SEMMELWEIS EGYETEM
GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Doktori (Ph.D.) tèzisek
CITOKRÓM P450 ENZIMEK IN VITRO ÉS IN VIVO INDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA REGENERÁLÓDÓ MÁJSEJTEKBEN
TAMÁSI VIOLA
Tèmavezetők: Dr. Monostory Katalin ès Dr. Dobozy Ottó
MTA Kémiai Kutatóközpont Kémiai Intézet Farmakobiokémiai Osztály és Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet
Budapest, 2004
Bevezetés A citokróm P450 enzimek (P450) számos exogén (gyógyszermolekulák, toxinok, peszticidek) és endogén (prosztaglandinok, szteroid hormonok, leukotriének) vegyület metabolizmusában vesznek részt. A legtöbb, xenobiotikum metabolizmusában részt vevő P450 enzim a májban fejeződik ki (1). A P450 enzimek regulációja nemcsak endogén szabályzó molekulák segítségével zajlik,
hanem
inhibítorok)
is
egyes
xenobiotikumok
képesek
befolyásolni
(induktorok, az
enzimek
mennyiségét és aktivitását. A reguláció legtöbbször nukleáris receptorokon (aromás szénhidrogén receptor, konstitutív androstán receptor, pregnán X receptor) keresztül történik. A ligand aktiválta nukleáris receptor a sejtmagba jutva dimerizálódik (pl. retinoid X receptorral, RXR) és a komplex a DNS megfelelő szakaszához kapcsolódik. Számos ko-aktivátor és ko-represszor molekula képes befolyásolni a komplex hatását (2, 3, 4). Az induktorok és endogén szabályzók mellett még számos más tényező is képes befolyásolni a P450 enzimek
aktivitását.
Például
2
ismert
tény,
hogy
sejtkárosodás során, sejtosztódáskor, vagy chirrhosis esetében ezen enzimek aktivitása megváltozik. A májsejtek osztódásának egyik ismert modellje a partiális hepatectomiát követő májregeneráció. Azt, hogy a májregeneráció során a P450 enzimek mennyisége lecsökken, először Von der Decken és Hutlin írta le 1960-ban (5). A partiális hepatectomiát követő P450 enzim csökkenést a későbbiekben sokan vizsgálták (6, 7). Számos hipotézis létezik a fenti jelenség magyarázatára: 1. a műtét soráni stressz, 2. a P450 enzimek degradációját végző egyik enzim, a hemoxigenáz aktivitása nő a regeneráció során (8), 3. sejtosztódáskor a sejtek fő feladata az osztódás, 4. a hepatocyták dedifferenciálódása során a specifikus, homeosztatikus feladatok háttérbe szorulnak (9), 5. a regeneráció során megnő a NO (nitrogén-monoxid) mennyisége, ami kötődve a P450 enzimek aktív centrumában lévő hem csoporthoz inaktiválja azt (10). Partiális hepatectomiát követve egyes P450 enzimek indukálhatósága is megváltozik, mert az indukciót szabályzó faktorok, nukleáris receptorok szintje a regeneráció során szintén változik. Például a RXR 3
mennyisége (11), ami fontos dimerizációs partner az indukció mechanizmusában, megnő a regeneráció során. Egy másik példa az aromás szénhidrogén receptor mennyiségének változása az osztódás során (12).
Célkitűzések Munkám során négy P450 enzim csoportot (CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A) vizsgáltam. 1. A kísérletsorozat első részében a májregeneráció, valamint a májregeneráció és in vivo dexametazon kezelés hatását figyeltük meg a patkány CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimeire. A következő kérdésekre kerestük a választ: •
Hogyan változik a CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és
CYP3A enzimek mennyisège ès aktivitása a regeneráció korai periódusában (0-72h)? •
Hogyan
dexametazon
hat a
egy szintetikus
glükokortikoid,
a
fenti
kifejeződésére
a
enzimek
regeneráció során?
4
2. A kísérletsorozat második rèszèben a CYP1A, CYP2E1 és CYP3A indukálhatóságát határoztuk meg. •
Vizsgáltuk, hogy mikènt változik a fenti enzimek
mennyisège ès aktivitása specifikus induktoraik (CYP1A; 3-metilkolantrèn,
CYP2E1;
imidazol,
CYP3A;
dexametazon) hatására regenerálódó májból izolált sejtekben? A kísérletekhez beállítottunk egy aktivitás mérési módszert a CYP2E1 indukciójának vizsgálatára májsejt kultúrában (klòrzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás).
5
Módszerek Operáció: Partialis hepatectomia: Higgins ès Anderson nyomán a máj 2/3-a került eltávolításra (13). Májperfúzió: Ca-mentesítés és kollagenázzal történő emésztés (14).
Mikroszóma preparáció: A mikroszóma frakciót differenciál centrifugálással izoláltuk. Mikroszómát nemcsak májszövetből, hanem sejtkulturából összegyűjtött sejtekből is preparáltunk.
Enzim aktivitás meghatározása: Mikroszomális és sejtkultúrából származó P450 enzimek aktivitásának vizsgálatára a következő specifikus szubsztrátokkal történő mérési módszereket használtuk: CYP1A; Etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitás (15) CYP2B; Pentoxirezorufin O-dealkiláz aktivitás (15) CYP2E1; p-Nitrofenol-hidroxiláz aktivitás (16) Etoxikumarin O-dealkiláz aktivitás (17) Klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás (18)
6
CYP3A; Aminopirin N-demetiláz aktivitás (19) Etilmorfin N-demetiláz aktivitás (20).
Western blot analízis: Az
enzimfehérjék
meghatározására
májból
és
sejtkultúrából származó mikroszómát használtunk. A gèlelektroforèzis SDS-poliakrilamid gèlben (7,5%-os), Laemmli módszere alapján törtènt (21). Nitrocellulòz membránra valò átjuttatás után (22) az izoenzimeket specifikus
antitest
immundetektálás
segítségével
során
két
mutattuk
antitestet
ki.
(primer
Az és
szekunder) használunk, melyekből az utóbbihoz tormaperoxidáz van kapcsolva (23). Statiszitika: Analízishez a Student féle t-próbát használtuk. A szignifikancia szint p<0.05 volt.
7
Eredmények és értékelésük Munkánk
során
májsejtekben,
azt
amit
vizsgáltuk,
partiális
hogy
hepatectomiát
osztódó követő
májregenerációval modelleztünk, milyen P450 enzim változásokat
tapasztalunk.
Vizsgálaltaink
során
a
következő megállapításokat tettük:
1. Partiális hepatectómia után a patkány májsejtek regenerációja során (72 órás periódus) a vizsgált P450 enzimek (CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A) aktivitása és fehérjemennyisége megváltozott: CYP1A
enzim
esetében
enyhe,
de
szignifikáns
csökkenést csak a nagyon korai időpontban találtunk, a későbbiek során az aktivitás értéke és a CYP1A1 fehérje mennyisége megegyezett az áloperált állatok értékeivel. CYP2B enzim aktivitása és fehérjemennyisége is rögtön lecsökkent a partiális hepatectomiát követően, azonban 72 órás periódus alatt nem állt vissza a kiindulási értékre. CYP2E1
enzim
aktivitása
a
regeneráció
kezdeti
szakaszában fluktuációt mutatott, ami fehérje szinten nem
8
mutatható ki, majd a későbbiek során lassan visszaáll a kiindulási értékre. CYP3A enzim esetében a korai időpontokban nincs aktivitás csökkenés, azonban 24 órával a partiális hepatectomiát követően drasztikusan lecsökken az enzim aktivitása és fehérjemennyisége.
2. In vivo dexametazon kezelés, ami egyben a regenerációs folyamatra és a P450 enzimekre is hatással van (lassítja a regenerációs folyamatot és egyes P450 enzimek
kifejeződését
befolyásolja),
regenerálódó
májban a P450 enzimek szintjét és aktivitását a következő képpen módosította: CYP1A ès CYP2B enzim esetében a dexametazon előkezelès mèrsèkelte a partiális hepatectomia okozta enzimaktivitás ès fehèrje vesztèst. CYP2E1 enzim esetében mind aktivitás, mind fehérje szintjén
a
dexametazon
megszüntette
a
korai
időpontokban tapasztalt fluktuációt. CYP3A esetében a dexametazon képes volt regenerálódó sejtekben is megőrizni az enzimek áloperált állatban mért értékét. 9
3. A harmadik kísérletsorozatban azt vizsgáltuk, hogy a P450
enzimek
(CYP1A,
CYP2E1
és
CYP3A)
indukálhatósága hogyan változik regenerálódó májból izolált sejtekben. Megállapítható, hogy a regenerálódó májból
izolált
sejtek
megtartották
P450
enzim
indukálhatóságukat, azonban az indukció mértékében eltérések tapasztalhatók: A CYP1A enzimek 3-metilkolantrén indukciójának mértéke nagyobb volt (3x) a három napig regenerálódó májból izolált sejtekben, mint az áloperált állatokból származó hepatocytákban. Az indukció során mind az aktivitás, mind a fehérje mennyiség megemelkedett. Imidazollal történő kezelés során a regenerálódó májból és az áloperált állatokból származó sejtek CYP2E1 indukciójának mértéke megeegyezett (2.5x). A
CYP3A
enzimek
dexametazonnal
kiváltott
indukciójának mértéke szintén nagyobb volt (2-2.5x) az 1, 3 és 7 napig a regenerálódó májbòl nyert sejtekben, mint az áloperált állatokból származó hepatocytákban.
Összefoglalva megállapítottuk, hogy a regeneráció során a P450 enzimek alapaktivitása és fehérjemennyisége is 10
csökkent. A CYP1A, CYP2B, CYP2E1 ès CYP3A enzimek csökkennek a regeneráció korai szakaszában, de a csökkenés mértéke minden enzim esetében más. Dexametazon kezelés hatására a partiális hepatectomia hatásai mérséklődnek. A partiális hepatectomia nemcsak az alapaktivitást, hanem
a
P450
enzimek
indukálhatóságát
is
megváltoztatja. Mind a három enzim indukálható a partiális hepatectomiát követően. A CYP1A és CYP3A enzimek esetében az indukció mértéke nagyobb volt a regenerálódó állatokból izolált sejtekben, mint az álloperáltakból származó hepatocytákban.
11
Irodalomjegyzék 1) Ioannides, C. (1996). Cytochromes p450 metabolic and toxicological aspects. CRC press, Boca Raton. 2) Honkakoski, P. and Negishi, M. (2000) Regulation of cytochrome P450 (CYP) genes by nuclear receptors. Biochem. J. 347: 321-337. 3) Zelko, I. and Negishi, M. (2000) Phenobarbital-Elicited Activation of Nuclear Receptor CAR in Induction of Cytochrome P450 Genes. Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 1-6. 4) Quatrochi, L.C. and Guzelian, P.S. (2001) CYP3A regulation: from pharmacology to nuclear receptors. Drug. Metab. Disp. 29: 615-622. 5) Van der Decken, A., and Hutlin, T. (1960). The enzymic composition of rat liver microsomes during liver regeneration. Exp. Cell Res. 19: 591-604. 6) Ronis, M. J. J., Lumpkin, C. K., Thomas, P. E., IngelmanSundberg, M. and Badger, T. M. (1992) The microsomal monooxigenase system of regenerating liver. Biochem. Pharmacol. 43, 567-573. 7) Trautwein, C., Rakemann, T., Obermayer-Straub, P., Niehof, M. and Manns, M. P. (1997). Differences in the regulation of cytochrome P450 family members during liver regeneration. J.Hepatol. 26: 48-54. 8) Yoshida, T., Arakaki, M., Kumakawa, J. and Kuroiwa, Y. (1984) An induction of heme oxygenase and its possible relation to the decrease of cytochrome P450 content during liver regeneration. J. Pharmacodyn. 7: 112-119. 9) Liddle, C., Murray, M., and Farrell, G. C. (1989). Effect of liver regeneration on hepatic cytochrome P450 isozymes and serum sex steroids in the male rat. Gastroenterol. 96, 864-872. 10) Steer, C. J. Liver Regeneration. (1995) FASEB J. 9:13961400. 11) Matsushima-Nishiwaki, R, Okuno, M, Adachi, S., Sano, T., Akita, K., Moriwaki, H., Friedman, S. L., Kojima, S. (2001) Phosphorylation of retinoid X receptor alpha at
12
12)
13) 14)
15)
16)
17)
18)
19)
20)
21)
22)
serine 260 impairs its metabolism and function in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 61: (20), 7675-82. Santini, R. P., Myrand, S., Elferink, C., Reiners, J. J. Jr. (2001) Regulation of Cyp1a1 induction by dioxin as a function of cell cycle phase. J. Pharmacol. Exp. Ther. 299(2): 718-28. Higgins, G. M. and Anderson, R. M. (1931) Experimenthal pathology of the liver. Arch. Pathol. 12, 186-202. Bayliss, M. K., and Skett, P. (1996) In: Human Cell Culture Protocols (ed. Jones G.E.) Humana Press, Totowa, NJ, 36990. Burke, M. D. and Thomson, S. (1970) Ethoxy-, pentoxy and benzyloxyphenoxazones and homologues: a series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P-450. Biochem. Pharmacol. 34: 3337-45. Reinke, L. A. and Moyer, M. J. (1985). A microsomal oxidation which is highly inducible by ethanol. Drug Metab. Disp. 13: 548-52. Monostory, K., Vereczkey, L. (1996) In vitro-in vivo correlation of CYP1A induction. Exp. Toxic. Pathol. 48, suppl. II., 291-294. Tamasi, V, Hazai E, Porsmyr-Palmertz M, IngelmanSundberg M, Vereczkey L, Monostory K. (2003) GYKI47261, a new AMPA [2-amino-3-(3hydroxymethylisoxazole-4-yl) propionic acid] antagonist, is a CYP2E1 inducer.Drug Metab Dispos. 31 (11):1310-4. Nash, T. (1953) The colorimetric estamination of formaldehyde by means of the hantsch reaction. Biochem. 55: 416-21. Hino, Y., Imai, Y., and Sato, R. (1974). Induction by phenobarbital of hepatic microsomal drug-metabolizing enzyme system in partially hepatectomized rats. J. Biochem. 76, 735-44. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide
13
gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350-4. 23) Pollard-Knight, D., Read, C. A., Downes, M. J., Howard, L. A., Leadbetter, M. R., Pheby, S. A., McNaughton, E., Syms, A., Brady, M. A. (1990) Nonradioactive nucleic acid detection by enhanced chemiluminescence using probes directly labeled with horseradish peroxidase. Anal. Biochem. 185(1) 84-9.
14
Az értekezés témájában megjelent közlemények 1) Tamási, V., Kiss, Á., Dobozy, O., Falus, A., Vereczkey, L. and Monostory, K. (2001) The effect of dexamethasone on P450 activities in regenerating rat liver. Biochem Biophys Res Commun. 286(2):239-42. 2) Tamási, V., Hazai, E., Porsmyr-Palmertz, M., Ingelman-Sundberg, M., Vereczkey, L., and Monostory, K. (2003) GYKI-47261, a new AMPA [2-amino-3-(3hydroxymethylisoxazole-4-yl)propionic acid] antagonist, is a CYP2E1 inducer.Drug Metab Dispos. 31(11):1310-4. 3) Tamási, V., Riedl, Zs., Dobozy, O., Falus, A., Vereczkey, L. and Monostory, K. (2004) In vitro induction of cytochrome P450 enzymes in hepatocytes isolated from regenerating rat liver. Pol. J.Pharmacol. (nyomtatás alatt).
Az értekezés témájához kapcsolódó poszterek 1) Kiss, Á, Tamási, V., Falus, A., Vereczkey, L.: Investigation of enzimes during liver regeneration. Meeting (Budapest, Aug. 22-26, Proceedings 14. 51.
Monostory, K. and cytochrome P450 7th European ISSX 1999) ibid. ISSX
2) Tamási, V., Monostory, K., Vereczkey, L., Kiss, Á., és Falus, A.: Citokróm P450 enzimaktivitás változások a
15
májregeneráció során. Tox 2000- Magyar Toxikológiai Társaság Kongresszusa (Balatonkenese, Okt. 19-21, 2000) P3.1. 3) Tamási, V., Dobozy, O., Falus, A., Vereczkey, L. and Monostory, K.: The effect of dexamethasone on P450 activities in regenerating rat liver. The 6th International ISSX Meeting (München, Okt. 7-11, 2001) Drug Metabolism Reviews 33. (Suppl) 1. 152. 4) Vereczkey, L., Tamási, V. and Monostory, K.: In vitro induction of CYP2E1 in rat and human hepatocytes. The 6th International ISSX Meeting (München, Okt. 7-11, 2001) Drug Metabolism Reviews 33. (Suppl) 1. 152. 5) Tamási, V., Dobozy, O., Falus, A., Vereczkey, L. és Monostory, K.: Citokróm P450 enzimek in vitro indukciója sejtkultúrában. X. Sejt- és Fejlődésbiológiai napok (Siófok, Márc. 27-29, 2002) P31. (6) Tamási, V., Vereczkey, L., Hazai, E., és Monostory, K.: In vitro induction of CYP2E1 in rat and human hepatocytes. 14th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations (MDM2002) (Sapporo, Japán, Júl. 22-26, 2002) P26-C46. (7) Monostory, K., Tamási, V., és Vereczkey, L.: In vitro induction of cytochrome P450 enzymes in hepatocytes isolated from regenerating liver. 14th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations (MDM2002) (Sapporo, Japán, Júl. 22-26, 2002) P26C46.
16
Az értekezés témájához kapcsolódó előadások 1) Tamási, V., Monostory, K., Vereczkey, L., Kiss, Á., és Falus, A.: Citokróm P450 enzimaktivitás változások a májregeneráció során. Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szimpózium (Mátraháza, Ápr 28-29, 2000) ibid. Abs. p 42. 2) Tamási, V., Monostory, K., Kiss, Á., Vereczkey, L., és Falus, A.: Citokróm P450 enzimaktivitások a májregeneráció során. 2000, Magyar Biokémiai Társaság Molekuláris Biológia szekciójának V. Munkaértekezlete (Sopron, Máj. 8-11, 2000) GE-3. 3) Tamási, V., és Monostory, K.: Citokróm P450 enzimek és a májregeneráció kapcsolata. III.PhD Iskola (Mátraháza, Ápr. 10-12, 2000). 4) Tamási, V., Kiss, Á., Falus, A., Monostory, K., és Vereczkey, L.: Citokróm P450 enzimek változása a májregeneráció során. VIII. Sejt- és Fejlődésbiológiai napok (Pécs, Jan 17-19, 2000) E21. 5) Tamási, V., és Monostory, K.: CYP2E1 enzim indukciója májsejtkultúrában. IV. PhD iskola (Mátraháza, Ápr. 22-24, 2001). 6) Tamási, V., Hazai, E., Vereczkey, L., és Monostory, K.: CYP2E1 enzim indukciójának vizsgálata humán és patkány májsejtkultúrában. Tox 2001- Magyar
17
Toxikológiai Társaság Kongresszusa (Eger, Okt. 25-27, 2001) S1-3. 7) Tamási, V., Hazai, E., Monostory, K., és Vereczkey, L.: CYP2E1 enzim indukciója májsejtkultúrában. Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szimpózium (Mátraháza, Ápr. 4-6, 2002) ibid. Abs. E-8. 8) Vereczkey, L., Tamási, V., és Monostory, K.: P450 gének polimorfizmusa és expressziója. Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szimpózium (Mátraháza, Ápr. 4-6, 2002) ibid. Abs. P-1. .
18
