EFEKTIVITAS PENAMBAHAN BERBAGAI JENlS DAN KONSENTRASI SERUM SERTA KBKULTUR §El-SEL EPITEL TUBA FALLOPll DAN KUMULUS PADA TCM - 199 DALAM PRODUKSl EMBRIO SAP1 /Ny/rRO 3
PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANlAN BOGOR 1997
Et:EK'I'IVl'l'hS I'ENAMBAHAN BEKBAGAI JMNIS DAN KONSEN'I'KASI SERUM SEK'I'A KOKUCI'UK SEL-SEL EPI'I'EL 'I'UHA FALLOPII DAN KUMULUS I'ADA 'I'CM-199 DALAM PKODUKSI EMBKIO SAl'l IN VI'I'KO 'I'he efiectivenws of suplementation of various type.. and concentriitions of scra and cc~ulturesd Fallopian tube epithelia1 and cumulus cells in 'I'CM-199 on in vitro hovine emhryo priduction. HENDKI (NKP :925UllBKY)
I
This research was designed in four experiments to determine the effectiveness of supplementation of various types and concenbations of sera and cocultures of Fallopian tube epithelial and cumulus cells in 'I'issue Cutture Medium 199 (TCM-199) on in vitro bovine embryo production. In the first experiment oocytes were collected by aspiration method from ovaries obtained from the slaughter house. Oocytes were classified into three grades (A, B and CID) according to their qualities. The second experiment dealt with maturation of cmcytes of A and B qualities (COCs, cumulus oocyte complexes) in TCM-199 supplemented with 5, 10, 15 and 20 percents of fetal bovine serum (FBS), estrous heifer serum (SHg) and m e n days after estrous heifer serum (SH7), respectively, at 38.S°C. 5.0% Cq2 in humidified air for 22 to 24 hours. Oocytes were thea f e d i d in vitro with capcitated spematozoa. After six to eight hours of culturing, the presumptive zygotes were tiansferred into 100 pl drop of in virro culture medium for development of embryos. These embryos were then incubated for 4 x 48 hours, evaluated and its culture medium was changed with a fresh one every 48 hours. In the third e q m b a COCs resulted fmm the first eqeakem were matured and fertilized using the best &m obtained from the seamd . The matured C O a were fertihed using fi-e& rod frozen-thawed b n h r z w m p a r e the effectiveness of these semen. In the fourthexperimentCOCsresaIting fromthe first-were matured and fertilized based on the best d t s obtained from the second and third experiments. The f e d i x d oocytes were cultured in the control medium (TCM-199 20% SH7), comparing it to the ones cultwed in coculture media of Fallopian tube epithelial and cumulus cetls. Data from the first, third and fourth experiments were amdonned by Jx+0,5 and analyzed by one way clasification test. Data from the second experiment were transformed by arcsin Jx and analized by 3 x 4 factorial design with two periods of time as replicates. Results from these experiments indicate that the supplementation of 10% SH7 promotes the highest maturation rate (78.55%), cleavage rate (49.60%). the rate of emhryo development to eight to 16 cells (72.23%) and momla rate (27.75%). However, the coculture systems of Fallopian tube epithelial cells and of cumulus cells do not improve the morula rate. It is concluded that SH7 may be used as substitute for F a in TCM-199 for in virrr) hovine m y t e maturation and embryo production.
+
KINGKASAN HENDRI, 1997. Efektivitas Penambahan Berbagai Jenis dan Konsentrasi Serum serta Kokultur Sel-Sel Epitel Tuba Fallopii dan Kumulus pada TCM-199 dalam Produksi Embrio Sapi In Vitro. (Di bawah bimbiigan MOZES R. TOELlHERE sebagai Ketua, HARlMURTl MARTOJO, IMAN SUPRIATNA, TUTY LASWAKDI YUSUF dan BAMBANG PURWANTARA sebag&Anggota). Pengembangan dan penerapan bioteknologi repmduksi yane bertujuan untuk meningkatkan populasi dan mutu genetik ternak kini m e n j d salah satu prioritas utama dqlam pembangunan peternakan di Indonesia. Dalam kaitannya dengan bioteknologi tersebut upaya untuk memprodultsi embrio di laboratorium melalui teknik fertilisasi in virro (FIV), sebagai dasar untuk men embangkan bioteknologi reproduksi yang lebih mutakhir, seperti milrromanipufasi dan rekayasa genetik pada embrio, memegang peranan yang semakin penting. Teknik FlV berpotensi untuk meningkatkan daya reproduksi sapi betina setelah habis masa produksinya (diatlcir) dan dipotong di RPH. Teknik FIV efektif untuk menghasilkan embrio pada berbagai taraf perkembangan di laboratorium, baik untuk kepentingan penelitian dasar dan terapan ataupun untuk ditransfer pada induk sapi resipien. Kendala utama dalam pengembangan teknii FIV adalah belum ditemukannya kondisi medium yang menyerupai keadaan lin@angan di dalam tubuh (in vivo) sehingga hasil FIV sangat bervariasi dan relatif rendah. Untuk mengatasi kendala tersebut dilakukan penelitian guna mencari jenis dan konsentrasi serum sapi yang terbaik yang disuplementasikan ke dalam media pematangan oosit dan kultur embrio in vitro, walaupun sebagian besar kebutuhan nutrisi untuk pematangan oosit dan perkembangan embrio telah terpenuhi oleh medium buatan seperti tissue culntre medium 199 (1%M-199). Hal ini disebabh karena serum mengandung berbagai macam protein, asam amino, polipeptida dan faktor penumbuh, asam lemak, hormon dan mineral. Unsur-unsur tersebut merupakm bahan-bahan yang diperlukan di dalam medium pematangan oosit, medium fertilisasi dan medium perkembangan embrio in vitro. Keberhasilan mensubstitusi penggunaan FBS dengan serum sapi yang dapat diproduksi di laboratorium sen: din untuk meningkatkan produksi embrio in vino merupakan salah satu faktor penting bagi perkembangan teknik PIV di Indonesia. Pengujian potensi spmnatozoa yang berasal dari semen segar dan semen beku untuk membuahi oos~tyang dimatangkan in vitro serta penggunaan sistem kokultur selapis sel-sel epitel tuba Fallopii atau sel-sel kumulus diharapkan dapat mempertinggt tingkat keberhasilan perkembangan embrio sapi in vine. Penelitian ini bertujuan untuk : 1. mengetahui pengaruh struLtur fisiologik ovarium terhadap jumlah dan kualitas oosit yang dapat diaspirasi per ovarium sapi yang dipotong di RPH; 11. menguji pengaruh pnggunaan serum sapi yang ~ s atau pada hari ketu uh setelah estrus (SH7) sebagai diambil pads saat e s t ~ (SHO) pengganti fetal bovine serum (FBS, serum impor omersiaf) pada tingkat konsentrasi 5, 10, 15 dan 20 persen di dalam TCM-199 terhadap angka matangan oosit, angka cleavage (angka fertilisasi), angka embrio 8 sampai 6 sel, dan angka morula; 111. menguji pengaruh jenis semen segar dan semen beku terhadap angka fertilisasi dan perkembangan embrio in vitro; dan 1V. menguji pengaruh kokultur selapis sel-sel epitel tuba Fallopii atau sel-sel kumulus terhadap perkembangan embrio in vitro.
i
P"
Penelitian yang dilakukan selama 22 bulan dari bulan November 1994 sampai bulan Agustus 1996 mencakup empat seri percobaan sesuai dengan tujuan tersebut di atas. Penelitian dilakukan di Laboratorium Bagian Keproduksi dan Kebidanan Fakultas Kedokteran Hewan IPB dan di Laboratorium Virologi dan Kultur Jaringan, Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian Institut Pertanian Bogor. Percobaan 1. Oosit diperoleh dari berbagai shuktur ovarigm yang diambil dari 2 17 ekor sapi betina dipotong di RPH. Tramportasi ovatia dari RPH ke laboratorium men larutan fisiologilr (0.9% NaCI) steril yang streptomisin 100 c@l pada suhu 37Oc, mengandung penisilin 1 tiga sampai lima jam setelah sapi Jg0n.g: dt Oosit diaspiras: dari folikel berdiameter 2.0 sampai 6.0 mm menqgu sinnge 10 ml dengan ukuran jarum 21 Ci yang berisi 3.0 ml medium aspuasi oosit (D-PBS 3.0% PBS). P e n d a b kualitas oosit hasil aspirasi didasarkan pa& kriteria keutuhan dan kuantitas sel-sel kumulus yang menyelimuti oosit, kehomogenan ooplasma dan performans korona radiata serta kecerahan warm oosit secara keseluruhan (Loos et al., 1989 dan Laurincik er al., 1992). Oosit yang diperoleh dikelompokkan ke dalam kualitas A, B dan C/D sesuai dengan struktur masing-masing ovarianya. Percobaan 11. Lima sampai 10 oosit kualitas A dan B (hasil percobaan 1) dimasukkan ke dalam tetes-tetes (100 pl) media perlakuan pematangan oosit dm ditutup dengan minyak mineral. Perlakuan media pematangan oosit mencakup tiga jenis sera (FBS, S t 4 dan SH ) dengan empat t i n e t konsentrasi (5, 10, 15 dan 20 persen) di dalam ~ c M - I ~Oosit . tersebut dimkubasi selama 22 sampai 24 jam pa& suhu 38.s0c, 5.0% C02 di dalam udara dengan kelembaban nisbi 90 sampai 100 persen. Evaluasi kematangan oosit dilakukan secara morfologik (visual) berdasarkan luiteria yang dinyatakan oleh Chye (1986). Metode kapasitasi spermatozoa untuk fertilisasi in virro menurut prosedur penelitian yang dilakukan oleh Niwa er al. (1992), yaitu menggunakan medium Brackett dan Oliphant (BO) yang mengandung caffeine 5.0 mM, heparin 10 pglml dan BSA 1.0%. Oosit yang telah difertilisasi selama enam sampai delapan jam dilcultur di dalam medium perlakuan yang sama dengan medium pematangan oosit. Evaluasi perkembangan embno dan penggantian media dilakukan setiap 48 jam sampai. hari ke-11 semenjak fertilisasi in virro. Evaluasi perkembangan embrio secara morfologik didasarkan pada pengamatan jumJah blsstomer sesuai dengan tahap perkembangan embrio in virro. Percobaan 111. Oosit hasil percobaan 1 dimatangkan menurut prosedur terbaik hasil percobaan 11. Oosit yang matang difertilisasi dengan yang berasal dari semen segar atau semen b e h yang dicairkan kemb 1 &lam au bersuhu 37% selama dua sampai tiga menit. Prosedur evaluasi kematangan yiapan spermatozoa yang berasal dari semen segar dan semen b e b untuk ertilisasi in virro dan kultur embrio dilakukan menurut ""v sedur terbaik di dalam percobaan 11. Oosit yang telah difertilisasi dikultur m d u m kultur embrio yang terbaik menurut hasil percobaan 11. Evaluasi perkembangan embrio dilakukan sama seperti pada percobaan 11. Percobaan 1V. Oosit yang diperoleh dari percobaan 1 dimatangkan dan difertilisasi dengan semen segar menurut hasil terbaik percobaan 11 dan 111. Oosit yang telah difertilisasi diinkubasi dalam tiga perlakuan media kultur embrio yaitu medium kontrol (TCM-199 20% serum SH7), medium kokultur selapis sel-sel epitel tuba Fallopii dan sel-sel kumulus. Evaluasi perkembmgan embno dilakukan sama rti pada percobaan 11. Parameter yang diamati adalah rataan jumlah oosit alitas A, B, atau CID per ovarium (pada masing-masing struktur
+
y--!a
P"
&
+
%
ovarium), angka pematangan oosit in vino (maturdon mte), angka cleavage (fertilization rate), angka embrio delapan sampai 16 sel dan an& morula (morularare). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ovarium yang hanya memiliki folikel dominan (FD) &pat men ilkan satu sampai 15 oosit kualitas A per ovarium. O w i u m yang memilED ba& dmgm atau -a corpus luteurn (CL) menghasilkan rataan jumlah oosit kualitas A per ovanum yang tinggi, masing-masing 5.00k4.86 dan 4.17f 3.17 oosit per ovarium. dan sebaliknya menghasilkan rataan jumlab oosit kualitas CJD yang rendah. " Ovarium yang hanya memiliki CL menghasikan rataan jumlah oosit kualitas A paling rendah yaitu 2.34f 2.19 oosit per ovarium, dan s e b a l h a menghasilh rataan jumlah oosit kualitas CID paling tinggi yaitu 3.31f2. 4 oosit per ovarium. Kataan jumlah omit kualitas B tidak berbeda nyata di antara struldur ovarium yang berbeda (dengan atau tanpa FD dan CL). Keberhasilan untuk mendapatkan jumlah dan kualitas oosit yang tinggi berkaitan erat dengan dinamika gelombang pertumbuhan dan perkembangan folikel pa& ovarium sapi. Jenis serum SH7 dengan konsentrasi terbaik 10 persen dapat digunakan sebagai pengganti FHS di &lam TCM-199 untuk pematangan oosit dan kultur embrio in vitro. Penambahan 10 persen serum SH ke dalam media pematangan oosit dan kultur embrio in virro dapat menghasidan angka pematangan oosit, angka cleavage, angka embrio delapan sampai 16 sel dan angka morula masingmasing 78.55 % , 49.60%. 72.23 % dan 27.75%. Jenis serum SH7 menghasilkan angka pematangan oosit in vitro dan angka momla lebih tingg~drbandingkan dengan SHO,tetapi angka pematangan oosit in vitro kedua jenis serum sapi tersebut tidak berbeda nyata dibandingkan dengan PBS. Angka cleavage dan angka embrio delapan sampai 16 sel di antara ketiga jenis serum SH7, FBS dan SHO tidak berbeda nyata. Keefektivan serum sapi di &lam medium pematangan oosit in vitro bervariasi disebabkan besarnya variasi konponen-komponen yang terdapat di dalam serum seperti asam amino (Fallon et al., 1988), hormon progesteron dan estrogen (Henricks et al., 1972). berbagai macam protein, asam lemak, hormon insulin, mineral dan faktor penumbuh (Freshney, 1985 dan Malole, 1990). Fetuin (glikoprotein) yang terdapat di &lam PBS &pat mencegah C y a U M pelusi& selama pematangan oosit in vitro (Schroeder et al., 1 Zhang et al., 1991;' Yamazaki dan Ishibashi, 1990). Serum yang diambil pa& hari ketujuh setelah estrus (SH7) mengandung estrogen kurang dari 7.0 pglml (pa& sapi yang tidak bunting) dan kurang dari 5.0 pglml @a& sapi yang bunting), dan progesteron mendekati 8.2 nglml @a& sapi yang tidak bunting) (Henricks et al., 1972). Menurut Lorenzo et al. (1997) angka pematanqan oosit in vino tertinggi didapatkan pa& rasio estrogen dan progesteron pa& tmgkat 2.10 nglml dan 4.90 nglml. Gordon (1994) juga menyatakan bahwa pematangan oosit dipengaruhi oleh perubahan keseimbangan estrogen dan progesteron di dalam folilrel. Namun secara frsiologik peranan progesteron &lam proses pematangan oosit tidak diketahui dengan jelas. Sedangkan angka pematangan oosit in vitro yang lebih rendah pa& penambahan SHO diduga disebabkan kandungan konsentrasi estrogen yang tinggi pada serum tersebut. Menurut Kruip et al. (1988) peme.ntase abnormalitas pembentukan spindle dan pemunculan badan kutub meningkat secara tajam pa& oosit yang dikultur selama 12 sampai 20 jam di dalam medium yang mengandung konsentrasi estradiol yang tinggi (37 pmolll). Sedangkan konsentrasi estrogen di &lam plasma darah perifera1 sapi pada pada hari estrus berkisar antara 15 sampai 25 pglml (Gordon, 1994 dan Hemcks et ul., 1972).
7
Penggunaan semen segar dapat menghasilkan angka fertilissi in virro (58.49%) lebih tinggi dibandingkan dengan penggunaan semen beku (46.52%). Penggunaan semen segar dan semen beku tidak berpengaruh nyata terhadap perkembangan embrio sampai taraf morula (angka embrio 8 sampai 16 sel dan angka morula). Angka fertilisasi in vitro yang lebih rendah pada penggunaan semen beku disebabkan karena pembekuan semen dapat menurunkan viabilitas dan motilitas spermatozoa. Penurunan viabilitas dan motilitas spermatozoa yang berasal dari semen beku disebabkan oleh disintegrasi membran plasma sperm baik intraselular ataupun selubung lipoprotein dinding sel @(termasuk protein-protein akrosomal) yang terjadi secara drastis selama proses pembekuan dan pencairan kembali (Artiga et al., 1993; 'l'oelihere, 1985a,b; Garde et al., 1993). Angka cleawge (angka fertilisasi) in vitro di dalam media kokultur selapis sel-sel epitel tuba Fallopii dan sel-sel kumulus adalah 68.46% dm 54.8096, keduanya tidak berbeda nyata dibandingkan dengan 58.49% di dalam medium kontrol. Demikian juga angka embrio 8 sampai 16 sel tidak berbeda nyata di antam ketiga media kultur embrio tersebut. Sebaliknya angka morula sebesar 18.23% di &lam medium kontrol lebih tinggi baik dibandingkan dengan penggunaan medium kokultur selapis sel-sel epitel tuba Fall ii ataupun dengan penggunaan medium kokultur sel-sel kumulus (8.5096 dan 0 % ~ ) . Keefektivan sistem kokultur oosit yang telah d i f d i s a s i dengan berbagai macam sel somatik untuk meningkatkan perkembangan embrio masih menjadi perdebatan. Bavister (1993) menekankan pentingnya kontrol kualitas pembuatan medium dengan mengeliminasi beberapa komponen biokimia dalam medium. Sedangkan menurut Gandolfi et u1. (1988) kultur sel selapis (sef-sel epitel tuba Fallopii) cepat mengalami diferensiasi dan tidak mempunyai karakteristik bentuk kolumnar, silia dm mengalami pembelahan sel yang teratur yang jarang terjadi pada kondisi in vivo. Perubahan-perubahan tersebut menyebabkan sel kehilangan sifat-sifat steroidogenik disebabkan reseptornya tidak aktif atau hilang sama sekali. Hal ini pula yang menyebabkan kultur sel selapis tidak &pat menciptakan keadaan lingkungan seperti di dalam saluran telur sendiri. Dapat disimpulkan bahwa ovarium yang memiliki folikel dominan menghasilkan jumlah dan kualitas oosit yang lebih tinggi. Penambahan serum sapi yang diambil pa& hari ketujuh setelah estrus (SH7) pada konsentrasi 10 persen dapat digunakan sebagai pengganti FBS di dalam TCM-199 untuk pematangan' oosit dan kultur embrio in virro. Penambahan serum SH7 ke dalam medii pematangan oosit dan kultur embrio in vitro dapat mengeliminasi penggunaan kokultur selapis sel-sel epitel tuba Fallopii atau kokultur sel-sel kumulus. Untuk menghasilkan angka fertilisasi in virro yang lebih tinggi disarankan untuk menggunakan spermatozoa yang berasal dari semen segar.
EFEKTIVITAS PENMIAHAH BERBAGAI JENIS DAN KONSENTRASI SERW SERTA KOKULTUR SEL-SEL EPITEL TUBA FALLOPII DAN K W L U S PADA TCM-199 DALAM PROWKSI EIBRIO SAP1 I N YZTRO
Oleh HENDKI NKP. 92530lBKP
Disertasi sebagai saiah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi Heprrduksi Program Pascasarjana, lnstitut Pertanian Bogor
PKOtiKAM PASCASAKJANA INSI'I'I'U'I' PEKI'ANIAN B W O K BWOK
1997
Disertasi
: EFEKTlVlTAS PENAMBAHAN BERBAGAI JENlS DAN KONSENTKASl SERUM SERTA KOKULTUR SEL-SEL EPlTEL TUBA FALLOAI DAN KUMULUS PADA TCM199 DALAM PRODUKSI EMBRIO SAP1 IN VITRO
Nama Mahasiswa : H E N D R I Nomor Pokok : 925"0/BKP Menyetujui: 1. Komisi Pembimbing
(Prof. Dr. Mozes R. Toelihere, MSc.)
J$cii& Anggota
(Dr. Tuty L. Yusuf, MS.) Anggota
Anggota
(Dr. Bambang Yurwantara, MSc.) Anggota
2. Ketua Program Studi Biologi Reproduksi
Tanggal lulus : 4 Desember 1997.
asajana IPB
Penulis adalah putera pertama Ayahanda H. Ahmad Maulana dan lhunda Syafni Kasimin.
Dilahirkan tanggal 29 Juli 1962 di Kodya Wyakumhuh, Sua
rnatera Barat.
Penulis mengikuti pendidikan sekolah dasar sampai sekolah menengah atas (SMA) dari tahun 1969 sampai 1982 di Kodya Payakumbuh. Pada tahun 1982 melanjutkan pendidikan ke lnstitut Pertanian Bogor melalui Proyek Perintis 11. Lulus sarjana peternakan lnstitut Pertanian Bogor pa& tahun 1986. Diangkat menjadi pegawai negeri dari tahun 1988 sampai sekarang, sehagai staf pengajar di Jurusan Produksi 'I'ernak Fakultas Peternakan Universitas Andalas ( U N A N D ) Padang.
Pada tahun 1989 memperoleh heasiswa dari 'I'MPD Ditjen
Dikti Departemen P dan K untuk memperdalam ilmu pada Progridm Studi Biologi Keproduksi Program Pascasarjana IPB, dan memperoleh gelar Magister Sain pada tanggal 3 Januari 1992. Program S3 pada Program Studi Biologi Keproduksi Program Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor dimulai tahun 1992. Penulis menikah dengan Dm. Linda Gusrini Fadri, Apt. pada tahun 1991, dan kini adalah seorang ayah dengan dua orang anak, lndri Fajria Musfiroh (enam tahun) dan Kiflci Anshory Hendri (satu tahun).
KATA YENGANTAR
'l'eknik FlV berpotensi untuk meningkatkan daya reproduksi sapi betina haik sema.sa ataupun setelah habis masa produksinya (diafkir) dan dipotong di KPH.
'I'eknik FIV efektif untuk menghasilkan embrio pad& berbagai taraf
perkembangan di laboratorium, baik untuk kepentingan penelitian dasar dan tcrapan ataupun untuk ditransfer pada induk sapi resipien. Kendala utama dalam pengembangan teknik FIV adalah belum ditemukannya kondisi medium yang menyerupai keadaan lingkungan seperti di dalam tubuh (in v i w ) sehingga hasil PlV masih rendah
d m bervariasi.
Untuk mengatasi kendala tersebut dilakukan
penelitian guna mencari jenis dan konsentrasi serum sapi yang lebih baik yang disuplementasikan ke dalam media pematangan oosit dan kultur embrio in vitro, walaupun sebagian besar kebutuhan nutrisi untuk pematangan oosit dan perkembangan embrio telah terpenuhi oleh medium buatan seperti tissue culntre medium 199 ('I'CM-199).
Serum mengandung herhagai macam protein, asam amino, plipeptida dan faktor penumbuh, asam lemak, hormon dan mineral.
Unsur-unsur tersebut
merupakan bahan-bahan yang diperlukan di dalam media pematangan oosit dan perkembangan embrio.
Pengujian potensi spermatozoa sapi yang berasal dari
semen segar dan semen beku untuk memfertilisasi oosit yang dimatangkan in virro serta penggunaan sistem kokultur sel-sel epitel tuba Fallopii atau sel-sel kumulus diharapkan &pat mempertinggi tingkat keberhasilan perkembangan embrio sapi in virro. lnformasi demikian telah mendorong penulis untuk melakukan peneli-
tian dan menulis disertasi ini. Kesempatan yang diberikan untuk mengikuti Program Doktor di lnstitut Pertanian Bogor (IPB) merupakan anugerah Allah Subhaanahu Wata'aala yang
sangat penulis syukuri. Kesempatan ini menjadi sangat berharga sebagai kelengkapan bekal menghadapi perkembangan ilmu pengtahuan, pendidikan dan pengabdian dimasa yang akan datang. Semenjak mengikuti program Doktor sampai sekarang tidak terhitung %
banyaknya bantuan yang diperoleh baik dalam bentuk jasa maupun biayalmateri sehingga penelitian dan penulisan disertasi ini dapat dilaksanakw. Penulis mengucapkan terima kasih dan menyampaikan penghargaan yang tinggi kepada Bapak Prof. Dr. Mozes K. 'Lbelihere, MSc. Sebagai ketua komisi pembimbing beliau telah memberikan perhatian yang sungguh besar.
Seorang
Guru Besar terkemuka dalam bidang ilmu Pisiologi Keproduksi dan lnseminasi Buatan pada temak ini amat berjasa dalam memberdayakan penulis tatkala jatuhbangun dalam melakukan penelitian. Bimbingan dan dorongan moril yang telah Bapak berikan sangat berkesan bagi penulis. Selanjutnya penulis mengucapkan terima kasih dan menyampaikan perhargaan yang tinggi kepada Bapak Prof. Dr. H. Harimurti Martojo, Bapak Dr. lman Supriatna. Ibu Dr. 'Tuty Laswardi Yusuf, MS.
, dan Bapak Dr. Bambang h r -
wantara, MSc. Sebagai anggota komisi pembimbing, Bapak-Bapak dan Ibu telah . banyak mencurahkan waktu dan pemikiran untuk membimbing penulis, memherikan dorongan semangat dan dana untuk melengkapi sebagian besar bahan dan peralatan penelitian, sehingga terkabul apa yang penulis cita-citakan. Dorongan datl antusiasme yang diberikan baik oleh mantan maupun Bapak Kektor &an Bapak Dekan l;akultultas Petemakan Universitas Andalas (UNAND) Padang sangat memhantu penulis dalam menyelesaikan pendidikan di Program Pascasarjana lnstitut Pertanian Bogor (PPS IPB). Penulis mengucapkan terima kasih atas kesempatan dan bantuan, baik moril terlebih lagi materil, yang penulis
terima dari UNAND Padang selama penulis mengikuti studi di PPS IPB Bogor. Kepada yang terhormat Bapak Kektor lnstitut Pertanian Bogor, Bapak Direktur Program Pascasarjana, dan Bapak Ketua Program Studi Biologi Reproduksi serta Bapak dan Ibu staf pengajar beserta karyawan di Bagian Reproduksi dan Kebidanan Fakultas Kedokteran Hewan IPB, singkatnya kepada segenap keluarga h e w LPB, penulis mengucapkan terima kasih clan sangat menghargai kesempatan dan fasilitas serta kerjasama yang baik yang telah diberikan kepada penulis.
Penghargaan khusus untuk almarhum Bapak Prof. Dr. H. Soebadi
Partodihardjo yang telah mendorong penulis &lam meminati bidang biologi reproduksi ternak. Semoga Allah SW'T mengampuni dan memberikan balasan yang baik atas pengetahuan yang telah diajarkannya. Selanjutnya penulis mengucapkan terima kasih kepada Tim Manajemen Prgram Uoktor ('I'MPD) Ditjen Dikti Depdikbud K1 dan Yayasan Supersemar yang telah memberikan beasiswa dan menyediakan sebagian biaya penelitian sehingga penulis &pat menyelesaikan studi di PPS 1PB Bogor. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Kepala Dinas Peternakan Kabupaten Cianjur, Bapak H. Basor dan Bapak Apih sebagai pedagang besar ternak sapi beserta seluruh karyawan yang telah memberikan izin, kesempatan, dan memudahkan penulis dalam mengumpulkan ovarium sapi dalam penelitian ini. Kepada teman sejawat atas perhatian dan bantuannya serta sumbang-saran yang membuahkan banyak pengetahuan yang sangat berharga, pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih. Akhirulkalam, dengan rasa haru penulis mengucapkan terima kasih kepada ayahanda dan ibunda serta kedua orang mertua tercinta yang senantiasa menumbuhkan harapan dan mendoakan keselamatan bagi penulis, kepada istriku yang
selalu rnembetikan pengertian dan dorongan semangat untuk menyelesaikan disertasi ini, dan juga kepada anak-anakku atas kesabarannya. Penulis berdoa ke hadhirat llahi, semoga segala amal perbuatan semua pihak yang telah diberikan kepada penulis mendapat balasan yang diridhoi dan a berlipatganda dari Allah Subhaanahu wata'aala. Arnin ya rabbal'aalamin.
Hendri
DAPTAK IS1 Halaman DAPI‘AK IS1 ....................................................................... xiii xv DAFI‘AK TABEL .................................................................. b DAPI‘AK GAMBAK .............................................................. xvi DAFl'AK LAMPIRAN ...........................................................xvii PENDAHULUAN ..
1
1 Latar Belakang ............................................................. Hipotesis ................................................................... 5 .1.ujuan dan Manfaat Penelitian .......................................... 6
'I'INJAUAN PUS'I‘AKA ........................................................... Keberhasilan l'eknologi Fertilisasi In Vitro pada Sapi ............... Potensi Penggunaan 'l'eknologi Fertilisasi In Vifro pada Sapi ....... Potensi dan Perkembangan Oosit pada Ovariurn Sapi................ Pengambilan Oosit dari Ovarium Sapi ................................. Umur. Siklus Estrus dan Kebuntingan ......................... Bangsa. Nutrisi dan Variasi lndividu .......................... 'l'eknik Pengambilan Oosit dari Ovaria Sapi .................. Medium Pengambilan Oosit dari Ovaria Sapi ................ Suhu dan Batas Waktu Penyimpanan Ovaria ................. lndikator Kualitas Oosit ......................................... Ukuran Folikel dan Kualitas Oosit ............................. Pematangan Oosit In Vitro ............................................... Fisiologi Pematangan Oosit ..................................... Sistem lnkubasi Pematangan Oosit In Vitro .................. Penggunaan Serum Sapi &lam Pematangan Oosit In Vitro...................................................... Suplernentasi Hormon ke dalam Medium Pematangan Oosit In Vitro ...................................... Kapasitasi Spermatozoa ................................................... Fertilisasi In Vitro ......................................................... Kultur Embrio In Virro ...................................................
xiii
Penenggunaan Medium TCM- 199 ................................ Pengaruh Suplementasi Serum.................................. Wngaruh Substrat Energi........................................ Pengaruh Sistem lnkubasi ....................................... Pengaruh Kokultur Sel-Sel Somatik ........................... b
MATEKI DAN METODE PENELlTlAN
.....................................
Materi Penelitian .......................................................... Oosit. Bahan Kokultur dan Semen Sapi ....................... Serum Sapi ........................................................ Bahan Kimia ....................................................... Peralatan ........................................................... Metode Penelitian ......................................................... Wmbuatan Media ................................................. Prosedur Penelitian ............................................... Parameter yang Diamati ......................................... Analisis Statistik .................................................. HASlL DAN PEMBAHASAN ................................................... Aspirasi Oosit dari Ovarium Sapi yang Dipotong di W H .......... Pengaruh Jenis clan Konsentrasi Serum terhadap Pematangan Oosit dan Perkembangan Embrio I n Vitro............................. Pengaruh Penggunaan Semen Segar dan Semen Beku terhadap Angka Wrtilisasi dan Perkembangan Embrio In Vitro............... Perkembangan Embrio In Virro di dalam Medium Kokultur Sel-Sel Epitel Tuba Fallopii dan Kumulus ............................. KESIMPULAN DAN SARAN
..................................................
Kesimpulan ................................................................ Saran ........................................................................
Nomor
Halaman
Bk.7 1.
Konsentrasi asam amino serum sapi. ................................
32
2.
Kriteria tingkat pematangan oosit secara morfologik .............
65
3.
Kataan jumlah oosit kualitas A, B dan C/D per ovarium pada struktur ovaria 1, 11, 111 dan I V ................................
75
Kataan persentase angka pematangan omit di dalam TCM-199 yang disuplementasi dengan FBS, SHOdan SH7 .................
83
Kataan persentase angka cleavage di dalam TCM- 199 yang disuplementasi dengan FBS, SHOdan SH7 .................
85
Kataan persentase angka embrio 8 sampai 16 sel di dalam 'I'CM-199 yang disuplementasi dengan PBS, SHOdan SH7.. ...
87
Rataan persentase angka morula di &lam '1'CM-199 yang disuplementasi dengan PBS, SHO dan SH7 .................
89
Persentase angka cleavage dan perkembangan embrio in virro menggunakan semen segar dan semen beku ..............
97
Persentase angka perkembangan embrio yang dikokultur dengan sel-sel epitel tuba Fallopii dan kumulus ...................
100
4.
5.
6. 7.
8. 9.
-#
Halaman
1.
Histogram rataan jumlah oosit kualitas A, B dan CID per ovarium pada struktur ovarium 1, 11, 111 dm 1V ..... ............. 3
2.
Foto mikro oosit kualitas A hasil aspirasi (100x) .................
3.
Foto mikro oosit kualitas B hasil aspirasi (200x)..... .............
4.
Foto mikro oosit kualitas C hasil aspirasi (200x) ...... ...........
5.
Foto mikro oosit kualitas I) hasil aspirasi (200x) .................
6.
Histogram angka pematangan oosit in vitro di dalam '1'CM-199yang disuplementasi FBS, SHOdan SH7 dengan Konsentrasi 5, 10, 15 dan 20%.............................
7.
Foto mikro oosit kualitas A dan B setelah dimatangkan selama 22 sampai 24 jam (100x) ...... ................... ...........
8.
Histogram angka cleavage di dalam 1'CM-199 yang disuplementasi FBS, SHOdan SH7 dengan konsentrasi 5, 10, 15 dan 20% ......................................
9.
Foto mikro embrio dua dan empat sel (200x) ...... .... .... .......
10. Histogram angka embrio 8 sampai 16 sel di dalam 'CCM-199 yang disuplementasi FBS, SH dan D7 dengan konsentrasi 5 , 10, 15 dan 2049 ........ ....................... ....... 11. Foto mikro embrio 8 sampai 16 sel (200x) ........................ 12. Histogram angka morula di dalam '1'CM-199yang disuplementasi FBS, SHOdan SH7 dengan konsentrasi 5, 10, 15 dan 20% ......................................
13. Foto mikro morula. ....................................................
DAPTAR LAMPMAN
Nomor
1.
Komposisi Dulbecco 's Phosphate-Buffered Saline I (11500-022, GlBCO BRL) .................... .;.....................
2.
Komposisi .Tissue Culture Medium- 199 (31 100-035, GIBCO BKL) ...........................................
3.
Komposisi medium Brackett dan Oliphant (BO) ..................
4.
l'ekanan osmotik berbagai media yang digunakan untuk pematangaan oosit dan perkembangan embrio in vitro ...........
5.
Jumlah oosit kualitas A, B dan CID per ovarium pada struktur ovarium 1, 11, 111 dan I V .............................
6. Sidik ragam pengaruh struktur ovaria terhada jumlah oosit kualitas A per ovarium, data ditransformasi &x+0,05). ........ 7.
Sidik ragam pengaruh struktur ovaria terhada jumlah oosit kualitas B per ovarium, data ditransformasi (x+0,05) .........
8.
Sidik ragam pengaruh struktur ovaria terhadap jumlah oosit kualitas CID per ovarium, data ditransformasi J(x+0,05). .....
9.
Sidik ragam pengaruh jenis dan konsentrasi serum pada 'I'CM-199 terhadap angka matangan oosit in vino, data ditransformas~arsin .......................................
J
x)
10. Sidik ragam pengaruh jenis dan konsentrasi serum pada 'I'CM-199 terhadap angka cleavage, data ditransformasi arsin J(x) ............................................. I I . Sidik ragam pengaruh jenis dan konsentrasi serum pada TCM- 199 terhadap angka embrio delapan sampai 16 sel, data ditransformasi arsin J(x) ....................................... 12. Sidik ragam pengaruh jenis dan konsentrasi serum pa& 'TCM- 199 terhadap an data ditransformasi Arsin ...................................... 13. Sidik ragam pengaruh jenis semen terhadap angka fertilisasi in vitro (angka cleavage), data ditransformasi arsin J ( x ) .......................................
xvii
14. Sidik rigam pengaruh jenis semen terhadap angka embrio delapan sampai 16 sel, data ditransformasi arsin J(x) ...........
138
15. Sidik ragam pengaruh jenis semen terhadap angka morula, data ditransformasi arsin J(x) .......................................
139
16. Sidik ragam pengaruh media kokultur sel-sel epitel tuba Fallopii dan kumulus terhadap angka fertilisasi in vitro, % data ditransformasi arsin J(x) .......................................
139
17. Sidik ragam ngaruh media kokultur sel-sel epitel tuba Fallopii dan Emulus terhadap met. embrio delapan sampai 16 sel, data ditransformasi arsin J(x) .....................
139
18. Sidik ragam pengaruh media kokultur sel-sel epitel tuba Fallopii dan kumulus terhadap angka morula, data ditransformasi arsin J(x) .......................................
140
