RÉZ- ÉS MANGÁNTARTALMÚ KOMPLEXEK ENZIMUTÁNZÓ TULAJDONSÁGAINAK VIZSGÁLATA

PANNON EGYETEM

RÉZ- ÉS MANGÁNTARTALMÚ KOMPLEXEK ENZIMUTÁNZÓ TULAJDONSÁGAINAK VIZSGÁLATA DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

Készítette: CSONKA RÓBERT okleveles vegyész

Témavezető: Dr. SPEIER GÁBOR egyetemi tanár

PANNON EGYETEM KÉMIAI ÉS KÖRNYEZETTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA VESZPRÉM 2010

RÉZ- ÉS MANGÁNTARTALMÚ KOMPLEXEK ENZIMUTÁNZÓ TULAJDONSÁGAINAK VIZSGÁLATA Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Csonka Róbert Készült a Pannon Egyetem Kémiai és Környezettudományi Doktori Iskolájának keretében.

Témavetető: Dr. Speier Gábor Elfogadásra javaslom (igen/nem) ................................................ (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton ........... %-ot ért el. Veszprém, .......................................... ................................................ Szigorlati Bizottság elnöke Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: ..........................................

igen/nem ................................................ (aláírás)

Bíráló neve: ..........................................

igen/nem ................................................ (aláírás)

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján ........... %-ot ért el. Veszprém, .......................................... ................................................ Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése: ...................... ................................................ EDT elnöke

KIVONAT

Réz- és mangántartalmú komplexek enzimutánzó tulajdonságainak vizsgálata Készítette: Csonka Róbert A szervezetünkben lejátszódó biokémiai folyamatok pontos mechanizmusának megértése, a metalloenzimek megismerése napjaink gyógyszerkémiai alapkutatásainak tárgya. A bioszervetlen kémia tudományág különböző szerkezeti, és funkcionális enzimmodell-rendszerek kidolgozásával kínál lehetőséget ismereteink bővítésére ebben a témakörben. A biokatalizátorok egyik nagy és jelentős csoportját képezik az oxidoreduktázok, amelyek néhány képviselője a fenoxazinon szintetáz, a pirokatechin oxidáz és dioxigenáz, a metán-monooxigenáz és a kataláz. Ezek az enzimek rezet, mangánt és vasat használnak katalitikus folyamataik kivitelezéséhez. Mechanizmusuk felderítése érdekében részletes reakciókinetikai vizsgálatokat végeztünk olyan réz- és mangántartalmú komplexekkel, amelyek képesek voltak a megfelelő enzim funkcionális modellezésére. Az előállított vegyületek közül a [Cu2(bpy)2(phga)4], a [Cu4(bnac)4(µ-EtO)4], a [Cu(bpy)(ox)]n és a [Cu(bpy)(bma)H2O]n

összetételű

komplexek

esetén

röntgendiffrakciós

szerkezet-

meghatározásra alkalmas egykristályokat is nyertünk. A többi esetben spektroszkópiai módszerekkel (UV-Vis, IR, ESR, AAS) határoztuk meg a lehetséges formációt. Az elvégezett kísérletsorozatok eredményeképpen kiszámítottuk a kinetikai paramétereket, majd javaslatokat tettünk a lehetséges reakciómechanizmusokra.

ABSTRACT

Investigating the enzyme mimicking properties of copper and manganese complexes By Róbert Csonka

Understanding metalloenzymes and the exact mechanism of several biochemical processes enacted in the human body is the subject of recent pharmacological research. The methods of bioinorganic chemistry give us the opportunity to widen our scientific horizon by developing structural and functional enzyme model systems. One populous group of the most important biocatalysts is the oxidoreductases. Some of their representatives are the phenoxazinone synthase, catechol oxidase, catechol dioxygenase, methane-monooxygenase and catalase. These enzymes use copper, iron and manganese as the key factors of their catalytic processes. Detailed studies in reaction kinetics were carried out with copper and manganese containing complexes that were able to functionally mimic the corresponding enzyme. From the complexes studied, four of them [Cu2(bpy)2(phga)4], [Cu4(bnac)4(µ-EtO)4], [Cu(bpy)(ox)]n and [Cu(bpy)(bma)H2O]n were structurally resolved by X-ray analysis. The remaining complexes were characterized by spectroscopic methods (UV-Vis, IR, ESR, AAS). As a result of our investigation we determined the kinetic parameters and we made suggestions for plausible reaction mechanisms.

ZUSAMMENFASSUNG

Untersuchungen einiger Kupfer- und Mangankomplexe als Enzymmodelle Von Róbert Csonka

Das Verständnis von Metallenzymen als auch die Aufklärung des genauen Mechanismus verschiedener biochemischer Prozesse im menschlichen Körper sind Gegenstand

der

modernen

pharmakologischen

Forschung.

Die

Methoden

der

bioanorganischen Chemie erweitern unseren wissenschaftlichen Horizont durch die Entwicklung struktureller und funktioneller Modellsysteme zur Beschreibung der Wirkung von Enzymen. Eine umfangreiche Gruppe wichtiger Biokatalysatoren bilden die Oxidoreduktasen. Einige Vertreter dieser Gruppe sind Phenoxazinonsynthase, Brenzcatechin-Oxydase, Brenzcatechin-Dioxygenase, Methan-monooxygenase und Katalase. In diesen Enzymen bilden Kupfer, Eisen und Mangan die Schlüsselelemente für die jeweiligen katalytischen Prozesse. In dieser Arbeit wurden ausführliche Studien über die Reaktionskinetik von Kupfer- und Mangan enthaltenden Komplexe durchgeführt. Diese Komplexe sind in der Lage, die Rolle des korrespondierenden Enzyms nachzuahnen. Die Struktur von vier der untersuchten Komplexe, [Cu2(bpy)2(phga)4], [Cu4(bnac)4(µ-EtO)4], [Cu(bpy)(ox)]n und [Cu(bpy)(bma)H2O]n wurden durch Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt. Die übrigen Komplexe wurden mithilfe spektroskopischer Methoden (UV-Vis, IR, ESR, AAS) charakterisiert. Als Ergebnis unserer Untersuchungen wurden die kinetischen Parameter bestimmt, Vorschläge für plausible Reaktionsmechanismen gemacht.

A DOLGOZATBAN ELŐFORDULÓ RÖVIDÍTÉSEK PHS

fenoxazinon szintetáz

CO

pirokatechin oxidáz

PTU

fenil-tiourea

CTD

pirokatechin dioxigenáz

NAD+

nikotinamid-adenin-dinukleotid kation

acac

acetil-aceton

bpy

2,2’-bipiridin

TEMPO

2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinil-oxil

OAP

orto-amino-fenol vagy 2-amino-fenol

APX

2-amino-3H-fenoxazin-3-on

PDA

orto-fenilén-diamin

DAP

2,3-diamino-fenazin

BQMI

benzokinon-monoimin

DBCatH2

3,5-di-terc-butil-pirokatechint

DBQ

3,5-di-terc-butil-o-benzokinon

flaH

3-hidroxiflavon vagy flavonol

bnacH

benzoil-aceton

Cl4CatH2

3,4,5,6-tetra-kloro-pirokatechin

oxH2

oxálsav

baH

benzoesav

phgaH

fenil-glioxilsav

bmaH2

2-terc-butil-maleinsav

NEt3

trietil-amin

6’-MeIndH

1,3-bisz(6’-metil-2’-piridil-imino)-izoindolin

6’-Me2PAP

1,4-di-(6’-metil-2’-piridil)-aminoftalazin

Szeretném kifejezni köszönetemet témavezetőmnek, Dr. Speier Gábor egyetemi tanár úrnak, valamint Dr. Kaizer Józsefnek az elmúlt évek során nyújtott segítségükért, megállíthatatlanul özönlő szakmai tanácsaikért. Köszönöm továbbá kutatócsoportunk minden tagjának ösztönzését, segítőkészségét, közülük is Dr. Pap Józsefnek a kezdeti nehézségekben nyújtott segítő jobbért. Mindennél jobban köszönöm családom végtelen bíztatását és bizalmát. Veszprém, 2010

Csonka Róbert

TARTALOMJEGYZÉK BEVEZETÉS .................................................................................................... 1 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ......................................................................... 3 1.1. A biokatalizátorok és az anyagcsere-folyamatok .................................................................... 3 1.2. Metalloenzimek és modelljeik ................................................................................................ 4 1.2.1. A fenoxazinon szintetáz enzim (PHS – EC 1.10.3.4) és modelljei .................................. 7 1.2.2. A pirokatechin oxidáz enzim (CO – EC 1.10.3.1) és modelljei ..................................... 10 1.2.3. A pirokatechin dioxigenázok és modelljeik ................................................................... 15 1.2.4. A metán-monooxigenáz enzim (MMO -- EC 1.14.13.25) ............................................. 20 1.2.5. A kataláz enzim (EC 1.11.1.6) ....................................................................................... 25

2. CÉLKITŰZÉSEK ....................................................................................... 33 3. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ...................................................... 36 3.1. PHS enzimmodellek .............................................................................................................. 36 3.1.1. A PHS enzim működési modelljei TEMPO szabadgyökkel ......................................... 36 3.1.2. A PHS enzim modellezése mangántartalmú komplexszel ............................................ 44 3.2. A pirokatechin oxidáz (CO) enzim modelljei ....................................................................... 49 3.2.1. A Cu4(bnac)4(µ-EtO)4 előállítása, szerkezete és katalitikus hatása a di-terc-butilpirokatechin oxidációjára ........................................................................................................ 50 3.2.2. A Mn2(6’Me2PAP)2Cl4 előállítása, szerkezete és katalitikus hatása a di-terc-butilpirokatechin oxidációjára ........................................................................................................ 60 3.3. A Cu(I)-(bpy)-(DBCat) rendszer. Pirokatechin dioxigenáz, vagy pMMO modell? ............. 65 3.4. Kataláz enzimmodellek ......................................................................................................... 77 3.4.1. A Cu2(bpy)2(phga)4 előállítása, szerkezete, katalitikus hatása a H2O2 dizmutációjára ..77 3.4.2. A prolintartalmú [Mn2L(OAc)(H2O)2](H2O)2 előállítása, és katalitikus hatása a H2O2 dizmutációjára ......................................................................................................................... 83

4. KÍSÉRLETI RÉSZ ...................................................................................... 88 5. ÖSSZEFOGLALÁS .................................................................................... 94 IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................. 97

Bevezetés

BEVEZETÉS

Környezetszennyezés, betegségek, túlnépesedés, élelmezési problémák, és még lehetne sorolni a XXI. századba lépő emberre váró gondokat, amikre megoldást kell találnia. Szinte megszámlálhatatlan az egészségre káros anyagok száma, amit különféle nagyüzemek a levegőbe, földbe és vizeinkbe juttatnak. Modern, civilizációs betegségek alakulnak ki, amik ellen védekezni próbálunk, de egyre csak újabbakkal találjuk szembe magunkat. Minél jobban átalakítjuk környezetünket, annál jobban alakulnunk kell hozzá. Ez első olvasásra talán paradoxonnak tűnik, de csupán annyit jelent, hogy tanuljunk a természettől. Az élő szervezetek védekező rendszerében is a dinamikusságon van a hangsúly. Ilyen, és hasonló elven működő rendszerek kifejlesztése az irányelv a természettudományok legtöbb ágában. Divatos kifejezéssel élve a „zöld kémia” kell, hogy irányvonalat adjon a kor kémiai kutatóinak. A biológiai, biokémiai reakciók pontosabb megismerésével és alkalmazásával nem csak a hulladékok környezetkímélő lebontását oldhatjuk meg, hanem tisztább, hatékonyabb gyógyszereket is előállíthatunk. Ilyen, és még számtalan más hasonló lehetőség rejlik az enzimek kémiájában. Az élő szervezetekben lezajló biokémiai folyamatok többsége összetett, gyors konszekutív reakciók sorozata. A reakciók sebességét és specifikusságát az enzimek alakítják. Az emberi test harmonikusan működő összetett rendszer. Működése közben fellépő problémák, zavarok eredményeként betegségek alakulnak ki, és ez sok esetben éppen a biokatalizátorok hiányos, vagy túlműködésének következménye. Felépítésüket tekintve az enzimek nagy része fehérjéken kívül fémet is tartalmazhat. Ez alakítja ki az ún. aktív centrumot – a metalloenzimek esetében a fém és a koordinációs övezete –, ami teljes mértékben meghatározza az enzim specifikusságát. Működési mechanizmusuk részleteinek tisztázásához azonban összetett – nem csupán egy tudományágat magába foglaló – vizsgálatsorozatra van szükség. Az analitikai technikák, mint például a röntgendiffrakció, ICP, AAS fejlődése, valamint az elektromikroszkópok felbontásának javulása nagyobb betekintést engedett az anyagok pontos szerkezetébe. A biológiai ismeretek fontossága a testben lezajló enzimreakciókról és azok körülményeiről, célzott viselkedésükről elengedhetetlen mindenféle gyógyászattal kapcsolatos tevékenységhez, kutatáshoz. Az egyes folyamatok pontos megértéséhez azonban többre van szükség. Így alakulhatott ki évtizedekkel ezelőtt egy új, interdiszciplináris tudományterület, a bioszervetlen vagy biokoordinációs kémia. 1

Bevezetés Az enzimek nagy méretük és összetettségük révén nehezen kezelhető vegyületek. Tisztításuk,

izolálásuk

nem

kevésbé

körülményes

munka.

Szerkezetüket,

vagy

funkciójukat alapul véve ún. bioutánzó vegyületeket hozhatunk létre, amelyek felépítésükben sokkal egyszerűbbek a megfelelő enzimnél. Enzimutánzó tulajdonságuk abból fakad, hogy azonos folyamatokat katalizálnak, azonban azt nagyságrendekkel kisebb hatásfokkal teszik. Mivel az elsődleges cél a folyamat lépésről-lépésre történő leírása, így az utóbbi jellemző kulcsfontosságú, hiszen a lassú reakciók jobban nyomonkövethetőek. A modellvegyületek reakcióinak pontos feltérképezésével tehát, egy lépéssel közelebb kerülhetünk a valós enzimmechanizmusok megértéséhez. Az enzimek egyik nagy és jelentős csoportját képezik az oxidoreduktázok, melyek reakcióiban elektron, vagy hidrogénatom transzfer történik a kölcsönhatásba lépő molekulák között. Alcsoportjai az oxigenázok és az oxidázok. Általunk vizsgált képviselőik a fenoxazinon szintetáz, a pirokatechin oxidáz és dioxigenáz, a metánmonooxigenáz és a kataláz enzimek. Ezek bemutatása, valamint funkciójuknak pontosabb megismerése modellvegyületeik leírásán, jellemzésén keresztül a jelen értekezés témája.

2

Irodalmi áttekintés

1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

1.1. A biokatalizátorok és az anyagcsere-folyamatok Változatosak, bonyolultak, szelektívek. Ez a három legfontosabb jellemző kifejezés, amivel az élőlények biokémiai folyamatait nagymértékben meghatározó katalizátorokat körül lehetne írni. Nélkülük a szervezetben az anyagátalakulások egyáltalán nem, vagy csak lassan játszódnának le. Feladatuk tehát a folyamatok aktiválási energiájának csökkentése. Molekulatömegük általában 1,2 × 104 – 5 × 105 Dalton között változhat. Felépítésüket tekintve az egyszerű fehérjék (apoenzimek) kizárólag αaminosavakból épülnek fel. Az összetett fehérjék (proteidek, holoenzimek) az alapvető aminosavak mellett nem fehérje jellegű részt is tartalmaznak. Többnyire ilyen részek alakítják ki az aktív centrumot. Azokat a molekulákat, amelyek átalakulásában az enzimek katalitikus szerepet töltenek be, szubsztrátumnak nevezzük. A szubsztrátum molekula általában kisebb molekulatömeggel rendelkezik – M < 103 Dalton – mint maga az enzim. Természetes

formában

általában

az

enzimek

inaktív

állapotban

vannak.

„Bekapcsolásukhoz” egy koenzim, vagy bármilyen más másodlagos faktor (pl. fémion) szükséges. Ez a folyamat az aktív centrumhoz méretben és funkcióban is hasonló, mégis jól elkülöníthető alloszterikus centrumon keresztül megy végbe. A kofaktor kapcsolata az enzimmel megváltoztatja a rendszer alakját, vagy éppen polaritását, utat engedve ezáltal a szubsztrátumnak a kapcsolódáshoz, majd átalakuláshoz. A körfolyamat az összes szubsztrátum termékké való alakulása után a kofaktor leválásával zárul. A kémiai reakcióktól eltérően az enzimkinetikában nem ütközésen alapuló, hanem adszorpciós kölcsönhatások dominálnak. A különböző molekulákat van der Waals, hidrogénhídkötések, és elektrosztatikus erők rögzítik az enzimfelülethez. A szubsztrátum változásával járó tényleges reakció természetesen kémiai jellegű [1]. A katalizált reakció szempontjából 6 fő csoportba lehet az enzimeket sorolni: 1.

Hidrolázok. Fehérjék peptidkötését, poliszacharidok glikozidkötését, vagy zsírok és foszfátok észterkötését hasítják hidrolízis reakciójuk katalízise révén.

3

Irodalmi áttekintés 2.

Oxidoreduktázok. Ezek az enzimek redoxireakciókat katalizálnak, melyek során elektronok, vagy hidrogénatom kerül át egyik molekuláról a másikra.

3.

Transzferázok. Egy meghatározott atomcsoport átvitelét katalizálják egyik molekuláról a másikra (pl. -CH3, -NH2, -COOH, stb.).

4.

Izomerázok. Ez az enzimcsoport különböző átrendeződéses reakciókat segít elő.

5.

Liázok. A szubsztrátum adott csoportját távolítják el nem hidrolitikus reakció során, vagyis eliminációs reakciókat katalizálnak.

6.

Ligázok. Két molekula összekapcsolását katalizálják. A kapcsolt atomok szerint vannak C-O, C-N és C-C kötést kapcsoló ligázok [2]. A dolgozat célja az oxidoreduktáz enzimcsalád néhány tagjának megismertetése.

Ezeken belül is a metalloenzimek bemutatása, ahol a fém nem kofaktorként szerepel, hanem az aktív centrum kulcsfontosságú elemeként szolgál. 1.2. Metalloenzimek és modelljeik Az enzimeknek ez a csoportja az összetett fehérjék (proteidek, holoenzimek) közé tartozik. Tagjainak a reakciósebesség-növelő képessége – mint ahogy a bevezetőben is már említésre került – egy kémiailag és fizikailag is jól elkülöníthető részükhöz kapcsolható: az aktív centrumhoz. Ennek az egységnek a meghatározó elemei a fémionok – leginkább vas, réz, cink, mangán – melyek képesek stabilis kelátkomplexek kialakítására. A fém-fehérje kapcsolatban a specifikusság és a kötött sztöchiometriai arány meghatározó tényezők. A fémionok említett tulajdonságain kívül, az azonosíthatóság szempontjából jelentőségüket megnöveli, hogy az általuk és a szubsztrátum által kialakított fém-protein kötések spektroszkópiai módszerekkel végzett vizsgálatokra alkalmasak. Kiemelkedő közülük is a rézion, amely az oxidáz és oxigenáz enzimek gyakori alkotóeleme (például citokróm-coxidáz). Szerepe van még vitaminok, szteroidok, aminosavak bioszintézisében és metabolizmusában is. Nyomelemként a legtöbb élőlény számára létfontosságú. A vas biokémiai

szerepéhez

hasonlóan

bizonyos

élőlények

oxigén

anyagcseréjének

nélkülözhetetlen résztvevője. Aktív centrumban való előfordulása szerint három típusa lehetséges:

4

Irodalmi áttekintés • Az első típusú „kék” réz(II)iont tartalmazó komplexek intenzív sávot adnak 600 nm-nél, és szokatlanul kicsi hiperfinom AII csatolási állandót mutatnak az ESR spektrumban. Nevüket arról a jellegzetességükről kapták, hogy a proteineket, amikben előfordulnak (pl. azurin, plasztocianin) kékre festik. A szín a ligandumfém töltésátvitelből adódik a cisztein kénatomjával történő koordinációja eredményeként. Szerkezeti felépítésüket trigonális piramis, bipiramis és torzult tetraéderes forma jellemzi. A trigonális alapot két hisztidin és egy cisztein molekula alakítja ki, az axiális ligandumok változatosak [3]. • A második típusú réz(II) a normális, vagy „nem kék” centrum. Ismertebb képviselőik a galaktóz oxidáz, az amin oxidáz és a Cu/Zn szuperoxid dizmutáz enzimek. Szerkezetükben a planáris és a tetragonális-piramis formák a kedvezményezettek. Abszorpciójuk a látható tartományban gyenge (ε = 100-1000 M-1 cm-1), ESR spektrumuk éppen csak megfigyelhető, a hiperfinom csatolási állandó 150 Gauss körüli [3, 4]. • A harmadik típus antiferromágnesesen csatolt binukleáris centrummal rendelkezik [5], ezért ESR-ben inaktívak. Tirozináz, pirokatechin oxidáz és hemocianin enzimek jellemző alkotóeleme. Intenzív abszorpciós sávot adnak 330 nm körül az UV-látható spektrumban. Oxidált állapotban [Cu(II)-Cu(II)] a réz 3-3 hisztidinhez koordinálódva található meg bennük trigonális piramis szerkezetet alakítva. A két fém között gyakran µ-hidroxo, vagy aktív állapotban peroxo híd (O22-) alakul ki µ-η2:η2 formában. Az utóbbi enzimfajták többek között aromás vegyületek oxidatív lebontását végzik, gyakran vas ionokkal együtt. A reakciómechanizmusok kialakításához és megértéséhez szükséges az az ismeret, hogy a fémion a metalloenzimekben belső feszültséget (entatikus állapot) alakít ki – hat az enzim elektronszerkezetére és sztereokémiájára –, így reakcióképessé teszi azt. Ilyen módon akár a fém oxidációs száma is megváltozhat. Gyakori példa erre a réz(I) oxidációja réz(II)ionná. A reakció egyik magyarázata a réz(II) esetén kialakuló stabilisabb geometriai szerkezet (síknégyzetes, de inkább torzult oktaéderes

forma)

kialakulása.

Itt

rögtön

meg

is

említhető

a

réz(II)ionok

elektronszállításban, valamint elektronátvitelben betöltött fontos szerepe. Ez a tulajdonság közvetetten alakítja az enzim reakcióját dioxigénnel a következő séma szerint (1. ábra).

5

Irodalmi áttekintés AH2

Cu(II)-fehérje

H2O

A

Cu(I)-fehérje

1/2 O2

1. ábra Az AH2-szubsztrátum redukálja a fémet, ami dioxigénnel újra oxidálható. Ehhez szükséges az elektronátvivő szerepe. Ilyen módon lehetőség nyílik az oxidációs folyamatban felszabaduló energia szétosztására, és ezáltal energiadús vegyületek képződésére. A molekuláris oxigén (EN= 3,5) köztudottan erős oxidálószer. Ennek, és a fémion elektronátadó képességének köszönhetően biológiailag a dioxigén megkötése, szállítása legtöbbször MO2 szuperoxo-, (1) vagy M2O2 peroxokomplexek (2) formájában történik. Sok esetben nem dönthető el biztosan a fémion oxidációs állapota, azonban oxidációs foka nő, miközben a dioxigén redukálódik.

M + O2

MO2

2M + O2

M2O2

(M+O2- )

[(M+)2O22- ]

(1) (2)

Ilyen formában a dioxigén a metalloenzimek által, vagy közvetlenül is részt vehet a biológiai oxidációs folyamatokban. A metalloenzimek katalitikus hatása, valamint reakcióik, azok mechanizmusa a tudomány számára még nem minden esetben tisztázott terület. Nagy moláris tömegük és kis fémtartalmuk miatt kezelésük és spektroszkópiai jellemzőiknek vizsgálata nehéz és körülményes. Az egyszerűbb kezelhetőség érdekében a gyakorlatban modellvegyületek kialakításával próbálkoznak. Mivel ezek a vegyületek több szempontból hasonlítanak az eredeti enzimre, így bioutánzó rendszernek tekinthetők. Akár reakciókinetikai, akár szerkezeti vizsgálatuk jó közelítéssel ad információt a természetes enzimekről. Egy modellvegyület megválasztásánál az első feladat eldönteni, hogy milyen célnak feleljen meg, vagyis milyen szempontból hasonlítson a helyettesítendő enzimre. A két lehetséges forma:

6

Irodalmi áttekintés

FUNKCIONÁLIS

MODELLEK:

Céljuk a szelektivitás, aktivitás (enzimek esetén), vagy teljes működési mechanizmus helyettesítése, utánzása. A szerkezeti hasonlóság nem meghatározó szempont. A ligandum kiválasztása kizárólag a folyamat minőségének megtartása érdekében történik.

SZERKEZETI

MODELLEK:

Az aktív centrum térbeli felépítésének megismerését segíti elő a minta

és

a

modell

spektroszkópiai

adatainak

összehasonlításával. A ligandumok helyes megválasztásával egyre jobban lehet közelíteni, egy enzim szerkezetéhez. A leggyakoribb felmerülő probléma, hogy a szintetikus vegyületek gyakran túl stabilisak. Ez hátrány katalitikus funkciók ellátásánál és lebomlási folyamatok során is.

1.2.1. A fenoxazinon szintetáz enzim (PHS – EC 1.10.3.4) és modelljei A multiréz-oxidáz enzimcsoport tagjai közül a lakkáz, az aszkorbát oxidáz és a ceruloplazmin enzimek a leggyakrabban kutatottak. A fenoxazinon szintetáz enzimre (vagy

o-amino-fenol oxidáz) azért terelődött a kutatók figyelme, mert a gyógyszeripar egy fontos készítményének az aktinomycin D bioszintézisének az utolsó lépésében van szerepe. Ez az egyik legrégebben alkalmazott tumorellenes kemoterápiás szer például a choriocarcinoma, a Wilm’s tumor és a rhabdomyosarcoma kezeléséhez, ráadásul gyulladáscsökkentő hatása is ismeretes. Korábban kimutatták, hogy onkogén vírusokkal (pl. RSV) való fertőzést, a DNS szintézist gátló anyagok megakadályozzák. A gátló anyagok közül az egyik csoport a DNS-hez kapcsolódva módosítja a templát szerkezetét, és ezáltal megzavarja az mRNS bioszintézisét (transzkripció), amely a fehérjeszintézis bevezető fázisának tekinthető. A DNS templát funkcióját zavarja a Pseudomonas és Streptomyces antibioticus termelte oligopeptid-tartalmú aktinomycin D (2. ábra). Pontos hatása abban áll, hogy az aktinomycin

D gyűrűje beékelődik, interkalálódik a DNS két bázispárja közé és megakadályozza, hogy a DNS hatékony templátként működjön. Az aktinomycin D-ben a fenoxazin gyűrűhöz két öttagú peptidlánc kapcsolódik, amiben metil-valin (MeVal), szarkozin (Sar), prolin (Pro),

7

Irodalmi áttekintés D-valin (Dval) és treonin (Thr) található. A metil-valin karboxilcsoportja és a treonin hidroxilcsoportja között észter-kötés alakul ki [6, 7]. CONHR

3 H2 O

1,5 O2

CONHR

NH 2 2

OH

N

f enoxazinon szintetáz

CH 3

CONHR NH 2

O CH 3

1

O CH 3

2 R = Thr-DVal-Pro-Sar-MeVal O

2. ábra A fenoxazinon szintetáz enzim által katalizált biokémiai reakció A fenoxazinon szintetáz kristályszerkezetét 2006-ban Smith írta le [8]. (3. ábra) Az enzim két oligomer formában létezik. Egy kevésbé aktív dimerként és egy nagyobb bioaktivitással bíró, de egyben stabilabb hexamerként. A monomerek egyenként 5-5 Cu atomot tartalmaznak, ezek között pedig mindhárom korábban említett réz típus megtalálható. Az ötödik Cu atom a spektroszkópiai adatok alapján kettes típusú réz, azonban az enzimre jellemző három két-elektron oxidációs folyamatban közvetlenül nem vesz részt. Szerepe a hexamer struktúra összetartásában van.

3. ábra A fenoxazinon szintetáz enzim (PHS) szerkezete [8]

8

Irodalmi áttekintés A kutatókat az aktinomycin D kedvező tulajdonságainak megismerése után rögtön foglalkoztatni kezdte gazdaságos előállítása és természetes képződésének pontos megismerése. Az 1950-es években a fenoxazinok kémiájával, különböző kromofórok előállításával Brockmann [9] foglalkozott behatóbban, majd a 60-as évek elején Katz [10] vizsgálta meg elsőként más-más baktériumokból származó enzim extraktumok viselkedését külső fém behatással szemben. Az első igazi modell kísérletekre viszont várni kellett az 1980-as évekig. Ebben az időben derült ki ugyanis, hogy rézsók és egyszerű réz komplexek oxidáló hatása és elektronátvitelben való szerepe a megfelelő réztartalmú enzimek modelljeként alkalmazható. A fenoxazinon szintetáz enzimről Prati és munkatársai készítettek részletesebb tanulmányt [11]. Munkájuk szoros összefüggésben van C. E. Barry enzimmel végzett kísérleteivel [6]. Az így kialakult első kép az enzim reakciómechanizmusáról (3-5) alapjaiban három két-elektron oxidációs folyamatot alkot. Az enzimnek csupán az első oxidációs lépésben van szerepe. Ez indítja el a következő két oxidációs lépést, amelyek a levegő oxigénjének hatására gyorsan lejátszódnak. NH 2

NH2 +

OH

OH

3

-2e-2H

NH 2

NH 2+

OH

O

4

3

(3)

Cu(I) + O2 = Cu(II)OO Cu(II)OO + SH = Cu(II)OOH + S H N

NH 2+

OH

O

5

-

-2e -2H

H N

NH2

OH

OH

(4)

4a

Tautomerizáció H N

NH 2

O

OH

-2e-2H

5a

N

NH2

O

O

(5)

6

Ahogy a (3-5) reakciók is mutatják, a legegyszerűbb módja a szóban forgó enzim modellezésének az o-amino-fenol oxidatív kapcsolási reakciójának vizsgálata. A termékként kapott 2-amino-3H-fenoxazin-3-on (6) nem csak szerkezetileg hasonló az

aktinomycin D-hez, de önmagában is alkalmazott antibiotikum és daganatellenes szer, amely questiomycin A néven ismert [12, 13]. Szintén biológiai aktivitással bírnak a csupán 9

Irodalmi áttekintés egy aminocsoporttal különböző fenilén-diaminok reakciójából származó diamino-fenazin származékok, amik a 1960-as évekig csak azofestékként voltak használatban [14, 15]. Előállításuk questiomycinéhez hasonló oxidáció útján történik, így továbbra is kutatott téma a területen [16]. Mindkét esetben a reakciókat hasonló módon katalizálják réz(I)-, réz(II)- és kobalt(II)sók, valamint kobaloxim, ferroxim, kobalt(III)- és réz(II)-oxalát, továbbá mangán komplexek. Az enzimmechanizmus kutatásában Simándi modellreakciói mutattak rá, hogy gyökök is szerepelhetnek a kérdéses első két-elektron oxidációs folyamatban. ESR merésekkel sikerült ugyanis igazolnia, hogy a (3-5) reakciókban 2amino-fenoxil gyök intermedier képződik, ami nagy valószínűséggel egy terner fémhidroperoxo-, vagy fém-peroxo-szubsztrát komplex kialakulásán keresztül történhet [17, 18].

1.2.2. A pirokatechin oxidáz enzim (CO – EC 1.10.3.1) és modelljei A oxidoreduktáz enzimek következő képviselője a növényvilág számos tagjában megtalálható, és a fenoxazinon szintetázhoz hasonlóan szintén a rézcentrumok határozzák meg az aktivitását. Az édesburgonyából (Ipomoea batatas) kinyert és sikeresen meghatározott szerkezet, 39 kDa tömegű enzimet takar, amely természetes állapotában (met forma) hármas típusú réz központtal rendelkezik [19] (4. ábra).

4. ábra Az édesburgonyából kinyert pirokatechin oxidáz enzim természetes (met) formában

10

Irodalmi áttekintés Ebben az inaktív állapotban felismerhető a hármas réz típusra érvényes réziononkénti 3-3 hisztidin koordináció, a trigonális piramis szerkezet és a Cu(II)-Cu(II) közötti oxo-híd 2,87 Å távolsággal. A redukált (dezoxi) formában a centrumok hídkapcsolata megszűnik, a CuA-hoz víz kötődik torzult trigonális piramissá váltva a geometriát, miközben a CuB körül egy síknégyzetes koordinatíve telítetlen állapot alakul ki. A távolságuk ebben az állapotban 4,40 Å. Egy másik kétmagvú rézcentrummal rendelkező enzim a tirozináz (EC 1.14.18.1.), melynek kristályszerkezetét évekkel később határozták meg, hasonló aktív centrumot mutat [20]. Az azonos osztályba tartozó biokatalizátorokat, és kinetikai kísérleteket alapul véve, már a szerkezet pontos ismerete nélkül is születtek hipotézisek a mechanizmussal kapcsolatban [21]. A feltételezések közös pontja az enzim oxi állapotára vonatkozik, ami a szubsztrát kapcsolódásakor jön létre, és a spektroszkópiai, valamint a modellvegyületek reakcióiból származó adatok alapján µ-η2:η2 formában tartalmaz peroxo híd-ligandumot [22]. Szerkezetét tekintve – legalábbis az aktív centrum szempontjából – a pirokatechin oxidáz meglehetősen hasonlít a tirozináz enzimhez, azonban funkcióban kicsit elmarad tőle, ugyanis monooxigenáz aktivitással nem rendelkezik. Hasonlóságuk onnan származik, hogy orto-difenol származékok oxidációját képesek katalizálni orto-kinonná dioxigén jelenlétében, miközben a dioxigént vízzé redukálják. Biológiailag értelmezve a növények érési-rothadási ciklusában a barna (fekete) színt eredményezik. Ez a képződő melaninoknak köszönhető melyek nagyon jó fotokémiai tulajdonságokkal rendelkeznek. Sötét színük révén képesek a napsugárzásból származó káros UV sugarakat elnyelni, így a szervezetek számára védelmi funkciót töltenek be [23]. (Az UV sugárzás elnyelése csökkenti a szabadgyökök képződését, amelyek közvetlen okozói nagyon sok nemkívánatos biológiai folyamatnak, többek között a DNS károsodásának.) A tirozinból kiinduló melaninhez tartó leegyszerűsített folyamat az 5. ábrán látható [24]. A szintézis első szakaszában a kizárólag enzimatikus folyamat mindössze csak az oDOPAkinon kialakulásáig tart. A melanocitákban termelődő tirozináz enzim DOPÁ-vá (L3,4-dihidroxi-fenilalanin) oxidálja a p-hidroxi-fenilalanint, ami ezután több különböző enzim közreműködésével is képes o-DOPAkinonná oxidálódni. Hasonló felépítésű fenolokon más réztartalmú enzimek is képesek az említett reakciót katalizálni. Ezeket összefoglaló néven polifenol-oxidáz (PPO) enzimeknek hívjuk. Ilyen például a lakkáz, vagy az L-aszkorbát oxidáz is [25].

11

Irodalmi áttekintés

COO NH + 3

HO

O2 Tirozináz

HO

COO NH + 3

HO DOPA

Tirozin

O2

O

COO NH 3 + Tirozináz O Pirokatechin oxidáz o - DOPAkinon-H + H+ + cisztein

-H

O

COO NH2 +

feomelanin O

o - DOPAkinon HO

O eumelanin HO

N H

COO

DOPAchrome

HO

N H

COO

LeukoDOPAchrome

5. ábra A tirozinból kiinduló melanin szintézis Az enzimek szerepe a mechanizmusban egyértelműen a réz központjukhoz köthető, bár részleteiben nem ismert pontosan, hogy miként. További fontos paraméterek a CuA– CuB távolság, a híd-ligandum jelenléte, a pH, a fémek redox hajlama, valamint a protein negyedleges szerkezete s annak hidrofil-hidrofób felülete. Mindezek együtt határozzák meg a funkciót, és alapul szolgálhat egy-egy modell-vegyület előállításához. Az eddigi ismeretek alapján Krebs [26] és Solomon [22] által javasolt mechanizmus egy körfolyamat, amelyben az enzim két mól pirokatechint oxidál kinonná, miközben egy mól dioxigént használ fel (6. ábra). A met és dezoxi állapot az enzim szerkezetének meghatározásakor ismertté vált, azonban az oxi állapot csupán a spektroszkópiai mérések alapján feltételezhető. Ezek a két réz közötti dupla oxo hidat sugallják µ-η2:η2 formában a jellegzetes Raman spektroszkópiával mért jellemzőik alapján. A Limulus polyphemusból származó oxihemocianin (Hc) enzim esetén a megegyező spektrumok mellett röntgenadatok is alátámasztják ugyanezt a struktúrát [27]. A szubsztrát kapcsolódása további kérdéseket vet fel. A CO enzim természetes inhibitora – a fenil-tiokarbamid (PTU) – tioéter hidat képezve egy nitrogénen keresztül kapcsolódik az enzim központhoz. Pirokatechint szuperimponálva az inhibitorra a CO-PTU komplexben a van der Waals-kötések száma úgy alakul ideálisan, ha az egy oldalon koordinálódik a CuB rézhez. Ezt az elképzelést erősíti meg az egyik közelben levő glutamát (Glu 236), amely a szubsztrát deprotonálódásában asszisztálhat [19].

12

Irodalmi áttekintés

O

His + H2O

O

His

O His

HO

O

2H+

O

O

His

His

His CuBII

His

OH

His

met-forma

O CuAII

OH

His His

CuBII O H

His

3H+

His

CuAII

His

His

CuAII O H

His

His

CuBII

His His

O

O

His

His His

CuAII

CuBII O H

His

2 H+ + H2O

His His

H+

OH O OH O2H O

His His His

CuAII

His CuBII

O

O2

His CuAI

His His

His

oxi-forma

His

O

His CuBI

His

His

dezoxi-forma

6. ábra A Krebs és Solomon által javasolt körfolyamat a CO enzim mechanizmusára [26, 22] A modellkísérleteket is figyelembe véve, és a két Cu(II)-ion ideális távolságából adódóan az oxi formában a hidat alkotó szerkezet sem kizárt. Mivel ez az állapot elég instabilis, így rövid ideig létezik, ezért csak kevés számításba vehető módszer áll a kutatók rendelkezésére. Általában csak ESR és abszorpciós spektroszkópiai módszerekre lehet hagyatkozni. A rézionok közötti távolságot EXAFS (röntgenabszorpciós finomszerkezet spektroszkópia) méréssel lehet meghatározni. Az ESR-rel a réz típusa állapítható meg; abszorpciós és rezonancia spektroszkópiával pedig a peroxo O–O kötés jellege deríthető ki. A 6. ábrán bemutatott µ-η2:η2 kapcsolat O–O Raman frekvenciája ~750 cm-1 körül jelentkezik nagyon gyenge jelként. UV-Vis spektrumban egy erős fényelnyelési abszorpció látható ~345 nm körül (log ε = 3,78 – 4,04 származási helytől függően), és egy gyengébb 580 nm-nél (log ε = 2,65) [5, 28]. Ezek az értékek összevethetőek a sokkal gyakrabban előforduló bisz-µ-oxo szerkezettel, ahol a Raman rezgés ~610 cm-1-nél, valamint az UVVis maximum 450 nm-en (log ε = 4,11) jelentkezik [29]. Néhány lehetséges Cu–dioxigén koordinálódás mód a következő ábrán látható (7. ábra).

13

Irodalmi áttekintés

O Cu

O

O

Cu

O

Cu O

η 1 end-on

Cu

Cu

O

O

η 2 side-on

µ -η 2:η2 side-on

szuperoxo

O

O

Cu

Cu

Cu O

µ -1,2 end-on

bisz- µ-oxo

peroxo

oxo

7. ábra A Cu–dioxigén kapcsolatok néhány lehetséges szerkezete A CO működési és funkcionális modelljeit bemutató tudományos közlemények száma évről-évre nagy ütemben növekszik. Néhány kiválasztott vegyület, és azok kinetikai adatai a 1. táblázatban vannak összeállítva. 1. táblázat. Egy-, és kétmagvú CO modellek szerkezeti és kinetikai adatai Cu–Cu (Å)

Komplex

KM (M)

kcat (s-1)

kcat/KM (M-1s-1)

Cu2(Lig1)(OH)(ClO4)4 [30] N

N Cu

N

O H

N N Cu N

O3 ClO

3,45

8,90 × 10-5 7,80 × 10-1

8752

3,70

2,90 × 10-3 3,30 × 10-2

11,40

3,76

4,90 × 10-3

2,99

4,20 × 10-4 4,50 × 10-2

OClO3

Cu2(Lig2-O)(CF3SO3)3 [31] N N O N Cu Cu N N O O N S

Cu2(Lig3)(µ-OH)3+ [32] N N O N Cu Cu N O N N

-

-

(aktív forma) Cu2(Lig4-O)(µ-OH)(ClO4)2 [33] O

N Cu N

N Cu

O H

107

N

Cu2(Lig5)(MeCN)2(ClO4)4 EtOH [34] N N Cu N N

O

N Cu N N N

Cu(acac)2 , Cu(bpy)2 stb. [35]

4,76 -

14

nincs aktivitás -

-

-

Irodalmi áttekintés A bemutatott komplexek kiválasztásánál figyelembe vettem, hogy lehetőleg minden spektroszkópiailag ismert típus szerepeljen. A táblázatban a rézionok közötti kapcsolat és a távolság is fel lett tüntetve. Ahogy korábban

is

említésre

került,

ezek

fontos

adatok,

ugyanis

a

szubsztrátum

koordinálódásának módját határozzák meg. Amennyiben a távolság nagyobb, mint 4 Å, a modell már kevés eséllyel, vagy csak alacsony hatásfokkal képes az oxidációt katalizálni. Mindezekből egyenesen következik, hogy a kétmagvú komplexek többnyire jobb katalitikus sajátságokkal rendelkeznek, mint egymagvú analógjaik [35]. Az oxi állapot alakját illetően látszólag nem vonható le szigorú következtetés a reakció kimenetelével kapcsolatban, bár a µ-OH híddal rendelkező komplexek jobban teljesítenek. Ez arra utalhat, hogy ebből a szempontból csak a fém redoxi tulajdonságai számítanak. Kutatása azonban továbbra is fontos feladat marad, hiszen az inertnek ismert triplett állapotú dioxigén aktiválása ebben a stádiumban teljesedik ki, és még nem ismert pontosan, hogy hogyan.

1.2.3. A pirokatechin dioxigenázok és modelljeik Az előző fejezetben tárgyalt enzim szerepe a pirokatechin származékok oxidációján alapul. Oxigénezésük azonban bonyolultabb folyamat, és az erre „szakosodott” enzimek is több módon láthatják el ezt a feladatot. Attól függően, hogy a két hidroxilcsoport között, vagy a gyűrű egy másik pontján katalizálják a C–C kötés felszakítását, megkülönböztetünk

intradiol-, vagy extradiol-típusú hasítást (8. ábra). OH

O O2

O

HO

cisz,cisz-mukonsav OH OH

pirokatechin 1,2-dioxigenáz O2

OH

pirokatechin pirokatechin 2,3-dioxigenáz

COOH CHO

α -hidroxi-mukonsav-szemialdehid

8. ábra A pirokatechin dioxigenázok által katalizált reakciók 15

Irodalmi áttekintés Intradiol hasítást végző enzimek A 8. ábra felső része a pirokatechin intradiol hasításának reakcióját mutatja. Termékként cisz,cisz-mukonsavat kapunk, ami adipinsavvá hidrogénezhető. Az adipinsav iparilag fontos nyersanyag műanyagok, vagy természetben lebomló polimerek gyártásához. Enzimatikus úton történő előállítása tehát divatos téma jelenleg a kémiai és biomérnöki kutatásokban [36]. A szomszédos hidroxilcsoportok közötti gyűrűhasítást több enzim is képes elvégezni különböző szubsztrátum származékokon. Az irodalomban előforduló két fontosabb képviselőjük a talajban található baktériumokból kinyert pirokatechin 1,2dioxigenáz (1,2-CTD; EC 1.13.11.1) és protocatechuat 3,4-dioxigenáz (3,4-PCD; 3,4dihidroxi-benzoát 3,4-dioxigenáz; EC 1.13.11.3). A korábban bemutatott enzimektől eltérően a katalitikus hatásuk a nagy spinszámú, nem porfirin-vázas vas(III) aktív centrumuknak köszönhető. A 3,4-PCD enzimet már az 1960-as években ki tudták nyerni kristályos formában [37], különböző spektroszkópiai módszerekkel is vizsgálták [38, 39], azonban röntgenszerkezetét csak 1988-ban ismerték meg [40]. A vas(III)ion trigonális bipiramisos környezetben található, két tirozin és két hisztidin, plusz egy víz molekula koordinálódik hozzá alapállapotban. A szubsztrátummal együtt készült röntgenvizsgálat alapján egy fontos szerkezeti változás történik az aktív formájában. A pirokatechinek kétfogú ligandumként kapcsolódnak, és kiszorítanak egy tirozint a koordinációs övezetből, valamint a forma oktaéderesre változik [41].

O

O Fe3+

R

Fe2+

R

O

O

O2

Fe2+

R

O

O

O O

O R

COOH COOH

O O

R

Fe3+

R O

O

Fe3+

O O

9. ábra A pirokatechin 1,2-dioxigenáz javasolt mechanizmusa Az 1,2-CTD szerkezetének meghatározására jóval később 2000-ben került sor [42]. Az eredmények az mutatták, hogy nincs számottevő eltérés a 3,4-PCD enzimtől. A szerves 16

Irodalmi áttekintés ligandumok hasonló módon koordinálódnak a központi vashoz, és annak oxidációs állapota nem változik az enzimfolyamat során. Mindemellett ismerve, hogy a triplett állapotú

oxigén

nagy

affinitással

rendelkezik

gyökös

jelleggel

rendelkező

reakciópartnerekkel szemben, logikus feltételezni egy szemikinonon keresztül induló mechanizmust, ahogy a 9. ábra is mutatja [43].

Extradiol hasítást végző enzimek A 8. ábra alsó része a pirokatechinek extradiol hasítását vázolja. A katalizált reakcióban való eltérés alapján nem meglepő, hogy szerkezetileg is nagy különbségeket találtak „intradiolos” rokonaikkal szemben. Legszembetűnőbb, hogy a vasion a centrumban ezúttal Fe2+ formában található a natív enzimekben. A 2,3-CTD (EC 1.13.11.2) például egy tetramer, ami egységenként egy-egy Fe2+-t tartalmaz [44] két hisztidin és egy glutaminsav alkotta környezetben az első elérhető szerkezet alapján. Érdekesség, hogy 2,3-dioxigenázok más fémeket használó válfajait is azonosították Mn(II) [45, 46] – Arthrobacter globiformis-ból kinyert 3,4-dihidroxi-fenilacetát-2,3-dioxigenáz (EC 1.12.11.15) – és Mg(II) centumokkal [47], – ugyanazon enzim Klebsiella

pneumoniae-ból – bár az utóbbi röntgen szerkezete nem ismeretes (10. ábra).

10. ábra Fe és Mn tartalmú pirokatechin 2,3-dioxigenázok aktív centruma [48, 46]

17

Irodalmi áttekintés A mechanizmust tekintve alapvető különbség az intradiol és extradiol hasítást végző enzimek között, hogy az előbbieknél molekuláris oxigén jelenléte szükséges az aktív állapot eléréséhez, míg az utóbbiak a szubsztrátum segítségével képesek a dioxigén megkötésére, továbbá az aktiválódásra. A 10. ábra bal oldalán egy nemrég meghatározott [48] vastartalmú 2,3-CTD aktív centruma látható 4-nitro-pirokatechin szubsztrátummal, az enzimreakció különböző fázisaiban. A szerencsés szerkezet-meghatározásra azért kerülhetett sor, mert a tetramer enzim egységei kis részletekben különböznek egymástól, így az egyes egységekben, adott pillanatban, a reakciók nem azonos intermedier szakasznál tartanak. A hasonló mangántartalmú enzim röntgen adatait is alapul véve, a Lipscomb csoport a

11.

ábrán

látható

extradiol

2,3-

dioxigenáz katalitikus ciklust javasolta [49].

Fontos

megjegyezni,

hogy

a

feltételezett gyökös mechanizmus miatt, valamint a röntgen, a Mössbauer, ESR és IR mérések alátámasztásával [50] a legújabb

kutatások

szerint,

a

fém

oxidációs állapota nem változik, és az aktív

forma

egy

Fe(II)-O2-

(vas-

szuperoxo) adduktumban teljesedik ki.

11. ábra (jobbra) Az extradiol hasítást végző 2,3dioxigenázok javasolt mechanizmusa [49] 18

Irodalmi áttekintés Az extradiol hasítás lehetősége az 1,2-CTD enzimeknél és modelljeiknél Kevésbé ismert tény az intradiol hasítást végző enzimeknél, hogy bizonyos szubsztrátumok alkalmazásánál extradiol hasítás során keletkező végtermékeket is lehet azonosítani. 1975-ben Fujiwara fedezte fel, hogy a Pseudomonas fajokból származó 1,2CTD a 3-metil-pirokatechint – a keletkező termékek alapján – extradiol módon is hasítja. Később kiderült, hogy akár o-amino-fenollal [51] is hasonló reakciók mehetnek végbe. Számtalan bioutánzó – főleg vas – komplexet gyártottak a mechanizmus megismerése érdekében [52, 53], de egyelőre még a szelektivitást is nehezen tudják megmagyarázni. Tény, hogy befolyásoló hatással van a reakció kimenetelét tekintve a fém oxidációs állapota, a szubsztrátum koordinációja és az oldószer is. Ez utóbbira érdemes külön figyelmet fordítani, ugyanis Speier és Tyeklár modellkísérleteikben szubsztituált pirokatechin származékok autooxidációs folyamatait vizsgálva [54] azt találták, hogy az aprotikus, vagy protikus közeg jelenléte már a köztitermékként kialakuló szemikinont is meghatározza. Ez további hatással van a gyűrűnyitási, vagy a benzokinon végtermékek képződésére. A különbségek utalhatnak az enzim aktív centrumában uralkodó hidrofilhidrofób körülményekre. A fém oxidációs állapotával kapcsolatban ismét csak a modellkísérletekre lehet hivatkozni. Legyen szó Rh2+, 3+, Co3+, Ir3+ [55], vagy Fe2+,3+ [53] komplexekről, többnyire mindenfajta gyűrűhasítási terméket megfigyeltek. A 12. ábrán a leggyakrabban detektált intra-, és extradiol hasítás termékei lettek összegyűjtve a sok esetben alkalmazott 3,5-di(terc-butil)-pirokatechin (dtbcatH2) példáján keresztül. O O

O O

O

O

O

OH

O

7

O

O

8

O

intradiol

9

10 extradiol

O O O

11

O

12 egyéb

12. ábra Az intradiol és extradiol hasítás termékei dtbcatH2 szubsztrátum esetén

19

Irodalmi áttekintés 1.2.4. A metán-monooxigenáz enzim (MMO -- EC 1.14.13.25)

A dolgozatban szó volt eddig réz és vas centrummal is rendelkező enzimekről. A metanofil, vagy metanotróf baktériumokban található metán-monooxigenáz (MMO, EC 1.14.13.25.) valahová a kettő közé sorolható. A magyarázat annyi, hogy két jól elkülöníthető formája létezik, a „szemcsés” (particulate – pMMO) és „oldható” (soluble – sMMO). A fémek az enzim szekréció és aktivitás szempontjából is fontos szerepet játszanak. A pMMO-t minden baktérium alfaj (egy kivételével) képes termelni, és rézben gazdag környezet szükséges hozzá, ezen felül réznek köszönhető az aktivitása is. Az sMMO-t már kevesebb példány termeli, főleg rézhiányos környezetben, és valószínűleg ennek köszönhetően az aktív centrumban vas található [56]. Ezek a jellemzők a szubsztrátum specifikusságukat is alapjában meghatározzák. Az első forma a rövidebb egyenes láncú szénhidrogéneket (C1-C5) elsősorban alkoholokká, valamint a megfelelő alkéneket epoxidokká képes oxidálni. A második forma jóval többfajta vegyület átalakítására alkalmas [57, 58]. Ez utóbbiról számtalan publikáció jelent meg és jelenik meg, még a szerkezetének meghatározása után is, ugyanis kutatása minden formában könnyebb az oldhatósága miatt [59]. A 13. ábra részletekben szemlélteti a metán teljes biológiai lebontását jól ábrázolva a MMO szerepét a folyamatban. metánmonooxigenáz CH 4 O 2, NADH

metanoldehidrogenáz CH 3OH

H 2 O, NAD

H 2CO NAD

NADH formaldehiddehidrogenáz

hangyasavdehidrogenáz CO2

HCOOH NADH

NAD

13. ábra A metán teljes biodegradációja a Methylococcus capsulatus (Bath) baktériumban [60] A

továbbiakban

a

metán-monooxigenáz

pMMO

formáját

mutatnám

be

részletesebben, ugyanis a 3.3 fejezet címszereplő rendszerének képességei sokkal inkább ehhez hasonlíthatóak. A sejtmembránhoz kötődő partikuláris metán-monooxigenáz röntgen-szerkezetét 2005-ben Methylococcus capsulatus (Bath) baktériumból Rosenzweig csoportjában 20

Irodalmi áttekintés határozták meg [61]. A trimer enzim három ~ 100 kDa tömegű egységből áll, ahogy a 14. ábra mutatja eltérő színekkel. Egységenkénti három aktív centrum jelenlétét feltételezik. Az egymagvú rézközpont környezetét két hisztidin és egy glutamin alkotja. A közelében a kétmagvú réz körül három hisztidin, valamint az egy másik alegységben levő cink körül két hisztidin, egy glutaminsav és egy aszpartámsav található. A első röntgenszerkezet megmérése után, az elkövetkezendő évek folyamán, különböző kutatóhelyek számos ellentmondó

eredményt

publikáltak

a

spektroszkópiai

méréseik

alapján.

Ezek

megkérdőjelezni látszanak az előzőleg közölteket. Egy nemrég megjelent összegző cikk [62] alapján a Mössbauer mérések a „cink” központban kétmagvú vasra utalnak, az ESR adatok szerint pedig több különböző rézion is jelen lehet. A tisztítási eljárások következtében kicserélődhetnek egyes fémionok ami a cink jelenlétét kérdésessé teszi. Az EXAFS adatok közeli Cu–Cu kapcsolatra utalnak, így ezek megerősítik az eredeti észlelést [63]. Érdekes, hogy egy másik baktériumból (Methylococcus trichosporium OB3b) kinyert szintén pMMO enzim nemrég bemutatott röntgen szerkezetéből már teljesen hiányzott a cink centrum [64]. Mi lehet akkor a valódi szerkezet? Annak tisztázása csak az alkalmas szubsztrátummal együtt kristályosított röntgendiffrakciós méréstől várható a jövőben.

14. ábra A pMMO enzim trimer szerkezete normál (a), és sejtmembránra merőleges (b) nézetekből [61] A szerkezettel kapcsolatos sok bizonytalanság ellenére a kutatók többsége mindenképpen valamilyen rézcentrumot tart valószínűnek a rendelkezésre álló adathalmaz alapján. A számtalan előállított komplex, amelyekkel funkcionálisan próbálják modellezni 21

Irodalmi áttekintés a pMMO-t, főleg rezet tartalmaz. A többi réz-metalloenzimhez hasonlóan, réz-dioxigén (CuxOy) komplexekkel [65] próbálják leírni azt a mechanizmust ami arról ismert, hogy képes a metánban levő legerősebb alifás C–H kötéseket (kötési energia: 104 kcal / mol) is felszakítani, majd oxidációt véghezvinni. Komoly figyelmet szerzett például Chan és munkatársainak cikke [66], amely szerint trinukleáris réz-centrumot is tartalmazhat a pMMO. Az állításukat izotróp ESR jelekre, potenciometriás titrálásra és ide kapcsolódó számítógépes DFT (density functional theory – sűrűségfunkcionális elmélet) elméleti számításokra alapozták. Szerintük, a trinukleáris mag tökéletesen beilleszthető az enzim egy hidrofil aminosavakkal teli egységébe, ami ráadásul nem is azoknak az aktív centrumoknak az egyike, amit a röntgenszerkezet alkotói leírtak. Az ide illeszthető hidroxilezési mechanizmus hasonló a 15. ábrán láthatóhoz, annyi különbséggel, hogy az egyik oxigén atom µ3-O-Cu3 formában alkot hidat három réz között. Néhány korábban előállított, szintén trinukleáris magot tartalmazó Cu2+-pirazolát [67] és összetettebb [68] funkcionális modell komplex, és azok pMMO aktivitása jó alátámasztással szolgálnak ehhez a feltevéshez. Ezektől függetlenül, azonban továbbra is a leginkább elfogadott nézet a kétmagvú centrum jelenlétéhez kötődik. A modellreakciókban a pirokatechin oxidáz enzimmel megegyezően (1.2.2 fejezet), ebben az esetben is a µ-η2:η2-peroxo Cu22+ és bisz-µ-oxo Cu23+ formációknak köszönhető az egész enzimutánzó, és ennek alapján feltehetőleg az enzimatikus folyamat is [69, 70]. Az utóbbiról még nem található biológiai hivatkozás, azonban a gyakorlat és az elméleti számítások ebben az esetben mutatják a legerősebb katalitikus képességet. A 15. ábrán látható mechanizmus szerint a „kör” ráadásul még tovább szűkül egy vegyes oxidációs állapotú, kétmagvú rendszerre [71]. O Cu II

O

O CuIII

O H H C H H

CuIII

Cu II

Cu II

O

O

H

H

H C H H

H

O CuII

C H

Cu II

O CuIII

O H H

H C

H

H

Cu I

CuII

OH H C H H

15. ábra A pMMO modellkísérlet mechanizmusa kétmagvú rendszernél [71] A harmadik lehetséges aktív centrum az enzimben cinket, vagy nagyobb valószínűséggel rezet tartalmazhat. Kicsinek tartják ugyan a valószínűségét, hogy ezen a 22

Irodalmi áttekintés helyen is katalitikus reakciók játszódjanak le, azonban az egymagvú Cu–O2 rendszer is képes C–H kötés aktiválásra. A szuperoxo-réz vegyületek side-on és end-on formái – ugyan nem túl nagy hatékonysággal, de – fenolok oxidációjára képesek [69]. A CuII–OOH (hidroperoxid) és CuII(O2•-) (szuperoxid) komplexek – részletes spektroszkópiai mérésekkel igazolva – reaktívak ugyan, de magukban nem képesek C–H kötések bontására, csak valamilyen hidrogén atom donorral (fenol, TEMPOH). Az így keletkező magas vegyértékű réz-oxo (CuIII=O, CuIV=O) formációk az elméleti számolások alapján létrejöhetnek, azonban a gyakorlatban még nem mutatták ki őket. Kialakulásuk heterolitikus CuII–OOH, vagy homolitikus O–O kötés-hasadással lehetséges, ami termodinamikailag nem kedvezményezett, mégis racionális magyarázat a mechanizmus szempontjából [65, 72, 73] (16. ábra).

16. ábra A pMMO egymagvú modell rendszerénél felvázolt lehetséges mechanizmus [65] A fenti ábrán a réz ebben az esetben egy N–CH3 rendszert oxidál, amely ráadásul a ligandum egysége. Nehéz olyan egymagvú komplexet találni az irodalomban, ami igazi modellje

lehetne

az

enzimnek.

A

tesztek

szerint

a

vegyületeknek,

amelyek

megfelelhetnének ennek a kritériumnak, oxidálni kellene maximum 5 szénatom hosszúságú szénhidrogéneket C2-nél, ráadásul enantioszelektíven [74]. Lucas és Karlin mutattak be egy anizol tartalmú, négyfogú polipiridil ligandumot, ami rézzel toluolt és etilbenzolt volt képes oxidálni, azonban mindehhez a komplex dimerizációja szükséges [70]. 23

Irodalmi áttekintés A reakció az alifás oldalláncon történt. Kunishita és Itoh a komplexükkel kuménhidroperoxid által aktiválva egy akridin származék oxidálását voltak képesek elérni [75]. Ezek a cikkek mind egyedi eseteket mutatnak be C–H kötés aktiválására, így funkcióban közel állnak a pMMO-hoz. Specifikusságukról és több szubsztrátummal szemben mutatott viselkedésükről azonban a rendelkezésünkre álló adatmennyiség rendkívül hiányos. Amennyiben a fentiekben egymagvú rézrendszerekről volt szó, két további enzimet érdemes még röviden megemlíteni. Ezek a dopamin-β-monooxigenáz (DβM – EC 1.14.17.1) és peptidil-glicin monooxigenáz (PHM, EC 1.14.17.3). Mindkét enzim aszkorbát segítségével (hidrogén absztrakció) képes hidroxilezni C–H kötéseket [76, 77] (17. ábra). aszkorbát NH3+

2

dehidro-aszkorbát H+,

NH3+

D βM

HO OH

O2

O N H

HO H 2O

aszkorbát

O

O2

OH N H

PHM

O

OH

dehidro-aszkorbát

2 H+, 2e-

O-

OH

2e-

OO

H 2O

17. ábra A DβM és PHM enzimek biológiai funkciója [76] A 17. ábra a DβM dopamin, és PHM peptidil-glicin oxidációját szemlélteti az erre alkalmas enzimek segítségével. Az esetek többségében, amikor pMMO aktivitásról, CH kötés oxidálásról esik szó a modellkísérletek során, ezek az enzimek is szóba kerülnek. A 16. ábrán bemutatottakhoz hasonlóan feltételezik működésüket, ami egyben a PHM tökéletes funkcionális modellezését is mutatja. Ha a jövőben bizonyossá válik, hogy a pMMO egymagvú aktív centrumot is tartalmaz, akkor talán majd az ezekkel az enzimekkel végzett kísérletek is hozzájárulnak a mechanizmus megfejtéséhez.

24

Irodalmi áttekintés 1.2.5. A kataláz enzim (EC 1.11.1.6)

A 240 kDa tömegű kataláz (EC 1.11.1.6) az egyik legfontosabb védelmi funkciót ellátó enzim. A különböző biológiai folyamatok melléktermékeként keletkező hidrogénperoxid oxigénné és vízzé alakítását katalizálja az enzimek közül a legnagyobb hatásfokkal (kcat/KM = 4,00 × 108 M-1 s-1). Az emberi szervezetben például az összes termelődő H2O2 felét alakítja át, nem csekély védelmet nyújtva ezzel a hemoglobinnak [78].

2 H2O2

2 H2 O +

O2

(6)

Minden állat minden szervében „használ” katalázt, de különösen a májban. Ismerve, hogy ez az elsődleges méregtelenítő szerv, ez nem meglepő. Fő feladatán kívül szerepet játszik még sejt apoptózis megelőzésében [79], mutagenézisnél [80], számos tumor stimulálásánál [81], valamint gyulladásos betegségeknél [82]. Hiánya az úgynevezett acatalasemia, vagy Takahara genetikai betegségben mutatkozik [83]. Az agyban olyan funkciója is ismeretes, hogy képes az etanolt acetaldehiddé alakítani, amely vegyület az ittasság és a vele járó egyéb neurológiai hatások kiváltója [84]. Oscar Loew német kémikus számos növényből és állatból készített enzim kivonatot, és ő használta először a kataláz nevet több mint egy évszázada [85]. Aminosav szekvenciáját már 1969 óta ismerik [86], három dimenziós röntgen szerkezetét pedig 1981ben határozták meg [87]. A tetramer formát négy több mint 500 aminosavat tartalmazó polipeptid lánc alkotja. Az egységenkénti aktív centrumok egy-egy porfirin gyűrűbe zárt vasból állnak, ami kb. 25 Å távolságra van az enzim felszíntől. (18. ábra).

18. ábra Emberi eritrocitából (vörösvérsejt) származó kataláz és aktív centruma [88] 25

Irodalmi áttekintés A protein gombolyagban mélyebben ülő hem központ egy 25 Å hosszú, folyamatosan szűkülő csatornán keresztül kapcsolódik a felszínhez. Ez egy felettébb különös képződmény, ugyanis nem csak kis molekulák keresztülhaladását teszi lehetővé, hanem egyedi felépítése révén szelektivitást is biztosít. A falát aminosavak (tirozin, fenilalanin, valin, triptofán) hidrofób oldalláncai alkotják. A belső részt vízmolekulák tömege veszi körül a csatorna egész hosszán keresztül. A keresztmetszet annyira lecsökken a maghoz közeli utolsó szakaszon, hogy már csak olyan kis molekuláknak marad hely az átjutáshoz, mint a hidrogén-peroxid [88]. A 19. ábrán a hem központhoz vezető csatorna látható a zöld színű aminosav építőelemekkel, és a belső fal mellett felhalmozódott, pirosra festett vízmolekulákkal.

19. ábra Emberi eritrocitából (vörösvérsejt) származó kataláz aktív centrumához vezető csatorna [88] Az élőlényekben található szabad vasionoknak sokfajta káros hatása ismert. Különösen nagy figyelmet érdemes fordítani a FeII ionok Fenton, vagy Haber-Weiss folyamatokban [89] történő hidroxil-gyök (•OH) képzésére (7). Fe3+ +

Fe2+ + H 2O2

OH

+

OH

(7)

A reakció ugyan már nem új felfedezés, de jelentősége mindmáig nagy, ugyanis számos súlyos betegség közvetett kiváltó okának tartják. Köze van szívrohamhoz, szélütéshez, szervi rendellenességekhez ugyanúgy, mint a legismertebb neurodegeneratív betegségekhez, mint például Alzheimer-kór, Parkinson-kór, Huntington-kór [90]. A megfelelően kötött vas (többnyire Fe3+) azonban, éppen az ellenkező reakciót képes katalizálni, vagyis a káros gyökök, peroxidok, hidroxidok lebontását (szuperoxid-dizmutáz, kataláz). A emberi kataláz enzimben a Fe3+-ion egy hem szerkezetben (négy N atom által) van rögzítve, plusz még egy tirozin (Tyr358) koordinálódik hozzá. Ez utóbbinak és a hem 26

Irodalmi áttekintés körül levő hisztidinnek (His75), valamint aszparaginnek (Asn148) (18. ábra) fontos szerepük van a mechanizmusban. Miután a korábban leírt szűk csatornán átjutnak a hidrogén-peroxid molekulák, az utóbbi kettő aminosav elektronszívó tulajdonsága segítségével, és az aktív centrum elektronokban gazdag magja közreműködésével megindul a peroxid kötés heterolitikus hasítása (20/a ábra). A következő lépésében kialakul egy olyan formáció, amit egyszerűen „vegyület I”-nek kereszteltek el (20/b ábra). (a.)

O O H O HN

Asn148

H2N

NH2

O H

Asn148

O H HN

N

O

NH

75His

75His N

N

N

N

Fe N

Fe N

N

N

O

O Tyr358

Tyr358

(b.) O

Asn148

O

H2N HN

Asn148

H2N H O H

O H NH

HN

O

75His

N

π

75His N

O

N

N

N

Fe N

N

O

O

N

O

NH2 H2N

Fe

NH

Asp348

O

NH2 Tyr358

HN

N HN

N

O

Arg354

H O

NH Arg354

N

Asp348

His218

Tyr358

NH

"vegyület I"

His218

20/a,b ábra A hidrogén-peroxid lebontásának mechanizmusa a kataláz enzimben [88]

27

Irodalmi áttekintés (c.)

O

HN

H O O H

Asn148

O O O

H 2N

N

π

O

N

H 2N H O H

HN

75His

N

75His N

N

N

Fe N

"vegyület I" HN

N

O Tyr358

NH

Asp348

H2 N O

Arg354

N

N O

NH 2

NH

OH

O

Fe N

NH 2

Asn148

O

N Arg354

HN

Asp348

His218

Tyr358

NH

His218

20/c ábra A hidrogén-peroxid lebontásának mechanizmusa a kataláz enzimben [88] Miközben „vegyület I” kialakul, a hemhez közeli arginin (Arg354) a hisztidin (His218) és aszparagin (Asp348) irányában olyan semlegesítésbe kezd, ami végül enyhíti a töltés-taszítást a porfirin π-gyök-kationnal, valamint csökkenti a polarizációt az amúgy is már

elektron

hiányos

Tyr358-Fe4+=O

rendszeren.

A

redoxpotenciál

további

változtatásában a 18. ábrán látható fenil-alaninek (Phe153, Phe161), és argininek (Arg72, Arg112, Arg365) is részt vesznek [88]. A folyamat következő részében a „vegyület I” „vegyület II”-vé redukálódik (8) [91].

V egyület I (Por +

FeIV

O) + H (H + + e-)

Vegyület II (Por

FeIV

OH )

(8)

Ebben az állapotban az enzim inaktív. A ciklus utolsó szakaszba lépéséhez NADPH-ra (nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát) van szükség, ami egy elektronos reakcióban reaktiválja, azaz más megfigyelések szerint megakadályozza a „vegyület II” kialakulását. A második H2O2 oxidálódásával az enzim visszatér nyugalmi állapotába. Számos kísérletet elvégeztek ugyan a NADPH szerepének tisztázására, azonban a kép a mechanizmusról továbbra sem teljes. Kérdéses például, hogy a NADPH hogyan képes egy elektronos reakciót véghezvinni, amikor kételektronos folyamatairól ismert. A „vegyület II”-t sikerült ugyan kimutatni, de feltételezik, hogy csak alacsony H2O2 koncentráció 28

Irodalmi áttekintés esetén van ideje kialakulni. Magas hidrogén-peroxid koncentrációnál elvégzett kísérletekről egyelőre nincsenek az irodalomban elérhető adatok [92]. Úgy tűnik, hogy a vas tökéletesen alkalmas a feladat elvégzésére, azonban a természet mégis produkált egy enzim-változatot. Ahogy az előző fejezetben bemutatott MMO-nak is, úgy a kataláznak is van egy másik fémet tartalmazó formája, ez esetben mangántartalmú. Felfedezésük úgy kezdődött, hogy a Pediococcus Cerevisiae és számos más laktonsav baktériumból kinyert kataláznál nem működött a cianid-inhibíció [93, 94]. A korábban pszeudokatalázként emlegetett enzimekről 1982-ben derült ki, hogy mangánt tartalmaznak, és homohexamer formában léteznek [95]. Az első röntgenszerkezetet már 1986-ban sikerült meghatározni [96], azonban 2000-ben és utána a felbontás javításával, egyre több információ került napvilágra [97, 98]. A megismert szerkezet és funkció összehasonlításával, a kétmagvú mangántartalmú enzimek mangán kataláz és mangán peroxidáz alcsoportokra választhatók szét. A Lactobacillus plantarum mangán kataláza homohexamer formában létezik (21/a. ábra). Minden egyes mangániontól 15 Å távolságra 11 Ca2+ található. Ezek nyolcas koordinációjúak, valamint a monomerek szélein helyezkednek el.

Ligandumjaik

a

szomszédos

protein

egységekből származnak, vagyis szerepük a szerkezet alakításában és összetartásában van.

21/a ábra (balra) A mangántartalmú kataláz enzim szerkezete [98]

21/b ábra A mangán kataláz enzim aktív centruma [98] 29

Irodalmi áttekintés A katalitikus központ fő alkotóelemei maga a Mn2O2 formuláció és a µ1,3-hidat formáló glutaminsavból (Glu66) származó karboxilát (21/b ábra). Erre a felállásra jellemző tipikus ESR érték a J = -20 cm-1 gyenge csatolási állandó a két nagy spinszámú, egymástól 3,03 Å távolságra lévő, azonos vegyértékű Mn2+-ion között [99]. A mechanizmus meghatározásánál is főleg az ESR és az EXAFS adatok játszottak szerepet. Ezek segítségével bizonyították ugyanis, hogy az egész körfolyamat a MnIIMnII és MnIIIMnIII állapotok közötti átmenetnek köszönhető (22. ábra) [98, 100, 101]. O 178Glu C O

O 178Glu C O H O H O

H

O

Mn III

OX

O O

Mn III

Mn II

O H

Mn II O H

O 178Glu C O

O 178Glu C O H

H 2O

O O

H RED

Mn

H O

II

O Mn

II

Mn

III

O H

Mn III O H

22. ábra A mangántartalmú kataláz enzim feltételezett mechanizmusa [98] A fenti mechanizmus egy oxidációs és egy redukciós félfolyamatból áll. Mindkét forma reagál a H2O2 szubsztrátummal. Részben ennek köszönhetően, és részben az enzimatikus reakció gyorsasága (kcat ≈ 105 s-1) [97] miatt precíz megállapítások még nem születtek. Sokkal nagyobb hangsúlyt fektetnek a kutatók azonban a modellvegyületekkel végzett kísérletekre. Ezeknek természetesen megvan az előnyük és hátrányuk is. A legjobbak közel állnak az enzim valódi mechanizmusához, de sajnos nem túl effektívek, a funkcionalitásban közel állók pedig hatékonyak, de nem a valós enzimreakciót tükrözik. A 23. ábra néhány véletlenül kiválasztott mangán- és réztartalmú modell és a különböző baktérium fajokból származó enzim kinetikai adatait mutatja.

30

Irodalmi áttekintés 2. táblázat. Egy-, és kétmagvú kataláz modellek szerkezeti és kinetikai adatai Komplex, baktérium

Thermus thermophilus [101, 97] Lactobacillus plantarum [101, 98] [MnIV(SALPN)(µ-O)]2 [102, 103] O O Mn N N

M–M (Å) 3,13 3,19

KM (mM) 83 ± 8 350

kcat (s-1) 2,60 × 105 2,00 × 105

kcat/KM (M-1s-1) 3,10 × 106 5,70 × 105

2,73

250

250

1000

3,54

3,00

2,10

700

3,25

10,20

10,10

990

3,46

-

0,02 (kobs)

-

-

2,20 ± 0,2 (kobs) (M-1 s-1)

-

-

0,27 (kobs) (M-1 s-1)

-

N Mn N O O O O

[MnIII2(µ-O)(OH2)(OAc)benzimpn]+ [104] L O

N

N

N Mn Mn N O N N O O

[MnIII(2-OH-salpn)]2 [105] O Mn N N

O

N Cl Cu N N

O

O

N N Mn O O O

[BDBPHCuII2]ClBr × 3H2O [106] O

N N Cu Cl N

[Fe2O(bpy)4(OH2)2](ClO4)4 [107] N O N N N Fe Fe N N N OH HO N

3,32

[FeIII(PBMPA)(H2O)2]Cl2 [108] N

N

N

-

Fe O

A

O

legtöbbször

O

hivatkozott

[MnIV(SALPN)(µ-O)]2

(H2SALPN

=

1,3-

bisz(szalicilidén-imináto-propán) komplex [102, 103] mindmáig a legjobb funkcionális modellje a mangán kataláznak. A katalitikus ciklus alatt azonban a központi ionok a MnIV és MnIII oxidációs állapotok között mozognak. A további két mangántartalmú példa szintén a jobb modellek közé tartozik, de főleg a MnII/MnII - MnIII/MnIII átmenet szempontjából. Komplexek tucatjait lehetne még bemutatni, azonban azok messze alulmúlják az enzim teljesítményét

[108,

109].

A

területen

dolgozó

tudósok

szerint

a

[MnIII2(µ-

O)(OH2)(OAc)benzimpn]+ (benzimpn = N,N,N’,N’-tetrakisz-(2-metilén-benzimidazoil)1,3-diamino-2-propanol) irányába érdemes további kutatásokat folytatni.

31

Irodalmi áttekintés A modellreakciók egyszerűségének és a téma divatosságának köszönhetően eltérő fémet tartalmazó vegyületekkel is szép számban találhatók kataláz utánzó reakciók. Az enzimatikus hatékonyság összehasonlítását a kobs pszeudo elsőrendű reakciósebességi állandó segítségével teszik. Különlegesebbnek mondhatóak a réztartalmú komplexek [106, 110], mivel erre a fémre H2O2 dizmutációval kapcsolatos biológiai vonatkozást ugyan még nem találtak, de láthatóan számos mesterséges vegyület képes ilyen reakciót katalizálni. A vastartalmú modellek száma már nagyságrendekkel nagyobb. Fellelhetőek hem típusúak és egyszerűbb felépítésű egy-, vagy kétmagvú komplexek is. A referenciák, és a 2. táblázatban látható adatok alapján elmondható, hogy kinetikai értékeik az enzimétől távol, szűkebb határokon belül mozognak, ami ideálissá teheti őket a lehetséges mechanizmus meghatározásra.

32

Célkitűzések

2. CÉLKITŰZÉSEK

Enzimekkel dolgozni, tisztítani, változtatni őket körülményes és drága feladat. Az enzimmodellezés, modellvegyületek készítésének célja egyértelműen a hatékonyabb, olcsóbb anyagoknak az előállítása. Célunk nem kizárólag túlszárnyalni az enzim hatásfokát – ami ugyan iparilag előnyösebb lenne –, hanem amennyiben éppen az ellenkezőjét érjük el a modell komplexeinkkel, abban az esetben lehetőségünk nyílik a mechanizmusuk felderítésére is. Egyszerű reakciókinetikai vizsgálatok alkalmazásával, olyan kérdésekre próbáltunk válaszokat találni, hogy az oxidoreduktáz enzimeknél hogyan történik a dioxigén aktiválás? Mi az oxigenáz és oxidáz aktivitás közötti kemoszelektivitás alapja? Milyen reaktív intermedierek játszanak szerepet az oxidáció során? Biokatalizátorokra lebontva, a következő feladatokat tűztük ki célul:

A fenoxazinon szintetáz enzim (PHS) esetén: Mind az enzim által, mind a modelljei által katalizált reakciók termékei gyógyszeriparilag

fontos

anyagok

(aktinomycin

D,

questiomycin

A).

Hatékony

előállításukhoz elengedhetetlenül szükséges a reakciómechanizmus pontos megismerése. A PHS ismert kofaktorait [111] és Simándi munkásságát alapul véve [17, 18], amelyek szerint a legkülönfélébb fémkomplexek, fémsók különösképpen Mn2+ képesek a fenti vegyületeknek a szintézisét katalizálni, csoportunk is előállított egy mangán(II)komplexet. Ligandumként

1,3-bisz-(6’-metil-2’-piridil-imino)-izoindolint

használtunk.

Az

előkísérletek alapján a komplex alkalmasnak bizonyult 2-amino-fenol oxidálására aminofenoxazinná enyhe körülmények között (40°C, levegőn). Kérdés, hogy milyen módon lehetséges az oxidáció mangán(II)ionok közreműködésével? Az oxidáció kezdeti lépésében (3, 4) ESR bizonyítékok vannak gyökök jelenlétére. Ezek szerepének tisztázására TEMPO szabadgyökkel végzett kísérletek kivitelezését tűztük ki célul.

33

Célkitűzések A pirokatechin oxidáz (CO) esetén: A kétmagvú réz központtal rendelkező enzim szerepe a melanin szintézis első lépései között van a tirozináz enzimmel együttesen. Az utóbbival szemben, azonban a CO csak monofunkciós. Jelenleg is aktuális kérdés, hogy a strukturális hasonlóságok ellenére mi okozhatja, hogy az egyikük fenolok oxigénezésére is képes? Segíthet-e a mechanizmus megismerésében más fémekkel alkotott komplexek vizsgálata, és mi a hatása különböző ko-ligandumok használatának? (Szemléltetve a fém koordinációs övezetét esetenként befolyásoló aminosavak szerepét.) A kérdések megválaszolására amino-ftalazin-tartalmú mangán, és benzoil-aceton-tartalmú réz komplexeket készítettünk. Célunk volt ezek részletes

spektroszkópiai

leírása,

aktivitásuk

összehasonlítása

és

lehetséges

reakciómechanizmusuk bemutatása.

A pirokatechin dioxigenázok (CTD) és metán-monooxigenázok (MMO) esetén: A bevezetőben megismertük működésüket, szerkezetüket, azonban a természetben a jelentőségük egyszerűen az aromás vegyületek lebontásában, vízoldható alifás vegyületekké alakításában van. Amíg Avogadro a „fürdőkádjában” mosakodott, Newton almafák alatt sétált, addig csoportunk pirokatechinek aminálásával próbálkozott ortoamino-fenolok előállítása céljából. A kísérletek során azonban, az oldószerként alkalmazott acetonitril oxidációját észleltük. A réz(I)-pirokatechinát-bipiridil komplex, amelyet katalizátorként kívántunk használni, olyan rendszert eredményezett, ami a két enzim közötti, oldószertől függő viselkedéssel azonosítható. A meglehetősen egyedi tulajdonság behatóbb vizsgálata enzimek szelektivitásának okára adhat magyarázatot: például, mi választja szét az intra-, és extradiolos hasítását pirokatechineknek, vagy mitől képes a pMMO csak kis szénatomszámú szénhidrogének oxidálására, míg sMMO párja ezt hosszabb és többféle vegyülettel is képes megtenni?

A kataláz esetén: Az oxidatív stressz elleni küzdelemben a legnagyobb szerepet a szuperoxiddizmutáz, kataláz és glutátion-peroxidáz enzimek kapták. Az utóbbi kettő a hidrogénperoxid dizmutációját katalizálja dioxigénné és vízzé. Számtalan reakciókinetikai vizsgálatot elvégeztek már a mechanizmus felderítése érdekében, azonban még nem 34

Célkitűzések sikerült olyan komplexet alkotni, amely minden szempontból megfelelt volna az elvárásoknak. Mivel az enzim a tömege révén túl nagy, így nem képes a sejtmembránon áthatolni. Ez kizárja a lehetőséget, hogy terápiás szerként használják például acatalasemia esetén. Mindemellett túl gyorsan végzi feladatát, ami a mechanizmusának megfigyelésénél jelent gondot. A modellek készítésének tehát két fontosabb célja is van. Egyrészt kis és hatékony bioutánzó vegyületek orvosolhatnák a terápiás nehézségeket, valamint „lassabb” komplexek által jobban megismerhetnénk a mechanizmust. A szakirodalomban csak kis számban találhatók réztartalmú modellek, ezért két – fenilglioxilsav-bipiridin

és

benzoesav-bipiridin

tartalmú

–

komplex

reakciókinetikai

vizsgálatával szándékozunk hozzájárulni a kutatásokhoz. Az összehasonlíthatóság érdekében egy már ismert ötfogú, L-prolin tartalmú ligandumot is felhasználtunk kétmagvú mangán komplex előállításához, valamint kinetikai vizsgálathoz.

35

Eredmények és értékelésük

3. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

3.1. PHS enzimmodellek

Ahogy az irodalmi betekintésben is említésre került, a fenoxazinon szintetáz enzim modellezésének a lényege az o-amino-fenol dimerizációs folyamatának megismerése (9). Egy enzimmodell felderítése a kinetikai módszereken belül nem csupán réz, vagy mangán komplexek előállításával és vizsgálatával lehetséges, hanem más indirekt módszerekkel is. Mivel a gyökös folyamat nem kizárható a dimerizáció kezdő lépéseként [17, 18], ennek bizonyítására szabadgyökök alkalmazása, mint például TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-1piperidinil-oxil) logikus megoldásnak tekinthető a kinetikai vizsgálatoknál.

3.1.1. A PHS enzim működési modelljei TEMPO szabadgyökkel [112, 113]

A fenoxazinon-szintetáz enzim modellezéséhez használt legáltalánosabb vegyület a 2-amino-fenol (OAP) (3). Ez TEMPO jelenlétében már szobahőmérsékleten is reagál molekuláris oxigénnel 2-amino-3H-fenoxazin-3-on (APX) (6) keletkezése mellett. A szerkezetileg hasonló fenazinszármazékok reakciómechanizmusa feltételezéseink szerint hasonló, így azok vizsgálatát az előbbivel párhuzamosan szándékozunk bemutatni. Az ofenilén-diamin (PDA) (13) csak 50°C-on vihető hasonló reakcióba megfelelő hozammal, 2,3-diamino-fenazin (DAP) (14) termék keletkezése mellett. A reakciókról elmondható, hogy szelektívek, az APX és DAP mellett más termékek jelenléte nem volt kimutatható. A keletkezett termékek koncentrációját UV-Vis spektroszkópiai, míg a felhasznált dioxigén mennyiségét gázvolumetrikus módszerrel (részletek: 4. fejezetben), a dioxigén-felvétel mérésén keresztül határoztuk meg. A reakciók sztöchiometriája a (9-10) egyenletek szerint írható le. NH 2 2

3/2 O2

N

NH2

O

O

+

OH

6

3

36

3 H 2O

(9)

Eredmények és értékelésük

NH 2

N

3/2 O2

NH2

2

+ NH 2

N

13

(10)

3 H 2O

NH2

14

A keletkező 2-amino-3H-fenoxazin-3-on-t (6) a betöményített reakcióelegyből, éterrel való „kicsapással” kaptuk, valamint olvadáspontja (254-256°C) és UV-Vis spektruma alapján azonosítottuk. A 2,3-diamino-fenazint (4) preparatív VRK módszerrel nyertük ki, benzol-aceton (1 : 1) eluens alkalmazása mellett, majd szintén jellegzetes UVVis spektruma alapján azonosítottuk. A reakciók sztöchiometriájának meghatározása után az oxidáció mechanizmusának tisztázása céljából részletes kinetikai vizsgálatokat végeztünk metanolban 25-50°C (OAP esetén) és 35-50°C (DAP esetén) tartományban. A reakciók időbeli lefutásának nyomon követésére az UV-Vis spektroszkópiai módszert alkalmaztuk. A termékek aktuális koncentrációját

a

Lambert-Beer-törvény

alapján

határoztuk

meg.

A

mérési

hullámhosszokban kicsi eltérés volt. Az APX termék abszorpciója metanolban λ = 435 nm (log ε = 4,20) volt, míg a DAP jellegzetes fényelnyelése λ = 430 nm, log ε = 4,22 abszorpciós koefficienssel. A kísérleteket 40 cm3 metanolban végeztük, a további körülmények pedig a 3-4. táblázatokban találhatóak. 3. táblázat. A 2-amino-fenol TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójának reakciókinetikai adatai

a

Mérés szám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Hőmérs. (°C) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 35 40 45 50

[OAP] (10-2 M) 5,00 7,00 9,00 11,00 11,00 11,00 11,00 11,00 11,00 11,00 11,00 11,00 11,00

[TEMPO] (10-2 M) 3,00 3,00 3,00 3,00 0,50 1,00 2,00 4,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00

k’ (10-6 s-1) 4,49 4,32 4,53 4,30 0,89 1,43 2,98 5,78 5,48 5,51 5,99 6,77 7,42

k (10-4 M-1 s-1) 1,49±0,02 1,44±0,04 1,51±0,05 1,43±0,08 1,78±0,07 1,43±0,04 1,49±0,05 1,45±0,07 1,52±0,06a 1,83±0,07 2,00±0,08 2,26±0,11 2,47±0,13

-d[OAP]/dt (10-7 M s-1) 2,25 3,03 4,08 4,73 0,98 1,58 3,28 6,36 6,03 6,06 6,59 7,45 8,16

levegőn k standard hibájának σ(k) számítása: σ(k) = (∑iwi(ki-k)2/(n-1)∑iwi)1/2, ahol wi = 1/σi2

37

Eredmények és értékelésük 4. táblázat. A fenilén-diamin TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójának reakciókinetikai adatai

a

Mérés szám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Hőmérs. (°C) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 45 40 35

[TEMPO] (10-1 M) 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83 0,50 1,00 1,17 0,83 0,83 0,83 0,83

[PDA] (10-1 M) 1,17 1,67 2,50 3,33 4,17 1,17 1,17 1,17 3,33 3,33 3,33 3,33

k’ (10-7 s-1) 2,66 3,01 2,93 2,45 2,70 1,95 4,04 4,33 2,42 1,92 1,06 0,78

k (10-6 M-1 s-1) 3,19±0,38 3,61±0,24 3,51±0,12 2,94±0,17 3,24±0,15 3,90±0,10 4,04±0,12 3,70±0,23 2,90±0,22a 2,30±0,07 1,27±0,05 0,94±0,04

-d[PDA]/dt (10-8 M s-1) 3,11 5,02 7,31 8,17 11,3 2,28 4,73 5,06 8,06 6,38 3,52 2,61

levegőn k standard hibájának σ(k) számítása: σ(k) = (∑iwi(ki-k)2/(n-1)∑iwi)1/2, ahol wi = 1/σi2 A 23. ábrán a 2-amino-fenol oxidatív kapcsolási reakciójában keletkező 2-amino3H-fenoxazin-3-on termékhez rendelhető abszorpciós sáv időbeli változása látható. A spektrum jól reprezentációja a kísérleti megfigyeléseknek. 2.50

↑

t

0.00 300

400

500

600

Hullámhossz (nm) 23. ábra Az OAP TEMPO-katalizált reakciójának időbeli lefutása (3. táblázat, 13. mérés) A 2-amino-fenol és az o-fenilén-diamin TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciói rendre a következő általános sebességi egyenletekkel írhatóak fel (11-12): -d[OAP]/dt = d 0,5[APX]/dt = k [OAP]m [TEMPO]n [O2]q

(11)

-d[PDA]/dt = d 0,5[DAP]/dt = k [PDA]m [TEMPO]n [O2]q

(12)

38

Eredmények és értékelésük Annak érdekében, hogy az egyes reaktánsok részrendjét meghatározzuk, a reakciókat különböző szubsztrátum és katalizátor koncentrációk mellett, illetve levegőn is elvégeztük. A kísérletek leegyszerűsítése érdekében látszólagos elsőrendű körülményeket teremtettünk, ami azt jelenti, hogy az egyes részrendek meghatározása során a másik reaktáns koncentrációját állandó értéken tartottuk. Feltételezve, hogy a katalizátor (TEMPO) és a dioxigén koncentrációja az egyes reakciók előrehaladtával nem változik, a sebességi egyenlet a következő formára egyszerűsödik mindkét reakciósorozat esetén (szubsztrátum = OAP = PDA): -d[OAP]/dt = k’ [OAP]m n

(13) q

ahol k’ = k [TEMPO] [O2]

(14)

A szubsztrátum részrendjének meghatározása a 24. ábrán látható, amelyen az OAP és PDA átalakulásának a sebességét a kiindulási koncentrációjuk függvényében ábrázolva megállapíthattuk, hogy a pontokra origóból induló egyenes illeszthető (R = 99,78 %, és R = 98,42 %), tehát azok részrendje egy, m = 1.

24. ábra Az OAP és PDA átalakulásának sebessége a kiindulási koncentrációjuk függvényében A katalizátor részrendjének megállapítása céljából, állandó szubsztrátum és dioxigén koncentráció mellett változtattuk a TEMPO kiindulási koncentrációját. Az észlelt reakciósebességi állandókat (k’) a TEMPO kiindulási koncentrációjának függvényében ábrázolva a 25. ábrán látható egyenesekhez (R = 99,85 % és R = 97,61 %) jutottunk, amely alapján elmondható, hogy a TEMPO részrendje is egy, tehát n = 1. 39

Eredmények és értékelésük

25. ábra Az OAP (balra) és PDA (jobbra) TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakcióinak észlelt sebesség (k’) értékei különböző TEMPO kiindulási koncentrációk függvényében A vizsgált reakciókat levegőn elvégezve (3-4. táblázat, 9. mérés) a számolt sebességi értékek alapján elmondható, hogy a reakciók sebessége független a dioxigén koncentrációjától, ami azt jelzi, hogy a dioxigénre vonatkozó részrend nulla. Állításunk alátámasztása céljából a reakció időbeli lefutását gázvolumetrikus módszerrel is nyomon követtük a dioxigén-felvétel mérésén keresztül. Eredményként a 26. ábrán feltüntetett egyeneshez jutottunk, amely egyértelműen jelzi, hogy a reakció dioxigénre nézve nulladrendű, tehát q = 0. A PDA reakciók során ugyanezeket tapasztaltuk.

26. ábra A 2-amino-fenol TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójában észlelt dioxigén-2 felvétel [OAP]0 = [TEMPO]0 = 3,50 × 10 M; T = 323 K A kinetikai mérések eredményei alapján elmondható, hogy a 2-amino-fenol és ofenilén-diamin TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciója bimolekulás sebességi 40

Eredmények és értékelésük egyenletekkel írható le, amelyben a szubsztrátum és a TEMPO koncentrációja egyes hatványon szerepel. A reakciósebességi egyenletből számolt reakciósebességi állandó -4

-1

3

-1

értéke OAP kísérleteknél 298 K-en k = (1,49 ± 0,02) × 10 mól dm s -nek, PDA esetén -6

-1

3 -1

323 K-en k = (3,60 ± 0,13) × 10 mól dm s -nek adódott. A sebességi állandó átlagának számítása: k = (∑iwiki/∑iwi). A 25. ábrán látható egyenesek meredeksége jó közelítéssel szintén ezeket az értékeket adja, vagyis a gyakorlati adatok alátámasztják az elméleti számolásokat. A két reakciósorozatot azonos hőmérsékleten összehasonlítva a 2-amino-fenol -4

-1

3

-1

oxidációja során kapott érték 323 K-en k = (2,47 ± 0,13) × 10 mól dm s , vagyis az utóbbi nagyságrendekkel nagyobb. A különbség oka az O–H és N–H kötések erősségében keresendő. Az irodalomból ismeretes, hogy a 2-amino-fenol acetonitrilben, levegőn 2-aminofenoxazin-3-on-ná alakul át lassú autooxidációs reakció eredményeként [114]. A reakciókinetikai mérések eredményeként a szerzők egy bimolekulás sebességi egyenlethez jutottak (-d[OAP]/dt = kaut [OAP] [O2]), amelyből a reakciósebességi állandó értéke -8

-1

3 -1

szobahőmérsékleten kaut = (1,46 ± 0,03) × 10 mól dm s -nek adódott. Az autooxidációs reakcióra kapott értéket összevetve az általunk vizsgált rendszerre kapott értékkel, elmondható, hogy a TEMPO-katalizált reakció nagyságrendekkel nagyobb sebességgel játszódik le. A különbség a sebesség-meghatározó lépésben történő H• absztrakcióval magyarázható, amit a katalizátor jelentősen elősegít. Különböző hőmérsékleten meghatározva a reakciósebességi állandókat, az

Arrhenius (27. ábra) és Eyring (28. ábra) összefüggések lineárisnak adódtak, jelezve, hogy a reakciók a vizsgált hőmérséklettartományban azonos mechanizmus szerint játszódnak le. A fenti összefüggésekből számolt aktiválási paraméterek a következők az OAP rendszer esetén: -1

EA = 17 ± 0,5 kJ mól , -1

∆H‡ = 15 ± 0,3 kJ mól , -1

-1

∆S‡ = -268 ± 0,3 J mól K .

41

Eredmények és értékelésük A PDA rendszer esetén: -1

EA = 76 ± 11 kJ mól , -1

∆H‡ = 74 ± 10 kJ mól , -1

-1

∆S‡ = -122 ± 31 J mól K .

27. ábra Az OAP (balra) és PDA (jobbra) TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakcióinak Arrhenius diagramjai

28. ábra. Az OAP (balra) és (jobbra) PDA TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójának Eyring diagramjai Az Arrhenius diagramról az egyenesek meredekségének értéke –EA/R -rel egyenlő, ahol R az egyetemes gázállandó (8,314 J K-1 mól-1) EA pedig az aktiválási energia. Az

Eyring diagramról az aktiválási entalpia és entrópia értékeket lehet meghatározni, mégpedig az elsőt a meredekség alapján, ami –∆H‡/R -rel egyenlő. Az ordináta metszet 42

Eredmények és értékelésük értéke = ln(kB/h) + ∆S‡/R segítségével pedig a második adódik (kB = 1,38 × 10-23 J K-1 Boltzmann és h = 6,626 × 10-34 J s Planck állandók). Az elvégzett reakciókinetikai méréseket kiértékelve, az aktiválási paraméterek figyelembevételével, a reakciókra javasolt mechanizmus a (15-18) egyenletek alapján foglalható össze. A megállapítások a PDA rendszerre is igazak a megfelelő behelyettesítéssel. NH 2 +

TEMPO

NH 2

K1

H O

N O

OH

3

+

+

16

NH O

(16)

NH 2 +

O

17 OAP

TEMPOH

O

NH

k 4 (gyors)

O

16

O

NH

k 3 (gyors) 17

NH2

17

TEMPO

O

2

(15)

15

NH2

16

NH 2

k 2 (lassú) -TEMPOH

3

H H N

NH 2

OH

O

4b N

NH 2

O

O

6

(17)

OH

O2 -2H+ -2e

N

NH2

OH

O

5b

(18)

O2 -2H+ -2e

Feltételezésünk szerint TEMPO jelenlétében a szubsztrátum hidroxilcsoportja és a gyök oxigénje között hidrogénhíd kötésen keresztül, egyensúlyi folyamatban egy molekulakomplex 15 jön létre (K1). A reakció leglassúbb, úgynevezett sebességmeghatározó lépése a hidrogénatom átmenete a szubsztrátumról a gyökre, amely eredményeként 2-amino-fenoxil gyökhöz (16) jutunk. Az entrópia nagy negatív értéke összhangban van a javasolt bimolekulás sebességi egyenlettel. Ezt követően az obenzokinon-monoimin (17) képződése kétféle úton vezethető le: a 2-amino-fenoxil gyök és a TEMPO gyök-gyök reakciójával, illetve a 2-amino-fenoxil gyök diszproporcionálódásán keresztül, amelyek gyors folyamatok. A képződő o-benzokinon-monoimin stabilitása kicsi, így gyors folyamatban kétszer két elektron oxidációs lépésben tovább alakul a termékké, 2amino-fenoxazin-3-on-ná (6) az irodalomban leírt lépéseken keresztül [6, 11]. A javasolt mechanizmus alapján (feltételezve, hogy k1 << k-1, k2) a 15 átmeneti termék keletkezését és továbbreagálását a (19-20) egyenletek fejezik ki: 43

Eredmények és értékelésük d[15]/dt = k1 [OAP][TEMPO]

(19)

- d[15]/dt = k-1 [15] + k2 [15]

(20)

A stacioner állapot elve alapján (felhasználva, hogy Σ[OAP] = [OAP] + [15]) a (19) és (20) egyenletek egyenlővé tehetők, amely megoldásával a reakció sebességi egyenlete a következő formában adódik (21):

-

d[OAP] dt

=

K 1k 2[OAP][TEMPO] k2/k -1 + 1 + K 1[TEMPO]

= k [OAP][TEMPO]

(21)

Az általunk javasolt mechanizmus alapján a k2/k-1 és a K1[TEMPO] << 1, így elhanyagolhatóak. Ennek eredményeként egy bimolekulás sebességi egyenlethez jutunk, amelyet a reakciókinetikai mérések eredményei is alátámasztanak.

3.1.2. A PHS enzim modellezése mangántartalmú komplexszel [115] A

fenoxazinon

szintetáz

reakciójának

TEMPO-val

történő

modellezése

meglehetősen különálló eset a téma irodalmában. A legtöbb próbálkozás természetesen a különböző fémkomplexek előállítása és tesztelése irányában történt. Kobalt-, [17] vas-, [116] kétmagvú mangán-, [18] valamint – a csoportunk által – rézkomplexekkel [117] végzett kísérletek már dokumentálva vannak. Ezekhez kapcsolódóan (6’-MeIndH) = 1,3bisz(6’-metil-2’-piridil-imino)-izoindolin (18) ligandummal [118] előállított egymagvú mangánkomplex (22) PHS utánzó reakcióját mutatjuk be. (Részletek a kísérleti fejezetben.) A Mn2+ ismert katalizátora (kofaktora) az enzimnek komplex és só formában is [111].

N

N + MnII(ClO 4) 2 6 H 2O

NH N

N

CH 3CN NEt3, Ar

[Mn(6'-MeIndH)(H2 O) 2(CH 3CN)](ClO 4) 2

(22)

19

18

A 19 komplex összetételének és szerkezetének meghatározása elemanalízis és spektroszkópiai mérések alapján történt (előállítási részletek 4. fejezetben találhatóak). Mivel röntgendiffrakciós szerkezet nem áll rendelkezésünkre, így az elemzéskor észlelt 44

Eredmények és értékelésük fizikai jellemzők a már ismert, hasonló ligandumot tartalmazó réz(II)komplex [119] adataival lettek feltüntetve az 5. táblázatban az összehasonlíthatóság érdekében. 5. táblázat. A 19 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai

Komplex Szín Olvadáspont (°C) IR (KBr; cm-1) UV-Vis (DMF)

[Mn(6’-MeIndH)(H2O)2]2+ citromsárga 286-289 3450 (OH), 3336, 2300 (CN), 1657, 1634, 1099 (ClO4) log ε370 = 4,40

[CuII(fla)(Ind) [119] zöld 306-308 1636, 1574, 1001 log ε334 = 4,23

Az alkalmazott ligandum egy érdekes szerkezeti sajátsága, hogy komplexképzésben mind semleges, mind deprotonált formában is részt vehet. Az infravörös spektrumban 3334 cm-1-nél és 1600 cm-1 felett jelentkező két intenzív sáv (1657, 1634 cm-1) a koordinálódó, deprotonált formára utalnak, azonban pontosan nem lehet meghatározott rezgéshez hozzárendelni őket. Legnagyobb valószínűséggel az imino-, és 2-piridilcsoportok csatolt rezgéseiről van szó. A 2300 cm-1-nél található a kristály növesztésénél használt és koordinálódó acetonitril ν(CN) rezgése. Az 1099 és 625 cm-1 a nem koordinációs övezethez tartozó perklorát-ionok tipikus antiszimmetrikus rezgései. Koordináció esetén a 930 cm-1 hullámszámnál jelentkeznének [120, 121]. Az előző fejezetben leírtakkal azonos technikával, ezúttal DMF oldószerben tanulmányoztuk az o-amino-fenol oxidatív kapcsolási reakcióját (9) a 19 komplex jelenlétében. Az utóbbiból katalitikus mennyiséget használtunk (1 : 5-200 arányban), valamint a kísérleteket különböző dioxigén koncentrácóban is elvégeztük. A V0 értékek az időegység alatt keletkező APX mennyiségét mutatják. A termék fényelnyelési sávja DMFben kicsit eltér a metanolban mértektől, λ = 433 nm (log ε = 3,74). A 6. táblázat részletesen mutatja a reakciókinetikai eredményeket. A reaktánsok részrendjének megállapítása során, a szubsztrátum esetén Michaelis-

Menten-típusú telítési görbét kaptunk (29. ábra). Ebből arra lehet következtetni, hogy az oxidáció elején egy átmeneti komplex-szubsztrátum rendszer képződik az előegyensúlyi lépésben, és az irreverzibilis OAP oxidáció a sebesség-meghatározó lépése a katalitikus ciklusnak.

45

Eredmények és értékelésük 6. táblázat. A 19 komplex által katalizált OAP oxidáció kinetikai adatai (levegőn, 40°C-on, DMF oldószerben) Mérés szám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

[O2] (10-3 M) 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 2,69 5,40

[Mn] (10-4 M) 1,67 1,67 1,67 1,67 1,67 1,67 0,17 0,83 1,25 2,50 1,67 1,67

[OAP] (10-3 M) 1,67 4,17 8,33 12,50 16,60 25,00 12,50 12,50 12,50 12,50 12,50 12,50

V0 (10-8 M s-1) 3,27 6,99 7,61 9,66 10,58 10,65 0,91 6,41 9,10 19,30 18,11 35,73

29. ábra Az OAP [Mn(6’-MeIndH)(H2O)2(CH3CN)](ClO4)2-katalizált oxidatív kapcsolási reakció sebességi állandóinak értékei különböző szubsztrátum kiindulási koncentrációk függvényében Adataink elemzéséhez, és a kinetikai állandók kifejezéséhez az enzimeknél is alkalmazott Michaelis-Menten modellt használtuk fel. Az elméletileg elérhető maximális sebesség (Vmax) és a szubsztrátum enzim irányában (ez esetben katalizátor felé) mutatott affinitását kifejező KM (Michaelis állandó) értékét a Lineweaver-Burk (vagy dupla reciprok) diagram segítségével határoztuk meg (30. ábra). Ennek érdekében a reakciósebességi

állandók

reciprokát

a

szubsztrátumkoncentráció

reciprokának

függvényében ábrázolva egy egyeneshez jutunk. Az egyenes metszéspontjának az értéke az x-tengelyen -1/KM-mel egyenlő, amelyből KM = 5,13 × 10-3 M. Az y-tengelyen a 46

Eredmények és értékelésük metszéspont 1/Vmax, amelyből Vmax = 1,35 × 10-7 M s-1. A katalitikus aktivitás, vagy „turn over” a Vmax/ET-ből (ET ez esetben az aktív katalizátor koncentrációja: 1,67 × 10-4 M) számolható: kcat = 0,81 × 10-3 s-1. Végül, a kcat/KM = 0,16 M-1 s-1 értéke mutatja az „enzim” hatékonyságot, azaz az időegység alatt a katalizátor által átalakított szubsztrátum mennyiséget.

30. ábra Az OAP [Mn(6’-MeIndH)(H2O)2(CH3CN)](ClO4)2-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójának Lineweaver-Burk diagramja A katalizátor és dioxigén részrendjének meghatározása során mindkét esetben első rendet tapasztaltunk (31, 32. ábra). Az utóbbi kivitelezése érdekében eltérő összetételű dioxigén-argon atmoszférában végeztük a kísérleteket. Az egyenesek regressziója rendre: 97,02 % és 99,57 %.

32. ábra Az OAP [Mn(6’-MeIndH)(H2O)2(CH3CN)](ClO4)2-katalizált oxidatív kapcsolási reakció sebességi állandóinak értékei különböző katalizátor kiindulási koncentrációk függvényében 47

Eredmények és értékelésük

33. ábra Az OAP [Mn(6’-MeIndH)(H2O)2(CH3CN)](ClO4)2-katalizált oxidatív kapcsolási reakció sebességi állandóinak értékei különböző dioxigén koncentrációk függvényében Mindezek után a kinetikai adatok alapján javaslatot tettünk a reakció mechanizmusára (23-30). Az ábrázolt reakciósorozat szerint az előegyensúlyi lépésben az OAP komplexet képez a [Mn(6’-MeIndH]2+-val (23). Ez a rendszer dioxigén jelenlétében MnIII komplexszé alakul (24), ami a sebességmeghatározó lépésben o-amino-fenoxil gyököt eredményez (25). Ez, a TEMPO-katalizált reakcióhoz hasonlóan, benzokinonmonoiminné (BQMI) bomlik (26), ami végül 2 × 2 e--os oxidációval APX-ná alakul. [MnII(6'-MeIndH)] 2+ + OAP [MnII(6'-MeIndH)(OAP)]+ + O2 [MnIII(6'-MeIndH)(OAP)(O2)]+ [MnIII(6'-MeInd)(O2H)]+ + OAP

K1 K2 k cat (lassú)

[MnII(6'-MeIndH)(OAP)]+ + H+

(23)

[MnIII(6'-MeIndH)(OAP)(O2)]+

(24)

[MnIII(6'-MeInd)(O2H)]+ + OAP

(25)

[MnIV(6'-MeInd)(O)]+ + BQMI + H2O

(26)

[MnIV(6'-MeInd)(O)]+ + OAP

[MnII(6'-MeInd)]+ + BQMI + H2O

(27)

[MnII(6'-MeInd)] + + H+

[MnII(6'-MeIndH)] 2+

(28)

2OAP

(29)

BQMI

48

Eredmények és értékelésük

NH

OAP

O

BQMI

N

NH2

O

O

HH N

O2

NH2

OH -2H+ O 2 -2e N

O

OH

O

-2H+ -2e

(30) NH2

Összegezve az általunk bemutatott PHS modelleket, és néhány rézkomplex eredményeit is figyelembe véve [117] azt tapasztaltuk, hogy a fémek redoxaktív sajátsági nagymértékben befolyásolják a reakciót. Szerepük a meglehetősen reaktív OAP• gyök képződésének inicializálásában van. Ennek a gyöknek a részvételét TEMPO szabadgyök katalizátorként való alkalmazásával igyekeztünk bizonyítani.

3.2. A pirokatechin oxidáz (CO) enzim modelljei

Pirokatechinek szubsztrátumként

oxigénezési

nem

pirokatechint,

és

oxidációs

hanem

annak

reakcióinak

vizsgálatakor

szubsztituált

származékait,

leggyakrabban a 3,5-di-terc-butil-pirokatechint (DBCatH2 20) használnak. Egyrészt a tercbutil-csoportok elektronküldő hatása kedvez az oxidációs reakciónak, valamint az oxidáció során képződő 3,5-di-terc-butil-o-benzokinon (DBQ 21) Diels-Alder típusú dimerizációját is megakadályozzák (31).

OH OH

O2

O

Cu, Mn

O

+

20

H 2O (H2O2)

(31)

21

Az enzimreakció modellezésére benzoil-aceton tartalmú Cu(II)-, és aminoftalazin tartalmú

Mn(II)-komplexeket

állítottunk

elő

és

meghatároztuk

szerkezetüket

spektroszkópiai módszerekkel. A rézvegyület esetén röntgenszerkezet meghatározásra alkalmas kristályokat is sikerült produkálnunk.

49

Eredmények és értékelésük 3.2.1. A Cu4(bnac)4(µ-EtO)4 előállítása, szerkezete és katalitikus hatása a di-terc-butilpirokatechin oxidációjára [122]

Csoportunk évek óta foglalkozik a pirokatechin oxidáz enzim modellezésével. A legkülönfélébb réz(I)- [123], réz(II)-, és cinkkomplexeket [124] állították elő és részletes reakciókinetikai elemzésnek vetették alá. Folytatva a sorozatot, a címszereplő enzim mechanizmusáról további ismeretek megszerzése érdekében egy négymagvú komplexet 23 állítottunk elő, amely jó funkcionális modellnek bizonyult. Ligandumcsere reakciókkal,

para-helyen

szubsztituált

piridinszármazékok

felhasználásával,

dimer

szerkezetű

komplexeket kaptunk. Ezek lehetőséget adtak különböző elektronszívó és elektronküldő funkciós csoportok reakciósebességet befolyásoló hatásának vizsgálatára. A 23 vegyület előállítása 1-1 mmól benzoil-aceton (bnacH) (22) és dimetoxi-réz(II) – Cu(OMe)2 – etanolos oldatának összekeverésével történt. Az elegyet 70°C-on, 2 órán keresztül kevertettük (32). (Részletek a kísérleti fejezetben) O

O EtOH + Cu(OMe) 2

22

[Cu 4(bnac)4(µ -OEt)4]

(32)

23

A terméket oldatából, lassú kristályosítással kaptuk (34. ábra). Összetételét, fizikai tulajdonságait elemanalízissel és spektroszkópiai módszerekkel is meghatároztuk (7. táblázat). A szerkezetből származó fontosabb kötésszögeket és kötéstávolságokat a 8. táblázat tartalmazza.

34. ábra A Cu4(bnac)4(µ-EtO)4 komplex röntgendiffrakciós képe 50

Eredmények és értékelésük 7. táblázat. A 23 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai Komplex Szín Olvadáspont (°C) IR (KBr; cm-1) UV-Vis (DMF) Elemanalízis (számított) Elemanalízis (mért)

[Cu4(bnac)4(µ-EtO)4] sötétzöld 189-191 1589 (C=O), 1517 (C=C) log ε256 = 4,78; log ε322 = 4,83; log ε665 = 2,20 C: 53,40; H: 5,20 C: 53,60; H: 5,00

8. táblázat. Fontosabb kötésszögek és kötéstávolságok a 23 komplexben Atompár Cu1–Cu2 Cu1–O1 Cu1–O2 Cu1–O3 Cu1–O6 O1–C7 O2–C9 Kötés O1–Cu1–O2 O1–Cu1–O3 Cu1–O3–Cu2

Kötéshossz (Å) 3,286 1,916 1,910 1,935 2,401 1,275 1,278 Kötésszög (°) 93,52 94,12 97,96

Atompár Cu2–O3 Cu2–O4 Cu2–O5 Cu2–O6 O4–C19 O5–C21

Kötéshossz (Å) 2,402 1,913 1,911 1,960 1,271 1,257

Kötés O4–Cu2–O5 O6–Cu2–O6 Cu1–O6–Cu2

Kötésszög (°) 93,23 80,12 95,40

Az elemanalízis során számított és mért értékek jó egyezése azt mutatja, hogy a termék összetétele megfelel a 23 komplexének. Az IR spektrumban azonosított legfontosabb, jellegzetes vegyértékrezgések az 1589 cm-1 ν(CO) karboxilát és 1517 cm-1 ν(CC) aromás gyűrűhöz rendelhetőek. Összehasonlításként, a Cu(acac)2 (acac = acetil-aceton) komplex megfelelő rezgései 1578 és 1528 cm-1-nél találhatóak [125, 126]. Az UV-látható tartományban 23 fényelnyelése a 250-330 nm intervallumba esik. A tipikusan 300-400 nm között jelentkező ligandum-fém töltésátviteli sáv [127] a 322 nm hullámhosszú fényelnyeléshez, míg a 256 nm-nél látható abszorpciós sáv a O
Cu(II) átmenethez rendelhető. 665 nm-nél csak egy nagyon gyenge fém d-d átmenet jelentkezik. Szerkezetét tekintve a 23 komplex egy dimer dimerje. A négy rézcentrum között etoxo hidak biztosítják a kapcsolatot. Minden fémközpont körül a koordinációs övezet torzult négyzet alapú piramis formájú. (τ = 0,04 [128]) Az alapsíkot a benzoil-aceton oxigén atomjai, és két etoxi-csoport adja. A kötések távolsága minden esetben ~ 1,92 Å. Axiális helyzetben még egy etoxi-csoport koordinálódik, meglehetősen hosszabb

51

Eredmények és értékelésük kötéstávolsággal ~ 2,40 Å-mel. Az átlagos Cu – Cu távolság 2,99 Å. A röntgendiffrakciós szerkezet-meghatározásból származó információkat a 9. táblázatban foglaltuk össze. 9. táblázat. A 23 komplex krisztallográfiai adatai Komplex Összegképlet Szín Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport

Elemi cella méretei Elemi cella térfogata Kristály méretei Z Sűrűség (számított) Abszorpciós koefficiens F(000) Index tartományok Gyűjtött reflexiók Megfigyelt reflexiók száma Végső R [I>2σ(I)] A

Cu4(bnac)4(µ-EtO)4

[Cu4(bnac)4(µ-EtO)4] Cu4O12C48H56 sötétzöld 1079,14 g/mól 293 K Mo-Kα (λ = 0,71073 Å) monoklin C 2/c a = 13,3980 Å α = 90,00° b = 14,6080 Å β = 103,41° c = 25,7460 Å γ = 90,00° 4901,59 Å 0,30 mm × 0,15 mm × 0,15 mm 8 1,23 g/cm3 0,92 mm-1 1912 0 ≤ h ≤ 19 0 ≤ k ≤ 20 -25 ≤ l ≤ 25 6149 4419 R1 = 0,0688 , wR2 = 0,2083

katalitikus

hatását

a

3,5-di-terc-butil-pirokatechin

oxidációjára reakciókinetikai méréssorozatokkal vizsgáltuk 30 cm3 etanol oldószerben, 40°C-on. A kísérletek kivitelezése a fenoxazinon-szintetáz enziméhez hasonlóan történt. (Részletek a kísérleti fejezetben.) A különbség annyi, hogy a szubsztrátumot a piridinnel és a katalizátorral argon alatt előkészítettük, a reakció időbeli lefutását pedig a levegő hozzáadásának pillanatától mértük. A DBQ képződését UV-Vis spektroszkópiával követtük nyomon 400,50 nm hullámhossznál (log ε = 3,21). A (31) egyenlet alapján a reakciókörülményektől függően a végtermékek víz, vagy hidrogén-peroxid lehetnek. A spektroszkópiai mérésekkel párhuzamosan jodometrikus titrálást végezve (35. ábra) úgy találtuk, hogy a mi esetünkben a képződő melléktermék H2O2. Más termék jelenlétét nem tapasztaltuk.

52

Eredmények és értékelésük

35. ábra A DBCatH2 oxidációja 23 jelenlétében. Reakciókörülmények: [Cu4] = 5,00 × 10-4 M; [DBCatH2] = 4,90 × 10-2 M; levegő, 40°C; 30 cm3 EtOH A

kezdeti

reakciósebességek

nyomon

követésével

az

egyes

részrendek

meghatározása érdekében különböző szubsztrátum, katalizátor, piridin és dioxigén koncentráció alkalmazásával végeztünk kísérleteket. Megvizsgáltuk továbbá a piridin hatását katalizátorral és nélküle is. Mindezen eredmények és a kísérleti körülmények a 10. táblázatban találhatóak. Az átlagos katalizátor-szubsztrátum arány 1:100 volt. Rézre vonatkoztatva 20 ekvimoláris mennyiségű piridin és származékainak felhasználásával a sebességeket radikálisan sikerült növelni, ezért minden kísérletnél alkalmaztuk őket. 10. táblázat. A 23 komplex által katalizált DBCatH2 oxidáció kinetikai adatai (levegőn, 40°C-on, EtOH oldószerben) Mérés szám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

[O2] (10-3 M) 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13

[Cu4] (10-4 M) 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,21 0,42 1,67 2,50 3,33 0,85 0,85 0,85 0,85

[DBCatH2] (10-3 M) 2,50 4,17 5,83 8,33 12,50 16,67 20,83 25,00 35,00 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50

53

[Py] (10-3 M) 1,70 1,70 1,70 1,70 1,70 1,70 1,70 1,70 1,70 0,42 0,84 3,34 5,00 6,66 0,83 1,67 3,33

V0 (10-7 M s-1) 1,14 1,17 1,81 2,30 2,93 3,26 3,59 3,99 4,80 1,75 1,95 4,42 6,11 7,04 1,33 3,08 3,65 3,96

Eredmények és értékelésük 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 2,69 5,40

0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85

8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50 8,50

5,00 6,67 8,33 19,68 32,47 49,60 78,08 106,61 1,70 1,70

4,32 5,34 5,86 9,04 12,69 15,00 17,42 19,42 4,41 7,89

36. ábra A DBCatH2 oxidáció sebességének függése a piridin koncentrációjától 23 jelenlétében (10. táblázat 15-26 mérés)

37. ábra A DBCatH2 oxidáció sebességének alakulása a Cu4(bnac)4(µ-EtO)4 koncentráció gyökének függvényében (10. táblázat 10-14 mérés)

54

Eredmények és értékelésük

38. ábra A DBCatH2 oxidáció sebességének változása a szubsztrátum koncentráció függvényében (10. táblázat 1-9 mérés) és a Lineweaver-Burk diagram A DBCatH2 oxidációjának függése a piridin koncentrációjától telítési görbét eredményezett mutatva, hogy a piridin szerepe nem merül ki csupán bázicitásában, hanem mint társ-ligandum, erős hatással van a rézközpontok elektronsűrűségére is. Szerepének pontosabb megismerése érdekében megvizsgáltuk, hogy hogyan történik az oxidáció csak a piridin, vagy csak a katalizátor, vagy mindkettő jelenlétében. A piridint 2,6-di-terc-butilpiridinre cserélve (kihasználva a terc-butil csoportok sztérikus gátlását) kisebb reakciósebességet kaptunk, ami által a koordináció létrejöttéről bizonyosodhattunk meg (39. ábra).

39. ábra A DBCatH2 oxidáció sebességének változása: (×) 20 ekvimoláris piridin jelenlétében, katalizátor nélkül; (●) Cu4(bnac)4(µ-EtO)4-vel piridin nélkül; (■) 20 ekvimoláris 2,6-diterc-butil-piridin és katalizátor jelenlétében; (▲) 20 ekvimoláris piridin és katalizátor jelenlétében

55

Eredmények és értékelésük A kísérletek elvégzése után kialakult képet a négymagvú Cu4(bnac)4(µ-EtO)4 komplex dimerré disszociálásáról piridin és származékainak hatására, a 40. ábrán bemutatott módon lehet elképzelni. L: 4R-py (R: NMe2; NH2; Ph; H; CN; OAc) Ph

O O Cu EtO

OEt

Cu EtO

O

Cu O

Ph

Cu O Et

O

L

O

Ph

L

Ph 8L O

2

O

Cu

O O

Ph

O

Et O

Cu O Et L

O

L

24

Ph

[Cu4(bnac)4( µ -OEt)4] + 8(4R-py) = 2 [Cu2(bnac)2( µ-OEt) 2(py)4] 40. ábra A piridin és származékainak hatására bekövetkező szerkezeti változás a 23 komplexben A komplex részrendjének meghatározásánál (37. ábra) arra 1/2 értéket kaptunk (R = 98,08 %). Ez szintén disszociatív mechanizmusra utal, vagyis jó bizonyítékul szolgál az előbbiekhez. A DBCatH2 részrendjére kapott Michaelis-Menten-típusú telítési görbe (38. ábra), az OAP mangán-katalizált oxidációjánál tapasztaltakhoz hasonlóan a szubsztrátum koordinációját jelzi. A Lineweaver-Burk diagramról leolvasható értékek Vmax = 1,35 × 10-7 M s-1 és KM = 5,13 × 10-3 M. A katalitikus aktivitás kcat = 5,66 × 10-3 s-1, amelyből az időegység alatt átalakított szubsztrátum mennyiség kcat/KM = 0,64 M-1 s-1-nek adódik. Órában kifejezve a katalitikus aktivitást az érték 20,40 h-1, ami a Krebs és csoportja által publikált értékek intervallumába esik [34] (4-214 h-1), azonban jóval alacsonyabb Monzani [129] kcat = 1188 h-1 értékénél. A pirokatechin koordinációját a katalizátorhoz nem csupán annak részrendje sejteti. 3,4,5,6-Tetra-kloro-pirokatechint (Cl4CatH2) adva a reakcióelegyhez teljesen megáll az oxidációs reakció. Ez annak köszönhető, hogy az utóbbi vegyület jó koordinációs képessége révén kiszorítja a DBCat-ot, valamint kis reaktivitása miatt további termékképződést sem lehet tapasztalni. A kinonképződést, és a 600 másodpercnél 56

Eredmények és értékelésük hozzáadott tetra-kloro-pirokatechin miatt bekövetkezett inhibíciót a 41. ábrán lehet nyomon követni. Összehasonlításként látható ▲-gel jelölve a reakció normális haladása, valamint az, hogy mi történik (●), ha Cl4CatH2 jelenlétében végezzük az oxidációt.

41. ábra A DBCatH2 oxidációja Cu4(bnac)4(µ-EtO)4 jelenlétében, és annak inhibíciója tetra-kloropirokatechin hatására. (●) [Cu4(bnac)4(µ-EtO)4] = 0,85 × 10-4 M, [py] = 1,70 × 10-3 M, [Cl4CatH2] = 8,50 × 10-3 M; (■) [Cu4(bnac)4(µ-EtO)4] = 0,85 × 10-4 M, [py] = 1,70 × 10-3 M, [DBCatH2] = 8,50 × 10-3 M, + [Cl4CatH2] = 8,50 × 10-3 M 600 másodpercnél; (▲) [Cu4(bnac)4(µ-EtO)4] = 0,85 × 10-4 M, [py] = 1,70 × 10-3 M, [DBCatH2] = 8,50 × 10-3 M A reakciókinetikai vizsgálatokat különböző dioxigén koncentrációnál is elvégeztük. Ezek alapján a dioxigén egyes részrenddel szerepel a sebességi egyenletben (R = 98,27 %).

42. ábra A DBCatH2 oxidáció sebességének függése a dioxigén koncentrációjától 23 jelenlétében (10. táblázat 4, 27-28 mérés)

57

Eredmények és értékelésük A 23 komplex önmagában kevésbé jó katalizátora a DBCatH2 oxidációjának, azonban különböző piridinszármazékok és azok para helyzetben levő funkciós csoportjai erős hatással vannak a fém elektronsűrűségére, az pedig az oxidáció lefolyására. A 40. ábrán felsorolt 4R-piridin származékokat felhasználva megvizsgáltuk azok sebesség befolyásoló képességét normál piridinhez viszonyítva (11. táblázat és 43. ábra). 11. táblázat. A 23 komplex által katalizált DBCatH2 oxidáció kinetikai adatai különböző piridin származékok jelenlétében (levegőn, 40°C-on, EtOH oldószerben) Ligandum

σ

4Me2N-py 4H2N-py 4Ph-py py 4OAc-py 4CN-py

-0,83 -0,66 -0,01 0 0,50 0,66

reakcióidő (min) 100 100 100 100 100 100 100

Vx (106 s-1) 1,21 1,27 0,75 0,43 0,38 0,26

Konverzió (%) 8,2 66,4 67,8 45,8 23,8 22,4 16,9

43. ábra A piridinre vonatkoztatott sebességi érékek a 4R-py származékok Hammett állandóinak függvényében A Hammett para szubsztituens állandó σ értékei a különböző funkciós csoportok elektronszívó és elektronküldő hatásait fejezik ki számszerűsítve. A tény, hogy egy egyenest kaptunk a piridinre vonatkoztatott relatív sebességi állandók ábrázolásával a σ konstansok függvényében azt mutatja, hogy ezek a hatások érzékenyen befolyásolják a rézközpontok elektronsűrűségét, így annak elektronátviteli képességét a DBCatH2 oxigénjei felé. A másik információ, ami az egyenesből nyerhető az a meredeksége, ami a ρ = -0,45 értéket adja. Ez a Hammett ρ reakció állandó, aminek negatív jellege azt mutatja, hogy az elektronküldő csoportok növelik a reakciók sebességét. 58

Eredmények és értékelésük Az enzim központjával összehasonlítva a kétmagvú komplexünket megállapítható, hogy a rézionok közötti távolság (3,29 Å) határozottan az enzim met (2,87 Å) és dezoxi (4,40 Å) állapota között van [28]. Ez a távolság ideális arra, hogy a DBCatH2 koordinációja létrejöjjön, és az oxidáció lejátszódhasson. A hisztidinekből származó nitrogénnel teli környezet ugyan nem azonos, de az eredmények alapján úgy tűnik, hogy a könnyen kapcsolódó piridinek képesek pozitívan befolyásolni a rézionok elektrokémiai tulajdonságait, kialakítva a kívánt funkcionalitást. Figyelembe véve a fontos Cu(II)–Cu(II) távolságot, és a reakciókinetikai méréseket is felhasználva, a javasolt mechanizmus szerint a pirokatechin egy irreverzibilis gyors lépésben Cu(I)–Cu(I) komplex magot formál 25. Az irodalomból ismert dioxigén-komplex 26 egy gyors előegyensúlyi reakcióban képződik, ami a sebességmeghatározó lépésben a második DBCatH2-val reagálva 27 vegyületet eredményezi, végül a további reakcióra képtelen termékeket 28, 21 adja.

L O

CuII

O Ph

L

O

Et O

CuII

O

HO

O

O Et

+

L

Ph

L

Ph

L

CuI

HO

L

Ph

CuI

O Et

O

L

O

Et O

O L O

O

25

24

O2 K1 O

O

O

O

L

L

L

O EtO CuII

O

CuII

O L

Ph

O

k2

O OEt

lassú

L O

L

Ph

O CuII O

OEt

L O

O

Ph O

EtO CuI O

L

EtO

26 L

CuI

CuII

O Ph

O

27

O

Ph

L

Ph

O

O OEt

L

+

+ H 2O2 O

L

28

21 59

(33)

Eredmények és értékelésük

3.2.2. A Mn2(6’Me2PAP)2Cl4 előállítása, szerkezete és katalitikus hatása a di-tercbutil-pirokatechin oxidációjára [130] Mangántartalmú

CO

enzimmodell

rendszerek

meglehetősen

ritkák

a

szakirodalomban. Az izoindolinból könnyen előállítható 1,4-di-(6’-metil-2’-piridil)aminoftalazin (6’Me2PAP) a réz, kobalt, nikkel és cink sókkal képzett komplexei alapján [131, 132, 133] képes olyan ideális fémionok közötti távolságot biztosítani (~3 Å), amely lehetőséget nyújthat a pirokatechin-oxidáz enzim modellezésére. A ligandumot (30) az izoindolinból hidrazin-hidrát reakciójával (34) kaptuk [134]. A belőle készített kétmagvú mangánkomplex 31 szintézisét pedig, a (35) egyenlet mutatja (részletesen a kísérleti fejezetben).

HN

N

N

NH

N 2H4

N NH NH

(34)

N

N

HN

N

30

18 CH 3CN

MnCl2

MeOH

(35)

[Mn 2(6'-Me2PAP)2Cl4

31 A komplex átkristályosítási kísérletei során nem sikerült röntgendiffrakciós mérésre alkalmas kristályokat nyernünk, így a tulajdonságait spektroszkópiai módszerekkel térképeztük fel (12. táblázat), amik alapján a lehetséges szerkezet a 44. ábrán látható. 12. táblázat. A 31 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai

Komplex Szín Olvadáspont (°C) IR (KBr; cm-1) UV-Vis (DMF)

[Mn2(6’-Me2PAP)2Cl4] 31 barna 182-184 3380 (NH), 1635, 1602, 1093, 1023, 993 (py) log ε374,388 = 4,36

60

[Cu2(PAP)Cl3(OH)] [134] zöld 3590, 3460 (OH), 3285 (NH), 1019 (py) log ε290 = 4,32 (H2O)

Eredmények és értékelésük

N N N H H N N N Cl Cl Mn Mn N N ClCl N N N N H H

44. ábra A Mn2(6’-Me2PAP)2Cl4 31 komplex feltételezett szerkezete Az IR spektrumban a 3380 cm-1-nél található a ν(NH) rezgés. A rezgés szimpla, ami egyfajta (azonos környezetű) NH csoportra utal. A két 1600 cm-1 feletti rezgés a semleges ligandum ν(CN) jelei. Egy erős sáv 1023 cm-1-nél, és egy gyengébb 993 cm-1-nél az irodalmi adatok alapján a koordinálódott piridin vázrezgésével azonosítható. Az UV-Vis spektrumban 390 nm alatt jelennek meg a π-π* töltésátviteli sávok. Az irodalmi hivatkozások szerint ez a töltés nélküli ligandumra utal, ugyanis anionos formában ugyanez az abszorbancia 390 nm felett jelentkezne [134]. A spektroszkópiai adatok alapján jó közelítéssel a 44. ábrán látható komplexet kaptuk. Atomabszorpciós mérések szintén a számított százalékos mangán tartalmat adták. A reakciókinetikai méréseket ebben az esetben DMF-ben, 40°C-on végeztük. A reaktánsokat előkészítettük argonban, majd a reakció időbeli lefutását a levegő hozzáadásának pillanatától mértük. A DBQ képződését UV-Vis spektroszkópiával követtük nyomon 400,50 nm hullámhossznál (log ε = 3,21). A jodometriás titrálás ez esetben nem mutatott hidrogén-peroxidot, így a (31) egyenlet a H2O végtermékkel érvényes. A dioxigénben végzett kísérleteknél annak DMF oldhatóságát (5,40 × 10-3 M) figyelembe vettük [135]. Koncentrációját különböző parciális nyomáson a Dalton-törvény szerint számítottuk [136].

61

Eredmények és értékelésük 13. táblázat. A 31 komplex által katalizált DBCatH2 oxidáció kinetikai adatai (levegőn, 40°C-on, DMF oldószerben) Mérés szám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

[O2] (10-3 M) 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 2,69 5,40

[Mn] (10-4 M) 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,78 0,98 1,25 1,67 0,92 0,92

[DBCatH2] (10-3 M) 0,92 1,84 4,60 9,20 12,50 18,43 12,50 12,50 12,50 12,50 12,50 12,50

V0 (10-7 M s-1) 5,44 9,08 15,51 25,92 27,82 36,16 19,12 28,89 30,73 39,76 42,20 87,70

A reaktánsok részrendjének meghatározását a szubsztrátuméval kezdtük. Ennek érdekében a katalizátor koncentrációját állandó értéken tartva Michaelis-Menten-típusú telítési görbét kaptunk (45. ábra), hasonlóan a Cu(II)-katalizált DBCatH2 oxidációhoz. A megfelelő állandók a következők: Vmax = 42,90 × 10-7 M s-1 és KM = 6,40 × 10-3 M. A katalitikus aktivitás kcat = 46,60 × 10-3 s-1, amelyből az időegység alatt átalakított szubsztrátum mennyiség kcat/KM = 7,25 M-1 s-1-nek adódik. Órában kifejezve a katalitikus aktivitást az érték 167,90 h-1. Ez az egymagvú MnIII-tartalmú rendszerekre talált értékekkel azonos tartományba esik (kcat = 86-336 h-1) [137, 138], azonban meglehetősen alacsonyabb a például kétmagvú MnIV-komplexekénél (kcat = 940-1620 h-1) [139].

45. ábra A DBCatH2 oxidáció 31 által katalizált sebességének változása a szubsztrátum koncentráció függvényében (13. táblázat 1-6 mérés) és a Lineweaver-Burk diagram

62

Eredmények és értékelésük A DBCatH2 oxidációjának sebességét ábrázolva a katalizátor-koncentráció változásának függvényében (46. ábra) egyenest kaptunk (R = 98,67 %). Ugyanígy, egyeneshez jutottunk a dioxigén részrendjének meghatározásakor is (47. ábra) (R = 98,45 %). A részrendek, tehát minkét esetben egynek adódtak.

46. ábra A DBCatH2 oxidáció sebességének alakulása a Mn2(6’-Me2PAP)2Cl4 koncentráció függvényében (13. táblázat 7-10 mérés)

47. ábra A DBCatH2 oxidáció sebességének függése a dioxigén koncentrációjától 31 jelenlétében (13. táblázat 5, 11-12 mérés) A réz(II)komplexszel végzett kísérletekhez hasonlóan ezúttal is feltételeztük a DBCatH2 koordinációját 31-hez. A 48. ábra a DBQ képződését mutatja az idő függvényében. A ■-tel ábrázolt görbe az előbbi kísérlettel párhuzamosan végzett mérés eredményeit szemlélteti, amelynek során tetra-kloro-pirokatechint (Cl4CatH2) adtunk az elegyhez 20 perc után. A Cl4CatH2 ismét inhibitorként viselkedett, vagyis a DBCatH2 koordinációját a katalizátorhoz a reakció során ezzel igazoltuk.

63

Eredmények és értékelésük

48. ábra A DBCatH2 oxidációja 31 jelenlétében, és annak inhibíciója tetra-kloro-pirokatechin hatására. (▲) [Mn2(6’-Me2PAP)2Cl4] = 1,45 × 10-3 M, [DBCatH2] = 0,10 M; (■) [Mn2(6’Me2PAP)2Cl4] = 1,45 × 10-3 M, [DBCatH2] = 0,10 M, + [Cl4CatH2] = 0,10 M 1200 másodpercnél; levegőn, 55°C-on, DMF-ben Az

előző

fejezetben

láttuk,

hogy

különböző

para-helyen

szubsztituált

piridinszármazékok a funkciós csoportjaiktól függően befolyásolni tudták a DBCatH2 oxidáció sebességét. Mivel jelen esetben a komplex koordinációs övezete telített, így ezúttal pirokatechin-származékokkal teszteltük az elektronos hatásokat. 3,5-DBCatH2-tól pirokatechin irányában növekvő redox potenciálú pirokatechineket választottunk tesztjeink alanyául. A redoxpotenciál növekedése egyben az elektronküldő sajátosságok, vagyis a

Lewis bázicitás csökkenését is jelenti [140] (49. ábra).

49. ábra A pirokatechin származékainak hatása az oxidációra 31 jelenlétében. Körülmények: [Mn2(6’-Me2PAP)2Cl4] = 0,92 × 10-4 M; [R-CatH2] = 12,50 × 10-3 M, levegőn, 55°C, DMF

64

Eredmények és értékelésük A 3.1 fejezet szubsztrátumait alkalmazva (OAP és PDA) nem tapasztaltunk aktivitást. Összegezve a reakciókinetikai adatainkat, a Mn2(6’-Me2PAP)2Cl4 katalizátor jelenlétében is megvizsgáltuk a DBCatH2 oxidációját. A szubsztrátum részrendjének vizsgálatakor tapasztalt telítési görbe alapján meghatároztuk a kinetikai állandókat. Megállapítottuk, hogy a szubsztrátum az előegyensúlyi lépésben komplexet alkot a katalizátorral (36), oxidációja pedig a katalitikus folyamat sebességmeghatározó lépése (38). [Mn2II(6'-Me2PAP)2Cl 4] + DBCatH2 [Mn2II(6'-Me2PAP)2Cl4(DBQ)]2- + 0,5 O2 [Mn2II,III(6'-Me2PAP)2Cl4(DBQ)(O)] 2-

K1 K2

[Mn2II(6'-Me2PAP)2Cl4(DBQ)]2- + 2 H+ (36) [Mn2II,III(6'-Me2PAP)2Cl4(DBQ)(O)] 2-

(37)

k cat

[Mn2II,III(6'-Me2PAP)2Cl4(O)]2- + DBQ (38) (lassú)

[Mn2II,III(6'-Me2PAP)2Cl4(O)]2- + 2H +

[Mn2II(6'-Me2PAP)2Cl4] + 0,5 H2O

(39)

Összesítve a jelen fejezet eredményeit, réz- és mangánkomplexek katalitikus hatását tapasztaltuk

pirokatechin

oxidáz

enzim-utánzó

reakciókban.

Az

első

esetben

piridinszármazékok, a másodikban a pirokatechin-származékok oxidációra kiváltott elektronikus hatásait is feltérképeztük. Reakciómechanizmusukra a kinetikai eredmények alapján tettünk javaslatot. Katalitikus aktivitásukat tekintve a rézkomplexé kcat = 5,66 × 10-3 s-1, valamint a mangáné kcat = 46,60 × 10-3 s-1, amely kicsit gyorsabb. A sebességek az irodalomban találhatókéhoz hasonlóak.

3.3. A Cu(I)-(bpy)-(DBCat) rendszer. Pirokatechin dioxigenáz, vagy pMMO modell? [141] A pirokatechinek aminálása az irodalmi hivatkozások szerint bázisos közegben, gyökanionon keresztül lejátszódó folyamat [142]. A reakció felgyorsítása érdekében réz(II)sókkal próbáltuk katalizálni a folyamatot sikertelenül. 2,2’-bipiridilt (bpy) ligandumként használva, és réz(I)-kloridra váltva sem kaptuk meg a kívánt amino-fenolt, azonban sikerült a reakció végén egy olyan komplexet kikristályosítani, amely – meglepő módon – oxálsavat (oxH2) tartalmazott hídligandumként a két réz(II)ion között. A reakció során CuCl-t, bpy-t. DBCatH2-t és difenil-amint kevertünk össze ekvimoláris mennyiségben acetonitrilben (40). Az elegy oxigénfelvételét gázbürettás módszerrel 65

Eredmények és értékelésük követtük

nyomon.

módszerekkel

és

gázkromatográfiával

A a

termékeket komplexek

azonosítottuk.

röntgendiffrakciós

elbontása Ezek

és

méréssel,

diazo-metános

alapján

spektroszkópiai észterezése

[Cu(bpy)(ox)]n

és

után

Cu(bpy)Cl2

komplexeket nagyjából azonos mennyiségben, valamint DBCatH2-t kaptunk, és a reakció szempontjából indifferens difenil-amint.

(40)

A 36 komplex már régebb óta ismert [143], azonban a 35 szerkezete kissé eltér a korábban

bemutatottakétól

[144].

Az

utóbbi

röntgenszerkezetét

az

50.

ábra,

spektroszkópiai adatait a 14. táblázat, fontosabb kötésszögeit és kötéstávolságokat pedig a 15. táblázat tartalmazza. A krisztallográfiai adatok a 16. táblázatban találhatóak.

50. ábra A [Cu(bpy)(ox)]n 35 komplex röntgendiffrakciós képe 66

Eredmények és értékelésük 14. táblázat. A 35 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai

Komplex Szín IR (KBr; cm-1) UV-Vis (DMF) Elemanalízis (számított) Elemanalízis (mért) ESR (77 K)

[Cu(bpy)(ox)]n halványzöld 1650, 1621, 1405, 1343 log ε267 = 3,77; log ε298 = 3,92; log ε417 = 1,42 C: 46,80; H: 2,60; N: 9,10 C: 46,60; H: 2,50; N: 8,90 gII = 2,173; g┴ = 2,070

15. táblázat. Fontosabb kötésszögek és kötéstávolságok a 35 komplexben Atompár Cu1–O6 Cu1–O30 Cu1–O53 Cu1–O56 Cu1–N13 O30–C24 Kötés O6–Cu1–O53 O6–Cu1–O30 N13–Cu1–N20

Kötéshossz (Å) 1,956 2,327 1,993 2,317 2,029 1,200 Kötésszög (°) 91,10 76,80 80,50

Atompár Cu2–O3 Cu2–O4 Cu2–O28 Cu2–O43 Cu2–N11 O4–C10 Kötés N35–Cu2–N11 O28–Cu2–O43 O3–Cu2–O4

Kötéshossz (Å) 2,005 2,300 1,980 2,310 1,999 1,270 Kötésszög (°) 81,30 77,80 79,10

16. táblázat. A 35 komplex krisztallográfiai adatai

Komplex Összegképlet Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport Elemi cella méretei Elemi cella térfogata Z Sűrűség (számított) Abszorpciós koefficiens F(000) Index tartományok Gyűjtött reflexiók Megfigyelt reflexiók száma Végső R [I>2σ(I)]

[Cu(bpy)(ox)]n C12H8N2Cu1O4 627,68 g/mól 293 K Mo-Kα (λ = 0,71073 Å) triklin P1 α = 110,318° a = 8,9220 Å b = 9,0950 Å β = 97,529° c = 9,6560 Å γ = 105,768° 684,73 Å 1 1,522 g/cm3 0,933 mm-1 329 0 ≤ h ≤ 11 -11 ≤ k ≤ 10 -12 ≤ l ≤ 11 2443 2333 R1 = 0,0303 , wR2 = 0,0952

67

Eredmények és értékelésük A [Cu(bpy)(ox)]n komplex azonosítására az IR spektrumában leginkább az aszimmetrikus karboxilátcsoport νas(CO2) = 1650 cm-1 rezgés a legalkalmasabb. Szimmetrikus párja νsym(CO2) = 1343 cm-1-nél található. A fontosabb elnyelési sávok az UV-Vis spektrumban 267 és 298 nm-nél vannak. Ezek a két ligandum és fém közötti töltésátvitelhez rendelhetőek. A röntgenszerkezet alapján minden rézion körül két-két oxalát és egy bpy található polimerláncot alkotva. Cu1 és Cu2 azonban nem teljesen egyformák: a kötésszögekben és kötéstávolságokban apró eltérések fedezhetőek fel. Nyilvánvalóan, eredeti tervünk a pirokatechinek aminálásával kudarcot vallott, azonban helyette egy nem kevésbé érdekes terméket kaptunk. A 35 komplexben a rézionok közötti hidat alkotó oxalát legnagyobb valószínűséggel ugyanis, az oldószerként alkalmazott acetonitrilből származik. A reakció teljes feltérképezése érdekében először a sztöchiometriát igyekeztünk tisztázni. Az említett reaktánsokon kívül a dioxigén is fontos szerepet játszik, így annak felvételét vizsgáltuk először (51. ábra). A nyomjelzett kísérletek esetünkben megfelelő módszernek bizonyultak (52. ábra) az oxalát eredetének bizonyítása végett. Az utóbbi méréseket 13CH3CN-ben és 18O2-ben viteleztük ki.

51. ábra A [Cu(bpy)(ox)]n komplex dioxigén felvétele. Oldószer: 5 ml, [CuCl] = [bpy] = [DBCatH2] = 5 mmól, 25°C, 1 bar O2

68

Eredmények és értékelésük

16

O2, 12CH3CN

18

O2, 12CH3CN

16

O2, 13CH3CN

Hullámszám (cm-1) 52. ábra Izotóppal jelzett termékek IR spektrumai a 35 komplexszel Az izotóppal jelzett acetonitrilben is és

18

O2 atmoszférában is, a reakcióból

származó IR spektrumokban láthatóan mind az aszimmetrikus, mind a szimmetrikus νCO jelek jelentősen eltolódtak. Mindezeken felül lehetőségeink szerint a legtisztább oldószereket és reagenseket használtuk, így nem sok kétség maradt, hogy az oxalát-híd valóban az oldószerből származik. További bizonyítékként DFT kvantum kémiai számításokkal is alátámasztottuk feltevéseinket. Az eredmények együtt láthatóak a 17. táblázatban, zárójelben mutatva a számított izotóp eltolódásokat cm-1-ben az eredeti kísérlethez képest. 17. táblázat. A 35 komplexszel végzett izotópos kísérletek IR jelei (cm-1)

Rezgés ν7 ν1 ν2 ν8

[Cu(bpy)(ox)]n 35 kísérleti számolt 1650 1659 1621 1625 1405 1427 1343 1326

35 12CH3CN + 18O2 kísérleti számolt 1643(7) 1650(9) 1606(15) 1611(11) 1397(8) 1414(13) 1333(10) 1302(24)

35 13CH3CN + 16O2 kísérleti számolt 1644(6) 1648(11) 1591(30) 1588(37) 1373(30) 1413(14) 1329(14) 1313(13)

A legnagyobb frekvenciájú ν7 IR sávok 6-11 cm-1 közötti eltolódásokat mutattak a referenciaként használt normál dioxigénben és acetonitrilben végzett kísérletekhez képest. 69

Eredmények és értékelésük Az eltérés a mért és számított értékek között minimális. A ν1 és ν2 közepes intenzitású IRsávok mutatták a legnagyobb mértékű izotóp eltolódásokat (akár 30-37 cm-1 is). Mindazonáltal, ezek sajnos nem rendelhetők pontosan hozzá egy bizonyos kötés rezgéséhez elsősorban a bpy-ligandum jeleivel történő átfedések miatt. Csupán egy kérdéses sáv maradt, ez pedig a 13CH3CN-ben mutatkozó 1373 cm-1-es. Ez lehet az eredeti 1405 cm-1 erősen negatív eltolódású párja, azonban ez ellen szól, hogy a számított 1413 cm-1-nél is található egy rezgés. A spektrum összetettsége ebben az esetben sem teszi lehetővé a pontos meghatározást. Kísérletsorozataink alapján eddig a pontig ki tudtuk zárni az amin szerepét, ugyanis hiányában a dioxigénfelvétel és a termék is változatlan. Cu2+-sókat használva nem találtuk az oxalát híd jelenlétét, valamint nem vonható kétségbe a bpy koordinációja a rézhez. További tapasztalataink, hogy DBCatH2 alkalmazása nélkül nem a kívánt komplex keletkezése észlelhető, mégis a gázkromatográfiás elemzés az „érintetlen” pirokatechint mutatta a reakció végén. Az irodalmi ismeretekink szerint a pirokatechin oxidáz enzimeknél a szubsztrátum a réz(II)központokat képes redukálni, de ott benzokinon állapot a végleges. UV-Vis spektroszkópiával ezúttal is sikerült DBQ-t kimutatni, ami azonban a ciklus végével visszaalakult DBCatH2-vá (53. ábra).

λ (nm) 53. ábra DBQ képződés és visszaalakulás a [Cu(bpy)(ox)]n komplex képződése során Oldószer: 5 ml MeCN, [CuCl] = [bpy] = [DBCatH2] = 5 mmól, 25°C, 1 bar O2 70

Eredmények és értékelésük Mindezekután elégséges információ állt birtokunkban, hogy a reakció pontos sztöchiometriáját leírjuk. Ez a következőképpen alakul: 2 CuCl + CH3CN + 2 bpy + 3,5 O2 Az

oldószerként

alkalmazott

DBCatH2

vegyületek

(41)

35 + 36 + 3 H2O hatásának

vizsgálata a

reakció

kimenetelére nem maradt ki a méréssorozatinkból. A szénlánc méretét csupán eggyel növelve, azonban újabb váratlan eredményeket kaptunk. Propionitrilben elvégezve az oxidációt a korábbiaktól eltérő új [Cu(bpy)(bma)H2O]n összetételű komplexet sikerült előállítanunk, ahol bmaH2 = 2-terc-butil-maleinsav. Cu O O OH

N

CH 3CH 2CN

+ CuCl + OH

N

20

32

O

33

N

O Cu

O N OH 2

O Cu

O N +

Cl Cu

N

Cl

O

37

36

(42) Ebből az anyagból is sikerült röntgendiffrackiós mérésre alkalmas kristályokat növesztenünk. A réz(II)ionok geometriája torzult síknégyzetes piramisos szerkezettel jellemezhető (τ = 0,12). Az alapsíkban a bpy ligandum két nitrogénje és két maleát egység egy-egy oxigénje helyezkedik el. Axiális helyzetben egy vízmolekula koordinációja figyelhető meg. A szerkezet az 54. ábrán látható, a fizikai és spektroszkópiai tulajdonságai pedig a 17-19 táblázatokban.

54. ábra A [Cu(bma)(bpy)(H2O)]n (37) komplex röntgendiffrakciós képe

71

Eredmények és értékelésük 17. táblázat. A 37 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai

Komplex Szín Olvadáspont (°C) IR (KBr; cm-1) UV-Vis (DMSO) Elemanalízis (számított) Elemanalízis (mért) ESR (77 K)

[Cu(bma)(bpy)(H2O)]n kék 266 1645, 1601, 1446, 1374, 776 log ε260 = 3,78; log ε302 = 4,03; log ε423 = 1,61 C: 53,00; H: 4,90; N: 6,90 C: 52,80; H: 4,70; N: 6,70 gII = 2,270; g┴ = 2,050; CuAII = 177 G

18. táblázat. Fontosabb kötésszögek és kötéstávolságok a 37 komplexben Atompár Cu1–O19 Cu1–O22 Cu1–O23 Kötés N1–Cu1–O19 N2–Cu1–O22 N1–Cu1–O23

Kötéshossz (Å) 1,969 1,952 2,371 Kötésszög (°) 165,74 172,87 94,90

Atompár Cu1–N1 Cu2–N2

Kötéshossz (Å) 2,003 1,992

Kötés O19–Cu1–O23 N1–Cu1–N2 O19–Cu1–O22

Kötésszög (°) 99,17 81,10 88,91

19. táblázat. A 37 komplex krisztallográfiai adatai

Komplex Összegképlet Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport Elemi cella méretei Elemi cella térfogata Kristály méretei Z Sűrűség (számított) Abszorpciós koefficiens F(000) Index tartományok Gyűjtött reflexiók Megfigyelt reflexiók száma Végső R [I>2σ(I)]

[Cu(bma)(bpy)(H2O)]n C18H37N2Cu1O12 537,04 g/mól 293 K Mo-Kα (λ = 0,71073 Å) monoklin P 21 / c a = 11,2760 Å α = 90,00° b = 18,5120 Å β = 113,47° c = 12,9750 Å γ = 90,00° 2484,33 Å 0,4 mm × 0,4 mm × 0,2 mm 4 1,436 g/cm3 0,940 mm-1 1136 0 ≤ h ≤ 13 0 ≤ k ≤ 22 -16 ≤ l ≤ 14 4781 4133 R1 = 0,0566 , wR2 = 0,1250

72

Eredmények és értékelésük A 37 komplex UV-Vis spektruma kis mértékben különbözik a 35-től. Az IR spektrumban a meghatározó különbség a két komplex között a szimmetrikus és aszimmetrikus ν(CO) rezgéseik közötti távolság (1645, 1374 cm-1), ami a 37 esetében valamivel nagyobb ∆ν = 271 cm-1. Ugyanez a távolság 35 esetén ∆ν = 245 cm-1. A paramágneses komplex ESR spektruma axiális szimmetriát mutat (gII > g┴), valamint a g tenzorok értékei alátámasztják a négyzet alapú piramis geometriát [145].

55. ábra A [Cu(bpy)(bma)H2O]n komplex dioxigén felvétele. Oldószer: 5 ml, [CuCl] = [bpy] = [DBCatH2] = 5 mmól, 25°C, 1 bar O2 Az acetonitrilben végzett kísérletekhez hasonlóan ebben az esetben is megmértük a dioxigén felvételt (55. ábra), és a korábbi ismereteinket alapul véve a reakció pontos sztöchiometriáját is meghatároztuk (43). 2 CuCl + DBCatH2 + 2 bpy + 3 O2

CH3CH2CN

36 + 37 + H2O + mellékermékek (43)

Ahogy a (43) egyenlet is mutatja, az oldószer ezúttal nem reagensként szerepel. Az acetonitriles kísérletektől eltérően itt a pirokatechin gyűrű teljes kémiai hasítását tapasztaltuk. Mindezek a megfigyelések természetesen felvetették a kérdéseket, hogy más oldószerek milyen hatással vannak a folyamatra, valamint különböző nitrogén-donor ligandumok, rézsók és pirokatechinek is megváltoztathatják-e a reakciók kimenetelét? A kérdéseket

megválaszoló

kísérletek

eredményei

a

20.

táblázatban

találhatóak.

Alapkísérletnek a (41) és (43) egyenleteket vettük, a táblázatban pedig csak a megváltoztatott paraméter lett feltüntetve.

73

Eredmények és értékelésük 20. táblázat. A Cu-bpy-DBCatH2 rendszer részletes vizsgálata Megváltoztatott paraméter pirokatechin változtatás

O2N

OH

Termék színe vörös

Oldószer

MeCN

Informatív IR csúcsok 1603, 1506, 1270

OH

F

OH

O

OH OH OH OH OH

vörös világos barna barna világos barna barna barna barna

EtCN MeCN

1603, 1503, 1270 1603, 1483, 1281

EtCN MeCN

1602, 1482, 1281 1602, 1534, 1446

EtCN MeCN EtCN

1600, 1495, 1445 1602, 1445, 1254 1602, 1446, 1254

kék

MeCN

1647, 1447, 1320

barna

EtCN

1602, 1495, 1257

barna barna

MeCN EtCN

1601, 1446 1601, 1495

zöld

MeCN

1655, 1446, 1316

zöld

EtCN

1648, 1449, 1315

OH OH OH OH

OH

Bz

Bz N

N Bz

N

N

Bz

+ + +

OH

ligandum változtatás

Oxalát, vagy maleát jelenléte

zöld

MeCN

1492, 1451

barna

EtCN

-

zöld

MeCN

1636, 1422, 1346

sárga

EtCN

1644, 1428, 1342

narancs

MeCN

-

+ + -

N

N

zöld

MeCN

N N

N

74

1744, 1600, 1449, 1326

+

Eredmények és értékelésük folyt.

Megváltoztatott paraméter

Cu-só változtatás

Cu(OMe)2 CuCl2 CuBr CuI Cu(OAc) Cu2O CuCN CuSCN Cu(ClO4)

oldószer változtatás

alap alap alap

Termék színe

Oldószer

Informatív IR csúcsok

lila

MeCN

1680, 1447, 1248

lila zöld zöld zöld vörös barna zöld zöld barna barna narancs zöld kék kék zöld zöld kék

EtCN MeCN MeCN EtCN MeCN EtCN MeCN EtCN MeCN EtCN MeCN MeCN MeCN EtCN EtOH MeOH CH2Cl2

1602, 1437, 1248 1602, 1445, 1317 1651, 1446, 1320 1652, 1446, 1315 1593, 1438, 1315 1595, 1438, 1312 1670, 1405, 1297 1672, 1405, 1297 1635, 1447, 1394 1630, 1600, 1389 1593, 1438, 1309 1592, 1437, 1308 1653, 1445, 1089 1653, 1446, 1090 1651, 1445, 1315 1652, 1443, 1314 1650, 1446, 1321

Oxalát, vagy maleát jelenléte + + + + + + + + + + +

Az eredmények alapján látható, hogy az elektronszívó csoportokat tartalmazó pirokatechin-származékok nem képesek a leírt reakciók véghezvitelére. Az elektronküldő csoportokat tartalmazók közül is csak azok hatékonyak, amelyeken az alifás oldalláncok hosszabbak, magasabb rendű szénatomokat tartalmaznak. A választott nitrogéndonor ligandumok mind jól koordinálódnak a rézionhoz, azonban a hatásukra kialakuló redoxpotenciál értéke eltérő. Az elvárt oxalát- és maleáttartalmú termékeket csak az 1,10-fenantrolin és terpiridin esetén azonosítottuk. A neocuproin a Cu(I)-t nagyobb mértékben stabilizálja, így termékképződés annál nem volt tapasztalható. A nitrogéntartalmú kétfogú ligandumok nélkül a kívánt reakciók nem vitelezhetőek ki. A fém sói közül egyértelműen a réz(I)ionokat tartalmazók az aktívak. Ennek a faktornak a változtatása a legkisebb százalékkal volt hatással a reakció lefolyására. Mindazok ellenére, hogy a termékek keletkezése IR spektroszkópiával jól nyomon követhető, a különböző oldószerek használatával mégsem lehetünk teljesen biztosak az oxalát képződésben. Nagy valószínűséggel megállapítható azonban, hogy a rövidebb szénlánccal rendelkező oldószereket a rendszerünk savakká képes oxidálni, amelyek azután a rézionhoz koordinálódnak. 75

Eredmények és értékelésük

Az acetonitrilben és propionitrilben végzett kísérletek eredményeit összegezve a Cu(I)-(bpy)-(DBCat) komplex-rendszer enzimutánzó tulajdonságai tükröződnek az eredményeken. Rövidebb szénláncú oldószer jelenléte esetén annak oxidálódása tapasztalható. Ez a kritérium a pMMO enzim egyik legszembetűnőbb tulajdonsága. További párhuzam, hogy ez éppen egy rézmaggal rendelkező biokatalizátor. Lehetséges magyarázatot keresve a jelenségre a 11. és 16. ábra dioxigén-aktiválási mechanizmusát lehet alapul venni. A kisméretű acetonitril molekulák a rézionok környezetében nagyobb valószínűséggel kerülhetnek olyan pozícióba, hogy a 11. ábra d) lépése helyett a pirokatechint egyszerűen kiszorítják a reaktív oxigén gyökök, gyökanionok szférájából. A kísérleteinket minden esetben dioxigénben, levegő kizárásával végeztük, vagyis annak folyamatos utánpótlása biztosított volt, így az oxidáció kétértékű sav keletkezéséig játszódhatott le. A ciklus végén a formálódó oxalát koordinációja a pirokatechin rekombinációját eredményezte. Az oldószer szénatomjainak a számát növelve annak szerepe a hátérbe kerül. A DBCatH2 által redukált rézionok egyéb alkalmas reakciópartner híján a molekuláris dioxigén közreműködésével a pirokatechint magát kezdik a dioxigenázokhoz hasonlóan hasítani és oxidálni. A pirokatechinek extradiol hasítását végző enzimekkel kapcsolatos irodalmi hivatkozások között nagyon nehéz olyat találni, amelyik a 3,4-dioxigenázoktól eltérőt említene. Vassal és más fémekkel végzet modellkísérletek során azonban számtalan melléktermék keletkezik, többek között maleinsavanhidrid (12) is (12. ábra). A Funabiki által javasolt mechanizmust [146] kombinálva a manapság elérhető legfrissebb eredményekkel [49, 50], a lehetséges oxigénezés a (44) reakciósorozat szerint alakul. O O

O Cu+

Cu+

O

Cu+

O

38

O

O

O2

O

38a

39 (44)

Cu+ HO

O

O

O

O

O

OH

42

O Cu+

Cu+

O

41

O

40

+ f ragment termékek

76

O O

Eredmények és értékelésük 3.4. Kataláz enzimmodellek

A pirokatechin oxidáz enzimet utánzó reakcióknál néhány esetben hidrogénperoxid képződését is tapasztaltuk. Ezzel együtt más biológiai folyamatok eredményeként is keletkezhet ez a belső szervekre, szövetekre meglehetősen ártalmas vegyület. Ahogy az irodalmi áttekintésben is említésre került, a szervezetek természetes védekezése ez ellen az anyag ellen elsősorban a kataláz enzimmel valósul meg. Ebben a fejezetben a rendkívül egyszerű (6) reakciót alapul véve a már ismertetett gázvolumetriás módszer alkalmazásával (a hidrogén-peroxidból képződő dioxigén méréséhez) kataláz funkcionális modelleket szándékozunk bemutatni. Egyrészt egy az enzim fémtartalmától eltérő Cu2(bpy)2(phga)4 (phgaH = fenil-glioxilsav) réz komplexen keresztül, másrészt a mangán katalázokhoz jobban hasonlító, prolin alapú ligandumot tartalmazó, kétmagvú mangán komplexszel.

3.4.1. A Cu2(bpy)2(phga)4 előállítása, szerkezete, katalitikus hatása a H2O2 dizmutációjára [147]

A 3.3 fejezet kísérletsorozatai során a termékek azonosítása érdekében a bpy mellett a legkülönfélébb egyszerű savakat próbáltuk alkalmazni másodlagos ligandumként komplexképzéshez. Így jutottunk el a fenil-glioxilsavhoz, amelynek felhasználásával olyan vegyületet sikerült előállítanunk, ahol a phga terminális és hídligandumként is funkcionál (45). (Az előállítás részletesen a kísérleti fejezetben megtalálható.) A terméket az anyalúgból sikerült kikristályosítani, melynek során röntgendiffrakciós mérésre alkalmas egykristályok keletkeztek (56. ábra). Ph O

O N

OH 4

O

43

CH 3CN

+ 2 Cu(OMe)2 + 2 N

33

O

O N O O N Cu Cu Ph (45) N O O O N O

O Ph

O Ph

44

77

O

Eredmények és értékelésük

56. ábra A Cu2(bpy)2(phga)4 (44) komplex röntgendiffrakciós szerkezete A dimer komplex kromofórja a CuN2O3 formáció, ami torzult négyzetalapú piramist (τ = 0,01 [128]) alakítva veszi körül a központi fémet. Az átlagos Cu–O távolság a piramis alapjában 1,945 Å, a Cu–N pedig 2,000 Å. A axiális Cu–O távolság meglehetősen hosszabb 2,383 Å. A O2–Cu1–N2 (175,40°) és O2–Cu1–O2 (76,37°) kötésszögek értékei határozzák meg a SP-5 alakzat torzulását. A Cu–Cu 3,432 Å távolság a 2. táblázatban bemutatott katalázmodellekével azonos tartományba esik. 21. táblázat. A 44 és 46 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai Komplex Szín Olvadáspont (°C) IR (KBr; cm-1) UV-Vis (DMF) Elemanalízis (számított) Elemanalízis (mért)

[Cu2(bpy)2(phga)4] kék 210 1652, 1385 (C=O) log ε305 = 4,38; ε679 = 1,31

[Cu2(bpy)2(ba)4] kék 198 1600, 1397 (C=O) log ε310 = 4,33; ε697 = 2,29

C: 60,30; H: 3,50; N: 5,40

C: 62,40; H: 3,90; N: 6,10

C: 59,60; H: 3,70; N: 5,60

C: 61,80; H: 3,70; N: 5,90

22. táblázat. Fontosabb kötésszögek és kötéstávolságok a 44 komplexben Atompár Cu1–Cu1 Cu1–O2 Cu1–O5 Kötés O5–Cu1–O2 O2–Cu1–N2 N2–Cu1–N1

Kötéshossz (Å) 3,432 1,971 1,918 Kötésszög (°) 90,10 175,40 80,92

Atompár Cu1–N1 Cu1–N2 Cu1–O2 Kötés O2–Cu1–N1 O2–Cu1–O2 O5–Cu1–N1 78

Kötéshossz (Å) 2,003 1,998 2,383 Kötésszög (°) 94,57 76,37 174,69

Eredmények és értékelésük

23. táblázat. A 44 komplex krisztallográfiai adatai Komplex Összegképlet Molekulatömeg Hőmérséklet Besugárzási hullámhossz Kristályrendszer Tércsoport

Elemi cella méretei Elemi cella térfogata Kristály méretei Z Sűrűség (számított) Abszorpciós koefficiens F(000) Index tartományok Gyűjtött reflexiók Megfigyelt reflexiók száma Végső R [I>2σ(I)]

[Cu2(bpy)2(phga)4] C52H36N4Cu2O12 517,96 g/mól (× 2) 293 K Mo-Kα (λ = 0,71073 Å) monoklin P 21 / c a = 11,7440 Å α = 90,00° b = 20,9020 Å β = 93,22° c = 9,3980 Å γ = 90,00° 2303,30 Å 0,3 mm × 0,2 mm × 0,15 mm 4 1,494 g/cm3 0,994 mm-1 1060 -14 ≤ h ≤ 14 -25 ≤ k ≤ 0 0 ≤ l ≤ 10 4353 3621 R1 = 0,0521 , wR2 = 0,1204

Ahogy a [Cu(bpy)(ox)]n komplexnél 35 és a maleát-ligandumot tartalmazó 37 párjánál tapasztaltuk, az IR spektrumban ezúttal is az azonosításra az aszimmetrikus karboxilátcsoport νas(CO2) = 1652 cm-1 rezgés és szimmetrikus párja νs(CO2) = 1385 cm-1nél volt alkalmas. Az irodalmi adatok szerint a bpy koordinációjára utaló rezgésekhez az 1232, 1003, 834, 776, 716 cm-1 csúcsok rendelhetőek [148, 149]. A UV-Vis spektrumban a réz(II) d-d átmenet 679 nm-nél gyenge intenzitású, de elkülöníthető jelként mutatkozott. Az elvárható ligandum-fém töltésátviteli sávokat 300 nm felett találtuk. A 21. táblázatban bemutatott [Cu2(bpy)2(ba)4] (baH = benzoesav) komplex előállítása (46) a phga-t tartalmazó párjához hasonlóan történt. (Részletek a kísérleti fejezetben.) A molekula monomer formája nem ismeretlen az irodalomban [150], így részletesebb leírását nem találtuk szükségesnek, azonban katalázutánzó képességét a [Cu2(bpy)2(phga)4]-éval szándékoztuk összehasonlítani a reakciókinetikai méréseink során.

79

Eredmények és értékelésük

Ph

O OH

4

N

CH 3CN

+ 2 Cu(OMe)2 + 2 N

O

N O Ph O N Cu Cu N O O O N Ph

45

O

O

33

(46)

Ph

46

Hidrogén-peroxiddal szemben mindkét komplex esetén erős gázképződést tapasztaltunk. Kísérleteinket 20°C-on, 30 cm3 acetonitrilben, 0,05 mmól komplex és kb. százszoros mennyiségű H2O2 hozzáadásával viteleztük ki. Az dioxigénképződés azonnal észlelhető volt, annak ütemét félperces intervallumokban mértük (57. ábra).

57. ábra Dioxigénképződés a (44 - ●) (17,10 × 10-4 M) és (46 - ■) (16,70 × 10-4 M) komplexek katalitikus hatására a H2O2 dizmutációja során. [H2O2] = 0,17 M, CH3CN, 20°C 24. táblázat. A 44 komplex által katalizált H2O2 dizmutáció kinetikai adatai (20°C-on, CH3CN oldószerben) Mérés szám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[Cu2] (10-4 M) 4,28 8,56 12,90 17,10 25,70 17,10 17,10 17,10 17,10 17,10

[H2O2] (M) 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,13 0,20 0,23 0,27 0,33

k’ (10-3 s-1) 0,74 1,48 1,74 2,05 2,48 2,32 2,75 2,67 2,10 2,24

80

kphga (M-0,5 s-1) 0,037 0,052 0,050 0,051 0,050 0,055 0,066 0,063 0,052 0,053

d[O2]/dt (10-4 M s-1) 1,27 2,52 2,96 3,48 4,22 3,02 5,50 6,15 5,67 7,39

Eredmények és értékelésük

25. táblázat. A 46 komplex által katalizált H2O2 dizmutáció kinetikai adatai (20°C-on, CH3CN oldószerben) Mérés szám 1 2 3 4 5 6 7

[Cu2] (10-4 M) 3,32 8,33 12,50 16,70 25,00 16,70 16,70

[H2O2] (M) 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,10 0,23

k’ (10-3 s-1) 0,19 0,53 0,69 1,04 1,54 1,00 1,15

kba (M-1 s-1) 0,59 0,65 0,57 0,63 0,63 0,60 0,68

d[O2]/dt (10-4 M s-1) 0,32 0,90 1,18 1,76 2,62 1,00 2,65

A reakciókinetikai mérések forgatókönyve szerint mind a katalizátor, mind a szubsztrátum részrendjét meghatároztuk a koncentrációk változtatásával. Az eredmények a 24, 25 táblázatokban vannak összegyűjtve.

58. ábra A komplexkoncentráció változtatásának hatása a hidrogén-peroxid bomlására (44 - ●) és (46 - ■). [H2O2] = 0,17 M, CH3CN, 20°C

59. ábra A H2O2 koncentráció változtatásának hatása a (44 - ●) (17,10 × 10-4 M) és (46 - ■) (16,70 × 10-4 M) komplexek által katalizált H2O2 dizmutációra. CH3CN, 20°C 81

Eredmények és értékelésük Az 58, 59. ábrák az egyes reagensek részrendjének megállapítására végzett kísérleteket mutatják. A korábbi ábra egyenesének regressziója 99,66 %, az 59. ábrán látható egyeneseké pedig 95,13 %, és 99,50 %. Az eredmények alapján a [Cu2(bpy)2(phga)4] komplexet találtuk reaktívabbnak hidrogén-peroxiddal szemben. Az azonos körülmények között kivitelezett mérések szerint d[O2]/dt = 2,96 × 10-4 M s-1, míg a benzoáto komplexé d[O2]/dt = 1,18 × 10-4 M s-1. A katalizátor koncentrációjának a hatása a H2O2 bomlására eltérő kinetikát eredményezett, azonban mindkét komplex pszeudo elsőrendű profilt mutat a hidrogén-peroxid koncentráció függés szempontjából. Mindezekután a felírható reakciókinetikai egyenletek a következők: d[O2]/dt = kphga[Cu2(bpy)2(phga)4]0,5[H2O2]

(47)

d[O2]/dt = kba[Cu2(bpy)2(ba)4][H2O2]

(48)

A sebességi állandók értékei kphga = 0,05 M-0,5 s-1 és kba = 0,62 M-1 s-1, amelyek az irodalomban szereplő réztartalmú modellek értékeivel összevethető nagyságrendűek [110, 151]. A kinetikai eredményeket figyelembe véve a következő mechanizmust javasoltuk a katalitikus reakciókra (49-51): Cu2II CuII + H2O2 2 CuIII-OH + H2O2

K1 k2 lassú

k2

2 CuII

(49)

2 CuIII-OH

(50)

2 CuII + O2 + 2 H2O

(51)

Egy gyors előegyensúlyi lépésben (K1) a dimer rézkomplexek monomer formává disszociálnak (49). A sebességet meghatározó, lassú lépésben a monomer formák reakcióba lépnek a H2O2-vel, és aktív hidroxo-, esetleg peroxo-réz(III) komplexek képződnek (50). Ezek további H2O2 molekulák részvételével gyorsan visszaalakulnak az eredeti Cu(II) komplexszé (51). A két komplex sebességi egyenletében (47, 48) mutatkozó különbség a monomer és dimer formák stabilitásából fakad. 46 esetén K1 nagy, így a dimer gyorsan disszociál, vagyis [Cu(ba)2(bpy)] formája van túlsúlyban. Ez az érték [Cu2(bpy)2(phga)4] komplexnél kicsi, a dimer kedvezményezettebb. A sebességmeghatározó lépés pedig a monomer reakciója a hidrogén-peroxiddal.

82

Eredmények és értékelésük

3.4.2. A prolintartalmú [Mn2L(OAc)(H2O)2](H2O)2 előállítása, és katalitikus hatása a H2O2 dizmutációjára [152] A

bioszervetlen

kémiai

alkalmazások

jelentős

hányadában

a

kétmagvú

komplexekkel jobb eredmények érhetőek el egymagvú társaiknál. A modellreakciókhoz ezért a megfelelő ligandum választása a legszámottevőbb lépés. Sougandi és munkatársai publikáltak néhány éve egy olyan ötfogú ligandumot, amely céljainknak megfelelő kétmagvú komplexek képzésére alkalmas [153]. Előállítása gyors, olcsó és magas hozamú. A Mannich típusú reakció p-terc-butil-fenol, valamint formaldehid és L-prolin között (52) eredményezi a H3L = 2,6-bisz-[(1-prolinil)-metil]-4-terc-butil-fenol ligandumot (50). Ebből mangán(III)-acetáttal képeztük (53) azt a [Mn2L(OAc)(H2O)2](H2O)2 komplexet (51), amely nem csak funkcionális, hanem a mangán kataláz aktív centrumában található aminosavak alapján jó szerkezeti modellnek is bizonyult [98].

N H 2

EtOH + 2 HCHO

O

+

(52)

24 h reflux

OH

N

OH

N

OH

47

48

49

O

OH

HO

O

50 5h

MeOH Mn(OAc) 3 * 2H 2O

(53)

N O N Mn Mn H2O O H 2O

O

O

O

O

H2O O H 2O

51 Az 51 komplexszel nem sikerült ugyan egykristályokat növesztenünk, így a [153] referenciát alapul véve IR, UV-Vis és elemanalízis (AAS) módszerekkel azonosítottuk. A 26. táblázat a megfelelő réz(II)komplexszel együtt a fizikai és spektroszkópiai tulajdonságokat tartalmazza.

83

Eredmények és értékelésük 26. táblázat. Az 51 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai

Komplex Szín Olvadáspont (°C) IR (KBr; cm-1) UV-Vis (DMF) Elemanalízis (számított) Elemanalízis (mért)

[Mn2L(OAc)(H2O)4] 51 barna 189-191 1561, 1481, 1419 (C=O) log ε312 = 3,35 C: 40,80; H: 6,42; N: 4,35; Mn: 17,08 C: 39,92; H: 6,21; N: 4,28; Mn: 17,17

[Cu2L(OAc)H2O] [153] zöld 1637, 1442 350, 240 nm (MeOH) C: 49,60; H: 5,30; N: 4,50; Cu: 20,90 C: 49,90; H: 5,40; N: 4,60; Cu: 21,10

Az IR spektrumban 1561 cm-1-nél található a νas(CO2) rezgés, az 1481, és 1419 cm1

-nél látható abszorpciók pedig νs(CO2)-hoz rendelhetők. A 2964 cm-1 körüli tartományban

az alifás és aromás CH rezgések jelennek meg, a 3400 cm-1 alatti széles csúcs pedig a tipikusan vízhez köthető ν(OH) jel. Az UV-Vis spektrumban 310 nm-nél a ligandumról ligandumra történő töltésátvitel sávja látható. Az atomabszorpciós spektroszkópiával (AAS) kapott százalékos mangántartalom értéke megfelelő alátámasztása a feltételezett szerkezetnek. A reakciókinetikai méréseket ebben az esetben DMF-ben és 20°C-on végeztük. A képződő dioxigén mérését több cikluson keresztül is megtettük, ugyanis a katalizátor újrahasznosíthatónak tűnt. Egy ciklus befejeződése után, az újabb adag hidrogén-peroxid majdnem azonos sebességgel diszproporcionálódott a katalizátor hatására. A 60. ábra jól szemlélteti ezt a jelenséget.

60. ábra A H2O2 dizmutációja 51 hatására két cikluson keresztül. [51]0 = 1,94 × 10-3 M, [H2O2]0 = 3,35 × 10-1 M, DMF, 20°C 84

Eredmények és értékelésük Az egyes reaktánsok részrendjének meghatározásához végzett kísérleteket változó katalizátor- és szubsztrátum-koncentráció mellett viteleztük ki, amit a 61, és 62 ábrák szemléltetnek. Az elvégzett reakciókinetikai mérések eredményeit a 27. táblázat tartalmazza.

61. ábra Az észlelt reakciósebességi értékek változása az 51 katalizált H2O2 dizmutáció során különböző katalizátor koncentrációkkal. [H2O2]0 = 2,29 × 10-1 M, DMF, 20°C

62. ábra A d[O2]/dt reakciósebességi értékek változása az 51 katalizált H2O2 dizmutáció során különböző H2O2 koncentrációkkal. [51]0 = 0,78 × 10-3 M, DMF, 20°C Az ábrák alapján levonható következtetések szerint a H2O2 dizmutációja elsőrendű a katalizátorra és a szubsztrátumra nézve egyaránt. Az egyenesek regressziója rendre 99,90 % és 99,56 %.

85

Eredmények és értékelésük 27. táblázat. A 51 komplex által katalizált H2O2 dizmutáció kinetikai adatai (DMF oldószerben) Mérés szám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Hőmérs. (°C) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 25 30 35

[Mn2] (10-3 M) 0,78 1,55 1,94 2,33 3,11 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78

[H2O2] (10-1 M) 2,29 2,29 2,29 2,29 2,29 2,85 3,42 4,00 4,57 5,71 9,14 2,85 2,85 2,85

k’ (10-4 s-1) 2,09 3,95 4,81 5,86 8,05 2,57 2,89 3,82 4,53 5,88 9,13 3,02 4,13 5,92

k (M-1 s-1) 0,27 0,26 0,25 0,25 0,26 0,26 0,25 0,28 0,29 0,30 0,29 0,39 0,53 0,76

d[O2]/dt (10-5 M s-1) 4,79 9,06 11,04 13,44 18,48 5,88 6,70 8,72 10,34 13,43 20,87 8,60 11,76 16,89

A 61. ábrán az észlelt sebességi állandókat ábrázolva a változó katalizátor koncentráció függvényében a pontokra fektetett egyenes meredekségéből a H2O2 dizmutációjának [Mn2L(OAc)(H2O)2](H2O)2 által katalizált reakció sebességi állandója meghatározható k = 0,27 mól-1 dm3 s-1. Ennek értéke az átlagolás alapján számolt értékkel megegyezik. A szakirodalomból ismert legaktívabb mangánkomplexek állandóinál ez sokkal kisebb [102-105], azonban a vas-, és réztartalmúakéval azonos nagyságrendű [106108]. A bimolekulás sebességi egyenlet mindezek után a következőképpen alakul (54): -d[H2O2]/dt = k[H2O2][ Mn2L(OAc)(H2O)2](H2O)2]

(54)

63. ábra Az 51 katalizált H2O2 dizmutáció Arrhenius és Eyring diagramjai. [51]0 = 0,78 × 10-3 M, [H2O2] = 2,85 × 10-1 M, DMF 86

Eredmények és értékelésük A különböző hőmérsékleten meghatározott reakciósebességi állandókat, az Arrhenius és Eyring (63. ábra) diagramokon ábrázoltuk. A pontokra mindkét esetben egyeneseket tudtunk fektetni (R = 99,80 % és 99,77 %), ami arra utal, hogy a reakciók a vizsgált hőmérséklettartományban azonos mechanizmus szerint játszódnak le. A fenti összefüggésekből számolt aktiválási paraméterek a következők: -1

EA = 53 kJ mól , -1

∆H‡ = 50 kJ mól , -1

-1

∆S‡ = -84 J mól K . A kinetikai adatok a H2O2 diszproporciójának mechanizmusára az 51 komplex és a hidrogén-peroxid közötti asszociatív átmeneti állapot kialakulását sugallják (55). Ahogy a kataláz enzimben a Mn2(II,II) és Mn2(III,III) oxidációs állapotok közötti átmenet a meghatározó, úgy ebben az esetben is a fém központok a reakció mozgató rugói. 52 kialakulásához két vízmolekula elhagyására van szükség egy egyensúlyi lépésben. A sebességmeghatározó folyamat az 52 homolízise 53 komplexszé, ami a ciklus befejezésével egy másik H2O2 felhasználásával visszaredukálódik Mn2(II,II) aktív formára. H 2 O2 - O2 Mn(II) OH2 O Mn(II) OH2

51

H 2 O2 2 H2O

Mn(II) O O Mn(II) O

H k2 lassú

Mn(III) OH O

H

52

(55)

Mn(III) OH

53

Összefoglalva a fejezet eredményeit, sikerült olyan réz és mangán komplexeket előállítanunk, amelyek felhasználásával a kataláz enzim reakcióját modelleztük. A komplexek hatékonysága hasonló a szakirodalomban találhatókéhoz. Eredményeink jelentősége, hogy az első esetben új szerkezet bemutatásával gazdagítottuk az irodalmat, a második

esetben

pedig

újrahasznosítható

87

katalizátort

sikerült

alkotnunk.

Kísérleti rész

4. KÍSÉRLETI RÉSZ Az inert kísérletek esetében a levegő és nedvesség gondos kizárásával dolgoztunk [154]. Az alkalmazott gázokat (Ar, O2) szárítottuk (P2O5, Blaugél), az argont szén-dioxid és oxigénmentesítettük KOH illetve DEOXO katalizátorral töltött oszlopokkal. A felhasznált oldószereket standard módszerekkel tisztítottuk, szárítottuk és argon alatt tároltuk [155]. A műszeres vizsgálatokat az alábbi készülékeken végeztük: Avatar 330 FT-IR Thermo Nicolet infravörös spektrofotométer Shimadzu UV-160A UV-Vis spektrofotométer Carlo Erba EA 1108 C,H,N,S elemi analizátor JEOL JES-FE/3X ESR spektrométer UNITY 300 1H-NMR HP 5830 gázkromatográf (lángionizációs detektor, CP SIL8CB oszlop). Az oldószerek és a továbbiakban feltüntetettek kivételével minden esetben a kereskedelmi forgalomban beszerezhető kiindulási anyagokat használtunk, amelyeket további tisztítás nélkül alkalmaztunk.

Nitrozo-metil-karbamid előállítása 101 g (1,50 mól) metil-amin-hidrokloridot és 300 g (5,00 mól) karbamidot 400 cm3 vízben oldottuk és visszacsepegő hűtőt alkalmazva 3 órán át forraltuk. 110 g (1,60 mól) nátrium-nitrit hozzáadása után a -10°C-ra hűtött oldatot 600 g jég és 110 g tömény kénsav, jég-konyhasó keverékével hűtött elegyéhez kevertetés közben lassan hozzáadtuk. A leváló nitrozo vegyületet szűrtük, jeges vízzel mostuk. A termék hozama 80 %-os volt.

Diazo-metán előállítása Erlenmeyer lombikban, állandó rázogatás közben, 100 cm3 éterhez 10,30 g (0,10 mól) nitrozo-metil-karbamidot adagoltunk kis részletekben. Az éter alá 35 cm3 hűtött, 40 88

Kísérleti rész %-os kálium-hidroxid oldatot rétegeztünk. A hőmérséklet nem emelkedett +5°C fölé. Tíz perccel az utolsó adagolás után, az éteres diazo-metán oldatot leöntöttük és három órán át, kevés szilárd kálium-hidroxidon szárítottuk.

[MnII(6’-MeIndH)(H2O)2(CH3CN)](ClO4)2 előállítása (19) (3.1.2 fejezet): Feloldottunk 1,03 g (2,85 mmól) MnII(ClO4)2-t és 0,93 g (2,85 mmól) 6’-MeIndH-t 5 cm3 CH3CN-ben argon atmoszféra alatt. Az oldatot kevertettük 4 órán keresztül. A kivált szilárd anyagot inert körülmények között szűrtük, acetonitrillel és éterrel mostuk, majd vákuumban szárítottuk. Hozam: 1,43 g (76 %). Op.: 149-151°C. UV-Vis (λmax, DMF): 370,50 nm (log ε = 4,41). IR (KBr): 3334, 3060, 2917, 1634, 1590, 1557, 1456, 1409, 1372, 1209, 1113, 1097, 1054, 1001, 931, 862, 804, 780, 694, 625 cm-1. Elemanalízis (%) (C22H24O10N6MnCl2): számított: C: 40,14; H: 3,67; N: 12,77; mért: C: 40,09; H: 3,72; N: 12,85.

[Cu4(bnac)2(µ-EtO)4] előállítása (23) (3.2.1 fejezet): 0,16 g (1,00 mmól) benzoil-acetont és 0,13 g (1,00 mmól) Cu(OMe)2-t 5-5 cm3 etanolban feloldottunk. Összeöntésük után kék oldatot kaptunk, amit 70°C-on két órán keresztül kevertettünk. A röntgendiffrakciós mérésre alkalmas zöld kristályokat az anyalúg lassú, napokon át tartó bepárolásával kaptuk. Hozam: 0,20 g (70 %). Op.: 189-191°C. UV-Vis (λmax, EtOH): 322 nm (log ε = 4,83). IR (KBr): 3431, 1589, 1558, 1517, 1488, 1410, 1310, 1289, 1028, 1002, 773, 709, 683, 628, 555, 458 cm-1. Elemanalízis (%) (Cu4O12C48H56): számított: C: 53,40; H: 5,20; mért: C: 53,60; H: 5,00.

[Mn2(6’-Me2PAP)2Cl4] előállítása (31) (3.2.2 fejezet) MnCl2 0,25 g (2,00 mmól) 3 cm3 metanolos oldatát 6’Me2PAP 0,68 g (2,00 mmól) 3 cm3 acetonitrilben elkészített oldatához öntöttük argon atmoszféra alatt. Mangánra vonatkoztatva négyszeres mennyiségű NEt3-t adtunk a keverékhez, majd 24 órán át refluxáltuk. Az oldószer bepárlásos eltávolítása után a nyers terméket hideg metanollal és dietil-éterrel mostuk, majd vákuum alatt szárítottuk. 89

Kísérleti rész Hozam: 0,54 g (58 %). Op.: 182-184°C. UV-Vis (λmax, DMF): 374, és 388 nm (log ε = 4,36). IR (KBr): 3380, 1635, 1602, 1549, 1456, 1443, 1308, 1156, 1093, 1023, 993, 791, 657 cm-1. Elemanalízis (%) (C40H36N12Mn2Cl4): számított: C: 51,30; H: 3,87; N: 17,95; Mn: 11,73; Cl: 15,14; mért: C: 50,40; H: 4,10; N: 17,10; Mn: 11,80; Cl: 14,90.

[Cu(bpy)(ox)]n előállítása (35) (3.3 fejezet) Egy gázbürettával összekötött reakcióedényben, tiszta oxigénben, 0,05 g (0,5 mmól) CuCl-t, 0,11 g (0,5 mmól) DBCatH2-t, és 0,08 g (0,5 mmól) bpy-t oldottunk fel 5 cm3 acetonitrilben. A reakcióelegy 2-3 perc alatt barnáról zöldre változott, azonban a kevertetést addig folytattuk szobahőmérsékleten, amíg a dioxigén felvétele be nem fejeződött. A termékként kapott zöld port vízből kristályosítottuk át, aminek eredményeként [Cu(bpy)(ox)]n komplexet kaptunk kék kristályként, valamint [Cu(bpy)Cl2] komplexet zöld kristályok formájában. [Cu(bpy)(ox)]n hozam: 0,07 g (46 %). UV-Vis (λmax, DMF): 267 nm (log ε = 3,77); 298 nm (log ε = 3,92); 417 nm (log ε = 1,42). IR (KBr): 1650, 1621, 1405, 1343 cm-1. Elemanalízis (%) (C12H8N2CuO4): számított: C: 46,80; H: 2,60; N: 9,10; mért: C: 46,60; H: 2,50; N: 8,90. [Cu(bpy)Cl2] hozam: 0,028 g (19 %). IR (KBr): 1610, 1601, 1445, 1317, 778 cm-1.

[Cu(bpy)(bma)H2O]n előállítása (37) (3.3 fejezet) Egy gázbürettával összekötött reakcióedényben, tiszta oxigénben, 0,05 g (0,5 mmól) CuCl-t, 0,11 g (0,5 mmól) DBCatH2-t, és 0,08 g (0,5 mmól) bpy-t oldottunk fel 5 cm3 propionitrilben. A reakcióelegy 2-3 perc alatt barnáról zöldre változott, azonban a kevertetést addig folytattuk szobahőmérsékleten, amíg a dioxigén felvétele be nem fejeződött. A termékként kapott zöld port vízből kristályosítottuk át, aminek eredményeként [Cu(bpy)(bma)H2O]n komplexet kaptunk kék kristályként, valamint [Cu(bpy)Cl2] komplexet zöld kristályok formájában. [Cu(bpy)(bma)H2O]n hozam: 0,085 g (42 %). Op.: 266°C. UV-Vis (λmax, DMSO): 260 nm (log ε = 3,78); 302 nm (log ε = 4,03); 423 nm (log ε = 1,61). IR (KBr): 1645, 1601, 1446, 1374, 776 cm-1. Elemanalízis (%) (C18H20N2CuO5): számított: C: 53,00; H: 4,90; N: 6,90; mért: C: 52,80; H: 4,70; N: 6,70. [Cu(bpy)Cl2] hozam: 0,025 g (17 %). IR (KBr): 1610, 1601, 1445, 1317, 778 cm-1. 90

Kísérleti rész

[Cu2(bpy)2(phga)4] előállítása (44) (3.4.1 fejezet): 0,60 g (4,00 mmól) fenil-glioxilsav és 0,31 g (2,00 mmól) 2,2’-bipiridin oldatát 3 cm3 acetonitrilben 0,25 g (2,00 mmól) Cu(OMe)2 3 cm3 acetonitrilben elkészített szuszpenziójához öntöttük. Az így keletkezett világoskék szuszpenziót 2 órán át szobahőmérsékleten kevertettük. Ezek után szűrtük, majd a szűrletből lassú, napokon át tartó bepárolással kék kristályokat kaptunk. Hozam: 0,75 g (73 %). Op.: 210°C. UV-Vis (λmax, DMF): 305 nm (log ε = 4,38); 679 nm (log ε = 1,31). IR (KBr): 1652, 1600, 1445, 1385, 1232, 1003, 834, 776, 716, 684 cm-1. Elemanalízis (%) (Cu2O12C52H36N4): számított: C: 60,30; H: 3,50; N: 5,40; mért: C: 59,60; H: 3,70; N: 5,60.

[Cu2(bpy)2(ba)4] előállítása (46) (3.4.1 fejezet): 0,49 g (4,00 mmól) benzoesav és 0,31 g (2,00 mmól) 2,2’-bipiridin oldatát 5 cm3 acetonitrilben 0,25 g (2,00 mmól) Cu(OMe)2 5 cm3 acetonitrilben elkészített szuszpenziójához öntöttük. Az így keletkezett világoskék szuszpenziót 2 órán át szobahőmérsékleten kevertettük. Ezek után szűrtük, majd a szűrletből lassú, napokon át tartó bepárolással kék kristályokat kaptunk. Hozam: 0,65 g (71 %). Op.: 198°C. UV-Vis (λmax, DMF): 310 nm (log ε = 4,33); 697 nm (log ε = 2,29). IR (KBr): 1600, 1555, 1445, 1397, 1380, 1313, 1031, 846, 775, 729, 687, 416 cm-1. Elemanalízis (%) (Cu2O8C48H36N4): számított: C: 62,40; H: 3,90; N: 6,10; mért: C: 61,80; H: 3,70; N: 5,90.

2,6-bisz-[(1-prolinil)-metil]-4-terc-butil-fenol (H3L) előállítása (50) (3.4.2 fejezet) [153]: 1,50 g (10,00 mmól) 4-terc-butil-fenol és 2,30 g (20,00 mmól) L-prolin etanolos oldatát összeöntöttük. Az elegyhez állandó keverés mellett lassan 37 cm3 (120,00 mmól) formaldehidet adagoltunk. 24 óra refluxálás után a rendszert szárazra pároltuk vákuumban. Az olajos terméket telített Na2CO3 oldattal semlegesítettük, majd kloroformmal extraháltuk. A még mindig olajos anyagot éterrel digeráltuk, ami által higroszkópos sötét sárga port kaptunk.

91

Kísérleti rész Hozam: 3,26 g (81 %). IR (KBr): 3396, 1607, 1483, 1109 cm-1. 1H-NMR (300MHz, CDCl3): 6,42-6,90 (m, 2 H), 4,55 (t, 2 H), 4,00 (t, 2 H), 3,30- 3,50 (m, 4 H), 1,50-3,20 (m, 8 H), 1,26 (s, 9 H).

[Mn2L(OAc)(H2O)2](H2O)2 előállítása (51) (3.4.2 fejezet): 1,34 g (5,00 mmól) két kristályvizes mangán(III)-acetát és 1,01 g (2,50 mmól) H3L (50) 3 és 7 cm3 metanolban elkészített oldatát összekevertük. A képződő zöld oldat 5 perc alatt barnává vált, a kevertetés pedig 5 órán keresztül zajlott szobahőmérsékleten. A barna terméket szűrtük, éterrel mostuk és szárítottuk. Hozam: 1,50 g (93 %). Op.: 189-191°C. UV-Vis (λmax, DMF): 312 nm (log ε = 3,35). IR (KBr): 3397, 2964, 1561, 1481, 1419, 1344, 1222, 1110, 1051, 1024, 937, 882, 832, 766, 660, 617, 501 cm-1. Elemanalízis (%) C24H41Mn2N2O11): számított: C: 40,80; H: 6,42; N: 4,35; Mn: 17,08; mért: C: 39,92; H: 6,21; N: 4,28; Mn: 17,17.

Az oxidációs reakciók kinetikai mérésesének leírása Az o-amino-fenol katalitikus dimerizációját metanol és N,N-dimetil-formamid oldószerekben vizsgáltuk. A kísérleteket termosztálható reaktorban végeztük el. Első lépésként a feloldott szubsztrátum hőmérsékletét a megfelelő értékre állítottuk be, majd hozzáadtuk a katalizátort. Ezután 1,5-2 percenként történő mintavétellel UV-Vis spektroszkópiai módszer segítségével követtük nyomon a reakciókat. A termékeket a szükséges esetekben a komplexek elhidrolizálása, valamint diazo-metános észterezése utáni GC elemzéssel határoztuk meg. A kísérleti eredmények a 3.1.1. és a 3.1.2. fejezetekben részletesen megtalálhatóak. A hőmérsékletet ± 0,5°C pontossággal állítottuk be. A pirokatechin származékok mangán(II)-, és réz(II)-katalizált oxidációjának vizsgálata a fentiekhez hasonlóan UV-Vis spektroszkópiai módszer segítségével történt (3.2.1 és 3.2.2 fejezetek).

92

Kísérleti rész

A kataláz aktivitás és a pirokatechin dioxigenáz modellek dioxigén felvételének mérése A mangán(II)- és réz(II)komplexek kataláz-aktivitásának mérését (3.4 fejezet) 20°C-on N,N-dimetil-formamid és acetonitril oldószerben termosztálható reaktorban végeztük. A reaktorba 30 cm3 oldószert mértünk be, majd hozzáadtunk adott mennyiségű komplexet és egy szeptumos feltéttel lezártuk. A szeptumon keresztül hidrogén-peroxidot adagoltunk különböző mennyiségben. A reaktort csatlakoztattuk egy olajjal töltött gázbürettához és mértük a keletkező dioxigén térfogatát. A 3.3 fejezetben szereplő rendszerek dioxigén felvételét ugyanezzel az eszközzel lehet mérni, azzal a különbséggel, hogy a gázbürettát előzőleg oxigénnel szükséges feltölteni.

Ar, vákuum

O2 Reaktor Gázbüretta 64. ábra A gázvolumetriás mérésekhez használt berendezés vázlatos rajza

93

Összefoglalás

5. ÖSSZEFOGLALÁS A dolgozatban néhány oxidoreduktáz (fenoxazinon szintetáz, pirokatechin oxidáz és dioxigenáz, metán-monooxigenáz és kataláz) enzim bioutánzó reakcióját vizsgáltuk reakciókinetikai módszerekkel. A biokatalizátorokat réz- és mangántartalmú komplexekkel helyettesítettük,

amelyek

közül

négy

esetben

sikerült

új

kristályszerkezetet

meghatároznunk és bemutatnunk. Az esetek többi részében – ahol nem kaptunk röntgendiffrakciós

mérésre

alkalmas

kristályokat

–

a

komplexek

szerkezetét

spektroszkópiai módszerekkel (IR, UV-Vis, AAS, ESR) határoztuk meg. A kinetikai mérésekhez dioxigénfelvétel és kibocsátás esetén gázvolumetriás módszert használtunk, az arra alkalmas termékek képződését pedig UV-Vis spektroszkópiával követtük nyomon. Az új vegyületek előállítása, preparatív munkák legtöbbször inert laboratóriumi körülmények között zajlottak Schlenk-technika alkalmazásával. Eredményeink és irodalmi ismereteink alapján minden esetben javaslatot tettünk a lehetséges reakciómechanizmusokra. Az új tudományos eredmények fejezetekre lebontva a következők: A fenoxazinon szintetáz enzim (PHS) modelljei: TEMPO pontosabban

szabadgyök

és

egy

metil-izoindolin-tartalmú

[Mn(6’-MeIndH)(H2O)2(CH3CN)](ClO4)2

mangánkomplex,

alkalmazásával

fenoxazinon

szintetáz modellreakciók teljes kinetikáját vizsgáltuk. Az enzimatikus reakció összetett szubsztrátuma helyett annak egyszerű formáját – o-amino-fenolt (és o-fenilén-diamint) – használtuk kísérleteinkben. A termék, 2-amino-3H-fenoxazin-3-on (és 2,3-diaminofenazin) képződése UV-Vis módszerrel követhető volt. A téma szakirodalma alapján a dimerizáció mechanizmusában gyökök jelenléte kimutatható. Ez a szóban forgó instabilis közti termék az OAP• gyök. Kialakulását TEMPO használatával indirekt módon bizonyítottuk, a komplex esetében pedig annak kellően erős redoxaktív sajátságával magyaráztuk. A reakciókinetikai állandók TEMPO rendszer esetén: k = 2,47 × 10-4 M-1 s-1 (OAP), és k = 3,60 × 10-6 M-1 s-1 (PDA), míg a mangán komplexnél KM = 5,13 × 10-3 M, kcat = 8,10 × 10-4 s-1, kcat/KM = 0,16 M-1 s-1 (OAP). A javasolt mechanizmusokat a (15-18) és (23-29) reakcióegyenletekben tüntettük fel.

94

Összefoglalás A pirokatechin oxidáz (CO) modelljei: A monofunkciós CO enzim modellezésére széles körben használják a 3,5-di-tercbutil-pirokatechint, mint szubsztrátumot. A belőle képződő benzokinon-származék megfelelő fényelnyeléssel rendelkezik a 400 nm feletti tartományban. A folyamat gyorsítására alkalmas katalizátorokat már számos különböző kutatócsoport előállított rézkomplexek formájában. Ezt egy új kristályszerkezetű vegyület, [Cu4(bnac)4(µ-EtO)4] formában nekünk is sikerült megtenni. Megfelelő katalitikus hatást értünk el a mangántartalmú

[Mn2(6’-Me2PAP)2Cl4]

komplexszel

is,

aminek

szerkezetét

spektroszkópiai módszerekkel azonosítottunk. A réztartalmú modell (KM = 5,13 × 10-3 M, kcat = 5,66 × 10-3 s-1, kcat/KM = 0,64 M-1 s-1) katalitikus hatását elektronküldő funkciós csoportokkal rendelkező másodlagos piridin ligandumok erősítették. A mangántartalmú modell (KM = 6,40 × 10-3 M, kcat = 46,60 × 10-3 s-1, kcat/KM = 7,25 M-1 s-1) esetén ezzel szemben a szubsztrátumokat változtattuk, azonban azok is erősebb elektronküldő jellegükkel (kisebb redox potenciál) mutattak sebességnövelő hatást. A javasolt mechanizmusok szerint a bioutánzó reakciók fontos lépése a pirokatechinát komplex kialakulása, ami a fémek megfelelő távolságának köszönhető. A környezetből származó dioxigén aktiválása ebben a formában történik, az pedig a DBCatH2 oxidációját eredményezi (33 és 36-39 reakcióegyenletek). A pirokatechin dioxigenázok (CTD) és metán-monooxigenázok (MMO) modelljei: Hasonló körülmények között, azonban eltérő oldószerben két – [Cu(bpy)(ox)]n és [Cu(bpy)(bma)H2O]n összetételű – réz(II)komplexet sikerült kristályos formában előállítani és szerkezetüket spektroszkópiai módszerekkel meghatározni. Az első kialakulása a metán-monooxigenáz enzim mechanizmusához közelíthető módon magyarázható (16. ábra). Az utóbbi, maleáto-ligandumot tartalmazó forma a pirokatechin dioxigenázhoz hasonló extradiol gyűrűhasítási mechanizmust enged feltételezni (44). A rendszerek behatóbb tanulmányozása érdekében rendre változtattuk azok egyes paramétereit. Ezt összegezve elmondható, hogy a reakciók szükséges feltétele réz(I)sók jelenléte, legalább kétfogú N-donor ligandum részvétele és DBCatH2, mint kezdeti Habsztrakciót biztosító reagens.

13

CH3CN és

18

O2 alkalmazásával egyértelműen igazoltuk,

hogy a [Cu(bpy)(ox)]n komplexben található oxalát képződése az oldószerként használt acetonitrilből vezethető le oxidatív C–H aktiváláson keresztül. 95

Összefoglalás A kataláz modelljei: A kataláz enzim funkciójának modellezésére egy, az enzimével megegyező fémet tartalmazó [Mn2L(OAc)(H2O)4] (H3L = 2,6-bisz-[(1-prolinil)-metil]-4-terc-butil-fenol) összetételű komplexet, és az ilyen célra ritkábban használt [Cu2(bpy)2(ba)4] és [Cu2(bpy)2(phga)4]

komplexeket

állítottuk

elő.

Az

utóbbi

szerkezetét

sikeres

átkristályosítás után röntgendiffrakciós módszerrel is meghatároztuk. A réz(II)-, és mangán(II)vegyületeknek a hidrogén-peroxid dizmutációjában mutatott katalitikus hatását vizsgáltuk a modellreakciók során. A sebességi állandók értékeire az első esetben kphga = 0,05 M-0,5 s-1 és kba = 0,62 M-1 s-1, míg a másodiknál kMn = 0,27 M-1 s-1 értékeket kaptunk. Mindezek az irodalomban szereplő réztartalmú modellek értékeivel összevethető nagyságrendűek, azonban a legjobb mangántartalmú modellekétől meglehetősen lemaradnak. Kicsi hatékonysága ellenére a [Mn2L(OAc)(H2O)4] komplexnél több cikluson keresztül tartó újrahasznosíthatóságot tapasztaltunk. A mechanizmusokra tett javaslatok szerint (49-51 és 55) réz komplexeink monomerré disszociált formában, hidroxo-, peroxo-, esetleg hidroperoxo-réz(III) oxigén adduktumokkal képesek katalitikus hatást kifejteni. A mangán komplex formáját megtartva, Mn2(II,II) és Mn2(III,III) oxidációs állapotok közötti átmenettel fejti ki katalitikus hatását.

96

Irodalomjegyzék

IRODALOMJEGYZÉK [1]

V. Leskovac, Comprehensive Enzyme Kinetics, Kluwer ebook, (2004)

[2]

E. Kőrös, Bioszervetlen Kémia, Gondolat, Budapest, (1980)

[3]

E. I. Solomon, M. J. Baldwin, M. D. Lowery, Chem. Rev., 92, 521 (1992)

[4]

J. M. Guss, H. C. Freeman, J. Mol. Biol., 169, 521, (1983)

[5]

A. Rompel, H. Fischer, D. Meiwes, K. Karentzopoulos, R. Dillinger, F. Tuczek, H. Witzel, B. Krebs, J. Biol. Inorg. Chem., 4, 56, (1999)

[6]

C. E. Barry, P.G. Nayar, T. P. Begley, Biochemistry, 28, 6323 (1989)

[7]

H. Nakazawa, F. E. Chou, P. A. Andrews, N. R. Bachur, J. Org. Chem., 46, 1493, (1981)

[8]

A. W. Smith, A. Camara-Artigas, M. Wang, J. P. Allen, W. A. Francisco, Biochemistry, 45, 4378 (2006)

[9]

H. Brockmann, H. Muxfeldt, Chem. Ber., 91, 1242, (1958)

[10]

E. Katz, H. Weissbach, J. Biol. Chem., 237, 882, (1962)

[11]

L. Prati, M. Rossi, N. Ravasio, J. Mol. Cat., 75, 347, (1992)

[12]

K. Anzai, K. Isono, K. Ohkuma, S. Suzuki, J. Antibiotics Ser. A., 13 (2), 125, (1960)

[13]

M. Giurg, E. Wiech, K. Piekielska, M. Gebala, J. Mlochowski, M. Wolanski, B. Ditkowski, W. Peczinska-Czoch, Pol. J. Chem., 80 (2), 297, (2006)

[14]

J. C. MacDonald, Phenazines. In: D. Gottlieb and P.D. Shaw editors, Antibiotics

Vol. II, Springer, New York (1967), pp. 52–65 [15]

J. Fernando, W. S. Morgan, J. W. Hausser, J. Org. Chem., 32 (4), 1120, (1967)

[16]

P. W. Iseminger, M. Gregory, T. J. R. Weakley, G. Caple, A. G. Sykes, J. Org. Chem., 62 (8), 2643, (1997)

[17]

L. I. Simándi, T. M. Barna, L. Korecz, A. Rockenbauer, Tetrahedron Lett., 34, 717 (1993)

[18]

T. M. Simándi, Z. May, I. C. Szigyártó, L. I. Simándi, Dalton Trans., 365 (2005)

[19]

T. Klabunde, C. Eicken, J. C. Sacchettini, B. Krebs, Nature Struct. Biol., 5, 1084 (1998)

[20]

Y. Matoba, T. Kumagai, A. Yamamoto, H. Yoshitsu, M. Sugiyama, J. Biol. Chem.,

281 (13), 8981, (2006) 97

Irodalomjegyzék

[21]

E. I. Solomon, U. M. Sundaram, T. E. Machonkin, Chem. Rev., 96 (7), 2563, (1996)

[22]

E. I. Solomon, F. Tuczek, D. E. Root, C. A. Brown, Chem. Rev., 94 (3), 827, (1994)

[23]

P. Meredith, J. Riesz, Photochem. Photobiol., 79 (2), 211, (2004)

[24]

J. Pawelek, A. K. Chakraborty, The Enzymology of Melanogenesis, in: The Pigmentary System, Univ. Press, Oxford, (1998)

[25]

J. R. Ros, J. N. Rodríguez-López, J. C. Espín, R. Varón, F. García-Canóvas, Int. J. Biochem. Cell. Biol., 28 (8), 917, (1996)

[26]

C. Eicken, B. Krebs, J. C. Sacchettini, Curr. Opin. Struct. Biol., 9, 677, (1999)

[27]

H. Ton-That, K. J. Magnus, J. Inorg. Biochem., 51, 65, (1993)

[28]

C. Eicken, F. Zippel, K. Büldt-Karentzopoulos, B. Krebs, FEBS Lett., 436, 293 (1998)

[29]

S. Mahapatra, J. A. Halfen, E. C. Wilkinson, G. Pan, C. J. Cramer, L. Que, W. B. Tolman, J. Am. Chem. Soc., 117, 8865, (1995)

[30]

J. Ackerman, F. Meyer, E. Kaifer, H. Pritzkow, Chem. Eur. J., 8, 247 (2002)

[31]

K. Selmeczi, M. Réglier, M. Giorgi, G. Speier, Coord. Chem. Rev., 245, 191 (2003)

[32]

C. Belle, K. Selmeczi, S. Torelli, J-L. Pierre, C. R. Chimie, 10, 271, (2007)

[33]

J. Mukherjee, R. Mukherjee, Inorg. Chim. Acta, 337, 429, (2002)

[34]

P. Gentschev, N. Möller, B. Krebs, Inorg. Chim. Acta, 300-302, 442, (2000)

[35]

N. Oishi, Y. Nishida, K. Ida, S. Kida, Bull. Chem. Soc. Jpn., 53 (10), 2847 (1980)

[36]

G. Di Nardo, C. Roggero, S. Campolongo, F. Valetti, F. Trotta, G. Gilardi, Dalton Trans., 33, 6507, (2009)

[37]

H. Fujisawa, O. Hayaishi, J. Biol. Chem., 243 (10), 2673, (1968)

[38]

H. Fujisawa, M. Uyeda, Y. Kojima, M. Nozaki, O. Hayaishi, J. Biol. Chem., 247 (13), 4414, (1972)f

[39]

L. Que, Jr., J. D. Lipscomb, R. Zimmermann, E. Münck, N. R. Orme-Johnson, W. H. Orme-Johnson, Biochim. Biophys. Acta, 452 (2), 320, (1976)

[40]

D. H. Ohlendorf, J. D. Lipscomb, P. C. Weber, Nature (London), 336, 403, (1988)

[41]

M. W. Vetting, D. A. D’Argenio, L. N. Ornston, D. H. Ohlendorf, Biochemistry, 39 (27), 7943, (2000)

[42]

M. W. Vetting, D. H. Ohlendorf, Struct. Fold. Des., 8, 429, (2000)

[43]

M. Costas, M. P. Mehn, M. P. Jensen, L. Que Jr., Chem. Rev., 104, 939, (2004) 98

Irodalomjegyzék

[44]

A Kita, S. Kita, I. Fujisawa, K. Inaka, T. Ishida, K. Horiike, M. Nozaki, K. Miki, Structure, 7 (1), 25, (1999)

[45]

A. K. Whiting, Y. R. Boldt, M. P. Hendric, L. P. Wacket, L. Que Jr., Biochemistry,

35 (1), 160, (1996) [46]

J. P. Emerson, E. G. Kovaleva, E. R. Farquhar, J. D. Lipscomb, L. Que Jr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105 (21), 7347, (2008)

[47]

A. Gibello, E. Ferrer, M. Martin, A. Garrido-Pertierra, Biochem J., 301, 145, (1994)

[48]

E. G. Kovaleva, J. D. Lipscomb, Science, 316, 453, (2007)

[49]

J. D. Lipscomb, Curr. Opin. Struct. Biol., 18, 644, (2008)

[50]

K. Duerr, J. Olah, R. Davydov, M. Kleimann, J. Li, N. Lang, R. Puchta, E. Hübner, T. Drewello, J. N. Harvey, N. Jux, I. Ivanović-Burmazović, Dalton Trans., 39, 2049, (2010)

[51]

L. Que Jr., Biochem. Biophys. Res. Commun., 84 (1), 123, (1978)

[52]

M. Ito, L. Que, Jr., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36 (12), 1342, (1997)

[53]

T. D. H. Bugg, G. Lin, Chem. Commun., 11, 941, (2001)

[54]

G. Speier, Z. Tyeklár, J. Mol. Catal., 57 (3), L17, (1990)

[55]

P. Barbaro, C. Bianchini, K. Linn, C. Mealli, A. Meli, F. Vizza, F. Laschi, P. Zanello, Inorg. Chim. Acta, 198-200, 31, (1992)

[56]

J. C. Murrell, I. R. McDonald, B. Gilbert, Trends Microbiol., 8, 221, (2000)

[57]

B. G. Fox, J. G. Borneman, L. P. Wackett, J. D. Lipscomb, Biochemistry, 29, 6419, (1990)

[58]

M. J. Rataj, J. E. Kauth, M. I. Donnelly, J. Biol. Chem., 266, 18684, (1991)

[59]

L. J. Murray, S. J. Lippard, Acc. Chem. Res., 40, 466, (2007)

[60]

R. S. Hanson, T. E. Hanson, Microbiol. Rev., 60, 439, (1996)

[61]

R. L. Lieberman, A. C. Rosenzweig, Nature, 434, 10954, (2005)

[62]

A. C. Rosenzweig, Biochem. Soc. Trans., 36 (6), 1134, (2008)

[63]

R. L. Lieberman, K. C. Kondapalli, D. B. Shrestha, A. S. Hakemian, S. M. Smith, J. Telser, J. Kuzelka, R. Gupta, A. S. Borovik, S. J. Lippard, Inorg. Chem., 45, 8372, (2006)

[64]

A. S. Hakemian, K. C. Kondapalli, J. Telser, B. M. Hoffman, T. L. Stemmler, A. C. Rosenzweig, Biochemistry, 47, 6793, (2008)

[65]

R. A. Himes, K. D. Karlin, Curr. Opin. Chem. Biol., 13, 119, (2009) 99

Irodalomjegyzék

[66]

S. I. Chan, S. S.-F. Yu, Acc. Chem Res., 41 (8), 969, (2008)

[67]

R. Boca, L. Dlhán, G. Mezei, T. Ortiz-Pérez, R. G. Raptis, J. Telser, Inorg. Chem.,

42 (19), 5801, (2003) [68]

P. P.-Y. Chen, R. B.-G. Yang, J. C.-M. Lee, S. I. Chan, Proc. Natl. Acad. Sci., 104 (37), 14570, (2007)

[69]

E. A. Lewis, W. B. Tolman, Chem. Rev., 104 (2), 1047, (2004)

[70]

H. R. Lucas, L. Li, A. A. Narducci Sarjeant, M. Vance, E. I. Solomon, K. D. Karlin, J. Am. Chem. Soc., 131, 3230, (2009)

[71]

P. P-Y. Chen, S. I. Chan, J. Inorg. Biochem., 100, 801, (2006)

[72]

S. Itoh, Curr. Opin. Chem. Biol., 10, 115, (2006)

[73]

D. Maiti, D-H. Lee, K. Gaoutchenova, C. Würtele, M. C. Holthausen, A. A. Narducci Sarjeant, J. Sundermeyer, S. Schindler, K. D. Karlin, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 47, 82, (2008)

[74]

S. J. Elliot, M. Zhu, L. Tso, H-H. T. Nguyen, J. H-K. Yip, S. I. Chan, J. Am. Chem. Soc., 119 (42), 9949, (1997)

[75]

A. Kunishita, H. Ishimaru, S. Nakashima, T. Ogura, S. Itoh, J. Am. Chem. Soc., 130 (13), 4244, (2008)

[76]

M. Rolff, F. Tuczek, Angew. Chem. Int. Ed., 47, 2344, (2008)

[77]

B. F. Gherman, D. E. Heppner, W. B. Tolman, C. J. Cramer, J. Biol. Inorg. Chem.,

11, 197, (2006) [78]

G. F. Gaetani, S. Galiano, L. Canepa, A. M. Ferris, H. N. Kirkman, Blood, 73, 334, (1989)

[79]

M. Yabuki, S. Kariya, R. Ishisaka, T. Yasuda, T. Yoshioka, A. A. Horton, K. Utsumi, Free Radical Biol. Med., 26, 325 (1999)

[80]

M. Vuillaume, Mutation Research/Rev. Gen. Toxicol., 186 (1), 43, (1987)

[81]

T. Miyamoto, M. Hayashi, A. Takeuchi, T. Okamoto, S. Kawashima, T. Takii, H. Hayashi, K. Onozaki, J. Biochem., 120 (4), 725, (1996)

[82]

B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge, Biochem. J., 219, 1, (1984)

[83]

M. Ogata, Hum. Genet., 86, 331, (1991)

[84]

W. A. Hunt, Alcohol, 13 (2), 147, (1996)

[85]

O. Loew, Science, 11 (279), 701, (1900)

100

Irodalomjegyzék

[86]

W. A. Schroeder, J. R. Shelton, J. B. Shelton, B. Robberson, G. Appel, Arch, Biochem. Biophys., 131 (2), 653, (1969)

[87]

M. R. N. Murthy, T. J. Reid, A. Sicignano, N. Tanaka, M. G. Rossmann, J. Mol. Biol., 152 (2), 465, (1981)

[88]

C. D. Putnam, A. S. Arvai, Y. Bourne, J. A. Tainer, J. Mol. Biol., 296, 295, (2000)

[89]

F. Haber, J. Weiss, Naturwissenschaften, 20, 948, (1932)

[90]

A. Sigel, H. Sigel, R. K. O. Sigel, Metal Ions in Life Sciences, Volume 1 Neurodegenerative Diseases and Metal Ions, John Wiley & Sons Ltd, (2006)

[91]

C. Rovira, ChemPhysChem., 6 (9), 1820, (2005)

[92]

H. N. Kirkman, G. F. Gaetani, Trends Biochem. Sci., 32 (1), 44, (2007)

[93]

E. A. Delwice, J. Bacteriol., 81, 416, (1961)

[94]

M. A. Johnston, E. A. Delwice, J. Bacteriol., 83, 936, (1962)

[95]

Y. Kono, I. Fridovich, J. Biol. Chem., 258 (10), 6015, (1982)

[96]

V. V. Barynin, A. A. Vagin, W. R. Melik-Adamyan, Dokl. Akad. Nauk SSSR, 288 (4), 877, (1986)

[97]

S. V. Antonyuk, V. R. Melik-Adamyan, A. N. Popov, V. S. Lamzin, P. D. Hempstead, P. M. Harrison, P. J. Artymyuk, V. V. Barynin, Crystallog. Rep., 45, 105, (2000)

[98]

V. V. Barynin, M. M. Whittaker, S. V. Antonyuk, V. S. Lazmin, P. M. Harrison, P. J. Artymiuk, J. W. Whittaker, Structure, 9, 725, (2001)

[99]

S. Ménage, J-J. Girerd, A. Gleizes, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 6, 431, (1988)

[100] M. M. Whittaker, V. V. Barynin, S. V. Antonyuk, J. W. Whittaker, Biochemistry,

38, 9126, (1999) [101] J. Reedijk, E. Bouwman, Bioinorganic Catalysis Second Ed., Revised and Expanded, Marcel Dekker, Inc., Chapter 12. by J. Wikaira & S. M. Gorun, (1999) [102] E. J. Larson, V. L. Pecoraro, J. Am. Chem. Soc., 113, 3810, (1991) [103] E. J. Larson, V. L. Pecoraro, J. Am. Chem. Soc., 113, 7809, (1991) [104] A. E. M. Boelrijk, G. C. Dismukes, Inorg. Chem., 39 (14), 3020, (2000) [105] A. Gelasco, S. Bensiek, V. L. Pecoraro, Inorg. Chem., 37 (13), 3301, (1998) [106] J. Gao, A. E. Martell, J. H. Reibenspies, Inorg. Chim. Acta, 346, 32, (2003) [107] S. Ménage, J. M. Vincent, C. Lambeaux, M. Fontecave, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 14, 2081, (1994) 101

Irodalomjegyzék

[108] N. M. F. Carvalho, A. Horn Jr., R. B. Faria, A. J. Bortoluzzi, V. Drago, O. A. C. Antunes, Inorg. Chim. Acta, 359, 4250, (2006) [109] S. Signorella, A. Rompel, K. Büldt-Karentzopoulos, B. Krebs, V. L. Pecoraro, J-P. Tuchagues, Inorg. Chem., 46 (25), 10864, (2007) [110] J. Gao, J. H. Reibenspies, A. E. Martell, S. Yizhen, D. Chen, Inorg. Chem. Commun., 5, 1095, (2002) [111] M. Le Roes-Hill, C. Goodwin, S. Burton, Trends Biotechnol., 27 (4), 248, (2009) [112] J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier, J. Mol. Catal. A: Chem., 180, 91, (2002) [113] J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier, React. Kinet. Catal. Lett., 75 (2), 367, (2002) [114] Z. Szeverényi, E. R. Milaeva, L. I. Simándi, J. Mol. Cat., 67 (2), 251, (1991) [115] J. Kaizer, G. Baráth, R. Csonka, G. Speier, L. Korecz, A. Rockenbauer, L. Párkányi, J. Inorg. Biochem., 102, 773, (2008) [116] T. M. Simándi, L. I. Simándi, M. Győr, A. Rockenbauer, Á. Gömöry, Dalton Trans., 1056, (2004) [117] T. Horváth, J. Kaizer, G. Speier, J. Mol. Catal. A: Chem., 215, 9, (2004) [118] W. O. Siegl, J. Org. Chem., 42 (11), 1872, (1977) [119] É. Balogh-Hergovich, J. Kaizer, G. Speier, G. Huttner, A. Jacobi, Inorg. Chem., 39 (19), 4224, (2000) [120] K. Nakamoto, Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds, Wiley-Interscience, New York, 1978 [121] B. J. Hathaway, A. E. Underhill, J. Chem. Soc., 3091, (1961) [122] J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier, M. Giorgi, M. Réglier, J. Mol. Catal. A: Chem.,

235, 81, (2005) [123] Á. Kupán, J. Kaizer, G. Speier, M. Giorgi, M. Réglier, F. Pollreisz, J. Inorg. Biochem., 103, 389, (2009) [124] J. Kaizer, J. Pap, G. Speier, L. Párkányi, L. Korecz, A. Rockenbauer, J. Inorg. Biochem., 91, 190, (2002) [125] K. Nakamoto, A. E. Martell, J. Chem. Phys., 32, 588, (1960) [126] M. Mikami, I. Nakagawa, T. Shimanouchi, Spectrochim. Acta A., 23, 1037, (1967) [127] H. Adams, N. A. Bailey, I. A. Campbell, Q. He, D. E. Fenton, J. Chem. Soc. Dalton Trans., 11, 2233, (1996)

102

Irodalomjegyzék

[128] A. W. Addison, T. N. Rao, J. Reedijk, J. Van Rijn, G. C. Verschoor, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 7, 1349, (1984) [129] E. Monzani, L. Quinti, A. Perotti, L. Casella, M. Gullitti, L. Randaccio, S. Geremia, G. Nardin, P. Faleschini, G. Tabbi, Inorg. Chem., 37, 553, (1998) [130] J. Kaizer, R. Csonka, G. Baráth, G. Speier, Trans. Met. Chem., 32, 1047, (2007) [131] A. B. P. Lever, L. K. Thompson, W. M. Reiff, Inorg. Chem., 11 (1), 104, (1972) [132] G. Marongiu, E. C. Lingafelter, Acta Cryst., B38, 620, (1982) [133] J. A. Doull, L. K. Thompson, Can. J. Chem., 58, 221, (1980) [134] L. K. Thompson, V. T. Chacko, J. A. Elvidge, A. B. P. Lever, R. V. Parish, Can. J. Chem., 47, 4141, (1969) [135] A. Kruis, in Landolt-Börnstein, Board 4, Teil 4., Springer-Verlag, Berlin, (1976), pp. 269 [136] G. Ram, A. R. Sharaf, J. Ind. Chem. Soc., 45, 13, (1968) [137] M. U. Triller, D. Pursche, W. Y. Hsieh, V. L. Pecoraro, A. Rompel, B. Krebs, Inorg. Chem., 42, 6274, (2003) [138] Y. Hitomi, A. Ando, H. Matsui, T. Ito, T. Tanaka, S. Ogo, T. Funabiki, Inorg. Chem., 44, 3473, (2005) [139] G. Blay, I. Fernández, J. R. Pedro, R. Ruiz, T. Temporal-Sánchez, E. Padro, F. Lloret, M. C. Munoz, J. Mol. Catal. A, 250, 20, (2006) [140] M. Pascaly, M. Duda, F. Schweppe, K. Zurlinden, F. K. Müller, B. Krebs, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 828, (2001) [141] R. Csonka, J. Kaizer, M. Giorgi, M. Réglier, L. Hajba, J. Mink, G. Speier, Inorg. Chem., 47, 6121, (2008) [142] K. Ley, Angew. Chem., 74, 871, (1962) [143] M. Hernández-Molina, J. González-Platas, C. Ruiz-Pérez, F. Lloret, M. Julve, Inorg. Chim. Acta, 284, 258, (1999) [144] H. Oshio, U. Nagashima, Inorg. Chem., 31 (15), 3295, (1992) [145] G. M. Larin, V. F. Shul’gin, E. D. Mel’nikova, V. Y. Zub, A. N. Chernega, Rus. Chem. Bull. Int. Ed. 58 (7), 1342, (2009) [146] T. Funabiki, A. Mizoguchi, T. Sugimoto, S. Tada, M. Tsuji, H. Sakamoto, S. Yoshida, J. Am. Chem. Soc., 108, 2921, (1986)

103

Irodalomjegyzék

[147] J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier, M. Giorgi, M. Réglier, J. Mol. Catal. A: Chem.,

236, 12, (2005) [148] R. G. Inskeep, J. Inorg. Nucl. Chem., 24 (7), 763, (1962) [149] E. Labisbal, J. A. G. Vazquez, J. Romero, S. Picos, A. Sousa, A. Castineiras, C. M. Mossmer, Polyhedron, 14 (5), 663, (1995) [150] S. P. Perlepes, E. Libby, W. E. Streib, K. Folting, G. Christou, Polyhedron, 11 (8), 923, (1992) [151] A. Lekchiri, A. Castellano, J. Morcellet, M. Morcellet, Eur. Polym. J., 27 (11), 1271, (1991) [152] J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier, React. Kinet. Catal. Lett., 94 (1), 157, (2008) [153] I. Sougandi, R. Mahalakshmi, R. Kannappan, T. M. Rajendiran, R. Venkatesan, P. S. Rao, Trans. Met. Chem., 27, 512, (2002) [154] D. F. Shriver, M. A. Drezdzon, The Manipulation of Air-Sensitive Compounds, John Wiley and Sons, New York (1986) [155] D. D. Perrin, W. L. Armarego, D. R. Perrin, Purification of Laboratory Chemicals, 2nd ed., Pergamon, New York (1990)

104