogen, zelfmutilatie, agressie, vocalisatie en tandenknarsen. Het doel van gebalanceerde analgesie is deze symptomen tegen te gaan, de recovery te versnellen en daarmee postoperatieve mortaliteit te reduceren. De keuze van analgetica die gebruikt zullen worden, wordt onder andere bepaald door patiëntfactoren (diersoort, leeftijd, de toestand), de analgetica die eventueel reeds toegediend werden, de gebruikte anesthesiemethode, de te verwachte pijn en weefselschade, de ervaring van de dierenarts en de 22 beschikbaarheid van analgetica . Een goede analgesie wordt bekomen door preventief en
multimodaal te werken8,22. Preventieve analgesie is het toedienen van analgetica alvorens de pijnlijke stimulus heeft plaatsgevonden23. Dit is gebaseerd op het feit dat pijn, veroorzaakt door weefselschade en ontsteking tijdens de chirurgische ingreep, aanleiding geeft tot sensitisatie van het centrale zenuwstelsel en daardoor bijdraagt aan het ontstaan van postoperatieve pijn. Het doel is dus deze sensitisatie te voorkomen21,23. Preventieve analgesie kan gebeuren door middel van opiaten, nonsteroïdale ontstekingsremmers (NSAIDs) en lokale anesthesie21. Bij multimodale analgesie maakt men gebruik van een combinatie van analgetica die op verschillende punten van het pijntraject ingrijpen, nl. de transductie, transmissie, modulatie en perceptie. NSAID’s en corticosteroïden beïnvloeden de transductie, lokale anesthetica werken in op de transmissie en dissociatieve anesthetica, opiaten en α2-adrenerge agonisten beïnvloeden de modulatie van pijn. Perceptie wordt gewijzigd door middel van sedativa. Verschillende analgetica kunnen een synergistisch effect hebben, waardoor de werkzame dosis verlaagd wordt en er dus ook minder neveneffecten optreden. Dit is onder andere het geval voor opiaten in combinatie met NSAID’s. Omdat konijnen, in vergelijking met rodentia, minder gebruikt worden voor de ontwikkeling van analgetica zijn er ook minder gegevens bekend omtrent farmacokinetiek en -dynamiek in deze species
9,24
. Het bepalen van de dosis voor konijnen gebeurt daarom vaak door extrapolatie vanuit
andere species24,25. Om deze reden is het uiterst belangrijk gebruik te maken van een pijnscoresysteem aan de hand van het gedrag, de symptomen en fysiologische parameters (voedselopname, faecesproductie, activiteit,…) van het konijn9, hoewel dit tot op heden een grote uitdaging is aangezien konijnen vaak ‘bevriezen’ in aanwezigheid van een observator26. Data omtrent de efficiëntie van analgetica zijn meestal verkregen uit analgesiometrische testen, waarbij een pijnlijke
15
stimulus (thermisch, elektrisch, mechanisch,…) wordt toegediend en men de verandering in respons nagaat voor en na het toedienen van analgesie9. Deze testen zijn het beste bruikbaar om de werking van opioïden te evalueren, maar veel minder voor NSAID’s9. NSAID’s verminderen de vorming van prostaglandines door remming van het enzym cyclo-oxygenase (COX), waarvan er 2 isoenzymen bestaan (COX-1 en COX-2). COX-1 is vooral verantwoordelijk voor het reguleren van verschillende fysiologische processen (zoals nierdoorbloeding en bescherming van de maagmucosa), terwijl COX-2 vooral instaat voor de synthese van inflammatoire prostaglandines. Om neveneffecten zoals gastroinestinale en renale toxiciteit te vermijden, moet men de inhibitie van COX-1 zoveel mogelijk beperken door te kiezen voor een selectieve COX-2 remmer. De neveneffecten zijn dosisafhankelijk en dus is 24 het belangrijk het farmacokinetische profiel te kennen alvorens NSAID’s routinematig te gebruiken .
Konijnen lijken minder gevoelig te zijn voor de neveneffecten in vergelijking met de meeste andere species21,27. Veel verschillende NSAID’s (tabel 5) werden reeds gebruikt bij het konijn, maar het NSAID bij uitstek is meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim). Meloxicam is een populaire onstekingsremmer voor gezelschapsdieren en tevens het enige NSAID waarvan data beschikbaar zijn omtrent farmacokinetiek en –dynamiek bij konijnen24,26,28. Het succes ervan is te danken aan de veiligheid, de effectiviteit en het simpele gebruik (smakelijke suspensie per os). Tot op heden werden er nog geen neveneffecten gerapporteerd. Dit laatste kan men verklaren door de selectieve inhibitie van COX-2. In een studie werd aangetoond dat een dosis van 1,5 mg/kg/dag gedurende 5 dagen geen aanleiding geeft tot neveneffecten24. Deze studie toonde eveneens aan dat de metabolisatie en de eliminatie van meloxicam sneller verloopt in vergelijking met andere species, met een maximum plasmaniveau 6-8u na toediening. Doseringen hoger dan 0,3 mg/kg kunnen nodig zijn om optimale plasmaspiegels te onderhouden24. Voor de bestrijding van postoperatieve pijn blijkt een initiële dosis van 1 mg/kg gevolgd door 0,5 mg/kg/dag analgesie te verschaffen, maar combinaties met opioïden worden aangeraden om een optimale analgesie te bekomen26. Actief bestanddeel
Dosis (mg/kg)
Route
referentie
Aspirine
10 - 100 bid
PO
9,25,29,30
Carprofen
1 - 4 bid
PO/SC/IV
8, 29,30
Ketoprofen
1 - 3 bid
IM
9,25,29,30
Ibuprofen
2-10 sid/bid
PO
29
Paracetamol
1 mL in 100 mL water
PO
9, 30
Meloxicam
0,3 – 1,5 sid
PO/SC
24
Piroxicam
0,2 – 0,3 tid/qid
PO
9, 29, 30
Flunixine
1,1 sid/bid
SC
9,25,29,30
Tabel 5: NSAIDs met doseringen voor konijnen.
Opiaten (tabel 6) zijn zeer geschikt voor het bestrijden van matige tot erge postoperatieve pijn en zijn daarnaast, door hun centrale werking, geschikt voor het bestrijden van viscerale pijn21,27. Ze dienen steeds parenteraal gegeven worden, omwille van de slechte orale biologische beschikbaarheid. Neveneffecten zoals sedatie, ademhalingsdepressie en ileus zijn dosis- en productafhankelijk8,10. Het negatieve effect op de maagdarmmotiliteit kan men relativeren gezien pijn-geïnduceerde ileus van
16
ergere aard is dan deze geïnduceerd door opiaten. Tevens kan een juiste keuze van opiaat dit effect verder beperken8,27. Opiaten kunnen ingedeeld worden op basis van hun activiteit op de verschillend receptoren. Buprenorfine geeft een matige analgesie en heeft slechts milde sedatieve eigenschappen, waardoor het zeer geschikt is voor postoperatieve analgesie in het geval van milde tot matig pijnlijke procedures8,21,27. Het gebruik ervan in het kader van preventieve analgesie moet steeds met nodige voorzichtigheid gebeuren aangezien de analgesie, indien niet voldoende, niet meer versterkt kan worden door de toediening van volle agonisten. Efficiënte transmucosale absorptie werd reeds aangetoond voor verschillende species (fret, kat) en zou een gemakkelijke toedieningsweg betekenen voor het verderzetten van analgesie door de eigenaar31. Butorfanol (Torbugesic, Zoetis) (tabel 6) is een gemengde agonist-antagonist met een agonistische werking op de κ-receptor en een antagonistische werking op de µ-receptor21,27. Door deze receptorwerking geeft butorfanol, in tegenstelling tot andere µ-receptoragonisten, weinig aanleiding tot ademhalingsdepressie, maar heeft het wel analgetische en sedatieve eigenschappen21,27. Dit laatste is ideaal in het kader van preventieve analgesie, maar is niet gewenst voor postoperatieve pijnbestrijding. Gezien de korte werkingsduur van 2-4u is frequente herdosering nodig of dient er een CRI worden aangelegd om een adequate analgesie te bekomen27. Ook hier moet men eraan denken dat, door de sterke µ-receptor binding, de analgesie niet meer versterkt kan worden door toediening van volle agonisten. Actief bestanddeel
Dosering + interval
Route
Butorfanol
0,5 mg/kg, q2–4u
IV/SC
0,1–0,3 mg/kg/u CRI
IV
Buprenorfine
0.01–0,05 mg/kg, q6-10u
IV/SC
Morfine
0.5 – 5 mg/kg
IM éénmalig pre-operatief
fentanyl
1–4 µg/kg/u CRI
IV tijdens anesthesie om dosis anesthecum te verlagen
25 µg/u
Transdermale patch
0,5 mg/kg
IV pre-op
10 µg/kg/min CRI
IV tijdens operatie
2 µg/kg/min CRI
IV gedurende 24u post-operatief
Tramadol
5–10 mg/kg, q12–24u
PO
Lidocaïne
2–4 mg/kg
Lokale infiltratie
ketamine
Tabel 6: Andere analgetica en doseringen gebruikt bij konijnen (Johnston et al., 200527) De volle µ-agonisten, zoals fentanyl en morfine hebben sterke analgetische eigenschappen, maar kunnen eveneens aanleiding geven tot ademhalingsdepressie en erge ileus. Fentanyl is lipofiel en geeft aanleiding tot een snelle, maar korte (30 minuten) analgesie10,21. Het kan in combinatie met fluanisone gebruikt worden voor premedicatie of individueel als transdermale patch (Duragesic patches, Janssen)21,27. Uit een studie waarbij het gebruik van fentanyl patches voor konijnen geëvalueerd werd, bleek dat plasmaconcentraties, effectief bewezen in andere species, behaald kunnen worden met een patch van 25 µg/u, maar dat er een sterke interindividuele variabiliteit optreedt32. Deze variabiliteit werd eveneens gerapporteerd bij andere species, maar bij konijnen kan
17
de snelle haargroei een bijkomende rol spelen in een verminderde absorptie32. Bijkomende studies zijn nodig om de therapeutische plasmaconcentratie van fentanyl in konijnen te bepalen en om de ernst van de gerapporteerde neveneffecten zoals ademhalingsdepressie, sedatie en gewichtsverlies te evalueren32. Bij de toediening van morfine parenteraal, werden bovenop deze neveneffecten bijkomend nog bradycardia, hypertensie en hyperglycemie gerapporteerd9,33. Om deze reden wordt het gebruik van morfine best beperkt tot een éénmalige toediening pre-operatief. Epidurale toediening van morfine verschaft daarentegen een langwerkende (12-24u) excellente analgesie zonder nevenwerkingen ideaal voor het uitvoeren van orthopedische of abdominale chirurgie21,27. Tramadol (Ultram, Janssen) is behalve een µ-receptor agonist ook een serotonine en noradrenaline reuptake inhibitor21,27. Uit een farmacokinetische studie waarbij intraveneuze injecties met tramadol werden toegediend aan konijnen is gebleken dat er een grote variabiliteit in plasmaconcentraties en klinische effectiviteit bestaat na orale en intraveneuze toediening21,34. Een therapeutische dosering werd nog niet vastgelegd voor konijnen en doseringen zijn gebaseerd op extrapolatie vanuit andere species27. Uit een studie bleek een orale dosis van 11 mg/kg onvoldoende hoge plasmaconcentraties te geven voor voldoende analgesie bij mensen35. Neveneffecten werden nog niet gerapporteerd. Ketamine wordt bij konijnen vooral gebruikt in combinatie met andere producten voor inductie. Hoewel de analgetische eigenschappen van ketamine in konijnen nog niet onderzocht zijn, wordt het in andere species regelmatig gebruikt voor de bestrijding van erge pijn, zowel intra- als postoperatief via CRI27,36. Alpha-2 adrenerge agonisten geven naast sedatie en spierrelaxatie ook aanleiding tot analgesie, en zijn om deze reden zeer interessant als preventieve analgesie. Omwille van de sedatieve effecten zijn deze producten minder geschikt voor postoperatieve analgesie. De verschillende toepassingen van lokale anesthesie met lidocaïne en bupivacaïne (Marcain, AstraZeneca), zoals beschreven voor andere species, zijn ook bruikbaar bij konijnen8,9,21,27. Wel moet men steeds met de nodige voorzichtigheid te werk gaan om toxiciteit te voorkomen21,27. Lokale anesthesie kan bijdragen aan het tot stand brengen van zowel preventieve als multimodale analgesie. In deze case had de analgesie, bekomen door toediening van burpenorfine pre- en postoperatief, eventueel aangevuld kunnen worden door het gebruik van lokale infiltratie met lidocaïne ter hoogte van de incisieplaats. Het gebruik van α2-adrenerge agonisten was in dit geval niet aangewezen aangezien het geen volkomen gezonde patiënt was. 3.7. Postoperatieve zorgen Zoals reeds aangehaald werd in de inleiding, is de anesthesie-gerelateerde mortaliteit bij konijnen het hoogst tijdens de post-anesthetische fase. Toch zijn de basisprincipes voor goede postoperatieve zorgen eenvoudig: monitoring, pijnbestrijding (zie 3.6.) en het zoveel mogelijk beperken van stress geassocieerd met hospitalisatie. Het doel van goede postoperatieve zorg, is het dier te laten terugkeren naar een normale fysiologische toestand21. De hospitalisatie dient te gebeuren in een rustige en warme (25°C) omgeving waar het konijn goed geobserveerd kan worden. De monitoring van verschillende parameters, zoals activiteit, houding, eetlust, drinkwateropname, faeces- en urineproductie, hart- en ademhalingsfrequentie, slijmvliezen en lichaamstemperatuur helpen de toestand van het konijn te evalueren8,9,21, zodat men tijdig kan ingrijpen indien complicaties zouden
18
optreden. Om de lichaamstemperatuur op peil te krijgen kan men gebruik maken van een couveuse, warmtelamp of warmtematje. Maakt men gebruik van een warmtematje of-lamp moet men de nodige voorzorgen nemen om brandwonden te voorkomen en om te zorgen dat er niet geknaagd kan worden aan het elektrisch materiaal. De temperatuur moet regelmatig gecontroleerd worden (om het half uur) tot een temperatuur van 38°C bereikt wordt. De opvolging van de temperatuur dient enkele dagen postoperatief verder gezet te worden om bijvoorbeeld het ontstaan van koorts tijdig op te merken4,8,21. Vloeistoftherapie, eventueel met 5% dextrose, kan IV of SC verder gezet worden, zeker wanneer veel bloed verloren werd tijdens de operatie9,21. De bedding moet schoon en droog zijn en de aanwezigheid van voldoende ruimte is een voordeel om het natuurlijk gedrag van het konijn te kunnen observeren5,21. Voeding en water dienen zo snel mogelijk aangeboden én opgenomen te worden5,8,21. Het eetgedrag kan gestimuleerd worden door het aanbieden van smakelijk voeder, zoals vers geplukt gras, hooi van goede kwaliteit en verse groenten4,21. Er kan eventueel aan de eigenaar gevraagd worden om wat van het favoriete voedsel achter te laten. Omdat anesthesie, pijn en stress geassocieerd met hospitalisatie negatieve effecten kunnen hebben op gastro-intestinale motiliteit is het belangrijk voedselopname en faecesproductie nauwgezet op te volgen. De observeerder dient hiervoor in staat te zijn het onderscheid te maken tussen normale faeces, diarree en caecotrofen21. Bij vermoeden van ileus (geen/weinig harde faeces, anorexie, lusteloosheid) dient onmiddellijk ingegrepen te worden door dwangvoedering en het toedienen van prokinetica zoals cisapride (Cisaral drops, ASTfarma 0,5 mg/kg, PO, 2 maal per dag) en metoclopramide (Primperan, Sanofi Aventis, 0,5 mg/kg, PO of IV, 3 maal per dag)5,8,21. Dwangvoederen kan gebeuren met een speciaal daarvoor ontwikkeld voeder zoals Oxbow Critical care® en Supreme Science Recovery®, of alternatieven, zoals groentepotjes voor baby’s. Zonder tijdige en adequate therapie kan ileus aanleiding geven tot hepatische lipidose, maagulcera, maagdilatatie en sterfte (tabel 1)3,4,9. Om maagulcers tegen te gaan kan een maagzuurremmer zoals ranitidine (Zantac, Warner-Lambert Company) (5 mg/kg, PO, 2 maal per dag) toegediend worden21. Net zoals bij andere dieren is het belangrijk dat er niet aan de operatiewonde gebeten, gelikt of gekrabd wordt. Hechten zonder al teveel spanning en het voorzien van goede analgesie kan vaak voldoende zijn. Indien dit niet zo is kan men eventueel de snijtanden bijvijlen en het konijn een t-shirt aandoen. Het gebruik van een kraag kan stressvol zijn ten gevolge van een beperk zicht, moeilijk eten (caecotrofie wordt sterk belemmerd) en het storend gevoel ter hoogte van de oren21. 3.8. Preventie van complicaties peri- en postanesthesie De verschillende problemen en complicaties worden hier per anesthesiestadium nog eens samengevat waarbij er dieper wordt ingegaan op de preventie en therapie ervan. Indien men afwijkingen (dyspnee, dehydratatie, erge obesitas) aantreft op pre-anesthetisch onderzoek, kan men door stabilisatie van de patiënt en het aanpassen van het anesthesieprotocol vele problemen tijdens de anesthesie ontwijken/voorkomen (zie 3.1.). Complicaties tijdens de anesthesie (tabel 7) kunnen tijdig worden opgemerkt door adequate monitoring (zie 3.5.). Door middel van intraveneuze katheterisatie en intubatie kan men snel ondersteuning bieden indien noodsituaties zich voordoen. Wanneer mogelijk wordt er best gebruikt gemaakt van kortwerkende en antidoteerbare producten
19
(tabel 8). Indien men kritieke patiënten onder anesthesie brengt kan het verstandig zijn noodmedicatie vooraf klaar te leggen aan de juiste dosering (tabel 7). Als er geen intraveneuze katheter aanwezig is maar de patiënt wel geïntubeerd is, kan men deze medicatie ook in de tube laten druppel gevolgd door artificiële respiratie zodat de medicatie op een adequate manier verspreid wordt in de alveoli3. Complicatie
Preventie/therapie
Dosis
Apnee
1. Zit de tube nog goed, zijn de luchtwegen doorgankelijk? 2. Artificiële respiratie of thorax compressies starten (20-30/minuut) 3. Toedienen van antogonisten indien mogelijk 4. Doxapram toediening
5 mg/kg, IV/SC
hartmassage vasopressine adrenaline
0,8 IU/kg 0,2 mg/kg, IV of via tube
Hartstilstand
Arytmieën
Niet altijd therapie vereist! Indien wel: 2 mg/kg, IV of via tube Lidocaïne. Bradycardie Glycopyrrolaat 0,1 mg/kg IV of via tube Tachycardia Propranolol 0,1 mg/kg IV of via tube Hypotensie Bolus colloïden en herhalen indien nodig 5 mL/kg over 5-10 minuten Dopamine ? Adrenaline 0,2 mg/kg IV of via tube Efedrine ? noradrenaline ? Hypothermie Warme intraveneuze vloeistoffen Warmtematje, warme handschoentjes Bedekken van de oren Povidone-iodine scub gebruiken Hypoglycemie Niet uitvasten Monitoring glucose tijdens anesthesie Indien lange anesthesie of hypoglycemie optreedt: 5% dextrose infuus Convulsies 1. Antidoteren of uitschakelen anesthesie 2. Diazepam 1 mg/kg, IM/IV/SC 3. Glucose infuus indien hypoglycemie Tabel 7: Complicaties tijdens de anesthesie (Grint et al. 20133; Longley et al., 20084). ?= geen dosering voor het konijn bekend in de literatuur. Antidoot Atipamezole Flumazenil Naloxone
Antidoot voor dosis Medetomidine 1 mg/kg IV/SC Midazolam 0,1 mg/kg IV/SC µ-receptor agonist (sedatie + analgesie 0,03 mg/kg IV/SC beëindigd) Buprenorfine µ-receptor agonist (sedatie beëindigd, 0,01- 0,05 mg/kg IV/SC analgesie verder gezet) Tabel 8: Antidoten met gebruikte doseringen voor het konijn (Grint et al., 20133; Lipman et al.,19979). In deze case heeft men getracht de bloeddrukval op te vangen met bolussen colloïden en vervolgens efedrine. Efedrine is een kortwerkend product (5-15 minuten), heeft positief inotroop effect en geeft vasoconstrictie37. Het werkt in op zowel α als β-receptoren en bevordert de vrijstelling van endogeen noradrenaline37. Het voordeel van dit product is dat het in bolussen kan gegeven worden en er geen CRI opgestart moet worden zoals voor dopamine en noradrenaline. Voor hond en kat bedraagt de
20
geadviseerde dosis 0,1 - 0,2 mg/kg37. Aangezien efedrine bij het konijn minder goed werkzaam is dan bij hond en kat werd er hier gekozen voor een hogere dosering van 0,5 mg/kg38,39. Complicaties die kunnen optreden tijdens de anesthesie, kunnen zich ook voordoen post-anesthesie. Andere mogelijke complicaties post-anesthesie zijn chirurgie-gerelateerde problemen (bloedingen, wonddehiscentie,…) en ileus (zie 3.7.). Indien het konijn niet gehospitaliseerd wordt dient men de eigenaar te wijzen op het belang van een goede faecesproductie en eetlust binnen de 24u na de operatie. 4. BESLUIT Hoewel konijnen beschouwd worden als zijnde risicovolle anesthesiepatiënten, kan dit risico beperkt worden door een goede kennis van de anatomie en fysiologie, het gebruik van veilige anesthetica met doseringen toegespitst op de conditie van het konijn en een adequate monitoring. Het beperken van stress en pijn door goede postoperatieve zorgen en analgesie is een prioriteit in alle stadia en heeft een grote invloed op het slagen van de anesthesie. Opioïden en NSAIDs zijn momenteel de meest gebruikte analgetica, maar andere manieren van pijnbestrijding, zoals lokale anesthesie, moeten zeker overwogen worden.
21
5. LITERATUURLIJST 1. Bordbelt, D.C., et al. (2008). ‘The risk of death: the confidential enquiry into perioperative small animal fatalities.’ Vet Anaesth Anal 35:365-373,2008. 2. Clarke, K.W. and Hall, L.W., (1990). A survey of anaesthesia in small animal practice: AVA/BSAVA report. J Vet Anaesth 17, 4–10. 3. Grint, N. (2013). ‘Anaesthesia’ In: ‘Rabbit Surgery, Dentistry and Imaging’. Hartcourt-Brown, F. and Chitty, J., Replika Press, India. Chapter 1, p1-25. 4. Longley, L.A. (2008) ‘Rabbit anaesthesia’ In: ‘Anaesthesia of Exotic Pets. Philadalphia, PA, Saunders/Elsevier, Chapter 3, p. 36-58. 5. Herman, K. (2013). ‘Konijnen en knaagdieren in de praktijk’. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent. 6. Dominquez, R. (1927). The systolic blood pressure of the normal rabbit measured by a slightly modified van Leersum method: final report. J Exp Med. 31;46(3):443-61 7. Harvey, L. and Murison, P. (2010). ‘Comparison of direct and Doppler arterial blood pressure maesurements in rabbit during isoflurane anaesthesia. Abstract presented Spring AVA conference, Cambridge, UK, 30-31 Maart 2010. 8. Wenger, S. (2012). "Anesthesia and Analgesia in Rabbits and Rodents." Journal of Exotic Pet Medicine 21(1): 7-16. 9. Lipman, N., Marini, P., Flecknell P. (1997). ‘Anesthesia and analgesia in rabbits’ In: Dennis F. Kohn, ’Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals’, Acadamic Press, London. Chapter 10, p. 205-232. 10. Gasthuys, F. (2013). ‘Anesthesie bij de huisdieren’. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent. 11. Stormont, C. and Suzuki, Y. (1970). ‘Atropinesterase and cocainesterase of rabbit serum: localization of the enzyme activity in isoenzymes. Science 167:200. 12. Flecknell, P.A. (1987). ‘Laboratory Animal Anaesthesia: An Introduction for Research workers and Technicians.’ Academic Press, London. nd 13. Lumb, W.V., and Jones, E.W. (1984). ‘Veterinary Anaesthesia.’ 2 edition., Lea & Febiger,
Philadelphia. 14. Botner, S. and Sintov, A.(2011) "Intranasal Delivery of Two Benzodiazepines, Midazolam and Diazepam, by a Microemulsion System," Pharmacology & Pharmacy, Vol. 2 No. 3, pp. 180-188. 15. Difilippo, S.M. et al. (2004). ‘A comparison of xylazine and medetomidine in an aneaesthetic combination in New Zealand white rabbit. Contemp Topics Lab Anim Sci 43:31-34. 16. Grint, N.J. et al. (2008). ‘Clinical evaluation of alfaxalone in cyclodextrin for the induction of anaesthesia in rabbit’. Veterinary Record 163, 395-396. 17. Stephens DeValle, J.M. (2009). ‘Succesfull management of rabbit anesthesia through the use of nasotracheal intubation.’ Journal of the American Association of Laboratory Animal Science 48, 166170. 18. Millpledge, V-gel® supraglottic airway devic. http://millpledge.com. 19. van Praag, E. (2003). ‘Anesthesia of the rabbit Part II: Intra-anesthetic period, and its monitoring’. Ph.D.
22
20. Donelly, T.M. (2004). Rabbits: basic anatomy, physiology, and husbandry. In: ‘Ferrets, Rabbits and Rodents: Clinical medicine and surgery. Quesenberry, K.E. and Carpenter, J.W., Saunders, St. Louis, Missouri, 2nd edn. Pp. 136-146. 21. Johnson-Delaney C.A. and Hartcourt-Brown, F. (2013). ‘Analgesia and postoperative care’ In: ‘Rabbit Surgery, Dentistry and Imaging’. Hartcourt-Brown, F. and Chitty, J., Replika Press, India. Chapter 2, p26-38. 22. Folia veterinaria 2013 nr. 3, analgesie in de diergeneeskunde. 23. Muir, W.W. (2002). Physiology and pathophysiology of pain. In: ‘Handbook of veterinary pain management.’ Gaynor, J.S et al., St. Louis, Mosby. 24. Turner, P.V. et al. (2006). Pharmacokinetics of meloxicam in rabbits after single and repeat oral dosing. Comparative medicine 56, 53-67. 25. Liles, J.H. and Flecknell, P.A. (1992b). The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs for the relief of pain in laboratory rodent and rabbits. Lab animals 26, 242-55. 26. Leach, M.C. et al. (2009). Behavioural effects of ovariohysterectomy and oral administration of meloxicam in laboratory housed rabbits. Research in veterinary science 87, 336-347. 27. Johnston, M.S. (2005). ‘Clinical approaches to analgesia in ferrets and rabbits. In: ‘seminars in Avian and exotic Pet Medicine; 14(4): 299-335. 28. Carpenter, J.W. et al. (2009). ‘Single and multiple-dose pharmacokinetics of meloxicam after oral administration to the rabbit (Oryctolagus cuniculus)’. Journal of Zoo and Wildlife Medicine 40, 601-606. 29. Harkness, J.E. and Wagner J.E. (1995). ‘Biology and medicine of rodent and rabbits’. Williams and th Wilkins 5 edition.
30. Mook, M.D. (2005) ‘The Use of Analgesics in Rodents and Rabbit’s. Ph.D., Emory university. 31. Robertson, S.A. et al. (2003). ‘Systemic uptake of buprenorphine by cats after oral administration. Vet Rec 152, 675-678. 32. Foley, P.L. et al. (2001). ‘Evaluation of fentanyl transdermal patches in rabbits: blood concentrations and physiologic response. Comp Med 51: 239-244. 33. May, C.N. et al. (2005). Intravenous morphine causes hypertension, hyperglycaemia and increases sympatho-adrenal outflow in conscious rabbits. Clin Sci 75: 71-77. 34. Kuek, A., et al. (2005). Investigation of the pharmacokinetics and determination of tramadol in rabbit plasma by a high performance liquid chromatography-diode array detector method using liquidliquid extraction. Journal of chromatography B816, 23-208. 35. Souza, M.J. et al. (2008). ‘pharmacokinetics of oral tramadol in the domestic rabbit. Am J Vet Res 69: 979-82. 36. Gaynor, J.S. (2002). ‘Other drugs used to treat pain’. In: Handbook of veterinary pain management. Gaynor J.S. and Muir W.W.. St. Louis, Mosby. 37. Efficacy of preanesthetic intramuscular administration of ephedrine for prevention of anesthesiainduced hypotension in cats and dogs." The Canadian veterinary journal. La revue vétérinaire canadienne 50, No. 2 2009, pp. 179-84. 38. Chen, H.C., et al. (2007). ‘Use of ephedrine and dopamine in dogs for the management of hypotension in routine clinical cases under isoflurane anesthesia.’ 34(5):301-11.
23
39. Chen, K.K. et al. (1930). ‘Ephedrine and related substances’. The Williams and Wilkins company, London.
24
