Tennu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
PEMERIKSAAN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PADA ORGAN DALAM HE WAN DAN BAHAN MAKANAN SUPARTONO Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. RE Martadinata No . 30 PO BOX 151 Bogor
RINGKASAN Untuk menghasilkan produk biologik asal hewan percobaan seperti mencit putih, kelinci, marmot perlu diperhatikan kesehatannya Kemungkinan infeksi kuman Staphylococcus aureus bisa saja terjadi . Begitu pula produk pangan asal hewan yang mengandung daging dan telur . Penyakit yang dapat membahayakan kesehatan manusia asal makanan seperti keracunan makanan atau di sebut Food Borne Disease yang dapat di temukan pada daging (sapi, babi, unggas) . Staphylococcus aureus salah satu bakteri patogen juga dapat di isolasi dari bahan makanan . Secara mikroskopik dapat di lihat dengan pewarnaan gram berupa gram positif bentuk coccus / bulat berpasangan dan cluster / kelompok . tidak bergerak, dapat hidup secara aerob dan anaerob (facultative) . Organ limpa marmot, kelinci, tikus dapat di isolasi pada medium pengkaya seperti Trypticase Soy Broth, Brain Heart, Infusion Broth di lanjutkan dengan pemupukan pada medium agar Vogel Johnson dan Baird Parker. Hasil isolasi di perbanyak kemudian di identifikasi sebagai uji penegasan dengan uji agglutinasi plasma kelinci serta pembiakan pada media agar darah untuk melihat R hemolysis, yang dilanjutkan uji bio kimia dengan menggunakan gula-gula . Kata kunci: Hewan percobaan, Isolasi ; Staphylococcus aureus, bakteri patogen, medium agar . PENDAHULUAN Untuk menghasilkan produk biologik asal hewan percobaan seperti anti serum kelinci atau hewan lainnya perlu di perhatikan balk segi kebersihan, makanan dan kesehatan, Walaupun demikian masih terkadang infeksi tetap terjadi misalnya pada karkas kelinci, organ dalam, infeksi yang di sebabkan Staphylococcus aureus dapat di isolasi hingga 10% (KHALLA FALLA, 1992) kontaminasi organisme patogen apabila pada makanan dapat berbahaya karena endotoksin yang di hasilkan di antaranya a (alpha) hemolysin dan y (gamma) hemolysin . (MENESTRINA, et al 2003) Staphylococcus aureus apabila di warnai dengan pewarnaan gram akan terlihat positif berbentuk coccus/bulat gram berdiameter 0,7- 0,9 .tm dan tidak bergerak . Bakteri dapat tumbuh secara aerobik dan anaerobic, facultatif dengan membentuk kumpulan sel seperti buah anggur mampu bertoleransi pada temperatur tinggi (Cowan and Steel 1974) dan mampu tumbuh pada medium dengan kadar garam dan kadar gula tinggi . Staphylococcus aureus penyebab keracunan pada makanan atau Food Borne Disease (FBD) yang sering di ternukan pada daging (sapi, babi, unggas) produk ternak dan salad . Kontaminasi biasanya berasal dari
254
manusia, hewan, dan lingkungan ketika prosesing makanan. Bakteri ini memproduksi berbagai macam toksin dan sifatnya tahan panas, selain itu apabila menginfeksi manusia menyebabkan penyakit seperti infeksi pada folikel rambut, infeksi pada luka, meningitis dan pneumonia . Prosedur untuk mengisolasi Staphylococcus aureus yang berasal dari hewan secara klinis dapat di lakukan dengan pengambilan darah, cairan nanah/pus, sputum, urine (ISENBERG et al., 1980) uji pupukan kuman pada biakan cawan yang berisi media agar darah domba 5% yang telah didefibrinasi cawan dieramkan pada lemari pengeram dengan suhu 37 ° C selama 24 jam . Pengkayaan/ Enrichment untuk isolasi . Staphylococcus aureus berasal dari makanan (HEIDELLBAUGH et al ., 1978) yang di perkirakan kandungannya sedikit/kecil setelah melalui pemrosesan pemanasan, pembekuan, atau penyimpanan di tumbuhkan pada TSB (Trypticase soy Broth) dengan penambahan 10% garam, kemudian di lanjutkan dengan uji pupukan pada media selective Vogel Johnson agar (LEINEGER, 1976), Baird Parker agar (HOLBROOK et al ., 1969, Food and Drug administration 1976) . Isolasi dan identifikasi di perlukan dengan melakukan serangkaian uji reaksi MRVP . Uji gula-gula (Bio kimia) dan uji koagulasi
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Temu Teknis Nasiona! Tenaga Fungsional Pertanian 2006
dengan menggunakan plasma kelinci yang kemudian hasil uji di kofirmasikan pada tabel dan data pada Bergey's Mannual 1986 . Setelah kuman didapatkan segera di simpan pada agar miring sebagai koleksi kuman untuk di simpan dalam kering beku dan dapat di pergunakan untuk keperluan koleksi sebagai sumber plasma nutfah dan di simpan . Apabila di perlukan di lanjutkan dengan uji antibiotik sensitivitas terhadap berbagai jenis antibiotik sehingga pengobatan dapat di lakukan dengan pemberian obat yang tepat . MATERI DAN METODA Sampel Organ limpa, kelinci dan marmot di koleksi secara aseptis untuk menghindari pencemaran dan diusahakan selama pengambi-lan dalam kondisi dingirt, organ limpa diberi identitas asal hewan dalam kantong plastik steril . (Untuk pemeriksaan bahan makanan yang mengandung telur atau daging di tmbang seberat 25 gram yang kemudian di encerkan dengan pelarut Buffered Peptone Water sebanyak 225 ml atau dengan perbandingan I : 10 untuk organ hewan jumlah secukupnya) . Limpa di homogenisasi dengan cara menggerus hingga lembut kemudian suspensinya di ambil dan di pupukan pada medium pengkaya Trypticase Soy Broth atau Brain Heart Infusion (BHI) lalu di inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam . Setelah inkubasi di ambil 1-2 ose pada media agar Baird Parker atau Vogel Johnson agar yang mengandung potassium tellurite 2% sebagai supplemen penghambat bakteri pencemar . Kemudian setelah inkuhasi semalam di lakukan pengamatan koloni, Staphylococcus aureus pada medium selektive akan terlihat berwarna hitam yang sekelilingnya akan berwarna kuning . Besar koloni antara 0,5 sampai 1 mm, berbentuk cembung dan mengkilat . Koloni yang di duga S. aureus, lalu di perbanyak pada agar (TSA) atau media agar darah untuk melihat hemolysis (3 (Beta) . Selanjutnya di lakukan uji penegasan di mulai dengan pewarnaan, uji agglutinasi plasma kelinci serta uji lainnya seperti uji dengan gula-gula untuk bio kimia identilikasi
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Bahan Media Pertu mbuhan dan Supplemen Medium Trypticase Soy Broth, Trypticase soy agar, Media agar darah (domba) 5%, Media Vogel Johnson, Baird Parker agar, Plasma kelinci, Supplemen potassium Tellurite 2% . Isolasi S. aureus dari sample makanan Timbang 25 gram contoh yang akan di uji ke dalam wadah, tambahkan 225 ml larutan BPW dan homogenkan . Kemudian pipet 0,1 ml suspensi ke atas permukaan Vogel Johnson agar dan ratakan . Inkubasikan pada suhu 37° C selama 24 jam . Koloni S . aureus pada media VJA terlihat hitam, konvek mengkilat di kelilingi oleh areal berwarna kuning . Ambil koloni satu ose untuk di lakukan pengecatan gram . koloni yang diduga S. aureus kemudian di murnikan ke media agar . Setelah di peroleh koloni murni kemudian di identifikasi . Pewarnaan Gram Gelas objek di bersihkan dengan alkohol dan di fiksir di atas api . Ambil koloni kuman dengan ose lalu buat suspensi di atas objek glas dan biarkan mnegering atau fiksir di atas api . Tuangklan larutan kristal Violet pada sediaan dan biarkan I menit kemudian di cuci atau di bilas dengan air mengalir . Tuangkan larutan lugol iodine dan biarkan di atas selama I menit. Cucilah objek glas dengan alkohol 96% dengan cara menggoyangkan sambil sedikit di bilas dengan air mengalir hingga warna yang berlebih terbilas . Tuangkan larutan carbol Fuchsin atau safranin dan biarkan selama I menit. Bilas kembali dengan air lalu keringkan dan lihat di bawah mikroskop . Biakkan . Umur 24 'jam berwarna biru/gram positif bentuk bulat berpasangan atau kelompok seperti buah anggur . Uji Bio Kimia Uji Katalase Teteskan larutan Hydrogen Peroksida 3% di atas objek glass lalu dengan kawat ose ambil beberapa koloni disentuhkan pada cairan tadi tunggu dalam beberapa saat reaksi positif di tandai dengan terbentuknya
255
Tenni Teknts Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
gelembung di sekitar kumpulan koloni .
kawat
ose
dan
Uji Urease Inokulasikan kultur pada media urea agar miring dengan cara di goreskan pada permukaan agar kemudian di inkubasikan pada suhu suhu 37°C selama 24 jam . Hasil positif bila terbentuk warna merah .
Uji Reaksi Metyl Red-VP (Voges Proskauer) Inokulasikan bakteri ujipada media MRVP dan inkubasikan pada pada suhu 37° C selama 24 jam . Setelah inkubasi media men. jadi keruh lalu di tambahkan peubah atau reagen dengan urutan sbb : Uji MR dengan cara menambahkan 2 tetes reagen methyl red lalu kocok beberapa kali . Reaksi positif di tandai perubahan warna menjadi merah . Uji VP dengan media yang sama setelah uji MR di lanjutkan dengan uji VP dengan menambahkan 0,6 nil alpha naphtol soln dan 0,2 ml KOH 40% aq soln, kemudian kocok sedikit reaksi di tunggu mulai 20 sampai 30 menit, lihat perubahan warna, reaksi positif di tandai perubahan warna men.jadi merah .
Uji Gelatin Dengan menggunakan media agar nutrient yang di tambahkan gelatin, pengujian dengan cara mengambil bakteri uji dengan ose membentuk lingkaran dengan membentuk lingkaran dengan besar kurang lebih 0,5 cm di goreskan pada permukaan agar lalu di inkubasi suhu 37° C . Setelah inkubasi reaksi dengan menambahkan larutan Mercuric chloride di atas permukaan koloni . Tunggu beberapa saat reaksi positif di tandai dengan adanya zona bening di seputar lingkaran koloni . Uji Koagulasi
Uji Nitrat
Kultur yang di gunakan untuk uji koagulasi adalah kultur yangdi tumbuhkan pada Brain Heart Infusion (BHI) selam 1624 jam pada suhu 37 ° C atau suspensi di dalam BHI dari kultur yang di tumbuhkan pada agar miring Heart Infusion Agar (HIA) pada suhu 37 °C selama 16-24 jam . Sebanyak 0,5 ml plasma kelinci di tempatkan dalam tabung kecil di tambah tetes kultur atau suspensi BHI dan di inkubasi pada suhu 37 ° C . Staphylococcus yang bersifat koagulase positif akan menggumpalkan plasma dalam waktu I jam . Jika belum terjadi koagulasi, pengamatan di lakukan lagi setelah 3 jam inkubasi pada suhu 37°C sebelum kultur dinyatakan sebagai koagulase negatif . (Masniari dan Susan MN 2006) .
Inokulasikan kultur dalam nitrat broth dan di inkubasikan pada suhu 35 °C selama 5 hari . Tambahkan 0,2 ml reagen A kemudian reagen B . Reaksi negative/tidak mereduksi nitrat (tidak terjadi perubahan warna menjadi merah) . Reagen A 0,8% sulphalinic acid in 5 N-acetic acid (di larutkan dengan sedikit pemanasan) . Reagen B 0,6 % dimethyl-anaphthylamine in 5 N-acetic acid (di larutkan dengan sedikit pemanasan) .
Tabel 1 . Identifikasi staphylococcus aureus Jenis U.I'i Reaksi
R
Hemolisis +
Catalase
Reduksi Nitrat
Hydolisi Urea
Methyl Red
Voges proskauer
+
+
+
+
+
Tabel 2 . Reaksi uji gula-gula Staphylococcus aureus Gula-gula Reaksi
256
Glucosa
Lactosa
Maltose
Mannitol
Sucrose
Xylose
Pusat Penelitian dan Pengetnbangan Peternakan
Temn Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
HASIL DAN PEMBAHASAN Sebanyak marmot
dapat
30
organ
di
limpa
isolasi
2
pus/nanah dari isolat
Staphylococcus aureus . Sedangkan dari 30 sampel limpa kelinci dapat di isolasi 2 isolat . Adanya Staphylococcus aureus pada limpa marmot
maupun
menunjukkan
kelinci
oleh Staphylococcus aureus . tersebut
Dengan tahapan pengkayaan TSB (Trypticase Soy Broth) atau Brain Heart Infusion
dan di lanjutkan dengan pemupukan pada agar Vogel Johnson atau Baird Parker koloni berwarna hitam di sekelilingnya berwarna kuning kemudian di
bahwa hewan tersebut terdeteksi/ infeksi hewan
pada limpa, nampak seperti benjolan putih atau biasa di sebut perkejuan .
Secara klinis
tidak
menampakkan perubahan bahkan terlihat seperti sehat . lakukan pembedahan secara Setelah di
patologis dapat di lihat seperti adanya
sub kultur pada media agar darah untuk perbanyakan dan
melihat beta hemolysis .Untuk uji penegasan di lakukan agglutinasi plasma kelinci,berikut hasil yang di peroleh .
Tabel 3 . Hasil Pemeriksaan Organ dan Bahan Pangan Organ /Bhn pangan Limpa Limpa Produk pangan
Hewan
Jumlah
Marmot Kelinci -
30 30 27
KESIM PU LAN
Hasil + 2 Isolat + 2 Isolat 0 / Neg
Media Vogel Johnson Vogel Johnson Vogel Johnson
hadirkan dalm acara temu teknis . Semoga
berasal dari Organ limpa yang marmot dan kelinci di periksa menggunakan
Allah SWT membalas segala kebaikan ini . Ainien .
media pengkaya Trvpticase Sov broth atau
Brain Heart Infusion Broth lalu di subkultur pada media I'ogel Johnson atau Baird
Parker
agar yang di tambahkan supplemen
mempermudah seta mempercepat isolasi serta identifikasi apakah
Staphylococcus
ada/tidak. Begitu pula bahan pangan perlu di periksa apakah terdapat cemaran yang dapat kesehatan . Uji lanjutan membahayakan dengan memperbanyak isolat, pembiakan pada agar darah untuk melihat (3 hemolysis dan
uji
agglutinasi
plasma
kelinci .
Pemeriksaan bebas dari cernaran di ketahui dengan cepat sehingga menjamin produk yang di gunakan aman begitu pula hewan percobaan tidak tercampur organisme lain yang dapat mempengaruhi hasil .
UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan kali ini penulis mengucapkan banyak terima kasih atas bantuan ibu Masniari Pulungan dan Susan MN
atas koreksi dan memberikan
saran
bimbingan dalam penulisan makalah ini . Juga tidak lupa kepada panitia Temu Teknis Litkayasa atas penyelenggaraan acara ini . Tentunya tulisan ini jauh dari sempurna sehingga dapat di pcrbaiki dan dapat di
Pusat Penelitian dan Pengemhangan Peternakan
DAFTAR BACAAN BERGEY'S 1986 Mannual of systematic Bacteriology Vol ; 2 Kathy A . Kallafalla . Microbiogical status of rabbit carcases in Egypt 196 ;233-235 .july 30 . 1992 Menestrina G, m .Dallasera,M .Comai Ion Channels and bacterial infection, the case of G3-Barrel pore forming protein toxins of staphylococcus aureus HEIDELLBAUGH . D .B RAWLEY E .M POWERS CT BOURLAND 1976 performance of stable Versions of Bairds Parke's medium for isolating Staphylococcus aureus J .Appl Bacterial 32 .187-192 . LEINEGER,H .V 1976 . equipment, Media, Reagents,,Routins test and strains in speech (editor) Compedium of methods for the microbigical Examination of foods, Americans public Healths, washington D .C : 10-94 PULUNGAN, MASNIARI DAN M NOOR, SUSAN, bahan praktikum 2006 ISENBERG . H.DJA WASHINGTON H .A BELOWS AND AC SONNENWIRTH 1980 Collection Handling and processingof specimens . Mannual of clinical Microbiology 3` d ed . American Society for Microbiology 5282 .
257
Tenni Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian 2006
ST
258
Cowans and steel's Mannual for the identification of Medical bacteria, second edition Cambridge University press
Pasat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
