Tabel 1. Daftar Sampel dan Metode Ekstraksi/Sampling yang digunakan No.
Kode
Sampel Daun Eucalyptus (terinfeksi Mycosphaerella sp.) Daun Eucalyptus (terinfeksi Mycosphaerella sp.) Daun Eucalyptus (terinfeksi Mycosphaerella sp.)
Metode Ekstraksi DNA Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi
1
Euc A1
2
Euc A2
3
Euc A3
4
Euc B1
Daun Eucalyptus (terinfeksi A. eucalypti )
5
Euc B2
Daun Eucalyptus (terinfeksi A. eucalypti )
6
Euc B3
Daun Eucalyptus (terinfeksi A. eucalypti )
7
Sb1
Jamur karat (U. betae) pada B. vulgaris
8
Sb2
9
Gr1
10
Gr2
Jamur karat (U. betae) pada B. vulgaris Jamur karat daun rumput (A.elatius var. bulbosum) Jamur karat daun rumput (A.elatius var. bulbosum)
11
Pn1
Daun Pinus
12
Pn2
Daun Pinus
13
Ro1
Akar E. nitens
14
Ro2
15
Kk1
16
Kk2
Akar E. nitens Miselium dari bag. bawah kulit kayu pohon Miselium dari bag. bawah kulit kayu pohon
A
Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun kering digerus dalam buffer ekstraksi diteteskan pada kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk Akar digerus dalam buffer ekstraksi diteteskan pada kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk Miselia ditekan kuat-kuat di kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk
B
C
Gambar 1. A. Daun Eucalyptus globulus dengan bintik-bintik karakteristik Mycosphaerella sp. B. Daun Eucalyptus obliqua yang terinfeksi Aulographina eucalypti C. Daun Beta vulgaris (silverbeet) terinfeksi dengan Uromyces betae
A
B
Gambar 2 A. Akar Eucalyptus nitens memperlihatkan miselium warna putih karena infeksi Armillaria sp. B. Kulit kayu yang terinfeksi Armillaria luteobubalina
Tabel 2. Proporsi hasil PCR positif menggunakan primer spesifik jamur (F) dan primer general (G). Kode
EucA EucB Sb Gr Pn Ro Kk 1
Sampel material
Daun Eucalyptus (terinfeksi Mycosphaerella sp.) Daun Eucalyptus (terinfeksi Aulographina eucalypti ) Jamur karat (U. betae) pada B. vulgaris Jamur karat (undet.) daun rumput (A.elatius var. bulbosum) Daun Pinus Akar E. nitens Miselium dari bag. bawah kulit kayu
TD berarti tidak dilakukan.
Jumlah Sampel
Kartu FTA
Kartu FTA + Buffer Ekstraksi
Glassmilk
F
G
F
G
F
G
3
3/3
2/2
2/3
2/2
3/3
2/2
3
3/3
2/2
2/3
1/2
2/3
1/2
2
2/2
2/2
TD1
TD
2/2
2/2
2
2/2
2/2
TD
TD
2/2
2/2
2 2
TD TD
TD TD
1/2 1/2
1/2 1/2
1/2 1/2
1/2 2/2
2
2/2
2/2
TD
TD
2/2
2/2
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
16 17 18 19
Gambar 3. Amplifikasi PCR dari salah satu ulangan menggunakan primer ITS1F/4. Kiri ke kanan: 1. DNA size marker; 2. Euc A1; 3. Euc A2; 4. Euc A3; 5. Euc B1; 6. Euc B2; 7. Euc B3; 8. Sb1; 9. Sb2; 10. Gr1; 11. Gr2; 12. Pn1; 13. Pn2; 14. Ro1; 15. Ro2; 16. Kk1; 17. Kk2, 18. Positif kontrol; 19. Negatif kontrol.
Tabel 3. Keseluruhan hasil amplifikasi sampel menggunakan primer ITS1F/4 dan ITS3/4 Sampel Kode Euc A1 Euc A2 Euc A3 Euc B1 Euc B2 Euc B3 Sb1 Sb2 Gr1 Gr2
1
Detil Daun Eucalyptus (terinfeksi Mycosphaerella sp.) Daun Eucalyptus (terinfeksi Mycosphaerella sp.) Daun Eucalyptus (terinfeksi Mycosphaerella sp.) Daun Eucalyptus (terinfeksi Aulographina eucalypti ) Daun Eucalyptus (terinfeksi Aulographina eucalypti ) Daun Eucalyptus (terinfeksi Aulographina eucalypti ) Jamur karat (U. betae) pada B. vulgaris Jamur karat (U. betae) pada B. vulgaris Jamur karat daun rumput (A.elatius var. bulbosum) Jamur karat daun rumput (A.elatius var. bulbosum)
Pn1
Daun Pinus
Pn2
Daun Pinus
Ro1
Akar E. nitens
Ro2
Akar E. nitens
Kk1
Miselium dari bag. bawah kulit
Kk2
Miselium dari bag. bawah kulit kayu
Metode Ekstraksi DNA Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun kering digerus dalam buffer ekstraksi diteteskan pada kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk Daun kering digerus dalam buffer ekstraksi diteteskan pada kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk Miselia ditekan kuat-kuat di kartu FTA Ekstraksi DNA metode glassmilk
Hasil PCR1 ITS1 ITS3 /ITS4 / ITS4 1 2 3 1 2 P
P
P
P
P
N
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
N
P
N
N
P
P
P
N
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
N
N
P
N
P
N
N
P
N
P
N
N
P
N
P
N
P
N
P
P
P
P
N
P
P
P
P
P
P
P
P mengindikasikan amplifikasi fragmen pada ± 500 – 600 bp untuk primer ITS1F/4 dan ± 300 bp untuk primer ITS3/4; N mengindikasikan tidak adanya amplifikasi fragmen.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
15 16
17 18 19
Gambar 4. Amplifikasi PCR dari salah satu ulangan menggunakan primer ITS3/4. Kiri ke kanan: 1. DNA size marker; 2. Euc A1; 3. Euc A2; 4. Euc A3; 5. Euc B1; 6. Euc B2; 7. Euc B3; 8. Sb1; 9. Sb2; 10. Gr1; 11. Gr2; 12. Pn1; 13. Pn2; 14. Ro1; 15. Ro2; 16. Kk1; 17. Kk2, 18. Positif kontrol; 19. Negatif kontrol.
1
2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Gambar 5. Amplifikasi dari nested PCR menggunakan primer McrypF/McrypR pada sampel daun Eucalyptus di kartu FTA. Kiri ke kanan: 1. DNA marker; 2. Euc A1.1; 3. Euc A1.2; 4. Euc A1.3; 5. Euc A2.1; 6. Euc A2.2; 7. Euc A2.3; 8. Euc A3.1; 9. Euc A3.2; 10. Euc A3.3; 11. Euc B1.1; 12. Euc B1.2; 13. Euc B1.3; 14. Euc B2.1; 15. Euc B2.2; 16. Euc B2.3; 17. Euc B3.1; 18. Euc B3.2; 19. Euc B3.3; 20. Positif kontrol (DNA dari isolat murni M. cryptica).
Tabel 4. Daftar sampel daun Eucalyptus untuk nested PCR Hasil PCR* Kode
Deskripsi
Metode ekstraksi DNA
McrypF/ McrypR
MnubF/ MnubR
Euc A1.1
Daun Eucalyptus A
Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA
N
N
Euc A1.2
Daun Eucalyptus A
Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi
N
N
Euc A1.3
Daun Eucalyptus A
Ekstraksi DNA metode glassmilk
N
N
Euc A2.1
Daun Eucalyptus A
Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA
N
N
Euc A2.2
Daun Eucalyptus A
Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi
N
N
Euc A2.3
Daun Eucalyptus A
Ekstraksi DNA metode glassmilk
N
N
Euc A3.1
Daun Eucalyptus A
Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA
P
N
Euc A3.2
Daun Eucalyptus A
Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi
N
N
Euc A3.3
Daun Eucalyptus A
Ekstraksi DNA metode glassmilk
N
N
Euc B1.1
Daun Eucalyptus B
Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA
P
N
Euc B1.2
Daun Eucalyptus B
Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi
N
N
Euc B1.3
Daun Eucalyptus B
Ekstraksi DNA metode glassmilk
N
N
Euc B2.1
Daun Eucalyptus B
Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA
P
N
Euc B2.2
Daun Eucalyptus B
Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi
P
N
Euc B2.3
Daun Eucalyptus B
Ekstraksi DNA metode glassmilk
N
N
Euc B3.1
Daun Eucalyptus B
Daun ditekan kuat-kuat pada kartu FTA
P
N
Euc B3.2
Daun Eucalyptus B
Daun digerus dicampur dengan buffer ekstraksi
P
N
Euc B3.3
Daun Eucalyptus B
Ekstraksi DNA metode glassmilk
N
N
DNA tersedia
P
NT
DNA tersedia
NT
P
T2 T5
Mycosphaerella cryptica Mycosphaerella nubilosa
* P mengindikasikan amplifikasi fragmen pada ± 500 – 600 bp untuk primer McrypF/ McrypR dan primer MnubF/ MnubR. N mengindikasikan tidak adanya amplifikasi fragmen.
