Academiejaar 2008 - 2009
De genetische oorzaken van osteoporose
Brecht Calle
Promotor: Prof. P. Coucke Co-promotor: Ir. A. Willaert
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot ARTS
“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
Datum (handtekening student)
(handtekening promotor)
(Naam student)
(Naam promotor)
II
Academiejaar 2008 - 2009
De genetische oorzaken van osteoporose
Brecht Calle
Promotor: Prof. P.Coucke Co-promotor: Ir. A. Willaert
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot ARTS
III
Voorwoord. Graag wil ik de mensen bedanken die mij hebben gesteund bij het maken van deze masterproef. Ten eerste een woord van dank aan mijn promotor prof. Paul Coucke, hoofd van het labo moleculaire genetica. Daar kon ik gebruik maken van de nodige faciliteiten om het onderzoek voor deze masterproef te verrichten. Ik ben blij dat ik via deze opdracht de kans kreeg om kennis te maken met de werking van een labo, enkele labotechnieken en het uitvoeren van wetenschappelijk onderzoek. Ook wil ik de laboranten bedanken die steeds klaar stonden om te antwoorden op mijn vele vragen, in het bijzonder Els De Vogelaere. Tevens gaat er speciale dank uit naar mijn co-promotor Jr. Andy Willaert voor zijn begeleiding, het aanleren van labotechnieken en zijn advies bij het schrijven van mijn masterproef. Als laatste wil ik ook mijn dank uitspreken voor het begrip dat werd getoond voor mijn dyslectische aanleg. Ik begrijp dat het niet altijd makkelijk was om mij te begeleiden. In deze context bedank ik ook de vele mensen die mij geholpen hebben met de spellingcontrole van dit werk. Brecht Calle
IV
Inhoudstafel 1. INLEIDING----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 1.1. HET BOTMETABOLISME ------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.1. CELLULAIRE BOTCOMPONENTEN. ------------------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.2. ANATOMISCHE BOTOPBOUW ----------------------------------------------------------------------------------------- 4 1.1.3. BOT REMODELLING ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 5 1.2. OSTEOPOROSE ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 1.2.1. DEFINITIE VAN OSTEOPOROSE ---------------------------------------------------------------------------------------- 7 1.2.2. PATHOGENESE VAN OSTEOPOROSE ----------------------------------------------------------------------------------- 7 1.2.3. RISICOFACTOREN VOOR OSTEOPOROSE ------------------------------------------------------------------------------ 8 1.2.4. DE EPIDEMIOLOGIE VAN OSTEOPOROSE ------------------------------------------------------------------------------ 9 1.2.5. DIAGNOSE VAN OSTEOPOROSE --------------------------------------------------------------------------------------- 9 1.2.6. ALTERNATIEVE MANIEREN OM DE BMD TE BEPALEN ------------------------------------------------------------- 10 1.2.7. BEHANDELING VAN OSTEOPOROSE --------------------------------------------------------------------------------- 10 2.2. SIGNALISATIE PATHWAYS BETROKKEN BIJ HET BOTMETABOLISME ------------------------------------------------- 12 2.5.5. BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 -------------------------------------------------------------------------------- 12 2.5.6. DE WNT SIGNALISATIE PATHWAY ----------------------------------------------------------------------------------- 15 2.6. SOORTEN MUTATIES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 18 2. METHODOLOGIE ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 19 2.1. RECRUTERING OSTEOPOROSE PATIËNTEN---------------------------------------------------------------------------- 19 2.2. MUTATIESCREENING -------------------------------------------------------------------------------------------------- 19 2.3. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ------------------------------------------------------------------------------ 19 2.3.1. PRINCIPE VAN PCR -------------------------------------------------------------------------------------------------- 19 2.3.2. TOUCH-DOWN PCR ------------------------------------------------------------------------------------------------- 21 2.3.3. COMPONENTEN MASTERMIX---------------------------------------------------------------------------------------- 21 2.3.4. VOOR-EN NADELEN VAN DE PCR-TECHNIEK ----------------------------------------------------------------------- 24 2.3.5. STANDAARD PCR-PROTOCOL --------------------------------------------------------------------------------------- 24 2.4. AGAROSEGELELEKTROFORESE ---------------------------------------------------------------------------------------- 27 2.4.1. PRAKTISCH ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 28 2.4.2. METHODE ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 29 2.5. SEQUENERING---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29 2.5.1. PROTOCOL VOOR MANUEEL SEQUENEREN ------------------------------------------------------------------------- 33 2.6. ANALYSE VAN DE GEVONDEN EIWITVERANDERINGEN -------------------------------------------------------------- 34 2.7. ANALYSE VAN MOGELIJKE SPLICE SITE VERANDERINGEN ------------------------------------------------------------ 34 3. RESULTATEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 35 3.1. BMP2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 35 3.1.1. BMP2-EXON 2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 35 3.1.2. BMP2-EXON 3 DEEL 1 ---------------------------------------------------------------------------------------------- 37 3.1.3. BMP2-EXON 3 DEEL 2 ---------------------------------------------------------------------------------------------- 39
V
3.1.4. BMP2-EXON 3 DEEL 3 ---------------------------------------------------------------------------------------------- 40 3.1.5. BMP2-ENHANCER--------------------------------------------------------------------------------------------------- 42 3.2. FZD2 EXON1 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 43 3.2.1. FZD2_EXON1DEEL1 ------------------------------------------------------------------------------------------------- 44 3.2.2. FZD2_EXON1DEEL2 ------------------------------------------------------------------------------------------------- 44 3.3. WNT10B --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 45 3.3.1. WNT10B-EX2-3 ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 45 3.3.2. WNT10B-EX4 -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 46 3.3.3. WNT10B-EX5 -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 47 3.4 BESPREKING RESULTAAT ----------------------------------------------------------------------------------------------- 48 3. DISCUSSIE --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 49 4. REFERENTIELIJST ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 53
VI
Abstract INTRODUCTIE: Osteoporose is het resultaat van een verminderde botdensiteit en een desorganisatie van de microscopische botarchitectuur. Hierdoor wordt het bot minder sterk en neemt het risico op fracturen toe. Voornamelijk de ruggengraat, de heup, polsen, humerus en pelvis worden makkelijk getroffen. Door de WHO wordt osteoporose gedefinieerd als een reductie van de BMD (“Bone Mineral Density") met 2.5 standaarddeviaties waarbij als uitgangspunt de gemiddelde botdichtheid bij jongvolwassenen wordt genomen. In België werd bij 15% van de vrouwen van 65 jaar of ouder osteoporose gediagnosticeerd, hoewel er vermoedelijk nog veel meer mensen aan leiden. Mannen lopen nagenoeg hetzelfde risico, maar dan met een leeftijdsverschil van 6 tot 7 jaar ouder. Osteoporose resulteert in een gestegen risico op Collins-fractuur, wervelfractuur en vooral heupfractuur. Over heupfracturen op oudere leeftijd is geweten dat de mortaliteit oploopt tot van 12 tot 20% in de eerst 6 maand na de breuk. Door de toenemende vergrijzing in onze maatschappij zal de prevalentie van de aandoening nog toenemen. Aan de basis van osteoporose liggen enerzijds omgevingsfactoren en anderzijds genetische componenten. Onderzoek naar het exacte ontstaansmechanisme van osteoporose zal leiden tot een efficiëntere behandeling en een meer gerichte preventie. METHODE: We beschikken voor deze studie over 102 mannelijke patiënten, die onderling niet verwant zijn. Zij hebben een familiale vorm van osteoporose. In deze groep hebben we kandidaatgenen die verantwoordelijk kunnen zijn voor osteoporose nagekeken op het voorkomen van mutaties. Om de genen te analyseren wordt een mutatiescreening verricht. Daarvoor moeten de exonen van het gen eerst worden vermenigvuldigd door middel van een PCR-reactie. De kwaliteit van het PCR-product wordt vervolgens gecontroleerd via agarosegelelektroforese waarna het PCR-product gesequeneerd kan worden. De bekomen sequentie wordt dan vergeleken met de gekende referentiesequentie voor het specifieke gen en er wordt nagegaan of er al dan niet mutaties of polymorfismen zijn terug te vinden. BMP2, Fzd2 en Wnt10b werden als kandidaatgenen geselecteerd omdat voor deze genen al een behoorlijk aantal aanwijzingen bestaan dat zij mogelijks verantwoordelijk zijn voor de verlaging van de BMD en voor het ontstaan van osteoporose. RESULTAAT: Voor de genfragmenten BMP2-exon2, BMP2-exon3-deel1, BMP2-exon3-deel3, BMP2enhancer en Wnt10b-exon5 werd bij bijna alle patiënten de sequentie ontrafeld. Op die manier kwamen heel wat SNP’s, puntmutaties en een deletie aan de oppervlakte. De bekomen sequentievarianten werden geanalyseerd met SIFT, polyphen en “Splice Site Prediction by Neural Network”. Zo werd van Rs235768 (Arg190Ser) uit BMP2 en c.854T>C uit Wnt10b voorspeld dat ze schadelijk zijn.
1
DISCUSSIE: De aangetroffen sequentievariant Rs3178250 ( bij 32.3% heterozygoot en bij 2.9% homozygoot), een SNP gelokaliseerd in exon 3 van BMP2, werd reeds onderzocht en bleek een protectieve factor te zijn voor otosclerose. Deze aandoening gaat gepaard met een overmatige botvorming in de gehoorsbeentjes. Ook een c.*936_*939delATTT in het 3’UTR gebied van BMP2-exon3 komt bij 2.9% van de patiënten heterozygoot voor. Dit lijkt interessant omdat ze mogelijks de expressie van het BMP2 gen beïnvloedt. Door de deletie gaat een gebied verloren dat zorgt voor de regeling van de stabiliteit van het mRNA van dit gen. De c.854T>C mutatie komt slechts bij 1 patiënt heterozygoot voor in exon 5 van Wnt10b wat resulteert in Ile285Thr, deze variant kan niet worden terug gevonden in de literatuur. De substitutie zou volgens de predictieprogramma’s SIFT en polyphen, de werking van het proteïne kunnen verstoren. CONCLUSIE: Er zijn dus heel wat polymorfismen gevonden waarvan moet worden onderzocht of zij iets te maken hebben met de verlaagde BMD bij osteoporose patiënten. Vooral sequentievarianten Rs3178250, Rs235768, Rs2273073 en c.*936_*939delATTT uit BMP2 en c.854T>C uit Wnt10b lijken een grote kans te hebben om van belang te zijn bij het ontwikkelen van een laag BMD, en bijgevolg bij osteoporose.
2
1. Inleiding Osteoporose is een botaandoening die gepaard gaat met verminderde minerale botdensiteit (= bone mineral density = BMD) en een desorganisatie van de microscopische botarchitectuur. Hierdoor wordt het bot minder sterk en neemt het risico op fracturen toe. Voornamelijk ruggengraat, heup, pols, humerus en pelvis worden makkelijk getroffen (Poole en Compston, 2006). In België worden 3% van de mannen en 15% van de vrouwen van 65 jaar of ouder gediagnosticeerd met osteoporose, hoewel er vermoedelijk nog veel meer patiënten zijn. Dit vertaalt zich in een heupfracturenincidentie van 2% voor vrouwen tussen de 85 en 89 jaar en meer dan 2,5% voor vrouwen ouder dan 90 jaar. Mannen lopen nagenoeg hetzelfde risico maar dan met een leeftijdsverschil van 6 tot 7 jaar ouder (Capet et al, 1999). De aandoening is verantwoordelijk voor een grote morbiditeit en zelfs mortaliteit, vooral in de oudere bevolkingsgroepen. Door de toenemende vergrijzing in onze maatschappij zal de prevalentie van de aandoening nog groeien. De aandoening is multifactorieel. Enerzijds is er een sterke omgevings- en levensstijlfactor die een rol speelt bij het ontwikkelen van de ziekte en anderzijds staat BMD onder zeer sterke genetische controle. Een aanwijzing dat genetische factoren een grote rol spelen in het ontwikkelen van de ziekte is het feit dat osteoporose vaak voorkomt in familieverband (Annie, 2007). In de meeste gevallen kent osteoporose een multigenisch karakter waardoor slechts zelden één genetische variant verantwoordelijk is voor het ontstaan van de aandoening. In dit onderzoek is het de bedoeling om genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van osteoporose en dit door kandidaatgenen te onderzoeken bij 102 mannelijke patiënten met een familiale vorm van osteoporose. De selectie van de kandidaatgenen gebeurde op basis van literatuuronderzoek. Op deze kandidaatgenen werd een mutatiescreening uitgevoerd. Wanneer hieruit blijkt dat er mutaties voorkomen bij deze patiënten, zal in tweede instantie moeten gekeken worden of er een correlatie te vinden is tussen het voorkomen van de mutatie en de BMD. Het uiteindelijke doel van dit onderzoek is een beter inzicht te verwerven in de ontstaansmechanismen van de aandoening osteoporose. Dit zal leiden naar een nieuwe en betere gezondheidszorgstrategie.
1.1. Het botmetabolisme 1.1.1. Cellulaire botcomponenten. De 3 voornaamste cellen betrokken bij het botmetabolisme zijn de osteoblast, osteocyt en de osteoclast. (Shapiro, 2008)(Ombregt et al., 2003)
3
Osteoblasten zijn cellen die afkomstig zijn van osteoprogenitorcellen. Ze bevinden zich aan de oppervlakte van het bot en maken een proteïnemix aan die osteoïd genoemd wordt. Deze mineraliseert om zo bot te vormen. De voornaamste componenten van het osteoïd zijn collageen type1, chondroitin sulfaat en osteocalcine. Om de mineralisatiereactie te bevorderen produceren ze ook alkalische fosfatasen. Daarnaast maken zij ook hormonen aan die voor communicatie zorgen met andere botcellen. Inactieve osteoblasten dekken trouwens ook volledig het vrije botoppervlak af, zodat dit beschermd is tegen het omliggende milieu. Zij worden “bone lining” cellen genoemd.
Osteocyten zijn osteoblasten die zich hebben ingekapseld in het bot door botmatrix te produceren rondom zichzelf. Zij bevinden zich in lacunae en houden contact met elkaar en de buitenwereld via canaliculi. Ze zorgen voor het matrixonderhoud, hebben een rol in de calcium homeostase en reguleren de respons van bot op mechanische druk.
Osteoclasten zijn cellen die bot resorberen. Zij breken het bot af en vormen op die manier Howship lacunes door het botoppervlak bloot te stellen aan protheolytische enzymen zoals zure fosfatasen, onder andere cathepsin K. Hun activiteit kan door hormonale invloeden geregeld worden. Osteoclasten zijn afkomstig uit de myeloïde cellijn.
1.1.2. Anatomische botopbouw Het menselijke skelet is opgebouwd uit 2 verschillende botsoorten. Aan de buitenkant van het bot zit het compact bot terwijl aan de binnenkant een zone van trabeculair bot aanwezig is. (Chavassieux et al., 2006)( Marieb et al., 2006)(Netter et al., 1987) Het compacte bot bestaat uit een beenmatrix die hard is, doordat hij gemineraliseerd is met een grote hoeveelheid calciumzouten en fosfor, hydroxyapatiet genoemd. De beenmatrix bevat ook een grote hoeveelheid collageenvezels die door hun trekvastheid voor een verminderde broosheid en breekbaarheid zorgen. In deze matrix liggen in kleine lacunae, osteocyten ingebed die zorgen voor het opbouwen en onderhouden van de botmatrix. De osteocyten zijn door een netwerk van canaliculi met elkaar verbonden; en via die canaliculi wordt de osteocyt voorzien van voedingsstoffen. Dit komt doordat door de botmatrix zelf geen diffusie mogelijk is. In het compacte bot lopen tevens bloed- en lymfevaten. Zij volgen een netwerk van Haverse kanalen en Volkmann’s kanalen ( figuur 1). Het geheel van Haverse kanalen met daarin bloed- en lymfevaten en de daarrond circulair en lamellair geschikte botmatrix, noemt men een osteon. Aan de binnenzijde is het compacte bot bekleed met spongieus of trabeculair bot (figuur 1). Dit gedeelte bestaat uit een netwerk van dunne beenbalkjes of trabeculae, waardoor het veel lichter is en in staat is
4
om veel meer energie te absorberen dan het compacte bot dat dan weer veel sterker is. De ruimten tussen de trabeculae zijn gevuld met beenmerg dat rijkelijk voorzien is van bloedvaten.
Figuur 1: Anatomie van het bot. (netter, 1987)
1.1.3. Botremodelering Het bot vormt geen onveranderlijke structuur, er vindt een levenslange “botremodelering” plaats. Dit is het resultaat van een evenwicht tussen botafbraakprocessen, uitgevoerd door osteoclasten, en door botaanmaakprocessen, uitgevoerd door osteoblasten. Dit proces vindt tegelijkertijd plaats op verschillende oppervlakten van het bot, “remoddeling units” genaamd (figuur 2). Deze zorgen er geleidelijk voor dat het volledige skelet vernieuwd wordt. Dit is belangrijk, want door dit proces worden kleine beschadigingen, die optreden bij de dagelijkse belasting van het bot verwijderd, en blijft het bot stevig.
Figuur 2: Processen binnen 1 remoddeling unit.( Compston, 2001)
5
De voornaamste manier waarop de activiteit van de osteoclasten wordt geregeld is door de Rank-RanklOPC-pathway (figuur3). RANK-ligand (RANKL) wordt geproduceerd door de “bone lining” cellen als reactie op signalen van de osteocyten en andere stimuli, waaronder PTH. De RANKL bindt op de RANK-receptoren op het oppervlak van de osteoclasten. Dit stimuleert zowel de differentiatie als de activering van de osteoclast, die tevens gereguleerd worden door integrine gemedieerde signalen uit de botmatrix zelf en M-CSF geproduceerd door de “bone lining” cellen. Door inwerking van deze factoren ontstaan er groepen van actieve osteoclasten. In de RANK-pathway is er ook nog een belangrijke rol weggelegd voor het Osteoprotegerin (OPG). Dit is in feite een decoil-receptor voor RANKL, wat ervoor zorgt dat RANKL gebonden kan worden, alvorens het op de RANK-receptor kan binden. Zo wordt de activatie van de osteoclasten geïnhibeerd. Het is ook zo dat de meeste factoren die de RANK expressie stimuleren tevens die van OPG inhiberen, al zijn daar uitzonderingen op. Er is overigens recent gebleken dat het de Wnt/β-catenin-signalisatie uit de osteoblasten het OPG in belangrijke mate reguleert. Wnt/β-catenin-pathway was vooral gekend bij de botvorming door osteoblasten. De osteoclasten spelen tevens een rol in het recruteren van osteoblasten bij het einde van hun resorptieve functie. ( Boyce en Xing, 2007 )(Rubin et al., 2005)
Figuur 3: de RANKL-RANK-OPG-pathway (Peterson et al., 2004) Bij de controle van de koppeling tussen de afbraak en de opbouw van bot zijn verschillende factoren betrokken die voorlopig nog niet goed begrepen worden. Het remodelling proces laat groei van botten toe en zorgt voor het elimineren van microbeschadigingen. Onder normale omstandigheden is de hoeveelheid bot dat geresorbeerd wordt en de hoeveelheid die opgebouwd wordt nagenoeg gelijk (Netter, 1987) Ook is het voor het normale opbouw/afbraak-evenwicht belangrijk dat er genoeg calcium wordt opgenomen in het organisme. Dit gebeurt langs de dunne darm via een mechanisme dat gestimuleerd wordt door vitamine D, dat wordt aangemaakt door blootstelling aan zonlicht.
6
1.2. Osteoporose 1.2.1. Definitie van osteoporose Osteoporose is een aandoening die gekarakteriseerd wordt door een verminderde botdensiteit en een desorganisatie van de microscopische botarchitectuur. Hierdoor wordt het bot fragieler en neemt het risico op fracturen toe (figuur 4). Door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) wordt osteoporose gedefinieerd als een reductie van de botdensiteit (BMD) met 2.5 standaarddeviaties ten opzichte van de gemiddelde botdichtheid bij jongvolwassenen in dezelfde populatie (Poole en Compston, 2006)(WHO, 2005).
Figuur 4: (a) Structuur van normaal trabeculair bot. (b) Structuur van osteoporotisch trabeculair bot. (Kumar en Clark, 2005, fig. 10.35)
1.2.2. Pathogenese van osteoporose Rond de leeftijd van 30 jaar bereikt de BMD een piek. Tot ongeveer het veertigste levensjaar blijft deze botdensiteit min of meer behouden en daarna neemt de dichtheid van het bot jaar na jaar af. Bij vrouwen gebeurt dit versneld tijdens de 10 jaar na de menopauze (figuur 5). Dit houdt in dat de BMD van een bepaalde persoon afhankelijk is van de hoogte van zijn piek-BMD en de snelheid waarmee hij BMD verliest na deze piek. (Whiting et al.,2004)
7
Figuur 5: Verandering van de BMD tijdens het leven. (Warrell et al., 2005) De afname van de botdensiteit gebeurt door toedoen van het remodelleringsproces waarbij de osteoclasten meer afbreken dan de osteoblasten opbouwen zodat er netto bot verloren gaat. De reductie van de BMD op zichzelf veroorzaakt geen klachten. Het maakt de botten wel veel zwakker, waardoor ze gevoeliger worden aan breuken. Deze osteoporotische breuken kunnen op zeer vele plaatsen in het lichaam voorkomen, maar de meest typische fracturen zijn de distale radiusfracturen (“Collins-fractuur”), de wervelinduiking en de proximale femurfractuur. (Warrell et al., 2005)
1.2.3. Risicofactoren voor osteoporose Het risico op osteoporose wordt bepaald daar 2 factoren: de piek-BMD, dit is de maximale BMD die een persoon gedurende zijn leven bereikt en de snelheid waarmee de BMD na de piek-BMD afneemt. Deze factoren worden beïnvloed door exogene en endogene factoren.
De exogene factoren: hebben vooral betrekking of het versneld verlies van BMD. De factoren zijn zeer divers, de voornaamste zijn: hypogonadismen, alcoholmisbruik, roken, immobilisatie, vit D of calcium deficiëntie, een gestegen ratio van de heupomtrek ten opzichte van de buikomtrek en nierlijden. Ook vele geneesmiddelen waaronder glucocorticoïden (Kumar en Clark, 2005), heparine, cyclosporine diuretica en sedativa (Seo et al., 2008) hebben versnelde botafbraak als bijwerking. (Annie et al., 2005)
Endogene factoren/genetische factoren: belangrijk hier zijn de variaties in genen die de piek -BMD bepalen. De piek-BMD is namelijk zeer sterk genetisch bepaald (70 à 80%). De nutritionele toestand of hormoonstatus tijdens de botopbouw speelt slechts een beperkte rol (Whiting et al., 2004). Nog niet alle genen die de piek-BMD bepalen, zijn gekend. De genen voor collageen type IA1, vit-D-receptoren en oestrogeen-receptoren zijn onder andere verantwoordelijk voor het bepalen van de piek-BMD (Kumar en Clark, 2005). De regio’s in het genoom die reeds in verband gebracht werden met de BMD zijn weergegeven in bijlage 1.
8
Eigenschappen als ras en geslacht kunnen eveneens tot de endogene risicofactoren worden gerekend. Het is namelijk zo dat blanke, Aziatische en Hispanic vrouwen een groter risico hebben op osteoporose dan hun zwarte geslachtsgenoten (Pothiwala et al., 2006) en dat vrouwen een groter risico hebben op het ontwikkelen van osteoporose dan mannen. Osteoporose kan dus over het algemeen gezien worden als een multifactoriële aandoening, die veroorzaakt wordt door de interactie van genetische factoren en omgevingsfactoren. (Bijlage 2)
1.2.4. De epidemiologie van osteoporose In België zijn 3% van de mannen en 15% van de vrouwen van 65 jaar of ouder gediagnosticeerd met osteoporose, hoewel er vermoedelijk nog veel meer patiënten zijn. Voor een 50-jarige blanke Britse vrouw schat men de kans dat zij in haar verdere levensloop een heupfractuur oploopt op 14%, een wervelfractuur op 11% en 13% kans op een Collins-fractuur (Warrell et al., 2005). Dit zorgt voor een totaal lifetime risico op breuken door osteoporose voor blanke vrouwen van 40% en voor blanke mannen slechts van 13% (Melton et al., 1992). Op die manier is de aandoening verantwoordelijk voor een grote morbiditeit en zelfs mortaliteit, vooral in de oudere bevolkingsgroepen (Warrell et al., 2005). Het is namelijk zo dat in de eerste 6 maand na een heupfractuur de mortaliteit tussen de 12 en de 20% bedraagt. Wervelverzakkingen kunnen resulteren in chronische pijn en een kyphose van de rug. Mannen lopen nagenoeg hetzelfde risico op fracturen als vrouwen maar op het moment dat ze 6 tot 7 jaar ouder zijn (Capet et al., 1999). Door de toenemende vergrijzing in onze maatschappij zal de prevalentie van de aandoening nog verhogen.
1.2.5. Diagnose van osteoporose Momenteel is het niet aangewezen om de volledige populatie te screenen op osteoporose. Men moet patiënten selecteren op basis van de aanwezigheid van risicofactoren op osteoporose, zoals leeftijd, geslacht, de familiale belasting en de inname van bepaalde geneesmiddelen, om een meting van de botdensiteit te rechtvaardigen. Om dit te doen is het uitvoeren van een X-ray absorptiedensitometrie de gouden standaard. Dit onderzoek geeft de BMD in gram calciumfosfaat per cm² gescand bot. Daaruit wordt de T-score bepaald. Deze waarde geeft het aantal standaarddeviaties weer dat de BMD van de patiënt afwijkt ten opzichte van deze van gezonde 30-jarige geslachtsgenoten. Wanneer dit lager blijkt te zijn dan 2.5 standaarddeviaties van het gemiddelde bij jongvolwassenen (T-score <-2.5) dan wordt de diagnose van osteoporose gesteld. De referentiewaarde bij jongvolwassenen kan echter verschillen van populatie tot populatie. Patiënten met een T-score tussen -1 en -2.5 hebben een osteopenie, wat een voorstadium van osteoporose kan zijn. Bij een T-score lager dan -2.5 wordt de diagnose van osteoporose gesteld.(tabel 2)
9
+1
3 eenheden per dag.
1.2.6. Alternatieve manieren om de BMD te bepalen Via de kwantitatieve CT-scan wordt BMD en ook de verhouding tussen corticaal bot/trabeculair bot bepaald, maar deze geeft een veel grotere stralenbelasting. Recent werd ook een kwantitatieve ultrasound ontwikkeld, dit is de goedkoopste wijze om de BMD te bepalen en maakt geen gebruik van ioniserende stralen. In de toekomst zal dit misschien de standaard worden in het bepalen van de BMD.(Kumar en Clark, 2005)
1.2.7. Behandeling van osteoporose 2.1.5.1.
Preventie
Volgende maatregelen moeten worden aangeraden bij mensen met een verhoogd risico op osteoporose. (Kumar en Clark, 2005) (Warrell et al., 2005)
Het dieet moet minstens 700 - 1000mg calcium per dag bevatten, in de postmenopauze is het ideaal om zelfs 1500mg per dag in te nemen.
Er wordt een vitamine D inname van 400 – 800 IU per dag aanbevolen bij patiënten die onvoldoende zonlicht krijgen.
10
Lichaamsbeweging: er wordt aangeraden 3x per week, 30 minuten oefeningen te doen die de botten belasten, botverlies voorkomen of zelfs een bottoename bewerkstelligen. Bij patiënten die reeds osteoporose hebben is een intense lichaamsbeweging echter niet aan te raden, omdat door de belasting juist schade kan worden aangebracht. (Rittweger, 2006)
Stoppen met roken is belangrijk omdat door het roken het verlies van bot versneld wordt. Roken vermindert ook het effect van oestrogeentherapie.
Valpreventie door middel van aanpassing van de leefomgeving of door het dragen van heupprotectie (60% dalen van het risico)
2.1.5.2.
Medicatie
(Christiaens et al., 2008) (Kumar en Clark, 2005)
Bifosfonaten: dit is een analoog van pyrophosphaat, adhereert aan hydroxyapatiet en inhibeert zo de werking van osteoclasten. Bifosfonaten verhogen de BMD in de heup en de wervels en reduceren het risico op breuken. Vooral bij postmenopausale vrouwen die al een vertebrale breuk hebben gehad, verminderen ze het risico op wervel-, heup- en polsfracturen met 40 tot 50%.
Ralaxifen is een selectieve oestrogeenreceptor modulator (SERM) die een antioestrogeen effect heeft op endometrium- en borstweefsel daarenboven heeft het een agostisch effect op de botreceptoren. Het vertraagt de afbraak van bot in de heupen en de ruggengraat bij postmenopauzale vrouwen. Het aantal fracturen daalt enkel in de wervels. Als bijkomend effect is er na 4 jaar behandeling met dit middel een daling in het aantal mamacarcinomen, maar het risico
op
tromboëmbolische
complicaties
is
gelijkaardig
aan
dat
van
oestrogeensubstitutietherapie.
Recombinant humaan parathyroid hormoon peptide (terapatide): dit geneesmiddel stimuleert de botopbouw en er is aangetoond dat het de kans op vertebrale en andere fracturen vermindert bij postmenopauzale vrouwen die reeds osteoporose hebben, al is er nog geen bewijs voor de preventie van heupfracturen. Het wordt vooral gebruikt bij ernstige osteoporose.
Strontium renelates: een anabole en antiresorptieve stof die een vermindering geeft van het aantal breuken bij postmenopauzale osteoporotische patiënten.
Calcium en vitamine D moeten in combinatie gebruikt worden bij de therapie van osteoporose in een dosis van respectievelijk 1g en 800UI.
11
2.1.5.3.
Minder voorkomend behandelingen
Hormon substitutie therapie (HST) is het toedienen van oestrogenen bij postmenopauzale vrouwen. Dit wordt echter veel minder gebruikt dan vroeger door het hogere borstkankerrisico dat deze therapie met zich mee brengt.Ook Calcetriol en calcitonine worden soms gebruikt in de behandeling van osteoporose.
2.2.
Signalisatie pathways betrokken bij het botmetabolisme
2.5.5. Bone morphogenetic protein 2 Het bone morphogenetic protein 2 (BMP2) is een groeifactor die behoort tot de TGF-β superfamilie. Het coderende gen bestaat uit 3 exonen en bevindt zich op chromosoom 20p12. Het speelt een rol in de hedgehog-pathway, de TGF-β signaling pathway en de cytokine-cytokine receptor interactie. Het reguleert zo functies als embryogenese, skelet ontwikkeling en osteoblast-differentiatie in het volwassen skelet (Spinella-Jaegle et al., 2001). De regulatie van de BMP-signalisatie wordt weergegeven in figuur 6.
12
Figuur 6: BMP-signalisatie en de regulatie daarvan. De signalisatie van de BMP2 molecule wordt gemedieerd door type I en II BMP-receptoren. Wanneer BMP2 daarop bindt, fosforyleren zij Smad1, 2 en 8, vormen een complex met Smad4 en transloceren naar de nucleus. Bij osteoblasten interageren deze complexen met transcriptiefactoren zoals Runx2. (1)Noggin en andere BMP antagonisten binden BMP2, 4 en 7. Overexpressie van noggin in mature osteoblasten veroorzaakt osteoporose bij muizen. (2) Smad6 bindt type I BMP receptoren en voorkomt Smad1, 5 en 8 activatie. (3) Tob intrageert specifiek met BMP geactiveerde Smad proteïnes en inhibeert BMP signalen. Tob-0-mutante muizen hebben een grotere botvorming. (4) Smurf1 is een Hect domein E3 ubiquitin ligase. Het interageert met Smad1 en 5 en medieert de afbraak van Smad proteïnes. (5) Smurf1 herkent ook botspecifieke transcriptie factor Runx2 en stimuleert zijn afbraak. (6) Smurf1 vormt een complex met Smad6, dit complex wordt uit de nucleus geëxporteerd en naar de type I BMP receptor gebracht om daar gedegenereerd te worden.(Chen et al.2004)
13
Via een “genome-wide linkage” studies van osteoporotische families werd een link aangetoond tussen een laag BMD en de chromosoomregio 20p12.3 in deze regio ligt onder andere het BMP2-gen. (Styrkarsdottir et al., 2003). Het BMP2-gen lijkt dan ook een geschikt kandidaatgen voor het beïnvloeden van de BMD. Het is namelijk zo dat via de BMP signalisatiepathway de differentiatie en activiteit van osteoblasten sterk kan worden gestimuleerd. Er is in vitro en in vivo aangetoond dat BMP2 de BMD kan verhogen en osteocalcineproductie kan induceren (Kawasaki et al, 1998). Reeds op dit moment wordt BMP2 als medicatie gebruikt om spinale fusie te stimuleren en BMP7 kan gebruikt worden bij het behandelen van nonunion fracturen van lange beenderen. Voor de behandeling van osteoporose komt geen van beide momenteel in aanmerking, dit onder andere doordat ze niet systemisch kunnen worden toegediend en door hun korte halfwaardetijd (khosla et al., 2008). Met Rs2273073 een SNP die voorkomt in BMP2 is er reeds een associatie met de lumbale spinale BMD beschreven in een internationale groep van 805 vrouwen uit Nieuw-Zeeland, het Verenigd Koninkrijk en België (Reneland et al., 2005). In de groep met lage BMD (<0.87 g/cm2, n = 319) was de prevalentie 2.2%, in de groep met hoog BMD slechts 1.4%. Gezien de relatief kleine groepen was de associatie hier net niet significant (P = 0.28). In twee latere studies, één uitgevoerd op 6353 personen in de Rotterdam studie (Medici et al., 2006) en een tweede op 411 mannen (tussen 18–61 jaar) en 1291 premenopausale vrouwen (tussen 20–50 jaar) door Ichikawa et al. (2006), kon echter geen associatie gevonden worden tussen het voorkomen van dit polymorfisme en BMD. Bovendien is er de ziekte brachydactyly type A2 die gekenmerkt wordt door hypoplasie van de middelste falangen van de 2de en 5de vinger. Deze wordt autosomaal overgedragen door mutaties in de Bone morphogenetic proteïne receptor 1B (BMPR1B) of zijn ligant Growth and differentiation factor 5 (GDF5). Recent werd ook een vorm ontdekt waarbij een microduplicatie van gebied
5.5 kb in een UTR-
110 kb downstream van BMP2 de aandoening veroorzaakt. Op de plaats van de duplicatie
bevindt zich vermoedelijk een ledemaat specifieke BMP2 enhancer, die een eind weg van het gen gelegen is. (Dathe et al., 2009) Er is ook een link tussen de BMP signalisatie en de Wnt-singnalisatie pathway. Zo is aangetoond dat bij een blokkage van het BMPR1A-proteïne de activiteit van de Wnt-pathway wordt gestimuleerd. Dit heeft als gevolg dat de osteogenese slechts een beetje vermindert en dat de osteoclastenactiviteit sterk afneemt zodat er netto een stijging is van het BMD. (Kamiya et al., 2008) Er is ook vastgesteld dat bij een blokkage van de canonical Wnt-pathway de capaciteit van BMP2 om ALP te induceren in mesenchymale cellen wordt geïnhibeerd. ALP is een proteïne dat zorgt voor de aanmaak van orthophosfosfaten, wat nodig is voor de vorming van hydroxyapatiet kristallen. (Borrásand en Comes, 2008). Het is zo dat via Smad3 een link bestaat tussen de TGF-β -en de canonical Wnt-pathway. Het is
14
zo dat smad3 zowel bindt met β-catenin uit de TGF- β als met TCF4 uit de Wnt Signalisatie pathway. (Guo et al., 2008). In de 3’ UTR regio van het BMP2-gen bevinden zich enkele gebieden die uitzonderlijk geconserveerd zijn. Deze gebieden zouden van belang zijn bij de posttranscriptionele regulatie van de BMP2 expressie (Fritz et al. 2006). Een zone van 656-bp waarin een BMP2-enhancer gelegen is op een afstand van 156.3 kilobasen van de 3’ promotor, lijkt de expressie van BMP2 te reguleren (Chandler et al. 2007). Er zijn dus zeer veel argumenten om aan te nemen dat BMP2 en de gebieden die de expressie ervan regelen ernstige kandidaten zijn om verantwoordelijk te zijn voor een aantal van de overerfbare varianten van osteoporose. Vandaar dat voor dit onderzoek BMP2 werd uitgekozen als kandidaat voor osteoporose.
2.5.6. De Wnt signalisatie pathway De Wnt-eiwitten behoren tot een grote familie van eiwitten die in de evolutie zeer sterk bewaard zijn gebleven. Ze spelen een rol in een groot aantal cellulaire processen waaronder embryogenese, organogenese, tumorvorming en botvorming. De Wnt-eiwitten doen dit via verschillende pathways, waarvan de Wnt/β-catenine signalisatie pathway het meest bestudeerd is. Deze pathway wordt de Canonical pathway genoemd. Hiernaast zijn er ook nog 2 Non-canonical pathways bekend (figuur 7). De activiteit van deze signaalcascade wordt bepaald door de cytoplasmatische concentratie aan βcatenin. In de afwezigheid van Wnt of bij inhibitie van de binding van Wnt op zijn receptor zal β-catenin via ubiquitine-proteasoom degeneratie worden afgebroken. Deze degeneratie wordt gecontroleerd door een multiprotëinecomplex van axine, adenomtous polyposis coli (APC), glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) en caseïn kinase 1α (CK1α). Dit complex bindt en fosforileert het β-catenin zodat het kan worden afgebroken door het ubiquitine-proteasoom. Wanneer Wnt echter wel kan binden op zijn receptor die bestaat uit een receptorcomplex gevormd door Frizzled en LRP5/6 aan de 7transmembranaire zijde zal het cytoplasmatische disheveled (Dvl) wordt gefosforyleerd. Deze vorm van Dvl inhibeert GSK-3β en CK1α, zorgt ervoor dat β-catenin niet langer kan worden afgebroken door het ubiquitine-proteasoom, wat resulteert in een accumulatie van niet gefosforyleerd β-catenine in het cytoplasma. Het niet gefosforyleerd β-catenin kan naar de nucleus migreren en in de kern vormt βcatenin een complex met de transcriptiefactor TCF. Door dit complex en enkele andere cofactoren, waaronder verschillende Smad-proteïnen, wordt de transcriptie van verschillende doelgenen geregeld zoals c-myc en cyclin D1. Dit resulteert in vele celfuncties zoals selectieve differentiatie, inhibitie van apoptose en functieveranderingen van de cel. De non-canonical planar cell polarity pathway en
15
Wnt/Ca2+-pathway worden respectievelijk in gang gezet door Wnt11 en Wnt5. Zij beïnvloeden uiteindelijk ook de transcriptie.. (Yavropoulou en Yovos, 2007)
Figuur 12: De canonical signalisatie: Wnt/β-catenin pathway. Non-canonical signalisatie:
Wnt/ca2+ pathway. Non-canonical signaling: Planar cell polarity pathway.(Yavropoulou en Yovos, 2007, fig 2)
Ook in bot is de functie van deze pathway significant. Niet enkel in de embryonale, maar eveneens in de postnatale fase, speelt deze een cruciale rol in de differentiatie van osteoblasten en bij de regulatie van de BMD (Bodin en Komm, 2006). In deze context zijn al vele actoren in de Wnt-singnalisatie onderzocht zowel in vitro als in vivo. Zo is bekend dat Wnt1, 2 en 3a alkalisch fosfaten induceren die belangrijk zijn in de differentiatie van osteoblast precursoren. Missense mutaties in de humane LRP5 receptor van Wnt resulteren in een afname van de BMD. Een actievere variant van het LPR5 zorgt voor een overactivatie van de Wnt-pathway wat resulteert in een stijging van de botmassa. Op deze manier werd duidelijk aangetoond dat de Wnt-pathway in staat is de BMD te veranderen. (Takahashi-Yanaga en Sasaguri, 2007) Er is ook reeds aangetoond dat een mutatie in LPR5 soms de oorzaak is van familiale osteoporose bij mensen.( Richards et al., 2008), ( Staehling-Hampton et al., 2002) Er zijn aanwijzingen dat andere eiwitten uit deze pathway aanleiding kunnen geven tot veranderingen in het botmetabolisme. Voorbeelden hiervan zijn Wnt10b en Frz1 en 2.
16
2.5.6.1.
Wnt10b
Wnt10b is net als de andere leden van de Wnt familie betrokken bij een brede waaier aan functies, onder andere de embryogenese, het metabolisme van adipocyten (Longo et al.,2004), oncogenese (Saitoh et al., 2002) en ook het botmetabolisme. Deze functies worden gereguleerd via de Canonicalpathway. De functie van Wnt10b is al uitvoerig onderzocht in muismodellen. Uit dit onderzoek is onder andere gebleken dat muizen met een overexpressie van het Wnt10b gen een viervoudig verhoogd TBV (totaal bot volume) vertonen. Enkel het trabeculair bot werd versterkt terwijl het corticaal bot niet werd beïnvloed. De overexpressie zorgt ervoor dat vrouwtjes ook resistent worden voor botverlies na ovariëctomie (Bennett et al., 2005). Bij Wnt10b knock-out muizen echter was het TBV gereduceerd met 30%. (Bodine en Komm, 2006) In dierenmodellen is dus duidelijk aangetoond dat Wnt10b wijzigingen, osteoporose bij proefdieren kunnen veroorzaken. Bij de mens ontstaat er onder andere door een homozygote missensmutatie in het Wnt10b-gen ectrodactyly. Dit is een complexe lidmaatmalformatie waarbij de middelste vingers en/of tenen niet ontwikkelen; dit gaat uiteraard ook gepaard met afwijkingen aan het skelet. Nu wordt er ook bij menselijke osteoporose patiënten nagegaan of Wnt10b een belangrijke factor is in de pathogenese van osteoporose. 2.5.6.2.
Frizzeld 2
Frizzeld2 (Fzd2) is een eiwit dat samen met LPR5/6 een receptor vormt voor Wnt-proteïnen. Van het LPR5 is reeds gekend dat mutaties in dit gen betrokken kunnen zijn bij de pathogenese van osteoporose (Ferrari et al.,2005). Bovendien ziet men dat bij LRP5 G171V transgene muizen met een hoge BMD, het Fzd2 één van de genen is die verhoogt tot expressie komt bij deze muizen (Robinson et al. 2006). Bij het uitvoeren van gewichtdragende oefeningen is bekend dat er gezorgd wordt voor een stijging van het BMD. In dat verband is er aangetoond dat in wild type muizen 3 uur na het uitoefenen van gewichtdragende oefeningen de expressie van Fzd2 stijgt. Deze stijging is niet aanwezig bij muizen zonder oestrogeen receptor α. Deze muizen hebben daarenboven ook een laag BMD. Dit laat een verband tussen beide vermoeden.(Armstrong et al. 2007). Al deze elementen samen maken van Fzd2 een interessant gen om te onderzoeken in verband met de pathogenese van osteoporose.
17
2.6.
Soorten mutaties
Bij het onderzoeken van de genen is het mogelijk om verschillende soorten afwijkingen terug te vinden in de sequentie, waaronder deleties, inserties en puntmutaties. Bij puntmutaties wordt er een nucleotide uitgewisseld voor een andere. Als deze vrij frequent voorkomen worden ze ook wel SNP’s (Single Nucleotide Polymorphism of ook wel snip) genoemd. Hierbij kan ofwel een purine vervangen worden door een purine (A↔G) en een pyrimidine door een andere pyrimidine(C↔T). Dit noemt men een transitie genoemd en veroorzaakt geen echte structuurverandering. Wanneer een purine door een pyrimidine wordt vervangen en vice versa heet dit een transversie. Deze SNP’s kunnen eveneens worden ingedeeld naargelang hun gevolg. Als deze mutatie geen invloed heeft op de eiwitsequentie, is dit een “stille” mutatie. Wanneer er een eiwitverandering optreedt, is dit een missense mutatie (bijlage 3). Bij de introductie van een vroegtijdig stopcodon spreekt men van een nonsens mutatie. Bij inserties of deleties is het ook mogelijk dat er een verandering optreedt in het leesraam, dit zijn frame shift mutaties. SNP’s die gekend zijn en relatief frequent voorkomen krijgen een rs-nummer. Ten gevolge van een mutatie kan een aminozuur veranderen in het eiwit (bijlage 2), dit heeft dan al dan niet een effect op de werking van het proteïne. Wanneer er geen eiwitverandering plaatsvindt, wil dit nog niet zeggen dat de SNP geen effect heeft want door de verandering van de nucleotide kan ook een splice site verandering geïnduceerd worden. Ook kunnen deleties en inserties voorkomen. Afhankelijk van de plaats en de sequentie die respectievelijk ontbreekt of toegevoegd wordt, kunnen zij verschillende effecten hebben op de genen waarop zij betrekking hebben. Sequentieveranderingen kunnen ook van belang zijn wanneer ze niet in het transcriptiegebied zelf voorkomen, maar in untranslated regions (UTR) liggen, kunnen ze de expressie van een gen veranderen of de stabiliteit van het transcript beïnvloeden.
18
2. Methodologie 2.1. Recrutering osteoporose patiënten Voor deze studie werd het DNA van 102 mannelijke osteoporosepatiënten verzameld door Professor J M Kaufman van de dienst endocrinologie, UZ Gent. Elk van hen had, afgaande op hun stamboom, een duidelijke overerfbare vorm van osteoporose, maar ze waren onderling niet verwant. De patiënten hebben een BMD Z-score ≤ −2.0 aan de LS of de proximale femur. Om secundaire vormen van osteoporose uit te sluiten zijn alle patiënten relatief jonge mannen, tussen de 20 en de 65 jaar oud en werden volgende exclusiecriteria gehanteerd: hypothyroidie nu of in de voorgeschiedenis, metabolische aandoeningen met een gekend effect op het bot, puberositas tarda, alcoholisme nu of in de voorgeschiedenis (≥5 U per dag meer dan eens per week), tabagisme (≥ 40 pack-years), malabsorptie, hemochromatose, renale of gonadale dysfunctie, maligniteiten en ooit langdurige behandeling met glucocorticoiden, synthetische thyroxine of (anti)androgenen. Het DNA van deze patiënten werd genoom geamplificeerd met de Genomify kit.
2.2. Mutatiescreening Op de geselecteerde genen BMP2, Fzd2 en Wnt10b werd een mutatiescreening uitgevoerd bij de 102 patiënten (zie 2.1). Een mutatiescreening bestaat uit 3 delen:
Eerst wordt de polymerase chain reaction (PCR)(zie 2.3.) geoptimaliseerd voor de exonen van de geselecteerde genen.
De geamplificeerde DNA-fragmenten worden gecontroleerd op specificiteit door middel van agarosegelelektroforese.(zie 2.4)
Daarna worden de PCR-fragmenten gesequeneerd. De sequenties die daaruit bekomen worden, dienen dan te worden gecontroleerd op de aanwezigheid van variaties (mutaties en polymorfismen). Deze variaties kunnen dan eventueel verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van osteoporose bij de patiënt. (zie 2.5)
2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.3.1. Principe van PCR De Polymerase Chain Reaction (PCR) of de polymerase kettingreactie stelt je in staat om uit een complexe DNA-bron één specifiek DNA-fragment (de template) vele malen te vermenigvuldigen. Dit gebeurt door het herhalen van een PCR-cyclus, die kan onderverdeeld worden in 3 verschillende stappen: denaturatie, annealing en elongatie. Een standaard PCR-reactiemix bestaat uit een buffer,
19
magnesium, een forward en een reverse primer, deoxyribonucleotiden trifosfaat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), template-DNA en DNA-polymerase. De PCR-cyclus: Stap1 denaturatie: Bij de denaturatie wordt het dubbelstrengig DNA (dsDNA) omgezet in enkelstrengig DNA (ssDNA). Om dit te bereiken wordt de oplossing met het dsDNA opgewarmd tot een temperatuur van 90 à 95 °C. Hierdoor worden de waterstofbruggen die de twee complementaire DNA-strengen bij elkaar houden verbroken tot ssDNA zonder de bindingen binnen één DNA-streng te verbreken. Stap 2 annealing: Vervolgens wordt de temperatuur verlaagd. Dit zorgt ervoor dat de primers die aanwezig zijn in de oplossing zich kunnen binden met de specifieke sequentie op het template-DNA. Naarmate de temperatuur hoger is, wordt het moeilijker voor de primers om zich aan de DNA-streng te binden en zal deze binding specifieker worden. Als de temperatuur verlaagd wordt, zal de primer/templatebinding makkelijker doorgaan, maar zal ze wel minder specifiek zijn. Door deze aspecificiteit kunnen er meer ongewenste DNA-amplicons gevormd worden. Stap 3 elongatie: In deze stap worden de primers die op het template-DNA gebonden zijn, verlengd aan het 3’ uiteinde. Dit gebeurt door het warmtebestendige Taq DNA-polymerase. Dit enzyme is het meest actief bij 72°C, en zorgt ervoor dat de passende vrije mononucleotiden, die ook aanwezig zijn in de PCR-mix, worden ingebouwd aan het 3’ uiteinde van de primer. Door deze verlenging wordt een nieuwe DNA-streng gevormd. In het nieuw gevormde DNA-fragment is opnieuw de target DNA-sequentie aanwezig. De cyclus kan worden herhaald maar ditmaal zal er dubbel zoveel template-DNA en dus dubbel zoveel opbrengst zijn. Het op die manier laten doorlopen van de PCR-cyclus zal leiden tot een exponentiële vermenigvuldiging van het target-DNA. Dit zorgt ervoor dat na de gebruikelijke 25-tal cycli er ongeveer
copies
gemaakt worden (figuur 8). Door de grote hoeveelheid aangemaakt DNA dat de targetsequentie bevat, wordt de hoeveelheid DNA dat niet de gewenste sequentie heeft, afkomstig uit de complexe DNA-bron, verwaarloosbaar ten opzichte van de hoeveelheid gewenste DNA.
20
Figuur 8: Illustratie van de denaturatie, annealing en elongatie van het target-DNA. Door het verschillende malen doorlopen van de PCR-cyclus ontstaat steeds meer DNA met de target sequentie zodat uiteindelijk de hoeveelheid DNA met een andere sequentie verwaarloosbaar wordt.(lodish et al., 2004, fig 9-24)
2.3.2. Touch-down PCR Een touch-down PCR verloop wil zeggen dat bij de eerste cycli de annealing temperatuur hoog wordt gehouden en verlaagd wordt naarmate het aantal cycli vordert. Op die manier wordt een grotere specificiteit verkregen in het begin. Dit is belangrijk omdat de stukken target-DNA die dan geproduceerd worden nog vele keren zullen gekopieerd worden. De verlaagde temperatuur op het einde van de run zorgt dan weer voor een grotere opbrengst. Een typisch verloop van de annealingtemperatuur is van 62°C naar 50°C. (Strachan en Read, 1999).
2.3.3. Componenten mastermix Template-DNA: dit is het DNA dat als basis dient voor het nieuw aangemaakte DNA tijdens het PCRproces. (bijvoorbeeld het menselijk genoom) Buffer: deze dient om de pH op een gepast peil te houden (10xPCR-buffer). (Haines et al.,2007) MgCl2: het magnesium hieruit stabiliseert het dsDNA tijdens de PCR-reactie wat de smelttemperatuur en specificiteit beïnvloedt. Het dient ook als cofactor voor Taq-polymerase. (Kramer en Coen, 2001)
21
Primer: een primer is een oligonucleotide van 18 à 22 basen dat ontworpen is om te binden op een specifieke plaats op een complexe DNA bron. Voor een PCR-reactie zijn twee verschillende primers nodig waarvan de ene aan de sens-DNA streng en de andere aan de antisens-DNA streng bindt. Respectievelijk een forward primer en een reverse primer. Deze primers moeten elk aan een verschillende kant van het target-DNA binden. Dit houdt in dat de sequentie van het DNA, dat zich naast de sequentie waarin men geïnteresseerd is bevindt, moet gekend zijn om een goede primer te kunnen ontwikkelen. Deze kennis is over de mens en vele andere dieren voorhanden in grote databases, beschikbaar via zogenaamde genome browsers zoals Ensembl, NCBI en UCSC. Bij het ontwerpen van een primer moet rekening gehouden worden met verschillende factoren:
Lengte: een primer voor een target sequentie uit een complexe DNA-bron is gewoonlijk ongeveer 20 basen lang. Dit kan korter bij eenvoudigere DNA-bronnen, omdat de kans uiterst klein is dat er elders in het DNA nog een identieke sequentie is voor beide primers.
Secundaire structuren: de primers mogen geen secundaire structuren kunnen aannemen doordat de 2 zijden van de primer complementaire delen bevatten die groter zijn dan 3 basen.
GC-gehalte: bindingen tussen G en C bestaat uit 3 waterstofbruggen terwijl deze tussen T en A er slechts 2 bevatten. Dit zorgt ervoor dat de smelttemperatuur van een DNA-sequentie rechtevenredig is met het aantal GC-baseparen. Bijgevolg moet het GC gehalte van een primer tussen 40 en 60% zijn, zodat de Tm optimaal blijft voor de PCR-reactie.
Smelttemperatuur(Tm): beide primers moeten bijna dezelfde smelttemperatuur bezitten. Deze kan als volgt worden berekend. Tm=81.5+16.6
).
Specificiteit: naast de andere factoren is het uiteraard belangrijk dat de primers enkel binden op de plaatsen waar ze bedoeld zijn, dus moet er gecontroleerd worden of ze niet kunnen binden op homologe plaatsen elders in het template-DNA. Dit kan worden nagegaan door het uitvoeren van een virtuele
PCR.
Dergelijke
software
is
beschikbaar
via
de
UCSC
Genome
Browser
(www.genome.ucsc.edu/). Ook wordt de specificiteit gecontroleerd met behulp van BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) wat kan gebruikt worden via de NCBI website (www.ncbi.nbm.nih.gov/). Deze tool zoekt voor de ingegeven sequentie (in dit geval voor de primer die moet getest worden) de meest homologe sequenties die in het menselijk genoom aanwezig zijn en sorteert ze volgens afnemend homologie. Met computerprogramma’s kunnen de primers worden geselecteerd waarin voorafgaande eigenschappen het best verenigd zijn. Bijvoorbeeld het programma Primer3 dat online beschikbaar is via http://frodo.wt.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi.
22
In dit onderzoek werden M13 primers gebruikt. Dit zijn primers die aan hun 5’ uiteinde een gestandaardiseerde DNA-staart hebben die niet bindt met het target-DNA. Deze staart is verschillend voor de forward en de revers primer (reverse: M13_R_A= CAGGAAACAGCTATGACC en forward: M13_F_B= CACGACGTTGTAAAACGAC). Deze uiteinden worden tijdens een PCR-reactie ingebouwd in de geproduceerde stukken DNA. Ze kunnen dan later bij de sequenering gebruikt worden om er een specifieke primer voor de M13 uiteinden op te laten binden. Zo hoeft men niet voor iedere sequenering een verschillende primer te gebruiken.(Schuelke,2000) Deoxyribonucleotidetrifosfaten:
Deoxyribonucleotidetrifosfaten of afgekort dNTP’s zijn de
monomeren waaruit DNA opgebouwd is, bestaande uit 3 delen: een base (A, T, C of G), een desoxyribose en een trifosfaatgroep (figuur 9). In de mastermix zijn er 4 verschillende basen aanwezig, deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxythymidine triphosphate (dTTP) en deoxycytidine triphosphate (dCTP). Ze kunnen door het Taq DNA-polymerase worden ingebouwd bij het verlengen van een DNA-streng wanneer op de template de juiste partnerbase aanwezig is.
Figuur 9: structuur van deoxyribonucleotiden (lodish, 2004, fig 9-22) Taq DNA-polymerase: dit is een thermosstabiel DNA-polymerase afkomstig van de thermofiele bacterie thermus aquaticus. Het enzym werkt optimaal bij een temperatuur van 75 tot 80°C en heeft een halfleven van 9 minuten bij 97.5°C (Lawyer et al. 1993). Bij een temperatuur van 75°C heeft het een verlengsnelheid van 35-100 nt/sec (Wittwer en Garling, 1991). Het Taq polymerase heeft echter wel het nadeel dat het vrij veel fouten maakt, ongeveer 1 op 9000 basen (Tindall en Kunkel, 1988) wordt op de verkeerde plaats ingebouwd. Dit komt door het ontbreken van 3’-5’ exonuclease proofreading activiteit, wat bij andere polymerasen de gemaakte fouten detecteert en verbetert. Er bestaan enkele andere
23
termonstabiele polymerasen die dit wel hebben, deze kunnen gebruikt worden wanneer een lagere foutenlast vereist is. 2.3.4. Voor-en nadelen van de PCR-techniek De PCR-techniek heeft 3 grote voordelen: De techniek duurt amper een paar uur, wat zeer snel is in vergelijking met het Cell-based DNA-cloning, die weken kan duren. Daarboven is het in staat om zeer kleine hoeveelheden target DNA te vermenigvuldigen, dus het heeft een grote sensitiviteit. Tenslotte is de techniek in staat tot de amplificatie van stukken DNA die ernstig gedegradeerd zijn of die zich in een medium bevinden dat conventionele isolatie moeilijk maakt. De nadelen zijn onder andere het feit dat slechts relatief kleine stukjes DNA kunnen worden geamplificeerd, namelijk standaard tussen de 0.1en 5kb. Een ander probleem is het relatief hoog aantal fouten dat optreedt bij de replicatie (1 op 9000 basenparen) bij het veel gebruikte taq polymerase, dat geen 3’->5’exonuclease bevat. Dus is een PCR-product eigenlijk een mengeling van verschillende sterk op elkaar lijkende maar niet identieke stukjes DNA. Echter door de analyse van het PCR-product in zijn totaliteit kan men toch een correct beeld krijgen van de originele template. Tevens is de voorkennis die vereist is om de correcte primers te kunnen ontwerpen een nadeel. (Strachan en Read, 1999)
2.3.5. Standaard PCR-protocol Hieronder wordt de werkwijze weergegeven waarmee een PCR reactie wordt uitgevoerd. Bij iedere aangemaakte mastermix wordt telkens ook 1 blanco staal geïncludeerd om contaminatie uit te sluiten. 1. ontdooi alle producten en vortex en centrifugeer ze 2. mastermix aanmaken. (tabel 2) Hoeveelheid (µl) 12,4 2,5 5
product H2O Invitrogen 10x buffer dNTP’s (1µM) Forward primer 1,5 (10µM) Revers primer 1,5 (10µM) 0,9 MgCl2 (50 mM) 0,2 Taq Platinum (5U/µl) Tabel 2: Samenstelling van 1 PCR-reactiemix van 25µl. 3. vortexen en centrifugeren 4. 24µl mastermix verdelen per staal
24
5. 1µl DNA (50ng/µl) toevoegen aan het staal. 6. de PCR-stalen in het PCR-toestel brengen en het programma uitvoeren
functie
Temperatuur(°C) Tijd(min:sec) Aantal cycli
denaturatie denaturatie annealing elongatie denaturatie annealing elongatie elongatie afkoeling
94 94 62* 72 94 50* 72 72 4
2:00 0:20 0:15 1:00 0:40 0:40 0:30 10:00 5:00
1x 12x
24x 1x
Tabel 3: Standaard PCR-Programma. * tijdens een touch-down PCR wordt per cyclus de temperatuur wat verlaagt. In dit geval van 62°C naar 50°C. De temperatuur van de annealing moet ook vaak aangepast worden bij verschillende PCR-reacties en verschillende templates en primers.
2.3.6. Optimalisatie PCR Wanneer een PCR onder basisomstandigheden niet, onvoldoende of aspecifiek doorgaat, zijn er verschillende mogelijkheden om de procedure aan te passen om zo toch een succesvolle specifieke PCR-reactie te verkrijgen: Aanpassen annealing temperatuur: wanneer een PCR-reactie een aspecifiek PCR-product oplevert, is een aspecifieke annealing van de primers de oorzaak. In dat geval kan een verhoging van de annealing temperatuur een mogelijke optie zijn. Wanneer de PCR-reactie geen of zeer weinig DNA produceert is dit mogelijk het gevolg van een gebrekkige annealing van de primers, een probleem dat mogelijks wordt verholpen door een verlaging van de annealing temperatuur waardoor de primer makkelijker zal kunnen binden. Aanpassen van het aantal PCR-cycli: wanneer de DNA productie per cyclus beperkt is kan het voldoende zijn om het aantal cycli te vergroten om zo toch genoeg DNA te produceren. Verlengen van de tijd waarin het DNA-polymerase actief is: dit kan vooral helpen wanneer de targetsequentie vrij lang is. Aangezien het Taq-polymerase in 10 seconden ongeveer 1000 basenparen repliceren, kan de normale tijd die voorzien is, ontoereikend zijn. Starten met een hogere beginconcentratie template-DNA: dit kan nodig zijn als het template-DNA van iets mindere kwaliteit is. Toevoegen van DMSO (bijvoorbeeld 5%): dit inhibeert de secundaire structuren die het target-DNA soms vormt, zodat de primer gemakkelijker kan binden. In de mastermix wordt een deel van het water
25
vervangen door DMSO waardoor de samenstelling wordt zoals opgegeven in tabel 4. Het programma hoeft niet te worden aangepast. (Chakrabarti en Schutt, 2001) Hoeveelheid (µl) product 9,9 H2O 2,5 Invitrogen 10x buffer 5 dNTP’s (1mM) 1,5 Forward primer ( 10µM) 1,5 Revers primer (10µM) 0,9 MgCl2 (50 mM) 0,2 Taq Platinum 2,5 DMSO 5% Tabel 4: samenstelleng mastermix met DMSO Gebruiken van Invitrogen enhancer kit: dit is een oplossing die specifiek ontwikkeld is voor het gebruik bij PCR’s met problematische en GC-rijke templates. Het zou een hogere primerspecificiteit, een breder magnesiumoptimum, een bredere annealingoptimum en een thermostabilisatie van het Taq DNA-polymerase moeten opleveren. Bij het gebruik van deze substantie dient ook een aangepaste buffer (10X PCRx Amplification Buffer) gebruikt te worden en MgSO4 worden toegevoegd zodat de uiteindelijke samenstelling van de mastermix voor 1 PCR wordt zoals beschreven in tabel 5. Het aanbevolen programma is ook aangepast. Dit staat weergegeven in tabel 6.(Invitrogen, 2009) Hoeveelheid (µl) product 7,55 H2O 2,5 10x PCRx Amplification Buffer 5 dNTP’s (1mM) 1,5 Forward primer (10µM) 1,5 Revers primer (10µM) 0,75 MgSO4 (50 mM) 0,2 Taq Platinum 5 enhancer Tabel 5: Samenstelling mastermix bij gebruik van een invitrogen PCRx enhancer kit. functie Temperatuur(°C) Tijd(min:sec) Aantal cycli denaturatie 97 2:00 1x denaturatie 97 0:30 annealing 55 0:30 31x elongatie 68 1:00 elongatie 68 10:00 1x afkoeling 4 5:00 1x Tabel 6: Aanbevolen programma PCRx Enhancer kit.
26
2.4. Agarosegelelektroforese Agarosegelelektroforese is een techniek die toelaat moleculen te scheiden op basis van de snelheid waarmee zij er in slagen zich volgens een elektrisch veld door een gel voort te bewegen. In dit geval worden er negatief geladen DNA-moleculen gescheiden. Deze bewegen dus in de richting van de positieve pool. De grootte van de moleculen zal bepalen hoe snel zij zich in de gel kunnen verplaatsen en zo zullen de DNA-strengen van verschillende lengtes, van elkaar gescheiden worden nadat ze zich een bepaalde tijd in het elektrische veld bevonden (figuur 10 links). Na de scheiding kunnen de DNAfragmenten in de gel worden gevisualiseerd door middel van ethiduimbromide dat in de gel wordt verwerkt. Deze stof bindt zich op dsDNA en wordt daardoor fluorescent onder UV-belichting (figuur 10 rechts). Op die manier ontstaan bandjes van DNA met dezelfde lengte. Tijdens dit proces laat men in dezelfde gel DNA-fragmenten meelopen met een gekende lengte, dit wordt een ladder genoemd. Door te vergelijken met de afstand dat het DNA van deze ladder heeft afgelegd kan men dan bepalen hoe lang de onderzochte DNA-strengen zijn.
Figuur 10: (Links) Gel in bak met bufferoplossing en met stroombron, die een spanningsveld over de gel kan aanbrengen. (rechts) Gel op UV-lichtbak, de roze streepjes zijn de DNA-moleculen die gebonden zijn met etidiumbromide.
In ons onderzoek had de gelelektroforese tot doel de kwaliteit van het PCR-product te evalueren. Wanneer er bij gelelektroforese één enkel bandje van stukjes DNA met de verwachte lengte kan worden aangetoond dan is dat een indicatie dat de PCR gelukt is zodat er in het product enkel stukjes van een gelijke lengte aanwezig zijn. Als er tijdens de PCR-reactie aspecifieke amplificaties hebben plaatsgevonden zijn er meerdere bandjes te zien. Dan wijst dit op aspecifieke interacties. Wanneer er geen bandjes of slechts zeer zwakke bandjes te zien zijn, wijst dit op een onvoldoende amplificatie tijdens de PCR (figuur 11). (Lodis et al., 2004) (Strachan en Read, 1999)
27
Figuur 12: (1) Een laan met een specifieke bandje. (2),(3) en (4) lanen met aspecifieke bandjes erin, in (4) is er 1 specifiek bandje met 1 klein aspecifiek bandje. (5) Een ladder. 2.4.1. Praktisch Stap 1 agarose gel: Er wordt een gel gemaakt van 5 gram agarose gemengd onder 250 ml TBE buffer. Dit wordt opgewarmd zodat het agarose poeder wordt opgelost. Eens dit is opgelost wordt er ethidiumbromide toegevoegd en onder de oplossing gemengd. Vervolgens wordt de oplossing in een mal gegoten. Deze zorgt ervoor dat de gel als hij afkoelt, opstijft met een rij slotjes erin, waarin later het DNA-materiaal kan worden aangebracht. Wanneer de gel hard is, wordt deze ondergedompeld in een bad gevuld met TBE buffer. Stap 2 gel laden: Men vermengt 3µl van het PCR-product met 10 µl Orange G, dit is een kleurstof bestaande uit een 1Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfoniczuurdisodiumzout oplossing. Deze oplossing wordt in de slotjes in de gel gepipetteerd(laden). Ze blijft op de bodem van het slotje liggen doordat het soortelijk gewicht groter is dan dat van de TBE buffer. Dan wordt over het geheel een spanningsveld aangebracht van 140 volt. Hierdoor beginnen de DNA-fragmenten te migreren. Na een 30 tot 45 minuten is dit voldoende gebeurd om de lengte van de fragmenten in te schatten. Dit gebeurt door de fragmenten te vergelijken met een ladder, dit is een slotje dat gevuld wordt met verschillende stukjes DNA met een gekende lengte.
28
Stap 3 uitlezen: Als de gel lang genoeg heeft gelopen, wordt hij op een UV bak gelegd zodat het etiduimbromide dat met het dsDNA is gebonden, oplicht.
2.4.2. Methode Agarosegel maken: Standaard 2% agarose gel: 1) 5g agarose afwegen. 2) Voeg hierbij 250 ml TBE (10x). 3) Breng dit mengsel aan de kook totdat de agarose is opgelost. 4) Koel iets meer af dan tot wanneer het zichtbaar verdampen stopt. 5) Voeg 5 druppels ethidiumbromide toe. 6) Giet de gel in een mal waarin kammetjes zijn aangebracht voor het vormen van slotjes. 7) Eventuele luchtbellen verwijderen. Agarosegelelectroforese: 1) Voeg 10 μl Buffer Orange samen met 3 μl PCR-product. 2) Voeg bij de 0.8µl ladder (ReddyRunTM SuperLadder) 10 μl Orange. 3) Plaats de agarosegel in de buffertank (gevuld met TBE 10x). 4) Laad slotjes met het orange/PCR-product mengsel. 5) Sluit de elektroden aan en leg een spanning aan van 140 V (ongeveer 45min). 6) Aflezen op de UV lichtbak.
2.5. Sequenering Nadat met gelelectroforese gecontroleerd is of de PCR-reactie goed gelukt is, kan het PCR-product worden gebruikt om te worden gesequeneerd, dit wil zeggen het bepalen van de volgorde van de basen waaruit het target-DNA is opgebouwd. Dit wordt gedaan met de Sanger-methode die bestaat uit verschillende stappen. In de eerste stap wordt het PCR-product opgezuiverd, dan wordt de eigenlijke sequencingreactie uitgevoerd, waarna het mengsel nogmaals wordt opgezuiverd om tenslotte een capillaire gelelectroforese uit te voeren. Dit proces gebeurt bijna volledig gerobotiseerd, al blijft het principe hetzelfde als bij de manuele sequencing. De voordelen van robotische sequencing is dat het minder arbeidsintensief is, tijdbesparend en een grotere accuraatheid heeft. (Lodis et al., 2004), (Strachan en Read,1999). Al blijkt manueel sequencen soms toch robuuster te zijn dan het gerobotiseerd sequencen.
29
Stap 1 opzuiveren: De bedoeling van het opzuiveren is het verwijderen van de overblijvende dNTP’s en primers uit het PCR-product zodat ze de sequeneringsreactie niet kunnen verstoren. Dit wordt gedaan door het toevoegen van een enzymenmengsel, genaamd exoSAP. Het bevat exonuclease I en shrimp alkalisch fosfatase. Exonuclease I splitst ssDNA in enkelvoudige dNTP’s (Lehman en Nussbaum, 1964). Dit zorgt ervoor dat primers en aspecifieke ssDNA-fragment geproduceerd bij de PCR-reactie, worden afgebroken. Shrimp alkalisch fosfatase verwijdert de fosfaatgroepen van dNTP’s. Hierdoor kunnen ze niet langer worden ingebouwd in een DNA-streng door het polymerase tijdens de sequenerings reactie. (Sambrook en Russell, 2001) Deze beide enzymen zijn actief bij 37°C. Deze temperatuur wordt 15 minuten aangehouden, daarna wordt de temperatuur voor 15 minuten opgetrokken naar 80°C om het exoSAP enzymenmengsel te inactiveren. Daarna laat men de temperatuur weer zakken. (figuur 12)
Figuur 13: Opzuiveren PCR-product.(Usb, 2007, http://www.usbweb.com/category.asp?cat=144&id=78200) Stap 2 sequencing reactie: Het uiteindelijke doel van het sequeneren is het kennen van de exacte volgorde van de nucleotiden van een stukje DNA. Tijdens deze stap worden er stukjes DNA gevormd van verschillende lengtes. Het reactiemengsel bevat het opgezuiverde PCR-product, een forward of een revers primer, DNApolymerase(taq) dat de primers kan verlengen, een buffer en een grote hoeveelheid dNTP’s. Daarnaast
30
is er tevens een kleine hoeveelheid dideoxyxynucleotiden (ddNTP’s) aanwezig. Dit zijn nucleotiden die een 3’hydroxylgroep missen op hun deoxyribose (figuur 13). Door het gebrek aan deze groep is het wel mogelijk dat de nucleotiden door het polymerase wordt ingebouwd in een DNA-streng. Daarna is het niet meer mogelijk de streng in kwestie nog te verlengen. Daarom worden ze ook wel chain terminators genoemd. Op iedere verschillende nucleotide wordt er wel eens gestopt met de aanmaak van de DNA-streng waardoor men stukjes krijgt die elk eindigen op een andere nucleotide. De verschillende soorten ddNTP’s (ddATP, ddTTP, ddGTP en ddCTP) zijn elk gelabeld met een verschillend fluorescentie merker.
Figuur 13:ddNTP’s (lodisch et al., 2004, fig9-22) Stap 3 opzuiveren van het sequentieproduct: Het sequentieproduct wordt gezuiverd door middel van magnetische beads. Op die manier worden resten van buffer, primer, dNTP’s en ddNTP’s verwijderd. Deze methode wordt geïllustreerd in figuur 14.
31
Figuur 14: 1) Het sequentieproduct wordt opgelost in ethanol, 2) Bij de oplossing worden magnetische beads gevoegd, deze hechten zich aan de DNA -fragmenten. 3) Door het aanbrengen van een magneetveld rond het epje migreren de magnetische beads naar de rand ervan en blijven daar vas hangen. Daarbij trekken ze de DNA-fragmenten met zich mee. 4) Nu kunnen de resten van de sequencing reactie worden weggewassen met ethanol. 5) Er wordt een elutie buffer toegevoegd (H2O) en deze zorgt ervoor dat de DNA-fragmenten niet langer aan de beads blijven hangen zodat ze weer oplossen in de vloeistof. 6) Aangezien de beads aan het magnetisch veld blijven hangen is het mogelijk om de oplossing met de DNAfragmenten in een ander epje te brengen zonder dat er beads in aanwezig zijn. (Agencourt, 2009, http://www.agencourt.com/products/spri_reagents/cleanseq/cleanseq-processoverview.gif) Stap 4 aflezen van de sequentie: De opgezuiverde DNA-fragmenten van de sequencing reactie werden ingebracht in silica capillairen, gevuld met polymeer. Dan wordt er een spanningsveld aangelegd over de capillair en kan de electroforese beginnen. Er vindt een scheiding plaats op basis van de lengte van de DNA-fragmenten. Zo komen alle fragmenten met hetzelfde aantal basenparen bij elkaar te liggen. Dit wordt dan uitgelezen in een detectiecel waar de fluorescente labels worden geëxciteerd door een laserstraal. Op die manier zullen de fluorescent gelabelde ddNTP’s aan het einde van de fragmenten fluoresceren. Dit wordt gedetecteerd met een CCD-camera (Charge-Coupled Device). De mate van fluorescentie van de 4 verschillende kleuren wordt uitgezet op een elektroferogram met de afstand afgelegd tijdens de electroforese in de X-as en de intensiteit van fluorescentie van de verschillende kleuren op de Y-as (zie figuur 15). Zo bekomt men verschillende fluorescentiepieken die overeenkomen met de volgorde waarin de basen zich op het target-DNA bevinden. De data die op deze manier worden gegenereerd kunnen verder worden geanalyseerd met de Sequencing Analyse software (Applied Biosystems).
32
Figuur 15: Elektroferogram met de daaruitvolgende sequentie.
2.5.1. Protocol voor manueel sequeneren 2.5.1.1.
Opzuivering PCR-prduct
exoSAP-mix aanmaken:
- 0,05 μl Exonuclease I - 0,20 μl Antartic Phosphatase
PCR opzuivermix aanmaken:
- 0,75 μl H2O -5 μl PCR – product -1 μl exoSAP-mix
Reactie laten plaatsvinden door de temperaturen in tabel toe te passen: Temperatuur °C
Tijd (minuten)
functie
37
15
enzymactivatie
80 4
20 1
enzyminactivatie koelen
Tabel 7: Reactie enzymatische opzuivering PCR-reactie.
2.5.1.2.
Sequencing reactie
Sequencing reactiemix bereiden:
- 2,0 μl sequencing buffer - 0,5 μl RR-mix (een mengsel van gelabelde ddNTP’s) - eventueel 0,5 μl DMSO - 2,0 μl 1μM primer - 1,0 μl PCR–product - H2O toevoegen zodat men 10 µl bekomt.
De reactie vindt plaats onder de omstandigheden in tabel 8 omschreven. functie denaturatie annealing elongatie
Temperatuur(°C) Tijd (minuten) 92 10 55 5 60 4 Tabel 8: Sequencing reactie.
Aantal cycli 25x
33
2.5.1.3. Opzuiveren met magnetische beads 1) Resuspendeer beads (homogeen maken) door te vortexen. 2) Voeg 10 μl beads toe aan ieder PCR-staal. 3) Voeg 45 μl 85% EtOH toe en mix. 4) Plaats de plaat met sequence-producten op de magnetische houder gedurende 3 minuten. 5) Verwijder supernatans. 6) Voeg 100 μl 85% EtOH en plaats gedurende 30’ op de magnetische houder. 7) Voer de vorige 2 stappen 7x na elkaar uit. 8) Droog gedurende 10’ aan de lucht. 9) Voeg 40 μl H2O toe en mix door op en neer te pipetteren. 10) Plaats de plaat op de magnetische houder en wacht minimum 30’. 11) Breng 30 μl zuiver sequence-product (zonder beads) over naar een nieuwe plaat. 12) Plaat laten analyseren op capillair elektroforesetoestel. 2.6.
Analyse van de gevonden eiwitveranderingen
Wanneer er sequentievarianten werden gevonden die een eiwitverandering teweeg, en bracht werd de impact daarvan geschat door middel van 2 computerprogramma’s. Zij maken voorspellingen over het effect van een aminozuurvervanging op de functie van een proteïne en ze zijn ontworpen om te oriënteren betreffende de consequenties van mutaties. De programs heten SIFT en polyphen. Zij doen hun voorspellingen op basis van de graad van conservatie van een aminozuur. Hoe beter het geconserveerd blijft, hoe belangrijker de functie van een aminozuur wordt geschat. Ook de eigenschappen van de aminozuren worden in rekening gebracht.
2.7.
Analyse van mogelijke splice site veranderingen
Met het computer programma “Splice Site Prediction by Neural Network” wordt een inschatting gemaakt van de veranderingen die een sequentievariant teweeg brengt in de splice sites. Dit programma voorspelt aan de hand van de lokalisatie van mRNA donor en acceptor lokalisatie.
34
3. Resultaten Hieronder wordt weergegeven wat de resultaten zijn voor de verschillende exonen van de genen BMP2, Frz1 en Wnt10b. Een eerste doel was het op punt stellen van het PCR-protocol op test-DNA dat analoog is bekomen met het patiënten-DNA. Dit gebeurde meestal met een touch-down PCR en soms ook met behulp van DMSO of de invitrogen PCRx enhancer kit. Wanneer de PCR-reactie was geoptimaliseerd kon de PCR gebeuren voor alle patiënten. Met het daaruitvolgende PCR-product kon de sequentie bepaald worden, deze sequenties werden vergeleken met de normale sequentie om te kijken of er sequentievariaties aanwezig waren.
3.1. BMP2
Figuur 16: Overzicht BMP2-gen 3.1.1. BMP2-exon 2 3.1.1.1.
Optimalisatie PCR-protocol
1. test touch-down 60-48 (wat aspecifieke bandjes) 2. test touch-down 64-52 (1goed specifiek bandje) 3. touch-down 64-52 op patiënt (lukt niet) 4. touch-down 64-52 op patiënt met dubbel zoveel template-DNA (lukt niet) 5. nieuwe primer 6. test touch-down 60-48 (1 aspecifiek bandje + sterker specifiek bandje ( figuur 17, (1))) 7. test touch-down 64-52 (nog steeds aspecifiek bandje) 8. test PCRx-enhancer kit (lukt goed) 9. PCRx-enhancer kit op patiënt (lukt goed (figuur 17, (2)) )
35
10. Sequencen (lukt goed)
Figuur 17: Agarosegels passend bij stappen 6 ((1))en 9 ((2)) ( L = laan met de lader)
3.1.1.2.
Finaal PCR-protocol Hoeveelheid (µl) product 7,55 H2O 2,5 10x PCRx Amplification Buffer 5 dNTP’s (1mM) 1,5 Forward primer (10µM) 1,5 Revers primer (10µM) 0,75 MgSO4 0,2 Taq Platinum 5 enhancer Tabel 9: Mastermix samenstelling. Temperatuur(°C) Tijd(min:sec) Aantal cycli 97 2:00 1x 97 0:30 55 0:30 31x 68 1:00 68 10:00 1x 4 5:00 1x Tabel 10: Thermocylinder programma.
Finaal gebruikte primers:
3.1.1.3.
1)
BMP2_exon2_M13_Fbis: gccagccaaatgggagac
2)
BMP2_exon2_M13_Rbis: cggccaagctgcctctac
Sequencing resultaten
Opnieuw te sequeneren wegens mislukt bij vorige poging tot sequeneren patiëntnummers 11, 12, 57, 82
Sequentievarianten:
1) Rs2273073 – Ser37Ala(c.109T>G)
36
Heterozygoot voor het G-allel, patiëntnummers: 30, 44, 66 (3.1 % voorkomen) SIFT en polyphen voorspellen dat deze SNP wordt getolereerd en Splice Site Prediction by Neural Network vermoedt geen splice site veranderingen door deze sequentievariant. 2) Rs1049007 – Ser87Ser (c.261A>G) Heterozygoot voor het G-allel, patiëntnummers: 2, 4, 6, 9, 10, 13, 15, 16, 17, 21, 23, 25, 26, 31, 33, 34, 37, 39, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 48, 55, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 70, 71, 74, 78, 79, 83, 84, 88, 90, 92, 93, 98, 100 ( 48.9% ) Homozygoot voor het G-allel, patiëntnummers: 3, 7, 11, 12, 14, 18, 22, 24, 29, 30, 32, 35, 36, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 58, 68, 72, 75, 76, 77, 82, 85, 86, 91, 101, 102 ( 31.6% ) Splice Site Prediction by Neural Network vermoedt geen splice site veranderingen door deze sequentievariant. 3.1.1.4.
Conclusie
Van bijna alle patiënten is de sequentie van BMP2-exon2 nu gekend, er werden 2 SNP’s gevonden Rs2273073 – Ser37Ala, die voor een eiwitverandering zorgt die vermoedelijk werd getolereerd, en Rs1049007 – Ser87Ser.
3.1.2. BMP2-exon 3 deel 1 3.1.2.1.
Optimalisatie PCR protocol
1. test touch-down 60-48 (vrij breed maar bandje op de juiste plaats) 2. test touch-down 62-50 (specifiek) 3. touch-down 62-50 voor 102 patiënten (voor bijna alle patiënten gelukt ( figuur 18, (3))) 4. sequeneren gelukt voor bijna alle patiënten
Figuur 18: Agarosegel passend bij stap 3 ((3)) ( L = laan met de lader)
3.1.2.2.
Finaal PCR-protocol Hoeveelheid (µl) 12,4 2,5
product H2O Invitrogen 10x buffer
37
5 dNTP’s (1µM) 1,5 Forward primer (10µM) 1,5 Revers primer (10µM) 0,9 MgCl2 (50 mM) 0,2 Taq Platinum (5U/µl) Tabel 11: samenstelling mastermix. Temperatuur(°C) Tijd(min:sec) Aantal cycli 94 2:00 1x 94 0:20 62* 0:15 12x 72 1:00 94 0:40 50* 0:40 24x 72 0:30 72 10:00 1x 4 5:00 Tabel 12: Thermocylinder programma. Finaal gebruikte primers:1) BMP2_M13_exon3deel1F: ttacatcaaatcccacgatgag 2) BMP2_M13_exon3deel1R: tccacgtacaaagggtgtctc 3.1.2.3.
Sequencing resultaten
Opnieuw PCR en sequeneren omdat deze mislukte bij een vorige poging om te sequencen patiëntnummers 3, 4, 5, 6, 7
Sequentievarianten:
1) Rs235768 – Arg190Ser (c.570A>T) Heterozygoot voor het T-allel, patiëntnummers: 2, 9, 10, 11, 13, 16, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 31, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 48, 55, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 71, 74, 78, 79, 83, 84, 88, 90, 93, 94, 95, 98, 100 ( 40.2% ) Homozygoot voor het T-allel, patiëntnummers: 12, 14, 15, 18, 22, 24, 29, 30, 32, 35, 36, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 68, 72, 75, 76, 77, 82, 85, 86, 91, 101, 102 ( 30.9% ) SIFT en polyphen voorspellen dat de werking van het proteïne beschadigd wordt door het serine en het Splice Site Prediction by Neural Network vermoedt geen splice site veranderingen door deze sequentievariant. 2) Puntmutatie Gln151Gln (c.453G>A) Heterozygoot voor het A-allel in patiëntnummer 80 (1%) Splice Site Prediction by Neural Network vermoedt geen splice site veranderingen door deze sequentievariant.
38
3.1.2.4.
Conclusie
Van bijna alle patiënten is de sequentie van BMP2-exon3-deel1 gevonden, er werd een SNP en een puntmuntmutatie gevonden, namelijk Rs235768 – Arg190Ser en
c.453G>A - Gln151Gln. Het
Rs235768 veroorzaakt een eiwitverandering Arg190Ser, die vermoedelijk de functie van het BMP2eiwit aantast.
3.1.3. BMP2-exon 3 deel 2 3.1.3.1.
Optimalisatie PCR protocol 1. test touch-down 60-48 (1 aspecifiek bandje) 2. test touch-down 62-50 (specifiek) 3. touch-down 62-50 voor 102 patiënten (voor bijna alle patiënten gelukt ( figuur 19, (4))) 4. sequeneren( lukt toch niet, misschien door zeer licht aspecifiek bandje) 5. test primer op td 64-52 (gelukt) 6. test touch-down 64-52 op patiënten (zweem van een aspecifiek bandje ( figuur 19, (5))) 7. test touch-down 64-52 + 5% DMSO op patiënten (lukt niet) 8. touch-down 66-52 (zeer fijn maar specifiek bandje ( figuur 19, (6)))
Figuur 19: Agarosegels passend bij stappen 3 ((4)), 6((5)) en 8 ((6)) ( L = laan met de lader) Finaal gebruikte primers: 1) BMP2_M13_exon3deel2_Fbis: aacgtcaagccaaacacaaac 2) BMP2_M13_exon3deel2_Rbis: aaattatgtacaaacccgatacttc
3.1.3.2.
Conclusie
Hier werden nog geen sequentievarianten gevonden omdat het nog niet is gelukt om het PCR programma te optimaliseren voor dit exon. Hier kan in de toekomst geprobeerd worden om met een enhancer oplossing te werken, of een andere primer aan te maken.
39
3.1.4. BMP2-exon 3 deel 3 3.1.4.1.
Optimalisatie PCR-protocol 1. test touch-down 60-48 (vrij breed maar bandje op de juiste plaats) 2. test touch-down 62-50 (specifiek) 3. touch-down 62-50 voor 102 patiënten (voor bijna alle patiënten gelukt ( figuur 20, (7))) 4. sequeneren lukt toch slecht 5. nieuwe primer 6. test touch-down 60-48 (goede specifieke band + 1 klein aspecifieke band ( figuur 20, (8))) 7. test touch-down 62-48 (goed gelukt) 8. touch-down 62-48 op patiënten (goed gelukt ( figuur 20, (9))) 9. sequencen manueel goed gelukt
Figuur 20: Agarosegels passend bij stappen 3 ((7)), 6((8)) en 8 ((9)) ( L = laan met de lader)
3.1.4.2.
Finaal PCR-protocol Hoeveelheid (µl) product 12,4 H2O 2,5 Invitrogen 10x buffer 5 dNTP’s (1µM) 1,5 Forward primer (10µM) 1,5 Revers primer (10µM) 0,9 MgCl2 (50 mM) 0,2 Taq Platinum (5U/µl) Tabel 13: Mastermix samenstelling. Temperatuur(°C) 94 94 62* 72 94 50* 72 72
Tijd(min:sec) 2:00 0:20 0:15 1:00 0:40 0:40 0:30 10:00
Aantal cycli 1x 12x
24x 1x
40
4 5:00 Tabel 14: Thermocylinder programma. Finaal gebruikte primers: 1) BMP2_exon3deel3_Fbis: tcaaaagaagtatcgggtttg 2) BMP2_exon3deel3_Rbis: aatgcaaacacaaggtcatca
3.1.4.3.
Sequencing resultaten
Opnieuw te sequencen: geen
Sequentievarianten:
1) Rs3178250 – 3’UTR (T>C) Heterozygoot voor het C-allel: 2, 3, 7, 9, 14, 16, 17, 18, 19, 24, 31, 32, 36, 37, 43, 44, 55, 57, 65, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 77, 79, 84, 88, 90, 91, 94, 101(32.3%) Homozygoot voor het C-allel: 30, 53, 85 (2.9%) 2) Rs235769 – 3’UTR (G>A) Heterozygoot voor A-allel: 2, 10, 11,13, 16, 17, 21, 23, 25, 26, 31, 33, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 48, 55, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 71, 74, 100 (34.3%) Homozygoot voor A-allel: 3, 7, 12, 14, 15, 18, 19, 22, 24, 29, 30, 32, 35, 36, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 68, 71, 82, 85, 86, 91, 101, 102 (29.4%) 3) Rs170986 – 3’UTR (C>A) Heterozygoot voor het A-allel: 6, 7, 10, 12, 22, 23, 24, 29, 42, 46, 47, 50, 51, 54, 57, 61, 68, 72, 83, 86, 91, 101, 102 ( 22.5% ) Homozygoot voor het A-allel: 58 ( 1% ) 4) c.*731A>T – 3’UTR (A>T) Heterozygoot voor het T-allel in patiënt 20 (1%) 5) c.*731A>T – 3’UTR (T>C) Heterozygootvoor het C-allel in patiënt 13 (1%) 6) c.*936_*939delATTT – 3’UTR Heterozygoot in patiënten 59, 63 en 76 (2.9%) AAATTT[ATTT]GTGTTTTA
3.1.4.4.
Conclusie
Van alle patiënten werd de sequentie bepaald, er werden verschillende SNP’s en een deletie aangetroffen, zij bevinden zich allen in UTR-gebied. Rs3178250, Rs235769, Rs170986, c.*731A>T, c.*731A>T en c.*936_*939delATTT.
41
3.1.5. BMP2-enhancer 3.1.5.1.
Optimalisatie PCR-protocol
1. test touch-down 60-48 (zeer sterke bandjes zeer licht wat aspecifiek bandje) 2. test touch-down 62-50 3. touch-down 62-50 op102 patiënten (goed gelukt ( figuur 21, (10))) 4. sequeneren (lukt toch slecht) 5. nieuwe primers 6. test touch-down 60-48 (beetje aspecifiek) 7. test touch-down 62-50 (goed gelukt) 8. touch-down 62-50 op102 patiënten (goed gelukt ( figuur 21, (11))) 9. sequeneren (lukt niet goed) 10. manueel sequeneren
Figuur 21: Agarosegels passend bij stappen 3 ((10)) en 8 ((11)) ( L = laan met de lader)
3.1.5.2.
Finaal PCR-protocol Hoeveelheid (µl) product 12,4 H2O 2,5 Invitrogen 10x buffer 5 dNTP’s (1µM) 1,5 Forward primer (10µM) 1,5 Revers primer (10µM) 0,9 MgCl2 (50 mM) 0,2 Taq Platinum (5U/µl) Tabel 15: Mastermix samenstelling
42
Temperatuur(°C) Tijd(min:sec) Aantal cycli 94 2:00 1x 94 0:20 62* 0:15 12x 72 1:00 94 0:40 50* 0:40 24x 72 0:30 72 10:00 1x 4 5:00 Tabel 16: Thermocylinder programma. Finaal gebruikte primers: 1) BMP2_enhancer_Fbis: gtgcaatgtgagaggcgaata 2) BMP2_enhancer_Rbis: tggtcattcaaacagctctga 3.1.5.3.
Sequencing resultaten
Opnieuw te sequencen: geen
Sequentievarianten:
1) Rs6085724 – enhancer (T>G) Heterozygoot voor het G-allel: 1, 2, 4, 10, 14, 16, 21, 22, 23, 26, 27, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 47, 49, 52, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 69, 70, 71, 72, 76, 77, 80, 83, 84, 85, 86, 88, 90, 93, 94, 98 ( 46.0% ) Homozygoot voor het G-allel: 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 24, 25, 29, 30, 32, 37, 40, 43, 45, 47, 51, 53, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 73, 74, 78, 79, 81, 82, 87, 89, 91, 92, 95, 97, 99, 100 ( 45.1% ) 3.1.5.4.
Conclusie
De sequentie kon voor iedere patiënt worden bepaald, uit deze sequenties kon 1 SNP weerhouden worden, namelijk Rs6085724.
3.2. Fzd2 exon1
Figuur 22: overzicht fzd2-gen
43
3.2.1. Fzd2_exon1deel1 3.2.1.1.
Optimalisatie PCR-protocol
1. test td 60-48 (zeer aspecifiek) 2. test td 64-50 (blijft aspecifiek) 3. test td 65-53 + DMSO gebruikt (veel beter blijft enkele zeer lichte aspecifiek bandjes vertonen ook het specifiek stuk werd zeer licht) 4. test met enhancer (specifiek) 5. met enhancer op patiënt (lukt maar wat lichte bandjes) 6. met enhancer op patiënt met verdubbeling van de hoeveelheid template-DNA (geen verbetering ( figuur 23, (12)) ) 7. sequencen (slecht)
Figuur 23: Agarosegel passend bij stap 6 ((12)) ( L = laan met de lader) Finaal gebruikte primers: 1) Fzd2_exon1_deel1_F: gtgtctccggctgctcagt 2) Fzd2_exon1deel1_R: gtggaagcgcagcacag 3.2.1.2. Conclusie Hier is het nog niet gelukt om de PCR te optimaliseren en mislukte de robotische sequencing. Mogelijke uitwegen zijn het opnieuw proberen sequeneren maar dan manueel of door de aanmaak van andere primers.
3.2.2. Fzd2_exon1deel2 3.2.2.1.
Optimalisatie PCR-protocol
1. test touch-down 60-48 (zeer aspecifiek) 2. test touch-down 64-50 (blijft aspecifiek) 3. test touch-down 65-53 + DMSO gebruikt (veel beter blijft enkele zeer lichte aspecifiek bandjes vertonen) 4. test touch-down 67-55 + DMSO gebruikt (specifiek) 5. touch-down 67-55 + DMSO gebruikt op patiënten (lukt goed maar bandjes ietwat licht)
44
6. sequencen (slecht) 7. touch-down 67-55 + DMSO gebruikt + ook bij 24 cycli 1’ op 72°C op patiënt. (Op die manier wordt er getracht de bandjes wat sterker te krijgen, aangezien dit exon vrij lang was kreeg Taq zo wat meer tijd voor de elongatie, er trad echter geen verbetering op ( figuur 24, (13)) )
Figuur 24: Agarosegel passend bij stap 7 ((13)) ( L = laan met de lader) Finaal gebruikte primers: 1) Fzd2_exon2_deel2_F: cgatggttccatgttcttctc 2) Fzd2_exon2_deel2_R: gggtgttgggcagagagtt 3.2.2.2. Conclusie Hier is het nog niet gelukt om de PCR te optimaliseren en mislukte de robotische sequencing. Mogelijke oplossingen zijn het opnieuw proberen sequeneren zij het dan manueel of door het aanmaken van andere primers.
3.3. Wnt10b
Figuur 25: overzicht Wnt10b-gen 3.3.1. Wnt10b-ex2-3 3.3.1.1.
Optimalisatie PCR-protocol 1. test touch-down 60-48 (niets te zien) 2. test met enhancer (gelukt) 3. met enhancer op patiënten (lukt niet)
45
4. met enhancer op patiënten met dubbele hoeveelheid template-DNA ( lukt goed (figuur 26, (14))) 5. sequensen (slecht)
Figuur 26: Agarosegel passend bij stap 4 ((14)) ( L = laan met de lader) 3.3.1.2. Conclusie Hier mislukt het sequeneren ondanks een mooi resultaat bij de gelelectroforese. Mogelijke oplossingen voor het optimaliseren zijn het opnieuw proberen om met DMSO een beter resultaat te verkrijgen, sequeneren maar dan manueel of door de aanmaak van andere primers.
3.3.2. Wnt10b-ex4 3.3.2.1.
Optimalisatie PCR-protocol
1. test touch-down 60-48 (1 specifiek maar licht bandje) 2. touch-down 60-48 op patiënten (goed resultaat ( figuur 27, (15)) 3. sequencen (slecht)
Figuur 27: Agarosegels passend bij stap 2 ((15)) ( L = laan met de lader) Finaal gebruikte primers: 1) Wnt10b_exon 4_F: gcagggtcaggattcagttag 2) Wnt10b_exon 4_R: tgtcagtcactcatcacactttatc
3.3.2.2.
Conclusie
Hier mislukt het sequeneren ondanks een goed resultaat bij de gelelectroforese. Mogelijks biedt optimalisatie met DMSO of enhancer, manueel sequencen of de aanmaak van andere primers een oplossing.
46
3.3.3. Wnt10b-ex5 3.3.3.1.
Optimalisatie PCR-protocol
1. test touch-down 60-48 (specifiek goed bandje, en uiterst licht aspecifiek bandje) 2. test touch-down 61-49 (gelukt) 3. touch-down 61-49 op 102 patiënt (goed gelukt (figuur 28, (16)) 4. sequeneren
Figuur 28: Agarosegel passend bij stap 3 ((16)) ( L = laan met de lader)
3.3.3.2.
Finaal PCR-protocol Hoeveelheid (µl) product 12,4 H2O 2,5 Invitrogen 10x buffer 5 dNTP’s (1µM) 1,5 Forward primer (10µM) 1,5 Revers primer (10µM) 0,9 MgCl2 (50 mM) 0,2 Taq Platinum (5U/µl) Tabel 17: Mastermix samenstelling. Temperatuur(°C) Tijd(min:sec) Aantal cycli 94 2:00 1x 94 0:20 64* 0:15 12x 72 1:00 94 0:40 52* 0:40 24x 72 0:30 72 10:00 1x 4 5:00 Tabel 18: Thermocylinder programma.
3.3.3.3.
Sequencing resultaten
Opnieuw te sequeneren omdat deze mislukten bij het sequencen patiëntnummers 3, 58, 67, 71, 72, 75, 81, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 101
47
Sequentievarianten:
1) c.854T>C - Ile285Thr Heterozygoot in patiëntnummer 34 (1.1%) Volgens SIFT en polyphen heeft deze eiwitverandering mogelijks de eiwitfunctie beïnvloedt. En Site Prediction by Neural Network vermoedt geen splice site veranderingen door deze sequentievariant. 2) Rs35034312 - Pro301Ser (c.901C>T) Heterozygoot in patiëntnummers 16, 20, 24, 50, 80 (5.7%) Volgens SIFT en polyphen wordt deze eiwitverandering getolereerd en volgens Splice Site Prediction by Neural Network zijn er
geen splice site veranderingen door deze
sequentievariant. 3) Rs1051886 - His353His (c.1059C>T) Homozygoot in voor het C-allel, patiëntnummers: 5, 7, 19, 22, 28, 33, 34, 40, 42, 46, 51, 53, 65, 66, 68, 73, 75, 89, 90 (21.6%) Splice Site Prediction by Neural Network vermoedt geen splice site veranderingen door deze sequentievariant. 3.3.3.4.
Conclusie
Bijna al de sequenties van de patiënten zijn gekend, uit deze gekende sequenties werden 3 polymorfismen gehaald, Rs1051886 - His353His, Rs35034312 - Pro301Ser en c.854T>C - Ile285Thr.
Rs35034312 en c.854T>C veroorzaken een eiwitverandering. Van Rs35034312 wordt dit vermoedelijk getolereerd maar bij c.854T>C wordt de eiwitfunctie mogelijks beïnvloed.
3.4
Bespreking resultaat
Het is nog niet gelukt om de sequenties van bepaalde exonen te bepalen, dit zijn BMP2-exon3-deel2, frizzeld1-exon1 en 2 en Wnt10b-exon2, 3 en 4. Bij BMP2-exon3-deel2 kwam dit vooral doordat bij een eerst poging tot sequencen in de gelelectroforese nog een klein aspecifiek bandje te zien was. Bij pogingen om de PCR-reactie te optimaliseren liep de productie van de specifieke sequentie terug. Er zal eerst worden geprobeerd met een beperkt aantal stalen of het sequencen toch mogelijk is. Wanneer dit niet zo blijkt te zijn, zal een andere primer moeten worden aangemaakt. Bij de beide frizzeld1 exonen is het zeer moeilijk om voldoende DNA-fragmenten te produceren in een PCR die specifiek doorgaat. Er zullen hier waarschijnlijk nieuwe primers moeten worden aangemaakt. Bij Wnt10b-exon2-3-4 ziet de gelelectroforese er goed uit en toch lukt het sequencen om een onbekende reden niet. Hier zal getracht worden om de sequencing manueel te doen, wat een iets robuustere techniek is die hopelijk wel lukt.
48
3. Discussie In dit eindwerk werd op zoek gegaan naar genvarianten die verantwoordelijk zijn voor het ontstaan van osteoporose. Voor dit onderzoek beschikten we over 102 mannelijke, onderling niet verwante, patiënten met een familiale vorm van osteoporose. Elk van hen was tussen de 20 en 65 jaar oud en had een BMD score ≤ −2.0 aan de LS of de proximale femur. Mensen die een gekende risicofactor hadden op secundair osteoporose werden uitgesloten. Er werd geopteerd voor het uitvoeren van kandidaatgenscreening. Deze manier van werken maakt het mogelijk om de relevantie van vrij zeldzame genetische variaties op te sporen en te evalueren. Tevens biedt deze onderzoeksmethode de mogelijkheid om relatief eenvoudig een causaal verband aan te tonen. Er werd geopteerd voor de kandidaatgenen BMP2, Fzd2 en Wnt10b omdat daarvoor al een behoorlijk aantal aanwijzingen bestaan dat zij mogelijks verantwoordelijk zijn voor de verlaging van de BMD. Om deze kandidaatgenen te analyseren, werd een mutatiescreening verricht. Daarvoor werden exonen en eventueel UTR regio’s vermenigvuldigd door middel van een PCR-reactie. De specificiteit van het PCR-product werd vervolgens gecontroleerd via een agarosegelelektroforese zodat dit PCR-product kon worden gesequeneerd. De bekomen sequentie werd uiteindelijk vergeleken met de referentiesequentie voor de genen en werd gecontroleerd op het voorkomen van sequentievarianten. Voor een aantal sequentievarianten die gevonden werden, verandert de aminozuursequentie van het proteïne waarvoor ze coderen (missense varianten). Rs235768 (Arg190Ser) in BMP2-exon3-deel1, Rs35034312 (Pro301Ser) in Wnt10b-exon5, Rs2273073 (Ser37Ala) in BMP2-exon2 en c.854T>C (Ile285Thr) die beiden in Wnt10b-exon5 voorkomen. Voor al deze eiwitveranderingen werd een analyse verricht met de computerprogramma’s SIFT en polyphen om het belang van de eiwitverandering in te schatten. Van Rs235768 (Arg190Ser) uit BMP2 en c.854T>C uit Wnt10b werd voorspeld dat ze schadelijk zijn. Dit is dus een belangrijke indicatie dat deze 2 eiwitveranderingen de normale functie van hun proteïnen in het gedrang brengen, en op die manier een oorzaak zijn van osteoporose. Naast de eiwitverandering die deze sequentievarianten met zich meebrengen is het ook mogelijk dat zij splice site veranderingen teweeg brengen. Met “Splice Site Prediction by Neural Network” werden echter geen veranderingen opgemerkt, dus is de kans dat zij hier voor splice site veranderingen zorgen erg klein. Voor Rs2273073 uit BMP2-exon2
werd
reeds een associatie met de lumbale spinale BMD
beschreven. In een internationale groep van 805 vrouwen uit Nieuw-Zeeland, het Verenigd Koninkrijk en België (Reneland et al., 2005). In de groep met lage BMD (<0.87 g/cm2, n = 319) was de prevalentie 2.2%, in de groep met hoog BMD slechts 1.4%. Gezien de relatief kleine groepen was de associatie hier net niet significant (P = 0.28). In twee latere studies, één uitgevoerd op 6353 personen in “de
49
Rotterdam” studie (Medici et al., 2006) en een tweede op 411 mannen (tussen 18–61 jaar) en 1291 premenopausale vrouwen (tussen 20–50 jaar) door Ichikawa et al. (2006), kon echter geen associatie gevonden worden tussen het voorkomen van dit polymorfisme en BMD. Polyphen en SIFT voorspellen dat deze eiwitverandering getolereerd zou worden. De c.854T>C (Ile285Thr) variant die zich in het Wnt10b gen bevindt, komt heterozygoot voor bij één patiënt. Deze sequentievariant is niet gekend als polymorfisme (dbSNP). Dit houdt in dat het slechts zelden voorkomt en dat er een grotere kans bestaat dat deze sequentievariant een belangrijk effect heeft, in dit geval bijvoorbeeld op de BMD. Volgens de analyse van deze variant met SIFT en Polyphen zou deze mutatie schadelijk zijn voor de eiwitfunctie. Voor een dergelijke zeldzame sequentievariant is familieonderzoek nodig om aan te tonen of dit genotype verantwoordelijk is voor het laag BMD fenotype in deze patiënt. Om vast te stellen of er een koppeling is tussen de sequentievariant is een familie onderzoek met de volledige familie noodzakelijk. Dit zal gecombineerd worden met een onderzoek van deze zeldzame variant in een controlepopulatie. Daarvoor zal een groep van 350 mannen met een “normale” BMD worden onderzocht op de aanwezigheid van deze variant. Wanneer blijkt dat de variant niet voorkomt bij de gezonde controlepopulatie en wanneer er koppeling is met het lage BMD fenotype binnen de familie, dan is dit een indicatie dat deze variant verantwoordelijk is voor het ontstaan van een lage BMD. Naast de missense mutaties werden er een aantal silent of “stille” mutaties gevonden in BMP2 werd Rs1049007 (Ser87Ser) aangetroffen en in Wnt10b Rs1051886 (His353His) en c.453G>A (Gln151Gln). Dit zijn sequentievarianten die binnen het coderend gebied liggen maar geen wijziging veroorzaken in de aminozuursequentie van het daaruit volgend eiwit. Dit wil echter niet zeggen dat deze puntmutaties geen functioneel effect kunnen hebben. Het is mogelijk dat zij wijzigingen in de splicing en transcriptiecontrole van het gen met zich meebrengen, met “Splice Site Prediction by Neural Network” werd echter geen van deze veranderingen in een splice site verandering aangetroffen. Dus is de kans dat deze toch aanwezig is zeer klein. De variant c.453G>A uit Wnt10b komt enkel voor bij patiënt 80 en er bestaan geen gegevens over in genoom browsers. Dit is dus een zeldzaam polymorfisme en de kans dat hij een belangrijke invloed uitoefent is groter. Deze variatie zal verder moeten worden uitgewerkt met familieonderzoek en hun voorkomen zal moet worden bestudeerd in een controlepopulatie. Er werden ook verschillende sequentievarianten gevonden die gelegen zijn in het UTR-gebied van BMP2 gen deze zijn: Rs235769, Rs170986, Rs3178250, een puntmutatie c.*731A>T, een puntmutatie c.*905T>C en c.*936_*939delATTT. Sequentievarianten die zich bevinden in een UTR-gebied bevinden
kunnen van belang zijn voor de splicing en de transcriptieregeling van een gen.
50
Rs3178250 uit BMP2 waarbij het C-allel 32.3% heterozygoot voorkomt en homozygoot in 2.8% van de individuen, werd al eerder onderzocht in het kader van otosclerose, een aandoening waarbij door een overmatig botaanmaak in het middenoor een conductief gehoorverlies ontstaat. Uit het onderzoek op 632 onverwante patiënten met otosclerose uit België, Nederland en een iets kleinere groep uit Frankrijk bleek dat personen met het homozygoot C-allel ongeveer 2 maal meer beschermd zijn dan deze die het T-allel dragen. (de gecombineerde populaties: P = 2.2 x
; OR = 2.027 (Schrauwen et al., 2008).
De puntmutatie c.*731A>T en c.*905T>C uit BMP2 komen elk slechts bij 1 patiënt voor. Deze varianten zullen moeten worden onderzocht met familieonderzoek en hun voorkomen in een controlepopulatie. De deletie c.*936_*939delATTT in het 3’UTR-gebied van BMP2-exon3 komt heterozygoot voor bij drie patiënten en heeft volgende flankerende DNA-sequentie AAATTT[ATTT]GTGTTTTA. Wanneer er geen deletie is opgetreden in deze DNA-sequentie en ze wordt vertaald tot mRNA, resulteert dit in een sequentie AUUUA met daar omheen een UG-rijk gebied. De combinatie van een UG-rijk gebied en de sequentie AUUUA staat echter bekend als een belangrijk signaal dat de stabiliteit van mRNA reguleert. Dit gebeurt via sequentiespecifieke RNA bindende proteïnen die het mRNA afbreken. Op deze wijze wordt de expressie van het gen ook gereguleerd. Door de deletie van ATTT verdwijnt in het mRNA transcript het AUUUA motief. (Bolognani en Perrone-Bizzozero, 2008). Bovendien ligt het AUUUA motief dat hier is aangetast door de deletie in een regio met een hoge observatiegraad, wat een aanwijzing is dat dit gebied een belangrijke functie bezit. Er is reeds een SNP bekend (rs15705) die op deze manier osteoporose bewerkstelligt. (Fritz et al., 2006). Het is dus mogelijk dat door deze deletie de expressie van het BMP2 gen niet meer correct wordt geregeld door de verstoring van dit signaal. (Bolognani en Perrone-Bizzozero, 2008) Verder familieonderzoek en het voorkomen in een controlepopulatie zullen moeten uitwijzen of de deletie dit inderdaad een verlaagd BMP veroorzaakt. Ook in de onderzochte enhancer sequentie van het BMP2-gen is een SNP gevonden, Rs6085724. Deze enhancer is een DNA-sequentie die gekend is voor zijn vermogen om de expressie van BMP2 te reguleren. (Chandler et al. 2007). Op die manier kan een wijziging van deze sequentie de expressie van BMP2 mogelijks beïnvloeden. Er zijn dus al een aantal polymorfismen aan de oppervlakte gekomen, waarvan moet worden onderzocht of zij iets te maken hebben met het verlagen van de BMD bij osteoporose patiënten. Vooral sequentievarianten Rs3178250, Rs235768, Rs2273073 en c.*936_*939delATTT uit BMP2 en c.854T>C uit Wnt10b lijken een grote kans te hebben om van belang te zijn bij het ontwikkelen van een laag BMD, en bijgevolg in de ontwikkeling van osteoporose. Daarnaast zal ook nog moeten verder gewerkt worden aan het sequencen van BMP2-exon3-deel2, frizzeld1-exon1 en 2 en Wnt10b-exon2, 3 en 4.
51
Bij polymorfismen die frequenter voorkomen, zal het verwachte effect op de BMD kleiner zijn dan bij de zeldzamere polymorfismen. Het effect kan worden getest door hun voorkomen na te gaan bij een groep gezonde controlepersonen. Er kan worden nagegaan of er een verband bestaat tussen het voorkomen van het polymorfisme en een iets lager BMD. Zo ja, dan is het waarschijnlijk dat het polymorfisme de oorzaak is van een kleine verlaging van de BMD. Op die manier komt men stap voor stap dichter bij de volledige identificatie van de genen die verantwoordelijk zijn voor en verlaging van de BMD, en bij gevolg voor osteoporose.
52
4. Referentielijst 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.
20. 21. 22.
Annie WC, Kung AW, Huang QY. genetic and environmental determinants of osteoporosis. Musculoskelet Neuronal Interact2005;7:26-32. Argencount. process overview. In: cleanseq-process-overview, editor. GIF-afbeelding: agencount; 2009. Armstrong VJ, Muzylak M, Sunters A, Zaman G, Saxon LK, Price JS, et al. Wnt/-catenin signaling is a component of osteoblastic bone cells' early responses to load-bearing, and requires estrogen receptor J Biol Chem2007;282(28):20715-27. Bennett CN, Longo KA, Wright WS, Suva LJ, Lane TF, Hankenson KD, et al. Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by Wnt10b. Proc Natl Acad Sci 2005;102(9):3324-9. Bodine PV, Komm BS. Wnt signaling and osteoblastogenesis. Rev Endocr Metab Disord2006 jun;7(12):33-9. Bolognani F, Perrone-Bizzozero NI. RNA-protein interactions and control of mRNA stability in neurons. J Neurosci Res2008;86(3):481-9. Borrásand T, Comes N. Evidence for a calcification process in the trabecular meshwork Experimental Eye Research2008;88(4):738-46. Boyce BF, Xing L. Biology of RANK, RANKL, and osteoprotegerin Arthritis Research Therapy2007;9. Capet F, Oyen HV, Tafforeau J. OSTEOPOROSE EN HEUPFRACTUREN huidige toestand en bijdrage van informatie voor het opbouwen van een gezondheidsbeleid. In: Volksgezondheid WI, editor. brussel1999. Chandler R, Chandler K, McFarland K, Mortlock D. Bmp2 transcription in osteoblast progenitors is regulated by a distant 3' enhancer located 156.3 kilobases from the promoter. Mol Cell Biol2007;27(8):2934-51. Chandler RL, Chandler KJ, McFarland KA, Mortlock DP. Bmp2 Transcription in Osteoblast Progenitors Is Regulated by a Distant 3' Enhancer Located 156.3 Kilobases from the Promoter. Molecular and Cellular Biology2007;27(8):2934-51. Chavassieux P, Seeman E, Delmas PD. Insights into Material and Structural Basis of Bone Fragility from Diseases Associated with Fractures: How Determinants of the Biomechanical Properties of Bone Are Compromised by Disease. Endocrine Reviews2006;28: 151-64. Chen D, Zhao M, Mundy GR. Bone Morphogenetic Proteins Growth Factors2004;22(4):233-41. Christiaens T, Loof GD, Maloteaux JM. gecommentarieerd geneesmiddelenrepertorium 2008: B.C.F.I. (Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische Informatie); 2008. Compston JE. Sex steroids and bone Physiological Review 81:419-47.; 2001. Dathe K, Kjaer KW, Brehm A, Meinecke P, Nürnberg P, Neto JC, et al. Duplications Involving a Conserved Regulatory Element Downstream of BMP2 Are Associated with Brachydactyly Type A2. Am J Hum Genet 2009;84(4):483-92. Ferrari SL, Deutsch S, Antonarakis SE. Pathogenic mutations and polymorphisms in the lipoprotein receptor-related protein 5 reveal a new biological pathway for the control of bone mass. Current Opinion in Lipidology2005;16(2):207-14. Fritz DT, Jiang S, Xu J, Rogers MB. A polymorphism in a conserved posttranscriptional regulatory motif alters bone morphogenetic protein 2 (BMP2) RNA:protein interactions. Mol Endocrinol2006;20(7):157486. Guo W, Flanagan J, Jasuja R, Kirkland J, Jiang L, Bhasin S. The Effects of Myostatin on Adipogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells Are Mediated through Crosscommunication between Smad3 and Wnt/β-Catenin Signaling Pathways. J Biol Chem2008;283(14):9136-45. Haines JL, Korf BR, Morton CC, Seidman CE, Seidman JG, Smith DR. Current Protocols in Human Genetics: John Wiley and Sons; 2007. Ichikawa S, Johnson ML, Koller DL, D. Lai XX, Edenberg HJ, Hui SL, et al. Polymorphisms in the bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene do not affect bone mineral density in white men or women. Osteoporos Int2006;17:587-92. Kamiya N, Ye L, Kobayashi T, Mochida Y, Yamauchi M, Kronenberg HM, et al. BMP signaling negatively regulates bone mass through sclerostin by inhibiting the canonical Wnt pathway. Development2008;135(22):38801-8811.
53
23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39.
40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49.
Kanis JA. Diagnosis of osteoporosis and assessment of fracture risk the lancet2002;359(9381):1929-36. kanis JA. FRAX WHO Fracture Risk Assessment Tool. sheffield: univercitie of sheffield; 2009. Kawasaki K, Honmo J, Sakurai S, Fujimaki Y, Sakamoto K, Fujimaki E, et al. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on differentiation of cells isolated from human bone, muscle, and skin. Bone1998;23(3):223-31. Kramer MF, Coen DM. Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization. current protocols in immunology2001(10). Kumar P, Clark M. clinical medicine. london: elsevier; 2005. Lawyer FC, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. . PCR Methods Appl1993;2:275-87. Leslie WD, Adler RA, Fuleihan GE-H, Hodsman A, Kendler DL, McClung M, et al. Application of the 1994 WHO Classification to Populations Other Than Postmenopausal Caucasian Women: The 2005 ISCD Official Positions Journal of Clinical Densitometry 2006;9(1):22-30. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M. moliculair cel biology. 2 ed. New York: elsevier; 2004. Longo KA, Wright WS, Kang S. Wnt10b inhibits development of white and brown adipose tissues. development of white and brown adipose tissues. J Biol Chem2004;279:35503-9. Marieb EN, Hoehn K, Wilhelm PB, Zanetti N. Human Anatomy & Physiology 7ed: Pearson Higher Education; 2006. Medici M, Meurs JB, Rivadeneira F, Zhao HY, Arp PP, Hofman A, et al. BMP-2 gene polymorphisms and osteoporosis: the Rotterdam study. J Bone Miner Res 2006;21:845-54. Melton LJ, Chrischilles EA, Cooper C, Lane AW, Riggs BL. Perspective. How many women have osteoporosis? Bone Mineral research1992;7:1005-10. Netter FH. Musculoskeletal system: anatomy, physiology, and metabolic disorders. : Ciba-Geigy Corporation; 1987. Netter FH. Compact bone & spongy (cancellous bone) long bone. JPEG1987. Ng PC, Henikoffa S. SIFT: predicting amino acid changes that affect protein function Nucleic Acids Res2003;31(13):3812-4. Ombregt L, Bisschop P, Veer Ht. A system of orthopaedic medicine. Livingstone C, editor2002. Peterson M, Stouch B, Chen D, Baughman S, Holloway D, Bekker P, et al. A PK/PD Model Developed in Cynomolgus A PK/PD Model Developed in Cynomolgus Monkeys Predicts Concentrations and Monkeys Predicts Concentrations and Effects of AMG 162, A Fully Human Effects of AMG 162, A Fully Human Monoclonal Antibody Against RANKL, in Monoclonal Antibody Against RANKL, in Healthy Postmenopausal Women apps. kent 2004. Poole KES, Compston JE. Osteoporosis and its management. BMJ 2006;333(1251-1256). Pothiwala P, Evans E, Chapman-Novakofski K. Ethnic variation in risk for osteoporosis among women: a review of biological and behavioral factors. J Womens Health2006;15(6):709-19. Reneland RH, Mah S, Kammere S, Hoyal CR, Marnellos G, Wilson SG, et al. Association between a variation in the phosphodiesterase 4D gene and bone mineral density. BMC Med Genet2005;6:5. Richards JB, Rivadeneira F, Inouye M, Pastinen TM, Soranzo N, Wilson SG, et al. Bone mineral density, osteoporosis, and osteoporotic fractures: a genomewide association study. . Lancet2008;371:1505-12. Rittweger J. Can exercise prevent osteoporosis? Musculoskelet Neuronal Interact2006;6(2):162-6. Robinson JA, Chatterjee-Kishore M, Yaworsky PJ, Cullen DM, Zhao W, Li C, et al. WNT/-catenin signaling is a normal physiological response to mechanical loading in bone J Biol Chem2006;281(42):31720-8. Rubin J, Rubin C, Jacobs CR. Molecular pathways mediating mechanical signaling in bone Gene2005;367:1-16. Saitoh T, Kirikoshi H, Mine T, Katoh M. Proto-oncogene WNT10B is up-regulated by tumor necrosis factor alpha in human gastric cancer cell line MKN45. Int J Oncol2002;19(6):1187-92. Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, . New York: Cold Spring Harbor; 2001. Schrauwen I, Thys M, Vanderstraeten K, Fransen E, Dieltjens N, Huyghe JR, et al. Association of bone morphogenetic proteins with otosclerosis.. J Bone Miner Res2008;23(4):507-16.
54
50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66.
Schuelke M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nature Biotechnology 2000;18. Seo HJ, Kim SG, Kim CS. Risk factors for bone mineral density at the calcaneus in 40-59 year-old male workers: a cross-sectional study in Korea. BMC Public Health2008;8:253. Shapiro F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European cells & materials journal2008;15 : 53 - 76. Spinella-Jaegle S, Roman-Roman S, Faucheu C, Dunn FW, Kawai S, Gallea S, et al. Opposite effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-_1 on osteoblast differentiation. Bone2001;29(4):323-30. Staehling-Hampton K, Proll S, Paeper BW, Zhao L, Charmley P, Brown A, et al. A 52-kb deletion in the SOST-MEOX1 intergenic region on 17q12-q21 is associated with van Buchem disease in the Dutch population. Am J Med Genet 2002;110:144-52. Strachan T, Read AP. Human Molecular Genetics 2. FranKingston, editor. Oxfort: BIOS; 1999. Styrkarsdottir U, Cazier JB, Kong A, Rolfsson O, Larsen H, Bjarnadottir E, et al. Linkage of osteoporosis to chromosome 20p12 and association to BMP2. PLoS biol2003;1:1-10. Takahashi-Yanaga F, Sasaguri T. The Wnt/β-Catenin Signaling Pathway as a Target in Drug Discovery. Journal of Pharmacological Sciences2007;104:293-302. Tindall KR, Kunkel TA. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry1988;27:6008-13. Ugur SA, Tolun A. Homozygous Wnt10b mutation and complex inheritance in Split-Hand/Foot Malformation. Human Molecular Genetics 2008 17(17):2644-26532008;17(17):2644-53. Usb. Summary of ExoSAP-IT PCR product treatment In: 78200_f1[1].pdf, editor. acrobat reader: Usb; 2007. Warrell DA, Cox TM, Firth JD, Jr EJB. Oxfort textbook of medicine fourrh edition. Warrell DA, Cox TM, Firth JD, editors. Oxfort: Oxford University Press; 2005. Whiting SJ, Vatanparast H, Baxter-Jones A, Faulkner RA, Mirwald R, Bailey DA. Factors that affect bone mineral accrual in the adolescent growth spurt. Journal of Nutrition2004;134: 696-700. WHO. consultation on esteblishing regional guidlines on osteoporosis. beirut: world health organisation2005. Yavropoulou MP, Yovos JG. The role of the Wnt signaling pathway in osteoblast commitment and differentiation. Hormones2007;6(4):279-94. Zmuda JM, Sheu YT, Moffett SP. The search for human osteoporosis genes. J Musculoskelet Neuronal Interact2006;6(1):3-15. Zmuda JM, Yerges LM, Kammerer CM, Cauley JA, Wang X, Nestlerode CS, et al. Association analysis of WNT10B with bone mass and structure among individuals of African ancestry. J Bone Miner Res2009;24(3):437-47.
55
56
(Bijlage1)
Chromosomale regios die door genom wide likage studies in verband kunnen worden gebracht met BMD*.(Zmuda et al., 2006)
57
(bijlage2)
58
(bijlage 3)
59
(bijlage 4)
BMP2-exon2
BMP2-exon3deel1
BMP2exon3deel2
BMP2-exon3deel3
BMP2enhancer
PCRx-enhancer kit
*Td 62-50
geen
*Td 62-50
*Td 62-50
11, 12, 57, 82
3, 4, 5, 6, 7
allemaal
geen
geen
Gen PCR-programma Nog niet gesequeneerd
Sequentievarianten
Gen
PCR-programma
-Rs2273073 (Ser37Ala) -Rs1049007 (Ser87Ser)
-Rs235768 (Arg190Ser) - c.453G>A (Gln151Gln)
geen
-Rs3178250 -Rs235769 -Rs170986 - c.*731A>T - c.*731A>T - c.*936_*939 delATTT
Frizzeld1
Frizzeld2
Wnt10bexon2-3
Wnt10bexon4
geen
geen
geen
geen
-Rs6085724
Wnt10b-exon5
*Td 61-49 3, 58, 67, 71, 72,
Nog niet gesequeneerd
Sequentievarianten
geen
allemaal
allemaal
allemaal
geen
geen
geen
geen
75, 81, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 101 -c.854T>C (Ile285Thr) -Rs35034312 (Pro301Ser) -Rs1051886 (His353His)
Tabel: Samenvattende tabel met de resultaten van de uitgevoerde mutatiescreening. *Td staan voor Touch-down PCR programma.
60