Polymorfismen in microRNAgenen en het optreden van prostaatkanker
Delphine Hoorelbeke
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Hubert Thierens Vakgroep: Medische basiswetenschappen
Academiejaar 2012-2013
Polymorfismen in microRNAgenen en het optreden van prostaatkanker
Delphine Hoorelbeke
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Hubert Thierens Vakgroep: Medische basiswetenschappen
Academiejaar 2012-2013
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum
Delphine Hoorelbeke
Prof. Dr. H. Thierens
Voorwoord
Als afsluiter van mijn opleiding Biomedische wetenschappen aan de UGent, heb ik een jaar lang aan deze masterproef gewerkt. Het was een jaar dat voorbij gevlogen is en waarin ik veel bijgeleerd heb. Ik wil dan ook enkele mensen bedanken voor hun medewerking en steun. In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. Thierens bedanken voor de mogelijkheid om mijn thesisonderzoek in zijn labo uit te voeren. Dr. Ir. Kim De Ruyck heeft mij gedurende mijn jaar in het labo en het schrijven van mijn masterproef begeleid. Ik wil haar dan ook hartelijk bedanken voor de vele uren die ze hieraan gespendeerd heeft. Ook bij Sofie De Langhe kon ik altijd terecht voor vragen en dan in het bijzonder over de stalen van de prostaatkankerpatiënten, bedankt hiervoor. Virginie De Gelder en Nele Willaert wil ik bedanken voor de ‘technische’ ondersteuning en natuurlijk ook een welgemeende dank u aan alle personeelsleden op het INW voor de vriendelijke ontvangst. Samen met Laura, Eline en Veerle heb ik vele uurtjes gesleten in het computerlokaal, bedankt voor de gezellige sfeer. Ook mijn ouders en vriend Peter ben ik enorm dankbaar voor de steun tijdens het volgen van mijn opleiding en het uitvoeren van mijn masterproef. Peter, nu is het jouw beurt om je masterproef te schrijven. Hartelijk bedankt, zonder jullie was dit niet mogelijk geweest.
Inhoudstafel Samenvatting .............................................................................................................................. 1
1.
Inleiding .............................................................................................................................. 2 1.1
Prostaatkanker ............................................................................................................. 2
1.1.1
Risicofactoren ....................................................................................................... 3
1.1.2
Screening .............................................................................................................. 3
1.1.3
Gleason score ....................................................................................................... 4
1.1.4
Behandeling .......................................................................................................... 4
1.2
microRNAs .................................................................................................................. 5
1.3
SNPs ............................................................................................................................ 6
1.4
Biomerkers voor kankerrisico ..................................................................................... 7
1.4.1
SNPs in miRNA genen ......................................................................................... 7
1.4.2
SNPs in genen betrokken bij de biogenese van miRNAs .................................... 9
1.4.3
SNPs in targetgenen ........................................................................................... 10
1.5
Doelstelling ................................................................................................................ 11
2. Materialen en methoden ....................................................................................................... 11 2.1 Patiëntenpopulatie .......................................................................................................... 11 2.2 Bloedstalen ..................................................................................................................... 12 2.3 Isolatie lymfocyten ......................................................................................................... 12 2.4 DNA purificatie .............................................................................................................. 13 2.4.1 DNA purificatie uit humane bloed lymfocyten........................................................ 13 2.4.2 DNA purificatie uit humaan bloed ........................................................................... 14 2.5 PCR (Polymerase Chain Reaction)................................................................................. 14 2.5.1 PCR techniek ........................................................................................................... 14 2.5.2 Optimalisatie PCR-reacties ...................................................................................... 16 2.6 Genotypering .................................................................................................................. 17 2.6.1 Restrictie Fragment Length Polymorphism (RFLP) ................................................ 17 2.6.2 High resolution Melting (Analysis) (HRM(A)) ....................................................... 18 2.6.3 kwaliteitscontrole ..................................................................................................... 20 2.6.4 sequencing ................................................................................................................ 20
2.7 linkage analyse ............................................................................................................... 20 2.8 gebruikte protocols voor genotypering ........................................................................... 21 2.9 statistische analyse .......................................................................................................... 21
3. resultaten .............................................................................................................................. 22 3.1 optimalisatie protocols .................................................................................................... 22 3.1.1 mir196a2: rs11614913 ............................................................................................. 23 3.1.2 mir146a: rs2910164 ................................................................................................. 24 3.1.3 mir499: rs3746444 ................................................................................................... 25 3.1.4 ITGAv: rs11902171 ................................................................................................. 26 3.1.5 Gemin4: rs2740348 .................................................................................................. 27 3.1.6 Gemin4: rs910924 .................................................................................................... 27 3.1.7 Drosha: rs3805500 ................................................................................................... 28 3.2 beschrijving onderzoekspopulatie .................................................................................. 29 3.3 resultaten genotypering................................................................................................... 31
4. discussie ............................................................................................................................... 34 4.1 miRNA-146a: rs2910164 ............................................................................................... 35 4.1.1 vergelijking met eerdere studies .............................................................................. 35 4.1.2 vergelijking bij andere kankertypes ......................................................................... 35 4.1.3 mogelijk onderliggend mechanisme ........................................................................ 36 4.2 miRNA196a2: rs11614913 ............................................................................................. 36 4.2.1 vergelijking met andere studies ............................................................................... 36 4.2.2 vergelijking bij andere kankertypes ......................................................................... 37 4.2.3 mogelijk onderliggend mechanisme ........................................................................ 37 4.3 Gemin4 ........................................................................................................................... 38 4.3.1 rs910924 ................................................................................................................... 38 4.3.2 rs2740348 ................................................................................................................. 39 4.4 ITGAv: rs11902171 ........................................................................................................ 39 4.4.1 vergelijking met andere studies ............................................................................... 39 4.4.2 vergelijking bij andere kankertypes ......................................................................... 39 4.4.3 mogelijk onderliggend mechanisme ........................................................................ 40 4.5 Drosha: rs3805500 .......................................................................................................... 40
5. besluit ................................................................................................................................... 41
6. Referenties ............................................................................................................................ 42
Bijlage 1: protocol PCR/RFLP Drosha rs3805500 ..................................................................... i Bijlage 2: protocol HRM miRNA-196a2 rs11614913 ............................................................... ii Bijlage 3: protocol HRM miRNA-146a rs2910164 .................................................................. iii Bijlage 4: protocol PCR/RFLP ITGAv rs11902171 .................................................................. v Bijlage 5: protocol HRM rs2740348 ......................................................................................... vi Bijlage 6: protocol voor HRM rs910924................................................................................. viii
Alfabetische lijst van gebruikte afkortingen
A
Adenine
BI
Betrouwbaarheidsinterval
bp
Baseparen
C
Cytosine
CAPB
Capping protein bèta
DMSO
Dimethylsulfoxide
DNA
Deoxynucleïnezuur
ECM
Extracellulaire matrix
EDTA
Ethylenediaminietetra-aceticacid
G
Guanine
GSTP1
Glutation-S-transferase
HPC
Hereditary prostate cancer gene
HRM
High resolution melting
IMRT
Intensity modulated radiotherapie
MAF
Minimale allel frequentie
miRNA
MicroRNA
mRNA
Messenger RNA
OR
Odds ratio
OSCC
Oral squamous cell carcinoma
PAP
Prostate acid phosphatase
PBS
Phosphate buffered saline
PCA3
Prostate cancer gene 3
PCAP
Predisposing for prostate cancer
PCR
Polymerase chain reaction
PSA
Prostaat specifiek antigen
RARP
Robot-assisted radical prostatectomy
RBC
Rode bloedcel
RFLP
Restriction fragment length polymorphism
RISC
RNA-induced silencing complex
rpm
Rounds per minute
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
RPR
Retropubic prostatectomy
SNP
Single nucleotide polymorphism
T
Thymine
Ta
Annealingstemperatuur
Taq
Thermus aquaticus
TBE
Tris-boraat-EDTA-buffer
Tm
Smelt-temperatuur
TMPRSS2:ETS
Transmembrane protease serine2: transcription factor ETS-related gene
UTR
Untranslated region
Samenvatting
Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen in België. Momenteel gebeurt de screening naar prostaatkanker aan de hand van de bepaling van PSA (Prostaat Specifiek Antigen) in het bloed. Deze merker kan echter ook door andere aandoeningen gestegen zijn. MicroRNAs reguleren ongeveer 1/3de van het genoom door inhibitie van translatie of afbraak van het doelwit mRNA. Ze kunnen optreden als tumorsuppressor als hun doelwit een oncogene functie heeft en als oncogen als hun doelwit een tumorsuppressor functie heeft. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in microRNA regio’s zouden de processing van miRNAs kunnen beïnvloeden en de targetbinding en targetspecificiteit kunnen veranderen. Aangezien microRNAs ook tussenkomen in processen zoals celdeling, differentatie, enz. kunnen SNPs in microRNA regio’s een invloed hebben op het risico op het ontwikkelen van kanker. In deze masterproef werd de invloed van 6 SNPs (rs2910164 in miRNA146a, rs11614913 in miRNA-196a2, rs2740348 in Gemin4, rs910924 in Gemin4, rs3805500 in Drosha, rs11902171 in ITGAv) op het ontwikkelen van prostaatkanker nagegaan. Hiervoor werden 150 prostaatkankerpatiënten vergeleken met 158 kankervrije controlepersonen. De genotypering gebeurde voor twee SNPs (rs3805500 en rs11902171) aan de hand van RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) en voor vier SNPs (rs2910164, rs11614913, rs2740348 en rs910924) aan de hand van HRM (High Resolution Melting (Analysis)). Verder werd binnen de patiëntengroep ook de associatie van de SNPs met het Tnumber en de Gleason score nagegaan. Voor geen enkele van de vermelde SNPs werd een significante associatie gevonden met het ontwikkelen van prostaatkanker. Verder werd er geen associatie gevonden met de Gleason score. Het CC genotype bij rs3805500 is geassocieerd met een lagere Tnumber, maar na correctie voor multiple testing is dit niet meer significant.
1
1. Inleiding 1.1 Prostaatkanker Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen in België en 2/3de van de patiënten is ouder dan 65 jaar. In 2008 werden in België 8810 gevallen van prostaatkanker vastgesteld. Dit komt overeen met een leeftijd gestandaardiseerde incidentie van 91.5/100 000 persoonsjaren (1). De laatste jaren werd een stijging van de incidentie waargenomen, hetgeen waarschijnlijk wordt veroorzaakt door een hogere en snellere detectie van de ziekte (2). De laagste frequentie van prostaatkanker wordt gezien in Aziatische landen, de hoogste in NoordAmerika (voornamelijk bij Africo-Amerikanen) (3). Prostaatkanker is een adenocarcinoom dat ontstaat in de prostaatklier die zich onder de blaas en voor het rectum bevindt en normaal gezien de grootte van een kastanje heeft (zie figuur1). Prostaatkanker kan aanleiding geven tot plasproblemen doordat de vergrote prostaat tegen de urinewegen drukt. Plasproblemen kunnen ook veroorzaakt worden door benigne prostaathyperplasie. Bij de evolutie van prostaatkanker kunnen ook andere symptomen optreden waaronder breuken of botpijn door uitzaaiingen in de botten (4). Prostaatkanker kent geen extreem hoge mortaliteit, er zijn meer mannen die sterven met prostaatkanker dan door prostaatkanker (2). In België stierven in 2008 1410 personen aan prostaatkanker. Dit komt overeen met een leeftijd gestandaardiseerde mortaliteit van 11/100 000 persoonsjaren (1).
Figuur1: de prostaat (5)
2
1.1.1 Risicofactoren Prostaatkanker wordt beïnvloed door een combinatie van genetische factoren en invloeden vanuit de omgeving (3). Gekende risicofactoren voor prostaatkanker zijn familiegeschiedenis, hormonen, ras en leeftijd (2). Uit tweelingstudies blijkt dat de erfelijke component van prostaatkanker hoger zou zijn dan 40%, wat hoger is dan bij borstkanker (6). Enkele gekende genen die een rol zouden spelen bij het ontwikkelen van prostaatkanker zijn: HPC11 , CAPB2, PCAP3, HPC2, HPC20 en HPCX (3). Naast deze risicofactoren is er ook een mogelijke beschermende factor gekend, namelijk het gebruik van statines. Uit onderzoek blijkt dat statines (een klasse van cholesterolverlagende middelen) een beschermende rol kunnen spelen door inhibitie van de angiogenese en inflammatie, door inhibitie van proliferatie en metastase van prostaatkankercellen en door inductie van apoptose van prostaatkankercellen. Deze effecten zouden zowel veroorzaakt worden door de statines zelf als door de verlaging van het cholesterolgehalte (9).
1.1.2 Screening
In Europa gebeurt de screening naar prostaatkanker sinds 1990-1994 door het bepalen van het gehalte aan Prostaat Specifiek Antigen (PSA) in het bloed (10). Door het invoeren van deze test werd een daling in het aantal metastasen en een daling in de mortaliteit waargenomen (11). Het aandeel van deze screening in de daling van de mortaliteit zou echter pas na 10 jaar aanwezig zijn (dus pas na 2002 voor Europa). De vroegere daling in mortaliteit zou veroorzaakt worden door nieuwere en betere behandelingsmethodes en door een stijging van het gebruik van statines, die een daling van het risico op geavanceerde prostaatkanker met zich mee zouden brengen (10). De PSA-waarde kan echter ook gestegen zijn door goedaardige prostaathyperplasie, infectie of chronische inflammatie (11). Recent werd de Prostate Cancer gene 3-test (PCA3-test) ontwikkeld als hulpmiddel bij de diagnose en het bepalen van de gepaste behandeling van prostaatkanker. Bij deze test wordt de verhouding van PCA3 mRNA in de urine t.o.v. PSA mRNA in het bloed bepaald en dit na een digitaal rectaal onderzoek waardoor cellen in de urine terechtgekomen zijn (12). PCA3 wordt niet beïnvloed door leeftijd, prostaatvolume of andere prostaataandoeningen (13). Met 1
Hereditary prostate cancer gene 1/2/20/X (3,7) Capping protein beta (7) 3 Predisposing for prostate cancer (8) 2
3
deze test zou een onderscheid gemaakt kunnen worden tussen inerte prostaatkanker waarbij voorlopig geen behandeling vereist is en klinisch significante prostaatkanker. Bijgevolg zou deze test samen met andere variabelen kunnen gebruikt worden om de behandeling te selecteren (12). Andere mogelijke alternatieven of aanvullingen op PSA zijn: TMPRSS2:ETS4, GSTP15 en Creactive proteïne. Deze merkers moeten echter nog gevalideerd worden in klinische studies (3).
1.1.3 Gleason score Een belangrijke prognostische merker bij prostaatkanker is de Gleason score. Deze score bestaat uit de som van twee Gleason graden die gebaseerd zijn op de histologie van de twee meest voorkomende patronen in de tumor. Dit kan gebeuren na een naaldbiopsie of na het verwijderen van de prostaat (prostatectomie). De Gleason score is gecorreleerd met biochemisch falen, het ontwikkelen van metastasen, overleving na radiotherapie of andere behandelingen, progressie-vrije overleving en algemene overleving. Een Gleason graad 1 komt overeen met goed gedifferentieerde uniforme cellen die dicht op elkaar gepakt zitten in massa’s met goed omschreven grenzen. Een Gleason graad 2 bestaat eveneens uit goed gedifferentieerde cellen maar er is een grotere variatie aan cellen en deze zitten niet meer zo dicht op elkaar gepakt, de grenzen van de massa zijn dan ook minder goed omschreven. Bij een Gleason graad 3 zijn de cellen minder goed gedifferentieerd en kunnen ze in infiltratieve patronen groeien. De cellen bij een Gleason graad 4 vormen een gefuseerde glandulaire tumor en zijn vaak bleek. Bij Gleason graad 5 worden cellen met een minimale differentiatie die het stroma diffuus gaan infiltreren teruggevonden. Na het invoeren van dit systeem werden nog enkele wijzigingen aangebracht, waardoor er ook subcategorieën zijn en er eventueel een derde patroon in rekening wordt gebracht (14).
1.1.4 Behandeling
De behandeling van prostaatkanker kan gebeuren door hormoontherapie, operatie (steeds vaker robot-assisted radical prostatectomy, RARP ) of radiotherapie (voornamelijk Intensity 4 5
Transmembrane protease serine2: transcription factor ETS-related gene Glutation-S-transferase enzyme
4
Modulated Radiotherapy, IMRT). RARP is een minimaal invasieve techniek waarbij slechts enkele kleine incisies noodzakelijk zijn waardoor een kleiner bloedverlies en een beter herstel wordt waargenomen. Vroeger was retropubic prostatectomy (RPR) de gouden standaard bij chirurgie. Bij IMRT wordt de bestralingsbundel onderverdeeld in kleinere bundeltjes zodat variërende dosissen kunnen toegepast worden. Hierdoor wordt een zo hoog mogelijke dosis gegeven aan het tumorweefsel terwijl het omliggende gezonde weefsel een zo laag mogelijke dosis krijgt. Dit resulteert in een betere tumorcontrole en een lagere kans op bijwerkingen. Daarnaast kan ook cryotherapie toegepast worden bij personen die ongeschikt zijn voor chirurgie of een levensverwachting van minder dan 10 jaar hebben. Bij deze techniek worden argonprobes tegen de prostaat gebracht waardoor celdood optreedt. In onderzoekssetting worden nog enkele andere technieken toegepast: vasculair getargette fotodynamische therapie, laser geïnduceerde interstitiële thermotherapie en hoge-intensiteits gefocusseerde ultrasounds (15). Een andere recente methode voor de behandeling van een specifieke klasse van patiënten met prostaatkanker (asymptomatische metastatische castratie-resistente prostaatkanker) is het gebruik van het therapeutisch vaccin PROVENGE . Hierbij is het de bedoeling om PAP (prostate acid phosphatase) specifieke T-cellen te creëren (16). Antilichamen tegen N-cadherine zouden ook therapeutisch gebruikt kunnen worden aangezien N-cadherine meer tot expressie komt in prostaattumoren en metastasen. In vivo zorgen deze antilichamen voor een vertraging van de groei van de tumor en blokkeren ze lokale invasie en metastasering. Bij een hogere dosis zorgen ze voor een complete regressie (17).
1.2 microRNAs MicroRNAs (miRNAs) zijn niet-coderende enkelstrengige RNA molecules van ongeveer 22 nucleotiden die de expressie van genen negatief kunnen reguleren. De binding van een miRNA aan het doelwit mRNA leidt ofwel tot mRNA degradatie of translatie inhibitie van dit mRNA. Bij de biogenese van miRNAs (zie figuur 2) zijn verschillende componenten betrokken. MiRNAs worden afgeschreven van miRNAgenen door RNA-polymerase II (18). Hierbij worden pri-miRNAs gevormd, deze worden via Drosha omgezet naar pre-miRNAs en via exportine-5 naar het cytoplasma getransporteerd. Hier ondergaan ze verdere maturatie met
5
behulp van Dicer en binden de mature miRNAs met het RNA-induced silencing complex (RISC ). Dit complex zorgt dan voor binding aan het doelwit mRNA. MiRNAs komen tussen in een aantal belangrijke processen zoals: proliferatie, apoptose, differentiatie, celcyclus regulatie, … Eén miRNA-RISC complex kan tot 200 targets hebben, waardoor miRNAs de expressie van ongeveer 1/3de van de humane mRNA populatie kunnen reguleren (19). MiRNAs kunnen oncogenen zijn als hun doelwit mRNAs tumorsupressorgenen zijn en kunnen tumor-suppressors zijn als hun doelwit mRNAs oncogenen zijn (20).
Figuur 2: biogenese miRNAs (18)
1.3 SNPs
Een Single Nucleotide Polymorphism (SNP) is een enkelvoudige baseverandering die voorkomt bij meer dan 1% van de bevolking (22). SNPs liggen aan de basis van verschillende aandoeningen waaronder de vatbaarheid voor verslavingen onder andere nicotineverslaving (23), het risico op het ontwikkelen van kanker (24), het ontwikkelen van bijwerkingen na radiotherapie (25) en met de kans op overleving (26).
6
SNPs in miRNA regio’s zouden de processing van miRNAs kunnen beïnvloeden en de targetbinding en targetspecificiteit kunnen veranderen (27). SNPs kunnen hun effect uitoefenen op één van de volgende manieren: beïnvloeding van de transcriptie van het primiRNA (bij SNPs in pri-miRNAgenen en genen betrokken bij de biogenese van miRNAs), verandering van de pri-miRNA en pre-miRNA processing (bij SNPs in pri- en premiRNAgenen en genen betrokken bij hun biogenese) en door het beïnvloeden van miRNAmRNA interacties (bij SNPs in mature miRNA sequenties en miRNA binding sites) (28). Deze SNPs zouden als biomerkers kunnen gebruikt worden om risicogroepen te definiëren, de screeningstechnieken te verbeteren, onderscheid te maken tussen onschuldige en agressieve ziekte en om de therapeutische strategieën te verbeteren.
1.4 Biomerkers voor kankerrisico
Biomerkers voor kankerrisico kunnen onderverdeeld worden in drie klassen: hoog-penetrante biomerkers met een lage populatiefrequentie (zoals BRCA1 en 2 bij borstkanker), biomerkers met een gemiddelde penetrantie en biomerkers met een lage penetrantie (waar SNPs onder vallen) (29). De relatieve stijging in risico gebaseerd op 1 SNP is klein maar het risico stijgt naarmate er een hoger aantal risico-allelen aanwezig zijn (30). Deze SNPs kunnen voorkomen in miRNA genen, genen betrokken in hun biosynthese of in targetgenen. Doordat prostaatkanker een grote variabiliteit kent waarbij vele epidemiologische factoren een rol spelen en door de hoge leeftijd bij diagnose, is het moeilijk om een goede biomerker te vinden (3).
1.4.1
SNPs in miRNA genen
SNPs in pri- of pre-miRNA genen kunnen de stabiliteit of processing-efficiëntie van deze miRNAs beïnvloeden, verder kunnen SNPs in cis of trans van de pri-miRNA promotor ook de mate van transcriptie beïnvloeden en kunnen SNPs in mature miRNAs de interactie met de target stabiliseren of destabiliseren (28).
7
Mir-146a: rs2910164
Mir-146a gelegen op chromosoom 5 (7) wordt beschouwd als een tumorsupressor miRNA bij prostaatkanker. Dit miRNA zou via inhibitie van ROCK 1 zorgen voor een gedaalde celproliferatie (20). Geforceerde expressie van mir-146a in androgen-onafhankelijke prostaatkankercellen zorgt voor een daling in celmigratie, invasie en celproliferatie (31). De rs2910164 SNP (G>C) heeft een minimale allelfrequentie van 23.5% in Europeanen en 46.5 en 61% in Aziaten (afhankelijk van de HapMap-populatie)(32). Het verband tussen deze SNP en het risico op prostaatkanker werd onderzocht door Xu et al en George et al, respectievelijk op een Chinese populatie en op een Indische populatie (24,33). Xu et al vonden dat individuen met het genotype CC een lager risico op prostaatkanker hadden dan individuen met GC of GG. Deze associatie werd voornamelijk teruggevonden bij personen met lagere BMI, aantal pakjaren <20, geen verleden van alcoholgebruik en geen familiegeschiedenis van kankers. Xu et al toonden aan dat het C-allel geassocieerd is met een lagere expressie van het miRNA(24). George et al vonden geen associatie tussen deze SNP en prostaatkanker (33). Er werd een associatie gevonden tussen het voorkomen van deze SNP en het kankerrisico bij andere kankertypes, waaronder papillair schildkliercarcinoom (34) en gastro-intestinale kanker (35). Er werden eveneens tegenstrijdige resultaten bekomen tussen de verschillende studies (36).
Mir-196a2: rs11614913
MiRNA196a2 is gelegen op chromosoom 12 (7), dicht bij homeobox genen (hox genen), deze genen spelen een cruciale rol in embryogenese, organogenese en oncogenese. Één van deze hoxgenen is HOXC8 (37). Waltregny et al toonden aan dat dit hoxgen overgeëxpresseerd is in prostaatkankercellen (38). Deze SNP (C>T) heeft een MAF van 52.3% bij Aziaten en 44.2% in Europeanen(32). George et al bekeken de associatie tussen deze SNP en het risico op het ontwikkelen van prostaatkanker. Er werd aangetoond dat personen met CT en TT genotypes een hoger risico hadden op het ontwikkelen van prostaatkanker (33). Voor deze SNP werd ook de associatie met het risico op het ontwikkelen van andere kankertypes onderzocht. Xu et al vonden dat het variante allel van deze SNP een lager risico op het ontwikkelen van borstkanker gaf in een Aziatische populatie(35). Wang et al toonden aan dat individuen met CC of CT genotype een
8
hoger risico hebben op het ontwikkelen van kanker (39).
Mir-499: rs3746444 MiRNA499 is gelegen op chromosoom 20 (7) en is betrokken bij senescentie, apoptose, inflammatie en de immuunrespons. Al deze biologische processen spelen een rol bij de ontwikkeling en progressie van kanker (40). Deze SNP (T>C) heeft een MAF van 17.5% bij Europeanen, de MAF bij Aziaten is nog ongekend (32) George et al vonden dat CT en CC genotypes geassocieerd zijn met een hoger risico op het ontwikkelen van prostaatkanker (3). Uit een meta-analyse blijkt ook dat CT en CC genotypes een hoger risico hebben op het ontwikkelen van kanker bij Aziaten maar niet bij Kaukasiërs (41).
1.4.2
SNPs in genen betrokken bij de biogenese van miRNAs
SNPs in genen betrokken bij de biogenese van miRNAs (zie 1.2) kunnen de functie van alle miRNAs en dus de totale mRNA-silencing beïnvloeden. Hierbij zijn veranderingen die de mRNA-silencing ernstig verstoren zeldzaam. SNPs met subtiele effecten op de genfunctie komen daarentegen vaker voor. Doordat verschillende targets meer of minder gevoelig zijn aan veranderingen in miRNA concentratie kunnen zo bepaalde pathways meer of minder beïnvloed worden door een bepaalde SNP (28).
Gemin4: rs2740348 en rs910924 Gemin4 maakt deel uit van het 15S ribonucleoproteïne complex. Dit complex is essentieel voor miRNA splicing en maturatie. Verder is Gemin4 ook een belangrijk onderdeel in het RISC complex, dat deelneemt aan het maturatieproces van miRNAs, herkenning van doelwit mRNA en repressie. Verstoorde expressie van Gemin4 zou kunnen leiden tot een veranderde expressie van specifieke miRNAs die gerelateerd zijn aan kwaadaardige tumoren (42). Het gen voor Gemin4 is gelegen op chromosoom 17 (7). De SNP rs2740348 (G>C) heeft een MAF van 19.2% in Europeanen en 18.2% in Aziaten. De SNP rs910924 (C>T) heeft een MAF van 34.1% in Europeanen en 14.5% in Aziaten (32). Liu et al onderzochten het verband tussen 7 SNPs in dit gen (waaronder rs2740348 en rs 910924) en het optreden van
9
prostaatkanker in een Chinese populatie. Ze vonden bij twee SNPs een associatie met het risico op prostaatkanker waarbij het C allel bij rs2740348 een lager risico gaf op prostaatkanker(42). De SNP rs2740348 is volgens het artikel van Horikawa et al geassocieerd met het risico op renal cell carcinoma (43). Voor rs910924 werden geen associaties teruggevonden.
Drosha: rs3805500
Drosha (RNAse III enzyme RNASEN) is een RNase dat een belangrijke rol heeft in de biogenese van miRNAs (zie 1.2 microRNAs). Samen met de co-factor DGCR8 zorgt het voor de omzetting van pri-miRNAs naar pre-miRNAs. Deze laatste zijn ongeveer 70 nucleotiden lang en kunnen stabiele secundaire structuren vormen (18). Het verband tussen de rs3805500 SNP(C>T) en het risico op het ontwikkelen van een tweede primaire tumor of herval bij hoofd-en halskanker werd onderzocht door Zhang et al. Zij vonden hierbij een significante associatie (26). Er konden nog geen studies over het verband met het risico op prostaatkanker teruggevonden worden. Deze SNP heeft een MAF van 32.5% in Europeanen en 78.4% in Aziaten (32).
1.4.3
SNPs in targetgenen
SNPs in targetgenen kunnen bestaande bindingssites beïnvloeden waardoor de interactie met het miRNA gestabiliseerd of gedestabiliseerd wordt en kunnen extra targetsites creëren(28).
ITGAv: rs11902171 ITGAv is een gen gelegen op chromosoom 2 dat codeert voor integrineαV (44). Integrines zijn een familie van celoppervlakte receptoren die een rol spelen bij interacties met de ECM (extracellulaire matrix), regulatie van celproliferatie, differentiatie, migratie en overleving. Een aantal van deze integrines kunnen gereguleerd worden door miRNA’s (45). Er werd een hogere expressie van integrineαV aangetoond in prostaatkankercellen. IntegrineαVβ3 en integrineαVβ5 zouden een rol spelen in tumorgeïnduceerde angiogenese en het behouden van het migrerend karakter van de prostaatkankercellen. Verder werd na knockdown van ITGAv
10
een daling in het aantal stamcellen en voorlopercellen alsook een downregulatie van genen geassocieerd met invasie, bekomen. Één van de mogelijke SNPs in ITGAv is rs11902171 waarbij een G in een C verandert. Deze verandering kan ervoor zorgen dat het miRNA-target voor mir-382, mir-30a-3p en mir-30e-3p verdwijnt (44). In Aziatische populaties komt 7.8% C voor, in Europese populaties 27.5% (32). Liu et al toonden aan dat individuen met GC genotype een gedaald risico hebben op het ontwikkelen van prostaatkanker (44). Deze SNP is ook gerelateerd met het risico en de lymfekliermetastase bij OSCC (oral squamous cell carcinoma) (45).
1.5 Doelstelling
Uit de literatuurstudie blijkt dat er een grote indicatie is voor een verband tussen SNPs in miRNAgenen, in genen betrokken in hun biogenese of in hun targetgenen, en het ontstaan van prostaatkanker. Tot op heden werden geen studies die deze associatie nagaan uitgevoerd in Kaukasische populaties. Daarom wordt in dit eindwerk het verband tussen een aantal van deze SNPs en het ontwikkelen van prostaatkanker onderzocht.
2. Materialen en methoden 2.1 Patiëntenpopulatie
In deze studie werd het DNA van 150 prostaatkankerpatiënten en 158 kankervrije controles gebruikt. Binnen de onderzoeksgroep werden in het kader van radiogenomics onderzoek 465 bloedstalen van prostaatkankerpatiënten verzameld. Uit deze uitgebreide groep werd een selectie van 150 patiënten gemaakt op basis van tumor stage zodat een evenredige verdeling bekomen werd. Al deze patiënten ondergingen IMRT als behandeling voor hun prostaatcarcinoom. De groep kankervrije controles wordt gevormd door mannelijke 55plussers waarbij geen diagnose van kanker gekend is. Binnen de onderzoeksgroep werd vroeger een database met DNA-stalen van kankervrije controles aangelegd. Deze bevat meer dan 500 controles (van alle leeftijden, zowel mannen als vrouwen). Om voldoende stalen van oudere kankervrije mannen te bekomen, werden bij de start van dit onderzoek prikacties georganiseerd. Hierbij werd genetisch materiaal van 51 mannelijke 55-plussers aan de
11
databank toegevoegd. Vrijwilligers aan deze studie vulden een informatieformulier in waarin onder andere werd gepeild naar het gebruik van statines. 2.2 Bloedstalen Het DNA in onze databank wordt geïsoleerd uit bloed, dit bloed kan verkregen worden in heparinebuizen (groene buizen) of buizen gecoat met EthyleneDiamineTetra-Aceticacid (EDTA, paarse buizen). Als er vertrokken wordt van EDTA-buizen dan kan het DNA onmiddellijk geïsoleerd worden. Indien vertrokken wordt van heparinebuizen dan moeten de lymfocyten eerst geïsoleerd worden alvorens hieruit het DNA kan gehaald worden. Deze lymfocyten kunnen tussendoor bewaard worden in vloeibare stikstofvaten. Een deel van de aanwezige controlestalen, bevond zich nog in deze stikstofvaten waardoor ook hiervan het DNA nog moest geïsoleerd worden. Voor de lopende studies worden enkel EDTA buizen gebruikt.
2.3 Isolatie lymfocyten
Het bloed dat verzameld werd in een heparinebuis, wordt overgebracht in een steriele 50 ml buis waarna de lege bloedbuisjes met Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 medium gespoeld worden totdat het bloed met de helft verdund is. Per 8ml verdund bloed wordt één steriele 15 ml buis genomen, hierin wordt 4 ml lymfoprep gebracht, waarop langzaam de 8 ml bloed gebracht wordt. Na centrifugatie (15 minuten op 820xg/2130rpm, start-en stopsnelheid op 0) zijn vier lagen zichtbaar: onderaan de rode bloedcellen en granulocyten, daarboven de lymfoprep, als derde laag de lymfocyten en monocyten en bovenaan het serum. Met een steriele pasteurpipet wordt het laagje witte bloedcellen eruit gepipetteerd en overgebracht in een steriele 15 ml buis. De buisjes worden daarna gevuld met wasmedium (compleet RPMI1640 medium: RPMI-1640, L-glutamine, penicilline/streptomycine en foetaal kalf serum). Na centrifugatie (10 minuten op 405xg/1500 rpm) wordt het supernatans verwijderd en al vortexend 4 ml wasmedium toegevoegd. Deze wasstap wordt nog drie keer herhaald. Voor de telling van lymfocyten wordt een ½ verdunning gemaakt van celoplossing en trypaan-blauw, deze oplossing wordt op de Burker telkamer gebracht. Na telling wordt het aantal lymfocyten berekend aan de hand van volgende formule: aantal lymfocyten= aantal lymfocyten in 16 vakjes x verdunning x aantal ml x factor (10000) Na centrifugatie (10 minuten aan 180xg/1000 rpm) wordt het supernatans verwijderd en
12
wordt 0,5 ml vriesmedium toegevoegd per 5x106 cellen. Na zacht vortexen wordt de oplossing per 0,5 ml overgebracht in cryovials. Deze cryovials worden gedurende 4 uur in de Mr Frosty Cryo Freezy container in de -80°C vriezer geplaatst waarbij de temperatuur van de cryovials iedere minuut met 1°C daalt. Na 4 uur worden de cryovials overgebracht in vloeibare stikstof.
2.4 DNA purificatie 2.4.1 DNA purificatie uit humane bloed lymfocyten
De lymfocyten worden ontdooid en overgebracht in 1,5 ml epjes. Na centrifugatie (5 minuten aan 300xg) wordt het supernatans verwijderd en wordt de celpellet geresuspendeerd in Phosphate Buffered Saline (PBS) tot een totaalvolume van 200µl. Hierna volgt opnieuw centrifugatie (10 seconden aan 16000xg) en wordt het supernatans verwijderd tot er 40µl vloeistof overblijft. De epjes worden hevig gevortext waarna 600µl cellyse oplossing toegevoegd wordt, gevolgd door nog eens vortexen. Na deze stap kan het protocol onderbroken worden en kan de oplossing gedurende 2 jaar bewaard worden (op kamertemperatuur). Vervolgens wordt 200µl proteïne precipitatie buffer toegevoegd aan het cellysaat en worden de epjes aan hoge snelheid gedurende 20 seconden gevortext. Na 10 minuten incubatie op ijs worden de epjes gecentrifugeerd (2 minuten aan 16000xg) en worden de neergeslagen eiwitten zichtbaar als een wit/bruin pellet. Hierna wordt het supernatans overgegoten in een 1,5 ml epje dat 600µl 100% isopropanol bevat. Na mengen worden de witte DNA draden zichtbaar. Vervolgens wordt opnieuw gecentrifugeerd (1 minuut aan 16000xg) en is het DNA zichtbaar als een kleine witte pellet. Het supernatans wordt afgegoten en 600µl 70% ethanol wordt toegevoegd. Na zacht vortexen volgt centrifugatie (1 minuut aan 16000xg) en wordt het supernatans afgepipetteerd. Daarna worden de buisjes gedurende 8-10 minuten gedroogd aan de lucht. Tenslotte wordt 150µl DNA hydratie oplossing toegevoegd en wordt zacht gevortext. De epjes worden geïncubeerd in een warmwaterbad gedurende één uur en vervolgens overnacht op kamertemperatuur. Na centrifugatie wordt de DNA oplossing overgebracht in een 1,5 ml buisje en bewaard op 20°C.
13
2.4.2 DNA purificatie uit humaan bloed
Er wordt vertrokken van bloed verzameld in buisjes gecoat met EDTA. De cellyse wordt gestart door 3 ml vol bloed toe te voegen aan 9 ml RBC lyse in een 15 ml buisje. De buisjes worden enkele malen omgekeerd en daarna gedurende 5 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd. Na centrifugatie (5 minuten aan 2000xg) wordt het supernatans verwijderd waarna 200µl vloeistof overblijft. De buisjes worden hevig gevortext en 3 ml cellyse oplossing wordt toegevoegd, gevolgd door opnieuw vortexen. Na deze stap kan het protocol onderbroken worden en kan de oplossing gedurende 2 jaar bewaard worden (op kamertemperatuur). Om de proteïne precipitatie te starten wordt 1 ml proteïne precipitatiebuffer toegevoegd aan het cellysaat en worden de buisjes goed gevortext. Na incubatie op ijs gedurende 10 minuten gevolgd door centrifugatie (5 minuten aan 2000 xg) zijn de neergeslagen eiwitten zichtbaar als een donkerbruin pellet. Tijdens de DNA precipitatie wordt het supernatans (dat het DNA bevat) overgegoten in een 15 ml buisje met 3 ml 100% isopropranol. De buisjes worden omgedraaid, totdat de DNA draden zichtbaar worden. Na centrifugatie ( 3 min aan 2000xg) wordt het supernatans afgegoten. Aan het DNA pellet wordt 3 ml 70% ethanol toegevoegd. Na centrifugatie (1 min aan 2000xg) wordt het supernatans verwijderd en wordt het DNA gedurende 10 min gedroogd aan de lucht. Tenslotte wordt 500 µl DNA hydratie oplossing toegevoegd en worden de buisjes zacht gevortext. Incubatie gebeurt eerst 1 uur op 65°C in een warmwaterbad en daarna overnacht op kamertemperatuur. Na korte centrifugatie wordt de DNA oplossing overgebracht in een 1,5 ml buisje en bewaard op -20°C. Het bepalen van de DNA concentratie/ kwaliteit gebeurt op basis van fotospectrometrie. Vervolgens wordt een werkoplossing gemaakt van 25 ng/µl.
2.5 PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.5.1 PCR techniek
PCR is een techniek waarbij een specifiek fragment DNA geamplificeerd wordt in opeenvolgende cycli van denaturatie, annealing en elongatie (zie figuur 3).
14
Figuur 3: grafische voorstelling van de verschillende stappen in een PCR reactie (22)
Voor de PCR reactie maken we gebruik van een PCR mix met als eindvolume 15µl. Deze mix bevat: 3 µl dNTP-mix (1mM), 3 µl kappa buffer (5x), 0.9 µl MgCl2 (25mM), 0.3 µl forward primer (50µM), 0.3 µl reverse primer(50µM), 0.072 µl kappa taq polymerase, 4.43 µl sigmaH2O, 3 µl DNA (25ng/µl). Bij sommige PCR-reacties wordt slechts 2 µl DNA gebruikt, in deze reacties wordt dan 5.43 µl H2O toegevoegd. De PCR-reactie kan doorgaan op een algemeen programma of op een touchdown programma (zie tabel 1). Het touchdown programma wordt gebruikt om een hogere specificiteit te verkrijgen. Na de PCR reactie wordt op een 1,5%-agarosegel gecontroleerd of de PCR reactie gelukt is. Hiervoor wordt de gel na elektroforese gedurende 30 minuten gekleurd met ethidiumbromide (C21H20BrN3). Ethidiumbromide is een kleurstof die intercaleert in het DNA en zichtbaar wordt onder een UV-lamp. Deze 1.5%-agarosegel wordt bereid door 1.5g agarose op te lossen in 100 ml 0.5x Tris-Boraat-EDTA-buffer (=TBE, 950 ml water en 50 ml 10x TBE stockoplossing bestaande uit 54g Tris, 27.5g Boraat en 4.65 g EDTA2Na opgelost in 500 ml dH2O). Alvorens het DNA op de gel te laden wordt er 1 µl ladingsbuffer aan toegevoegd. Een ladder wordt geladen op de gel om zo de grootte van de bekomen DNA fragmentjes te kunnen inschatten. Tijdens de 15
PCR-reactie wordt ook een negatieve controle meegenomen, hierbij wordt in de mix in de plaats van DNA, water toegevoegd. Deze negatieve controle wordt ook op de gel geladen en zou niet mogen aankleuren met ethidiumbromide. Indien dit wel het geval is dan is er ergens tijdens het proces een contaminatie opgetreden.
Tabel1: algemeen en touchdown programma PCR
Algemeen programma
Touchdown programma
95°C
5min
94°C
2 min
95°C
30 sec
94 °C
20 sec
Ta
30 sec
Ta
15 sec
72°C
30 sec
-1 °C per cyclus
72°C
10 min
72°C
1 min
15°C
10 min
94 °C
40 sec
Ta-12°C
40 sec
72°C
30 sec
72°C
10 min
15°C
10 min
35 cycli
12 cycli
24 cycli
2.5.2 Optimalisatie PCR-reacties
Voor het optimaliseren van de PCR reactie wordt eerst in de beschikbare literatuur gezocht naar de gebruikte primers. Indien geen primers gevonden worden in de literatuur, dan worden deze zelf gekozen waarna via in silico PCR (genome.UCSC.edu ) getest wordt of deze primers het juiste DNA fragment amplificeren. Voorwaarden voor goede primers zijn: ongeveer 20 nucleotiden lang, geen herhalingen van 3 of meer dezelfde nucleotiden na elkaar, een forward primer eindigend op G of C en een reverse primer beginnend met G of C en een gelijkende smelttemperatuur (Tm) van beide primers. Van deze primers wordt een stockoplossing van 250 µM gemaakt en een werkoplossing van 50µM. Voor het bepalen van de ideale PCR condities wordt gestart met een algemeen programma op Ta (=Tm-2) en eventueel een touchdownprogramma (meestal op Tm + 2). Indien bij de controle op agarosegel vastgesteld wordt dat er aspecifieke banden aanwezig zijn of dat de PCR reactie niet optimaal
16
doorgegaan is, dan wordt er DMSO toegevoegd aan de PCR mix of wordt de temperatuur opgedreven totdat er een ideaal bandje bekomen wordt.
2.6 Genotypering 2.6.1 Restrictie Fragment Length Polymorphism (RFLP) 2.6.1.1 RFLP Techniek Bij RFLP wordt het DNA dat vermenigvuldigd werd in de PCR reactie, geknipt met een restrictie-enzyme. Elk restrictie-enzyme heeft een specifieke herkenningsplaats. Als op deze herkenningsplaats een SNP voorkomt dan kan het restrictie-enzyme niet meer knippen of net wel knippen doordat een herkenningsplaats gecreëerd of vernietigd wordt. Hierdoor ontstaan fragmenten van verschillende lengte afhankelijk van het genotype. Deze fragmenten kunnen gedetecteerd worden met gelelektroforese op een 2%-agarosegel na kleuring met ethidiumbromide. Bij de SNPs waar het verschil tussen de grootte van de fragmentjes klein was, werd gebruik gemaakt van een 2.5%-agarosegel. De 2%- of 2.5%-agarosegel wordt op analoge wijze gemaakt en geladen als bij de controle van de PCR, hierbij wordt nu wel respectievelijk 2g en 2.5g agarose toegevoegd. Naast een ladder wordt bij deze controle ook ongeknipt PCR-product geladen.
2.6.1.2 optimalisatie RFLP
Bij de optimalisatie wordt gestart met een literatuuronderzoek. Indien er via deze weg restrictie-enzymen gevonden worden, dan wordt hiermee verder gewerkt. Indien dit niet het geval is, dan wordt in silico naar een geschikt enzym gezocht (restrictionmapper.org). Daarna kan de optimalisatie in het labo beginnen. Verschillende mixen (verschillend aantal units) en verschillende duurtijden van incubatie worden uitgeprobeerd tot een zo goed mogelijk resultaat (alles geknipt) met een zo kort mogelijke incubatietijd en een zo klein mogelijke hoeveelheid enzym wordt bereikt.
17
2.6.2 High resolution Melting (Analysis) (HRM(A)) 2.6.2.1 HRM techniek
Bij HRM wordt na amplificatie van het DNA, de temperatuur langzaam opgedreven waardoor het smeltpunt bereikt wordt (zie tabel2). Tabel 2: verschillende stappen HRM programma
Standard HRM program Holding
10 min
95°C
Denaturatie
15 sec
95°C
Annealing
1 min
Ta
Denaturatie
15 sec
95°C
Annealing
1 min
60 °C
High resolution melting 15 sec
95°C
Annealing
60°C
15 sec
40cycli
Er wordt een specifieke kleurstof (Meltdoctor HRMdye of Syto9) gebruikt die bindt met het dubbelstrengige DNA en sterk fluoresceert. Bij het smelten van het DNA wordt dit DNA enkelstrengig en komt de kleurstof los waardoor de fluorescentie daalt. De daling van de fluorescentie is het grootst rond de Tm van het PCR-product. Dit is het punt waarop 50% van het DNA enkelstrengig is. Afhankelijk van de aanwezige SNP wordt dan een typisch smeltpatroon bekomen. De homozygote genotypes (normaal en variant) vertonen een smeltcurve die gelijkaardig is in vorm maar deze curves zijn van elkaar te onderscheiden door een shift in Tm. De heterozygote genotypes vertonen een smeltcurve met een afwijkende vorm doordat er heterodyplexen gevormd worden. Er kunnen vier klassen van SNPs onderscheiden worden: klasse 1 omvat veranderingen van C naar T en van G naar A, klasse 2 bevat veranderingen van C naar A en van G naar T, in klasse drie komen de G naar C SNPs voor en in klasse 4 de A naar T SNPs. Bij klasse 1 en 2 wordt een grote shift in de smeltcurve bekomen bij de homozygote genotypes, deze SNPs zijn dus gemakkelijk met HRM te bepalen. Bij klasse 3 wordt er slechts een kleine shift in de smeltcurve bekomen en bij klasse 4 een nog kleinere shift. SNPs uit deze laatste twee klassen zijn dus moeilijker met HRM te bepalen. Voor HRM wordt gebruikt gemaakt van de 7500 Fast Real Time PCR systems van Applied biosystems (46). De mix die gebruikt wordt bestaat uit: 2µl buffer (10x), 1,2µl MgCl2 18
(25mM), 0,4µl dNTP mix (10mM), 1,2µl forward primer (5µM), 1,2µl reverse primer (5µM), 1µl Meltdoctor HRM dye (20x), 0,05µl AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5U/µl), 11,95µl H2O en 1µl DNA. Meltdoctor dye kan eventueel vervangen worden door 0,6µl SYTO-9 (50µM) waarbij dan 12,35µl H2O gebruikt wordt. Soms is GC enhancer of een grotere hoeveelheid MgCl2 noodzakelijk. Bij een HRM reactie dienen gekende stalen van elk genotype mee geanalyseerd te worden. Na deze reactie worden de bekomen data geanalyseerd met behulp van de HRM-software van Applied Biosystems.
2.6.2.2 spike-in techniek Bij SNPs uit klasse 3 en 4, is het mogelijk dat de homozygoot normale en homozygoot variante genotypes moeilijk van elkaar te onderscheiden zijn door het kleine verschil in Tm. Een mogelijke oplossing hiervoor is het toepassen van de spike-in techniek. Deze bestaat uit twee opeenvolgende HRM-reacties. In een eerste HRM-reactie (zoals hierboven beschreven) worden de heterozygoten van de homozygoten onderscheiden. In een tweede HRM-reactie wordt enkel verder gewerkt met de homozygoten. Wild-type DNA wordt toegevoegd aan elk staal waardoor heteroduplexen gevormd worden als het staal een homozygoot variant is. Dit geeft dan een afwijkende smeltcurve na de HRM-reactie. Op deze manier kunnen de homozygoot normale en homozygoot variante van elkaar onderscheiden worden. De mix die hierbij gebruikt wordt is dezelfde als voor een standaard HRM-reactie maar 1 µl H2O wordt vervangen door 1 µl spike-in DNA.
2.6.2.3 optimalisatie HRM
Hier wordt opnieuw gestart met het doornemen van de literatuur. Indien mogelijk worden de primers uit deze literatuur gekozen en eventueel aangepast of aangevuld met zelfgekozen primers om zo verschillende primermixen uit te kunnen testen. Indien de primers zelf gekozen worden dan moet rekening gehouden worden met de volgende factoren: een fragment van 60200 baseparen lang en geen of zo weinig mogelijk andere SNPs in het fragment. Van deze primers wordt dan vervolgens een stockoplossing van 100 µM en een werkoplossing van 5µM gemaakt. Vooraleer er kan gestart worden met het uittesten van de HRM-reactie, zijn er gekende controles nodig. Deze kunnen bekomen worden via RFLP als er een restrictieenzyme bestaat, indien dit niet het geval is dan dient er overgegaan te worden tot sequenering.
19
Nadat er gekende controles beschikbaar zijn, worden verschillende combinaties van de primers uitgetest waarbij meestal gestart wordt bij Ta=60°C (standaard HRM- programma). Eventueel wordt deze temperatuur later verhoogd als de scheiding van de verschillende genotypes niet optimaal is.
2.6.3 kwaliteitscontrole
Als kwaliteitscontrole wordt per SNP 10-15% van de onderzochte stalen opnieuw geanalyseerd. Indien het bekomen resultaat afwijkt van het originele resultaat moeten alle stalen die in de desbetreffende batch bepaald werden, opnieuw geanalyseerd worden.
2.6.4 sequencing Voor het sequeneren worden primers gekozen zodat een fragment van 200-400 bp ontstaat. Bij het optimaliseren (zie 2.4.2) van de PCR reactie is het belangrijk dat een goed afgelijnd bandje bekomen wordt. Na de controle van de PCR-reactie wordt per staal 10 µl overgepipetteerd en wordt een primeroplossing van 1µM aangemaakt. Hierna worden de stalen bezorgd aan de dienst medische genetica (GSU) waar de eigenlijke sequeneringsreactie plaatsvindt. Tenslotte worden de sequenties bekeken in het programma Sequence Scanner, waardoor het genotype van elk staal voor die specifieke SNP bepaald kan worden.
2.7 linkage analyse
Om na te gaan of en hoe sterk bepaalde SNPs met elkaar gelinkt zijn, werd een analyse uitgevoerd met Haploview waarbij sequentie-informatie vanuit HapMap wordt opgeladen. Indien twee SNPs een r² hebben hoger dan 0.8 dan wordt slechts één van beide SNPs onderzocht.
20
2.8 gebruikte protocols voor genotypering
In tabel 3 zijn de SNPs die tijdens dit onderzoek onderzocht worden per gen weergegeven, daarbij wordt ook telkens de gebruikte techniek vermeld. Het protocol (zie bijlage 1) voor rs3805500 in Drosha werd reeds door de onderzoeksgroep geoptimaliseerd. De andere protocols werden tijdens het uitvoeren van deze masterproef geoptimaliseerd. Deze optimalisaties zijn terug te vinden onder 3.1 optimalisatie protocols. Tabel3: onderzochte SNPs
gen
SNP
nucleotiden Frequenties Europees Techniek
Pre-miRNA-146a
rs2910164
G>C
23,5% C 76,8% G
HRM spike-in
Pre-miRNA-
rs11614913
C>T
55,8% C 44,2% T
HRM
Pre-miRNA-499
rs3746444
T>C
17,5% C 82,5% T
/
Gemin4
rs2740348
G>C
19,2% C 80,8% G
HRM
196a2
spike-in rs910924
C>T
65,9% C 34,1% T
HRM
Drosha
rs3805500
T>C
67,5% T, 32.5% C
RFLP/HRM
ITGAv
rs11902171
G>C
27.5%C, 72.5% G
RFLP
2.9 statistische analyse De statistische analyse wordt uitgevoerd met SPSS Statistics 21. Voor het bepalen van de associatie tussen de SNPs en het al dan niet ontwikkelen van prostaatkanker wordt gebruik gemaakt van logistieke regressie. Het vergelijken van de populatie voor leeftijd, statinegebruik, drankgebruik en rookgedrag, gebeurt aan de hand van de t-test of chi-square test.
21
3. resultaten 3.1 optimalisatie protocols
Tijdens het uitvoeren van deze masterproef werden een groot deel van de gebruikte protocols eerst geoptimaliseerd. In tabel 4 worden de gebruikte primers tijdens de optimalisatie en uitvoering van de protocols opgesomd samen met de lengte en smelttemperatuur Tm. Tabel 4: gebruikte primers voor HRM/ PCR
SNP
Sequentie (5’-…-3’)
Lengte Tm (°C)
374
ATGGGTTGTGTCAGTGTCAGAGCT
24
72
376
GGGCATATCCATGTTTCTCATCTTC
25
72
417
CAGGATCTACTCTCTCCAG
19
58
424
AACTCATGAGTGCCAGGAC
19
58
416
AGCCGATGTGTATCCTCAG
19
58
418
GGTTGTGTCAGTGTCAGAC
19
58
419
ATATCCCAGCTGAAGAACTG
20
58
CTGATTGGAAGTGGCTCCAGAGC
23
72
378
CGAAAACCGACTGATGTAACTCCG
24
72
411
AGATGCAAAGCTGAATCTCC
20
58
412
AACCGACTGATGTAACTCAG
20
58
410
CAGCTGATCTGTGGCTTAG
19
58
379
GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC
26
76
380
TAGCACCAAGAAGGCATCCATGACC
25
76
414
CCTCTTGGCAGCCTCCAGC
19
64
444
CCAGCTGCACAAGGTAAGG
19
60
445
AAAGTCTTCACTTCCCTGCC
20
60
394
GCGACAGTCTGACTTCCTTC
20
62
395
GGCACTCTGAGTGAGCTGG
19
62
396
AAGAAGTGGGCCTTCTCGGAC
21
66
397
GCCTGCCTGGGGAGTAACAG
20
66
398
TCTATCACTGTTTCCAGCAGCC
22
66
Nummer primer
rs2910164
rs11614913 377
rs3746444
rs2740348
22
Tabel 4: gebruikte primers voor HRM/ PCR (vervolg)
SNP
Sequentie (5’-…-3’)
Lengte Tm (°C)
399
CAAGCCGTAGACCAGCAGC
19
62
400
CGCAGTCCTCACGAACGAG
19
62
401
GGGAGGACCAGCCGTCAA
18
60
403
CATACAGTCCCTCAACGCG
19
60
402
ACGCGAGGCTTCCACTCC
18
60
262
CTGATGATCTCAGTGATAAGTC
22
60
261
ACTGGAACAGATAATTCAGCAC
22
60
462
TGAGCATTAAGAACTAGAAGG
21
58
463
CCACTAGTCAATCAGGCAG
19
58
461
TCAGAGTTGATTGTCTAAGAG
21
58
GAACCTGGACCCCTTACC
18
58
441
CAGGCCTTGAGGAACTGTG
19
60
437
CTCTGTTTAAGCAAGGTAATG
21
58
438
GTTTTCAGTAACTTGAACTGC
21
58
439
AACTTGCCACCTATGTGGC
19
58
Nummer primer
rs910924
rs3805500
rs11902171 440
3.1.1 mir196a2: rs11614913
Bij de optimalisatie van deze SNP werd gestart met PCR-RFLP. Hierbij werd een mismatch in de reverse primer geïntroduceerd zodat een herkenningsplaats voor het enzyme MspI gecreëerd werd. Het gebruikte enzyme en de reverse primer (378) werden bekomen via het artikel van Hu et al (47)en de forward primer zelf ontworpen. Een PCR-reactie op touchdown-programma op 72°C werd uitgevoerd met primers 377 en 378 en een standaardmix met 2µl DNA. Daarna werd een digest uitgevoerd met de volgende mix: 16.875 µl dH2O, 10µl PCR-product, 3µl NEBuffer 4 en 0.125 µl MspI (20U/µl). Hierbij gebeurde een incubatie op 37°C en dit gedurende 3 uur. Na controle op 2.5%-agarosegel werden volgende bandjes bekomen: CC geeft 1 zichtbaar bandje op 539, CT geeft 2 zichtbare bandjes op 539 en 563 en TT geeft 1 bandje op 563. Daar het kleine verschil tussen deze bandjes niet altijd duidelijk te zien was, werd besloten om over te gaan tot HRM en de bekomen genotypes
23
uit RFLP te gebruiken als controles.
1
2
3
4
5
Figuur 4: foto van gel na RFLP voor rs1161491. Laan 1: ladder, laan 2: ongeknipt product, laan 3-5: patiëntenstalen
Bij de optimalisatie van de HRM-reactie werden 2 mixen uitgetest: mix 1 met primers 410 en 412 en mix 2 met primers 411 en 412 en dit op een standaard HRM-programma met Ta=60°C. Mix 2 gaf hierbij het beste resultaat, de bijhorende smeltcurve wordt weergegeven in figuur 5. Het resulterende protocol kan teruggevonden worden in bijlage 2.
Figuur 5: genormaliseerde smeltcurve na HRM
3.1.2 mir146a: rs2910164
Bij deze SNP werd eerst de PCR-RFLP techniek met het enzyme SacI (waarbij een mismatch in de forward primer geïntroduceerd werd) uitgetest als mogelijke methode. Hierbij werd het enzyme SacI uit het artikel van Hu et al bekomen en werd de forward primer 374 uit dit artikel lichtjes aangepast (47), de reverse primer 376 werd zelf ontworpen. Door het kleine verschil in de groottes van de bandjes konden hierbij de genotypes niet met 100% zekerheid bepaald worden. Om de gekende controles te bepalen werd overgegaan tot sequeneren. De
24
PCR reactie hiervoor werd uitgevoerd met een standaard PCR mix met 3 µl DNA en primers 424 en 417 en dit op een algemeen programma op 58°C. Voor het optimaliseren van de HRM reactie werden drie mixen uitgetest op een algemeen HRM-programma met Ta= 60°C: mix 1 met primers 416 en 417, mix 2 met primers 418 en 417 en mix 3 met primers 416 en 419. Mix 1 gaf het beste resultaat. Omdat de curves van de homozygoten niet optimaal gescheiden waren, werd besloten om over te gaan tot de spike-in techniek (zie 2.5.2.2). Na het uitvoeren van deze techniek was het wel mogelijk om de homozygoot variante genotypes van de homozygoot normale genotypes te onderscheiden (protocol zie bijlage 3). In figuur 6 worden de bekomen smeltcurves na het uitvoeren van de HRM weergegeven. Figuur A werd bekomen na de eerste stap van de spike-in techniek, hier werden de heterozygoten gescheiden van de homozygoten. Figuur B werd bekomen na de tweede stap van de spike-in techniek. In deze stap werden enkel de homozygoten geanalyseerd en werden de GG en CC genotypes van elkaar gescheiden.
A
B
Figuur 6: genormaliseerde smeltcurves na HRM: A: eerste stap van de spike-in techniek (blauw = heterozygoot, groen = homozygoot), B: tweede stap van de Spike-in techniek (rood = CC, groen = GG)
3.1.3 mir499: rs3746444 Bij de optimalisatie van deze SNP werd eerst een PCR (met een mismatch in de forward primer) gekoppeld aan een digest met BclI uitgetest. Dit enzyme en deze forward primer (379) werden uit het artikel van Hu et al bekomen (47), de reverse primer 380 werd zelf ontworpen. Door het kleine verschil in grootte tussen de fragmentjes konden de genotypes niet duidelijk onderscheiden worden. Daardoor werd geopteerd om verder te werken met
25
HRM. De benodigde controles werden bekomen via sequeneren met primers 444 en 445. Hiervoor werd een standaard PCR-mix met 3µl DNA gebruikt op een touchdown programma op 62°C. Met deze gekende genotypes werd een HRM uitgetest, dit met twee verschillende mixen: mix 1 met primers 413 en 415, mix 2 met primers 414 en 415, met Ta op 64°C. Bij mix 2 werd een duidelijke scheiding bekomen maar de vorm van de curves kwam niet overeen met het patroon dat verwacht werd op basis van de resultaten uit de sequenering. HRM is dus geen goede techniek om deze SNP te analyseren. Aangezien ook RFLP ongeschikt bleek, werd besloten om deze SNP niet verder te analyseren.
3.1.4 ITGAv: rs11902171
Voor het bepalen van de gekende genotypes voor deze SNP werd PCR gekoppeld aan RFLP uitgevoerd. Voor de PCR werd gebruik gemaakt van een standaardmix met 2µl DNA en primers 440 en 441. Het programma dat hierbij gebruikt werd is een algemeen programma op 60°C. Bij de optimalisatie van het digest werden twee mixen uitgetest: mix 1 met 1U en mix 2 met 2U, dit telkens gedurende vier uur op 37°C en overnacht op 37°C. Hierna werd besloten om verder te werken met mix 2 en dit gedurende 4 uur. De mix hiervoor gebruikt bestaat uit: 16.8µl dH2O, 10 µl PCR-product, 3µl NEBuffer 3 en 0.2 µl (2U) DdeI. Een voorbeeld van het knippatroon kan teruggevonden worden in figuur 7.
1
2
3
4
5
Figuur 7: visualisatie op gel na digest met DdeI: 1. ladder, 2. ongeknipt product, 3. genotype GG, 4. genotype CC, 5. genotype GC (laan 3-5 : patiëntenstalen)
Bij de optimalisatie van de HRM-reactie werden 2 mixen op Ta=60°C uitgetest: mix 1 met primers 437 en 438 en mix 2 met primers 437 en 439. Bij mix1 werd een goede curve bekomen. Doordat het hier om een SNP uit klasse 3 gaat, konden de homozygoot normale en homozygoot variante echter niet van elkaar onderscheiden worden. Hierdoor zou het
26
noodzakelijk zijn om de spike-in techniek te gebruiken. Er werd echter besloten om deze SNP met PCR-RFLP te analyseren. Dit protocol kan teruggevonden worden in bijlage 4.
3.1.5 Gemin4: rs2740348
Voor deze SNP werd eerst PCR-RFLP uitgetest als mogelijke methode voor het genotyperen. Hierbij werd gekozen voor het enzyme MmeI. Dit enzyme bleek echter niet geschikt voor dit doeleinde waardoor overgegaan werd tot sequeneren. De mix die gebruikt werd, is een standaard mix met 2 µl DNA met primers 394 en 395 en dit op een algemeen programma op 66°C. Bij het optimaliseren van de HRM-reactie werden twee primermixen uitgetest: mix 1 met 396 en 398 en mix 2 met 397 en 398, beiden werden uitgetest op 64°C. Er werd besloten om verder te werken met mix 1. Aangezien het hier opnieuw een SNP van klasse 3 betreft, was het ook hier noodzakelijk om de spike-in techniek toe te passen. Dit protocol kan teruggevonden worden in bijlage 5. De smeltcurves bekomen na HRM worden weergegeven in figuur 8. In figuur A wordt de eerste stap van de spike-in reactie weergegeven. In deze stap werden de homozygoten van de heterozygoten onderscheiden. In figuur B wordt de tweede stap waarin de GG en CC genotypes van elkaar onderscheiden werden, weergegeven.
A
B
Figuur 8: genormaliseerde smeltcurves na HRM, A: eerste stap spike-in techniek (blauwe = heterozygoot, groene = homozygoot), B: tweede stap spike-in techniek (blauwe = CC, groene = GG)
3.1.6 Gemin4: rs910924
Voor het bepalen van deze SNP werd opnieuw eerst PCR-RFLP uitgetest. Dit keer met het enzyme HgaI. Vermits de RFLP-reactie niet kon geoptimaliseerd worden (er bleef telkens nog
27
ongeknipt product over), werd overgegaan tot sequeneren. Er werd gebruik gemaakt van een standaard PCR mix met 3µl DNA en primers 443 en 403 en dit op een algemeen programma op 58°C. Voor het optimaliseren van de HRM-reactie werden 2 mixen uitgetest op een algemeen HRMprogramma met Ta=60°C: mix 1 met primers 401 en 402 en mix 2 met primers 401 en 403. Hierbij gaf mix 2 de beste resultaten. De genormaliseerde smeltcurve wordt weergegeven in figuur 9. Het protocol kan teruggevonden worden in bijlage 6.
Figuur 9: genormaliseerde smeltcurve na HRM
3.1.7 Drosha: rs3805500 Om de kwaliteitscontrole met een andere techniek te kunnen uitvoeren, werd besloten om deze SNP ook voor HRM te optimaliseren. Hierbij werden 2 mixen op een standaard HRMprogramma met Ta=60°C uitgetest: mix1 met primers 461 en 463 mix2 met primers 462 en 463. Mix1 gaf een redelijk resultaat en mix2 geen resultaat. Vervolgens werden beide mixen nog eens uitgetest op een standaard HRM-programma met Ta=58°C. Bij deze temperatuur gaf mix2 het beste resultaat. Om betrouwbare controles te bekomen werden enkele stalen gesequeneerd. De PCR-reactie voor sequenering werd uitgevoerd met een standaard PCR-mix met 2 µl DNA en primers 461 en 463, het gebruikte programma was een algemeen programma met Ta = 62°C. Aangezien de verschillende genotypes niet steeds duidelijk onderscheiden konden worden met de HRM techniek, werd verder gewerkt met de RFLP techniek. Een incubatietijd van 3 à 4 uur in plaats van 2 à 3 uur gaf een beter resultaat.
28
3.2 beschrijving onderzoekspopulatie
Tabel 5 geeft een overzicht van de controle- en patiëntenpopulatie. De leeftijd van de controlepersonen ligt gemiddeld lager dan deze van de prostaatkankerpatiënten, maar dit is niet statistisch significant. Het statinegebruik en BMI zijn niet significant verschillend tussen de twee groepen. Aangezien er slechts bij 54 van de 158 controlepersonen gegevens waren omtrent het BMI en slechts bij 59 van de 158 controlepersonen gegevens waren over het statinegebruik, zijn deze vergelijkingen onvolledig. Roken (vroeger of nu) blijkt een verhoogd risico op prostaatkanker met zich mee te brengen (p=0.022), er werd echter geen correlatie gevonden met het aantal packyears. Het huidige gebruik van alcohol lijkt een beschermende factor tegen prostaatkanker (p=0.012), maar éénmaal er een vergelijking gemaakt wordt met het aantal consumpties per week wordt er geen verband meer gevonden (p=0.604). De patiëntengroep bestaat uit 75 patiënten met Tnumber 1 of 2 en 75 patiënten met Tnumber 3 of 4, deze verdeling werd bekomen doordat de patiënten hierop geselecteerd werden. De Gleason score wordt onderverdeeld in 3 categoriën: <7, =7 en >7. De PSA-waardes van de patiënten bij eerste diagnose vertonen een grote spreiding (van 1.68 tot 150) vandaar de grote standaarddeviatie.
29
Tabel 5:Beschrijving onderzoekspopulatie
Parameter Leeftijd (jaren) a BMIa
Statines b
Roken b
Packyears (jaren) a Alcohol b
Alcoholconsumpties per week
Tnumber
a
Patiënten
p-waarde
Gemiddelde
66.2
67.9
0.084
Standaarddeviatie
9.4
7.046
Gemiddelde
27.70
27.27
Standaarddeviatie
2.813
3.533
Ongekend
104
2
Ja
27
43
Nee
32
90
Ongekend
99
17
Never
56
35
Ever
102
113
Ongekend
0
1
Gemiddelde
19.3
18.8
Standaarddeviatie
1.5
1.5
Current
139
115
former + never
19
34
Ongekend
0
1
0
13
15
1-7
69
55
8-24
63
68
>24
11
9
Ongekend
2
3
0.421
0.074
0.022
0.68
0.012
0.604
b
Gleason score
PSA
Controles
<7
56
=7
53
>7
41
1+2
75
3+4
75
Gemiddelde
15.35
Standaarddeviatie
18.13
: getest aan de hand van een t-test : getest aan de hand van een chi-square test
b
30
De prostaatkankerspecifieke mortaliteit is 0%, de globale mortaliteit in de patiëntengroep is 1.3%. Door deze lage mortaliteitcijfers was het onmogelijk om deze SNPs te linken aan de overleving bij prostaatkanker. Er is een biochemische relapse van 6% en een klinische relapse van 2.7%, ook hierbij zijn de percentages te laag om een associatie met het voorkomen van de SNPs te bekijken.
3.3 resultaten genotypering
Voor de resultaten van deze SNPs werd nagegaan of ze in Hardy-Weinberg equilibrium zijn. Dit bleek bij alle SNPs het geval te zijn, voor één SNP rs2910164 werden slechts 4 personen met een homozygoot variant genotype teruggevonden in de patiëntenpopulatie, hiervoor is de berekening van het Hardy-Weinberg equilibrium dus niet volledig betrouwbaar. In tabel 6 worden de resultaten van de genotypering per SNP beschreven. De odds ratio (OR) met de bijhorende 95% betrouwbaarheidsintervallen (BI) en p-waardes worden telkens weergegeven. Er werd voor geen enkele SNP een significante associatie bekomen met het ontstaan van prostaatkanker. Voor elke SNP werd ook de analyse aan de hand van het dominante (homozygoot normaal t.o.v. heterozygoot en homozygoot variant) en recessieve (homozygoot variant t.o.v. homozygoot normaal en heterozygoot) model gedaan maar ook dit zorgde niet voor een significante associatie. De analyse volgens het dominante model kan ook teruggevonden worden in tabel 6. De resultaten volgens het recessieve model zijn niet weergegeven.
31
Tabel 6: resultaten SNPs
SNPs rs2910164
rs11614913
rs910924
rs2740348
rs11902171
rs3805500
Controles
patiënten
OR (95% BI)
p-waarde
GG
92 (59.4%)
84 (56%)
1*
GC
55 (35.4%)
62 (41.3%)
1.235 (0.773-1.972) 0.378
CC
8 (5.2%)
4 (2.7%)
0.548 (0.159-1.885) 0.340
GC + CC
63 (40.6%)
66 (44%)
1.147 (0.728-1.808) 0.553
CC
55 (35.5%)
54 (36%)
1*
CT
72 (46.5%)
66 (44%)
0.934 (0.565-1.543) 0.789
TT
28 (18%)
30 (20%)
1.091 (0.577-2.064) 0.788
CT + TT
100 (64,5%)
96 (64%)
0.978 (0.612-1.562) 0.925
CC
84 (53.8%)
79 (52.7%)
1*
CT
61 (39.1%)
63 (42%)
1.098 (0.688-1.752) 0.694
TT
11 (7.1%)
8 (5.3 %)
0.773 (0.296-2.022) 0.600
CT + TT
72 (46.2%°
71 (47.3%)
1.049 (0.669-1.643) 0.836
GG
96 (62.3%)
103 (68.7%) 1 *
GC
52 (33.8%)
41 (27.3%)
0.735 (0.448-1.205) 0.222
CC
6 (3.9%)
6 (4%)
0.932 (0.291-2.989) 0.906
GC + CC
58 (37.7%)
47 (31.3%)
0.755 (0.470-1.214) 0.246
GG
82 (54.7%)
89 (59.3%)
1*
GC
59 (39.3%
52 (34.7%)
0.812 (0.503-1.310) 0.869
CC
9 (6%)
9 (6%)
0.921 (0.349-2.434) 0.394
GC + CC
68 (45.3%)
61 (40.7%)
0.836 (0.529-1.322) 0.443
TT
75 (50%)
67 (45.3%)
1*
TC
63 (42%)
62 (41.9%)
1.102 (0.681-1.782) 0.693
CC
12 (8%)
19 (12.8%)
1.772 (0.801-3.922) 0.158
TC + CC
75 (50%)
81 (81%)
1.209 (0.767-1.906) 0.414
* referentie
In tweede instantie werd de associatie onderzocht tussen de beschouwde SNPs en het vorkomen van een lage (<7) of hoge (>7) Gleason score. Deze correlatie werd voor alle SNPs onderzocht, maar er werd voor geen enkele SNP een statistisch significante associatie gevonden. In tabel 7 wordt voor 2 SNPs (rs2910164 en rs 11614913) de correlatie tussen deze SNP en een Gleason score <7 (low) of >7 (high) weergegeven. Bij deze analyse werden 32
patiënten met een Gleason score gelijk aan 7 buiten beschouwing gelaten. Bij rs2910164 wordt een hoger aantal GG-genotypes terugevonden bij de lage Gleason scores vergeleken met de hoge Gleason scores. Voor het GC-genotype wordt in elke groep 1 persoon teruggevonden, waardoor hieruit niets kan geconcludeerd worden. Tabel 7: correlatie tussen SNPs: rs2910164 en rs 116149134 en Gleason score low (<7) t.o.v. high (>7)
SNP
rs2910164
rs11614913
Genotype
Low Gleason
High Gleason OR
p-waarde
(n=56)
(n=42)
GG
34 (60.7%)
19 (45.2%)
1*
GC
1 (1.8%)
1 (2.4%)
1.8 (0.784-4.084)
0.17
CC
21 (37.5%)
22 (52.4%)
1.8 (0.106-30.266)
0.69
CC
19 (33.9%)
16 (39%)
1*
CT
28 (50%)
13 (31.7%)
0.55 (0.216-1.405)
0.21
TT
9 (16.1%)
12 (29.3%)
1.6 (0.532-4.712)
0.41
*referentie
Finaal werd de associatie bekeken tussen Tnumber en de beschouwde genetische polymorfismen. De analyses werden uitgevoerd voor alle SNPs, maar in tabel 8 worden enkel de relevante gegevens weergegeven. Voor rs3805500 wordt er een significante associatie gevonden tussen de aanwezigheid van het genotype CC en het voorkomen van Tnumber 1+2 (p=0.045). Tabel 8: correlatie tussen SNPs rs3805500 en rs2910164 en Tnumber (1+2 t.o.v. 3)
SNP
rs3805500
Genotype
Tnumber 1+2
Tnumber3+4
OR
p-waarde
(n=75)
(n=73)
TT
28 (37.3%)
39 (53.4%)
1*
CT
34 (45.3%)
28 (38.4%)
0.59 (0.294-1.187)
0.14
CC
13 (17.3%)
6 (8.2%)
0.33 (0.112-0.978)
0.045
*referentie
Aangezien uit tabel 5 blijkt dat roken een risicofactor is voor prostaatkanker, werden ook analyses uitgevoerd waarbij de personen die nooit of ooit (current + former) gerookt hebben, apart geanalyseerd werden. Wanneer enkel de rokers (current + former) beschouwd werden, werd geen significante associatie gevonden tussen het ontwikkelen van prostaatkanker en de aanwezigheid van deze SNPs. Wanneer enkel de niet-rokers (never) beschouwd werden,
33
werden opnieuw geen significante associaties gevonden, maar bij rs3805500 is er een verband te zien tussen het optreden van het genotype CC en een gestegen kans op prostaatkanker bij de niet-rokers (zie tabel 9). tabel 9: verband tussen het voorkomen van de SNP rs3805500 en het optreden van prostaatkanker bij niet-rokers
SNPs
rs3805500
Controles
Patiënten
OR
p-waarde
(n=55)
(n=36)
TT
25 (45.5%)
11 (30.6%)
1*
TC
25 (45.5%)
17 (47.2%)
1.545 (0.604-3.954)
0.364
CC
5 (9%)
8 (22.2%)
3.636 (0.968-13.659)
0.056
*referentie
4. discussie
In de literatuur werd al evidentie teruggevonden voor het effect van SNPs in microRNAgenen en genen betrokken bij hun biogenese op het optreden van prostaatkanker. Tijdens deze literatuurstudie werden echter enkel een beperkt aantal studies teruggevonden die de associatie tussen de besproken SNPs en het ontwikkelen van prostaatkanker nagaan in Aziatische populaties. Daarom werd uit deze artikels een selectie gemaakt van een aantal SNPs. Deze SNPs werden in dit thesisonderzoek onderzocht op een Kaukasische populatie. Na het uitvoeren van de analyses kan besloten worden dat er voor geen enkele SNP een statistisch significante associatie teruggevonden werd tussen het optreden van deze SNPs en het ontwikkelen van prostaatkanker. De frequenties waarmee deze SNPs voorkomen zijn verschillend tussen Kaukasische en Aziatische populaties (zie tabel 10) wat de vergelijking van de resultaten bemoeilijkt. Meestal worden voor de minimale allel frequentie (MAF) bij Aziaten, twee verschillende frequenties teruggevonden: deze voor een Chinese Han populatie en deze voor een Japanse populatie. Bij de meeste SNPs verschillen deze slechts enkele procenten, in de tabel wordt bij deze SNPs dan ook slechts één percentage weergegeven. Bij rs2910164 daarentegen bedraagt het verschil 14.5%. Deze frequenties worden dan ook beiden weergegeven in de tabel. Uit de tabel wordt ook duidelijk dat voor de SNPs rs11614913 en rs3805500 een omgekeerd patroon bekomen
34
wordt bij de twee populaties, het allel dat het minst frequent voorkomt bij de Kaukasische populatie komt het meest frequent voor bij de Aziatische populatie. Tabel 10: MAF’s voor Kaukasische en Aziatische populaties voor de beschouwde SNPs
SNP
allel
MAF Kaukasische populatie
MAF Aziatische populatie
rs2910164
C
23.5%
46.5% en 61%
rs11614913
T
44.2%
52.3%
rs910924
T
34.1%
14.5%
rs2740348
C
19.2%
18.2%
rs11902171
C
27.5%
7.8%
rs3805500
C
32.5%
78.4%
MAF = minimale allel frequentie
4.1 miRNA-146a: rs2910164 4.1.1 vergelijking met eerdere studies In tabel 11 worden de resultaten van dit thesisonderzoek vergeleken met de resultaten bekomen door Xu et al en George et al (24,33). Bij deze analyse wordt duidelijk dat George et al ook geen statistisch significante associatie vonden (33), maar dat Xu et al ondervonden dat het CC genotype een beschermende invloed had op het ontstaan van prostaatkanker (24). Het verband tussen deze SNP en de Gleasonscore en Tnumber is zowel in dit thesisonderzoek als in de andere onderzoeken niet significant (24,33). Tabel 11: vergelijking van de resultaten voor rs2910164 tussen deze studie en de studies van Xu et al en George et al (24,33)
Genotype
Deze studie
Xu et al
George et al
GG
1*
1*
0.82 (p=0.76)
GC
1.235 (p=0.378)
0.71 (0.46-1.10)a
1.11 (p=0.61)
CC
0.548 (p=0.340)
0.50 (0.29-0.85)a
1*
*referentie a 95% betrouwbaarheidsinterval
4.1.2 vergelijking bij andere kankertypes
Wang et al voerden een meta-analyse uit waarbij het verband tussen het optreden van 35
verschillende kankertypes en de aanwezigheid van deze SNP onderzocht werd. De conclusie was dat deze SNP in Aziatische populaties geassocieerd is met het ontstaan van kanker maar niet in Kaukasische populaties. Voor prostaatkanker werden in deze meta-analyse echter geen studies op Kaukasische populaties in rekening gebracht aangezien voor prostaatkanker enkel de studies van George et al en Xu et al onderzocht werden. Wang et al vonden ook geen significante associatie van deze SNP met prostaatkanker afzonderlijk (36).
4.1.3 mogelijk onderliggend mechanisme De hypothese van Xu et al is dat het C-allel een mispairing induceert in de hairpin van het pri-miRNA en op deze manier voor een gedaalde expressie van het miRNA zorgt (24). Tijdens de meta-analyse van Wang et al werd ook duidelijk dat er verschillende resultaten bekomen werden wat betreft de invloed van deze SNP op de expressie van miRNA-146a. Sommige artikels vermelden een hogere expressie als het CC genotype aanwezig is, anderen een lagere expressie (36). Het is mogelijk dat deze verschillen verklaard kunnen worden doordat dit miRNA een andere invloed heeft naargelang het weefsel of kankertype. Shi et al beschouwen miRNA146a als een tumorsuppressor miRNA bij prostaatkanker aangezien er een lagere expressie van dit miRNA voorkomt in prostaatkankercellen en ectopische expressie van dit miRNA zorgt voor een verlies van de invasie eigenschappen (20). Dit is in strijd met de bevindingen van Xu et al. In hun onderzoek werd een gedaald risico aangetoond bij het CC genotype en dit genotype was geassocieerd met een gereduceerde expressie van miRNA146a (24).
4.2 miRNA196a2: rs11614913 4.2.1 vergelijking met andere studies
George et al vonden dat het CT genotype significant geassocieerd is met een hoger risico op prostaatkanker (p=0.01) dit in tegenstelling tot de resultaten bekomen tijdens dit thesisonderzoek. Zowel in dit thesisonderzoek als in het artikel van George et al werd geen significante associatie gevonden van deze SNP met de Gleasonscore (33).
36
4.2.2 vergelijking bij andere kankertypes
In een meta-analyse uitgevoerd door Wang et al werd de associatie van deze SNP met het optreden van verschillende kankertypes nagegaan. In deze meta-analyse werd een significante associatie gevonden tussen het optreden van deze SNP en het ontwikkelen van kanker. Bij het onderzoeken van de associatie per kankertype werd een associatie gevonden bij borstkanker, longkanker, kanker van het spijsverteringssysteem en hepatocellulair carcinoom. In deze meta-analyse werden geen studies op prostaatkanker in rekening gebracht. Ook bij deze SNP werd er een significante associatie gevonden in Aziatische populaties maar niet in Kaukasische populaties (39). In de meta-analyse van Xu et al werd ook een significante associatie gevonden met het ontstaan van kanker en dit opnieuw in Aziatische populaties. Als de associatie per kankertype bekeken wordt, dan wordt een associatie gevonden bij borstkanker. Ook in deze meta-analyse werden geen studies over prostaatkanker in rekening gebracht(35).
4.2.3 mogelijk onderliggend mechanisme Deze SNP zou geassocieerd zijn met kanker doordat deze SNP gelegen is in de 3’ regio van het mature miRNA en zo maturatie en interactie met het doelwit mRNA zou beïnvloeden. Er werd aangetoond dat het CC genotype voor lagere levels van expressie zorgt dan het TT genotype (48). In celcultuur experimenten werd aangetoond dat hoge levels van dit miRNA voor onderdrukking van bepaalde genen waaronder Annexine A1 kunnen zorgen. Deze onderdrukking werd al in bepaalde kankertypes aangetoond (39). De bevinding van Ryan et al dat CC genotypes een lagere level van expressie van dit miRNA hebben dan TT genotypes (48) is in strijd met de bovenstaande bevindingen uit de metaanalyse van Wang et al. Indien de onderdrukking van Annexine A1 geassocieerd is met het optreden van kanker en deze onderdrukking tot stand komt door hogere levels van miRNA196a2 dan zou het CC genotype een lager risico moeten geven op het onstaan van kanker aangezien dit genotype voor een mispairing zou zorgen. Li et al daarentegen vonden een hogere expressie van dit miRNA bij aanwezigheid van het CC genotype. Dit ondersteunt de hypothese aangehaald in de meta-analyse van Wang et al (49). Bij prostaatkanker werd een verhoogde expressie van dit miRNA aangetoond dus ook hier zou het genotype dat voor een verhoogde expressie zorgt, een hoger risico op
37
prostaatkanker met zich meebrengen (50). De verschillen in effect van deze SNP op de expressie van dit miRNA kunnen erop wijzen dat deze SNP een andere invloed heeft afhankelijk van het weefsel en/of kankertype. De methode waarmee de SNP onderzocht werd zou ook een invloed hebben op het resultaat van de SNP-analyse. Er werd gevonden dat er een gestegen risico werd gedetecteerd in studies die PCR/RFLP gebruikten om de SNP te analyseren maar niet in studies die PCR/LDR (Ligation Detection Reaction) gebruikten(39). In dit thesisonderzoek werd voor deze SNP gebruik gemaakt van HRM, dit is dus een derde techniek die niet in de vergelijking van Wang et al opgenomen werd.
4.3 Gemin4
Het effect van SNPs in dit gen op het ontwikkelen van prostaatkanker werd nagegaan door Liu et al (42). In dit thesisonderzoek werden twee SNPs uit hun studie geselecteerd en werd de associatie van deze SNPs met het ontwikkelen van prostaatkanker in een Kaukasische populatie nagegaan. Gemin4 speelt een essentiële rol in miRNA splicing en maturatie en is ook een onderdeel van het RISC complex. Variaties in dit gen kunnen dus gevolgen hebben voor miRNA maturatie en/of expressie. SNPs in dit gen spelen ook een rol bij het ontwikkelen van een hepatocellulair carcinoom en bij de outcome na blaaskanker (42).
4.3.1 rs910924
Uit tabel 6 kan afgeleid worden dat er geen significante associatie tussen deze SNP en het ontstaan van prostaatkanker teruggevonden werd. Dit komt overeen met de resultaten van Liu et al (42). Deze SNP is gelegen in de promotorregio van het GEMIN4 gen (51) en is gelinkt met rs1045481 (r²=0.912).
38
4.3.2 rs2740348
In dit thesisonderzoek werd geen significante associatie gevonden tussen deze SNP en het voorkomen van prostaatkanker. Er werd wel een niet-significante associatie gevonden van het GC-genotype met een gedaald risico op prostaatkanker. Liu et al daarentegen vonden voor dit genotype een significante associatie met een gedaald risico op prostaatkanker (42). Voor deze SNP werd ook al een associatie gevonden met het risico op het ontwikkelen van renal cell carcinoma en dit in een gemengde populatie waarvan 82% Kaukasisch. In deze studie werd een gedaald risico waargenomen bij individuen met het GC of CC genotype (43). Een mogelijke verklaring voor het feit dat deze SNP een invloed heeft op het ontstaan van kanker is dat deze SNP gelegen zou zijn in het exon van het Gemin4 gen, in een regio die een kristische rol speelt in de regulatie van de expressie van het proteïne (42). Deze SNP veroorzaakt een aminozuurverandering in het proteïne: een Glutamaat verandert in een Glutamine (51,32). Deze SNP is gelinkt met rs2750003 (r²=0.942).
4.4 ITGAv: rs11902171 4.4.1 vergelijking met andere studies In het artikel van Liu et al wordt een significante associatie aangehaald waarbij het GCgenotype voor een gedaalde kans op het ontwikkelen van prostaatkanker zorgt. Individuen met genotype CC werden niet aangetroffen (44).
4.4.2 vergelijking bij andere kankertypes
Ook bij oraal squameus cel carcinoma werd een significante associatie gevonden van het GC genotype met het optreden van deze kanker. Hier werd wel een gestegen kans op het ontwikkelen van dit kankertype gevonden (45), dit in tegenstelling tot de bevindingen van Liu et al bij prostaatkanker (44). Ook Ma et al vonden geen individuen met het genotype CC (45). Dit komt overeen met de resultaten uit de Aziatische HapMap-populaties in de database van NCBI (32).
39
4.4.3 mogelijk onderliggend mechanisme Deze SNP zou volgens computersimulaties gelegen zijn in een miRNA bindingsregio van het ITGAv gen, waardoor er een veranderde interactie met het miRNA zou kunnen optreden. Een gedaalde interactie van miRNAs met het mRNA van dit gen veroorzaakt een gestegen expressie van het eiwit. In prostaatkankercellen werd een gestegen expressie van dit eiwit aangetoond (44). Hierdoor zouden SNPs die voor een gedaalde interactie van het miRNA met het mRNA zorgen, een gestegen risico op prostaatkanker veroorzaken. De SNP rs11902171 kan ervoor zorgen dat het miRNA-target voor mir-382, mir-30a-3p en mir-30e-3p verdwijnt (44).
4.5 Drosha: rs3805500
De SNP rs3805500 is niet geassocieerd met het ontstaan van prostaatkanker maar er werd wel een significante associatie gevonden tussen het voorkomen van het genotype CC en de Tnumber. Er werd een lager risico op het ontwikkelen van prostaatkanker met Tnumber 3+4 tov Tnumber 1+2 bekomen (p = 0.045). Als er een correctie toegepast wordt voor multiple testing, dan is deze p-waarde niet meer significant. Aangezien deze SNP nog niet onderzocht werd in de context van het ontwikkelen van prostaatkanker, kunnen de resultaten die hier bekomen werden niet vergeleken worden met andere onderzoeksresultaten. Deze SNP werd wel al onderzocht in het kader van het hervallen na hoofd-en halskanker. Zhang et al vonden hierbij een significante associatie. Gezien de essentiële rol van Drosha in de processing van miRNAs, is het niet verwonderlijk dat SNPs hierin een rol kunnen spelen bij het ontwikkelen van kanker. In dit artikel wordt aangehaald dat ondanks de algemene betrokkenheid van Dorsha bij de processing van miRNAs, het effect van SNPs in Drosha toch weefselspecifiek kan zijn aangezien er in de verschillende weefsels, verschillende miRNAs tot expressie komen en deze SNPs hier telkens een specifieke invloed op kunnen uitoefenen. De functionele impact van de SNPs in Drosha is afhankelijk van het miRNA-expressieprofiel en voorkomen in het welbepaalde weefsel (26).
40
5. besluit In dit thesisonderzoek werd geen significante associatie gevonden tussen het ontwikkelen van prostaatkanker en de aanwezigheid van de SNPs rs2910164, rs 11614913, rs910924, rs2740348, rs11902171 en rs3805500. Er werd wel een significante associatie (niet meer significant na correctie voor multiple testing) gevonden tussen het optreden van het CC genotype bij rs3805500 en de aanwezigheid van Tnumber 1+2. Om deze associatie te bevestigen, is het noodzakelijk dat deze SNP onderzocht wordt in een grotere populatie. Aangezien er voordien geen studies gepubliceerd werden over de associatie tussen het optreden van prostaatkanker en de aanwezigheid van deze SNPs in Kaukasische populaties, kunnen de resultaten niet vergeleken worden met eerdere studies. Daarenboven komt het homozygoot variante genotype bij enkele SNPs weinig voor, waardoor het moeilijk is om een significante associatie aan te tonen wanneer groepen van ongeveer 150 personen vergeleken worden. De patiëntenstalen uit deze studie werden verzameld op de dienst radiotherapie, alle patiënten ondergingen daar IMRT als behandeling voor hun prostaatkanker. Dit zou ervoor kunnen gezorgd hebben dat we bepaalde klasses van patiënten niet aan onze studie konden toevoegen. De controlepersonen in deze studie zijn personen waarbij geen gekende diagnose van kanker gekend is, bij deze personen werd dus geen medisch onderzoek uitgevoerd. In sommige studies die het verband nagaan tussen deze SNPs en het optreden van prostaatkanker werd het PSA-gehalte van de controlepersonen gecontroleerd en werden personen met een afwijkende waarde uitgesloten (24,33,42,44).
41
6. Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6.
7. 8. 9. 10.
11. 12.
13. 14. 15. 16. 17.
18. 19. 20.
21. 22. 23.
Kankerregister. Retrieved 11/12/12. Available from http://www.kankerregister.org/media/docs/ib/large.html Bostwick D, Burke H, Djakiew D, Euling S, Ho S-m, Landolph J, Morrison H, Sonawane B, Shifflet T, Waters D, Timms B (2004). Human prostate cancer risk factors. Cancer 101(10 suppl):2371-2490 Alvarez-Cubero MJ, Saiz M, Martinez-Gonzalez LJ, Alvarez JC, Lorente JA, Cozar JM (2012). Genetic analysis of the principle genes related to prostate cancer: a review. Urol Oncol [epub ahead of print] Stichting tegen kanker. Retrieved 15/10/12. Available from: http://www.kanker.be/node/3118 American Cancer Society. Retrieved 11/04/2013. Available from: http://www.cancer.org/cancer/prostatecancer/detailedguide/prostate-cancer-what-is-prostate-cancer Lichtenstein P, Holm NV, Verkasalo PK, Iliadou A, Kaprio J, Koskenvuo M, Pukkala E, Skytthe A, Hemminki K (2000). Environmental and heritable factors in the causation of cancer – analyses of cohorts of twins froms Sweden, Denmark and Finland. NEJM 343(2): 78-85 ensemble. Retrieved 29/01/2013. Available from: www.ensembl.org Entrez gene. Retrieved 30/01/2013. Available from: www.ncbi.nlm.nih.gov/gene Papadopoulos G, Delakas D, Nakopoulou L, Kassimatis T (2011). Statins and prostate cancer: molecular and clinical aspects. European Journal of cancer 47: 819-830 Neppl-Huber C, Zappa M, Coebergh JW, Rapiti E, Rachtan J, Holleczek B, Rosso S, Aareleid T, Brenner H, Gondos A (2011). Changes in incidence, survival and mortality of prostate cancer in Europe and the United States in the PSA era: additional diagnosis and avoided deaths. Annals of oncology 23(5): 1325-1334 Shariat SF, Semjonow A, Lilja H, Savage C, Vickers AJ, Bjartell A (2011). Tumor markers in prostate cancer I: blood-based markers. Acta oncologica 50:61-75 Van Poppel H, Haese A, Graefen M, de la Taille A, Irani J, de Reijke T, Remzi M, Marberger M (2012). The relationship between Prostate Cancer gene 3 (PCA3) and prostate cancer significance. BJU International 109 (3):360-366 Bourdoumis A, Papatsoris A, Chrisofos M, Efstathiou E, Skolarikos A, Deliveliotis C (2010). The novel prostate cancer antigen 3 (PCA3) biomarker. International Braz J Urol 36(6): 665-668 Delahunt B, Miller RJ, Srigley JR, Evans AJ, Samaratunga H (2012). Gleason grading: past, present, future. Histopathology 60(1):75-86 Wolff JM, Mason M (2012). Drivers for change in the management of prostate cancer- guidelines and new treatment techniques. BJU International 109 (supplement 6): 33-41 Cheever MA, Higano CS (2011). PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: the first FDAapproved therapeutic cancer vaccine. Clinical cancer research 17(11):3520-3526 Tanaka H, Kono E, Tran CP, Miyazaki H, Yamashiro J, Shimomura T, Fazli L, Wada R, Huang J, Vessela RL, An J, Horvath S, Gleave M, Rettig MB, Wainberg ZA, Reiter RE (2010). Monoclonal antibody targeting of N-cadherin inhibits prostate cancer growth, metastasis and castration resistance. Nat Med 16(12):1414-1420 Davis-Dusenbery BN, Hata A (2010). Mechanisms of control of microRNA biogenesis. J biochem 148(4):381-392 Ioro M, Croce C (2012). microRNA involvement in human cancer. Carcinogenesis 33(6): 1126-1133 Palmero EI, de Campos SGP, Campos M, de Souza NCN, Guerreiro IDC, Carvalho AL, Marques MMC (2011). Mechanisms and role of microRNA deregulation in cancer onset and progression. Genetics and molecular biology 34(3):363-370 Shi X-B, Tepper CG, White RWD (2008). MicroRNAs and prostate cancer. J Cell Mol Med 12: 14561465 Strachan T, Read A. Human molecular genetics. 4th edition. USA: Garland Science; 2011 De Ruyck K, Nackaerts K, Beels L, Werbrouck J, De Volder A, Meysman M, Salhi B, Van Meerbeeck J, Thierens H (2010). Genetic variation in three candidate genes and nicotine dependence, withdrawal and smoking cessation in hospitalized patients. Pharmacogenomics 11(8):1053-1063
42
24. Xu B, Feng N-H, Li P-C, Tao J, Wu D, Zhang Z-D, Tong N, Wang J-F, Song N-H, Zhang W, Hua L-X, Wu H-F (2010). A functional polymorphism in Pre-miR-146a gene is associated with prostate cancer risk and mature miR-146a expression in vivo. The prostate 70(5):467-472 25. De Langhe S, De Ruyck K, Ost P, Fonteyne V, Werbrouck J, De Meerleer G, De Neve W, Thierens H (2013). Acute radiation-induced nocturia in prostate cancer patients is associated with pretreatment symptoms, radical prostatectomy and genetic markers in the TGFβ1 gene. Int J Radiat Oncol Biol 85(2): 393-399 26. Zhang XF, Yang HS, Lee JJ, Kim E, Lippman SM, Khuri FR, Spitz MR, Lotan R, Hong WK, Wu X (2010). MicroRNA-related genetic variations as predictors for risk of second primary tumor and/or recurrence in patiens with early-stage head and neck cancer. Carcinogenesis 31(12):2118-2123 27. Tian T, Xu Y, Dai J, Wu J, Shen H, Hu Z (2010). Functional polymorphisms in two pre-microRNAs and cancer risk: a meta-analysis. Int J Mol Epidemiol Genet 1(4): 358-366 28. Slaby O, Bienertova-Vasku J, Svoboda M, Vyzula R (2012). Genetic polymorphisms and microRNAs: new direction in molecular epidemiology of solid cancer. J cell mol med 16(1): 8-21 29. Calzone KA (2012). Genetic biomarkers of cancer risk. Seminars in oncology nursing 28(2):122-128 30. Choudhury A, Eeles R, Freedland S, Isaacs W, Pomerantz M, Schalken J, Tammela T, Visakorpi T (2012). The role of genetic markers in the management of prostate cancer. European urology 62(4): 577-587 31. Pang YX, Young CYF, Yuan HQ (2010). MicroRNAs and prostate cancer. ABBS 42(6):363-369 32. dbSNP. Retrieved 29/01/2013. Available from: www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ 33. George GP, Gangwar R, Mandal RK, Sankhwar SN, Mittal RD (2011). Genetic variation in microRNA genes and prostate cancer risk in North Indian population. Mol Biol Rep 38(3):1609-1615 34. Qiu L-X, He J, Wang M-Y, Zhang R-X, Shi T-Y, Zhu M-L, Mao C, Sun S, Lv F-F, Zheng C-L, Zhu XD (2011). The association between common genetic variant of microRNA-146a and cancer susceptibility. Cytokine 56(3): 695-698 35. Xu W, Xu J, Liu S, Chen B, Wang X, Li Y, Qian Y, Zhao W, Wu J (2011). Effects of common polymorphisms rs11614913 in miR-196a2 and rs2910164 in miR-146a on ccancer susceptibility: a meta-analysis. PLoS One 6(5): e20471 36. Wang J, Bi J, Liu X, Li K, Di J, Wang B (2012). Has-miR-146a polymorphism (rs2910164) and cancer risk: a meta-analysis of 19 case-control studies. Mol Biol Rep 39(4): 4571-4579 37. Schimanski CC, Frerichs K, Rahman F, Berger M, Lang H, Galle PR, Moehler M, Gockel I (2009). High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells. World J Gastroenterol 15(17):2089-2096 38. Waltregny D, Alami Y, Clausse N, de Leval J, Castronovo C (2002). Overexpression of the homeobox gene HOXC8 in human prostate cancer correlates with loss of tumor differentiation. The prostate 50(3):162-169 39. Wang P, Xie S, Cui A, Zhang Y, Jiang B (2012). miR-196a2 polymorphisms and susceptibility to cancer: a meta-analysis involving 24.697 subjects. Experimental and therapeutic medicine 3(2): 324330 40. Fan C, Chen C, Wu D (2013). The association between common genetic variant of microRNA-499 and cancer susceptibility: a meta-analysis. Mol Biol Rep 40(4):3389-3394 41. Wang L, Qian S, Zhi H, Zhang Y, Wang B, Lu Z (2012). The association between hsa-miR-499 T>C polymorphism and cancer risk: a meta-analysis. Gene 508(1): 9-14 42. Liu J, Liu J, Wei M, He Y, Liao B, Liao G, Li H, Huang J (2012). Genetic variants in the microRNA machinery gene GEMIN4 are associated with risk of prostate cancer: a case-control study of the Chinese Han population. DNA and cell biology 31(7): 1296-1302 43. Horikawa Y, Wood C, Yang H, Zhao H, Ye Y, Gu J, Lin J, Habuchi T, Wu X (2008). Single nucleotide polymorphisms of microRNA-machinery genes modify the risk of renal cell carcinoma. Clin Cancer Res 14(23): 7956-7962 44. Liu J, Huang J, He Y, Liu J, Liao B, Liao G (2012). Genetic variants in the integrin gene predicted microRNA-binding sites were associated with the risk of prostate cancer. Mol Carcinog [epub ahead of print]
43
45. Ma X-R, Cheng H, Wang X-Y, Liu H, Zhao D (2012). Single-nucleotide polymorphisms of integrins are associated with the risk and lymph node metastasis of oral squamous cell carcinoma. Med Oncol 29(4):2492-2498 46. Applied Biosystems. Retrieved 04/04/2012. Available from: www.appliedbiosystems.com 47. Hu Z, Chen J, Tian T, Zhou X, Gu H, Xu L, Zeng Y, Miao R, Jin G, Ma H, Chen Y, Chen H (2008). Genetic variants of miRNA sequences and non-small cell lung cancer survival. J Clin Invest 118(7):2600-2608 48. Ryan BM, Robles AI, Harris CC (2010). Genetic variation in microRNA networks: the implications for cancer research. Nat rev cancer 10(7):389-402 49. Li X-D, Li Z-G, Song X-X, Liu C-F (2010). A variant in microRNA-196a2 is associated with susceptibility to hepatocellular carcinoma in Chinese patients with cirrhosis. Pathology 42(7):669-673 50. Ambs S, Prueitt RL, Yi M, Hudson RS, Howe TM, Petrocca F, Wallace TA, Liu C-G, Volinia S, Calin GA, Yfantis HG, Shepthens RM, Croce CM (2008). Genomic profiling of microRNA and mRNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res 68(15): 6162-6170 51. Yang HS, Dinney CP, Ye YQ, Zhu Y, Grossman HB, Wu XF (2008). Evaluation of genetic variants in microRNA-related genes and risk of bladder cancer. Cancer Res 68(7): 2530-2537
44
Bijlage 1: protocol PCR/RFLP Drosha rs3805500 MIRNA BIOGENESIS PATHWAY
DROSHA RS3805500 C>T PCR Primers
Forward Drosha/69198F Reverse: Drosha/69554R
5’-CTGATGATCTCAGTGATAAGTC-3’ 5’-ACTGGAACAGATAATTCAGCAC-3’
(262) (261)
PCR mix: Standard PCR conditions: Touchdown starting by 64°C PCR fragment size: 378 bp
Digest Enzyme: ApoI Incubation: 50°C for 2-3 hours Digest volume dH2O PCR product BSA NEB3 ApoI (10U/µl)
30 µl 19,5 µl 7 µl 0,3 µl 3 µl 0,2 µl (2U)
Expected digest product: CC: 378 CT: 378/272/106 TT: 272/106 Agarose gel picture:
i
Bijlage 2: protocol HRM miRNA-196a2 rs11614913 µRNA BIOSYNTHESIS POLYMORPHISMS
miRNA-196a2 (chr12) rs11614913 C>T (44%) PCR-HRM Mix : AB Meldoctor reagentia : Reagent dNTP mix buffer MgCl2 primer 411 primer 412 AmpliTaq HRM dye DNA H2O
PCR conditions :
Concentration 10mM 10X 25 mM 5 µM 5 µM 5 U/µl 20X 25 ng/µl -
95°
10 min
95° 60°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60° PCR fragment size : 123 nt
Amount (µl) 0.4 2 1,2 1.2 1.2 0,05 1 1 11.95 20
40 cycli
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
Pattern
ii
Bijlage 3: protocol HRM miRNA-146a rs2910164 µRNA BIOSYNTHESIS POLYMORPHISMS
miRNA-146 (chr12) RS2910164 G>C (23.5%) PCR-HRM spike-in Step 1:discrimination between homozygous and heterozygous genotypes
Reagent (Meltdoctor) Concentration dNTP mix 10 mM buffer 10X MgCl2 25 mM primer 416 5 µM primer 417 5 µM AmpliTaq 5 U/µl HRM dye 20X DNA 25 ng/µl H2O -
PCR conditions :
Amount (µl) 0.4 2 1,2 1.2 1.2 0,05 1 1 11.95 20
95°
10 min
95° 60°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
Reagent (Syto9) dNTPmix Buffer MgCl2 Primer 416 Primer 417 Amplitaq Syto9 DNA H2O
concentration Amount (µl) 10 mM 10X 25 mM 5 µM 5 µM 5 U/µl 50 µM 25 ng/µl -
0.4 2 1.2 1.2 1.2 0.05 0.6 1 12.35 20
40 cycli
PCR fragment size : 132 nt
Pattern
iii
Step2: only the homozygous genotypes are being used, discrimination between GG and CC genotypes
Reagent (Meltdoctor) Concentration Amount (µl) dNTP mix 10 mM 0.4 buffer 10X 2 MgCl2 25 mM 1,2 primer 416 5 µM 1.2 primer 417 5 µM 1.2 AmpliTaq 5 U/µl 0,05 HRM dye 20X 1 DNA 25 ng/µl 1 Spike-in DNA 25 ng/µl 1 H2O 10.95 20 PCR conditions :
95°
10 min
95° 60°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
Reagent concentration Amount (µl) (Syto9) dNTPmix 10 mM 0.4 Buffer 10X 2 MgCl2 25 mM 1.2 Primer 416 5 µM 1.2 Primer 417 5 µM 1.2 Amplitaq 5 U/µl 0.05 Syto9 50 µM 0.6 DNA 25 ng/µl 1 Spike-in DNA 25 ng/µl 1 H2O 11.35 20
40 cycli
PCR fragment size : 132 nt
iv
Bijlage 4: protocol PCR/RFLP ITGAv rs11902171
microRNA target site polymorphisms ITGAv Rs11902171 G>C, 27.5% PCR Primers ITGAv_rs11902171_RFLP_F ITGAv_rs11902171_RFLP_R PCR mix: Volume dNTPs Buffer kappa (5x) MgCl2 Forward primer (50µM) Reverse primer (50 µM) Kappa taq DNA (25 ng/µl) H2O
5'- GAACCTGGACCCCTTACC -3'(440) 5'- CAGGCCTTGAGGAACTGTG -3'(441)
15 µl 3 µl 3 µl 0.9 µl 0,3 µl 0.3 µl 0.072 µl 2 µl 5.43 µl
PCR program: Algemeen 60°C
PCR fragment size: 355 bp
Digest Enzyme : DdeI Incubation: 37°C for 4 hours Digest volume dH2O PCR product Buffer 3 DdeI(10U/µl)
30 µl 16.8 µl 10 µl 3 µl 0,2 µl (2U)
Expected digest product:
GG: 355 GC: 149 / 206 / 355 CC: 149/ 206 Agarose gel run : 2% agarose gel Agarose gel picture :
v
Bijlage 5: protocol HRM rs2740348 µRNA BIOSYNTHESIS POLYMORPHISMS
Gemin4 Rs2740348 G>C (19%) PCR-HRM spike-in Step 1:discrimination between homozygous and heterozygous genotypes Mix : AB Meldoctor reagentia : Reagent (Meltdoctor) Concentration dNTP mix 10 mM buffer 10X MgCl2 25 mM primer 396 5 µM primer 398 5 µM AmpliTaq 5 U/µl HRM dye 20X DNA 25 ng/µl H2O -
PCR conditions :
Amount (µl) 0.4 2 1,2 1.2 1.2 0,05 1 1 11.95 20
95°
10 min
95° 64°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
Reagent (Syto9) dNTPmix Buffer MgCl2 Primer 396 Primer 398 Amplitaq Syto9 DNA H2O
concentration Amount (µl) 10 mM 10X 25 mM 5 µM 5 µM 5 U/µl 50 µM 25 ng/µl -
0.4 2 1.2 1.2 1.2 0.05 0.6 1 12.35 20
40 cycli
PCR fragment size : 104 nt Pattern
vi
Step2: only the homozygous genotypes are being used, discrimination between GG and CC genotypes
Reagent (Meltdoctor) Concentration Amount (µl) dNTP mix 10 mM 0.4 buffer 10X 2 MgCl2 25 mM 1,2 primer 396 5 µM 1.2 primer 398 5 µM 1.2 AmpliTaq 5 U/µl 0,05 HRM dye 20X 1 DNA 25 ng/µl 1 Spike-in DNA 25 ng/µl 1 H2O 10.95 20 PCR conditions :
95°
10 min
95° 64°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
Reagent concentration Amount (µl) (Syto9) dNTPmix 10 mM 0.4 Buffer 10X 2 MgCl2 25 mM 1.2 Primer 396 5 µM 1.2 Primer 398 5 µM 1.2 Amplitaq 5 U/µl 0.05 Syto9 50 µM 0.6 DNA 25 ng/µl 1 Spike-in DNA 25 ng/µl 1 H2O 11.35 20
40 cycli
PCR fragment size : 104 nt
vii
Bijlage 6: protocol voor HRM rs910924 µRNA BIOSYNTHESIS POLYMORPHISMS
Gemin4 Rs910924 C>T (34%) Mix : AB Meldoctor reagentia : Reagent dNTP mix buffer MgCl2 Primer 401 Primer 403 AmpliTaq HRM dye DNA H2O
PCR conditions :
Concentration 10mM 10X 25 mM 5 µM 5 µM 5 U/µl 20X 25 ng/µl -
95°
10 min
95° 60°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
Amount (µl) 0.4 2 1,2 1.2 1.2 0,05 1 1 11.95 20
40 cycli
PCR fragment size : 132 nt
Pattern
viii
