POLYMORFISMEN ALS GENETISCHE DETERMINANTEN VAN

Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen

POLYMORFISMEN ALS GENETISCHE DETERMINANTEN VAN NICOTINE ADDICTIE

SOFIE DE LANGHE

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Begeleider: Ir. Kim De Ruyck Vakgroep Anatomie, Embryologie, Histologie en Medische Fysica

Academiejaar 2008-2009

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

25 mei 2009

Sofie De Langhe

Prof. Dr. H. Thierens

2

Voorwoord Hoe verder mijn opleiding Biomedische Wetenschappen evolueerde, des te meer groeide mijn interesse voor de neurogenetica. Het onderwerp van deze masterproef was dan ook voor mij een evidente keuze. Ik voeg er dan ook graag aan toe dat ik deze studie met genoegen heb afgerond. Bovendien wens ik een aantal personen te bedanken die van groot belang zijn geweest bij het verwezenlijken van deze masterproef. Vooreerst wil ik mijn promotor, Prof. Dr. Hubert Thierens en mijn begeleidster Ir. Kim De Ruyck bedanken omdat ze mij de mogelijkheid boden dit onderzoek te verrichten. Hun inhoudelijke tips en expertise waren van kapitaal belang voor het tot stand komen van deze masterproef. Ik wil Kim nog speciaal bedanken voor het vele geduld dat zij opbracht zowel bij het praktisch werk als bij het schrijven van mijn masterproef. Verder wil ik ook Virginie en Joke bedanken; ook bij hen kon ik terecht voor praktische probleempjes tijdens het labowerk. Tevens gaat mijn dank uit naar mijn ouders, mijn zussen en mijn vriend. Hun morele steun was van groot belang tijdens deze stressvolle periode.

3

Inhoudstafel

Toelating tot bruikleen

2

Voorwoord

3

Inhoudstafel

4

Afkortingen

7

Samenvatting

9

10

Deel I: Inleiding 1.1

Introductie

10

1.2

Nicotine

10

1.3

Nicotine in de hersenen

11

1.4

Rookstopbehandeling

13

1.4.1

Types rookstopbehandeling

14

1.4.2

Meetschalen voor verslaving en ontwenning

15

1.5

Genetische en omgevingsfactoren betrokken bij het rookgedrag

15

1.5.1

Genetische achtergrond

16

1.5.2

Dopamine D2 receptor

17

1.5.2.1 TaqIA (rs1800497)

17

1.5.2.2 TaqIB (rs1079597)

18

1.5.2.3 -141C Ins/Del (rs1799732)

19

1.5.3

Catechol-o-methyltransferase

19

1.5.3.1 COMT Val158Met (rs4680)

19 4

1.5.4 1.6

20

Nicotine acetylcholine receptor

21

Doelstelling

22

Deel II: Materialen en methoden 2.1

Inleiding

22

2.2

Studiepopulatie

22

2.3

DNA-purificatie uit humaan bloed

23

2.4

Polymerase chain reaction (PCR)

24

2.4.1

Principe

24

2.4.2

PCR-mix

25

2.4.3

Primers

26

2.4.4

Optimalisatie van het PCR-protocol

27

2.4.5

PCR-producten

27

2.4.5.1 Controle PCR-producten

27

2.4.5.2 Bereiding van TBE-buffer, ladingsbuffer en TE buffer

28

2.5

28

Polymorfisme bepaling

2.5.1

Restriction fragment length polymorphism assay

29

2.5.2

Optimatisatie RFLP

30

2.5.3

High resolution melt analyse

30

2.5.4

Allel specifiek 2-tube methode

31

2.6

Kwaliteitscontrole

33

2.7

Statistische analyse

33

Deel III: Resultaten

35

3.1

Optimalisatie CHRNA3 Gly394Gly (rs1051730)

35

3.2

Studiepopulatie

37 5

3.3

SNP data

37

3.4

Eindpunt I: maat van verslaving

37

3.4.1

Invloed van mogelijke confounding factors

37

3.4.2

Associatie genetisch polymorfismen met de mate van verslaving

38

3.4.3

Associatie van genetische polymorfismen met mate van verslaving, rekening houdend 39 met confounding factors

3.5

Eindpunt II: optreden van ontwenningsverschijnselen

40 40

3.5.1

Invloed van mogelijke confounding factors

3.5.2

Associatie genetisch polymorfismen met het optreden van ontwenningsverschijnselen 41

3.6

Eindpunt III: stopratio na 1 week en na 1 maand

41

3.6.1

Invloed van mogelijke confounding factors

41

3.6.2

Associatie genetisch polymorfismen met de stopratio

42

45

Deel IV: Discussie 4.1

Optimalisatie CHRNA3 Gly394Gly (rs1051730)

45

4.2

Maat van verslaving

45

4.2.1

Invloed van de leeftijd van rookstart en het aantal sigaretten per dag op de mate van 45 verslaving

4.2.2

Invloed van het genotype op de mate van verslaving

45

4.3

Maat van optreden van ontwenningsverschijnselen

49

4.4

Stopratio

49

4.5

Besluit

53

54

Deel V: Referentielijst 6

Afkortingen A

Adenine

bp

baseparen

C

Cytosine

CHRNA

nicotine acetylcholine α3 receptor

COMT

Catechol-O-MethylTransferase

COPD

Chronic Obstructive Pulmonary Disease

CWS

Cigarette Withdrawal Scale

DMSO

DiMethylSulfOxide

DRD2

Dopamine D2 Receptor

EDTA

EthyleenDiamineTetraAcetaat

FTND

Fagerström Test for Nicotine Dependence

G

Guanine

Gly

Glycine

HIS

Heaviness of Smoking Index

HRM

High Resolution Melt

Met

Methionine

MNWS

Minnesota Nicotine Withdrawal Scale

NCBI

National Center for Biotechnology Information

NS

Nicotine Substitutie

nt

nucleotiden

OR

Odds Ratio

PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

SNP

Single Nucleotide Polymorphism

SPSS

Statistical Package for the Social Sciences

T

Thymine

TBE

Tris Boraat EDTA2Na

TE

Tris EDTA 7

Tris

Tris-hydroxymethyl-aminomethaan

U

Units

UV

Ultra-Violette

Val

Valine

WWS

Wisconsin Withdrawal Scale

8

Samenvatting Roken is waarschijnlijk de belangrijkste, en vermijdbare, oorzaak van tal van ziektes. De werkzame stof in tabak is nicotine. Deze stof is verantwoordelijk voor de ontwikkeling van verslaving. Genetische factoren bepalen mede de individuele vatbaarheid voor verslaving en de slaagkansen bij het stoppen met roken. In deze studie worden vijf polymorfismen (DRD2 TaqIA, DRD2 TaqIB, -141C Ins/Del, COMT Val158Met en CHRNA3 Gly394Gly) in de genen onderzocht die betrokken zijn bij de ontwikkeling van een verslaving in de hersenen. Deze studie maakt deel uit van de WINST studie. Bij 255 deelnemers werd een bloedstaal afgenomen. Op elk bloedstaal wordt een DNA-extractie en een PCR-reactie uitgevoerd. De PCR-reactie voor de SNP CHRNA3 Gly394Gly wordt in deze studie geoptimaliseerd. De polymorfismen in het DRD2 gen worden geanalyseerd met RFLP; de SNP COMT Val158Met wordt geanalyseerd door de allel specifiek 2-tube methode. In dit onderzoek gebeurt de optimalisatie van HRM voor de SNP CHRNA3 Gly394Gly. De statistische analyse wordt toegepast op 227 personen. De associatie van de genetische polymorfismen op de mate van verslaving, op het optreden van ontwenningsverschijnselen na rookstop en op de stopratio (1 week en 1 maand na rookstopbehandeling), wordt onderzocht. De invloed van mogelijke confounding factors, zoals leeftijd van rookstart en aantal sigaretten per dag wordt in rekening gebracht. De SNP’s DRD2 TaqIA en DRD2 TaqIB, beïnvloeden de mate van verslaving: individuen die drager zijn van het variante allel, zijn meer vatbaar voor het ontwikkelen van een verslaving aan nicotine. Starten met roken op jonge leeftijd draagt daartoe bij. De onderzochte polymorfismen hebben geen invloed bij het optreden van ontwenningsverschijnselen. Dragers van de C deletie van het DRD2 141C Ins/Del polymorfisme en personen die heterozygoot zijn voor het COMT polymorfisme, vertonen een hogere stopratio in vergelijking met personen die homozygoot zijn voor beide polymorfismen. Rokers die drager zijn van de variante vorm van DRD2 TaqIA of DRD2 TaqIB en die vroeger starten met roken, zijn in grotere mate verslaafd zijn aan nicotine. Personen die drager zijn van de C deletie in het DRD2 gen of die de heterozygote vorm van het COMT polymorfisme bezitten, zijn meer geneigd zijn om te stoppen met roken.

9

Deel I: Inleiding

1.1

Introductie

Roken is een van de belangrijkste doodsoorzaken in België en in de wereld. Het veroorzaakt ziekten aan de luchtwegen - kanker, emfyseem en COPD -, hart-en vaatziekten en ligt aan de basis van nagenoeg alle soorten kankers. Er wordt geschat dat in de 21ste eeuw roken het leven zal kosten aan een miljard mensen (1). In 1995 was 18.5% van de sterfgevallen in België te wijten aan roken (2). De hoge morbiditeit als gevolg van het roken, brengt een enorme kost met zich mee, niet alleen voor de rokers zelf maar ook voor de ziekteverzekering als voor de werkgevers. Momenteel bedraagt het percentage dagelijkse rokers is België 30%; dit is een stijging met 3% ten opzichte van het vorige jaar (27%) (2). Om deze redenen is het belangrijk een inzicht te verwerven in de processen die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van de verslaving; dit inzicht kan helpen de efficiëntie van het stopzetten van roken te verhogen.

1.2

Nicotine

Met de term roken bedoelt men het gebruik van tabak in al zijn hoedanigheden. Tabak kan geconsumeerd worden onder verschillende vormen: opsnuiven van tabak, pruimen van tabak, roken van een sigaar of pijp. De meest voorkomende vorm van tabaksconsumptie is het roken van een sigaret (2). De tabaksplant bevat, zowel in natuurlijke als gedroogde toestand, een natuurlijk voorkomend alkaloïde, nicotine genaamd (2). Nicotine is de psychoactieve component en aldus verantwoordelijk voor de opbouw van een verslaving als het onderhouden van de verslaving. Nicotine is een molecule dat gemakkelijk doorheen biologische membranen migreert. Absorptie kan gebeuren doorheen de mond, de huid en de longen. De voornaamste weg van nicotineabsorptie bij rokers is via de longalveoli. Bij inhalatie van sigarettenrook zal nicotine dan ook vlug worden opgenomen in de bloedcirculatie (3). Nicotine kan ook via de huid worden opgenomen, dit is voornamelijk van belang bij nicotine substitutie behandeling. Eenmaal nicotine geabsorbeerd is, wordt het uitvoerig gemetaboliseerd door de lever in een aantal metabolieten. Dit grijpt plaats in twee fases (3). 10

In de eerste fase wordt voornamelijk cotinine gevormd door CYP2A6, een microsomaal enzym dat de C-oxidatie van nicotine katalyseert. 70 à 80% van nicotine wordt omgezet in cotinine.

Andere

metabolieten

zijn

nicotine

N-oxide,

nornicotine

en

nicotine

isomethonuimion. Cotinine is stabieler dan nicotine en blijft langer in de bloedbaan. Aan de hand van de hoeveelheid cotinine in de urine, kan de sigaretconsumptie worden nagegaan. Vervolgens doet zich een tweede fase voor, de N- of O-glucuronidatie. In deze fase worden de metabolieten en de niet-gemetaboliseerde nicotine, wateroplosbaar gemaakt door het toevoegen van een wateroplosbare groep (3). Na deze extensieve metabolisatie vindt excretie plaats in urine, feces, speeksel, zweet, gal en maagsap (3).

1.3

Nicotine in de hersenen

Nicotine kan bestemd worden als een verslavend middel aangezien de farmacologische en de gedragskenmerken die nicotineverslaving determineren, gelijkend zijn aan deze die bepalend zijn voor verslaving aan andere middelen zoals heroïne of cocaïne. Beide zijn psychoactieve stoffen daar ze direct werkzaam zijn in de hersenen. Bij gebruik van zowel nicotine als heroïne of cocaïne treedt tolerantie op: er is steeds meer van de substantie nodig is om het gewenste effect te bekomen. Bovendien leidt deprivatie van de drugs tot het optreden van ontwenningsverschijnselen. Dit is dan ook de voornaamste waarom het zo moeilijk is om te stoppen met roken of te stoppen met gebruik van andere verslavende middelen (4). Nicotine kan gemakkelijk migreren doorheen biologische membranen, waaronder de bloedhersenbarrière. Enkele seconden na inhalatie van sigarettenrook werkt het in ter hoogte van het beloningscentrum. Activatie van dit circuit gaat gepaard met gevoelens van genot. Dit circuit bevindt zich in de middenhersenen met als voornaamste structuur de nucleus accumbens. Dit is een heterogene structuur bestaande uit een ventromediale schil en een dorsolaterale kern. De nucleus accumbens ontvangt vezels van onder andere het ventrale tegmentum gebied (VTA) en de prefrontale cortex. De belangrijkste neurotransmitter in dit circuit is dopamine (5, 6). 11

Nicotine is een molecule gelijkend op acetylcholine en zal dus interageren met de nicotine acetylcholine receptoren. Binding van nicotine aan deze receptoren in het ventrale tegmentum gebied veroorzaakt een toename van dopamine vrijstelling in de nucleus accumbens. Deze extracellulaire stijging vindt plaats in de ventromediale schil. Dit leidt tot de inductie van een toestand van genot. Hierdoor kan een drijfveer naar nicotine ontwikkeld worden, door stimuli die geassocieerd zijn met de centrale effecten van nicotine (5, 7). Dit toont aan dat nicotine niet alleen farmacologische en gedragskenmerken deelt met andere psychoactieve drugs, maar ook discrete neurochemische en functionele eigenschappen. Bovendien wijst het erop dat de extracellulaire stijging van dopamine in de schil van de nucleus accumbens een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van de afhankelijkheid aan een bepaalde substantie (7). Zoals eerder vermeld stimuleert binding van nicotine aan de nicotine acetylcholine receptoren de dopamine neuronen, wat een toename van dopamine vrijstelling in de nucleus accumbens veroorzaakt. Dit is echter van korte duur omdat de receptoren na korte tijd desensitiseren. Nicotine heeft echter ook het vermogen om de glutamaterge excitatie op de dopaminerge neuronen te verhogen en de γ-aminoboterzuur inhibitie te verlagen (zie figuur 1). Dit leidt ertoe dat de verhoogde vrijstelling bijvend is zolang nicotine in het bloed zit. Deze synaptische veranderingen zijn gelijkend aan de normale synaptische plasticiteit die aan de grondslag ligt van leren en geheugen. Nicotine gooit het normale evenwicht omver ten gunste van misplaatste synaps potentiatie en dicteert op deze wijze het fundamentele synaptisch mechanisme dat aan de basis ligt van leren en geheugen (6). Op deze manier wordt roken een gewoonte en wordt het geassocieerd met bepaalde stimuli. Dit gaat gepaard met de aanwezigheid van prettige gevoelens bij roken en het optreden van ontwenningsverschijnselen bij onthouding. De ontwenningsverschijnselen hebben misschien te maken met het verloren gaan van deze synapsen en maakt het personen moeilijk om het roken op te geven.

12

Figuur 1: Binding van nicotine aan de nicotine acetylcholine receptoren in het ventrale tegmentum gebied veroorzaakt een vrijstelling van dopamine in nucleus accumbens. Nicotine heeft ook het vermogen om de glutamaterge excitatie op de dopaminerge neuronen te verhogen en de γ-aminoboterzuur inhibitie te verlagen. DA: dopamine, VTA: ventraal tegmentum gebied, nAchR: nicotine acetylcholine receptor, GABA: γ-aminoboterzuur, GABAAR: γ-aminoboterzuur, GLU: glutamaat, mGluR: metabole glutamaat receptor (Molecular Interventions 3:248-

252).

1.4

Rookstopbehandeling

Stoppen met roken brengt enorme gezondheidsvoordelen met zich mee: het verminderen van het risico op coronaire hartziekten, het dalen van het risico op longkanker en het reduceren van vervroegde achteruitgang van longfunctie. Het gaat eveneens gepaard met meerdere pogingen alvorens succes op lange termijn wordt bereikt. Personen roken omdat het hen een aangenaam gevoel verschaft of omdat het de stress kan verlichten. Eigenlijk zijn ze afhankelijk van nicotine en wordt door de hersenen een ‘nicotine honger’ gecreëerd. Absentie van

nicotine

veroorzaakt

ontwenningverschijnselen.

Dit

is

een

onaangename

gemoedstoestand en fysische symptomen die enkel kunnen worden weggenomen door het roken van een sigaret. Jaarlijks wenst ongeveer 70% van de rokers te stoppen met roken (8). De meeste rokers trachten te stoppen zonder enige bijstand, maar slechts 5% succesvol (9). Van degene die er initieel in slagen te stoppen, zal ongeveer 80% tijdens het eerste jaar hervallen.

13

1.4.1

Types rookstopbehandeling

Hieronder

wordt

een

overzicht

gegeven

van

de

eerstelijns

rookstopbehandelingsmogelijkheden. Een eerste vorm van rookstopbehandeling is nicotine substitutie (NS). Dit komt voor in verschillende vormen waaronder transdermale pleister, gum, tablet, inhaler of neusspray. De verschillende vormen hebben een gelijkende doeltreffendheid. De NS therapie is de meest populaire vorm van behandeling. Het optreden van de ontwenningssymptomen neemt af en de hunkering naar nicotine vermindert. De kans op stoppen is tot 70% verhoogd bij gebruik van NS. De stopratio’s op lange termijn zijn echter laag: slechts 13% bereikt een onafgebroken rookstop gedurende twaalf maanden (vergeleken met 8% die placebo gebruikt) (10). Toch is het belangrijk om deze subgroep te identificeren die wel voordeel haalt uit NS behandeling. Dit zal later nog aan bod komen. Een tweede vorm van rookstopbehandeling is het toedienen van bupropion (Zyban®). Dit is een selectieve inhibitor van neuronale heropname van catecholamines (noradrenaline en dopamine). Het juiste mechanisme is nog niet gekend; het zou gerelateerd zijn met een verminderde heropname van dopamine in de middenhersen hetgeen leidt tot verhoogd extracellulair dopamine (9). Aanhoudende vrijstelling van bupropion vermindert het optreden van ontwenningsverschijnselen en het verlangen naar de sigaret. Klinische studies wijzen uit dat gebruik van bupropion leidt tot stopratio’s van 23 tot 35% na 12 maanden in vergelijking met stopratio’s van 12 tot 16% bij gebruik van een placebo (9). Een derde vorm van rookstopbehandeling is het meest recente middel, varenicline (Champix®). Deze molecule werkt als een selectieve partiele agonist van nicotine acetylcholine receptoren. De agonist eigenschappen van varenicline stimuleren de dopamine vrijstelling in de nucleus accumbens. Dit leidt tot verminderde hunkering en ontwenningsverschijnselen. Daartegenover staan de antagonist eigenschappen van varenicline waardoor het geïnhaleerde nicotine verhinderd wordt te binden aan de acetylcholine 14

receptoren. Op die manier worden de positieve gevoelens, geassocieerd met roken, verminderd (11). Verder zijn er nog andere farmacologische middelen die kunnen dienen als rookstop ondersteuning

zoals

clonidine

en

nortriptyline

(11).

Dit

zijn

tweedelijns

rookstopbehandelingen en worden verder niet besproken.

1.4.2

Meetschalen voor verslaving en ontwenning

Er bestaan verschillende meetschalen om nicotine afhankelijkheid te bepalen. Een eerste schaal is de Fagerström Test for Nicotine Dependence (FTND). Dit is een lijst van zes vragen die de fysiologische afhankelijkheid aan nicotine, op een schaal van 1 tot 10, bepaalt. De opgenomen criteria zijn: tijdstip waarop eerste sigaret wordt gerookt, aantal sigaretten per dag, de vraag of het moeilijk is om niet te roken wanneer dit verboden is of wanneer men ziek is, welke sigaret de moeilijkste is om te laten en op welk tijdstip van de dag het meest wordt gerookt (12). Bij de Heaviness of Smoking Index (HSI) wordt enkel gepeild naar de hoeveel gerookte sigaretten per dag en de tijd vooraleer de eerste sigaret wordt gerookt (0-6) (13). Een andere meetschaal is de Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders (DSM criteria) (14). Dit wordt gebruikt om drugsafhankelijkheid en drugsmisbruik te diagnosticeren. De mate van optreden van ontwenningssymptomen kan eveneens worden nagegaan door een aantal meetschalen. Enkele voorbeelden zijn de Cigarette Withdrawal Scale (CWS), de Wisconsin Withdrawal Scale (WWS) en de Minnesota Nicotine Withdrawal Scale (MNWS). In deze vragenlijsten wordt gepeild naar de drang om te roken, droevig gevoel, prikkelbaarheid, ongeduldigheid, moeilijkheden om te concentreren, gewijzigd hondergevoel of slaapproblemen wanneer niet gerookt wordt (15).

1.5

Genetische en omgevingsfactoren betrokken bij het rookgedrag

Roken is een complex gedrag en is multifactorieel en polygenisch bepaald. Multifactoriele factoren worden zowel beïnvloed door de omgeving als door genetische factoren. Met

15

polygenisch wordt bedoeld dat een bepaalde genetische invloed wordt verspreid over verschillende genen, die elk een kleine bijdrage hebben (16). Familie-, adoptie- en tweelingenstudies geven aan dat rookstart en de instandhouding van roken onder een wezenlijke genetische invloed staat. Naast genetische invloed wordt in deze studies

ook

gedeelde

en

individuele

omgevingsfactoren

beschouwd.

Gedeelde

omgevingsfactoren zijn die invloeden die gelijk zijn voor leden van eenzelfde familie, terwijl individuele omgevingsfactoren uniek zijn voor het individu (16). De neiging tot rookstart vloeit voor 48% voort uit genetische factoren (17). Naast genetische factoren zijn ook gedeelde omgevingsfactoren bepalend voor rookstart. De rookpersistentie daarentegen wordt voornamelijk bepaald door genetische factoren (56%) (17). Er is aangetoond dat genen die verantwoordelijk zijn voor rookstart in grote mate overlappen met de genen die betrokken zijn bij rookpersistentie (18). Vinck et al. (2006) tonen aan dat de leeftijd van rookstart ook onder genetische invloed staat en dat dit ook verschillend is voor mannen en vrouwen. De erfelijkheid voor mannen is groter dan voor vrouwen, voor dewelke leeftijd van rookstart nog voor een groot deel beïnvloed wordt door gedeelde omgevingsfactoren (17, 19). Het belang van omgevingsfactoren neemt af naarmate men ouder wordt. Carmelli et al impliceren dat rookstop ook genetisch bepaald wordt. Ze toonden aan dat de concordantie ratio voor het stoppen met roken groter is voor monozygote tweelingen dan voor dizygote tweelingen hetgeen een erfelijke factor met betrekking tot rookstop veronderstelt (20).

1.5.1

Genetische achtergrond

Roken bezit een erfelijke factor, maar de exacte bijdrage van bepaalde genen is nog onzeker. Single nucleotide polymorfismen (SNP’s) zijn de voornaamste vormen van genetische variatie en zijn voor meer dan 90% verantwoordelijk voor de totale sequentie variatie van individuen. Een SNP is de verandering van één enkele base waarvan het minst frequente allel een voorkomen van 1% of meer heeft (21). Bovendien kunnen inserties en deleties ook leiden tot sequentie variatie. De variaties gelegen in regulatorische regio’s van het genoom kunnen genexpressie beïnvloeden. Polymorfismen die leiden tot aminozuurveranderingen kunnen de eiwitfunctie wijzigen. De meeste SNP’s zijn echter ‘silent’ mutaties die geen direct effect hebben op genfunctie maar die wel kunnen bijdragen tot een variatie in individuele genetische 16

susceptibiliteit voor bepaalde aandoeningen of voor de individuele en inter-individuele verschillen in drugrespons (22, 23). Vele studies bestudeerden de associatie van kleine variaties binnen een gen met rookgedrag of met een bepaald facet hiervan. Een groot aantal kandidaatgenen zijn reeds onderzocht, voornamelijk in twee domeinen: enerzijds de neurotransmitter signaalwegen in de middenhersenen, door hun rol in de ontwikkeling van verslaving, en anderzijds het nicotine metabolisme, door hun respons op nicotine zelf. Tevens werd de invloed van polymorfismen in deze genen onderzocht op de uitkomst van rookstopbehandeling (22). De meest frequent bestudeerde polymorfismen en hun associatie met bepaald rookgedrag bevinden zich in het dopamine D2 receptor (DRD2) gen, in het catechol-O-methyltransferase (COMT) gen en in het nicotine acetylcholine α3 receptor gen. Het overzicht beperkt zich tot studies van het Kaukasische ras.

1.5.2

Dopamine D2 receptor

De dop amine D2 receptor is een G-gekoppelde receptor die, door zijn aanwezigheid in de middenhersenen, mogelijks een rol speelt in de ontwikkeling van verslaving (24). Het gen dat codeert voor de receptor is gelegen op chromosoom 11 en is gerelateerd met stress, angst en impulsief gedrag (25). Deze receptor wordt ook gerelateerd met alcoholverslaving (23). De polymorfismen in dit gen waarop het meeste onderzoek is uitgevoerd zijn Taq1A, Taq1B en -141C Ins/Del.

1.5.2.1

TaqIA (rs1800497)

TaqIA, C>T Glu713Lys, is gelegen 10kbp stroomafwaarts van het DRD2 gen, in een kinase gen (ANKK1) met ongekende functie. De frequentie van het minst voorkomende allel bedraagt 22,5% (21). Dragers van het variante T allel vertonen een verminderde D2 receptor binding (25) en een verminderde receptor densiteit (26) in vergelijking met individuen die homozygoot zijn voor het wild type allel.

17

Vele studies bestuderen de correlatie van het polymorfisme met rookgedrag. Een studie kan een associatie aantonen tussen het TaqIA polymorfisme en het aantal gerookte sigaretten (27). Dit werd echter tegengesproken door studies uitgevoerd door Johnstone et al en Preuss et al (10, 28). De associatie tussen het polymorfisme en verslaving, gemeten door de Fagerström test voor nicotine afhankelijkheid, vertoonde geen consistentie over verschillende studies (27, 29, 30, 31). Er werd een hogere prevalentie van het variante allel aangetoond bij rokers in vergelijking met niet-rokers (32) en de rokers waren significant jonger bij rookstart (32, 33). Dit werd niet bevestigd door drie andere studies (27, 30, 31). Met betrekking tot de associatie van het TaqIA polymorfisme en de uitkomst van rookstopbehandeling tonen twee studies aan dat de nicotinepleister effectiever is bij rokers die drager zijn van het T allel (10, 34), alhoewel dit bij Yudkin et al enkel geldt voor vrouwen. Vier studies (35, 36, 37, 38) tonen aan dat er hogere stopratio’s worden bekomen met bupropion bij rokers die het homozygote normale genotype bezitten.

1.5.2.2

TaqIB (rs1079597)

TaqIB, G>A, is gelegen in intron 1 dicht bij de junctie met exon 2. De frequentie van het minst voorkomende allel is 16,4% (21). Analoog aan TaqIA vertonen de dragers van het variante A allel een verminderde receptor densiteit (26) in vergelijking met individuen die homozygoot zijn voor het wild type allel. Het aantal studies met DRD2 TaqIB in Kaukasische populatie is beperkter. Er werd aangetoond dat het variante allel meer voorkomt in rokers in vergelijking met niet-rokers (33). Individuen met het A allel startten vroeger met roken en meldden minder sigaretten per dag te roken (33). Preuss et al vond tevens een associatie van TaqIB en het aantal gerookte sigaretten per dag maar in deze studie vertoonden de dragers van het variante allel een grotere intensiteit van roken (28).

18

1.5.2.3

-141C Ins/Del (rs1799732)

Deze variatie is een functioneel polymorfisme dat gelegen is in de promotor regio. De frequentie van het minst voorkomend allel is 13% (26) en wordt voornamelijk geassocieerd met schizofrenie (39). Het polymorfisme is geassocieerd met veranderde transcriptionele efficiëntie, waarbij de aanwezigheid van het -141C Del allel gaat gepaard met een afname van de promotor sterkte (39). Een studie geeft aan dat rokers die drager zijn van het variante allel een hogere stopratio vertoonden na NS behandeling in vergelijking met rokers die homozygoot normaal zijn. Dit is in tegenstelling tot rokers die met bupropion behandeld worden, waarbij rokers die de twee normale allelen bevatten een groter voordeel bleken te hebben in vergelijking met rokers die drager waren van het variante allel (40).

1.5.3

Catechol-O-methyltransferase (COMT)

COMT is een enzym dat betrokken is in de degradatie en inactivatie van dopamine. Het katalyseert de transfer van een methylgoep van S-adenosyl-methionine naar de hydroxylgroep van dopamine (41, 42). COMT is ook betrokken in het oestrogeen metabolisme; het breekt het catechol oestrogen af tot oestron. Dit werkt regulerend op de promotor van het COMT gen. Het gen is gelegen op chromosoom 22. Het polymorfisme in dit gen waarop tot nu toe het meeste onderzoek is uitgevoerd is Val158Met.

1.5.3.1

COMT Val158Met (rs4680)

Dit polymorfisme (G>A) is gelegen in exon 4. De frequentie van het minst voorkomende allel is 51,7%. Het wordt gelinkt aan psychische stoornissen zoals schizofrenie, ziekte van Parkinson, drugmisbruik en alcoholisme (41, 42). Een Val/Met substitutie veroorzaakt een functionele verandering van het COMT eiwit. Homozygoten voor de Valine variant zullen dopamine drie tot vier keer sneller afbreken dan deze die homozygoot zijn voor de Methionine variant; heterozygoten vertonen een

19

intermediair level van COMT activiteit (42). Een lage COMT activiteit is tevens geassocieerd met een verlaagde thermolabiliteit (42). Twee studies (43, 44) tonen een associatie aan van het Val/Met polymorfisme met verslaving gemeten volgens de FTND. Associaties van het polymorfisme met verslaving en andere kenmerken van rookgedrag zoals rookstart, rookpersistentie, leeftijd van rookstart, aantal gerookte sigaretten per dag, werden niet gevonden (43, 45, 46, 47, 48, 49). Met betrekking tot de associatie van het COMT polymorfisme en de uitkomst van rookstopbehandeling tonen drie studies (50, 51, 52) aan dat personen die homozygoot zijn voor de Met variant een groter voordeel hebben om te stoppen met roken gebruikmakend van een nicotinepleister in vergelijking met deze die drager zijn van de Val variant. Het tegenovergestelde wordt teruggevonden in een studie uitgevoerd door Omidivar et al waarbij de deelnemers van de studie geen rookstopbehandeling kregen (49). Hier vertonen de individuen met het homozygote Val/Val genotype een verhoogde neiging om te stoppen met roken in vergelijking met zij die drager zijn van het Met variant (49). Verder wordt er bij een drietal studies geen associatie gevonden tussen het COMT polymorfisme en rookstop zowel met als zonder rookstopbehandeling (48, 53,54).

1.5.4

Nicotine acetylcholine receptor

Nicotine acetylcholine receptoren zijn ligand-gated ionkanalen. Ze zijn opgebouwd uit vijf transmembranaire subunits. Deze subunits worden ingedeeld in α subunits (α2 tot α10) en β subunits (β2 tot β4), elk met hun eigen functionele en farmacologische eigenschappen. Er werd aangetoond (55) dat de allelen die geassocieerd zijn met een hoog risico op longkanker zich situeren op de lange arm van chromosoom 15 (locus 15q24-25.1). In deze regio ligt de gencluster, CHNRA3-CHRNA5-CHRNB4, die codeert voor drie subunits waaruit de acetylcholine receptoren zijn opgebouwd. Deze subunits komen voornamelijk voor in het perifere zenuwstelsel, in het vasculaire systeem en in epitheliale longcellen (56). De receptoren zijn de eerste doelwitten van nicotine en daarom is het biologisch aannemelijk dat deze genen een invloed zouden hebben op zowel de intensiteit van roken als op de nicotine afhankelijkheid. Er is reeds aangetoond dat activatie van deze receptoren door 20

nicotine, stimulatie van cellulaire proliferatie en inhibitie van apoptose van epitheliale longcellen tot gevolg heeft. Op die manier bestaat de mogelijkheid dat ontwikkeling van longkanker direct door nicotine kan beïnvloed worden in plaats van door blootstelling aan de carcinogene componenten uit sigarettenrook (56). In de regio 15q24-25.1 worden veel clusters van SNP’s teruggevonden die in sterk linkage disequilibrium zijn en meerdere haplotype blocks bevatten. De meest bestudeerde SNP’s, rs1051730 in het CHRNA3 gen en rs16969968 in het CHRNA5 gen, maken er deel uit van deze haplotype blocks en zijn in sterk linkage disequilibrium (r²=0,99) (55). Recente studies toonden aan dat een haplotype, die rs1051730 en rs16969968 omsluit, in de CHRNA3-CHRNA5-CHRB4 gencluster geassocieerd is met zwaar roken (56) en het aantal gerookte sigaretten per dag (57). Deze SNP’s werden eveneens geassocieerd met nicotine afhankelijkheid gedefinieerd door FTND (58, 59), en met jonge leeftijd van rookstart (60). Drie andere studies (61, 62, 63) toonden aan dat de SNP’s in de gencluster geassocieerd zijn met een verhoogd risico op longkanker. Een van deze studies (61) vond dat deze SNP’s geassocieerd zijn met rookhoeveelheid en nicotine afhankelijkheid en suggereert daarom dat de link met longkanker primair gemedieerd werd door bepaalde vormen van rookgedrag. De twee andere studies (62, 63) vonden weinig of geen bewijs voor associatie van de SNP’s met rookgedrag en deze concludeerden dat de genetische variaties direct een invloed hebben op de ontwikkeling van longkanker.

1.6 Doelstelling De huidige studie maakt deel uit van ‘The Flemish interuniversity study on Withdrawal Intervention by Nicotine Substitution Therapy in hospitalized smokers (WINST)’. In een eerste fase van deze studie wordt het effect van NS behandeling bij het optreden van acute ontwenningsverschijnselen van nicotine addictie bij gehospitaliseerde patiënten bestudeerd. In een tweede luik wordt de genetische achtergrond nagegaan die bijdraagt tot de ontwikkeling van verslaving, de stopratio en het optreden van ontwenningssymptomen. Het tweede luik wordt in de huidige studie behandeld. Hierbij zullen de bovenstaande polymorfismen worden onderzocht. Onderdeel van deze studie is het optimaliseren van PCR-, RFLP- en HRMprotocol voor de SNP in het CHRNA3 gen. 21

Deel II: Materialen en methoden

2.1

Inleiding

In deze studie zullen de polymorfismen in genen worden bepaald bij een bepaalde patiëntengroep. Hiervoor wordt uit elk bloedstaal het DNA geïsoleerd om er vervolgens een PCR op uit te voeren. De polymorfismen worden bepaald met behulp van RFLP, allel specifiek 2-tube primer methode en HRM. Uiteindelijk zullen de resultaten verwerkt worden in een statistische analyse.

2.2

Studiepopulatie

Voor deze studie worden patiënten gerekruteerd van vier Vlaamse Universitaire ziekenhuizen, UZ Gent, UZ Leuven, UZ Antwerpen en UZ Brussel, in het kader van ‘the Flemish interuniversity Study on Withdrawal Intervention by Nicotine Substitution Therapy in Hospitalized Smokers (WINST)’. Deze patiënten worden opgenomen in de studie wanneer ze voldoen aan volgende inclusiecriteria: ƒ

ouder dan 18

ƒ

een dagelijkse consumptie van minstens 15 sigaretten in de afgelopen 3 jaren, en gemiddeld 10 sigaretten per dag tijdens de laatste week voor opname

ƒ

een levensverwachting van minstens 1 jaar

ƒ

bewust en aanspreekbaar

ƒ

een informed consent kunnen lezen en ondertekenen

ƒ

Nederlands- of Franstalig

ƒ

voorziene hospitalisatieduur bedraagt minstens 72 uur

ƒ

behandelende arts en/of anesthesist gaat akkoord met deelname aan de studie.

Deze personen ondergaan een behandeling gedurende 7 dagen. De deelnemers worden ingedeeld in twee groepen: een groep wordt behandeld met actieve NS pleisters; de andere groep, de controlegroep, wordt behandeld met een placebo. Beide groepen krijgen een korte

22

counseling door de rookstopverpleegkundige. Follow-up gebeurt telefonisch na 1 week, na 1 maand en na 6 maand na studiebehandeling. Aan alle deelnemers van de studie wordt gevraagd een vragenlijst in te vullen die onder andere peilt naar de leeftijd van rookstart, naar het aantal sigaretten per dag, naar de mate van nicotineafhankelijkheid (Fagerström Nicotine Dependence Test) en naar de mate van optreden van ontwenningsverschijnselen (Minnesota Nicotine Withdrawal Scale). Tevens wordt hen gevraagd een informatie- en toestemmingsformulier te ondertekenen zowel voor de deelname aan de klinische studie als voor de bereidheid tot afgifte van een bloedstaal. Bij toestemming wordt er via een veneuze prik een vijftal ml vol bloed in een EDTA tube afgenomen. Aan de klinische studie nemen 390 personen deel; van 255 personen werd een bloedstaal genomen. Alle deelnemers behoren tot het Kaukasische ras.

2.3

DNA purificatie uit humaan bloed

Het DNA wordt uit het bloed geëxtraheerd volgens het Puregene protocol (Gentra® Puregene® Handbook). De rode bloedcellen worden gelyseerd door 9 ml RBC lyse aan 3 ml bloed toe te voegen. Na 5 min incubatie op kamertemperatuur en 5 min centrifugatie aan 2000xg wordt het supernatans verwijderd. Aan het pellet wordt 3 ml cellyse oplossing toegevoegd. Vervolgens wordt hieraan 1 ml proteïne precipitatie buffer toegevoegd. Dit wordt gedurende 5 min gecentrifugeerd aan 2000xg zodat de eiwitten neerslaan met vorming van een donkerbruin pellet. Het supernatans, dat het DNA bevat, wordt overgegoten in een buisje dat 3 ml 100% isopropanol bevat. Na 3 min centrifugatie aan 2000xg wordt het supernatans verwijderd en het overgebleven DNA pellet wordt gewassen met 3 ml 70% ethanol. Na 1 min centrifugatie aan 2000xg en verwijderen van supernatans wordt het DNA-pellet gedroogd aan de lucht. Hieraan wordt 500 μl DNA hydratie oplossing toegevoegd en wordt gedurende 1 uur geïncubeerd op 65°C. Na overnachting op kamertemperatuur wordt de DNA oplossing bewaard op −20°C.

23

2.4 2.4.1

Polymerase chain reaction (PCR) Principe

PCR is een techniek die wordt aangewend voor het amplificeren van een bepaald DNAfragment. De PCR-reactie bestaat uit drie fasen: de denaturatiefase, de hybridisatiefase en de verlengingsfase. De denaturatie grijpt plaats door het DNA te verhitten tot 95°C. Op deze temperatuur ontdubbelt het DNA met het ontstaan van enkelstrengig DNA en vallen alle enzymatische reacties stil (vb. de extensiefase van de vorige cyclus). Tijdens de hybridisatiefase

daalt

de

temperatuur

tot

een

voor

de

primer

specifieke

hybridisatietemperatuur (Ta), waardoor deze primers binden met hun complementaire sequenties op de gescheiden DNA-strengen. De verlengingsfase gaat van start op een temperatuur van 72°C. Dit is de ideale temperatuur voor de werking van het DNApolymerase. Tijdens deze fase binden de nucleotiden, complementair met de template, met vorming van het gewenste DNA-fragment. Door de stijging van temperatuur gaat de binding van primers met aspecifieke regio’s verloren. Bijgevolg zullen geen ongewilde DNAfragmenten worden gevormd. Deze cyclus wordt 35 maal herhaald. In deze studie wordt gebruik gemaakt van een algemeen programma en een gemodificeerd programma (zie tabel 1 en 2). Tabel 1: Algemeen PCR-programma. Temperatuur

Tijd

95°C

5 min

95°C

1 min

Ta

1 min

72°C

1 min

72°C

10 min

15°C

10 min

Ta: annealinstemperatuur.

24

Cycli

35 cycli

Tabel 2: Gemodificeerd PCR-programma. Temperatuur

Tijd

Cycli

98°C

1 min

98°C

20 sec

74°C

5 min

15°C

10 min

35 cycli

De TaqIA en TaqIB polymorfismen in DRD2 worden bepaald door gebruik te maken van het algemeen programma met een hybridisatietemperatuur van respectievelijk 64°C en 58°C. Het gemodificeerd PCR-programma wordt gebruikt om de DRD2 -141C Ins/Del te bepalen.

2.4.2

PCR-mix

Een standaard PCR-mix wordt gehanteerd voor het amplificeren van het DNA-fragment dat de polymorfismen DRD2 TaqIA, DRD2 TaqIB en DRD2 -141C Ins/Del flankeert. Voor deze variaties wordt gewerkt met een eindvolume van 25μl. De negatieve controle wordt gevormd door het DNA volume te vervangen door dH2O (Sigma). Een overzicht van de PCR-mix voor de SNP’s DRD2 TaqIA, DRD2 TaqIB en DRD2 -141C Ins/Del wordt gegeven in tabel 3. Tabel 3: PCR-mix.

Product

DRD2 TaqIA

DRD2 TaqIB

DRD2 -141C Ins/Del

Producent

dNTP’s

5μl

5μl

5μl

Amersham Pharmacia Biotech Inc., 1Mm

Gibco buffer

2.5μl

2.5μl

2.5μl

Gibco, 10x

MgCl2

0.75μl

0.75μl

0.75μl

Sigma, 50mM

Forward primer

0.5μl

0.5μl

0.25μl

Invitrogen, 50μM

Reverse primer

0.5μl

0.5μl

0.25μl

Invitrogen, 50μM

Platinum Taq DNApolymerase

0.12μl

0.12μl

0.12μl

Invitrogen, 5U/μl

dH2O

10.63μl

10.63μl

11.13μl

Sigma

DNA

5μl

5μl

5μl

/

25

2.4.3 Primers De sequenties van de primers, gebruikt voor PCR en HRM, worden door het labo zelf bepaald en geproduceerd door het bedrijf Biolegio. Om tot een succesvolle amplificatie te komen dienen hiervoor een aantal regels in acht genomen te worden. Idealiter is de primer ongeveer 20 nt lang met een annealingtemperatuur (Ta) die voor beide primers ongeveer dezelfde is. Deze Ta wordt bekomen door gebruik te maken van de volgende formule: Ta= (#[T/A] * 2 + #[G/C] * 4) - 2. Bijkomend dient men er rekening mee te houden dat de forward primer eindigt op G of C en de reverse primer begint met C of G. Dit verhoogt de efficiëntie van de hybridisatie. Drie of meer opeenvolgende identieke nucleotiden worden best vermeden, alsook complementariteit tussen beide primers, dit om vorming van ‘hairpins’ of primerdimeren te voorkomen. Een overzicht van de gebruikte primers wordt gegeven in tabel 4. Tabel 4: PCR-primers voor DRD2 TaqIA (C>T), TaqIB (G>A) en DRD2 -141C Ins/Del. Nr. Naam Sequentie Lengte (# nt)

Ta (°C)

DRD2 TaqIA C>T 69

DRD2/32.563F

-5' CTTGATCTCAGGTGATCTGC 3'-

20

58

70

DRD2/32.931R

-5' CCTTCCTGAGTGTCATCAAC 3'-

20

58

DRD2 TaqIB G>A 71

DRD2/7.231F

-5' TGATACCCACTTCAGGAAGTC 3'-

21

60

72

DRD2/7.690R

-5' GATGTGTAGGAATTAGCCAGG 3'-

21

60

DRD2 -141C Ins/Del 87

DRD2/284F

-5' ACTGGCGAGCAGACGGTGAGGACCC 3'-

25

82

88

DRD2/20R

-5' TGCGCGCGTGAGGCTGCCGGTTCGG 3'-

25

86

Ta: annealingstemperatuur.

26

2.4.4 Optimalisatie van het PCR-protocol De protocols voor het bepalen van de DRD2 polymorfismen TaqIA, TaqIB en -141C Ins/Del zijn reeds geoptimaliseerd. Het protocol voor het CHRNA3 polymorfisme Gly394Gly (rs1051730) (60) dient nog onder optimale condities gebracht te worden. Hiervoor worden verschillende PCR-programma’s en PCR-mixen geprobeerd om zo tot één enkel bandje op de gepaste hoogte te komen. Wanneer dit niet het geval is en een ‘smear’ ontstaat, kunnen verschillende parameters veranderd worden. Zo kan de hybridisatietemperatuur van de primers of het aantal cycli van de PCR-synthesestap gewijzigd worden om een beter PCRproduct te bekomen. Verhogen van de hybridisatietemperatuur, dus het verstrengen van de reactie, leidt ertoe dat de primers niet zoveel mogelijkheden meer hebben om te binden met aspecifieke regio’s. Voorts kan toevoegen van DMSO de reactie verbeteren, daar DMSO een betere denaturatie teweegbrengt. Dit zorgt op zijn beurt voor een sterkere binding van de primers. Deze parameters worden stap voor stap veranderd totdat het optimale PCR-bandje ontstaat. 2.4.5 PCR-producten Er wordt een PCR (Gene Amp 2700, Applied Biosystems; Px2 Thermal cycler, Thermo electron corporation) verricht op het bekomen DNA uit het bloed van de patiënt. Het DNAfragment dat de SNP bevat kan geamplificeerd worden door voor de verschillende polymorfismen steeds andere primerparen, die de gewenste variatie flankeren, te gebruiken.

2.4.5.1 Controle PCR-producten Vooraleer verdere analyses op het PCR-product worden uitgevoerd, dient te worden bevestigd dat de PCR-reactie geslaagd is. Deze controle gebeurt in een 1.5% agarosegel. Deze gel wordt gemaakt door 1.5 g agarosepoeder (Invitrogen) te mengen met 100ml 0,5x TBE-buffer en dit op te warmen tot een heldere gelachtige vloeistof wordt bekomen. Daarna wordt deze vloeistof in een ‘tray’ gegoten waarin een kam wordt geplaatst. De gel is na ongeveer 30 minuten opgesteven en klaar voor gebruik. Het PCR-product wordt geladen in de uitsparingen van de gel onder de vorm van een mengsel dat bestaat uit 2μl PCR-product, 1μl ladingsbuffer en 8μl Sigma dH2O. In de eerste laan van elke gel wordt steeds 0.8μl ladder (Biolabs, 100bp) 27

geladen. Nadat de gel geladen is kan het electroforesetoestel (Cosmo Bio, Westburg) aangelegd worden gedurende 30 minuten op 135 Volt. Na de electroforese kan het PCRbandje zichtbaar gemaakt worden door de gel voor ongeveer 30 minuten in een ethidiumbromide (Gibco) bad te leggen. Visualisatie van het PCR-product gebeurt door de gel op een UV-plaat (UV-transilluminator, UPV) aan te brengen. Wanneer een bandje van de juiste lengte verschijnt bij de stalen en de negatieve controle blanco blijft, dan is de PCR succesvol verlopen. Van elke gel wordt een foto (Olympus camera) genomen die bewaard blijft op de computer.

2.4.5.2 Bereiding van TBE-buffer, ladingsbuffer en TE-buffer TBE-buffer wordt in het labo zelf gemaakt. Hiervoor wordt eerst een stockoplossing (10x) bereidt door 54g Tris (Sigma), 27.5g boraat (Sigma) en 4.65g EDTA (Sigma) op te lossen in 500ml dH2O. Vervolgens wordt deze oplossing 20 maal verdund om tot de werkoplossing (0.5x) te komen door 50ml 10x TBE op te lossen in 950ml dH2O. De werkoplossing TBEbuffer wordt aangewend voor het maken van gels, voor in het electroforesebad en voor in het ethidiumbromidebad. Ladingsbuffer wordt eveneens bereid in het labo zelf, door het samenvoegen van 500μl glycerol (Sigma), 250μl bromofenolblauw 1% (Sigma) en 250μl dH2O. Dit mengsel dient goed te worden gevortext en wordt bewaard op -20°C. TE-buffer wordt gebruikt voor de bereiding van de primers. De poedervorm waarin de primers worden geleverd, wordt opgelost in 10mM TE-buffer. Dit ontstaat door de stockoplossing (100mM) 10 maal te verdunnen. De stockoplossing is een mengsel van 6.05g Tris (Sigma), 1.86g EDTA (Sigma) in 500ml dH2O.

2.5

Polymorfisme bepaling

Voor de detectie van de polymorfismen zullen drie verschillende technieken worden gebruikt. Een eerste techniek is ‘Restriction Fragment Length Polymorphisms assay’ (RFLP), dewelke enkel kan uitgevoerd worden wanneer de geschikte restrictie-enzymen voorhanden zijn. Er wordt steeds geprobeerd met deze techniek te werken. Wanneer dit niet lukt wordt overgeschakeld naar High Resolution Melt (HRM) analyse of wordt uitgekeken naar een in de 28

literatuur beschreven protocol voor het betreffende polymorfisme. De SNP’s in het DRD2 gen zullen gedetecteerd worden via RFLP, de SNP in het CHRNA3 gen via HRM en het polymorfisme in het COMT gen via de allel specifiek 2-tube primer methode. 2.5.1 Restriction fragment length polymorphism assay Bij de RFLP-techniek wordt het verkregen PCR-fragment met een specifiek restrictie-enzym geïncubeerd op een bepaalde temperatuur. Het eindvolume bedraagt steeds 30μl. De gebruikte protocols worden weergegeven in tabel 5. Tabel 5: RFLP-protocols. Reagentia

DRD2 TaqIA

DRD2 TaqIB

DRD2 -141C Ins/Del

dH2O

21.2μl

20.45μl

16.4μl

PCR-product

5μl

6μl

10μl

Buffer

3μl

3μl

3μl

BSA

0.3μl

0.3μl

0.3μl

Restrictie-enzym

0.5μl TaqIA, 10U

0.25 Taq1, 5U

0.3μl BstNI, 3U

Incubatieduur en -temperatuur

24 uur bij 65°C

5 uur bij 65°C

Min 20 uur bij 60°C

Digest product

CC: 125/244 CT: 125/244/369 TT: 369

GG: 192/268 GA: 192/268/460 AA: 460

CC: 144/160 C/-: 144/160/303 -/-: 303

De enzymen die een herkenningssequentie hebben die de polymorfe plaats bevat, worden geselecteerd door gebruik te maken van het programma ‘Restriction mapper’ (64). In dit programma wordt een bepaalde nucleotidesequentie, bij voorkeur het verkregen PCRfragment, ingegeven. Restriction mapper zoekt dan naar herkenningsplaatsen voor restrictieenzymen in het fragment. Het restrictie-enzym zal het PCR-fragment al of niet splitsen in meerdere fragmenten, afhankelijk van de aanwezigheid van de bepaalde vorm van de variatie. Zodoende kan een onderscheid gemaakt worden tussen de verschillende allelen. Na de incubatie wordt op het digest een gelelectroforese uitgevoerd (2% agarosegel: 2g agarosepoeder in 100ml 0,5x TBE-buffer). Op de gel wordt achtereenvolgens 0.8μl ladder, de negatieve controle die gelijk is aan het ongeknipte PCR-product, en 20μl van elk staal geladen. Afhankelijk van de aanwezige vorm van het polymorfisme zal het enzym 29

verschillend knippen en zal een ander bandenpatroon te zien zijn op de gel. De verschillende bandenpatronen van de SNP’s in het DRD2 gen kan men vinden in figuur 2. Figuur 2: a) DRD2 TaqIA, b) DRD2 -141C Ins/Del, c) DRD2 TaqIB. a)

b)

c)

2.5.2 Optimalisatie RFLP Bepaling van het CHRNA3 Gly394Gly polymorfisme vereist niet alleen optimalisatie van het PCR-protocol maar ook van de digestomstandigheden. Hiervoor worden verschillende situaties onderzocht om tot de beste omstandigheden te komen die het best het onderscheid maakt tussen de verschillende bandjes. Alweer kunnen enkele parameters gewijzigd worden. Zo kan men ofwel het PCR-product verminderen (men start met 10μl), ofwel de incubatietijd variëren, ofwel de hoeveelheid enzym per staal opdrijven. Omwille van de kostprijs wordt getracht om niet meer enzym te gebruiken dan nodig. De omstandigheden die voor het beste onderscheid in bandjes zorgen worden gezien als de optimale omstandigheden 2.5.3 High resolution melt analyse Ten gevolge van de tegenvallende resultaten bekomen met RFLP voor de genotypering van de CHRNA3 Gly394Gly SNP, werd in tweede instantie de HRM techniek gebruikt en is gebaseerd op een PCR in aanwezigheid van de DNA-dubbelstreng bindende kleurstof LCGreenTM en op hoge resolutie denaturatie van de DNA-fragmenten op een Lightcycler® 30

installatie. Door de aanwezigheid van de fluorescente kleurstof zullen smeltcurves gegenereerd worden, dewelke het dan mogelijk maken de sequentievariatie af te leiden. Een vereiste is dat een voorbeeld nodig is van alle genotypes. 2.5.4 Allel specifiek 2-tube methode Deze techniek (47) wordt gebruikt voor de genotypering van het COMT Val158Met polymorfisme en is gebaseerd op twee PCR-reacties. Hierbij wordt gebruik gemaakt van sequentie specifieke primers, waarbij de ene primer instaat voor de detectie van het wild type allel en de andere voor de detectie van het variante allel. Een overzicht van de PCR condities, de PCR-mix en de gebruikte primers wordt weergegeven in tabel 6, 7 en 8 respectievelijk.

Tabel 6: PCR condities (51). Temperatuur Tijd

Cycli

Temperatuur

Tijd

96°C

30 sec

55°C

60 sec

96°C

1 min

96°C 70°C 72°C

20 sec 25 sec

72°C

90 sec

96°C 65°C 72°C

25 sec

20°C

5 min

4°C

10 min

45 sec

50 sec

5 cycli

21 cycli

30 sec

31

Cycli

4 cycli

Tabel 7: PCR-mix allel-specifiek 2-tube methode (51). Product

COMT Val158Met

Producent

DNTPs

3μl

Amersham Pharmacia Biotech Inc., 1mM

Gibco buffer

1μl

Gibco, 10x

MgCl2

0,3μl

Sigma, 50mM

Forward primer (G of A)

0,14μl

Invitrogen

Reverse primer

0,14μl

Invitrogen

Forward primer controle

0,06μl

Invitrogen

Reverse primer controle

0,06μl

Invitrogen

Platinum Taq DNApolymerase

0,02μl (0,1U)

Invitrogen

dH2O

4,28μl

Sigma

DNA

1μl

/

Tabel 8: Primers allel specifiek 2-tube methode. Nr. Naam

Sequentie

Lengte (# nt)

COMT Val158Met G>A 90

COMT/23.735F1

-5' ATGGTGGATTTCGCTGGCG 3'-

19

91

COMT/23.735F2

-5' ATGGTGGATTTCGCTGGCA 3'-

19

92

COMT/24.205R

-5' GATGTCCTGGGACGCTCC 3'-

18

Controleprimer 97

HLA-DRB1/JohnstoneF

-5' TGCCAAGTGGAGCACCCAA 3'-

19

98

HLA-DRB1/JohnstoneR

-5' GCATCTTGCTCTGTGCAGAT 3'-

20

De reactiemix bevat telkens een forward primer die ofwel specifiek is voor de A variant ofwel voor de G variant. De reverse primer is voor beide reacties dezelfde zodanig dat er telkens een DNA-fragment van 471bp gevormd wordt. Er is tevens een controleprimer aanwezig om de vals negatieve resultaten te elimineren. Deze controleprimer geeft aanleiding tot een 750bp groot DNA-fragment. De PCR-producten worden gescheiden op een agarosegel (2% agarosegel: 2g agarosepoeder in 100ml 0.5x TBE-buffer). Na ongeveer 30 minuten wordt deze gel gevisualiseerd door deze gedurende 30 minuten in het ethidiumbromidebad te leggen. De resultaten zijn pas geldig wanneer het controlebandje zichtbaar is. De 32

aanwezigheid van een 471bp product in één van de reacties wijst op homozygotie, aanwezigheid van 471bp bandje in beide reacties wijst op heterozygotie (zie figuur 3).

Figuur 3: COMT Val158Met; bovenste laan: PCR-product specifiek voor de G variant; onderste laan: PCR-product specifiek voor de A variant.

2.6

Kwaliteitscontrole

Om zekerheid te bekomen over de juistheid en reproduceerbaarheid van de resultaten wordt een kwaliteitscontrole uitgevoerd. Hiervoor wordt van 20% willekeurig gekozen stalen het genotype opnieuw bepaald. Dit geschiedt ook bij de stalen waarvan het om een of andere reden niet mogelijk was om het genotype af te lezen. Dit heeft tot bedoeling om na te gaan of de resultaten stroken met de reeds voorheen bepaalde genotypes en om helderheid te bekomen omtrent de onzekere stalen. 2.7

Statistische analyse

In deze studie worden drie eindpunten onderzocht nl. maat van verslaving, optreden van ontwenningsverschijnselen na rookstop, stopratio na 1 week en stopratio na 1 maand na rookstopbehandeling. Voor elk van deze eindpunten wordt een associatie onderzocht met genetische polymorfismen in het DRD2 gen en in het COMT gen. De invloed van mogelijke confounding factors, zoals leeftijd van rookstart en aantal sigaretten per dag, op elk van de beschouwde eindpunten wordt eveneens getest via correlatie analyse of 33

via Mann-Withney en in rekening gebracht voor verdere analyses indien deze betrokken lijken. De associatie tussen genetische polymorfismen en verslaving en de associatie tussen genetische polymorfismen en het optreden van ontwenningsverschijnselen wordt bepaald met behulp van de niet-parametrische Kruskall-Wallis en Mann-Withney testen. Met behulp van variantie analyse wordt de invloed van de mogelijke confounding factors in rekening gebracht. Om de associatie tussen genetische factoren en de stopratio na te gaan wordt er gebruik gemaakt van logistieke regressie, waarbij odds ratio’s met bijhorende p-waarden worden bekomen. Testen voor Hardy-Weinberg evenwicht werden uitgevoerd gebruikmakend van de geobserveerde genotype frequenties en een χ² test. Bovenstaande statistische analyses worden uitgevoerd in SPSS versie 15.0. Voor de bepaling van mogelijke linkage tussen de SNP’s in DRD2 wordt gebruik gemaakt van Haploview software versie 4.0.

34

Deel III: Resultaten 3.1

Optimalisatie CHRNA3 Gly394Gly (rs1051730)

Teneinde dit polymorfisme te bepalen wordt getracht een RFLP assay toe te passen. Daarvoor dient eerst het PCR-protocol te worden geoptimaliseerd. Het algemeen programma, Ta =60°C, wordt toegepast met de primers 103 en 104 (zie tabel 9), gebruikmakend van de standaardmix met een eindvolume van 25μl. Dit PCR-protocol was succesvol met duidelijk zichtbare bandjes ter hoogte van ongeveer 500bp. Daarna moet het digest onder optimale omstandigheden gebracht worden. Zoals eerder vermeld, gebeurt dit door de hoeveelheid van PCR-product, het aantal units restrictie-enzym en de incubatietijd te laten variëren. Via Restriction mapper (64) werd het enzym BstEII gevonden. Dit enzym zal het PCR-fragment 1x knippen indien de T variante vorm van het polymorfisme aanwezig is. Verschillende digestcondities werden getest. Initieel werd uitgegaan van 10μl PCR-product met een stijgende hoeveelheid restrictie-enzym (van 2U tot 10U in stappen van 2U, 15U en 20U), dit telkens gedurende 2u, 4u en overnacht incubatie. Vervolgens werd vertrokken van 5μl PCRproduct met een stijgende hoeveelheid restrictie-enzym (8U, 15U, 20U) gedurende 4u en overnacht incubatie. Tijdens elk van deze condities konden geen verschillende bandjes worden waargenomen. Dit wijst erop dat het restrictie-enzym de vooropgestelde regio niet heeft gesplitst. Tabel 9: Overzicht van de gebruikte primers bij optimalisatie van het CHRNA3 Gly394Gly protocol. Frag Nr. Naam Sequentie # nt Tm (°C) RFLP: CHNRA3 Gly394Gly T>C 103

CHRNA3/19.301F

-5' TCACCGTCTTCGTGCTCAAC 3'-

20

60

104

CHRNA3/19.853R

-5' TAACACAGGCCACTGACTCC 3'-

20

60

553

HRM: CHRNA3 Gly394Gly 113

CHRNA3/19.406F

-5' TGACCAGGCCAACAAGCAAC 3'-

20

60

114

CHRNA3/19.605R

-5' GCTTCTCGTGAGGTTAGCAC 3'-

20

60

35

200

Aangezien de RFLP assay niet succesvol was, werd geopteerd om het polymorfisme te bepalen met HRM; hiervoor waren echter nieuwe primers nodig. HRM heeft een hogere kans op slagen indien het PCR-fragment tussen 100 en 200 bp is. Nieuwe primers werden ontworpen conform de regels. Opnieuw dient dit PCR-protocol onder optimale condities te worden gebracht. Hiervoor wordt de standaard PCR-mix met LCGreenTM gebruikt, met een eindvolume van 15μl (3μl DNA, 3μl dNTP’s (1mM), 1,5μl Gibco buffer (10X), 0,45μl MgCl2, 0,3μl forward primer (50μM), 0,3μl reverse primer (50μM), 0,072μl Platinum Taq (0,6U), 0,75μl LCGreenTM en 6,38μl dH2O). Er wordt met een eindvolume van 15μl gewerkt daar niet zoveel PCR-product nodig is voor de verdere analyse. Het algemeen programma, Ta =60°C, met primers 113 en 114 (zie tabel 9) wordt uitgevoerd. De resultaten waren geslaagd met een duidelijk bandje ter hoogte van 200bp (zie figuur 4). Figuur 4: PCR-mix met LCGreenTM.

Vervolgens worden diverse combinaties getest om geen tijd te verliezen. Er worden PCRmixen gemaakt waarbij er al dan niet DMSO wordt aan toegevoegd en de hoeveelheid MgCl2 gewijzigd wordt. De verschillende omstandigheden zijn: (1) standaard PCR-mix met 0.75μl LCGreenTM, (2) 2mM MgCl2 in plaats van 1.5mM MgCl2 (0.6μl) (3) 2mM MgCl2 en 0.75μl DMSO, (4) 2mM MgCl2 en 1.5μl DMSO, (5) 2.5mM MgCl2 (0.75μl). Een vereiste voor HRM is dat een aantal voorbeelden nodig zijn van alle genotypes. Daarom werden 16 stalen gesequeneerd door de Medische Genetica van het UZGent. Bij raadpleging van de resultaten van de sequeneringsdata werd duidelijk dat de 16 stalen allen homozygoot waren op de onderzochte positie. Dit resultaat werd niet conform bevonden hetgeen verwacht werd voor het polymorfisme op deze positie daarom werd besloten om niet verder te werken op deze SNP.

36

3.2

Studiepopulatie

Van de 370 personen die deelnamen aan de klinische studie, werden 255 bloedstalen gecollecteerd. Uiteindelijk zal de statistische analyse uitgevoerd worden op een populatie van 227 personen. De overige waren drop-outs. Van de 227 geïncludeerde personen kregen 118 de actieve NS behandeling, de overige 109 werden behandeld met een placebo. 3.3 SNP data De allelfrequentie van de onderzochte SNP’s in de beschouwde populatie bedraagt 21%, 13%, 8.5% en 50% voor respectievelijk DRD2 TaqIA, DRD2 TaqIB, DRD2 -141C Ins/Del en COMT Val158Met. Voor DRD2 TaqIB, DRD2 -141C Ins/Del en COMT Val158Met zijn de geobserveerde genotype frequenties consistent met het Hardy-Weinberg evenwicht (met pwaarden 0.57, 0.39 en 0.40 respectievelijk). De genotype frequentie van het DRD2 TaqIA polymorfisme wijkt af van het Hardy-Weinberg evenwicht (p=0.03). De linkage tussen TaqIA en TaqIB in het DRD2 gen bedraagt r²=0.58. 3.4 Eindpunt I: maat van verslaving Deze analyse gaat het verband na tussen het genotype met de mate van verslaving. De leeftijd van rookstart en het aantal sigaretten per dag werden initieel getest als mogelijke confounding factors op verslaving. Voor deze analyse werd de volledige groep in beschouwing genomen daar de maat van verslaving onafhankelijk is van de rookstop behandeling. 3.4.1

Invloed van mogelijke confounding factors

In eerste instantie wordt de correlatie nagegaan tussen enerzijds de leeftijd van rookstart en verslaving, en anderzijds tussen aantal gerookte sigaretten per dag en verslaving. Het aantal sigaretten per dag is positief gecorreleerd met de Fagerström score (correlatie coëfficiënt= 0.64). Indien het aantal sigaretten per dag stijgt, zal de Fagerström score ook stijgen. Dit is een logisch verband aangezien het aantal sigaretten opgenomen is in de FTND (3 punten van de 10). Leeftijd van rookstart is eveneens gecorreleerd met de Fagerström score, dit is echter een negatief verband (correlatie coëfficiënt= -0.14). Een jongere leeftijd gaat gepaard met een hogere Fagerström score. Bovendien is er een trend zichtbaar tussen de leeftijd van rookstart en het aantal gerookte sigaretten per dag (correlatie coëfficiënt=-0.112, 37

p=0.093); deze trend geeft aan dat een vroegere rookstart gepaard gaat met een hogere sigarettenconsumptie. Deze correlaties bestaan onafhankelijk van het genotype. 3.4.2

Associatie genetisch polymorfismen met de mate van verslaving

De Kruskall-Wallis test toont aan dat zowel DRD2 TaqIA als DRD2 TaqIB geassocieerd zijn met de mate van verslaving, DRD2; -141C Ins/Del en COMT Val158Met vertonen geen associatie (zie tabel 10 Deze associatie blijkt significant te zijn voor de heterozygoten en voor de dragers van het variante allel, wanneer deze worden gegroepeerd. De homozygoot varianten bevinden zich rond het significantieniveau. Er dient te worden opgemerkt dat slechts twee individuen dit genotype bezitten. Dus, over hoe meer variante allelen iemand beschikt, hoe hoger de mate van verslaving zal zijn (zie figuur 5). Tabel 10Effect van het genotype op de mate van verslaving, weergegeven door de Fagerström score. p-waarde K-W

p-waarde M-W

0.021*

Ref 0.020* 0.060 0.006*

4.91 (163) 5.91 (54) 7.00 (2) 5.95 (56)

0.013*

Ref 0.005* 0.286 0.004*

CC C/-/C/- + -/-

5.20 (180) 5.19 (36) / (0) 5.19 (36)

0.80

Nvt

GG GA AA GA+AA

5.12 (50) 5.09 (118) 5.42 (50) 5.19 (168)

0.75

Nvt

Gen

SNP

Genotype

FTND score (n)

DRD2

TaqIA

CC CT TT CT+TT

4.87 (143) 5.67 (60) 6.13 (16) 5.76 (76)

GG GA AA GA+AA

DRD2

DRD2

COMT

TaqIB

-141C Ins/Del

Val158Met

*: <0.05, statistisch significant. nvt: niet van toepassing

38

10

10

8

8

Fagerstrom score

Fagerstrom score

Figuur 5: Associatie tussen TaqIA, TaqIB en Fagerström score.

6

4

2

6

4

2 140 50 145

0

0 CC

CT

TT

GG

GA

AA

Taq1B, per 3

Taq1A, per 3

3.4.3

2

Associatie van genetische polymorfismen met mate van verslaving, rekening houdend

met confounding factors Voor deze analyse wordt effect genotype en de startleeftijd als covariante ingebracht. Het aantal sigaretten per dag wordt niet meegerekend als covariante omdat deze reeds is opgenomen in de FTND. Uit de variante analyse kan worden opgemaakt dat zowel leeftijd van rookstart als de polymorfismen in DRD2 TaqIA en TaqIB een invloed hebben op de mate van verslaving. Individuen die drager zijn van het variante allel van DRD2 TaqIA of DRD2 TaqIB en die een jongere leeftijd van rookstart vertonen, hebben de neiging een grotere mate van verslaving te ontwikkelen in vergelijking met die individuen die homozygoot normaal zijn voor beide polymorfismen en op latere leeftijd beginnen met roken (zie tabel 11. De variantie analyse hoeft voor DRD2 -141C Ins/Del en COMT Val158Met niet te worden uitgevoerd daar er geen verband bestaat tussen de polymorfismen en de mate van verslaving (zie hoger).

39

Tabel 11 Overzicht van de p-waarden verkregen uit de variantie analyse voor TaqIA en TaqIB met als afhankelijke variabele de Fagerström score en met als covarianten leeftijd rookstart en aantal sigaretten per dag. Afhankelijke variabele: Fagerström score TaqIA

TaqIB

CC,CT,TT

CC vs CT+TT

TaqIA

0.025*

0.011*

leeftijd rookstart

0.028*

0.034*

GG,GA,AA

GG vs GA+AA

TaqIB

0.026*

0.009*

Leeftijd rookstart

0.045*

0.044*

*: <0,05, statistisch significant

3.5

Eindpunt II: optreden van ontwenningsverschijnselen

Alle deelnemers van de studie vulden bij het einde van de 7 dagen durende behandeling de Minnesota vragenlijst in. Deze geeft aan in welke mate er ontwenningsverschijnselen optreden. Anders dan bij de analyse voor verslaving, wordt deze analyse uitgevoerd op de verschillende groepen namelijk op de controlegroep en op de groep die de actieve NS behandeling

kreeg.

Er

wordt

immers

verondersteld

dat

het

optreden

van

optreden

van

ontwenningsverschijnselen beïnvloed wordt door de gekregen behandeling. 3.5.1 In

Invloed van mogelijke confounding factors deze

analyse

wordt

de

correlatie

nagegaan

tussen

het

ontwenningsverschijnselen en de leeftijd van rookstart en tussen het aantal gerookte sigaretten per dag en het optreden van ontwenningsverschijnselen. Zowel het aantal sigaretten per dag als de leeftijd van rookstart is niet geassocieerd met het optreden van ontwenningsverschijnselen. Dit geldt voor zowel de controlegroep en als voor de groep die de actieve NS behandeling heeft gekregen. Bijgevolg is het niet nodig een variantie analyse uit te voeren.

40

3.5.2

Associatie genetisch polymorfismen met het optreden van ontwenningsverschijnselen

De Mann-Withney test dient niet uitgevoerd te worden daar de Kruskall-Wallis aantoonde dat er geen associatie tussen de polymorfismen en het optreden van ontwenningsverschijnselen is (zie tabel 12. Tabel 12 Effect van het genotype op de mate van optreden van ontwenningsverschijnselen. p-waarde K-W Minnesota score Gen SNP Genotype Placebo Actief (n) Placebo (n) Actief (n) (n) DRD2 TaqIA CC 8.9 (66) 7.4 (76) 0.121 0.244 CT 11.6 (30) 8.7 (30) TT 5.3 (7) 10.9 (9) CT+TT 10.4 (37) 9.2 (39) 0.373 0.140 DRD2

DRD2

COMT

3.6

TaqIB

-141C Ins/Del

Val158Met

GG GA AA GA+AA

8.9 (76) 10.9 (27) 0 (0) 10.9 (27)

7.9 (86) 8.1 (27) 12.0 (2) 8.4 (29)

CC C/-/C/- + -/-

9.4 (85) 9.2 (17) 0 (0) 9.2 (17)

8.2 (94) 7.4 (19) 0 (0) 7.4 (19)

GG GA AA GA+AA

7.8 (26) 9.2 (53) 11.6 (24) 10.0 (77)

8.3 (24) 8.0 (65) 7.6 (25) 7.9 (90)

0.307

0.411

0.307

0.624

0.868

0.741

0.868

0.741

0.175

0.824

0.240

0.545

Eindpunt III: stopratio na 1 week en na 1 maand

Voor dit eindpunt wordt de analyse opnieuw toegepast op de verschillende groepen. 3.6.1

Invloed van mogelijke confounding factors

In deze analyse wordt de correlatie nagegaan enerzijds tussen leeftijd van rookstart en stopratio en anderzijds tussen aantal sigaretten per dag en stopratio. Zowel het aantal sigaretten per dag als de leeftijd van rookstart is niet geassocieerd met de stopratio. Dit geldt voor zowel de controlegroep en als voor de groep die de actieve NS 41

behandeling heeft gekregen. Bijgevolg zal het niet nodig zijn een variantie analyse uit te voeren. 3.6.2

Associatie genetisch polymorfismen met de stopratio

Er is geen invloed van de DRD2 polymorfismen TaqIA en TaqIB op de stopratio, niet na 1 week, noch na 1 maand. Voor de controlegroep wordt een significant verband waargenomen tussen DRD2 -141C Ins/Del en de stopratio na 1 week rookstop (p=0.013). Personen die drager zijn van de heterozygote vorm zullen tot 4x meer geneigd zijn om te stoppen met roken. Die trend zet zich door na 1 maand; deze is echter verzwakt en niet meer significant. Individuen van dezelfde groep die beschikken over de heterozygote vorm van het COMT Val158Met polymorfisme zullen tot 3x meer de neiging hebben om het roken na 1 week op te geven (p=0.046). Opnieuw wordt deze trend waargenomen na 1 maand, maar deze is niet meer significant (zie tabel 13) Voor de personen die de actieve NS behandeling kregen, heeft geen enkel polymorfisme invloed op de uitkomst van de behandeling (zie tabel 14)

42

Stopratio 1 week Gen DRD2

DRD2

DRD2

COMT

SNP TaqIA

TaqIB

-141C Ins/Del

Val158Met

Genotype

Stopratio 1 maand OR

p-waarde

OR

p-waarde

20 (65) 8 (26) 3 (10)

ref 0.80 2.2

0.651 0.359

50 (72) 19 (28) 0

24 (77) 7 (23) 0

ref 0.77

0.602

58 (84) 11 (16) 0

23 (77) 7 (23) 0

ref 1.61

0.383

19 (28) 35 (51) 15 (22)

5 (16) 18 (58) 8 (26)

ref 1.95 2.03

0.248 0.289

niet gestopt (%)

gestopt (%)

44 (64) 22 (32) 3 (4)

0.295

Ref 4.14

0.013*

Ref 2.78 1.06

0.046* 0.921

niet gestopt (%)

Gestopt (%)

CC CT TT

36 (64) 18 (32) 2 (4)

31 (67) 11 (24) 4 (9)

Ref 0.71 2.32

0.450 0.349

GG GA AA

40 (71) 16 (29) 0

37 (80) 9 (20) 0

Ref 0.61

CC C/-/-

51 (91) 5 (9) 0

32 (71) 13 (29) 0

GG GA AA

17 (30) 23 (41) 16 (29)

8 (17) 30 (65) 8 (17)

Tabel 13 Effect van het genotype op de stopratio (controlegroep).

43

Stopratio 1 week Gen DRD2

DRD2

DRD2

COMT

SNP TaqIA

TaqIB

-141C Ins/Del

Val158Met

Genotype

Stopratio 1 maand OR

niet gestopt (%)

gestopt (%)

CC CT TT

41 (68) 14 (23) 5 (8)

36 (64) 16 (29) 4 (7)

ref 1.30 0.91

GG GA AA

46 (77) 12 (20) 2 (3)

41 (73) 15 (27) 0

CC C/-/-

49 (83) 10 (17) 0

GG GA AA

14 (24) 36 (61) 9 (15)

p-waarde

OR

p-waarde

25 (60) 13 (31) 4 (10)

Ref 1.63 1.60

0.277 0.510

56 (79) 13 (18) 2 (3)

29 (69) 13 (31) 0

ref 1.93 0.0

0.147 0.999

0.933 /

60 (86) 10 (14) 0

34 (81) 8 (19) 0

ref 1.41 /

0.508 /

0.749 0.121

17 (24) 39 (56) 14 (20)

6 (14) 26 (62) 10 (24)

ref 1.89 2.02

0.237 0.263

niet gestopt (%)

gestopt (%)

0.541 0.895

50 (70) 16 (23) 5 (7)

ref 1.40 0.0

0.445 0.999

46 (84) 9 (16) 0

ref 0.96 /

10 (18) 30 (54) 16 (29)

ref 1.17 2.49

Tabel 14 Effect van het genotype op de stopratio (groep met actieve NS behandeling).

44

Deel IV: Discussie 4.1

Optimalisatie CHRNA3 Gly394Gly (rs1051730)

Na sequenering van de 16 stalen bleken deze allen het homozygote genotype te hebben op de onderzochte positie. Uit literatuurdata was nochtans gebleken dat de frequentie van de SNP ongeveer 50% bedraagt. Daarom werd de SNP nogmaals opgezocht in de NCBI database (21). Daarbij werd duidelijk dat de onderzochte SNP niet voorkomt op de positie zoals vermeld was in de literatuur (60) en initieel in de database. Dit was meteen de verklaring waarom de sequentie 16x hetzelfde resultaat gaf en waarom het digest nooit lukte. Het polymorfisme rs1051730 blijkt een C>T substitutie te zijn ter hoogte van aminozuurpositie 215, waar zich een tyrosine residu bevindt. 4.2 4.2.1

Maat van verslaving Invloed van de leeftijd van rookstart en het aantal sigaretten per dag op de mate van

verslaving In de huidige studie wordt een zeer sterk verband aangetoond tussen het aantal sigaretten per dag en de mate van verslaving (p<0.001). Dit kenmerk is opgenomen in de Fagerström test voor nicotine afhankelijkheid; er is reeds meerdere malen bewezen dat het aantal sigaretten per dag sterk gecorreleerd is met de mate van verslaving (12, 65). Vink et al toont eveneens een negatieve correlatie aan tussen leeftijd rookstart en mate van verslaving, waarbij individuen die vroeger starten met roken een hogere mate van verslaving vertonen (65). Dit is consistent met wat in deze studie wordt gevonden. 4.2.2

Invloed van het genotype op de mate van verslaving

Uit de huidige studie kan worden geconcludeerd dat de polymorfismen in DRD2 TaqIA en TaqIB geassocieerd zijn met de Fagerström score, wat de mate van verslaving aangeeft. Individuen die drager zijn van het variante allel zullen geneigd zijn meer verslaafd te zijn aan 45

nicotine in vergelijking met die personen die over de homozygoot normale vorm van het polymorfisme beschikken. DRD2 -141C Ins/Del en COMT Val158Met werden niet significant bevonden. In de literatuur bestaat daar geen eensgezindheid over (zie tabel 15). Drie studies konden geen significant verband aantonen tussen het DRD2 TaqIA polymorfisme en mate van verslaving, terwijl de studie van Huang et al wel een significant verband vond (29). Dit is de studie met veruit de grootste populatie. Een andere studie vond geen significant verband tussen DRD2 TaqIB en de mate van verslaving, maar de populatie die werd bestudeerd is kleiner dan degene in deze studie. Voor het DRD2 polymorfisme -141C Ins/Del werden nog geen studies uitgevoerd met betrekking tot de maat van verslaving. In deze studie werd geen associatie tussen verslaving en het COMT polymorfisme gevonden. Dit is in strijd met enkele grootschalige studies, nl. deze van Beuten et al en deze van Redden et al (43, 44). Doch, hun resultaten zijn tegenstrijdig. Beuten et al toonden aan dat de variante methionine vorm gepaard gaat met een verhoogd risico op verslaving (44). Redden et al daarentegen, vond dat dragers van de valine variant een hoger risico op nicotine afhankelijkheid hadden (43). De studies van Redden et al betreft een initiële studie en een validatie studie. De deelnemers van de studie werden gerekruteerd uit verschillende geografische regio’s. Het feit dat de associatie niet werd teruggevonden in beide studies, kan een indicatie zijn dat enkele niet-geobserveerde omgevingsfactoren sterk betrokken zijn op de maat van verslaving.

46

Tabel 15 Associatie van het polymorfisme met mate van verslaving (Fagerström score). Gen

SNP

DRD2

TaqIA

DRD2

COMT

Referentie

# rokers

Populatie

MAF

p-waarde

Deze studie

227

Kaukasisch

0.21

0.022

(27)

84

Kaukasisch

0.14

0.440¹

(30)

52

UK

0.16

0.827¹

(31)

110

Duits

niet gegeven

niet significant

(29)

671

0.24

0.043

Deze studie

227

Kaukasisch

0.13

0.013

(33)

91

Kaukasisch

0.17

niet significant¹

Deze studie

227

Kaukasisch

0.50

0.750

(45)

1067

VS

niet gegeven

niet significant

(44)

671

0.73

0.006²

(43)

342

0.50

0.007³

0.52

0.64

EuropeesAmerikaans

TaqIB

Val158Met

EuropeesAmerikaans Washington en Buffalo Washington

443

en Philadelphia

MAF: Minor Allel Frequency ¹: de mate van verslaving werd nagegaan door gebruik te maken van de Fagerström Tolerance Questionnaire, dit is een oudere versie van de FTND. ²: methionine is risico allel (A allel). ³: valine is het risico allel (G allel).

47

Dikwijls wordt de invloed van het genotype op de leeftijd van rookstart en op het aantal gerookte sigaretten per dag onderzocht. Dit is echter niet de doelstelling van deze studie maar werd toch getest naar aanleiding van de literatuur data (data niet weergegeven). De huidige studie vertoont een associatie van DRD2 TaqIA en DRD2 TaqIB met de leeftijd van rookstart (p=0.02, p=0.05 respectievelijk). De individuen die drager zijn van het variante allel zullen meer vatbaar zijn om vroeger te beginnen met roken. Deze bevinding werd gestaafd door Spitz et al (33), maar tegengesproken door Batra et al (31). Hetzelfde geldt voor het criterium aantal sigaretten per dag. In de huidige studie kunnen we geen associatie aantonen tussen de polymorfismen en het aantal gerookte sigaretten per dag. Maar opnieuw is er verdeeldheid in de literatuur. Het is enkel Connor et al die een associatie tussen het aantal sigaretten per dag en TaqIA kan aantonen, waarbij de aanwezigheid van het variante allel aanleiding geeft tot een grotere rookintensiteit (27). Andere, grotere studies kunnen deze associatie niet vinden. TaqIB daarentegen, wordt wel geassocieerd met de rookintensiteit, volgens een studie die wordt uitgevoerd op 330 rokers (28), en volgens een andere studie op 126 rokers (33), beide studies komen tot tegengestelde bevindingen. Preuss et al tonen aan dat de variante vorm geassocieerd is met het roken van een grotere hoeveelheid (28), terwijl bij Spitz et al het roken van meer sigaretten geassocieerd is met de homozygoot normale vorm (33). Het COMT Val158Met polymorfisme wordt eenmaal geassocieerd met de hoeveelheid gerookte sigaretten per dag (44). Andere, omvangrijke studies kunnen deze associaties niet aantonen (45, 47). Het eindpunt in deze studie is het onderzoeken van de factoren die mogelijks een invloed hebben bij het ontwikkelen van een afhankelijkheid aan nicotine; dit wordt gemeten door de Fagerström test, voornamelijk met betrekking tot het genotype. In de literatuur wordt vaak het aantal gerookte sigaretten per dag als criterium gebruikt bij de bepaling van het rookgedrag. Echter, deze studie wijst uit dat het genotype een invloed uitoefent op de mate van verslaving maar niet op de hoeveelheid gerookte sigaretten per dag. Het is dan ook fout om deze 48

bevindingen met elkaar te vergelijken. Dit kan een mogelijke reden zijn waarom er geen samenhang tussen de verschillende studies gevonden wordt. Wanneer studies met elkaar vergeleken worden, dienen de criteria die verslaving determineren, dezelfde te zijn.

4.3

Maat van optreden van ontwenningsverschijnselen

Geen enkel polymorfisme wordt in deze studie geassocieerd met het optreden van ontwenningsverschijnselen, noch met de leeftijd van rookstart als met de hoeveelheid sigaretten per dag. Dit laatste werd reeds bevestigd door Smith et al (66). Dit is in tegenstelling tot de bevindingen uit de studie van David et al. (zie tabel 16). Deze toont een significant verband aan tussen het DRD2 polymorfisme TaqIA en het optreden van ontwenningsverschijnselen, onafhankelijk van de rookstopbehandeling (67). De individuen die beschikken over de homozygoot normale vorm vertonen een significante vermindering van de hunkering naar nicotine. Het gaat hier echter om een kleine studie. Tabel 16: Associatie van het polymorfisme met het optreden van ontwenningsverschijnselen. # rokers Gen

SNP

DRD2

TaqIA

Referentie

(placebo/actief)

Populatie

MAF

Deze studie

109/118

Kaukasisch

0.21

(68)

29

Providence, Rhode Island

0.19

p-waarde

0.001

MAF: minor allele frequency.

4.4

Stopratio

De polymorfismen in het DRD2 gen TaqIA en TaqIB hebben geen significante invloed op de stopratio. Dit geldt zowel voor de groep die de actieve behandeling kreeg als voor de controlegroep.

49

In de controlegroep werd een verband tussen DRD2 -141C Ins/Del en de stopratio teruggevonden na 1 week rookstop. Individuen die drager zijn van de heterozygote vorm zullen tot 4x meer geneigd zijn om te stoppen met roken. COMT Val158Met werd eveneens geassocieerd met de stopratio waarbij personen in de controlegroep die beschikken over de heterozygote vorm van het COMT Val158Met polymorfisme tot 3x meer de neiging hebben om het roken na 1 week op te geven. Voor de personen die de actieve NS behandeling kregen, heeft geen enkel polymorfisme invloed op de uitkomst van de behandeling. Dit is contradictorisch met wat in de literatuur wordt gevonden (zie tabel 17). Johnestone et al konden aantonen dat een nicotine pleister effectiever is na 1 week voor rokers die het variante allel van DRD2 TaqIA bezitten in vergelijking met diegenen die homozygoot normaal zijn; na 12 weken is dezelfde trend zichtbaar maar die is niet statistisch significant (p=0.26) (10). DRD2 TaqIB werd nog niet onderzocht met betrekking op de uitkomst van rookstop behandeling. Tabel 17: Associatie van het polymorfisme met de stopratio. # rokers Gen

SNP

Referentie

(placebo/

Populatie

MAF

Kaukasisch

24%

Kaukasisch

8.5%

OR

actief) DRD2

waarde

TaqIA (10)

DRD2

p-

CC

216/226

CT+TT

160/150

CC

83/95

C/-

18/19

1.41 2.80

0.04

-141C Ins/Del Deze studie

ref¹ 1.0

0.9 50

C/C (40)

C/- + -/-

COMT

0/303

Washington en

0/65

0.44

0.006

9.2% ref

Philadelphia

Val158 Met

Deze studie

(49)

(51)

GG

25/24

ref²

GA

53/66

2.8

0.046

AA

24/25

1.1

0.9

GG

25/24

GA

53/66

1.2

0.8

AA

24/25

2.5

0.1

GG

379/0

ref

GA

839/0

AA

515/0

AA

109/114

Groot-

ref

AG+GG

252/249

Brittannië

0.43

GA AA

Europees

50%

54%

ref³

0.78

0.02

0.82

0.08 0.05

4

GG (52)

Kaukasisch

796

GrootBrittannië

2.65

1.804

0.032

ref

0.002

MAF: minor allele frequency ¹: OR en p-waarde voor de groep die de actieve NS behandeling kreeg na 1 week. ²: OR en p-waarde voor de controlegroep. ³: OR en p-waarde voor de groep die de actieve NS behandeling kreeg na 1 week. 4 :hervalratio’s.

Lerman et al. onderzochten de invloed van het DRD2 -141C Ins/Del polymorfisme op de stopratio bij actieve NS behandeling (40). Anders dan in de huidige studie wordt de aanwezigheid van het variante allel als referentie voor de OR berekening gebruikt. De stopratio’s waren na 1 week hoger voor de personen die drager zijn van de C deletie in vergelijking met deze die homozygoot zijn voor de C insertie.

51

Met betrekking tot de invloed van het COMT polymorfisme dient een onderscheid gemaakt tussen het al dan niet krijgen van een actieve NS behandeling. In eerste instantie wordt de invloed van het genotype op de stopratio nagegaan bij individuen die geen rookstopbehandeling hebben gekregen. In de huidige studie zijn personen die tot de controlegroep behoren en die heterozygote vorm van het polymorfisme bezitten, tot 3x meer geneigd om te stoppen met roken. Omidivar et al toonden aan dat personen die drager zijn van de A variant minder geneigd zijn om het roken op te geven (49). In tweede instantie wordt de invloed van het genotype op de stopratio nagegaan bij individuen die wel een actieve NS behandeling hebben gekregen. Twee grote studies (51, 52) toonden aan dat personen die het homozygoot variante genotype bezitten, een grotere neiging hebben om te stoppen en dat individuen die drager zijn van het normale G allel, een grotere kans op herval vertonen. Deze trend wordt in de huidige studie ook waargenomen, waarbij personen die drager zijn van de A variant tot 2.5x meer de neiging hebben om te stoppen met roken. Dit is echter niet significant. Uit deze bevindingen kan worden opgemaakt dat personen die drager zijn van het A allel minder geneigd zullen zijn om te stoppen met roken, tenzij deze een actieve NS behandeling krijgen. Deze bevindingen kunnen de resultaten van Beuten et al (zie hoger) bevestigen, waarbij personen die drager zijn van het lage activiteit methionine allel, een hogere vatbaarheid vertonen om een nicotine verslaving te ontwikkelen (44). De huidige studie kan echter geen oplossing bieden, aangezien de heterozygote vorm gepaard gaat met een hogere stopratio.

52

Besluit Roken veroorzaakt ernstige schade aan de gezondheid. Het is dan ook van groot belang inzicht te verwerven in de biologische processen die aan de basis liggen van de ontwikkeling van verslaving. In deze studie wordt de invloed van vijf polymorfismen op de maat van verslaving, op het optreden van ontwenningsverschijnselen na rookstop en op de stopratio, onderzocht. Tevens wordt rekening gehouden met leeftijd van rookstart en aantal sigaretten per dag. Voor dit onderzoek werd beroep gedaan op een studiepopulatie van 227 personen. De polymorfismen worden gegenotypeerd aan de hand van de RFLP-, HRM- en allel specifiek 2-tube methode. De polymorfismen DRD2 TaqIA en DRD2 TaqIB zijn significant geassocieerd met de mate van verslaving. De dragers van het variante allel vertonen een hogere mate van verslaving in vergelijking met de individuen die homozygoot normaal zijn. Het optreden van ontwenningsverschijnselen

na rookstop

is

niet

geassocieerd

met

de

bestudeerde

polymorfismen. DRD2 -141C Ins/Del en COMT Val158Met vertonen een significante invloed op de stopratio; heterozygoten voor beide polymorfismen vertonen een hogere stopratio in vergelijking met de homozygoten. De studie toont aan dat rokers die de variante vorm van DRD2 TaqIA of DRD2 TaqIB bezitten en het roken op een jonge leeftijd aanvangen, een hogere verslaving zullen vertonen in vergelijking met de rokers die niet beschikken over de variante vorm en op een oudere leeftijd beginnen met roken. De studie toont eveneens aan dat rokers die heterozygoot zijn voor DRD2 -141C Ins/Del en COMT Val158Met, een grotere neiging vertonen om te stoppen met roken in vergelijking met de andere rokers.

53

Deel V: Referentielijst 1. World Health Organization – report on the global Tabacco Epidemic, 2008 – The MPOWER package. 2. Stichting tegen kanker – Folder – Tabak: feiten en cijfers; - persberichten. 3. Hukkanen J, Jacob P, Benowitz NL (2005). Metabolism and disposition kinetics of nicotine. Pharmacological Reviews 57:79-115. 4. The health consequences of smoking: nicotine addiction. A report of the Surgeon General. US Department of Health and Human Services. DHHS Publ No.88. Washington (DC): DHHS, 1988. 5. Balfour DJK (2004). The neurobiology of tobacco dependence: a preclinical perspective on the role of the dopamine projections to the nucleus. Nicotine and Tobacco research 6:899-912. 6. Pidoplichko VI, Noguchi J, Areola OO, Liang Y, Peterson J, Zhang T, Dani JA (2004). Nicotinic cholinergic synaptic mechanisme in the ventral tegmental area contribute to nicotine addiction. Learning and Memory 11:60-69. 7. Pontieri FE, Tanda G, Orzi F, Di Chiara G (1996). Nature 382:255-257. 8. Aveyard P, West R (2007). Managing smoking cessation. British Medical Journal 355:37-41. 9. Richmond R, Zwar N (2003). Review of bupropion for smoking cessation. Drug and alcohol review 22:203-220. 10. Johnstone EC, Yudkin PL, Hey K, Roberts SJ, Welch SJ, Murphy MF, Griffiths SE, Walton RT (2004). Genetic variation in dopaminergic pathways and short-term effectiveness of the nicotine patch. Pharmacogenetics 14:83-90. 11. Nides M, Glover ED, Reus VI, Christen AG, Make BJ, Billing CB, Williams KE (2008). Varenicline Versus Bupropion SR or Placebo for Smoking Cessation: A Pooled Analysis. American Journal of Health Behavior. 32:664-675. 12. Heatherton TF, Kozlowski LT, Frecker RC, Fagerstrom KO (1991). The Fagerstrom test for nicotine dependence – a revision of the Fagerstrom Tolerance Questionnaire. British Journal of Addiction 86:1119-1127. 13. Heatherton TF, Kozlowski LT, Frecker RC, Rickert W, Robinson J (1989). Measuring the heaviness of smoking – using self-reported time to first cigarette of the day and number of cigarettes smoked per day. British Journal of Addiction 84:791-800. 14. Lessov-Schlaggar CN, Pergadia ML, Khroyan TV, Swan GE (2008). Genetics of nicotine dependence and farmacotherapie. Biochemical Pharmacology 75:178-195. 15. Etter JF, Hughes JR (2006). A comparison of the psychometric properties of three cigarette withdrawal scales. Addiction 101:362-372. 16. Agrawal A, Lynskey MT (Lynskey, Michael T. (2008). Are there genetic influences on addiction: evidence from family, adoption and twin studies. Addiction 103:1069-1081. 17. Li MD, Cheng R, Ma JZ, Swan GE (2003). A meta-analysis of estimated genetic and environmental effects on smoking behavior in male and female adult twins. Addiction 98:23-31. 18. Madden PAF, Heath AC, Pedersen NL, Kaprio J, Koskenvuo MJ, Martin NG (1999). The genetics of smoking persistence in men and women: A multicultural study. Behavior Genetics 29:423-431. 19. Vink JM, Posthuma D, Neale MC, Eline Slagboom P, Boomsma DI (2006). Genome-wide linkage scan to identify loci for age at first cigarette in dutch sibling pairs. Behavior Genetics 36:100-111. 20. Carmelli D, Swan GE, Robinette D, Fabsitz R (1992). Genetics influence on smoking – a study of male twins. New England Journal of Medicine 327:829-833. 54

21. www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP. 22. Lerman C, Niaura R (2002). Applying genetic approaches to the treatment of nicotine dependence. Oncogene 21:7412-7420. 23. Lerman CE, Schnoll RA, Munafo MR (2007). Genetics and smoking cessation - Improving outcomes in smokers at risk. American Journal of Preventive Medicine 33:S398-S405. 24. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998). Dopamine receptors: from structure to function. Physiological Reviews 78:189-225. 25. Thompson J, Thomas N, Singleton A, Piggott M, Lloyd S, Perry EK, Morris CM, Perry RH, Ferrier IN, Court JA (1997). D2 dopamine receptor gene (DRD2) Taq1 A polymorphism: reduced dopamine D2 receptor binding in the human striatum associated with the A1 allele. Pharmacogenetics 7:479-484. 26. Jonsson EG, Nothen MM, Grunhage F, Farde L, Nakashima Y, Propping P, Sedvall GC (1999). Polymorphisms in the dopamine D2 receptor gene and their relationships to striatal dopamine receptor density of healthy volunteers. Molecular Psychiatry 4:290-296. 27. Connor JP, Young RM, Lawford BR, Saunders JB, Ritchie TL, Noble EP (2007). Heavy nicotine and alcohol use in alcohol dependence is associated with D2 dopamine receptor (DRD2) polymorphism. Addictive Behaviors 32:310-319. 28. Preuss UW, Zill P, Koller G, Bondy B, Soyka M (2007). D2 dopamine receptor gene haplotypes and their influence on alcohol and tobacco consumption magnitude in alcohol-dependent individuals. Alcohol and Alcoholism 42:258-266. 29. Huang WH, Payne TJ, Ma JZ, Beuten J, Dupont RT, Inohara N, Li MD (2009). Significant association of ANKK1 and detection of a functional polymorphism with nicotine dependence in an African-American sample. Neuropsychopharmacology 34:319-330. 30. Singleton AB, Thomson JR, Morris CM, Court JA, Lloyd S, Cholerton S (1998). Lack of association between the dopamine D2 receptor gene allele DRD2*A1 and cigarette smoking in a United Kingdom population. Pharmacogenetics 8:125-128. 31. Batra A, Gelfort G, Bartels M, Smoltczyk H, Buchkremer G, Riess O, Schols L (2000). The dopamine D2 receptor (DRD2) gene - a genetic risk factor in heavy smoking? Addiction Biology 5:429-436. 32. Comings DE, Ferry L, Bradshaw-Robinson S, Burchette R, Chiu C, Muhleman D (1996). The dopamine D-2 receptor (DRD2) gene: A genetic risk factor in smoking. Pharmacogenetics 6:7379. 33. Spitz MR, Shi HH, Yang F, Hudmon KS, Jiang H, Chamberlain RM, Amos CI, Wan Y, Cinciripini P, Hong WK, Wu XF (1998). Case-control study of the D2 dopamine receptor gene and smoking status in lung cancer patients. Journal of the National Cancer Institute 90:358-363. 34. Yudkin P, Munafo M, Hey K, Roberts S, Welch S, Johnstone E, Murphy M, Griffiths S, Walton R (2004). Effectiveness of nicotine patches in relation to genotype in women versus men: randomised controlled trial. British Medical Journal 328:989-990. 35. David SP, Brown RA, Papandonatos GD, Kahler CW, Lloyd-Richardson EE, Munafo MR, Shields PG, Lerman C, Strong D, McCaffery J, Niaura R (2007). Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking cessation. Nicotine and Tobacco Research 9:821-833. 36. David SP, Strong DR, Munafo MR, Brown RA, Lloyd-Richardson EE, Wileyto PE, Evins EA, Shields PG, Lerman C, Niaura R (2007). Bupropion efficacy for smoking cessation is influenced by the DRD2 Taq1A polymorphism: Analysis of pooled data from two clinical trials. Nicotine and Tobacco Research 9:1251-1257. 55

37. Lerman C, Shields PG, Wileyto EP, Audrain J, Hawk LH Jr, Pinto A, Kucharski S, Krishnan S, Niaura R, Epstein LH (2003). Effects of dopamine transporter and receptor polymorphisms on smoking cessation in a bupropion clinical trial. Health Psychology 22:541-548. 38. Swan GE, Valdes AM, Ring HZ, Khroyan TV, Jack LM, Ton CC, Curry SJ, McAfee T (2005). Dopamine receptor DRD2 genotype and smoking cessation outcome following treatment with bupropion SR. Pharmacogenomics Journal 5:21-29. 39. Arinami T, Gao M, Hamaguchi H, Toru M (1997). A functionele polymorphism in the promotor region of the dopamine D2 receptor gene is associated with schizofrenie. Human Molecular Genetics 6:577-582. 40. Lerman C, Jepson C, Wileyto EP, Epstein LH, Rukstalis M, Patterson F, Kaufmann V, Restine S, Hawk L, Niaura R, Berrettini W (2006). Role of functional genetic variation in the dopamine D2 receptor (DRD2) in response to bupropion and nicotine replacement therapy for tobacco dependence: Results of two randomized clinical trials. Neuropsychopharmacology 31:231-242. 41. Shield AJ, Thomae BA, Eckloff BW, Wieben ED, Weinshilboum RM (2004). Human catechol Omethyltransferase genetic variation: gene resequencing and functional characterization of variant allozymes. Molecular Psychiatry 9:151-160. 42. Lachman HM, Papolos DF, Saito T, Yu YM, Szumlanski CL, Weinshilboum RM (1996). Human catechol-O-methyltransferase pharmacogenetics: Description of a functional polymorphism and its potential application to neuropsychiatric disorders. Pharmacogenetics 6:243-250. 43. Redden DT, Shields PG, Epstein L, Wileyto EP, Zakharkin SO, Allison DB, Lerman C (2005). Catechol-O-methyl-transferase functional polymorphism and nicotine dependence: an evaluation of nonreplicated results. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention 14:1384-1389. 44. Beuten J, Payne TJ, Ma JZ, Li MD (2006). Significant association of catechol-Omethyltransferase (COMT) haplotypes with nicotine dependence in male and female smokers of two ethnic populations. Neuropsychopharmacology 31:675-684. 45. Wang SS, Morton LM, Bergen AW, Lan EZ, Chatterjee N, Kvale P, Hayes RB, Chanock SJ, Caporaso NE (2007). Genetic variation in catechol-O-methyltransferase (COMT) and obesity in the prostate, lung, colorectal, and ovarian (PLCO) cancer screening trial. Human Genetics 122:4149. 46. Foroud T, Wetherill LF, Dick DM, Hesselbrock V, Nurnberger JI, Kramer J, Tischfield J, Schuckit M, Bierut LJ, Xuei X, Edenberg HJ (2007). Lack of association of alcohol dependence and habitual smoking with catechol-O-methyltransferase. Alcoholism-Clinical and Experimental Research 31:1773-1779. 47. McKinney, EF; Walton, RT; Yudkin, P; Fuller, A; Haldar, NA; Mant, D; Murphy, M; Welsh, KI; Marshall, SE (2000). Association between polymorphisms in dopamine metabolic enzymes and tobacco consumption in smokers. Pharmacogenetics 10:483-491. 48. David SP, Johnstone E, Griffiths SE, Murphy M, Yudkin P, Mant D, Walton R (2002). No association between functional catechol O-methyl transferase 1947A > G polymorphism and smoking initiation, persistent smoking or smoking cessation. Pharmacogenetics 12:265-268. 49. Omidvar, M (Omidvar, Maryarn); Stolk, L (Stolk, Lisette); Uitterlinden, AG (Uitterlinden, Andre G.); Hofman, A (Hofman, Albert); Van Duijn, CM (Van Duijn, Cornelia M.); Tiemeier, H (Tiemeier, Henning) (2009). The effect of catechol-O-methyltransferase Met/Val functional polymorphism on smoking cessation: retrospective and prospective analyses in a cohort study. Pharmacogenetics and Genomics 19:45-51. 50. Colilla, S; Lerman, C; Shields, PG; Jepson, C; Rukstalis, M; Berlin, J; DeMichele, A; Bunin, G; 56

51. 52. 53. 54. 55.

56. 57. 58.

59.

60.

61.

Strom, BL; Rebbeck, TR (2005). Association of catechol-O-methyltransferase with smoking cessation in two independent studies of women. Pharmacogenetics and Genomics 15:393-398. Johnstone EC, Elliot KM, David SP, Murphy MFG, Walton RT, Munafo MR (2007). Association of COMT Val(108/158) met genotype with smoking cessation in a nicotine replacement therapy randomized trial. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention 16:1065-1069. Munafo MR, Johnstone EC, Guo B, Murphy MFG, Aveyard P (2008). Association of COMT Val(108/158)Met genotype with smoking cessation. Pharmacogenetics and Genomics 18:121-128. Ton TGN, Rossing MA, Bowen DJ, Srinouanprachan S, Wicklund K, Farin FM (2007). Genetic polymorphisms in dopamine-related genes and smoking cessation in women: a prospective cohort study. Behavioral and Brain Functions 3:Art No. 22. Berrettini WH, Wileyto EP, Epstein L, Restine S, Hawk L, Shields P, Niaura R, Lerman C (2007). Catechol-O-methyltransferase (COMT) gene variants predict response to bupropion therapy for tobacco dependence. Biological Psychiatry 61:111-118. Liu PY, Vikis HG, Wang DL, Lu Y, Wang Y, Schwartz AG, Pinney SM, Yang P, de Andrade M, Petersen GM, Wiest JS, Fain PR, Gazdar A, Gaba C, Rothschild H, Mandal D, Coons T, Lee JW, Kupert E, Seminara D, Minna J, Bailey-Wilson JE, Wu XF, Spitz MR, Eisen T, Houlston RS, Amos CI, Anderson MW, You M (2008). Familial aggregation of common sequence variants on 15q24-25.1 in lung cancer. Journal of the National Cancer Institute 100:1326-1330. Stevens VL, Bierut LJ, Talbot JT, Wang JC, Sun JZ, Hinrichs AL, Thun MJ, Goate A, Calle EE (2008). Nicotinic Receptor Gene Variants Influence Susceptibility to Heavy Smoking. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention 17:3517-3525. Berrettine W, Yuan X, Tozzi F, Song K, Francks C, Chilcoat H, Waterworth D, Muglia P, Mooser V (2008). alpha-5/alpha-3 nicotinic receptor subunit alleles increase risk for heavy smoking. Molecular Psychiatry 13:368-373. Beirut LJ, Madden PAF, Bersleau N, Johnson EO, Hatsukami D, Pomerleau OF, Swan GE, Rutter J, Bertelsen S, Fox L, Fugman D, Goate AM, Hinrichs AL, Konvicka K, Martin NG, Montgomery GW, Saccone NL, Saccone SF, Wang JC, Chase GA, Rice JP, Ballinger DG (2007). Novel genes identified in a high-density genome wide association study for nicotine dependence. Human Molecular Genetics 16:24-35. Saccone ST, Hinrichs AL, Saccone NL, Chase GA, Konvicka K, Madden PAF, Breslau N, Johnson EO, Hatsukami D, Pomerleau O, Swan GE, Goate AM, Rutter J, Bertelsen S, Fox L, Fugman D, Martin NG, Montgomery GW, Wang JC, Ballinger DG, Rice JP, Beirut LJ (2007). Cholinergic nicotinic receptor genes implicated in a nicotine dependence association study targeting 348 candidate genes with 3713 SNPs. Human Molecular Genetics 7:36-49. Weiss RB, Baker TB, Cannon DS, von Niederhausern A, Dunn DM, Matsunami N, Singh NA, Baird L, Coon H, McMahon WM, Piper ME, Fiore MC, Scholand MB, Connett JE, Kanner RE, Gahring LC, Rogers SW, Hoidal JR, Leppert MF (2008). A candidate gene approach identifies the CHRNA5-A3-B4 region as a risk factor for age-dependent nicotine addiction. PLoS Genet 4. Thorgeirsson TE, Geller F, Sulem P, Rafnar T, Wiste A, Magnusson KP, Manolescu A, Thorleifsson G, Stefansson H, Ingason A, Stacey SN, Bergthorsson JT, Thorlacius S, Gudmundsson J, Jonsson T, Jakobsdottir M, Saemundsdottir J, Olafsdottir O, Gudmundsson LJ, Bjornsdottir G, Kristjansson K, Skuladottir H, Isaksson HJ, Gudbjartsson T, Jones GT, Mueller T, Gottsater A, Flex A, Aben KKH, de Vegt F, Mulders PFA, Isla D Vidal MJ, Asin L, Saez B, Murillo L, Blondal T, Kolbeinsson H, Stefansson JG, Hansdottir I, Runarsdottir V, Pola R, Lindblad B, van Rij AM, Dieplinger B, Haltmayer M, Mayordomo JI, Kiemeney LA, Matthiasson 57

62.

63.

64. 65. 66. 67.

SE, Oskarsson H, Tyrfingsson T, Gudbjartsson DF, Gulcher JR, Jonsson S, Thorsteinsdottir U, Kong A, Stefansson K (2008). A variant associated with nicotine dependence, lung cancer and peripheral arterial disease. Nature 452:638-U9. Hung RJ Mckay JD, Gaborieau V, Boffetta P, Hashibe M, Zaridze D, Mukeria A, SzeszeniaDabrowska N, Lissowska J, Rudnai P, Fabianova E, Mates D, Bencko V, Foretova L, Janout V, Chen C, Goodman G, Field JK, Liloglou T, Xinarianos G, Cassidy A, McLaughlin J, Liu G, Narod S, Krokan HE, Skorpen F, Elvestad MB, Hveem K, Vatten L, Linseisen J, Clavel-Chapelon F, Vineis P, Bueno-De-Mesquita HB, Lund E, Martinez C, Bingham S, Rasmuson T, Hainaut P, Riboli E, Ahrens W, Benhamou S, Lagiou P, Trichopoulos D, Holcatova I, Merletti F, Kjaerheim K, Agudo A, Macfarlane G, Talamini R, Simonato L, Lowry R, Conway DI, Znaor A, Healy C, Zelenika D, Boland A, Delepine M, Foglio M, Lechner D, Matsuda F, Blanche H, Gut I, Heath S, Lathrop M, Brennan P (2008). A susceptibility locus for lung cancer maps to nicotinic acetylcholine receptor subunit genes on 15q25. Nature 452:633-637. Amos CI, Wu XF, Broderick P, Gorlov IP, Gu J, Eisen T, Dong Q, Zhang Q, Gu XJ, Vijayakrishnan J, Sullivan K, Matakidou A, Wang YF, Mills G, Doheny K, Tsai YY, Chen WV, Shete S, Spitz MR, Houlston RS (2008). Genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility locus for lung cancer at 15q25.1. Nature 40:616-622. www.restrictionmapper.org Vink JM, Willemsen G, Beem AL, Boomsma DI (2005). The Fagerstrom Test for Nicotine Dependence in a Dutch sample of daily smokers and ex-smokers. Addictive Behaviors 30:575579. Smith AE Cavallo DA, Dahl T, Wu R, George TP, Krishnan-Sarin S (2008). Effects of acute tobacco abstinence in adolescent smokers compared with nonsmokers. Journal of Adolescent Health 43:46-54 David SP, Niaura R, Papandonatos GD, Shadel WG, Burkholder GJ, Britt DM, Day A, Stumpff J, Hutchison K, Murphy M, Johnstone E, Griffiths SE, Walton RT (2003). Does the DRD2-Taq1 A polymorphism influence treatment response to bupropion hydrochloride for reduction of the nicotine withdrawal syndrome? Nicotine and Tobacco Research 5:935-942.

58