CITOKRÓM P450 ENZIMEK IN VITRO ÉS IN VIVO INDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA REGENERÁLÓDÓ MÁJSEJTEKBEN. Tamási Viola

SEMMELWEIS EGYETEM

GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

CITOKRÓM P450 ENZIMEK IN VITRO ÉS IN VIVO INDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA REGENERÁLÓDÓ MÁJSEJTEKBEN Doktori (Ph.D.) értekezés

Tamási Viola

Témavezetők: Monostory Katalin Dobozy Ottó Készítés helye: MTA Kémiai Kutatóközpont Kémiai Intézet Farmakobiokémiai Osztály és Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet

Budapest, 2004

Szigorlati bizottság:

Elnök:

Dr. Mandl József, egyetemi tanár, Orvos Vegyytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet

Tagok:

Dr. Szél

Ágoston, egyetemi

tanár,

Humánmorfológiai

és

Fejlődésbiológiai Intézet Dr. Tihanyi Károly, osztályvezető, Richter Gedeon RT

Az értekezés opponensei:

Dr. Kardon Tamás, egyetemi tanársegéd, Orvos Vegyytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet Dr. Tihanyi Károly, osztályvezető, Richter Gedeon RT

2

Tartalomjegyzék:

Tartalomjegyzék

3

Rövidítések

6

1. Bevezetés

8

2. Tudományos előzmények

9

2.1 P450 enzimek szerepe

9

2.2. A gyógyszermetabolizmusban fontos szerepet játszó P450 enzimek

11

2.2.1 CYP1A

12

2.2.1.1 CYP1A1

13

2.2.1.2 CYP1A2

15

2.2.2 CYP2B

15

2.2.3 CYP2E1

17

2.2.4. CYP3A

19

2.2.4.1. CYP3A1

19

2.2.4.2. CYP3A2

20

2.2.4.3. CYP3A23

20

2.3. A májregeneráció folyamata

22

2.3.1. Májregeneráció a partiális hepatectomia után

22

2.3.2. A regenerációban szerepet játszó faktorok

24

2.3.3. Glükokortikoidok hatása a regenerációra

26

2.4. Glükokortikoidok hatása a P450 enzimekre

27

2.5. P450 enzimek szintjének változása a regeneráció során

28

3. Célkitűzések

30

4. Mòdszerek

30

4.1 Használt vegyszerek és kísérleti állatok

31

4.2. Az állatok kezelése

32

3

4.3. Partiális hepatectomia

32

4.4. Májsejtpreparálás

32

4.5. Mikroszóma preparálás

33

4.5.1. Mikroszómapreparálás májszövetből

33

4.5.2. Mikroszómapreparálás sejtekből

34

4.6. P450 enzimaktivitások meghatározása

34

4. 6.1. Etoxiresorufin O-dealkiláz aktivitás

34

4.6.2. Pentoxiresorufin O-dealkiláz aktivitás

35

4.6.3. p-Nitrofenol hidroxiláz aktivitás

35

4.6.4. Klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás

36

4.6.5. Etoxikumarin O-dealkiláz aktivitás meghatározása

36

4.6.6. Aminopirin N-demetiláz

37

4. 6.7. Etilmorfin N-demetiláz

38

4.7. P450 enzimek kimutatása immunoblot (Western blot) technikával

39

5. Eredmények és értékelésük

40

5.1. A P450 enzimek aktivitására regenerálódó patkány májban

40

5.2. Dexametazon hatása a P450 enzimekre regenerálódó májban

45

5.3. CYP2E1 enzim indukciójának vizsgálata sejtkultúrában

46

5.3.1. Mòdszer a klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás sejtkultúrában valò meghatározására

46

5.3.2. CYP2E1 indukciója patkány májsejtekben

50

5.4. P450 enzimek in vitro indukciójának vizsgálata regenerálódó májból izolált sejtekben

52

5.4.1. CYP1A enzim indukciója regenerálódó májból izolált sejtekben

53

5.4.2. CYP2E1 enzim indukciója regenerálódó májból izolált sejtekben

56

5.4.3. CYP3A enzim indukciója regenerálódó májból izolált sejtekben

58

6. Összegzés

61

4

7. Köszönetnyilvánítás

63

8. Irodalomjegyzék

64

9. Összefoglaló

74

10. Summary

75

11.Mellékletek

76

11.1 Az értekezés témájában megjelent közlemények

76

11.3 Az értekezés témájához kapcsolódó poszterek

76

11.3 Az értekezés témájához kapcsolódó előadások

77

12. Különlenyomatok

79

5

Rövidítések: AhR

aromás szénhidrogén receptor

AhRR

AhR represszor

Arnt

AhR nukleáris transzlokátor

BTE

basic transcription element

BTEB

basic transcription element binding protein

CAR

konstitutív androgén receptor

C/EBP

CCAAT-enchancer binding protein

COUP-TF

chicken ovalbumin upstream promoter factor

DDT

diklòr-difenil-triklòretán

DMSO

dimetil-szulfoxid

DR

egyirányú ismétlődő szekvencia (direkt repeat)

DXM

dexametazon

DexRE

dexametazon érzékeny szakasz

EDTA

etilén-diammino-tetraecetsav

EGTA

etilén-glikol-bis (2-aminoetileter)-N, N, N’, N’-tetraecetsav

EGF

epidermális növekedési faktor

ER

kifelé fordított ismétlődő szekvencia (everted repeat)

GR

glükokortikoid receptor

GRE

glükokortikoid receptor kötőhely

HGF

hepatocyta növekedési faktor

HNF

hepatocyta nukleáris factor

Hsp90

hősokk fehérje

IGF

inzulin növekedési faktor

IL

interleukin

INFγ

interferon-γ

INF

interferon

IM

imidazol

6

IR

befelé fordított ismétlődő szekvencia´(inverted repeat)

IRE

insulin érzékeny szakasz

iPROP

izopropanol

NF-kappaB

nukleáris factor kappaB

NFY

nukleáris factor-Y

NF1

nukleáris factor 1

NRE

negatív szabályzò elem

NR1 és NR2

nukleáris receptor kötő helyek

Oct-1

szerves kation transzporter-1

PB

fenobarbitál

PBRU

phenobarbital responsive unit

PPAR

peroxiszóma proliferátor aktivált receptor

PXR

pregnán X receptor

RIF

rifampicin

RXR

retinoid X receptor

SRC-1

szteroid ko-aktivátor

Sp1

transzkripciós faktor

SDS

nátrium-dodecil-szulfát

STAT3

signal transducer and activator of transcription 3

TCDD

2,3,7,8-tetrechlorodibenzo-p-dioxin

TGFα

transzformáló növekedési faktor

TGF-β

transzformáló növekedési faktor-β

TNF

tumor nekrózis faktor

uPA3

urokináz típusú plazminogén aktivátor

XAP2

hepatitis B vírus asszociált fehérje

XREM, XRE

xenobiutikum érzékeny szakasz

7

1. Bevezetés A citokróm P450 enzimek (P450) számos endogén (szteroid hormonok, zsírsavak, leukotriének)

és

a

szervezetbe

kerülő

exogén

anyag

(xenobiotikumok)

metabolizmusáért felelősek. Szervezeten belül a májban helyezkednek el legnagyobb mennyiségben. A P450 aktív centrumába került szubsztrát molekula az enzim segítségével vízoldékonyabbá válik és így könnyebben kiürül a szervezetből. A P450 enzimek aktivitása a szervezeten belül nem állandó; a szervezetbe kerülő xenobiotikumok, vagy egyes endogén szabályzó molekulák képesek növelni (induktorok) vagy csökkenteni (inhibítorok) a P450 enzimek aktivitását. Különböző patofiziológiás elváltozásoknak (pl. chirrosis, diabetes mellitus) szintén kísérő jelensége az, hogy megváltozik az egyén metabolikus kapacitása. Kísérleteink során azt vizsgáltuk, hogy osztódó májsejtekben hogyan változik egyes P450 enzimek aktivitása. Partiális hepatectomiát követően a megmaradt hepatocyták dedifferenciálódnak (ezzel a specifikus, homeosztatikus funkciók, mint amilyen pl. a metabolizmus, csökkenek) és osztódni kezdenek. Vizsgálataink során arra kerestünk választ, hogy a májregeneráció során, hogyan változik a P450 enzimek közé tartozó CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimek alapszintje és indukálhatósága. Nemcsak a P450 enzimek in vitro indukálhatóságát vizsgáltuk, hanem ezen enzimek változását a májban partiális hepatectomiát követően. Irodalomból jól ismert a glükokortikoidok (pl. dexametazon) regenerációra és P450 enzimekre gyakorolt hatása. A későbbiekben arra kerestünk választ, hogy in vivo dexametazon kezelés hogyan befolyásolja a P450 enzimeket a regeneráció során.

8

2. Tudományos előzmények 2.1 P450 enzimek szerepe A P450 enzimek olyan hem tartalmú enzimek, amelyek számos anyag metabolizmusáért, szintéziséért és átalakításáért felelősek. A P450 enzimeknek egyik jelentős csoportja a sima felszínű endoplazmás retikulum membránjában helyezkedik el. Ezen enzimek fő feladatai közé tartozik a szervezetbe kerülő testidegen anyagok (xenobiotikumok) vízoldékonyabbá tétele (fázis I). Az így képződött metabolitok konjugálódhatnak glukuronsavval, glicinnel, szulfáttal stb. (fázis II) és kiürülnek a szervezetből. Ezek a fázis I. metabolizmust katalizáló enzimek a CYP1-4, csoportba sorolhatók. A P450 enzimek nem specifikus enzimek, számos vegyület átalakítására képesek (29, 37). Egyes endogén anyagok metabolizmusáért is felelősek, mint például a tesztoszteron, telítetlen zsírsavak, alkoholok, prosztaglandinok hidroxilezése (29). Az endoplazmás retikulum membránjában lévő P450 enzimek működéséhez szükséges elektront a NADPH, vagy a NADH szolgáltatja. A citokróm P450 enzim az elektrontranszportot létrehozó redukáló enzimekkel (NADPH-citokróm P450 reduktáz, NADH-citokrómb5-reduktáz) együtt multienzim komplexet alkot és a következő reakciót katalizálja:

9

P450

RH + O2 + NADPH + H+

→

ROH + H2O + NADP+

NADPH-P450 reduktáz

RH Fe

e-

3+

(RH) Fe

3+

(RH) Fe 2+ O2

ROH

(ROH) Fe 3+

(RH) Fe (O ) 3+ H2O

(RH) Fe 2+ (O2 )

(RH) Fe 3+ (O2 )2-

(RH) Fe 3+ (O2 )˙e-

2H+

NADPH-P450 reduktáz

1. ábra: P450 enzimek működése (Fe: az enzim aktív centrumában lévő hem, RH: szubsztrát, ROH: oxidált termék.

A szubsztrát megkötése után az enzim aktív helyén lévő Fe(III) könnyen redukálódik (1. ábra). A redukció során a NADPH-ról az elektronok a NADPH-citokróm P450reduktázon keresztül jutnak el a citokróm P450-hez. A redukáló enzim két koenzimet tartalmaz (FAD és FMN). A redukált, Fe(II)-őt tartalmazó P450 enzim képes megkötni a molekuláris oxigént és egy újabb elektron felvételével stabilizálódik. Az elektron két enzimtől is származhat: NADPH-citokróm P450-reduktáztól és NADHcitokróm-b5-reduktáztól. A keletkezett komplex O-O kötése felhasad, egy molekula víz kilépésével aktív intermedier jön létre, amely elvégzi a szubsztrát oxidációját. Végül is az oxidált metabolit disszociál az enzimről. A P450 enzimek számos kémiai

10

reakciót katalizálnak: hidroxilezést, N-, O-, S-dealkilezést, azocsoportok, epoxidok és N-oxidok redukcióját.

2.2 A gyógyszermetabolizmusban fontos szerepet játszó P450 enzimek A P450 géncsalád felosztása kisebb családokra és alcsaládokra a DNS szekvencia homológia alapján történik. Általában 40%-os hasonlóság szükséges ahhoz, hogy egy családba és 55%-os hasonlóság szükséges, hogy egy alcsaládba soroljuk a megfelelő géneket. A CYP betűjelek után arab számmal jelölik az enzimcsaládot, betűvel az alcsaládot, majd az adott gén jelölése ismét arab számmal történik. A patkányban lévő P450 enzimek közül a gyógyszerek metabolizmusában főleg a CYP1-CYP4

család

enzimei

vesznek

részt.

Munkám

során

négy

P450

enzimcsoporttal foglalkoztam részletesen, - CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A. Ezen enzimek nagy mennyiségben fordulnak elő a májsejtek endoplazmás retikulumában, ahol is számos vegyület átalakításáért, felelősek. A CYP1-CYP4 családba tartozó enzimek szabályzásában számos endogén és exogén anyag vesz részt. A szabályzás eredménye fokozott transzkripció vagy a már meglévő mRNS vagy enzimfehérje (pl. CYP2E1) stabilizálása. A transzkripciò fokozòdása nukleáris receptorokon keresztül történik (3. ábra). A xenobiotikummal közvetlenül, vagy foszforilációs kaszkádon keresztül aktivált nukleáris receptor a sejtmagban dimerizációs partnerével homo- illetve heterodimert képez és a DNS megfelelő szakaszához (kötőhely) kapcsolódik. Ez a szakasz általában AGGTCA szekvenciát tartalmaz (sok esetben egy-két bázis eltérhet ettől, de a nukleáris receptor akkor is felismeri a kötőhelyet). A dimer megkötéséhez két ilyen szakasz kell, amelyeket általában 1-7 bázis köt össze a DNS-en és többféle orientációban helyezkednek el. Az elhelyezkedés alapján az angol terminológiával élve a következő féle ismétlődő szakaszokat különböztetjük meg: DR: direct repeat (egyirányú ismétlődő szekvencia), ER: everted repeat (kifelé fordított ismétlődő szekvencia),

11

IR: inverted repeat (befelé fordított ismétlődő szekvencia) (2. ábra) (79, 28).

P450 CYP1A CYP2B CYP3A RECEPTOR

RECEPTOR AhR CAR, PXR GR, PXR, CAR

DIMERIZÁCIÓS PARTNER

XENOBIOTIKUM

P450 mRNS

5’

3’

(AGGTCA-Nx)2 DRx ERx IRx

2. ábra: A nukleáris receptorok kapcsolódasa a P450 enzimek reszponzív eleméhez (87).

2.2.1. CYP1A A patkány CYP1A enzimcsaládba két izoenzim tartozik: CYP1A1 és CYP1A2. A két enzim aminosav sorrendje 68%-os azonosságot mutat. A patkány májában lévő CYP1A1 gén 6.1 kb hosszú, hét exont és hat intront tartalmaz. A szabályzò szakaszok főképp a gén 5’ végén helyezkednek el, valamint egyes intron szakaszokban is (22).

12

2.2.1.1. CYP1A1 A CYP1A1 gén főleg a tüdőben expresszálódik, de indukció [pl. 3-metilkolantrén, 2,3,7,8-tetrechlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), cigarettafüst komponensei] hatására a májban is kifejeződik (29). Szubsztrátjai közül legismertebbek a planáris, policiklusos aromás szénhidrogének pl. a benzantracén. Gyógyszervegyületeket eddigi ismereteink szerint nem metabolizál. A CYP1A1 gén kifejeződését szabályzó szakaszok három nagy csoportra oszthatók (18): BTE, (basic transcription element), amely a gén alapszinten történő átíródásáért felelős, XRE (xenobiutikum érzékeny szakasz), amely az indukciós hatásért felelős, NRE (negatív szabályzò elem ), amely a gén átíródását csökkenti, GRE, (glükokortikoid receptor kötőhely), amely az indukciós hatás módosításaért felelős. A BTE szekvencia egy GC-gazdag szakasz, ezért GC-boxnak is nevezik. Ide kapcsolódnak olyan transzkripciós faktorok, mint az Sp1 (92). Az XRE szakaszokhoz kapcsolódnak az induktor molekulák, mint pl. a 3metilkolantrén, TCDD (3. ábra). A kapcsolódás nem közvetlen, hanem egy receptor (AhR), egy nukleáris transzlokátor (Arnt) és az induktor molekula által alkotott komplex szükséges hozzá. A sejtbe került induktormolekula asszociálódik az AhR-al, aminek hatására az leválik a Hsp90 (hősokk fehérje), (transzkripciòs faktor), a BTEB (basic transription element binding protein) az XAP2 (hepatitis B vírus asszociált fehérje) és a p23 fehérjékből álló komplexről (3). Az induktor-AhR komplex átjut a magmembránon, majd a nukleáris transzlokátor proteinnel aszociálódva az XRE-hez kapcsolódik és megnöveli, illetve beindítja a CYP1A1 gén transzkripcióját (89, 67).

13

5’

NRE

XRE

GC

TATA

GRE

EX.I

GRE GRE

GRE GRE

3’ EX.II

Oct-1

CYP1A1 mRNS SEJTMAG

Arnt

p23 XAP2

Hsp90

CYP1A1

AhRR CITOSZOL

induktor AhR

3. ábra: A CYP1A1 gén indukciójának szabályzása. (AhR-aromás szénhidrogén receptor, Hsp90-hősokk fehérje, Arnt nukleáris transzlokátor, AhRR aromás szénhidrogén receptor represszor, XAP2-hepatitis B vírus asszociált protein).

Ennek eredményeként a CYP1A1 fehérje szint is megnő a sejtben. E folyamatnak szab hatart egy fehérje, az AhRR, ami az endoplazmás retikulumban megjelenő CYP1A1 fehérje hatására aktiválódik és az Arnt-hez kapcsolódva megakadalyozza a további transzkripciót (95).

14

A génen belül helyezkedik el egy negatív szabályzò szakasz is (NRE), ami képes megkötni az Oct-1 nevű transzkripciós faktort és lassítani a gén átíródását (77). A CYP1A1 gén I. intron régiójában három GRE (glükokortikoid érzékeny szakasz) található (43), aminek nagy szerepe van az indukciós hatás módosításában, ugyanis képesek módosítani az XRE-hez kötődő induktor hatását. Patkányban a glükokortikoidok a glükokortikoid receptorhoz (GR) kötődve aktiválják a GRE szakaszokat és növelik az indukciós hatást. XRE nélkül a GRE nem képes önállóan indukciós hatást kiváltani (38).

2.2.1.2. CYP1A2 A CYP1A2 szubsztrátjai közé tartozik pl. a fenacetin, koffein, etoxirezorufin, aromás aminok, a dohányfüst egyes komponensei (29). A 3-metilkolantrén és a TCDD, a dohányfüstben és a káposztafélékben található egyes vegyületek képesek indukálni a CYP1A2-t. A gén promoterében számtalan szabályzó szakasz van az XRE-n kívül. Szabályzása szintén az AhR-on keresztül történik hasonlóan a CYP1A1-hez, de a mechanizmus teljes egészében még nem tisztázott.

2.2.2. CYP2B

A patkány genom két aktív CYP2B gént tartalmaz: CYP2B1 és CYP2B2. Szubsztrátjai közül ismertek: etilmorfin, kokain,

metilén-dioximetamfetamin

(Ecstasy) etoxikumarin, 6-aminokrizén, ciklofoszfamid, tesztoszteron (16α/β hidroxilezés). Számos vegyület képes indukálni (pl. fenobarbitál, fenitoin, DDT (diklòr-difenil-triklòretán), diallil-szulfid) (29, 73). A CYP2B szabályzása nem teljesen ismert, azonban miként, emberben, egérben és csirkében, patkányban is megfigyeltek a promoter előtti génszakaszon egy aktivitást fokozó (enhancer) régiót (PBRU; phenobarbital responsive unit), ami tartalmaz egy NF1 (nukleáris

15

factor 1) kötőhelyet és két nukleáris receptor kötő helyet (NR1 és NR2). A nukleáris receptor kötő helyeket egy 4 bázispárból álló szakasz, a DR4 választja el (4. ábra) és

csupán egy bázisban különböznek a humán CYP2B6 gén megfelelő régiójától

(78). Ezen kívül még valószínűleg számos transzkripciós faktor kötőhely van jelen.

NF1 NR2

NR1

DR4

DR4

PBRU

4. ábra: A CYP2B gének szabályzó régiója patkányban. (NR1 és NR2 nukleáris receptor kötő helyek, NF1 nukleáris factor 1, PBRU fenobarbitál érzekeny szakasz).

Patkányban a CYP2B indukciója nagyon hasonlóan megy végbe, mint emberben. Fenobarbitál okozta indukció esetén, az induktor egy foszforilációs kaszkádot indít el, amely a CAR sejtmagba kerülését idézi elő. A sejtmagba jutott CAR az RXR-el heterodimert képez és képes a PBRU régióhoz kapcsolódik (NR1 és NR2) és fokozza a CYP2B gének transzkripcióját (5. ábra) (97). A CAR/RXR heterodimer hatását fokozhatják olyan ko-aktivátor molekulák, mint amilyenek az SRC-1 (szteroid ko-aktivátor) és Sp1 (transzkripciós factor) (53). Ezek nemcsak az indukciós hatást, hanem a konstitutív kifejeződést is képesek befolyásolni. A CYP2B gének transzkripcióját a PXR (pregnán X receptor) is képes szabályozni

16

(ld. még 2.2.4-t). A PBRU génszakaszhoz kötődik a PXR/RXR heterodimer (és ez által a PXR-hez kapcsolódó induktor) és fokozza a CYP2B gén átíródását, de a fő szabályzás a CAR/RXR segítségével történik (78, 25).

Hsp90 Foszforiláció

CAR

P

Sp1

P INDUKTOR

PBRU

SRC-1

TATA

Defoszforiláció

RXR

CYP2B mRNS

PXR

5. Ábra: A CYP2B enzimek indukciójának mechanizmusa. (CAR konstitutív androgén receptor, RXR retinoid X receptor, HSP90 hősokk fehérje, PBRU fenobarbitál érzekeny szakasz, SRC-1 szteroid ko-aktivátor, Sp1 transzkripciós faktor, PXR pregnán X receptor).

2.2.3. CYP2E1 A CYP2E1 enzim szubsztrátjai főképp kis molekula súlyú vegyületek, mint pl. alkoholok, aldehidek, kloroform, de számos gyógyszermolekulát is képes metabolizálni (paracetamol, klórzoxazon). Egyes prekarcinogén vegyületeket képes karcinogénné alakítani (nitrozaminok). A CYP2E1 enzimet számos molekula (etanol, aceton, dimetil-szulfoxid, izopropanol, pirazol és imidazol) indukálja (29). A CYP2E1 promoter régiójában lévő TATA box mellett még számos transzkripciós faktor kötőhely van [HNF1 kötőhely (hepatocyta nukleáris factor), az NFY-t

17

(nuklearis factor Y) kötő CCAAT-szakasz, IRE (inzulin érzékeny szakasz)] (83, 64). Számos endogén hormon (androgének, ösztrogének, növekedési hormon, inzulin) képes befolyásolni a gén átíródását, de a mechanizmus még nem teljesen tisztázott. A CYP2E1 gén embrionális korban inaktív, csupán születés után aktiválódik (84). A CYP2E1 génben a TATA box mellett, valamint az első exonban és intron szakaszban számos ponton metilálódhat. Embrionális korban, vagy a CYP2E1 transzkripció drasztikus csökkenésekor ezen régiók hipermetiláltak. A különböző endogen szabályzó molekulák, vagy egyes patofiziológiás állapotok (kóros éhezés, diabetes) során fellépő hormonális változások nemcsak DNS szinten, hanem

(6. ábra)

poszttranszkripciós szinten is hatnak azzal, hogy képesek növelni, vagy csökkenteni a CYP2E1 mRNS féléletidejét. A transzkripciós szintű zabályzás csak az endogén hormonokra jellemző, xenobiotikumok jelenlétében a CYP2E1 enzim mennyisége és aktivitása főleg transzlációs és poszttranszlációs szinten szabályzott

PO 4

P450 kináz

CYP2E1 ER

-

hem PO 4

induktor

hsp PO 4 Proteoszomális degradáció

Lizoszomális degradáció

6. ábra: A CYP2E1 enzimek degradációjának mechanizmusa.

(29, 32). A posztranszlációs szintű szabályzás a CYP2E1 fehérje stabilizálását jelenti (6. ábra). Ha nem kapcsolódik induktor molekula az aktív centrumhoz, akkor az enzimet

egy

P450

kináz

foszforilálja;

a

foszforiláció

következtében

konformációváltozást szenved, aminek során elveszti hem csoportját. A megmaradt

18

apoprotein egy hősokk fehérjével (hsp) asszociálódva proteoszomális úton gyorsan degradálódik (11, 98). Amennyiben induktor molekula kapcsolódik az enzimhez, a fenti út gátlódik és az induktor stabilizálja az enzimet, ami miatt az több szubsztrátot képes átalakítani. Az enzim ugyan degradálódik, de ez a degradáció lassú, lizoszomális degradáció (29).

2.2.4. CYP3A Patkány májban öt féle CYP3A enzimet lehet megkülönböztetni: CYP3A1, CYP3A2, CYP3A9, CYP3A18 és CYP3A23 (35). Kifejeződésük nem, szövet, faj és kor függő (88): például a CYP3A2 gén hím patkányokban az egész élet során aktív, míg nőstényekben csupán az embrionális korban van jelen (19). A CYP3A1 és a CYP3A18 expressziója hím patkányban figyelhető meg, viszont a CYP3A9 enzim mennyisége nőstény állatban tízszer nagyobb, mint a hímekben (2). A CYP3A enzimek nagyon sokféle eltérő szerkezetű vegyületet képessek metabolizálni tammoxifen,

(eritromycin, verapamil,

cyclosporin

omeprazol).

A,

lidokain,

nifedipin,

etilmorfin,

Legfontosabb endogén szubsztrátja a

tesztoszteron (29). A CYP3A enzimet számos xenobiotikum: glukokortikoidok (dexametazon), rifampicin, fenobarbitál, eritromycin, troleandomycin indukálja.

2.2.4.1. CYP3A1 A CYP3A1 gén 30 kb hosszú és 13 exonból áll (54). CYP3A1 enzim nagyon kis mennyiségben van jelen a patkány májában, azonban nagymértékben indukálható különböző vegyületekkel (dexametazon, pregnenolon 16α-karbonitril). Nemcsak a májban, hanem más szövetekben is expresszálódik (8). A CYP3A1 indukciós mechanizmusában fontos szerepet játszik a PXR/RXR komplex, azonban maximális indukcióhoz egyéb transzkripciós faktoroknak is

19

aktiválódniuk kell COUP-TF (chicken ovalbumin upstream promoter factor) és a HNF-4 (hepatocyta nukleáris factor) (ld. 2.2.4.3.).

2.2.4.2. CYP3A2 A CYP3A2 gén is 13 exonból áll, azonban ellentétben a CYP3A1-el csupán hím patkány májában fejeződik ki és a pillanatnyi mennyisége az élet előrehaladtával változik.

2.2.4.3. CYP3A23 A patkánymájban jelen lévő CYP3A23 mind szubsztrát spektrumában, mind szabályzásában az emberi májban jelen lévő CYP3A4-nek felel meg. A CYP3A23 gén proximális szakaszában több féle szabályzó szakasz van (7. ábra). Ezek közül három képes glükokortikoid tipusú indukciót létrehozni: DexRE-1, DexRE-2 és az XREM; a site A nevű reszponzív elem egyéb faktorokat köt.

DexRE-1

DexRE-2

-TTAACTCAAAGGAGGTCA-

-TGAACTTCATGAACT-

XREM -AGTTCATGAAGTTCA-

7. ábra: A CYP3A23 enzim génjében lévő reguláló szakaszok.

20

A dexametazon indukciót közvetítő PXR/RXRα komplex csupán a DexRE-2-höz képes kötődni. A DexRE-1 és a siteA kötőhelyek a COUP-TF és HNF-4 faktorokat kötik, amelyek főképp az alapaktivitás közvetítésére képesek (28). Alacsony glükokortikoid koncentráció esetén a sejtbe kerülő induktor csupán a glükokortikoid receptorokat (GR) képes aktiválni (8. ábra). Az aktivált GR serkenti a PXR és RXR átiródását, ami komplexet képezve képes a DexRE-2 génszakaszon keresztül aktiválni a CYP3A23 gén transzkripciót (26). A PXR/RXR komplex megkötésével

DXM (> 10-7M)

PXR/RXR transzkripció

DXM (< 10-7M)

GRE CAR/RXRα α

PXR/RXRα α

PXR/RXRα α

B komplex

Dex-RE-1

DexRE-2

HNF-4

Site A

XREM COUP-TF +1

TATA

CAAT

CYP3A23 mRNA

8. ábra: A CYP3A enzim regulációja. (GR glucocortikoid receptor, COUP-TF chicken ovalbumin upstream promoter factor, RXR Retinoid X receptor, PXR pregnán X receptor, HNF-6, hepatocyta nukleáris factor 6, CAR konstitutív androsztán receptor, DXM dexametazon, PB fenobarbitál, RIF rifampicin).

21

a gátlást közvetítő COUP-TF disszociál a DexRE-2 szakaszról. A COUP-TF a DexRE-1-hez is képes kapcsolódni és kompetitíven gátolja a komplex B kötődését ehhez a reszponzív elemhez. A komplex B-t még eddig nem meghatározott transzkripciòs faktorok alkotják, amelyek a CYP3A23 gén aktiválásában vesznek részt. Magas dexametazon koncentráció esetén (10 µM) az induktor képes a PXR/RXR komplexet közvetlenül aktiválni és ezáltal kifejteni indukciós hatását, ami magasabb CYP3A23 expressziót eredményez, mint a GR receptoron keresztüli mechanizmus (27). Más reszponzív elemek is képesek módosítani a PXR/RXR komplex által létrehozott indukciót. Ilyen például az XREM, ami valójában egy PXR/RXR kötőhely (DR3) (94). Fenobarbitállal aktiválható CAR/RXR komplex a XREM-hez kötődve nem csak a CYP2B, hanem a CYP3A gének átíródását is képes növelni. Patkányban a reszponzív elemekben lévő ATGAACT szakaszhoz számos nukleáris receptor képes kapcsolódni, pl. D vitamin receptor (VDR), tiroxin receptor (TR), peroxiszóma aktivált receptor (PPAR), azonban ezek funkcionális jelentősége nem bizonyított (63).

2.3. A májregeneráció folyamata 2.3.1. Májregeneráció a partiális hepatectomia után A regeneráció egy szövet vagy egy szerv azon képessége, amelynek segítségével pótolni tudja a hiányzó (pl. partiális hepatectomiával eltávolított vagy más úton roncsolt) szöveti, szervi részeket (24). A legtöbb szervben nem figyelhető meg olyan regeneráció, amely sejtszám növekedéssel (hyperplasia) jár; ezekben csupán sejtnagyobbodás (hypertrophia) történik. A máj tulajdonságai eltérnek ettől: itt mindkét jelenség megfigyelhető. A májregeneráció folyamata nagymértékben függ a májeltávolítás módjától. Ha a sérülés nem túl nagy, a megmaradt hepatocyták és májban lévő őssejtek fognak

22

regenerálódni. A májban lévő őssejtek a Hering-csatorna környékén és az epevezeték mellett helyezkednek el (58, 20). Kétféle sejttípust képesek létrehozni: hepatocytákat és epevezeték sejtjeit (12). Amennyiben drasztikus sérülés áll fenn a szervezet képes a csontvelőben lévő őssejtek mozgósítására, amelyek tovább differenciálódnak májsejtekké (60). Patkányon végzett partiális hepatectomiát követően, amikor is a máj 2/3-a kerül eltávolításra, főleg a már meglévő hepatocyták fognak osztódni. Fiatal állatokban a hepatocyták 95%-a vesz részt a regenerációban, idősebb állatban ez az arány valamivel kisebb: nem annyira teljes, kevesebb hepatocyta vesz részt benne. A májsejtek a szervezet legdifferenciáltabb sejtjei közé tartoznak. Életük során nem sokszor osztódnak (kb.nyolcszor) és mitózisra 2x104 sejt közül csak egy képes (71). Hepatectomia után megváltozik a sejtek tulajdonsága és megindul a DNS-szintézis (13).

Jelölt sejtek mennyisge (%)

Hepatocyta Epevezetèk sejtjei Kupffer sejtek Szinuszoidális endothel sejtek

A regeneráció ideje

9. ábra. A különböző sejttípusok DNS szintézisének kinetikája a regeneráció során (58).

23

A májrészek eltávolítása után először is megváltozik a sejtmembrán polaritása (Na+ ionok áramlanak be a sejtbe) és megnövekszik a véráram. Egyes sejtek dedifferenciálódnak és bekerülnek G0 fázisból az S fázisba és a DNS szintézis fokozódik. A sejtosztódás nem egy időben történik a különböző sejtekben (9. ábra). Először is a periportális régióban lévő hepatocyták osztódnak. A májparenchima főképp a megmaradt érhálòzat és epekapilláris köré szerveződik. Két nap elteltével már a pericentrális részekben is beindulnak az osztódási folyamatok. A májban többrétegű lemezek jönnek létre. Három nap múlva a periportális régióban nyalábszerű

képletek

keletkeznek.

Ezek

10-14

hepatocytából

állnak.

A

májnyalábokbòl szerveződnek későbbiekben a máj lebenyei. A későbbiekben osztòdnak a Kupffer sejtek, majd organizálódnak az epe canalikusai az epevezeték sejtjeinek osztódásával. A máj új érhálòzata a májba áramlò endothel sejtekből szerveződik (50). A normális szöveti szerkezet helyreállításához egy hét szükséges. A májsejtek addig osztódnak, amíg a szerv el nem éri az eredeti nagyságot, térfogatot. A teljes mikromorfológiai szintű regeneráció kb. három hét alatt zajlik le (76).

2.3.2. A regenerációban szerepet játszó faktorok A májsejtek osztòdását és a máj organizáciòjat szabályzò molekulák még nem teljesen ismertek. Nem ismert az a központi mediátor, aminek hatására a májsejtek dedifferenciálódnak és osztódni kezdenek, viszont számos faktorról bizonyosodott be, hogy képes befolyásolni a regenerációt. A májra ható endogén szabályzò molekulákat Michalopoulos nyomán három csoportra osztjuk (48, 49): 1. komplett mitogének: olyan faktorok, amelyek sejttenyészetben és szérum hiányában is képesek DNS-szintézist és mitózist előidézni (HGF (46), TGFα, EGF (47), TNF (1)). 2. növekedési inhibítorok: gátolják a proliferációt, DNS-szintézist, mitózist (TGF-β (13), IL-6 (4), INF-γ (77)).

24

3. növekedési triggerek (komitogének): nincs közvetlen proliferációs hatásuk, szerepük a komplett mitogének felerősítésében és az inhibitorok gátló hatásának csökkentésében van (szteroid hormonok (9, 16), IGF (64), inzulin (17)). A fenti felosztáson kívül jelentős szerepet játszanak még egyes immunszupresszív molekulák is pl. prosztaglandinok, valamint egyes protoonkogének, mint például a cfos, c-jun és a c-myc (72, 74). Partiális hepatectomia után a megmaradt májsejteket számos hormonális hatás éri (pl. HGF, TNF-α, IL-6; lásd 10. ábra). A májregenerációt iniciáló lépések egyike az úgynevezett korai gének aktiválódása. Olyan általános transzkripciòs fehérjék szintetizálódnak, mint pl. az IGF-I, IGF-II, NF-κ B és STAT3, valamint a c-fos és cjun faktorokból álló AP-1 komplex (50).

Kupffer sejt

Hepatocyta

Szinpatikus neuron

Mellèkvese

U Brunner mirigy

U

HGF

HGF receptor

Pajzsmirigy Vèrá ram

Extracellulá ris mátrix

Pankreász

Inzulin Noradrenalin

10. ábra: A regeneráció iniciálásáért felelős faktorok (50).

25

Ezek aktiválják pl a HGF átíròdását, ami a regenerációs folyamat egyik kulcs lépése (10. ábra). A HGF nagymértékben felelős a DNS-szintézis megindításáért a hepatocytákban. Ha a májba HGF-et juttatunk, a májsejtek osztòdni kezdenek. Ha a HGF-t tartalmazò infúziòhoz kis mennyiségű kollagenázt adunk, a májsejtek DNS szintézis sebessége még nagyobb lesz, ami annak a következménye, hogy a sejteket körülvevő mátrix felbomlásakor még több HGF szabadul fel (39). A májsejteket körülvevő extracelluláris mátrix nemcsak a kollagenáz hatására, hanem a partiális hepatectomia után is felbomlik. Először is aktiválódik az urokináz (uPA) nevű proteolitikus enzim (44), ami egy foszforilációs kaszkádon keresztül aktiválja a plazminogén átalakulását plazminná, valamint bontja a biomátrixban jelen lévő laminin, entactin és fibronektin fehérjéket (33). A mátrix bontása során a benne lévő HGF felszabadul, és serkenti a májsejtek proliferációját. Az urokináz kapcsolódva a sejtfelületen lévő urokináz receptorhoz aktiválja a preHGF átalakulását HGF-é (50). A másik fontos regenerációt stimuláló faktor a Kupffer sejtekben termelődő TNFα, ami fokozza a DNS-szintézist és az IL-6 termelődését. A TNFα hatása főleg a kesőbbi regenerációs szakaszokban jelentős. A korai szakaszban fontos szerepet játszik még az EGF (epidermális növekedési faktor), noradrenalin, inzulin és a tiroid hormonok (50).

2.3.3. Glükokortikoidok hatása a regenerációra

A glükokortikoidok hatása a máj proliferációs folyamataira gyakorolt hatása már régen

ismert.

A

glükokortikoid

hatás

jól

modellezhető

egy

szintetikus

glükokortikoiddal a dexametazonnal. A glükokortikoidok a hepatocytákban képesek a TNF-α stimulált DNS-szintézist és proliferációt serkentő hatását gátolni. Egyéb glükokortikoidok, mint a kortizon és hidrokortizon hasonló hatást mutattak. Más szteroidok, mint a progeszteron és βestradiol nem befolyásolták a TNF-et. Az említett hatás dexametazon adás nélkül is jelen van, ugyanis a regenerációs folyamat kezdetén meginduló TNF-szekréció

26

következtében a központi adrenerg rendszeren keresztül megemelkedik a keringésben a glükokortikoidok szintje. Az ezúton nagyobb mennyiségben megjelenő glükokortikoidok képesek lesznek TNF szintézisét megakadályozni. Mivel a dexametazon előkezelés gátolja a TNF-stimulált in vitro hepatocyta proliferációt, ezért a glükokortikoidok lassítják a májregenerációt. Mivel a TNF segítségével

szabályzott

kémiai

mediátorok

(citokinek)

szekréciója,

a

differenciálódás és sejtnövekedés szabályzásában is részt vesznek (pl. a máj regenerálódása, embriogenesis) az egész regenerálódási folyamatra hatással lesznek (70, 55, 56). A dexametazonnak ismertek a regenerációra gyakorolt egyéb hatásai is. A hepatocyták a májban gap junctionokkal és dezmoszómákkal kapcsolódnak egymáshoz. A regeneráció során a sejtek közti gap junction kapcsolódások nagymértékben lecsökkennek, a dezmoszomális kapcsolódás viszont megmarad. Különböző sejtproliferációt gátló ágensek hatására (dexametazon) a gap junctionok down-regulációja is lassul. Mivel a gap junctionok fő feladata differenciált sejtek esetében a sejtek közti kommunikáció, így dexametazon hatására a sejtek közti kapcsolat tovább megmarad (15).

2. 4. Glükokortikoidok hatása a P450 enzimekre A glükokortikoidok citokróm P450 enzimre gyakorolt reguláló hatása már régen ismert. Nemcsak endogén glükokortikoidok, hanem a dexametazon, vagy egyéb szteriodok is képesek befolyásolni a P450 enzimek aktivitását. Röviden összegezve a 2.2 fejezetben leírtakat: CYP1A enzim esetében a gén I. intronjában több GRE is megfigyelhető. A dexametazon önmagában nem képes indukálni a CYP1A enzimet, de amennyiben valamely CYP1A induktor mellett dexametazon is jelen van, fokozódik a gén átíródása (38).

27

A CYP3A enzim esetében a dexametazon már önmagában is képes indukálni. Kis koncentrációban a glükokortikoid receptoron keresztül hat; nagyobb koncentrációban pedig a PXR-hoz kötődve növeli a CYP3A enzim átíródását (63). Mivel a dexametazon számos nukleáris receptor mennyiségét fokozza a sejten belül (pl GR, PXR), így azon P450 enzimek indukciója fokozódik, amelyek indukciós mechanizmusa ezekhez a receptorokhoz kötött.

2.5. P450 enzimek szintjének változása a regeneráció során A P450 enzimek aktivitását számos patológiás állapotban (pl. cirrhosis, diabetes mellitus, hepatocarcinoma, hepatitis) befolyásolja. Ez valójában azzal magyarázható, hogy ilyen állapotokban a homeosztatikus egyensúly megbomlása számos hormon/transzmitter

szint

változásával,

vagy

a

szövetet

alkotó

sejtek

dedifferenciálódásával jár együtt. Májregeneráció során mindkét hatás érvényesül; mind hormonális, mind a megmaradt sejtek dedifferenciációja és folyamatos osztódása csökkenti a P450 enzimek mennyiségét. Irodalomból ismert, hogy a regeneráció során a P450 enzimeket bontó hem-oxigenáz mennyisége megnő, vagy a májban lévő nitrogén-monoxid-szintáz mennyiségének növekedése miatt a felszaporodó nitrogén-monoxid (NO) kapcsolódhat a P450 enzimek aktív centrumához, és ezáltal gátolhatja azok működését. A NO nemcsak a hem-hez tud kapcsolódni, hanem az apoprotein tiol-csoportjaihoz is és ez által növeli a degradáció sebességét. A májsejtek dedifferenciálódása miatt szintén csökkenhet a P450 enzimek mennyisége (75, 93, 31). A regeneráció során nemcsak a P450 enzimek alapaktivitása, hanem indukálhatósága is megváltozhat, mivel megváltozhat az indukciós mechanizmusban részt vevő faktorok mennyisége. Például a sejtosztódás során az RXR degradációja lassul. Hepatocarcinoma sejtekben kimutatták, hogy a nukleáris receptor foszforilációval stabilizálódik, ami növeli a transzaktivációs képességét, valamint elősegíti a sejtosztodást. A RXR számos, más nukleáris receptorral képes dimerizálódni pl.

28

(PXR, PPAR, CAR). Ezen heterodimerek pedig jelentős szerepet játszanak a P450 enzimek szabályzásában (lásd előző fejezetek) (45). Másrészt a CYP1A enzimek indukciós mechanizmusában (TCDD indukció) szerepet játszó AhR mennyisége is változást mutat a sejtciklus során (G2/M szakaszban csökken, Go és G1 szakaszban pedig nő) (68). Az AhR-hoz számos aktiváló fehérje kapcsolódhat. Egyik ilyen koaktivátor a pRb, ami defoszforilált formában képes kötődni a receptorhoz. Mivel a defoszforilált forma csupán a G és G0 szakaszban van jelen, a CYP1A indukciója ebben a fázisban kifejezettebb, mint a G2/M fázisban (10).

29

3. Célkitűzések Munkám során négy P450 enzim csoportot (CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A) vizsgáltam. 1. A kísérletsorozat első részében a májregeneráció, valamint a májregeneráció és in vivo dexamethazon kezelés hatását figyeltük meg a patkány CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimeire. A következő kérdésekre kerestük a választ: •

Hogyan változik a CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimek

mennyisége és aktivitása a regeneráció korai periódusában (0-72h)? •

Hogyan hat egy szintetikus glükokortikoid, a dexametazon a fenti enzimek

kifejeződésére a regeneráció során?

2. A kísérletsorozat második részében a CYP1A, CYP2E1 és CYP3A indukálhatóságát határoztuk meg. A májregeneráció során azt vizsgáltuk, hogy: •

Miként változik a fenti enzimek mennyisége és aktivitása specifikus

induktoraik (CYP1A; 3-metilkolantrén, CYP2E1; imidazol, CYP3A; dexametazon) hatására regenerálódó májból izolált sejtekben? A kísérletekhez beállítottunk egy in vitro módszert a CYP2E1 indukciójának vizsgálatára májsejt kultúrában. Azt vizsgáltuk, hogy: •

a CYP2E1 enzim klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitása hogyan változik primer

patkány és humán hepatocyta kultúrában az idő függvényében? •

a CYP2E1 indukciója hogyan változik különböző irodalomból ismert

induktorok hatására (pirazol, aceton, etanol, i-propanol, dimetil-szulfoxid, imidazol)?

30

4. Módszerek

4.1. Használt vegyszerek és kísérleti állatok A

dexametazont,

3-metilkolantrént,

imidazolt,

klórzoxazont,

fenacetint,

etoxiresorufint, marha szérum albumint, etoxikumarint, aminopirint, Williams` medium E-t, nutrient mixture F-12 (Ham)-t, inzulint, etilmorfint, glükagont, amfotericin B-t, glükózt, piruvátot, kollagenázt (Type IV), tripán kéket, EGTA-t a Sigma Chemie GmbH-tól (Deisenhofen, Germany) rendeltük. A vizsgálatainkban használt pentoxirezorufin a Boehringer Mannheim, GmbH (Germany) terméke. A következő vegyszerek: diklórmetán, acetonitril, dietiléter, glükóz-6-foszfát, glükóz6-foszfát-dehidrogenáz a Merck-től (Darmstadt, Germany) származtak. A fehérje kimutatásához használatos oldatot és filmet (ECL Western blot reagens, HyperfilmTMECLTM) az Amersham Pharmacia Biotech-től (Buckinghamshire, England) rendeltük. A patkány CYP1A1 elleni antitest és a patkány CYP2B1/2 elleni antitest a Gentest Co. (Woburn, MA, USA) terméke. Az IgG elleni antitestek a BioRad-tól (Hercules, CA, USA) származtak. CYP2E1 és CYP3A1 elleni antitesteket Magnus

Ingelman-Sundberg

professzortól

(Karolinska

Intézet,

Stokholm,

Svédország) kaptuk. Noretilmorfint Riedl Zsuzsanna (MTA KKKI) szintetizálta. Minden egyéb vegyszert a Reanaltól (Budapest) vásároltunk. Kísérleteinket 150-250 g súlyú hím Wistar patkányokon (Toxicoop Safety Toxicological Study Center (Budapest)) végeztük, amelyet standard körülmények között tartottunk (25OC, fényviszonyok 12h világosság, 12h sötétség).

31

4.2. Az állatok kezelése Az in vivo vizsgálatok során patkányokat kezeltünk p.o. 100 mg/kg dexametazonnal a partiális hepatectomiát megelőzően három napon keresztül. A dexametazont napraforgó olajos szuszpenzióban (100 mg/ml) gyomor szondán keresztül juttatuk az állatokba.

4.3. Partiális hepatectomia A partiális hepatectomiát Higgins és Anderson módszerével végeztük el (21). Az állatokat éterrel elaltattuk, majd a hasfal felnyitása után a máj 2/3-át eltávolítottuk. A műtéti stressz hatásának vizsgálatára áloperációt is végeztünk, ami kísérleteink során az állat hasfalának felnyitását, a máj felületének végigsimítását és a has visszazárását jelentette.

4.4. Májsejtpreparálás A műtétek során éteres altatást használtunk. A hasfal felmetszése után két érbe, a véna cava inferiorba és a véna portaeba kanült helyeztünk: a v. portae-ban lévő kanülön keresztül juttatuk a perfúziós folyadékot a májba, ami a máj átmosása után a véna cava inferioron keresztül távozott (6). A perfúzió célja a hepatocyták közötti sejtkapcsoló struktúrák megszüntetése, hogy végül májsejt szuszpenzióhoz jussunk. Első lépésként a májat kelátképzőt (EGTA) tartalmazó pufferrel átmostuk. Az EGTA komplexet képez a kálcium ionokkal, így a kálcium-függő sejtkapcsoló struktúrák megszünnek. Második lépésben a kelátképzőt kimostuk a májból. Végül kollagenázt és fiziológiás koncentrációjú kálciumot tartalmazó folyadékkal feloldottuk a sejtek közötti mátrixot és sejtkapcsoló strukturákat, így a sejtek elváltak egymástól (5, 52). A preparált sejteket Ferrini és mtsai (14) által leírt tápfolyadékban szuszpendáltuk és tripánkék festéssel meghatároztuk az élő sejtek számát. A kísérleteinket kizárólag 90%-nál magasabb életképességű sejtpreparátummal végeztük. A sejteket kollagénnel borított petricsészékbe helyeztük (4x106 sejt/petri

32

csésze) és 37

o

C-on 5% CO2-n inkubátorban tartottuk. A sejteket különböző

induktorokkal kezeltük 48 órán keresztül: dexametazon (10 µM) 3-metilkolantrén (3.7 µM) aceton (5mM, 50mM) etanol (10mM, 100mM) izopropanol (5mM, 50mM) dimetil-szulfoxid (5mM, 50 mM) pirazol (50µM, 500µM) imidazol (50µM, 500µM).

4.5 Mikroszóma preparálás

4.5.1. Mikroszóma preparálás májszövetből A mikroszóma preparálás van der Hoeven és Coon módszere alapján történt differenciál centrifugálással (86). A májat izotóniás NaCl oldattal mostuk, majd ollóval összevágtuk. Ezután 1 mM EDTA-t és 0,15 M KCl-ot tartalmazó Tris-HCl pufferben (0.1M, pH 7.4) homogenizáltuk. A homogenizátumból centrifugálással eltávolítottuk a sejtmagot és a mitokondriumot (104 x g), majd a felülúszóból ultracentrifugálással (105 x g) kiülepítettük a mikroszóma frakciót. Ez után egy újabb tisztítási centrifugálás következett. Az üledéket a fenti pufferben szuszpendáltunk és ismét centrifugáltuk (105 x g). A fehérje koncentrációt Lowry és munkatársai módszere alapján mértük (40), standardként marha szérum albumint alkalmazva. A vizsgálatoknál használt mikroszóma mennyiséget a fehérje tartalom alapján adtuk meg.

33

4.5.2. Mikroszómapreparálás sejtekből Nemcsak májból, hanem kultúrában tartott sejtekből is történt mikroszóma preparálás. A petricsészében a kollagénmátrixhoz tapadt sejteket speciális kaparó segítségével lekapartuk és PBS oldattal (foszfàt puffert tartalmazó sóoldat) szuszpendáltuk. A sejteket jéghűtés mellett ultrahang segítségével tártuk fel, majd a fent már leírt módon mikroszómát preparáltunk belőle. A mikroszómák fehérjetartalmának meghatározását Lowry módszere szerint végeztük (40).

4.6. P450 enzimaktivitások meghatározása P450 enzimek aktivitásának meghatározása specifikus szubsztráttal történt. Mind májsejtkultúrából, mind mikroszómából az alábbi módszerek segítségével mértünk aktivitást.

4.6.1. Etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitás A CYP1A enzimek etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitását Burke és Thomson módszere alapján (7) határoztuk meg (11. ábra). A májszövetből nyert mikroszómához (0,4 mg fehérje/ml) 10 µM etoxirezorufint NADPH regeneráló rendszert (0.5 mM NADPH, 5 mM glükóz 6-foszfát, 3 mM MgCl2, 1.2 unit/ml glükóz 6-foszfát dehidrogenáz) adtunk. A reakciót jéghideg metanollal állítottuk le, a kicsapódott fehérjéket centrifugáltuk, majd a felülúszóból fluorimetriássan meghatároztuk a keletkező metabolit (rezorufin) mennyiségét. N CYP1A O

O

O

HO Etoxirezorufin O-dealkiláz Etoxiresorufin-O-dealkiláz

N O

O

rezorufin

etoxirezorufin

11. ábra: Az etoxirezorufin CYP1A enzimen keresztül történő metabolizmusa.

34

A sejtekből történő aktivitás meghatározás során 5µM rezorufinnal történt az inkubálás 10 µM dikumarol jelenlétében (47). A dikumarol gátolja a citoszólban lévő diaforáz enzimet, amely a rezorufint tovább alakítaná. Áz inkubációs idő elteltével az extracelluláris folyadékból meghatároztuk a termelődött rezorufin mennyiségét.

4.6.2. Pentoxirezorufin O-dealkiláz aktivitás A mikroszómális fehérjét (0,6 mg fehérje/ml) 10 µM pentoxirezorufinnal inkubáltuk a 4.6.1. fejezetben leírt módszerhez hasonlóan (7) (12. ábra). N

N

CYP2B O

O

O HO

O

O

Pentoxiresorufin-O-dealkiláz

Pentoxirezorufin O-dealkiláz pentoxirezorufin

rezorufin

12. ábra: Az pentoxirezorufin CYP2B enzimen keresztül történő metabolizmusa.

4.6.3. p-Nitrofenol hidroxiláz aktivitás A CYP2E1 mikroszomális p-nitrofenol hidroxiláz aktivitását (13. ábra)

Reinke és

Moyer módszere alapján mértük (66). 20µM p-nitrofenol és 1.5 mg/ml fehérje és NADPH regeneráló rendszert (0.5 mM NADPH, 5 mM glükóz 6-foszfát, 3 mM MgCl2, 1.2 unit/ml glükóz 6-foszfát dehidrogenáz) tartalmazó elegyben. A felülúszó lugosítása után (pH 12, 10N NaOH-al) a metabolit (4-nitro-katekol) mennyiségét fotometriássan határoztuk meg.

35

NO2 NO2 CYP 2E1 p-Nitrofenol-hidroxiláz p-Nitrofenol-hidroxiláz

OH

OH OH p-nitrofenol

4-nitro-katekol

13. ábra: A p-nitrofenol CYP2E1 enzimen keresztül történő metabolizmusa.

4.6.4 Klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás

A CYP2E1 enzim egyik szelektív szubsztrátja a klórzoxazon. A reakció során 6hidroxi-klórzoxazon

termelődik

Az Cl

irodalomban meghatározást alkalmaztuk Sejtkultúrából

leírt (59)

módosítva

májsejt

kultúrában.

történő

NH

mikroszomális

O O klórzoxazon KLÓRZOXAZON

CYP2E1 CYP2E1

aktivitás

meghatározás során 4x106 sejtet 2.5 ml

Cl

NH

400 µM klórzoxazont tartalmazó HBSS

O O

oldattal (Hank’s balanced salt solution)

OH 6-hidroxi-klórzoxazon

inkubáltunk (14. ábra). Az inkubálás végén az extracelluláris folyadékhoz 17,2

14. ábra: A klórzoxazon CYP2E1 enzimen

µM fenacetint adtunk belső standardként,

keresztüli metabolizmusa.

0,34 M foszforsavval savanyítottuk, 3x5 ml diklórmetánnal extraháltuk, bepároltuk és 300 µl 40%-os acetonitrilben oldottuk. A termelődött 6-hidroxi-klórzoxazon mennyiségét HPLC-vel határoztuk meg (oszlop: 125x4mm, LiChrospher RP18 5µm, mozgó fázis: acetonitril: 0.2% foszforsav = 25:75 v/v, áramlási sebesség: 1 ml/perc, hullámhossz: 290 nm).

4.6.5. Etoxikumarin O-dealkiláz aktivitás meghatározása Az etoxikumarin O-dealkilezésében több enzim vesz részt: CYP1A, CYP2B és CYP2E1. 4x106 sejtet 2.5 ml 150 µM etoxikumarint tartalmazó KHB (Krebs-Henseleit

36

puffer) oldattal inkubáltunk. Mivel a keletkezett metabolit (hidroxi-kumarin) a sejtekben gyorsan glükuronálódik, ezért a reakcióidő eltelte után az extracelluláris folyadék 1ml-ét β-glükuronidázal (1ml 0.1 M Na-acetát pH 4,4) emésztettük. Az emésztés célja a hidroxi-kumarin glükuronid konjugátumából való felszabadítása. A hidroxi-kumarin mennyiségét pH állítás után (pH 11) fluoriméterrel határoztuk meg (15. ábra).

CYP1A, CYP2B

CYP2E1

O

H5 C2 O

O

O

CYP2E1

Etoxikumarin

OH

O

Hidroxikumarin

Etoxikumarin O-deetiláz

15. ábra: Az etoxikumarin CYP1A, CYP2B és CYP2E1 enzimen keresztül történő metabolizmusa.

4.6.6. Aminopirin N-demetiláz A CYP3A egyik jelentős szubsztrátja az aminopirin, amelyből az enzim egy metil csoportot hasít le formaldehid képződése közben. A mikroszómális fehérje megfelelő mennyiségét (1mg/ml) 10 mM aminopirinnel inkubáltuk, a reakcóidő eltelte után a fehérjét centrifugálással eltávolítottuk, majd a képződött formaldehidet Nash-reagenssel (0.6% acetilaceton, 3.9 M ammònium-acetát) mutattuk ki (57). (16. ábra). A Nashreagens hozzáadása után a keletkezett komplex fotometriássan mérhető.

CH3

N

CH3

H

CH3

CH3 N CH3

O

CH3 N

CYP3A

-

N O

+

CH3

HCHO

Aminopirin N-demetilaz

Aminopirin

Noraminopirin

16. ábra: Az aminopirin CYP3A enzimen keresztül történő metablizmusa.

37

4.6.7. Etilmorfin N-demetiláz A CYP3A egyik specifikus szubsztrátja az etilmorfin, amelyből az enzim egy metil csoportot hasít le (17. ábra). 4x106 sejtet 2,5 ml 1,77 mM etilmorfinnal (HBSS-ben oldva) inkubáltunk. Az inkubálás után az extracelluláris folyadékot a sejtekkel együtt lúgosítottuk (26µl 4N NaOH-dal), majd diklórmetán:izopropanol (85:15 v/v) elegyel extraháltuk. A szerves fázist bepároltuk és HPLC eluensben oldottuk. A noretilmorfin mennyiségét Hino és mtsai (23) módszere alapján, HPLC-vel határoztuk meg.

HO

HO

N O

H

CH3

N

CYP3A CYP3A

CH3

O

etilmorfin N-demetiláz etilmorfin N-demetiláz O

O

C2H5

H2H5 C

Etilmorfin

Noretilmorfin

17. ábra: Az etilmorfin CYP3A enzimen keresztüli metabolizmusa.

4.7. P450 enzimek kimutatása immunoblot (Western blot) technikával A Western blot technika egy olyan elválasztás és kimutatási módszer, melynek során a mikroszomális fehérjéket gélelektroforézissel elválasztjuk, majd a fehérjék nitrocellulóz membránra való juttatása után az egyes fehérjék kimutatása az adott enzimre specifikus antitestek segítségével történik. Patkány máj mikroszómából, illetve hepatocyta kultúrából preparált mikroszómákból meghatároztuk az illető enzim fehérjemennyiségét (87).

38

A gélelektroforézis SDS-poliakrilamid gélben (7,5%-os), Laemmli módszere alapján történt (36). A mikroszomális fehérjéket denaturáltuk, így az elválasztás csupán a fehérjék méretétől függött. A gélben elválasztott fehérjéket elektromos térben nitrocellulóz membránra vittük át. A nitrocellulóz lapra került fehérjék elhelyezkedése és koncentrációja ugyanolyan, mint a gélben volt. Az elektromos cellában a membrán mindig az anód felöli részhez kerül, ugyanis az SDS-el denaturált fehérjék negatív tölktésűek (80). Antigén-antitest reakción alapuló detektálással néhány aminosavban különböző izoenzimek (pl P450 enzimek) is szelektíven kimutathatók. Az immundetektálás során két antitestet (primer és szekunder) használunk, melyekből az utóbbihoz tormaperoxidáz van kapcsolva. A következő patkány P450 enzimek ellen termeltetett ellenanyagokat használtuk: CYP1A1:

kecskében előálított anti-patkány-CYP1A1

CYP2B1/2: kecskében előálított anti-patkány-CYP2B1/2 CYP2E1:

nyúlban előálított anti-patkány-CYP2E1

CYP3A1/2: nyúlban előálított anti-patkány-CYP3A1/2. Szekunder ellenanyagként a következő tormaperoxidázzal konjugált ellenanyagokat alkalmaztuk: Anti-CYP1A1 és anti-CYP2B1/2-hez: nyúlban előállított anti-kecske IgG Anti-CYP2E1 és anti-CYP3A1/2: kecskében előállított anti-nyúl IgG. A kialakult antigén-primer antitest-szekunder antitest komplexhez hozzáadtuk a tormaperoxidáz szubsztrátját, a luminolt. Az enzimreakció során felvillanó fényt fényérzékeny filmmel rögzítettük (ECL Hyperfilm, Amersham). A filmen megjelenő foltok mind kvalitatív, mind kvantitatív kimutatásra is jók (61).

39

5. Eredmények és értékelésük

5.1. P450 enzimek aktivitása regenerálódó patkány májban A regeneráció P450 enzimekre gyakorolt hatását először von der Decken és Hutlin vizsgálta 1960-ban (85). A későbbiekben számos közlemény jelent meg ezzel kapcsolatban (23, 62, 34), amelyek azt tükrözik, hogy a P450 enzimek aktivitása és fehérjemennyisége nagymértékben lecsökken a regeneráció során. Nemcsak a P450 enzimek feherjemennyisége, hanem az mRNS szintek is jelentősen csökkennek (42, 81). Kísérleteink során vizsgáltuk, hogy a máj P450 enzimaktivitásai és az egyes P450 izoenzimek mennyisége hogyan alakul a májregeneráció kezdeti szakaszában. Partális hepatectomiát követően 72 órás regenerációs periódus alatt (0, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 72 óra) meghatároztuk a CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimek aktivitását és enzimfehérje mennyiségét. Minden időpontban négy állat eredményeiből átlagoltunk. A vizsgálatok önkontrollosak voltak, ami azt jelenti, hogy a kapott enzimaktivitásokat minden állat esetében a műtétileg eltávolított májszövetből mért alap aktivitásra (100%) vonatkoztattuk. Minden regenerációs időpontban meghatároztuk az áloperált állatok enzimaktivitásait is. Az áloperált állatok enzimaktivitásai nem különböztek a normál májlebenyekből mért értéktől, ami arra utal, hogy az éterrel történő altatás és a műtéti stressz nem befolyásolta az enzimaktivitásokat. A CYP1A enzimek etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitása enyhe csökkenést mutatott az első 6 órában, 12 órával a partiális hepatectomia után azonban az enzimaktivitás visszatért az eredeti szintre (18. ábra). A CYP1A1 fehérje szintén csökkenést mutatott a regeneráció 3. és 6. órájában és mennyisége csak a 12 órában emelkedett a kiindulási szintjére (22/A ábra). A CYP2B enzimek pentoxirezorufin O-dealkiláz aktivitása szignifikánsan csökkent az első 6 óra során, majd 12. órában visszatért a kiindulási értékre. A 24. és 36. órában azonban az aktivitások lecsökkentek és az enzim 72 órás regenerációs idő alatt nem érte el a kiindulási állapotot (19. ábra). A CYP2B1/2 enzim fehérje mennyisége az első 12 órában nem változott, azonos volt a kontroll (0h) értékkel. A 24 és 36. órában azonban jelentős csökkenést mutatott (22/A ábra).

40

A CYP2E1 p-nitrofenol-hidroxiláz aktivitása nagymértékben lecsökkent az első 6 órában. A 3. órában a kiindulási érték 30%-át mértük, majd ez után növekedést tapasztaltunk. 12 óra múlva a kiindulási aktivitásnak megfelelő értéket mértünk, majd 24. és 36. órában ismét csökkenést detektáltunk. Az enzim nem érte el a kiindulási értéket a 72 órás regenerációs idő alatt (20. ábra). A CYP2E1 fehérjemennyiség nem változott az első 12 órában, míg a 24 és 36 órás értékek nagyfokú csökkenést mutattak. A 72. órában az enzimfehérje mennyisége nőni kezdett (22/A ábra). A CYP3A aminopirin N-demetiláz aktivitása fokozatosan csökkent az első 12 órában és a minimumot 24. órában érte el. A 72 órában már majdnem 100%-os aktivitás volt mérhető (21. ábra). A CYP3A1/2 fehérjemennyiség lassan csökkent az első 24 órában, majd 72. órára mennyisége emelkedett (22/A ábra).

A fentiek alapján elmondható, hogy a partiális hepatectomia után megváltozott a máj metabolikus aktivitása. A regeneráció kezdetén (első 6 órában) az enzimaktivitások csökkenését tapasztaltuk. A CYP1A, CYP2B és CYP2E1 enzimek esetében rendre 30, 50 és 70%-os csökkenést tapasztaltunk. A CYP3A enzim aktivitásának csökkenése csak később (24. órában) következett be. A csökkenés mértéke 60%-os volt. A CYP1A1, CYP2B1/2 és CYP3A1/2 enzimek fehérjemennyiségének változása alátámasztotta az enzimaktivitások eredményeit. A CYP2E1 enzim aktivitása nagyfokú fluktuációt mutatott a regeneráció korai szakaszában, ami fehérje szinten nem volt detektálható.

41

A 160

CYP1A 140

Relatív aktivitás (%)

120 100 80 60

* Parciális hepatectomia Parciális hepatectomia és dexametazon

40 20 0 0

20

40

60

80

IdőIdo (óra)(óra)

18. ábra: A partiális hepatectomia és a dexametazon kezelés hatása a CYP1A enzimek etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitására 72 órás regenerációs időintervallum alatt. A * két pont közti szignifikáns különbségeket jelöli (p<0.05).

B 160

CYP2B 140

-○- parciális hepatectomia -●- partiális hepatectomia és dexametazon

Relatív aktivitás (%)

120 100 80 60

* 40 20 0 0

20

40

60

80

IdőIdo (óra)(óra)

19. ábra: A partiális hepatectomia és a dexametazon kezelés hatása a CYP2B enzimek pentoxirezorufin O-dealkiláz aktivitására 72 órás regenerációs időintervallum alatt. A * két pont közti szignifikáns különbségeket jelöli (p<0.05).

42

C 160

CYP2E1 140

-○- parciális hepatectomia -●- partiális hepatectomia és dexametazon

Relatív aktivitás (%)

120 100 80 60

* 40 20

* *

0 0

20

40

60

80

Ido (óra) Idő (óra)

20. ábra: A partiális hepatectomia és a dexamethazon hatása a CYP2E1 enzim p-nitrofenolhidroxiláz aktivitására 72 órás regenerációs időintervallum alatt. A * két pont közti szignifikáns különbségeket jelöli (p<0.05).

D 160

CYP3A 140

-○- parciális hepatectomia -●- partiális hepatectomia és dexametazon

Relatív aktivitás (%)

120 100 80 60

*

40 20

*

*

0 0

20

40

60

80

IdőIdo (óra) (óra)

21. ábra: A partiális hepatectomia és a dexamethazon hatása a CYP3A enzim aminopirin Ndeetiláz aktivitására 72 órás regenerációs időintervallum alatt. A * két pont közti szignifikáns különbségeket jelöli (p<0.05).

43

22. ábra: A partiális hepatectomia (A) és a partiális hepatectomia ± dexametazon kezelés (B) hatása a P450 enzimek (CYP1A1, CYP2B1/2, CYP2E1 és CYP3A1/2) fehérjemennyiségére 72 órás regenerációs időintervallum alatt.

A

Parciális hepatectomia

CYP1A1 CYP2B1/2 CYP2E1 CYP3A1/2 0

1

3

6

12

24

36

72

Idő (óra)

B

Parciális hepatectomia és dexametazon

CYP1A1 CYP2B1/2 CYP2E1 CYP3A1/2 0

1

3

6

12 Idő (óra)

44

24

36

72

5.2. Dexametazon hatása a P450 enzimekre regenerálódó májban Vizsgáltuk még egy szteroid molekula a dexametazon hatását a P450 enzimekre a regeneráció során. A dexametazonról ismert, hogy lassítja a regenerációs folyamatot, valamint képes egyes P450 enzimeket indukálni. Kísérleteink során 100 mg/tkg dexametazonnal kezeltünk patkányokat. Parciális hepatectomia után különböző ideig regenerálódó állatok májából mikroszómát preparáltunk és mértük a P450 enzimek ativitását és fehérjemennyiségét. CYP1A enzimek esetében a hepatectomiát követően 3 és 6 órával a dexametazon kezelés megakadályozta az aktvitás csökkenését a kezeletlen csoporthoz képest. A 24. 36. és 72. órában az aktivitás megegyezett a kezeletlen csoportban mért értékkel (18. ábra). A CYP1A1 fehérje mennyisége követi az aktivitásokból kapott eredményeket, az első 6 órában nem tapasztaltunk csökkenést, és enyhe enzimfehérje mennyiség változást detektáltunk a 12., 24. és 36. órában (22/B. ábra). A CYP2B enzimek esetében a 6. órában bekövetkező csökkenést a dexametazon kezelés megakadályozta, de a 24. órától mutatkozó aktivitás vesztést már nem volt képes kivédeni (19. ábra). A CYP2B1/2 fehérje mennyisége alátámasztotta az aktivitásokból kapott eredményeket, az első 12 órában az értékek megegyeznek a kontroll csoportok értékeivel. A 24., 36. és 72. órában csökken a fehérje mennyisége hasonlóan a kezeletlen állatokhoz (22/B. ábra). A dexametazonnal kezelt csoportban a CYP2E1 enzim p-nitrofenol hidroxiláz aktivitása lassan csökkent a kezdeti időpontokban, majd 36 óránál elérte a minimumot. A 72. órában enyhe növekedés volt mérhető. A dexametazonnal kezelt csoportban nem tapasztaltunk akkora fluktuációt az enzimaktivitásban, mint a kezeletleneknél (20. ábra). A CYP2E1 enzim fehérje mennyisége az első 12 órában nem változott, később fokozatosan csökkeni kezdett, majd a 72 órában már kezdett visszatérni az eredeti szintre (22/B ábra). A CYP3A enzimek aminopirin N-demetiláz aktivitása az első 24 órában nem változott, majd a későbbiekben enyhén csökkeni kezdett (21. ábra). A 72. órában az aktivitás a kiindulási állapot 80%-ára redukálódott. A CYP3A1/2 fehérjemennyisége követte az enzimaktivitások eredményeit (22/B ábra).

45

Összefoglalva elmondható, hogy a dexametazon kezelés mind a P450 enzimek aktivitására mind a fehérjemennyiségére hatással volt a regeneráció során. A CYP1A, CYP2B és CYP2E1 enzimek esetén a dexametazon hatása főként a korai regenerációs időpontokban érvényesült. Míg a CYP3A enzimaktivitás a dexametazon kezelés hatására szinte mindvégig konstans maradt, ellentétben a kezeletlen állatok CYP3A aktivitásaival.

5.3. CYP2E1 enzim indukciójának vizsgálata sejtkultúrában Mivel a CYP2E1 enzim p-nitrofenol-hidroxiláz aktivitása csak mikroszómából mérhető, az etoxikumarin O-deetilezését pedig több P450 enzim (CYP1A, CYP2B, CYP2E1) is katalizálja, vizsgálataink során egy olyan CYP2E1-re specifikus aktivitás (klórzoxazon 6-hidroxiláz) mérési módszert állítottunk be, amely sejtkultúrában tartott májsejtekben is jól mérhető.

5.3.1. Módszer a klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás sejtkultúrában való meghatározására A CYP2E1 enzim aktivitását és indukálhatóságát már sokan vizsgálták sejtkultúrás rendszerben. Ezek a vizsgálatok főleg Matrigel és Vitrogen felszínen elhelyezett hepatocytákon történtek (90, 91, 5). Kísérleteink során a CYP2E1 enzim specifikus aktivitását és ismert induktorokkal történő indukálhatóságát vizsgáltuk kollagén alapú mátrixon letapadt sejtekben. A kollagén jobban modellezi az eredeti májszövetben található állapotokat, mint más mesterséges mátrixok és kísérleti állatokból könnyen izolálható, alacsony költséggel preparálható. A klórzoxazont a CYP2E1 enzim hidroxilezi (6-hidroxi-klórzoxazon képződik), majd konjugáció nélkül ürül a sejtből (41, 59). Az irodalomban a klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás mérésére mikroszomális meghatározást találtunk. A meghatározás részleteit a Módszerek rész 4.6.4. fejezetében adtam meg. Mind mikroszòmábòl, mind sejtekből történő aktivitás meghatározás során

46

a keletkező metabolit mennyiségét HPLC-vel határoztuk meg. Az extrakciòs hiba kiküszöbölése végett az extrakciò előtt fenacetint (belső standard) adtunk a mintához, és a mért 6-hidroxiklòrzoxazon mennyiségét erre korrigáltuk. A 23. ábra jòl illusztrálja a keletkező metabolit, a fenacetin és a klòrzoxazon retenciòs idejét.

50

Terület (mV) Intenzitás

klórzoxazon

6-hidroxi-klórzoxazon

belso standard

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Idő Ido(perc)

23. ábra 6-Hidroxi-klórzoxazon meghatározása HPLC-vel.

A sejtkultúrás mérések során a sejteket 10, 20 vagy 30 percig inkubáltuk klòrzoxazon szubsztrát

segítségével,

mert

ebben

az

időintervallumban

400

µM

szubsztrátkoncentráciò mellett a szubsztrát fogyása egységnyi idő alatt nem változott (24. ábra).

47

6-hidroxi-klórzoxazon mennyisége (pmól) pmól

3000

2500

2000

1500

r= 0.996

1000

500

0 0

5

10

15

20

25

30

Id o(perc) (ó ra) Idő

24. ábra. 6-Hidroxi-klórzoxazon képződése az idő függvényében.

A patkánymájból nyert hepatocytákat 72 óráig tartottuk sejtkultúrás rendszerben. A sejtek CYP2E1 klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitása 72 óra alatt a kezdeti érték 20%-ra csökkent (25/A. ábra). A Western blot vizsgálatok azt mutatták, hogy a CYP2E1 enzim

48

fehérjemennyiségének változása nem követte teljesen az aktivitásokból kapott értékeket, mert a fehérje mennyiségének csökkenése az első 24 órában nem volt tapasztalható (25/B ábra), mérhető csökkenés csak a 48. és 72. órában történt.

A 150

Klórzoxazon 6-hidroxiláz 6 (pmól/4x10 sejt/perc)

125

100

75

50

25

0 0

20

40

60

80

Ido (óra)

Idő (óra)

CYP2E1

B

0

24

48

72

Idő (òra)

25. ábra CYP2E1 enzim klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitásának (A) és fehérjemennyiségének (B) változása sejtkultúrában.

49

5.3.2.CYP2E1 indukciója patkány májsejtekben

A CYP2E1 enzim sejtkultúrában történő indukálhatóságát a következő ismert induktorokkal vizsgáltuk: aceton (5mM, 50mM), etanol (10mM, 100mM), izopropanol (5mM, 50mM), DMSO (5mM, 50mM), pirazol (50µM, 500µM), imidazol (50µM, 500µM)) (20 ábra). A 48 órás indukciós periódus alatt a vizsgált induktorok mindegyike képes volt arra, hogy megakadályozza a kontroll sejtekben tapasztalható CYP2E1 aktivitás csökkenést, azonban egyik induktor sem emelte a kiindulási (0 percben mérhető) érték fölé a klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitást. Ez azt jelenti, hogy valós indukció (a CYP2E1 gén átíródásának fokozása) nem történt, csupán a már meglévő fehérje degradációját gátolták a vizsgált induktorok, vagyis a CYP2E1 enzim fehérjét stabilizálták. Meg kell azonban jegyezni, hogy 100 mM etanol és 5 mM aceton csak kb. 25-26%-os klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás növekedést okozott a kezeletlen sejtekhez képest, míg a DMSO, izopropanol, és pirazol hatása még kifejezettebb volt főleg a nagyobb koncentrációk esetében. A leghatékonyabb induktornak az imidazol bizonyult (500µM), ami kb. 4-szeres aktivitás növekedést eredményezett (26/A ábra). A fehérjeszintű vizsgálatok minden induktor esetében jól korrelálnak az enzimaktivitások eredményeivel (26/B ábra). A további in vitro vizsgálatokhoz az imidazol (500 µM) használtuk szelektív CYP2E1 induktorként.

50

A

*

Klórzoxazon 6-hidroxiláz 6 (pmól/ 4x10 sejt/perc)

250

200

150

* * 100

*

*

*

*

*

*

*

50

0 K

etanol

DMSO

i-PROP aceton pirazol

imidazol

B

B

10 K

100

etanol

5

50 DMSO

5

50 i-PROP

5

50 aceton

0.05

0.5

pirazol

0.05

0.5

imidazol

26. ábra. Különböző ismert induktorok hatása a patkány CYP2E1 enzimre sejtkultúrában: etanol (10mM, 100mM), DMSO (5mM, 50mM), i-PROP (5mM, 50mM), aceton (5mM, 50mM), pirazol (50µ µM, 500µ µM), imidazol (50µ µM, 500µ µM)). A. Klórzoxazon hidroxiláz aktivitás, B. A CYP2E1 fehérjemennyiségének meghatározása (K-kontrol, I-PROP-izopropanol).

51

mM

5.4. P450 enzimek in vitro indukciójának vizsgálata regenerálódó májból izolált sejtekben P450

enzimek

indukálhatóságát

regenerálódó

májból

létrehozott

sejtkultúrás

rendszerben vizsgáltuk és eredményeinket a normál hepatocyta, valamint az áloperált állatokból preparált sejtkultúrából kapott eredményekhez hasonlítottuk. Kísérleteink során a CYP1A, CYP2E1 és CYP3A enzimeket vizsgáltunk. A partiális hepatectomia után a májat különböző ideig hagytuk regenerálódni (1, 3, 7, 14 napig), majd a sejtpreparálás után a hepatocytákból sejtkultúrát hoztunk létre (27. ábra). A sejteket induktorokkal kezeltük 48 órán keresztül: 3- metilkolantrén (3.7 µM), imidazol (500 µM), dexametazon (10µM). Végül meghatároztuk a sejtek enzimaktivitásait és P450 enzimfehérje tartalmát (27. ábra). Mivel az áloperált állatokból nyert májsejtek eredményei nem különböztek a normál sejtekből mért értéktől, ezért megállapíthatjuk, hogy a műtéti stressz nem befolyásolta mérési eredményeinket.

májregeneráció (1, 3, 7, 14 nap)

indukció (48ó)

partiális hepatectomia vagy áloperáció

májsejtpreparálás

27. ábra. A kísérlet eseményeinek sematikus ábrázolása.

52

mérések

5.4.1. CYP1A enzimek indukciója vizsgálata regenerálódó májból izolált sejtekben

A CYP1A enzimek etoxiresorufin O-dealkiláz aktivitása nagymértékben lecsökkent az egy napig regenerálódó, sejtekben (28/A ábra). A CYP1A enzimek aktivitása a 3 napig regenerálódó májból izolált sejtekben már a normál sejtekben mérhető értékkel volt azonos. A 48 órán keresztül, 3-metilkolantrénnel indukált, regenerálódó májból izolált sejtekben a CYP1A enzimek aktivitása eltért az áloperált állatokból preparált sejtekhez képest. Szignifikáns eltérést tapasztaltunk a 3 napig regenerálódó májból izolált sejtekben 3metilkolantrén kezelés hatására, ugyanis ezen sejtek CYP1A enzim aktivitása (1633 ± 538.3 pmól/4 x 106 sejt/perc) 3x nagyobb volt, mint az áloperált állatokból nyert sejteké (466±80.3 pmól/4x 106 sejt/perc). Az 1, 7 és 14 napig regenerálódó májból izolált sejteket 3-metilkolantrénnel kezelve a CYP1A enzim aktivitása nem mutatott eltérést (29/A ábra). A CYP1A1 enzim fehérje 3-metilkolantrén hatására, mind az áloperált állatokból, mind a regenerálódó májból izolált sejtekben indukálódott; az 1, 7, 14 napig regenerálódó májbòl származó sejtekben az indukció mértéke közel azonos volt az áloperált állatok májsejtjeiben mért enzimfehérje mennyiségével. A 3 napig regenerálódó állatok májsejtjeiben az indukció szignifikánsan nagyobb mértékű fehérje expressziót okozott (29/B ábra).

53

Ethoxyresorufin O-dealkylation O-dealkiláz aktivitás Etoxirezorufin 6 (pmol/4x10 cells/min) (pmól/4x106 sejt/perc

A

12

10

8

6

*

* 4

* 2

0

SHAM àloperàlt

1

3

7

14

Regeneration period (days)

Regeneràciós periódus (napok)

B 6-hidroxiláz aktivitás Klórzoxazon Chlorzoxazone 6-hydroxylation 6 sejt/perc 6 (pmól/4x10 cells/min) (pmol/4x10

50

40

30

* * *

20

10

0

SHAM

àloperàlt

1

3

7

14

Regeneration period (days) (napok) Regeneràciós periódus

C Etilmorfin N demetiláz aktivitás Ethylmorphine N-demethylation 6 sejt/perc 6 (pmól/4x10 (pmol/4x10 cells/min)

1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

SHAM àloperàlt

1

3

7

14

Regeneration period (days)

Regeneràciós periódus (napok)

28. ábra. A CYP1A (A), CYP2E1 (C) és CYP3A (B) enzimek aktivitásának változása regenerálódó májból preparált sejtekben.

54

29. ábra 3-metilkolantrénnel (3.7 µM) indukált sejtek CYP1A enzim aktivitásának (A) és CYP1A1 fehérje tartalmának (B) vizsgálata regenerálódó, vagy áloperált sejtekben.

A

Etoxirezorufin O-dealkiláz Etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitás aktivitás 6 6 (pmól/4x10 (pmol/4x10 sejt/perc) sejt/perc)

*

CYP1A

2000

1500

1000

500

0

SHAM Áloperált

1

3

7

14

Regenerációs periódus (napok)

B

3-metilkolantrén kezelt

CYP1A1 Áloperált SHAM

1

3

7

55

14 nap

5.4.2. CYP2E1 enzim indukciója vizsgálata regenerálódó májból izolált sejtekben

Kezeletlen sejtekben a CYP2E1 enzim klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitása lecsökkent (50%). (28/B ábra). Csökkent aktivitást tapasztaltunk 3 illetve 7 napig regenerálódó májból származó sejtekben is, majd 14 nap után visszatért az áloperált állatok sejtjeiben mért értékre. Az imidazollal indukált sejtek szintén aktivitáscsökkenést mutattak az 1, 3 és 7 napig regenerálódó májból történő preparálás után. Habár az indukált sejtekből mért aktivitás változott a regeneráció hatására, az indukció mértéke mindig ugyan akkora volt, mint amekkora indukciót az áloperált állatokból származó sejtekben lehet mérni (2.5x) (30/A ábra).

A

CYP2E1

fehérje

mennyiségének

enzimaktivitásokból kapott változásokat (30/B ábra).

56

változása

megerősítette

az

29. ábra. Imidazollal indukált sejtek aktivitásának (A) és CYP2E1 enzimfehérje mennyiségének (B) vizsgálata regenerálódó és áloperált patkányok májsejtjeiben.

A

120

kezeletlen imidazol kezelt

(pmol/4x10 sejt/perc) Klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás 6 (pmól/4x10 sejt/perc)

CYP2E1

100

6

80

60

40

20

0

Áloperàlt SHAM

1

3

7

14

Regenerációs periódus (napok)

B Kontrol

imidazol kezelt

CYP2E1 SHAM Áloperált

1

3

57

7

14 nap

5.4.3. CYP3A enzimek indukciójának vizsgálata regenerálódó májból izolált sejtekben

A CYP3A enzim aktivitásának meghatározásához sejtkultúrában az aminopirin szubsztráttal történő mérés nem kivitelezhető, mivel a formaldehid meghatározást számos tényező zavarja a tápfolyadékban, ezért szubsztrátként etilmorfint alkalmaztunk és termelődő noretilmorfint HPLC-vel mértük. A CYP3A enzimek etilmorfin N-demetiláz aktivitása valamelyest csökkent a partiális hepatectomiát követően, de e változások a nagy szórás miatt nem szignifikánsak (28/C ábra). Dexametazon kezelés során a CYP3A enzim aktivitása nagymértékben megnőtt az 1, 3 és a 7 napig regenerálódó májból izolált sejtekben. Az indukció mértéke az áloperált patkányokból nyert, dexametazonnal kezelt sejtekhez képest 2x-2.5x volt (31/A ábra). Az indukció mértékének növekedését a CYP3A1 fehérje mennyiség változása is tükrözi (31/B ábra).

58

31. ábra. 10µ µM dexametazonnal indukált sejtek CYP3A aktivitásának (A) és CYP3A1/2 enzimfehérje mennyiségének (B) vizsgálata regenerálódó májból, vagy áloperált állatok májából származó sejtekben.

A

Etilmorfin N-demetiláz Etilmorfin N-demetiláz aktivitás 6 6 sejt/perc) (pmol/4x10 sejt/perc) (pmól/4x10

10 9

CYP3A

8

*

7

*

*

6 5 4 3 2 1 0

SHAM Áloperált

1

3

7

14

Regenerációs periódus (napok)

B

dexametazon kezelt

CYP3A1 Áloperált SHAM

1

3

59

7

14 nap

A fentiek alapján elmondható, hogy a partiális hepatectomia nemcsak a CYP1A, CYP2E1, CYP3A enzimek alapaktivitását befolyásolta, hanem a regeneráció hatására megváltozik ezen enzimek indukálhatósága is. A CYP1A és CYP3A enzimek esetében a 3-metilkolantrén és a dexametazon induktorok hatására nagyobb mértékű indukció jött létre a regenerálódó májból izolált sejtekben, mint az áloperált állatok májsejtjeiben. A CYP2E1 enzim mennyisége szintén csökkent a regeneráció során. Az imidazol mind az áloperált patkányokból származó, mind a regenerálódó máj sejteiben képes volt indukálni a CYP2E1 enzimet, de ennek mértéke mindkét csoportban egyforma volt (22.5x).

60

6. Összegzés A P450 enzimek aktivitása és fehérjemennyisége a máj patofiziológiás elváltozásával járó állapotokban megváltozik. Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy osztódó májsejtekben, amit partiális hepatectomiát követő májregenerációval modelleztünk, milyen P450 enzim változásokat tapasztalunk. Regeneráció során a hepatocyták dedifferenciálódnak, ami egyben a májsejt specifikus homeosztatikus funkcióinak csökkenésével jár, így a metabolikus aktivitása is csökken. Vizsgálaltaink során a következő megállapításokat tettük:

1. Partiális hepatectomia után a patkány májsejtek regenerációja során (72 órás periódus) a vizsgált P450 enzimek (CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A) aktivitása és fehérjemennyisége megváltozott: CYP1A enzim esetében enyhe, de szignifikáns csökkenést csak a nagyon korai időpontban találtunk, a későbbiek során az aktivitás értéke és a CYP1A1 fehérje mennyisége megegyezett az áloperált állatok értékeivel. CYP2B enzim aktivitása és fehérjemennyisége is rögtön lecsökkent a partiális hepatectomiát követően, azonban 72 órás periódus alatt nem állt vissza a kiindulási értékre. CYP2E1 enzim aktivitása a regeneráció kezdeti szakaszában fluktuációt mutat ami fehérje szinten nem mutatható ki, majd a későbbiek során lassan visszaáll a kiindulási értékre. CYP3A enzim esetében a korai időpontokban nincs aktivitás csökkenés, azonban 24 órával a partiális hepatectomiát követően drasztikusan lecsökken az enzim aktivitása és fehérjemennyisége.

2. In vivo dexametazon kezelés, ami lassítja a regenerációs folyamatot, egyes P450 enzimek kifejeződésére is hatással van, regenerálódó májban a P450 enzimek aktivitásat a következő képpen befolyásolta: CYP1A és CYP2B enzim esetében a dexametazon előkezelés mérsékelte a partiális hepatectomia okozta enzimaktivitás és fehérje vesztést.

61

CYP2E1 enzim esetében mind aktivitás, mind fehérje szintjén a dexametazon megszüntette a korai időpontokban tapasztalt fluktuációt. CYP3A esetében a dexametazon képes volt regenerálódó sejtekben is megőrizni az enzimek áloperált állatban mért értékét.

3. P450 enzimek in vitro indukciójának vizsgálata regenerálódó májból származó sejtkultúrában. A második kísérletsorozatban azt vizsgáltuk, hogy a P450 enzimek (CYP1A, CYP2E1 és CYP3A) indukálhatósága hogyan változik regenerálódó májból izolált sejtekben. Megállapítható, hogy a regenerálódó májból izolált sejtek megtartották P450 enzim indukálhatóságukat, azonban az indukció mértékében eltérések tapasztalhatók: A CYP1A enzimek 3-metilkolantrén indukciójának mértéke nagyobb volt (3x) a három napig regenerálódó májból izolált sejtekben, mint az áloperáltakban. Az indukció során mind az aktivitás, mind a fehérje mennyiség megemelkedett. Imidazollal történő kezelése során a regeneráltatott sejtek és az áloperált sejtek CYP2E1 indukciójának mértéke megeegyezett (2.5x). A CYP3A enzimek dexametazonnal kiváltott indukciójának mértéke szintén nagyobb volt (2-2.5x) az 1, 3 és 7 napig a regenerálódó májbòl nyert sejtekben, mint az áloperált hepatocytákban.

62

7. Köszönetnyilvánítás Disszertációm az MTA Kémiai Kutatóközpont Kémiai Intézetének Farmakobiokémiai Osztályán és részben a Semmelweis Egyetem Genetikai-, Sejt és Immunbiológiai Intézetében készült.

A páratlan segítségért, a példamutatásért, hogy mindig lehet még jobban csinálni és mindenekelőtt az irántam mutatott türelemért és szeretetért köszönettel tartozom: Monostory Katalinnak, Vereczkey Lászlónak, Falus Andrásnak, Grényi Máriának és Dobozy Ottónak…

63

8. Irodalomjegyzék

1. Akerman, P., Cote, P., Yang, S. Q. (1992) Antibodies to tumor necrosis factor alpha inhibit induction of hepatocyte and non-parenchymal cell proliferation after partial hepatectomy. Am. J. Physiol. 263: 579-85. 2. Anakk, S., Ku, C. Y., Vore, M. and Strobel, H. W. (2003) Insights into Gender Bias: Rat Cytochrome P450 3A9. JPET 305:703-709. 3. Baba, T., Mimura, J., Gradin, K., Kuroiwa, A., Watanabe, T., Matsuda, Y., Inazawa, J., Sogawa, K., and Fujii-Kuriyama, Y. (2001) Structure and Expression of the Ah Receptor Gene. J. Biol. Chem. 276: 33101-10. 4. Ballou, S. P., Kushner, I. (1992) C-reactiv protein and the acute phase response. Adv. Intern. Med. 37: 313-36. 5. Bayliss, M. K., Skett, P. (1996) In: Human Cell Culture Protocols (ed. Jones G.E.) Humana Press, Totowa, NJ, 369-90. 6. Berry, M. N., Edwards, A. M., Barrit, G. J. (1991) In: Isolated hepatocytes, preparation, proporties and applications. Elsevier, Amsterdam 45-70. 7. Burke,

M.

D.

and

Thomson,

S.

(1970)

Ethoxy-,

pentoxy

and

benzyloxyphenoxazones and homologues: a series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P-450. Biochem. Pharmacol. 34: 333745. 8. Debri, K., Boobis, A. R., Davies, D. S., and Edwards, R. J. (1995) Distribution and induction of CYP3A1 and CYP3A2 in rat liver and extrahepatic tissues. Biochem. Pharmacol. 50:12, 2047-2056. 9. Eagon, P. K., Porter, L. E., Francavilla, A., DiLeo, A., Van Thiel, D. H. (1985) Estrogen and androgen receptors in liver: their role in liver disease and regeneration. Semin. Liver Disease. 5(1):59-69. 10. Elferink, C. J., Nie-Lin, G., and Levine, A. (2001) Maximal aryl hydrocarbon receptor activity depends on an interaction with the retinoblastoma protein. Mol. Pharmacol. 59:1-10.

64

11. Eliasson, E., Johansson, I., Ingelman-Sundberg, M. (1988) Ligand-dependent maintenance of ethanol-inducible cytochrome P-450 in primary rat hepatocyte cell cultures. Biophys. Res. Commun. 150: 436-443. 12. Fausto, N. In the liver: Biology and Pathology, (1994) Arias I. M. Eds. Raven, New York, ed. 3, chap 8. 13. Fausto, N. (1990) Hepatic regeneration. in: Zakim D., Boyer T. D. Hepatology: a textbook of liver disease. Philadelphia, Saunders, 49-61. 14. Ferrini, J. B., Ourlin, J. C., Pichard, L., Fabre, G., Maurel, P. (1998) Human hepatocyte culture. Methods in Molecular Biology 107: 341-352. 15. Fladmark, K. E., Giersten, B. T., Molven, A., Mellgren, G., Vintermyr, O. K., Doskeland, S. O. (1999) Gap junctions and growth control in liver regeneration and in isolated rat hepatocytes. Hepatol. 25: 847-55. 16. Fleckenstein, J. F., Wand, G. S., Yang, S. Q. (1992) TNF-alpha inhibits hormonal activation of cAMP signalling and directly promotes mitogen-induced DNA synthesis in hepatocytes Hepatol. 16: 139-149. 17. Francavilla, A., Azzarone, A., Carrieri, G., Scotti-Foglieni, C. Zeng, Q. H. Cillo, U. Porter, K. Starzl, T. E. (1992) Effect of the canine Eck fistula liver of intraportal TGF-β alone all with hepatic growth factors. Hepatol. 16: 1267-70. 18. Fujisawa-Sehara, A., Sogawa, K., Yamane, M., and Fuji-Kurijama, Y. (1987) Caracterization of xenobiotic responsive elements upstream from the drugmetabolizing cytochrome P-450c gene: similarity to glucocorticoid regulatory elements. Nucleic Acids Res.15: 4179. 19. Gonzales, F. J., Song, B. J. and Hardwick, J. P. (1986) Pregnenolone 16-alphacarbonitrile-inducible P-450 gene family: gene conversion and differential regulation. Mol. Cell Biol. 6: 2969-2976. 20. Grisham, J. W., and Thorgeirsson, S. S. (1997) In: Stem Cells, Potten C. S. Ed. (Academic Press, San Diego, CA, chap. 8. 21. Higgins, G. M. and Anderson, R. M. (1931) Experimenthal pathology of the liver. Arch. Pathol. 12, 186-202. 22. Hines, R. N., Levy, J. B., Conrad, R. D., Iversen, P. L., Shen, M. L., Renli, A. M. and Bresnick, E. (1985) Gene structure and nucleotide sequence for rat cytochrome P-450c. 237:2 465-476.

65

23. Hino, Y., Imai, Y., and Sato, R. (1974). Induction by phenobarbital of hepatic microsomal drug-metabolizing enzyme system in partially hepatectomized rats. J. Biochem. 76, 735-44. 24. Hoffman, L. A., Rosen, R. H., Ljubimova, L. J., Sher, L., M. D., Poresta, L. G., Demetriov, A. A., Makowska, L. (1994)

Hepatic regeneration: Current

Concepts amd Clinical Implications Semin. Liver Dis. 14 (2) 190-210. 25. Honkakoski, P. and Negishi, M. (2000) Regulation of cytochrome P450 (CYP) genes by nuclear receptors. Biochem. J. 347: 321-337. 26. Huss, J. M. and Kasper, C. B. (1998) Nuclear receptor involvement in the regulation of rat cytochrome P450 3A23 expression. J. Biol. Chem. 273: 1615516162. 27. Huss, J. M. and Kasper, C. B. (2000) Two-Stage glucocorticoid induction of CYP3A23 through both the glucocorticoid and pregnane X receptors. Mol. Pharm. 58: 48-57. 28. Huss, J. M., Wang, S. I., Astrom, A., McQuiddy, P. and Kasper, C. B. (1996) Dexamethasone responsiveness of a major glucocorticoid-inducible CYP3A gene is mediated by elements unrelated to a glucocorticoid receptor binding motif. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4666-4670. 29. Ioannides, C. Cytochromes p450 metabolic and toxicological aspects. (1996) CRC press, Boca Raton. 30. Isom, H. C., Georgoff, I. (1984) Quantitative assay for albumin-producing liver cells after simian virus 40 transformation of rat hepatocytes maintained in chemically defined medium. PNAS 81(20): 6378-82. 31. Khatsenko, O. G., Gross, S. S., Rikind, A. B., Vane, J. R. (1993) Nitric oxide is a mediator of the decrease in cytochrome P450-dependent metabolism caused by immunostimulants. Proc. Natl. Acad. Sci.. 90:11147-51. 32. Kim, S. G., Shehin, S. E., States, J. C., Novak, R. F. (1990). Induction of rat hepatic P450IIE1 (CYP 2E1) by pyridine: evidence for a role of protein synthesis in the absence of transcriptional activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 767-774. 33. Kim, T. H, Mars, W..M., Michalopoulops, G. K. (1996). ibid. 24, 134A.

66

34. Klinger, W., and Karge, E., (1987) Interaction of induction, ontogenetic development and liver regeneration on the monooxygenase level . Exp. Pathol. 31, 117-24. 35. Komori, M. and Oda, Y. (1994) A major glucocorticoid –inducible P450 in rat liver is not P450 3A1. J. Biochem. 116:114-120. 36. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. 37. Lewis, D. F. V. (2001) The P450 catalytic cycle in: Guide to Cytochromes P450 Structure and Function, 51-75. 38. Linder, M. W., Falkner K. C., Sprinivasan, G., Hines, R. N. and Prough, R. A. (1999) Role of canonical glucocorticoid responsive elements in modulating expression of genes regulated by the arylhydrocarbon receptor. Drug. Metab. Rev. 31(1): 247-71. 39. Liu, M. L., Mars, W. M., Zarnegar, R., Michalopoulos, G. K., Collagenase pretreatment and the mitogenic effects of hepatocyte growth factor and transforming growth factor-alpha in adult rat liver. (1994) Hepatol. 19(6): 15217. 40. Lowry O. H. (1951) Protein measurment with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-75. 41. Lucas, D., Menez, J. F., Berthou, F. (1996) Chlorzoxazone: an in vitro and in vivo substrate probe for liver CYP2E1. Methods in Enzymol. 272: 115-123. 42. Marie, J. I., Dalet, C., Blanchard, J. M., Astre, C., Szawlowski, A., Saint Aubert, B., Joyeux, H., and Maurel, P. (1988) Inhibition of cytochrome P-450p (P450IIIA1) gene expression during liver regeneration from two thirds hepatectomy in the rat. Biochem. Pharmacol. 37: 3515-3521. 43. Mathis, J. M., Houser, W. H., Bresnick, E., Cidlowski, J. A., Hines, R. N., Prough, R. A. and Simpson, E. R. (1989) Glucocorticoid regulation of the rat cytochrome P450c (P450IA1) gene: receptor binding within intron I. Arch. Biochem. Biophys. 309:1, 93-105. 44. Mars, W. M., Liu, M. L., Kitson, R. P. Goldfarb, R. H., Gabauer, M. K. Michalopoulos, G. K. (1995) Immediate early detection of urokinase receptor

67

after partial hepatectomy and its implications for initiation of liver regeneration. Hepatol. 21: 1695-701. 45. Matsushima-Nishiwaki, R, Okuno, M, Adachi, S., Sano, T., Akita, K., Moriwaki, H., Friedman, S. L., Kojima, S. (2001) Phosphorylation of retinoid X receptor alpha at serine 260 impairs its metabolism and function in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 61: (20), 7675-82. 46. Matsumoto, K., Nakamura, T. Roles of HGF as a pleiotropic factor in organ regeneration (In: Goldberg ID, Rosen EM: Hepatocyte growth factor-scatter factor (HGF-SF) and C-met receptor. (1993) Basel: Birkhauser Verlag 225-49. 47. McGowan, J. A., Stain, A. J., Bucher, N. L. R. (1981) DNA synthesis in primary cultures of adult rat hepatocytes in defined medium: effects of epidermal growth factor, insulin, glucagon and cyclic-AMP J. Cell . Physiol. 108: 353-63. 48. Michalopulos, G. K. (1992) Liver regeneration growth factors: old puzzels and new perspectives. Lab. Invest. 67: 413-5. 49. Michalopulos, G. K. (1990)

Liver regeneration: molecular mechanism of

growth control. FASEB J 4: 176-87. 50. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. (1997) Liver regeneration. Science. 276: 60-66. 51. Monostory, K., Vereczkey, L. (1996) In vitro-in vivo correlation of CYP1A induction. Exp. Toxic. Pathol. 48, suppl. II., 291-294. 52. Morgan, J. R., Yarmush, M. L. (1998) Tissue engineering methods and protocols., Humana press, Totowa, NY. 227-243. 53. Muangmoonchai, R., Smirlis, D., Wong, S. C., Edwards, M., Philips, I. R., Shepard, E. A. (2001) Xenobiotic induction of cytochrome P450 2B1 (CYP2B1) is mediated by the orphan nuclear receptor constitutive androstane receptor (CAR) and requires steroid co-activator 1 (SRC-1) and the transcription factor Sp1. Biochem. J. 355:1 71-78. 54. Nagata, K., Ogino, M., Shimada, M., Miyata, M., Gonzalez, F. J., Yamazoe, Y. (1999) Structure and expression of the rat CYP3A1 gene: Isolation of the gene (P450/6BB) and caracterization of the recombinant protein. Arch. Biochem. Biophys. 362:2, 242-253.

68

55. Nagy, P., Bisgaard, H. C., Schnur, J., Thorgeirsson, S. S. (2000) Studies on hepatic gene expression in different liver regenerating models. Biochem. Biophys. Res. Commun. 272 591-5. 56. Nagy, P., Bisgaard, H. C., Schnur, J., Thorgeirsson, S. S. (1998) Dexamethasone inhibites the proliferation of hepatocytes and cells but not bile duct cells in rat liver. Hepatol. 28: 423-9 57. Nash, T. (1953) The colorimetric estamination of formaldehyde by means of the hantsch reaction. Biochem. 55: 416-21. 58. Novikoff, P. M., Yam, A., Oikawa, I. (1996) Blast-like cell compartment in carcinogen-induced proliferating bile ductules. Am. J. Pathol. 148, 1473. 59. Peter, R., Böcker, R., Beaune, P. H., Iwasaki, M., Guengerich, F. P. and Yang, C. S. (1990) Hydroxylation of chlorzoxazone as a specific probe for human liver cytochrome P-450IIE1. Chem. Res. Toxicol. 3: 566-573. 60. Petersen, B. E., Bowen, W. C., Patrene, K. D., Mars, W. M., Sullivan, A. K., Murase, N., Boggs, S. S., Greenberger, J. S. and Goff, J. P. (1999) Bone marow as a Potential Source of Hepatic Ovalé Cells, Science, 284: 168-70. 61. Pollard-Knight, D., Read, C. A., Downes, M. J., Howard, L. A., Leadbetter, M. R., Pheby, S. A., McNaughton, E., Syms, A., Brady, M. A. (1990) Nonradioactive nucleic acid detection by enhanced chemiluminescence using probes directly labeled with horseradish peroxidase. Anal. Biochem. 185(1) 849. 62. Presta, M., Aletti, M. G., and Ragnotti, G. (1980). Decrease of the activity of the mixed function oxidase system in regenerating rat liver: an alternative explanation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 829-34. 63. Quattrochi, L. C., Yockey, C. B., Barwick, J. L. and Guzelian, P. S. (1997) Characterization of DNA-Binding Proteins Required for Glucocorticoid Induction of CYP3A23. Arch. Biochem. Biophys. 349:2 251-260. 64. Raymondjean, M., Cereghini, S. and Yaniv, M. (1988) Several distinct “CCAAT” box binding proteins coexists in eucaryotic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 757-761.

69

65. Reinke, L. A. and Moyer, M. J. (1985) p-Nitrophenol hydroxylation: a microsomal oxidation which is highly inducible by ethanol. Drug Metab. Dispos. 13: 548-552. 66. Reinke, L. A. and Moyer, M. J. (1985). A microsomal oxidation which is highly inducible by ethanol. Drug Metab. Disp. 13: 548-52. 67. Reyes, H., Reisz-Porszasz, S., and Hankinson, O. (1992) Identifikation of the Ah receptor nuclear translocator protein (Arnt) as a component of the DNA binding form of the Ah receptor. Science, 256: 1193-5. 68. Santini, R. P., Myrand, S., Elferink, C., Reiners, J. J. Jr. (2001) Regulation of Cyp1a1 induction by dioxin as a function of cell cycle phase. J. Pharmacol. Exp. Ther. 299(2): 718-28. 69. Sato, Y., Tsukada, K., Matsumoto, Y., Abo, T. (1993) Interferon gamma inhibites liver regeneration by stimulating major histocomparibility complex class II antigen expression by regenerating liver. Hepatol. 18: 340-6. 70. Satoh, M., Yamazaki, M. (1993) In vitro DNA synthesis of mouse hepatocytes stimulated by tumor necrosis factor is inhibited by glucocorticoids and prostaglandin D. J. Cellular. Physol. 157: 104-9. 71. Schaffner, F. (1991) Structural and Functional Aspects of Regeneration of Human Liver. Dig. Dis. Sci. 36: 1282-6. 72. Schlossberg, H., Zhang, Y., Dudus, L., Engelhardt, J. F. (1996) Expression of cfos and c-jun during hepatocellular remodelling following ischemia/reperfusion in mouse liver Hepatol. 23 (6): 1546-55. 73. Schoedel, K. A. and Tyndale, R. F. (2003) Induction of nicotine-metabolizing CYP2B1 by ethanol and ethanol-metabolizing CYP2E1 by nicotin: summary and implications. Biochem. Biophys. Acta. 1619, 283-290. 74. Shiota, G., Kawasaki, H., Nakamura, T., Schmidt, E. V. (1995) Downregulation of c-myc mRNA after completion of liver regeneration in transgenic mice expressing hepatocyte growth factor in liver. Mol. Pathol. Pharmacol. Res. Commun. 89(3): 259-68. 75. Solangi, K., Sacerdoti, D., Godman, A. I., Schwartzmann, M. L., Abraham, N. G and Levere, R. D. (1988) Differencial effects of partial hepatectomy on renal heme and cytochrome P450 metabolism. Am. J. Med. Sci. 296, 387-91.

70

76. Steer, C. J. Liver Regeneration. (1995) FASEB J. 9:1396-1400. 77. Sterling, K. and Bresnick, E. Oct-1 transcription factor is negative regulator of rat CYP1A1 expression via an octamer sequence in its negative regulatory element. (1996) Mol. Pharm. 49: 329-337. 78. Sueyoshi, T. and Negishi, M. (2001) Phenobarbital response elements of cytochrome P450 genes and nuclear receptors. An. Rew. Pharm. Toxic. 41: 123143. 79. Tamasi, V., Vereczkey, L., Falus, A., Monostory, K. (2003) Some aspects of interindividual variations in the metabolism of xenobiotics. Inflam. Res. 52: 322333. 80. Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350-4. 81. Trautwein, C., Rakemann, T., Obermayer-Straub, P., Niehof, M. and Manns, M. P. (1997). Differences in the regulation of cytochrome P450 family members during liver regeneration. J.Hepatol. 26: 48-54. 82. Ueda, A., Hamadeh, H. K., Webb, K. H., Yamamoto, Y, Sueyoshi, T., Afshari, C. A., Lehmann, J. M. and Negishi, M. (2002) Diverse roles of the nuclear orphan receptor CAR in regulating hepatic genes in response to phenobarbital. Mol. Pharmacol. 61: 1-6. 83. Ueno, T., Gonzalez, F. J. (1990) Transcriptional Control of Rat Hepatic CYP2E1 Gene. Mol. Cell. Biol. 4495-505. 84. Umeno, M., McBridge, O. W., Yang, C. S., Gelboin, H. V., Gonzales, F. J. (1988) Human ethanol-inducible P450IIE1: complete intron and exon sequences, chromosome mapping, and correlation of developmental expression with specific 5’ cytosine demethylation. J. Biol. Chem. 263: 4956-4962. 85. Van der Decken, A., and Hutlin, T. (1960). The enzymic composition of rat liver microsomes during liver regeneration. Exp. Cell Res. 19: 591-604. 86. van der Hoeven, T. A. and Coon, M. J. (1974) Preparation and properties of partially purified cytochrome P-450 and reduced nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate-cytochrome

P-450

microsomes. J. Biol. Chem. 249: 6302-10.

71

reductase

from

rabbit

liver

87. van’t Klooster G. A. E., Blaauboer B. J., Noordhoek J., van Miert A. S. J. A. M. (1993) Sulfadimidine metabolism in vitro: II. Comperative studies in cultured rat, goat, sheep and cattle hepatocytes. Biochem. Pharmacol. 46: 454-61. 88. Waxman, D. J., Ram, P. A., Pampori, N. A., and Shapiro, B. H. (1995) Growth hormone regulation of male specific rat liver P450s 2A2 and 3A2: induction by intermittent growth hormone pulses in male but not female rats rendered growth hormone deficient by neonatal monosodium glutamate. Mol. Pharmacol. 48: 790-797. 89. Whitelaw, M., Pongratz, I., Wilhelmsson, A., Gustafsson, J.-A and Poellinger, L. (1993) Ligand-dependent recruitment of the Arnt coregulator determines DNA recognation by the digoxin receptor. Mol. Cell. Biol.; 13: 2504-14. 90. Woodcroft, K. J. and Novak, R. F. (1998) Xenobiotic-enhanced expression of cytochromes P450 2E1 and 2B in primary cultured rat hepatocytes. Drug Metab. Dispos. 26: 372-378. 91. Wu, D., Ramin, S. A. and Cederbaum, A. I. (1997) Effect of pyridine on the expression of cytochrome P450 isozymes in primary rat hepatocyte culture. Mol. Cell. Biochem. 173: 103-111. 92. Yanagida, A, Sogawa, K, Yasumoto, K-I, and Fuji-Kurijama, Y. (1990). A novel cis-acting DNA element required for a high level of inducible expression of the rat P-450c gene. Mol. Cell. Biol. 10: 1470-5. 93. Yoshida, T., Arakaki, M., Kumakawa, J. and Kuroiwa, Y. (1984) An induction of heme oxygenase and its possible relation to the decrease of cytochrome P450 content during liver regeneration. J. Pharmacodyn. 7: 112-119. 94. Xie, W., Barwick, J. L., Simon, C. M., Pierce, A. M., Safe, S., Blumberg, B., Guzelian, P. S. and Evans, R. M. (2000) Reciprocal activation of xenobiotic response genes by nuclear receptors SXR/PXR and CAR. Genes and Development. 14: 3014-3023. 95. Xu, L., Li, A. P., Kaminski, D. L., Ruh, M. F. (2000) 2,3,7,8, Tetrachlorodibenzo-p-dioxin induction of cytochrome P4501A in cultured rat and human hepatocytes. Chemico-Biol Inter. 124: 173-189.

72

96. Zangar, R. C., Woodcroft, K. J., Kocarek, T. A. and Novak, R. F. (1995) Xenobiotic-enhanced expression of cytochrome P450 2E1 and 2B1/2B2 in primary cultured rat hepatocytes. Drug Metab. Dispos. 23: 681-687. 97. Zelko, I. and Negishi, M. Phenobarbital-Elicited Activation of Nuclear Receptor CAR in Induction of Cytochrome P450 Genes. (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 1-6. 98. Zhukov, A., Ingelman-Sundberg, M., (1999) Relationship between cytochrome P450 catalytic cycling and stability: fast degradation of ethanol-inducible cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) in hepatoma cells is abolished by inactivation of its electron donor NADPH-cytochrome P450 reductase. Biochem. J. 340: 453-458.

73

9. Összefoglaló

Kísérleteinben a CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimek alap aktivitását, fehérjemennyiségét és indukálhatóságát vizsgáltuk a májregeneráció során. In vivo vizsgálataink alapján elmondhatjuk, hogy a fenti P450 enzimek aktivitása és fehérjemennyisége lecsökkent a partiális hepatectomiát követően. A csökkenés mértéke és ideje minden enzim esetében különböző volt. Dexametazon kezelés mérsékelte a regeneráció hatására bekövetkező P450 enzim aktivitás változásokat. In vitro kísérleteink során a CYP1A, CYP2E1 és CYP3A enzimek indukálhatóságát vizsgáltuk. Mivel a CYP2E1 enzim indukciójának sejtkultúrából történő mérésére igazán megfelelő módszer nem volt, ezért egy új mérési módszert állítottunk be. Regenerálódó májból izolált sejteken vizsgáltuk az enzimek indukálhatóságát. In vitro kísérleteink azt bizonyítják, hogy a vizsgált P450 enzimek indukálhatósága megmarad a regenerálódó májból származó sejtekben. 3-Metilkolantrénnel kezelt, 3 napig regenerálódó májból származó sejtekben a CYP1A enzim indukciójának mértéke mind aktivitás, mind fehérje szinten 3-szor nagyobb volt, mint az indukált, áloperált sejtekben. A CYP2E1 enzim indukálhatósága (imidazollal) nem változott a regenerálódó májból izolált sejtekben. A CYP3A enzim dexametazon indukciójának mértéke szintén nagyobb volt (2-2.5x) a regenerálódó májból preparált hepatocytákban, mint az áloperált, állatokból származó, indukált sejtekben.

74

10. Summary

The aim of our study was to investigate the basal activities and protein levels and inducibility of CYP1A, CYP2B, CYP2E1 and CYP3A enzymes during liver regeneration. From our in vivo studies it could be concluded that the activities and protein levels of the enzymes mentioned above decreased after partial hepatectomy. Dexamethasone treatment moderated the changes caused by liver regeneration. In in vitro studies we measured the inducibility of CYP1A, CYP2B, CYP2E1 and CYP3A enzymes. For measuring the inducibility of CYP2E1 from liver cell culture, the method of chlorzoxazone 6-hydroxylase assay in microsomes was adapted for monitoring CYP2E1 activity in hepatocyte culture. In hepatocytes, isolated from regenerating liver, the activities and protein levels of CYP1A, CYP2E1 and CYP3A were investigated. Our in vitro studies proved that the inducibility of some P450 enzymes changed during regeneration. The inducibility of 3methylcolantrene treated cells isolated from 3-day long regenerating liver was 3 times higher, than in hepatocytes from sham operated animals. In our experiments, the inducibility of CYP2E1 in imidazole treated hepatocytes, isolated from regenerating liver was the same as in imidazole treated cells from sham operated animals. The inducibility of CYP3A also change in cells from regenerating liver, it was 2-2.5 times higher in dexamethasone treated cells than in normal ones.

75

11. Mellékletek 11.1 Az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Tamási, V., Kiss, Á., Dobozy, O., Falus, A., Vereczkey, L. and Monostory, K. (2001) The effect of dexamethasone on P450 activities in regenerating rat liver. Biochem Biophys Res Commun. 286(2):239-42.

2. Tamási, V., Hazai, E., Porsmyr-Palmertz, M., Ingelman-Sundberg, M., Vereczkey, L.,

Monostory,

K.

(2003)

GYKI-47261,

a

new

AMPA

[2-amino-3-(3-

hydroxymethylisoxazole-4-yl)propionic acid] antagonist, is a CYP2E1 inducer. Drug Metab Dispos. 31(11):1310-4.

3. Tamási, V., Riedl, Zs., Dobozy, O., Falus, A., Vereczkey, L. and Monostory, K. (2004) In vitro induction of cytochrome P450 enzymes in hepatocytes isolated from regenerating rat liver. Pol. J.Pharmacol. (nyomtatás alatt)

11.2 Az értekezés témájához kapcsolódó poszterek 1) Kiss, Á, Tamási, V., Falus, A., Monostory, K. and Vereczkey, L.: Investigation of cytochrome P450 enzimes during liver regeneration. 7th European ISSX Meeting (Budapest, Aug. 22-26, 1999) ibid. ISSX Proceedings 14. 51.

2) Tamási, V., Monostory, K., Vereczkey, L., Kiss, Á., és Falus, A.: Citokróm P450 enzimaktivitás változások a májregeneráció során. Tox 2000- Magyar Toxikológiai Társaság Kongresszusa (Balatonkenese, Okt. 19-21, 2000) P3.1.

3) Tamási, V., Dobozy, O., Falus, A., Vereczkey, L. and Monostory, K.: The effect of dexamethasone on P450 activities in regenerating rat liver. The 6th International ISSX Meeting (München, Okt. 7-11, 2001) Drug Metabolism Reviews 33. (Suppl) 1. 152.

76

4) Vereczkey, L., Tamási, V. and Monostory, K.: In vitro induction of CYP2E1 in rat and human hepatocytes. The 6th International ISSX Meeting (München, Okt. 7-11, 2001) Drug Metabolism Reviews 33. (Suppl) 1. 152.

5) Tamási, V., Dobozy, O., Falus, A., Vereczkey, L. és Monostory, K.: Citokróm P450 enzimek in vitro indukciója sejtkultúrában. X. Sejt- és Fejlődésbiológiai napok (Siófok, Márc. 27-29, 2002) P31.

(6) Tamási, V., Vereczkey, L., Hazai, E., és Monostory, K.: In vitro induction of CYP2E1 in rat and human hepatocytes. 14th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations (MDM2002) (Sapporo, Japán, Júl. 22-26, 2002) P26-C46.

(7) Monostory, K., Tamási, V., és Vereczkey, L.: In vitro induction of cytochrome P450 enzymes in hepatocytes isolated from regenerating liver. 14th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations (MDM2002) (Sapporo, Japán, Júl. 22-26, 2002) P26-C46.

11.3 Az értekezés témájához kapcsolódó előadások 1) Tamási, V., Monostory, K., Vereczkey, L., Kiss, Á., és Falus, A.: Citokróm P450 enzimaktivitás

változások

a

májregeneráció

során.

Farmakokinetika

és

Gyógyszermetabolizmus Szimpózium (Mátraháza, Ápr 28-29, 2000) ibid. Abs. p 42.

2) Tamási, V., Monostory, K., Kiss, Á., Vereczkey, L., és Falus, A.: Citokróm P450 enzimaktivitások a májregeneráció során. 2000, Magyar Biokémiai Társaság Molekuláris Biológia szekciójának V. Munkaértekezlete (Sopron, Máj. 8-11, 2000) GE3.

3) Tamási, V., és Monostory, K.: Citokróm P450 enzimek és a májregeneráció kapcsolata. III.PhD Iskola (Mátraháza, Ápr. 10-12, 2000).

77

4) Tamási, V., Kiss, Á., Falus, A., Monostory, K., és Vereczkey, L.: Citokróm P450 enzimek változása a májregeneráció során. VIII. Sejt- és Fejlődésbiológiai napok (Pécs, Jan 17-19, 2000) E21.

5) Tamási, V., és Monostory, K.: CYP2E1 enzim indukciója májsejtkultúrában. IV. PhD iskola (Mátraháza, Ápr. 22-24, 2001).

6) Tamási, V., Hazai, E., Vereczkey, L., és Monostory, K.: CYP2E1 enzim indukciójának vizsgálata humán és patkány májsejtkultúrában. Tox 2001- Magyar Toxikológiai Társaság Kongresszusa (Eger, Okt. 25-27, 2001) S1-3.

7) Tamási, V., Hazai, E., Monostory, K., és Vereczkey, L.: CYP2E1 enzim indukciója májsejtkultúrában.

Farmakokinetika

és

Gyógyszermetabolizmus

Szimpózium

(Mátraháza, Ápr. 4-6, 2002) ibid. Abs. E-8.

8) Vereczkey, L., Tamási, V., és Monostory, K.: P450 gének polimorfizmusa és expressziója. Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szimpózium (Mátraháza, Ápr. 4-6, 2002) ibid. Abs. P-13.

78

12. Különlenyomatok

79